CN105251001A - 一种高效新城疫dna疫苗的分子佐剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂及其制备方法和应用，属于疫苗技术领域。所述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂为将鸡白细胞介素12的构建到真核表达载体pCAGGS中，获得重组鸡白细胞介素12的真核表达载体pCAGGS-IL12。本发明成功地构建了重组鸡白细胞介素12的单链双亚基真核表达质粒，不仅可保证P40、P35两亚基以1∶1比率表达，而且柔性氨基酸接头可使两个亚基充分延展、正确折叠，从而获得最大的生物学活性。pCAGGS-IL12与pCAGGS-F核酸疫苗通过电穿孔方法在SPF鸡体内共免疫，可显著增强核酸疫苗的免疫效果，发挥理想的基因佐剂功能。
Description
技术领域
本发明属于疫苗技术领域，特别涉及一种高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂及其制备方法和应用。
背景技术
新城疫是由新城疫病毒引起的禽类的急性、高度接触性传染病，免疫预防新城疫一直应用灭活疫苗或者弱毒苗，但是灭活疫苗免疫保护期短，而弱毒苗免疫保护效果好，但存在潜在毒力返强及与野毒基因重组的危险，因此，对DNA疫苗的研究越来越多。F基因是NDV的主要毒力因子与保护性抗原，但是，根据文章表明，单独的F基因构建的DNA疫苗通过普通的肌肉注射，是达不到理想保护效率，因此，对分子佐剂和免疫途径则需要进行进一步的探索。IL-12是一种由的异源二聚体蛋白组成的细胞因子，编码IL-12两个亚基(p35、p40)的基因位于不同的染色体上，二者分别合成后再通过亚基间二硫键结合成具有生物学活性的二聚体分子(p70)。单独的亚基不具有生物学作用，IL-12能够促进T淋巴细胞、NK细胞的分化与增殖，调控细胞免疫，提高NK/LAK细胞的杀伤功能和特异性CTL细胞的应答能力，诱导γ干扰素的产生；因此，选择IL12作为佐剂能够增强核酸疫苗的免疫效果。此外，电穿孔是功能强大的将核酸、蛋白及其它分子导入多种细胞的高效技术。通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子。与普通的肌肉注射相比，电穿孔能有效的减免DNA疫苗在进入细胞过程中的损失，提高了疫苗的表达效率，有效地减少了剂量，提高免疫效果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂。所述的分子佐剂为重组鸡白细胞介素12(rhIL-12)真核表达载体，所述的rIL-12真核表达载体(pCAGGS-IL12)与DNA疫苗共同通过电穿孔的方法免疫动物，发挥分子佐剂的作用。rIL-12佐剂能够克服新城疫DNA疫苗研究中保护率较低的困难，提供一种有效的DNA疫苗佐剂及一种高效率的免疫途径。
本发明的另一目的在于提供上述分子佐剂的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述分子佐剂的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂，为重组鸡白细胞介素12(rhIL-12)的真核表达载体pCAGGS-IL12。
所述的重组鸡白细胞介素12通过下述的四对引物扩增的获得：
IL12亚单位P40的扩增引物对：
IL12-p40-F1：ATGTCTCAGCTGCTCTTTGCCCTAC；
IL12-p40-R1：TTATCTACAGAGCTTGGACCACTC；
IL12亚单位P35的扩增引物对：
IL12-p35-F1：ATGGCTGAGCAGGGCATAGGCATC；
IL12-p35-R1：TTAGATCTCAGCAGTCAGGGCAC；
IL12亚单位P40的拼接引物对：
IL12-p40-F2：CGGAATTCGCCACCATGTCTCAGCTGCTCTTTGCCCTAC；
IL12-p40-R2：TCCGCTACCGCCTCCACCAGAGCCTCCTCCACCTCTACAGAGCTTGGACCACTC；
