JP6861637B2 - グロビン遺伝子クラスターの制御エレメントを含む真核性の発現ベクター - Google Patents
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Description
本発明は目的のタンパク質の生産収量を向上させるために使用され得る新規の発現カセットに関する。発現カセットは、ヒトグロビン遺伝子クラスターの発現調節エレメント、特にヒトAγグロビンのプロモーターおよびヒトβ−グロビンまたはα−グロビン遺伝子クラスターの遺伝子座制御領域を含む。特に、本発明は、そのようなグロビン発現調節エレメントを含む発現カセットを提供する。
組み換えタンパク質の生産は、今日の生物工学的産業の主要な側面である。これは、大量の高品質なタンパク質を要求する適用の数が市場で増加するにつれて、ますます重要性を増している。食糧生産および特に薬理学は、組み換えタンパク質に対する要求が着実に増加している2つの主要な領域である。最終産物のより高い生産効率およびその結果的としてのより低い費用が、商業的に実行可能なプロセスを取得するために要求されている。
(a)互いに機能的に連結して、
(i)ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターまたはヒトα−グロビン遺伝子クラスターの遺伝子座制御領域の少なくとも機能的部分を含む遺伝子座制御領域;
(ii)ヒトAγグロビン遺伝子のプロモーターの少なくとも機能的部分を含むプロモーター領域;および
(iii)該目的のポリペプチドをコードする核酸配列を含むコード領域
を含む発現カセットを含む宿主細胞を提供する工程と;
(b)該宿主細胞が該目的のポリペプチドを発現する条件の下で該宿主細胞を培養する工程と;
(c)該目的のポリペプチドを単離する工程と
を含む方法を提供する。
(i)ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターまたはヒトα−グロビン遺伝子クラスターの遺伝子座制御領域の少なくとも機能的部分を含む遺伝子座制御領域;
(ii)ヒトAγグロビン遺伝子のプロモーターの少なくとも機能的部分を含むプロモーター領域;
(iii)必要に応じてコード領域;
(iv)転写終結領域;および
(v)ヒトAγグロビン遺伝子の3’エンハンサーの少なくとも機能的部分を含むエンハンサー領域;
を含み、ヒトAγグロビン全体をコードする核酸配列を含まない、発現カセットを提供する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
目的のポリペプチドを組み換えによって生産するための方法であって、
(a)互いに機能的に連結して、
(i)ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターまたはヒトα−グロビン遺伝子クラスターの遺伝子座制御領域の少なくとも機能的部分を含む遺伝子座制御領域;
(ii)ヒト A γグロビン遺伝子のプロモーターの少なくとも機能的部分またはそのホモログを含むプロモーター領域;および
(iii)該目的のポリペプチドをコードする核酸配列を含むコード領域
を含む発現カセットを含む宿主細胞を提供する工程と;
(b)該宿主細胞が該目的のポリペプチドを発現する条件の下で該宿主細胞を培養する工程と;
(c)該目的のポリペプチドを単離する工程と
を含む方法。
(項目2)
前記発現カセットの前記コード領域が、分泌発現のためのシグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含み、工程(b)で、前記目的のポリペプチドが前記宿主細胞によって分泌される、項目1に記載の方法。
(項目3)
工程(c)の後に、
(d)医薬組成物として前記目的のポリペプチドを製剤化する工程
をさらに含む、項目1または項目2に記載の方法。
(項目4)
前記発現カセットの前記遺伝子座制御領域が、好ましくは配列番号1の906位〜939位の核酸配列を有する、ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターのDNアーゼI過敏性部位2(HS2)のコアエレメントを含む、項目1から項目3までのいずれか1項に記載の方法。
(項目5)
前記発現カセットの前記遺伝子座制御領域が、好ましくは配列番号1の742位〜995位の核酸配列を有する、ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターのDNアーゼI過敏性部位2(HS2)のM1−コア−M2エレメントを含む、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記発現カセットの前記遺伝子座制御領域が、配列番号1の741位〜1109位の核酸配列を含む、ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターの過敏性部位2(HS2)の少なくとも部分を含む、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記発現カセットの前記遺伝子座制御領域が、好ましくは配列番号1の310位〜735位の核酸配列を有する、ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターの過敏性部位3(HS3)もしくはそれの部分、および/または好ましくは配列番号1の13位〜294位の核酸配列を有する、ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターの過敏性部位4(HS4)もしくはそれの部分を含む、項目4から項目6までのいずれか1項に記載の方法。
(項目8)
