TW202413647A - 具有啟動子活性之核酸及其用途 - Google Patents
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Abstract
本申請案涉及遺傳學、基因療法和分子生物學領域。更具體地，本發明涉及具有啟動子活性之核酸(變體)、基於其的表達盒和載體、用於生產靶產物或表達載體的宿主細胞。
Description
本申請涉及遺傳學、基因療法和分子生物學領域。更具體地，本發明涉及具有啟動子活性之核酸(變體)、基於其的表達盒和載體、用於生產靶產物或表達載體的宿主細胞。
啟動子是一種DNA元件，其促進與啟動子可操作地連接的多核苷酸的轉錄。啟動子也可以是啟動子/增強子元件的一部分。儘管啟動子和增強子元件之間的物理邊界並不總是清楚的，啟動子通常是指核酸分子上的位點，RNA聚合酶和/或任何相關因子結合到該位點，並且在該位點啟動轉錄。增強子在時間上以及空間上增強啟動子活性。已知許多啟動子在廣泛的細胞類型中具有轉錄活性。啟動子可以分為兩類，組成型發揮功能的啟動子和通過誘導或去阻抑來調節的啟動子。這兩類都適用於蛋白質表達。用於在真核細胞中(並且特別是在哺乳動物細胞中)高水準生產多肽的啟動子應該是強的，並且優選在廣泛的細胞類型中是有活性的。能夠在許多細胞類型中驅動表達的強組成型啟動子是本領域公知的，並因此在此不必詳細描述它們。
啟動子和/或增強子的實例是衍生自逆轉錄病毒LTR、巨細胞病毒(CMV) (例如CMV啟動子/增強子)、猿猴病毒40 (SV40) (例如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))、CAG啟動子以及強哺乳動物啟動子(例如TTR啟動子或EF1-α啟動子)的啟動子和/或增強子。
根據亞型，CMV啟動子的長度為589-1650 bp (Changyu Zheng ET ALL., All Human EF1α Promoters Are Not Equal：Markedly Affect Gene Expression in Constructs from Different Sources, Int J Med Sci. 2014; 11(5): 404-408, doi: 10.7150/ijms.8033)。CAG啟動子(CMV早期增強子/雞β肌動蛋白)的長度為868 bp (Nieuwenhuis, B., Haenzi, B., Hilton, S.等人
.Optimization of adeno-associated viral vector-mediated transduction of the corticospinal tract: comparison of four promoters.
Gene Ther. 2021; 28: 56-74, https://doi.org/10.1038/s41434-020-0169-1)。
所有上述啟動子的長度都超過588 bp。表達盒中長度超過588 bp的啟動子不是使用多種表達載體表達大轉基因的最佳選擇。
因此，需要產生短啟動子。
許多啟動子(包括CMV啟動子)不是組織特異性的，即，它們不提供治療性轉基因在某些器官的細胞中的選擇性表達，當用於產生基因療法產物時，這個事實是這些啟動子的明顯缺點。
因此，需要產生組織特異性啟動子，其提供治療性轉基因在某些器官的細胞中的選擇性表達。
本發明的作者驚奇地發現具有選自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的核苷酸序列的核酸具有啟動子活性。具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的核苷酸序列的啟動子的長度在123-252 bp的範圍內。此外，本發明的作者驚奇地發現具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的核苷酸序列的啟動子在肝細胞來源的細胞中具有組織特異性啟動子活性。
定義和一般方法除非本文另有定義，否則與本發明結合使用的所有技術和科學術語將具有與本領域技術人員通常理解的相同的含義。
此外，除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數術語，並且複數術語應包括單數術語。通常，本文所述的細胞培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學、分析化學、有機合成化學、醫學和藥物化學以及蛋白質和核酸的雜交和化學的本分類和方法是本領域技術人員公知的並且廣泛用於本領域。酶反應和純化方法根據製造商的指導方針進行，如本領域常見的，或如本文所述。