IL12亚单位P35的拼接引物对：
IL-12-p35-F:GGTGGAGGCGGTAGCGGAGGCGGAGGGTCGGCTGAGCAGGGCATAGGC；
IL-12-p35-R2：CCCTCGAGTTAGATCTCAGCAGTCAGGGCAC。
上述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂的制备方法为：
采用(G4S)3疏水的柔性氨基酸接头连接的方案获取rIL-12的P40、P35融合基因，融合基因插入真核表达质粒pCAGGS，构建pCAGGS-IL12。上述载体的构建方法不仅可保证P40、P35两亚基以1∶1比率表达，而且柔性氨基酸接头可使两个亚基充分延展、正确折叠，从而获得最大的生物学活性。
上述的采用(G4S)3疏水的柔性氨基酸接头连接的方案获取rIL-12的P40、P35融合基因的制备方法，包括以下步骤：
(1)首先单独设计引物分别扩增IL12亚单位P40和P35，获得IL12亚单位P40和P35基因片段，其中IL12亚单位P40的扩增引物对序列如下：
IL12-p40-F1：ATGTCTCAGCTGCTCTTTGCCCTAC；
IL12-p40-R1：TTATCTACAGAGCTTGGACCACTC；
IL12亚单位P35的扩增引物对序列如下：
IL12-p35-F1：ATGGCTGAGCAGGGCATAGGCATC；
IL12-p35-R1：TTAGATCTCAGCAGTCAGGGCAC；
(2)以步骤(1)扩增获得IL12亚单位P40和P35基因片段为模板，用含酶切位点和互补的linker(G4S)3的连接引物去扩增，获得IL12亚单位P40和P35基因的拼接片段，上游目的基因P40去掉终止密码子TTA，下游目的基因P35去掉起始密码子ATG，所述的连接引物如下：
其中，IL12亚单位P40的拼接引物对序列如下：
IL12-p40-F2：CGGAATTCGCCACCATGTCTCAGCTGCTCTTTGCCCTAC；
IL12-p40-R2：TCCGCTACCGCCTCCACCAGAGCCTCCTCCACCTCTACAGAGCTTGGACCACTC；
IL12亚单位P35的拼接引物对序列如下：
IL-12-p35-F2：GGTGGAGGCGGTAGCGGAGGCGGAGGGTCGGCTGAGCAGGGCATAGGC；
IL-12-p35-R2：CCCTCGAGTTAGATCTCAGCAGTCAGGGCAC；
(3)再次分别以步骤(2)胶回收获得的拼接片段产物按照总量1:1的比例，加入Taq酶和dNTPs，PCRbuffer，进行第一轮PCR反应，循环数为8～12；第一轮PCR反应后取出2μL反应混合物作为模板，以IL12-p40-F2和IL-12-p35-R2为模版，进行第二轮PCR，循环数28～35；产物回收，送测序鉴定正确后获得采用(G4S)3疏水的柔性氨基酸接头连接的方案获取rIL-12的P40、P35融合基因。
上述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂的应用，具体体现在将重组鸡白细胞介素12(rhIL-12)真核表达载体与新城疫DNA疫苗共同通过电穿孔的方法免疫动物，重组鸡白细胞介素12(rhIL-12)真核表达载体发挥分子佐剂的作用。
pCAGGS-IL12的基因佐剂功能研究：pCAGGS-IL12与pCAGGS-F核酸疫苗通过电穿孔方法在SPF鸡体内共免疫。检测其对核酸疫苗的基因佐剂功能。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明成功地构建了重组鸡白细胞介素12的单链双亚基真核表达质粒(pCAGGS-IL12)，不仅可保证P40、P35两亚基以1∶1比率表达，而且柔性氨基酸接头可使两个亚基充分延展、正确折叠，从而获得最大的生物学活性。pCAGGS-IL12与pCAGGS-F核酸疫苗通过电穿孔方法在SPF鸡体内共免疫，可显著增强核酸疫苗的免疫效果，发挥理想的基因佐剂功能。本发明中rIL-12佐剂能够克服新城疫DNA疫苗研究中保护率较低的困难，提供一种有效的DNA疫苗佐剂及一种高效率的免疫途径。电穿孔方法减免DNA疫苗在进入细胞过程中的损失，提高了疫苗的表达效率，减少了疫苗有效使用量，经济实用。
