CN112442504B - 一种重组草鱼白介素-12活性蛋白的制备方法 - Google Patents

一种重组草鱼白介素-12活性蛋白的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组草鱼白介素‑12活性蛋白的制备方法，包括以下步骤：将p35核酸序列先构建到载体上，再将p40核酸序列插入到(GGGGS)3linker前，获得能够完整表达单链IL‑12蛋白的质粒；点种CHO/dhFr‑细胞并转染S3所得质粒，然后采用MTX连续梯度加压筛选，获得单克隆细胞；培养单克隆细胞，收集细胞培养基，采用蛋白质免疫印迹检测分泌到培养基中的蛋白，筛得高表达IL‑12的细胞株；对高表达IL‑12的细胞株进行悬浮驯化培养，收集细胞培养基，过滤，纯化，即得。本发明利用柔性氨基酸链连接草鱼p40和p35两个亚基以获得稳定的重组草鱼IL‑12蛋白，便于深入研究其生物学功能及后续应用于生产实践。

Description

一种重组草鱼白介素-12活性蛋白的制备方法
技术领域
本发明属于融合蛋白技术领域，尤其涉及一种重组草鱼白介素-12活性蛋白的制备方法。
背景技术
草鱼是重要的经济鱼类之一，在不断扩大的养殖面积的过程中，其病害以成为阻碍草鱼养殖发展的关键问题，因此解决养殖过程中出现的疾病是首要目的，而机体的免疫系统对于抵抗外界病原体等具有重要作用。
白细胞介素12(Interleukin 12,IL-12)是一种异源二聚体细胞因子，由p35和p40两个亚基通过链间二硫键连接构成。IL-12主要由活化的巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞产生；其主要功能刺激T或NK细胞分泌干扰素-γ(Interferon-gamma，IFN-γ)，从而激活巨噬细胞发挥功能以及促进T辅助细胞1(T helper cell 1,Th1)的分化和增殖，表明IL-12在调节先天和适应性免疫应答中充当重要角色。IL-12作为可以调节免疫系统的重要因子，可在提高机体抵抗力方面具有一定的作用；除此之外，IL-12还可以作为一种免疫佐剂提高疫苗的免疫保护效果。但目前关于鱼类IL-12稳定重组蛋白及相关功能研究较少。
现有技术中鱼类中白细胞介素-12的重组蛋白获得方法有将表达p40和表达p35亚基的质粒共转入昆虫细胞中，经表达获得异源二聚体的白细胞介素-12重组蛋白，但p40，p35单独转染入细胞中，需优化两种质粒的转染比例，获得的重组蛋白量少，获得的异源二聚体形式不稳定。
现有技术中还有将编码p40与p35亚基的核酸序列串联构建在同一个表达质粒上，转入大肠杆菌或昆虫细胞后获得稳定的白细胞介素-12重组蛋白，p40与p35串联形成单链IL-12，解决重组蛋白不稳定因素，但使用大肠表达系统不能很好控制内毒素含量，且实验结果显示所获得重组蛋白活性不高。
发明内容
本发明的目的在于：针对上述现有技术存在的不足，提供一种重组草鱼白介素-12活性蛋白的制备方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种重组草鱼白介素-12活性蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S1.用带有(GGGGS)3linker核酸序列的引物扩增，获得的带有(GGGGS)3linker的p35核酸序列；
S2.用带有HindIII酶切位点的引物扩增，获得p40核酸序列；
S3.将S1所得p35核酸序列先构建到载体上，再S2所得p40核酸序列插入到(GGGGS)3linker前，获得能够完整表达单链IL-12蛋白的质粒；
S4.点种CHO/dhFr-细胞并转染S3所得质粒，然后采用MTX连续梯度加压筛选，获得单克隆的细胞；
S5.培养S4所得单克隆细胞，收集细胞培养基，采用蛋白质免疫印迹检测分泌到培养基中的蛋白，筛得高表达IL-12的细胞株；
S6.对S5所得高表达IL-12的细胞株进行悬浮驯化培养，收集细胞培养基，过滤，纯化，即得。
本发明利用细胞因子融合蛋白技术，使用蛋白质linker——(GGGGS)3连接p40与p35亚基采用亚克隆的方式构建单链IL-12表达质粒，采用这样亚克隆的方式，可以确保每次的组装是正确的，并且可以扩展到模块化的质粒构建，如要构建表达IL-35蛋白的质粒，p40基因更换为EBI3基因即可，有效减少由重组PCR带来的不确定性；再转入CHO二氢叶酸还原酶缺陷型细胞中，经浓度梯度氨甲喋呤(methotrexate,MTX)缺陷筛选，将IL-12表达质粒整合入CHO基因组中，获得可稳定表达IL-12的细胞株。
进一步地，载体为pSV2-dhfr载体。
进一步地，获得能够完整表达单链IL-12蛋白的质粒后，经过转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性单克隆，测序验证，然后抽提质粒用于转染。
进一步地，MTX连续梯度加压过程中，每次加压之后待细胞正常增殖后进行下一浓度梯度的MTX筛选。
进一步地，悬浮驯化培养具体为：待细胞在原培养基中长到培养容器60-70％时，采用无血清培养基SFM4CHO进行培养，经过两次换液，得到大量悬浮培养的细胞；然后将获得细胞接种可换气培养容器，培养至2×106cells/mL时，间隔一天加入补充物L-glutamine和乳化剂F68，连续添加三次至L-glutamine终浓度为4mM、乳化剂F68终浓度为1％后通过离心法收集细胞培养基。
进一步地，纯化具体为：采用HisTrap HP柱进行亲和层析，用结合缓冲液pH7.4Binding buffer平衡，随后上样至平衡好的亲和柱；上样完毕后用不同浓度的洗脱缓冲液pH 7.4Elution buffer洗脱。