如本說明書和所附權利要求書中所用，除非上下文另有規定，否則詞語“包括(include)”和“包含(comprise)”或其變體(例如“包括(includes)”、“包括(including)”、“包含(comprises)”或“包含(comprising)”)將被理解為暗示包括所述的整體或整體組，但不排除任何其它整體或整體組。
核酸分子術語“核酸”、“核酸序列(nucleic sequence)”、“核酸序列(nucleic acid sequence)”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”在本說明書中可互換使用，是指核苷酸的精確序列，其經修飾或未經修飾，確定核酸的片段或區，含有或不含非天然核苷酸，並且是雙鏈DNA或RNA、單鏈DNA或RNA、或所述DNA的轉錄產物。
如本說明書中所用，通過非限制性實例，多核苷酸包括通過本領域可找到的任何方法獲得的所有核酸序列，作為非限制性實例，包括重組方法，即，使用普通克隆技術和PCR等從重組文庫或細胞基因組克隆核酸序列，和通過合成方法。
本發明不涉及其天然染色體環境中(即天然狀態下)的核苷酸序列，這也應包括在此。本發明的序列已經被分離和/或純化，即，它們被直接或間接取樣，例如通過複製，從而其環境已經至少部分地被修飾。因此，本文還應提及通過重組遺傳學(例如使用宿主細胞)獲得的或通過化學合成獲得的分離的核酸。
除非另有指示，否則術語核苷酸序列包括其互補序列。因此，具有特定序列的核酸應理解為包括其互補鏈及其互補序列的核酸。
載體如本文所用的術語“載體”是指能夠轉運與其連接的另一核酸的核酸分子。此外，術語“載體”在本文中是指能夠轉運核酸的重組病毒顆粒。
如本說明書中所用，術語“表達”定義為由其啟動子驅動的特定核苷酸序列的轉錄和/或翻譯。
具體實施態樣 核酸一方面，本發明涉及具有啟動子活性並且包括選自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的核苷酸序列的核酸。
在本發明的一些實施方案中，核酸是分離的核酸。
“分離的”核酸分子是從至少一種核酸分子-雜質中鑒定和分離的核酸分子。分離的核酸分子不同于其在天然條件下所發現的形式或集合。因此，分離的核酸分子不同于在天然條件下存在於細胞中的核酸分子。
具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的核苷酸序列的所有核酸都具有啟動子活性。
具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的核苷酸序列的所有啟動子在肝細胞來源的細胞中具有組織特異性啟動子活性。
具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的核苷酸序列的所有啟動子都是強啟動子，並且其作為表達載體的一部分的使用導致靶蛋白的生產和活性水準的增加。
表達盒。表達載體。一方面，本發明涉及包含具有啟動子活性的任何上述核酸的表達盒。
如本文所用，術語“表達的盒”或“表達盒”特別指在適當的環境下能夠觸發編碼目的多肽的多核苷酸表達的DNA片段，所述目的多肽的序列包括在所述表達盒中。當將表達盒引入宿主細胞時，表達盒尤其能夠參與細胞機制以將編碼目的多肽的多核苷酸轉錄成RNA，然後通常進一步加工RNA並最終翻譯成目的多肽。表達盒可以包含在表達載體中。
在一些實施方案中，表達盒在5'-末端至3'-末端方向包括以下元件：
左手(第一) ITR (反向末端重複)；
具有啟動子活性的上述核酸中的任一種；
轉基因；
聚腺苷酸化信號；
右手(第二) ITR。
表達盒的上述結構元件彼此可操作地連接。
如本文所用，術語“可操作地連接”是指多核苷酸(或多肽)元件功能關係地連接。當核酸與另一核酸序列在功能關係條件下存在時，該核酸是“可操作地連接的”。例如，如果轉錄調節序列影響編碼序列的轉錄，則轉錄調節序列可操作地連接至所述編碼序列。術語“可操作地連接”是指連接的DNA序列通常是連續的，並且在需要連接兩個蛋白編碼區的情況下，也是連續的並存在於閱讀框中。
在一些實施方案中，表達盒包括具有SEQ ID NO:16的核苷酸序列的左手(第一) ITR。
在一些實施方案中，表達盒包括具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列的聚腺苷酸化信號。
在一些實施方案中，表達盒包括具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的右手(第二) ITR。
在一些實施方案中，表達盒在5'-末端至3'-末端方向包括以下元件：
具有SEQ ID NO:16的核苷酸序列的左手(第一) ITR (反向末端重複)；
具有選自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的核苷酸序列的啟動子；
轉基因；
具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列的聚腺苷酸化信號；