附图说明
图1为实施例1中PCR检测的结果图；其中图1：M：MarkerDL:2000，1-13:pCAGGS-IL12菌液PCR；14：PCR阴性对照。
图2为间接免疫荧光结果检测的结果图；其中：A为pCAGGS-IL12转染，B为空载体pCAGGS转染。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1.实验所用主要材料和试剂：本发明使用的真核表达载体为pCAGGS。鸡白细胞介素12基因由脾脏扩得。P40、P35两个亚基由linker(G4S)3连接，本连接不仅可保证P40、P35两亚基以1∶1比率表达，而且柔性氨基酸接头可使两个亚基充分延展、正确折叠，从而获得最大的生物学活性。使用的限制性内切酶EcoR1、Xho1，T4DNA连接酶、ExTaq酶、预混RTaq等均为普通试剂。
2.扩增引物设计：引物的设计及合成是根据国内外已在GenBank中登录的鸡白细胞介素12基因序列经多重比较后设计。在启动子前，酶切位点之后加入Kozak序列“GCCACC”；根据真核表达载体pCAGGS上的酶切位点，上游引物设计并加上EcoR1酶切位点；下游引物设计在基因末端，并加上Xho1酶切位点。
所述的重组鸡白细胞介素12通过下述的四对引物扩增的获得：
IL12亚单位P40的扩增引物对：
IL12-p40-F1：ATGTCTCAGCTGCTCTTTGCCCTAC；
IL12-p40-R1：TTATCTACAGAGCTTGGACCACTC；
IL12亚单位P35的扩增引物对：
IL12-p35-F1：ATGGCTGAGCAGGGCATAGGCATC；
IL12-p35-R1：TTAGATCTCAGCAGTCAGGGCAC；
IL12亚单位P40的拼接引物对：
IL12-p40-F2：CGGAATTCGCCACCATGTCTCAGCTGCTCTTTGCCCTAC；
IL12-p40-R2：
TCCGCTACCGCCTCCACCAGAGCCTCCTCCACCTCTACAGAGCTTGGACCACTC；
IL12亚单位P35的拼接引物对：
IL-12-p35-F2：
GGTGGAGGCGGTAGCGGAGGCGGAGGGTCGGCTGAGCAGGGCATAGGC；
IL-12-p35-R2：CCCTCGAGTTAGATCTCAGCAGTCAGGGCAC。
3.鸡白细胞介素12基因片段的扩增：鸡白细胞介素12基因的PCR获取，研磨脾脏，提取RNA，反转为cDNA，以cDNA为模板，加入ExTaqDNA聚合酶、引物、dNTP进行扩增反应。
PCR的反应体系为：，4×dNTPmix(2.5mmol/L)4μL，上、下游引物(20μmol/L)各1μL，cDNA1.5μL，ddH2O41.5μL，ExTaq酶1μL。
PCR反应参数为：94℃处理4min，然后94℃30s、55℃30s、72℃2min，共35个循环，72℃延伸10min。PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶电泳观察，可分别见约950bp和650bp40和ILp35的扩增条带，融合后可见大小与预期的结果(目标长度1605bp)一致的IL12条带，初步确定扩增片段的正确性。
4.鸡白细胞介素12基因克隆入pMD-19TVector：将鸡白细胞介素12基因的PCR产物用Omega胶回收试剂盒进行胶回收。鸡白细胞介素12基因的PCR纯化产物连接入pMD-19TVector，载体连接反应体系为：LigationSolutionⅠ5μL、PCR纯化产物4.5μL、pMD-19TVector1μL；16℃连接过夜，将连接产物转化DH5a感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养；挑选单个菌落，进行PCR鉴定，并抽提质粒，送测序鉴定。