前記発現カセットの前記遺伝子座制御領域が、好ましくは配列番号5の24位〜278位の核酸配列を有する、ヒトα−グロビン遺伝子クラスターの過敏性部位40(HS40)またはそれの部分を含む、項目1から項目3までのいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
前記発現カセットの前記プロモーター領域が、前記ヒト A γグロビン遺伝子の転写開始部位および必要に応じて5’非翻訳領域の少なくとも部分を含む、項目1から項目8までのいずれか1項に記載の方法。
(項目10)
前記発現カセットの前記プロモーター領域が、前記ヒト A γグロビン遺伝子の前記転写開始部位に照らして−384〜+36のヌクレオチド、および/または配列番号1の1123位〜1542位の核酸配列を含む、項目1から項目9までのいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
前記発現カセットが転写終結領域をさらに含む、項目1から項目10までのいずれか1項に記載の方法。
(項目12)
前記転写終結領域が、好ましくは配列番号1の1725位〜1730位の核酸配列を含む、ポリアデニル化シグナル、および転写終結部位を含む、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記発現カセットが、前記発現カセットの他のエレメントに機能的に連結した、前記ヒト A γグロビン遺伝子の3’エンハンサーの少なくとも機能的部分を含むエンハンサー領域をさらに含む、項目1から項目12までのいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
前記発現カセットの前記エンハンサー領域が配列番号1の2136位〜2881位の核酸配列を含む、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記目的のポリペプチドが糖タンパク質またはそれの部分である、項目1から項目14までのいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
前記目的のポリペプチドが、抗体の重鎖または軽鎖を含む抗体またはそれの誘導体もしくは部分;ゴナドトロピン、例えばFSH(濾胞刺激ホルモン)、CG(絨毛ゴナドトロピン)、LH(黄体形成ホルモン)およびTSH(甲状腺刺激ホルモン);エリスロポエチン;ならびに第VII因子、第VIII因子、第IX因子またはフォンウィルブランド因子などの血液凝固因子からなる群から選択される、項目1から項目15までのいずれか1項に記載の方法。
(項目17)
前記発現カセットが前記宿主細胞に安定的にトランスフェクトされる、項目1から項目16までのいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
前記宿主細胞に、前記発現カセットおよび選択マーカー遺伝子、好ましくは増幅可能な選択マーカー遺伝子を含むベクターがトランスフェクトされており、工程(b)の培養条件が、細胞培養培地中の対応する選択薬剤の存在を含む、項目1から項目17までのいずれか1項に記載の方法。
(項目19)
前記選択マーカー遺伝子が、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、好ましくは抗葉酸剤耐性DHFRバリアントをコードし、前記対応する選択薬剤が、抗葉酸剤、好ましくはメトトレキセートである、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記宿主細胞が、真核細胞、好ましくは哺乳類細胞、より好ましくはヒト細胞、またはそれに由来する細胞である、項目1から項目19までのいずれか1項に記載の方法。
(項目21)
前記宿主細胞が、血液細胞、好ましくは白血球、血液前駆細胞または白血病細胞、またはそれに由来する細胞である、項目1から項目20までのいずれか1項に記載の方法。
(項目22)
互いに機能的に連結した、
(i)ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターまたはヒトα−グロビン遺伝子クラスターの遺伝子座制御領域の少なくとも機能的部分を含む遺伝子座制御領域;
(ii)ヒト A γグロビン遺伝子のプロモーターの少なくとも機能的部分を含むプロモーター領域;
(iii)必要に応じてコード領域;
(iv)転写終結領域;および
(v)ヒト A γグロビン遺伝子の3’エンハンサーの少なくとも機能的部分を含むエンハンサー領域;
を含み、ヒト A γグロビン全体をコードする核酸配列を含まない、発現カセット。
(項目23)
前記遺伝子座制御領域が、好ましくは配列番号1の906位〜939位の核酸配列を有する、ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターのDNアーゼI過敏性部位2(HS2)のコアエレメントを含む、項目22に記載の発現カセット。
(項目24)
前記遺伝子座制御領域が、好ましくは配列番号1の742位〜995位の核酸配列を有する、ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターのDNアーゼI過敏性部位2(HS2)のM1−コア−M2エレメントを含む、項目23に記載の発現カセット。
(項目25)
前記遺伝子座制御領域が、配列番号1の741位〜1109位の核酸配列を含む、ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターの過敏性部位2(HS2)の少なくとも部分を含む、項目24に記載の発現カセット。
(項目26)
