CN101638657A - 重组人白细胞介素12真核表达载体的构建及其应用 - Google Patents
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Abstract
重组人白细胞介素12真核表达载体的构建及其应用，它涉及重组人白细胞介素12(rhIL－12)表达载体的研制、稳定表达细胞系的筛选、其核酸疫苗基因佐剂功能和肿瘤基因治疗作用。采用10个疏水的柔性氨基酸接头连接P40、P35获得融合基因构建rhIL－12真核表达质粒(pCDNA6－IL－12)。将其转染CHO细胞筛选出了稳定表达细胞系，并且表达产物具有良好的生物学活性。pCDNA6－IL－12与核酸疫苗共免疫可显著增强其免疫效果。直接在实验小鼠肿瘤模型瘤体内注射或用其对肿瘤细胞进行基因修饰后再植入均可发挥强大的抗肿瘤作用。经进一步完善后可进入临床试用阶段的研究。
Description
技术领域：
本发明涉及重组人白细胞介素12(rhIL-12)真核表达载体的研制和应用。具体涉及该载体的构建、表达鉴定、生物学活性分析、rhIL-12在真核细胞中稳定表达细胞系的筛选、一种核酸疫苗的基因佐剂和肿瘤基因治疗制剂。
背景技术：
IL-12是一种由异源二聚体蛋白组成的细胞因子，编码IL-12两个亚基(p35、p40)的基因位于不同的染色体上，二者分别合成后再通过亚基间二硫键结合成具有生物学活性的二聚体分子(p70)。单独的亚基不能发挥其生物学作用。而且，p40易形成同源二聚体，通过受体竞争机制抑制IL-12的活性。
中国专利200410080518.7公开了一种纯化重组人白细胞介素12的方法，涉及蛋白质纯化方法。本发明纯化重组人白细胞介素12的方法，是将重组人白细胞介素12的细胞培养上清液进行阳离子交换层析和阴离子交换层析；所述重组人白细胞介素12的细胞培养上清液进行所述阳离子交换层析时，pH高于重组人白细胞介素12的等电点；进行所述阴离子交换层析时，先用pH3.5-5.0的缓冲液洗脱除去杂蛋白，接着洗脱收集目的物。但是这种方法生产rhIL-12，产出的rhIL-12纯度不够，目前还不能用于临床使用。
目前，国外已经将人IL-12真核表达载体和rhIL-12作为治疗制剂进入II/III期临床实验阶段，涉及多种传染性疾病、肿瘤、甚至自身免疫性疾病的治疗。使用人IL-12真核表达载体进行肿瘤进行基因治疗已成为肿瘤生物治疗的一个新策略；也为临床病毒性疾病及多种自身免疫性疾病的治疗开辟了新的研究领域。
本研究拟构建一种rhIL-I2的真核表达载体、对其进行表达鉴定、研究其基因佐剂功能和肿瘤基因治疗作用，并筛选其稳定表达细胞系。rhIL-I2真核表达载体的研制、在真核细胞中稳定表达细胞系的建立、其基因佐剂和肿瘤基因治疗功能的探索对于rhIL-I2的理论和应用研究均具有重要的意义，并具有潜在的市场前景。
发明内容：
本发明提供了重组人白细胞介素12真核表达载体的构建及其应用。构建rIL-12真核表达载体(pCDNA6-IL-12)，对其进行体外表达鉴定及表达产物的生物学活性分析；将其与重组人巨细病毒被膜蛋白PP65腺病毒核酸疫苗(Adno-pp65)共同免疫动物，评价其对核酸疫苗的基因佐剂功能；将其直接在实验小鼠肿瘤模型瘤体内注射或导入肿瘤细胞后再致瘤，观察其对肿瘤的基因治疗作用；筛选rhIL-12稳定表达细胞系。本发明已基本达到进入I期临床实验阶段，可审慎选择少量临床病例进行体内应用研究，以积累经验，探索和完善方法，为其后正轨的I期临床研究提供支持。
为了解决背景技术所存在的问题，本发明采用以下技术方案：pCDNA6-IL-12的构建：采用10个疏水的柔性氨基酸接头连接的方案获取rIL-12 P40、P35融合基因，本构建策略不仅可保证P40、P35两亚基以1∶1比率表达，而且柔性氨基酸接头可使两个亚基充分延展、正确折叠，从而获得最大的生物学活性。融合基因插入真核表达质粒(pcDNA6/v5-hisp)，构建pCDNA6-IL-12；通过酶切、测序鉴定重组克隆。将pCDNA6-IL-12导入HEK293细胞，ELISA检测培养上清液中rhIL-12表达。
rh-IL-12体外生物学活性分析：应用特异性淋巴细胞增生实验、NK杀伤活性、细胞因子流式细胞(CFC)等方法对rhIL-12进行体外生物学活性分析。
pCDNA6-IL-12的基因佐剂功能研究：pCDNA6-IL-12与HCMV核酸疫苗(aden-pp65)在Bab/c小鼠体内共免疫。检测其对核酸疫苗的基因佐剂功能