对测序正确的pMD-19T-IL12的质粒进行双酶切处理，同时，对pCAGGS载体以同样的酶切位点进行双酶切，胶回收1.6kb左右DNA片段和质粒，以IL12：pCAGGS为1:3-1：10的比例，两个总体积为8μL，再加入10xT4DNALigasebuffer1μL，T4DNA连接酶1μL至总体积为10μL，16℃连接18小时。将连接产物转化DH5a感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养。
5.在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个菌落，菌落进行PCR、质粒双酶切鉴定。菌落PCR的反应体系为：上、下游引物(20μmol/L)各0.2μL，菌液1.2μL，ddH2O8.4μL，RTaq10μL。反应参数为：94℃处理4min，然后94℃30s、55℃30s、72℃2min，共30个循环，72℃延伸10min。PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶电泳观察，可见约为1.6kb的扩增条带，检测结果如图1所示。将鸡白细胞介素12基因真核表达质粒pCAGGS-IL12分别用EcoR1、Xho1进行双酶切，酶切产物在1％琼脂糖凝胶电泳观察，pCAGGS-IL12双酶切后产生约为4.8kb和1.6kb左右的两条带，证明已经成功构建了鸡白细胞介素12基因真核表达质粒，并送测序鉴定，命名测序正确的质粒为pCAGGS-IL12。
6.鸡白细胞介素12基因真核质粒pCAGGS-IL12的表达。在100ml的三角瓶中加入40mL含氨苄LB培养基，加入100μL的上述菌液，37℃，230rpm/min，培养14h。同时，对空载体也进行摇菌，用MN去内毒质粒抽提盒，抽提的质粒用Lipofectamine3000转染293T细胞，通过westernblot、间接免疫荧光鉴定其表达，间接免疫荧光鉴定其表达见图2所示(为pCAGGS-IL12转染到293T细胞，用抗鸡IL12的抗体，通过间接免疫荧光来验证IL12的表达)。鉴定表达后，对质粒进行大提，质粒浓度为1mg/ml，即为鸡白细胞介素12基因分子佐剂pCAGGS-IL12。该分子佐剂与DNA疫苗用上海塔瑞莎公司的活体基因导入仪的方法进行预防接种。
7.用该分子佐剂与构建的新城疫含F基因的质粒(pCAGGS-F)联合应用(所述的F基因核苷酸序列见SeqIDNO：9)，该分子佐剂与DNA疫苗用上海塔瑞莎公司的活体基因导入仪的方法进行预防接种。pCAGGS-IL12与pCAGGS-F在鸡体内应用的初步安全性评价：pCAGGS-IL12与pCAGGS-F在鸡体内大剂量应用(肌肉注射，1:1，各200μg)。观察其体温、体重、一般状况等，结果显示，体温为40-42℃，体重与对照组(未做任何处理组)无明显差别，均在上升。精神状态良好，无异常反应。进一步分析pCAGGS-IL12作为佐剂的作用，将14日龄健康SPF雏鸡，随机分成5个组，每组10只，分别用PBS液(0.2ml)、pCAGGS、pCAGGS-F(100μg)、pCAGGS-F+pCAGGS-IL12(100μg+100μg)、pCAGGS-IL12(100μg)腿部肌肉电穿孔注射进行免疫，于14日龄、28日龄、42日龄进行免疫，每周进行翅静脉釆血，分离血清，监测抗体水平，于三免后14天用NDV强毒进行攻毒保护实验。测定结果发现，在免疫后加pCAGGS-IL12佐剂组鸡血清总IgG值二免后第7天起就一直高于DNA疫苗单独注射组。攻毒结果显示PBS对照组和pCAGGS对照组死亡率为100％，pCAGGS-IL12死亡率为100％。pCAGGS-F死亡率为30％，pCAGGS-IL12+pCAGGS-F疫苗组死亡率为0％，pCAGGS-IL12与pCAGGS-F核酸疫苗在SPF体内共免疫，可显著增强核酸疫苗的免疫效果，发挥理想的基因佐剂功能。但需要进一步对免疫剂量及电穿孔参数进行改善，为IL-12作为佐剂的研究奠定了基础。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂，其特征在于：所述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂为将鸡白细胞介素12的构建到真核表达载体pCAGGS中，获得重组鸡白细胞介素12的真核表达载体pCAGGS-IL12。