前記遺伝子座制御領域が、好ましくは配列番号1の310位〜735位の核酸配列を有する、ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターの過敏性部位3(HS3)もしくはそれの部分、および/または好ましくは配列番号1の13位〜294位の核酸配列を有する、ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターの過敏性部位4(HS4)もしくはそれの部分を含む、項目23から項目25までのいずれか1項に記載の発現カセット。
(項目27)
前記遺伝子座制御領域が、好ましくは配列番号5の24位〜278位の核酸配列を有する、ヒトα−グロビン遺伝子クラスターの過敏性部位40(HS40)またはそれの部分を含む、項目22に記載の発現カセット。
(項目28)
前記プロモーター領域が、前記ヒト A γグロビン遺伝子の転写開始部位および必要に応じて5’非翻訳領域の少なくとも部分を含む、項目22から項目27までのいずれか1項に記載の発現カセット。
(項目29)
前記プロモーター領域が、前記ヒト A γグロビン遺伝子の前記転写開始部位に照らして−384〜+36のヌクレオチド、および/または配列番号1の1123位〜1542位の核酸配列を含む、項目22から項目28までのいずれか1項に記載の発現カセット。
(項目30)
前記転写終結領域が、好ましくは配列番号1の1725位〜1730位の核酸配列を含む、ポリアデニル化シグナル、および転写終結部位を含む、項目22から項目29までのいずれか1項に記載の発現カセット。
(項目31)
前記エンハンサー領域が配列番号1の2136位〜2881位の核酸配列を含む、項目22から項目30までのいずれか1項に記載の発現カセット。
(項目32)
制限酵素の少なくとも1つの認識配列を含むクローニング部位をさらに含む、項目22から項目31までのいずれか1項に記載の発現カセット。
(項目33)
前記コード領域が目的のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、項目22から項目32までのいずれか1項に記載の発現カセット。
(項目34)
前記目的のポリペプチドが糖タンパク質またはそれの部分である、項目33に記載の発現カセット。
(項目35)
前記目的のポリペプチドが、抗体、抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはそれの部分である、項目33または項目34に記載の発現カセット。
(項目36)
前記コード領域が分泌発現のためのシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む、項目22から項目35までのいずれか1項に記載の発現カセット。
(項目37)
転写の方向において、互いに機能的に連結して、
(i)前記遺伝子座制御領域と、
(ii)前記プロモーター領域と、
(iii)前記コード領域および/またはクローニング部位と、
(iv)前記転写終結領域と、
(v)前記エンハンサー領域と、
を含む、項目22から項目36までのいずれか1項に記載の発現カセット。
(項目38)
真核細胞、好ましくは哺乳類細胞、より好ましくはヒト細胞における発現のために適応させられている、項目22から項目37までのいずれか1項に記載の発現カセット。
(項目39)
項目22から項目38までのいずれか1項に記載の発現カセットを含むベクター。
(項目40)
1つまたはそれより多くの選択マーカー遺伝子をさらに含む、項目39に記載のベクター。
(項目41)
真核細胞への安定的トランスフェクションのために適応させられている、項目39または項目40に記載のベクター。
(項目42)
項目22から38のいずれか1項に記載の発現カセットまたは項目39から項目41までのいずれか1項に記載のベクターを含む宿主細胞。
(項目43)
真核細胞、好ましくは哺乳類細胞、より好ましくはヒト細胞、またはそれに由来する細胞である、項目42に記載の宿主細胞。
(項目44)
血液細胞、好ましくは白血球、血液前駆細胞もしくは白血病細胞、またはそれに由来する細胞である、項目42または項目43に記載の宿主細胞。
(項目45)
項目1から項目21までのいずれか1項に記載の方法における、項目22から項目38までのいずれか1項に記載の発現カセットまたは項目42から項目44までのいずれか1項に記載の宿主細胞の使用。
(項目46)
前記発現カセットが項目22から項目38までのいずれか1項に記載の発現カセットであり、かつ/または前記宿主細胞が項目42から項目44までのいずれか1項に記載の宿主細胞である、項目1から項目21までのいずれか1項に記載の方法。
本明細書中で使用されるとき、以下の表現は、それらが使用される文脈がそうではないと示す範囲以外では、以下で説明される通りの意味を好ましくは有することが概して意図されている。
ヒトAγグロビンプロモーター
遺伝子座制御領域
コード領域
クローニング部位
転写終結領域
エンハンサー領域
一つの局面において、本発明は、本発明に従う発現カセットを含むベクターに関する。このベクターは、宿主細胞の中にこの発現カセットを移入させるのに適した任意のベクターであり得る。それぞれのベクターは当技術分野において公知である。特に、このベクターは、真核細胞、例えば哺乳類細胞、特にヒト細胞、の中への移入のために適応させられる。
選択マーカー遺伝子
さらなる局面において、本発明は、本発明に従う発現カセットまたは本発明に従うベクターを含む宿主細胞を提供する。この宿主細胞は、この発現カセットまたはベクターを用いるトランスフェクションのために適しており、そして特に、目的のポリペプチドの生産のために適した任意の細胞であり得る。特定の実施形態では、この宿主細胞は、確立された発現細胞株に由来する。この宿主細胞は、特に、真核細胞、例えば哺乳類細胞、特にヒト細胞、またはそれに由来する細胞である。特に、宿主細胞は、血液細胞、例えば白血球、血液前駆細胞または白血病細胞、またはそれに由来する細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は白血球起源の細胞である。