进一步地，采用Superdex 25柱进行分子筛层析，以pH7.4 10mM PB洗脱收集蛋白主峰。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明中，采用亚克隆的方法阶段性构建质粒，能够保证每步的质粒正确性，同时采用类模块化设计，采用相同的酶切位点，可更换其中的基因组成，利于表达同源或异源二聚体蛋白载体的构建；
2、本发明中，采用CHO二氢叶酸还原酶缺陷型细胞，联合使用MTX连续梯度加压筛选，可将待表达基因稳定整合到细胞基因组中，获得可稳定遗传表达此外源基因的细胞；
3、本发明培养过程中，考虑细胞代谢旺盛及成团情况，使用底部有隔板的可换气锥形瓶提高培养基溶氧，培养时补充L-glutamine作为细胞合成核酸和蛋白质的重要原料和乳化剂F68具有抗剪切力作用，减少细胞成团和情况，维持细胞高活性并促进细胞表达的蛋白活性；
4、本发明的方法产量大，可达到5mg/100mL重组草鱼IL-12蛋白，且整个培养体系均是无菌操作，无内毒素影响。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明构建质粒的示意图；
图2为蛋白质免疫印迹检测结果图；
图3为蛋白质纯化结果图；
图4为基因分泌情况图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例
本发明较佳的实施例提供一种重组草鱼白介素-12活性蛋白的制备方法，具体步骤如下：
1、使用合成的带有(GGGGS)3linker核酸序列的引物扩增获得的带有(GGGGS)3linker的p35核酸序列，用带有HindIII酶切位点的引物扩增获得p40核酸序列。
所用引物序列如下表1所示：
表1引物序列
Figure BDA0002826920620000041
引物扩增体系及程序如下：
P35扩增体系：
Figure BDA0002826920620000042
Figure BDA0002826920620000051
P35扩增程序：
Figure BDA0002826920620000052
P40扩增体系：
Figure BDA0002826920620000053
Figure BDA0002826920620000061
P40扩增程序：
Figure BDA0002826920620000062
2、将获得的p35序列首先构建到pSV2-dhfr载体上。
3、将获得的p40核酸序列插入到(GGGGS)3linker前，以获得完整表达单链IL-12蛋白的质粒。
4、经过转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性单克隆，送测序验证之后抽提质粒准备后续转染。
5、点种CHO/dhFr-细胞8×105cells/well(35mm dish)，转染上述测序验证的质粒。
6、经过使用MTX连续梯度加压筛选(10，30，100，250和500nM)，每次加压之后需要等到细胞可正常增殖之后再进行下一个浓度梯度的MTX筛选，最后获得单克隆的细胞。将所获得单克隆细胞单独培养在24孔板中，收集细胞培养基。
7、经蛋白质免疫印迹检测分泌到培养基中的蛋白，如图2所示，筛选到高表达IL-12的细胞株。
8、将筛选到的高表达IL-12细胞株进行悬浮驯化培养。具体是首先在100mm dish培养选定细胞株，待细胞长到覆盖60-70％时，换成无血清培养基SFM4CHO，经过两次换液，得到大量悬浮培养的细胞。
9、将获得细胞按照5×105cells/mL浓度接到带隔板的可换气锥形瓶。培养至2×106cells/mL时，间隔一天加入补充物L-glutamine(终浓度为4mM)和乳化剂F68(终浓度为1％)。连续添加三次之后通过离心法收集细胞培养基，经过0.45μm滤器过滤得到样品。
10、对样品采用HisTrap HP柱进行亲和层析，用结合缓冲液PH 7.4Bindingbuffer平衡，随后上样至平衡好的亲和柱；上样完毕后用不同浓度的洗脱缓冲液PH7.4Elution buffer洗脱，收集每个梯度的组分。进一步使用Superdex 25柱进行分子筛层析，以10mM PB(PH7.4)洗脱收集蛋白主峰，纯化结果情况图如图3所示。随后取部分样品经SDS-PAGE及抗His标签抗体进行蛋白质免疫印迹鉴定。其余样品分装，用冷冻真空干燥机冻干蛋白，放入-80℃保存。本实施例制得5mg/100mL重组草鱼IL-12蛋白。
实验例
分离草鱼头肾白细胞，按照6×105cells/well点种到24孔板，用RPMI1640完全培养基培养过夜。分别加入不同浓度(0/30/100/300ng/ml)的重组蛋白处理细胞12小时。收集细胞培养基，使用ELISA(酶联免疫吸附法)检测相关靶基因的蛋白分泌情况，结果如图4所示。结果表明，随着重组蛋白浓度的增加，相关靶基因的蛋白分泌量增加。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 电子科技大学
<120> 一种重组草鱼白介素-12活性蛋白的制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagcttggtg gcggaggttc aggaggcggt ggatccggtg gcggaggttc aggtcctgtc 60
ggagcgcgtg 70
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccaagcttg ggatggacaa gattgtcttt tttattct 38
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catggactcg ttggtgctgc 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aagcttttgt tccgaggtgt gccgg 25