2.根据权利要求1所述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂，其特征在于：所述的重组鸡白细胞介素12通过下述的四对引物扩增的获得：
IL12亚单位P40的扩增引物对：
IL12-p40-F1：SEQIDNO：1；
IL12-p40-R1：SEQIDNO：2；
IL12亚单位P35的扩增引物对：
IL12-p35-F1：SEQIDNO：3；
IL12-p35-R1：SEQIDNO：4；
IL12亚单位P40的拼接引物对：
IL12-p40-F2：SEQIDNO：5；
IL12-p40-R2：SEQIDNO：6；
IL12亚单位P35的拼接引物对：
IL-12-p35-F2：SEQIDNO：7；
IL-12-p35-R2：SEQIDNO：8。
3.权利要求1或2所述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂的制备方法，其特征在于：上述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂的制备方法为：采用(G4S)3疏水的柔性氨基酸接头连接的方案获取rIL-12的P40、P35融合基因，融合基因插入真核表达质粒pCAGGS，构建pCAGGS-IL12。
4.根据权利要求3所述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂的制备方法，其特征在于：所述的采用(G4S)3疏水的柔性氨基酸接头连接的方案获取rIL-12的P40、P35融合基因的制备方法，包括以下步骤：
(1)首先单独设计引物分别扩增IL12亚单位P40和P35，获得IL12亚单位P40和P35基因片段，其中IL12亚单位P40的扩增引物对序列如下：
IL12-p40-F1：SEQIDNO：1；
IL12-p40-R1：SEQIDNO：2；
IL12亚单位P35的扩增引物对序列如下：
IL12-p35-F1：SEQIDNO：3；
IL12-p35-R1：SEQIDNO：4；
(2)以步骤(1)扩增获得IL12亚单位P40和P35基因片段为模板，用含酶切位点和互补的linker(G4S)3的连接引物去扩增，获得IL12亚单位P40和P35基因的拼接片段，上游目的基因P40去掉终止密码子TTA，下游目的基因P35去掉起始密码子ATG，所述的连接引物如下：
其中，IL12亚单位P40的拼接引物对序列如下：
IL12-p40-F2：SEQIDNO：5；
IL12-p40-R2：SEQIDNO：6；
IL12亚单位P35的拼接引物对序列如下：
IL-12-p35-F2：SEQIDNO：7；
IL-12-p35-R2：SEQIDNO：8；
(3)再次分别以步骤(2)胶回收获得的拼接片段产物按照总量1:1的比例，加入Taq酶和dNTPs，PCRbuffer，进行第一轮PCR反应，循环数为8～12；第一轮PCR反应后取出2μL反应混合物作为模板，以IL12-p40-F2和IL-12-p35-R2为模版，进行第二轮PCR，循环数28～35；产物回收，送测序鉴定正确后获得采用(G4S)3疏水的柔性氨基酸接头连接的方案获取rIL-12的P40、P35融合基因。
5.权利要求1或2所述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂的应用，其特征在于：将重组鸡白细胞介素12真核表达载体与新城疫DNA疫苗共同通过电穿孔的方法免疫动物，重组鸡白细胞介素12真核表达载体发挥分子佐剂的作用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160120 |