さらなる局面によると、本発明は、目的のポリペプチドを組み換えによって生産するための方法であって、
(a)互いに機能的に連結して、
(i)ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターまたはヒトα−グロビン遺伝子クラスターの遺伝子座制御領域の少なくとも機能的部分を含む遺伝子座制御領域;
(ii)ヒトAγグロビン遺伝子のプロモーターの少なくとも機能的部分を含むプロモーター領域;および
(iii)該目的のポリペプチドをコードする核酸配列を含むコード領域
を含む発現カセットを含む宿主細胞を提供する工程と;
(b)該宿主細胞が該目的のポリペプチドを発現する条件の下で該宿主細胞を培養する工程と;
(c)該目的のポリペプチドを単離する工程と
を含む方法を提供する。
(d)医薬組成物として目的のポリペプチドを製剤化する工程をさらに含む。
グロビンベクターの構築のために、親ベクター(例えば、選択マーカーとしてピューロマイシンもしくはネオマイシン耐性遺伝子またはdhfr遺伝子を有するpEF)のエンハンサーおよびプロモーター領域を取り除いた。ヒトAγグロビンプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよび3’エンハンサー領域およびヒトグロビン遺伝子クラスターの遺伝子座制御領域の異なる構築物を合成し、適当な部位でベクターの中にクローニングした。図2は、構築されたベクターの発現カセットの例示的構築物を示す。次に、目的のポリペプチドをコードする核酸配列をクローニング部位に導入した。
一過性トランスフェクションは、製造業者の説明書に従ってLipofectamine(登録商標)LTXおよびPlus(商標)試薬で実行した。簡潔には、それらの対数増殖期の間に2×105個の細胞を6ウェルプレートに播種した。プラスミドDNAを、Opti−MEM I還元血清培地およびPlus(商標)試薬に希釈した。インキュベーション時間(15分間)の後、Lipofectamine(登録商標)LTXを溶液に添加した。さらなるインキュベーション(30分間)の後、混合物を細胞懸濁液に滴下した。72時間後に、発現をELISAによって解析した。ベクターpEFdhfrmut(−)と比較して、より高いタンパク質力価がベクターpHBG1Cdhfr、pHBG1DdhfrおよびpHBG1Edhfrによって達成された(図3)。
細胞株NM−H9D8のトランスフェクションは、製造業者の説明書に従って抗体の重鎖および軽鎖をそれぞれコードする2つの発現プラスミド(両方とも直鎖状)のプラスミドDNAを使用して、ヌクレオフェクション(Nucleofector(商標)技術、Amaxa)によって実行した。抗体産生プールの選択および増幅のために、メトトレキセートおよびピューロマイシンを漸増濃度で添加し、活性な抗体分子の分泌についてプールをスクリーニングした。
細胞株DSM ACC 2606およびDSM ACC 2605は、2003年8月14日にNemod Biotherapeutics GmbH & Co.KG,Robert−Roessle−Str.10,13125 Berlin(DE)によってDSMZ−Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg 1b,38124 Braunschweig(DE)に寄託された。これらはNemod Biotherapeutics GmbH & Co.KGからGlycotope GmbHへ譲渡されている期間であったので、グリコトープはこれらの生物学的材料を参照する権利を与えられていた。
Claims (53)
- 目的のポリペプチドを組み換えによって生産するための方法であって、
(a)互いに機能的に連結して、
(i)ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターのDNアーゼI過敏性部位2(HS2)のコアエレメントを少なくとも含む遺伝子座制御領域;
(ii)ヒトAγグロビン遺伝子のプロモーターの少なくとも機能的部分またはそのホモログを含むプロモーター領域;および
(iii)該目的のポリペプチドをコードする核酸配列を含むコード領域
を含む発現カセットを含む宿主細胞を提供する工程と;
(b)該宿主細胞が該目的のポリペプチドを発現する条件の下で該宿主細胞を培養する工程と;
(c)該目的のポリペプチドを単離する工程と
を含む方法。 - 前記発現カセットの前記コード領域が、分泌発現のためのシグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含み、工程(b)で、前記目的のポリペプチドが前記宿主細胞によって分泌される、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)の後に、
(d)医薬組成物として前記目的のポリペプチドを製剤化する工程