Claims (4)

1.一种重组草鱼白介素-12活性蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.用带有(GGGGS)3 linker核酸序列的引物扩增，获得的带有(GGGGS)3 linker的p35核酸序列；所述引物序列如序列1和序列2所示；
S2.用带有HindIII酶切位点的引物扩增，获得p40核酸序列；所述引物序列如序列3和序列4所示；
S3.将S1所得p35核酸序列先构建到载体上，再S2所得p40核酸序列插入到(GGGGS)3linker前，获得能够完整表达单链IL-12蛋白的质粒；获得能够完整表达单链IL-12蛋白的质粒后，经过转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性单克隆，测序验证，然后抽提质粒用于转染；
S4.点种CHO/dhFr-细胞并转染S3所得质粒，然后采用MTX连续梯度加压筛选，获得单克隆的细胞；
S5.培养S4所得单克隆细胞，收集细胞培养基，采用蛋白质免疫印迹检测分泌到培养基中的蛋白，筛得高表达IL-12的细胞株；
S6.对S5所得高表达IL-12的细胞株进行悬浮驯化培养，收集细胞培养基，过滤，纯化，即得；所述载体为pSV2-dhfr载体；所述悬浮驯化培养具体为：待细胞在原培养基中长到培养容器60-70%时，采用无血清培养基SFM4CHO进行培养，经过两次换液，得到大量悬浮培养的细胞；然后将获得细胞接种可换气培养容器，培养至2×106 cells/mL时，间隔一天加入补充物L-glutamine和乳化剂F68，连续添加三次之后通过离心法收集细胞培养基；
所述MTX连续梯度加压浓度为10、30、100、250和500 nM。
2.根据权利要求1所述的重组草鱼白介素-12活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述MTX连续梯度加压过程中，每次加压之后待细胞正常增殖后进行下一浓度梯度的MTX筛选。
3.根据权利要求1所述的重组草鱼白介素-12活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述纯化具体为：采用HisTrap HP柱进行亲和层析，用结合缓冲液pH 7.4 Binding buffer平衡，随后上样至平衡好的亲和柱；上样完毕后用不同浓度的洗脱缓冲液pH 7.4 Elutionbuffer洗脱。
4.根据权利要求3所述的重组草鱼白介素-12活性蛋白的制备方法，其特征在于，采用Superdex 25柱进行分子筛层析，以pH7.4 10 mM PB洗脱收集蛋白主峰。
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