应用pCDNA6-IL-12进行肿瘤基因治疗的研究：(1)以小鼠肉瘤细胞(S-180)在昆明种小鼠建立荷瘤模型，将pCDNA6-IL-12直接瘤体内注射。(2)将pCDNA6-IL-12转染小鼠乳腺癌细胞株EMT6，经筛选获得rhIL-12基因修饰的小鼠乳腺癌细胞株(EMT6/IL-12)；接种实验小鼠，观察并检测其对肿瘤的基因治疗作用。
rhIL-12稳定表达细胞系的筛选：将pCDNA6-IL-12转染CHO细胞；用Blasticidin筛选rhIL-12阳性表达克隆，并进行单克隆扩增、表达鉴定及表达稳定观察。
pCDNA6-IL-12在实验小鼠体内应用的初步安全性评价：pCDNA6-IL-12在实验小鼠体内大剂量应用(肌肉注射)。观察其体温、体重、一般状况等。
本发明的主要成果：本发明成功地构建了重组人白细胞介素12的单链双亚基真核表达质粒(pCDNA6-IL-12)，并证明其表达的产物(rhIL-12)具有预期的生物学活性。应用弹性蛋白接头连接rhIL-12两个亚基的方案在国内为首次报道，享有独立的知识产权。
pCDNA6-IL-12与HCMV核酸疫苗在实验小鼠体内共免疫，可显著增强核酸疫苗的免疫效果，发挥理想的基因佐剂功能。经进一步完善后，可进入临床试用阶段的研究。
pCDNA6-IL-12于实验小鼠瘤体内注射或应用pCDNA6-IL-12对肿瘤细胞进行基因修饰后再致瘤的研究表明，pCDNA6-IL-12通过激发机体的抗肿瘤细胞免疫机制而发挥抗肿瘤作用，研究结果令人振奋。同时获得了经基因修饰并稳定表达rhIL-12的小鼠乳腺癌细胞株(EMT6/IL-12)。为应用pCDNA6-IL-12进行肿瘤生物治疗的I期临床研究奠定了基础。
成功地筛选出稳定表达rhIL-12的细胞系，为进行rhIL-12的中试生产和纯化铺平了道路，并为其进一步深入的功能研究和产业化开发奠定了基础。初步的安全性评价结果表明，其在实验小鼠体内应用具有较好的安全性。
具体实施方式：
本具体实施方式采用以下技术方案：pCDNA6-IL-12的构建：采用10个疏水的柔性氨基酸接头连接的方案获取rIL-12P40、P35融合基因，本构建策略不仅可保证P40、P35两亚基以1∶1比率表达，而且柔性氨基酸接头可使两个亚基充分延展、正确折叠，从而获得最大的生物学活性。融合基因插入真核表达质粒(pcDNA6/v5-hisp)，构建pCDNA6-IL-12；通过酶切、测序鉴定重组克隆。将pCDNA6-IL-12导入HEK293细胞，ELISA检测培养上清液中rhIL-12表达。
rh-IL-12体外生物学活性分析：应用特异性淋巴细胞增生实验、NK杀伤活性、细胞因子流式细胞(CFC)等方法对rhIL-12进行体外生物学活性分析。
pCDNA6-IL-12的基因佐剂功能研究：pCDNA6-IL-12与HCMV核酸疫苗(aden-pp65)在Bab/c小鼠体内共免疫。检测其对核酸疫苗的基因佐剂功能
应用pCDNA6-IL-12进行肿瘤基因治疗的研究：(1)以小鼠肉瘤细胞(S-180)在昆明种小鼠建立荷瘤模型，将pCDNA6-IL-12直接瘤体内注射。(2)将pCDNA6-IL-12转染小鼠乳腺癌细胞株EMT6，经筛选获得rhIL-12基因修饰的小鼠乳腺癌细胞株(EMT6/IL-12)；观察并检测其对肿瘤的基因治疗作用
rhIL-12稳定表达细胞系的筛选：将pCDNA6-IL-12转染CHO细胞；用Blasticidin筛选rhIL-12阳性表达克隆，并进行单克隆扩增、表达鉴定及表达稳定观察。
Claims (5)
1、重组人白细胞介素12真核表达载体的构建及其应用，其特征在于pCDNA6-IL-12的构建过程：采用10个疏水的柔性氨基酸接头连接的方案获取rIL-12 P40、P35融合基因，插入真核表达质粒(pcDNA6/v5-hisp)，构建重组rIL-12表达载体(pCDNA6-IL-12)；通过酶切、测序鉴定重组克隆。
2、根据权利要求1所述的重组人白细胞介素12真核表达载体的构建及其应用，其特征在于rh-IL-12体外生物学活性分析：应用特异性淋巴细胞增生实验、NK杀伤活性、细胞因子流式细胞(CFC)等方法对rhIL-12进行体外生物学活性分析。
3、根据权利要求1所述的重组人白细胞介素12真核表达载体的构建及其应用，其特征在于基因佐剂功能；pCDNA6-IL-12与HCMV核酸疫苗(aden-pp65)在Bab/c小鼠体内共免疫，能显著增强疫苗的免疫效果。