をさらに含む、請求項1または請求項2に記載の方法。 - 前記ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターのDNアーゼI過敏性部位2(HS2)のコアエレメントが、配列番号1の906位〜939位の核酸配列を有する、請求項1から請求項3までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記発現カセットの前記遺伝子座制御領域が、ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターのDNアーゼI過敏性部位2(HS2)のM1−コア−M2エレメントを含む、請求項1から請求項3までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記発現カセットの前記遺伝子座制御領域が、配列番号1の741位〜1109位の核酸配列を含む、ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターの過敏性部位2(HS2)の少なくとも部分を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記発現カセットの前記遺伝子座制御領域が、ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターの過敏性部位3(HS3)もしくはそれの部分、および/またはヒトβ−グロビン遺伝子クラスターの過敏性部位4(HS4)もしくはそれの部分を含む、請求項1から請求項6までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記発現カセットの前記プロモーター領域が、転写開始部位を含む、請求項1から請求項7までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記発現カセットの前記プロモーター領域が、前記ヒトAγグロビン遺伝子の前記転写開始部位に照らして−384〜+36のヌクレオチド、および/または配列番号1の1123位〜1542位の核酸配列を含む、請求項1から請求項8までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記発現カセットが転写終結領域をさらに含む、請求項1から請求項9までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記転写終結領域が、ポリアデニル化シグナル、および転写終結部位を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記発現カセットが、前記発現カセットの他のエレメントに機能的に連結した、前記ヒトAγグロビン遺伝子の3’エンハンサーの少なくとも機能的部分を含むエンハンサー領域をさらに含む、請求項1から請求項11までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記発現カセットの前記エンハンサー領域が配列番号1の2136位〜2881位の核酸配列を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記目的のポリペプチドが糖タンパク質またはそれの部分である、請求項1から請求項13までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記目的のポリペプチドが、抗体の重鎖または軽鎖を含む抗体またはそれの誘導体もしくは部分;ゴナドトロピン、例えばFSH(濾胞刺激ホルモン)、CG(絨毛ゴナドトロピン)、LH(黄体形成ホルモン)およびTSH(甲状腺刺激ホルモン);エリスロポエチン;ならびに第VII因子、第VIII因子、第IX因子またはフォンウィルブランド因子などの血液凝固因子からなる群から選択される、請求項1から請求項14までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記発現カセットが前記宿主細胞に安定的にトランスフェクトされる、請求項1から請求項15までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記宿主細胞に、前記発現カセットおよび選択マーカー遺伝子を含むベクターがトランスフェクトされており、工程(b)の培養条件が、細胞培養培地中の対応する選択薬剤の存在を含む、請求項1から請求項16までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子が、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)をコードし、前記対応する選択薬剤が、抗葉酸剤である、請求項17に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、真核細胞、またはそれに由来する細胞である、請求項1から請求項18までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、血液細胞、またはそれに由来する細胞である、請求項1から請求項19までのいずれか1項に記載の方法。
- 互いに機能的に連結した、
(i)ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターのDNアーゼI過敏性部位2(HS2)のコアエレメントを少なくとも含む遺伝子座制御領域;
(ii)ヒトAγグロビン遺伝子のプロモーターの少なくとも機能的部分を含むプロモーター領域;
(iii)転写終結領域;および
(iv)ヒトAγグロビン遺伝子の3’エンハンサーの少なくとも機能的部分を含むエンハンサー領域;
を含み、ヒトAγグロビン全体をコードする核酸配列を含まない、発現カセット。 - 前記ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターのDNアーゼI過敏性部位2(HS2)のコアエレメントが、配列番号1の906位〜939位の核酸配列を有する、請求項21に記載の発現カセット。
- 前記遺伝子座制御領域が、ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターのDNアーゼI過敏性部位2(HS2)のM1−コア−M2エレメントを含む、請求項22に記載の発現カセット。
- 前記遺伝子座制御領域が、配列番号1の741位〜1109位の核酸配列を含む、ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターの過敏性部位2(HS2)の少なくとも部分を含む、請求項23に記載の発現カセット。
- 前記遺伝子座制御領域が、ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターの過敏性部位3(HS3)もしくはそれの部分、および/またはヒトβ−グロビン遺伝子クラスターの過敏性部位4(HS4)もしくはそれの部分を含む、請求項22から請求項24までのいずれか1項に記載の発現カセット。
- 前記プロモーター領域が、転写開始部位を含む、請求項21から請求項25までのいずれか1項に記載の発現カセット。
- 前記プロモーター領域が、前記ヒトAγグロビン遺伝子の前記転写開始部位に照らして−384〜+36のヌクレオチド、および/または配列番号1の1123位〜1542位の核酸配列を含む、請求項21から請求項26までのいずれか1項に記載の発現カセット。
- 前記転写終結領域が、ポリアデニル化シグナル、および転写終結部位を含む、請求項21から請求項27までのいずれか1項に記載の発現カセット。
- 前記エンハンサー領域が配列番号1の2136位〜2881位の核酸配列を含む、請求項21から請求項28までのいずれか1項に記載の発現カセット。
- 制限酵素の少なくとも1つの認識配列を含むクローニング部位をさらに含む、請求項21から請求項29までのいずれか1項に記載の発現カセット。
- 前記コード領域が目的のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項21から請求項30までのいずれか1項に記載の発現カセット。
- 前記目的のポリペプチドが糖タンパク質またはそれの部分である、請求項31に記載の発現カセット。
- 前記目的のポリペプチドが、抗体、抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはそれの部分である、請求項31または請求項32に記載の発現カセット。
- 前記コード領域が分泌発現のためのシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項21から請求項33までのいずれか1項に記載の発現カセット。
- 転写の方向において、互いに機能的に連結して、
(i)前記遺伝子座制御領域と、
(ii)前記プロモーター領域と、
(iii)前記コード領域および/またはクローニング部位と、
(iv)前記転写終結領域と、
(v)前記エンハンサー領域と、
を含む、請求項21から請求項34までのいずれか1項に記載の発現カセット。 - 真核細胞における発現のために適応させられている、請求項21から請求項35までのいずれか1項に記載の発現カセット。
- 請求項21から請求項36までのいずれか1項に記載の発現カセットを含むベクター。
- 1つまたはそれより多くの選択マーカー遺伝子をさらに含む、請求項37に記載のベクター。
- 真核細胞への安定的トランスフェクションのために適応させられている、請求項37または請求項38に記載のベクター。
- 請求項21から36のいずれか1項に記載の発現カセットまたは請求項37から請求項39までのいずれか1項に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 真核細胞、またはそれに由来する細胞である、請求項40に記載の宿主細胞。
- 血液細胞、またはそれに由来する細胞である、請求項40または請求項41に記載の宿主細胞。
- 請求項1から請求項20までのいずれか1項に記載の方法における、請求項21から請求項36までのいずれか1項に記載の発現カセットまたは請求項40から請求項42までのいずれか1項に記載の宿主細胞の使用。
- 前記発現カセットが請求項21から請求項36までのいずれか1項に記載の発現カセットであり、かつ/または前記宿主細胞が請求項40から請求項42までのいずれか1項に記載の宿主細胞である、請求項1から請求項20までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子座制御領域が、ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターの過敏性部位3(HS3)を含まない、請求項1に記載の方法。
- 前記宿主細胞が赤血球系列の細胞ではない、請求項1に記載の方法。
- 前記目的のポリペプチドがグロビンタンパク質ではない、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子座制御領域が、ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターの過敏性部位3(HS3)を含まない、請求項21に記載の発現カセット。
- 前記目的のポリペプチドがグロビンタンパク質ではない、請求項21に記載の発現カセット。
- 赤血球系列の細胞ではない、請求項40に記載の宿主細胞。
- 前記ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターのDNアーゼI過敏性部位2(HS2)のM1−コア−M2エレメントが、配列番号1の742位〜995位の核酸配列を有する、請求項5に記載の方法。
- 前記ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターのDNアーゼI過敏性部位2(HS2)のM1−コア−M2エレメントが、配列番号1の742位〜995位の核酸配列を有する、請求項23に記載の発現カセット。
- ヒト細胞、またはそれに由来する細胞である、請求項41または42に記載の宿主細胞。
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