4、根据权利要求1所述的重组人白细胞介素12真核表达载体的构建及其应用，其特征在于肿瘤基因治疗作用：将pCDNA6-IL-12直接在实验小鼠肿瘤模型瘤体内注射或导入乳腺癌细胞内再致瘤，表现出抗肿瘤作用。
5、根据权利要求1所述的重组人白细胞介素12真核表达载体的构建及其应用，其特征在于rhIL-12稳定表达细胞系的建立：将pCDNA6-IL-12转染CHO细胞，用Blasticidin筛选出rhIL-12阳性表达克隆，获得稳定表达细胞系。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103555734A (zh) * | 2012-09-17 | 2014-02-05 | 青岛康立泰药业有限公司 | 人白细胞介素-12的编码基因、真核宿主细胞和表达方法 |
| CN103609519A (zh) * | 2013-11-12 | 2014-03-05 | 邓飞 | Balb/c小鼠间变性大细胞淋巴瘤动物模型的构建方法 |
| CN105251001A (zh) * | 2015-08-31 | 2016-01-20 | 华南农业大学 | 一种高效新城疫dna疫苗的分子佐剂及其制备方法和应用 |
| WO2017117890A1 (zh) * | 2016-01-04 | 2017-07-13 | 杨世成 | Il-12/cd107a融合蛋白及其制法和用途 |
| CN107266581A (zh) * | 2017-06-13 | 2017-10-20 | 四川大学 | 藏猪il‑12重组质粒增强pcv2疫苗免疫佐剂的制备方法及应用 |
| CN112442504A (zh) * | 2020-12-10 | 2021-03-05 | 电子科技大学 | 一种重组草鱼白介素-12活性蛋白的制备方法 |
| CN116970631A (zh) * | 2023-09-19 | 2023-10-31 | 江西赛基生物技术有限公司 | 一种重组蛋白的编码基因、载体、细胞及制备方法 |
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Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103555734A (zh) * | 2012-09-17 | 2014-02-05 | 青岛康立泰药业有限公司 | 人白细胞介素-12的编码基因、真核宿主细胞和表达方法 |
| CN103555734B (zh) * | 2012-09-17 | 2015-07-15 | 青岛康立泰药业有限公司 | 人白细胞介素-12的编码基因、真核宿主细胞和表达方法 |
| CN103609519A (zh) * | 2013-11-12 | 2014-03-05 | 邓飞 | Balb/c小鼠间变性大细胞淋巴瘤动物模型的构建方法 |
| CN103609519B (zh) * | 2013-11-12 | 2015-09-09 | 邓飞 | Balb/c小鼠间变性大细胞淋巴瘤动物模型的构建方法 |
| CN105251001A (zh) * | 2015-08-31 | 2016-01-20 | 华南农业大学 | 一种高效新城疫dna疫苗的分子佐剂及其制备方法和应用 |
| WO2017117890A1 (zh) * | 2016-01-04 | 2017-07-13 | 杨世成 | Il-12/cd107a融合蛋白及其制法和用途 |
| CN107266581A (zh) * | 2017-06-13 | 2017-10-20 | 四川大学 | 藏猪il‑12重组质粒增强pcv2疫苗免疫佐剂的制备方法及应用 |
| CN107266581B (zh) * | 2017-06-13 | 2021-07-09 | 四川大学 | 藏猪il-12重组质粒增强pcv2疫苗免疫佐剂的制备方法及应用 |
| CN112442504A (zh) * | 2020-12-10 | 2021-03-05 | 电子科技大学 | 一种重组草鱼白介素-12活性蛋白的制备方法 |
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