具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的右手(第二) ITR。
在一些實施方案中，表達盒包括編碼蛋白質或小抑制性核酸的轉基因。
在一些實施方案中，表達盒包括編碼選自因子VIII或其功能變體、因子IX或其功能變體、SMN1蛋白(存活運動神經元蛋白)、SARS-CoV2的RBD-S多肽或治療性抗體的蛋白質的轉基因。
一方面，本發明涉及表達載體，其包括具有啟動子活性的任何上述核酸或任何上述表達盒。
在本發明的一些實施方案中，載體能夠在它們所引入的宿主細胞中自主複製(例如，具有複製來源的細菌位點的細菌載體和附加型載體)。在本發明的進一步的實施方案中，載體(例如非附加型載體)可以在引入宿主細胞後整合到宿主細胞的基因組中，並從而與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠指導與它們可操作地連接的基因的表達。這樣的載體在本文中稱為“重組表達載體” (或簡稱為“表達載體”)。
表達載體包括質粒、逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒(AAV)、植物病毒(例如花椰菜花葉病毒、煙草花葉病毒)、粘粒、YAC、EBV等。DNA分子可以插入載體中，使得載體內的轉錄和翻譯控制序列發揮它們調節DNA的轉錄和翻譯的預期功能。可以選擇與所用表達宿主細胞相容的表達載體和表達控制序列。可以通過標準方法(例如連接互補限制性位點，或如果不存在限制性位點，則進行平端連接)將DNA分子引入表達載體中。
在本發明的一些實施方案中，載體是質粒、AAV、腺病毒或慢病毒。
在本發明的一些實施方案中，載體是質粒，即，其中可以插入另外的DNA片段的環狀雙鏈DNA。
在本發明的一些實施方案中，載體是病毒(表達)載體，其中可以將另外的DNA片段插入到病毒基因組中。
在一些實施方案中，表達載體是重組腺相關病毒(AAV)。
在一些實施方案中，AAV選自以下AAV血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、rAAV.rh8、rAAV.rhlO、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-l、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2.6、rAAV2.8、rAAV2.9、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。
在本發明的一些實施方案中，除了啟動子之外，載體或盒還可以包括其它表達控制序列。如本說明書中使用的術語“其它表達控制序列”是指實現插入它們的編碼序列的表達和加工所必需的多核苷酸序列。本領域技術人員應當理解，表達載體或盒的設計(包括表達控制序列的選擇)可以取決於例如待轉化宿主細胞類型的選擇、所需的蛋白質表達水準等因素。除了啟動子之外，表達控制序列包括相應的轉錄起始、終止和增強子序列；有效的RNA加工信號，例如剪接和聚腺苷酸化信號；穩定細胞質mRNA的序列；增強翻譯效率的序列(即，Kozak共有序列)；增強蛋白質穩定性的序列；和當需要時，增強蛋白質分泌的序列。這樣的控制序列的性質根據宿主生物而不同；在原核生物中，這樣的控制序列通常包括啟動子、核糖體結合位點以及轉錄終止序列；在真核生物中，這樣的控制序列通常包括啟動子和轉錄終止序列。表達控制序列包括至少所有其存在對於表達和加工是重要的組分。
除了上述基因和表達控制序列之外，根據本發明的重組表達載體可以攜帶另外的序列，例如調節載體在宿主細胞中複製的序列(例如複製來源)和可選擇的標記基因。可選擇的標記基因促進選擇已經引入載體或盒的宿主細胞。
在本發明的一個實施方案中，表達載體涉及包含側翼為細小病毒序列或反向末端重複(ITR)序列的一個或多個目的多核苷酸序列、目的基因或轉基因的載體。
本發明的盒和載體都不包含編碼腺相關病毒的非結構蛋白(Rep)和結構蛋白(Cap)的基因的核苷酸序列。
宿主細胞一方面，本發明涉及用於生產靶產物或用於生產任何一種上述表達載體的宿主細胞，其包含具有啟動子活性的上述核酸的任一種。
如本文所用的術語“宿主細胞”是指已經引入根據本發明的重組表達載體或表達盒的細胞。應當理解，“宿主細胞”不僅指特定的受試細胞，而且還指這樣的細胞的後代。由於突變或環境影響，修飾可能發生在隨後的世代中，這樣的後代實際上可能與親本細胞不同；然而，這樣的細胞仍然包括在如本文所用的術語“宿主細胞”的範圍內。
根據本發明的表達載體或盒可以用於轉染哺乳動物細胞、植物細胞、細菌或酵母宿主細胞。轉染可以通過將多核苷酸引入宿主細胞的任何已知的方法進行。用於將異源多核苷酸引入哺乳動物細胞中的方法是本領域公知的並且包括葡聚糖-介導的轉染、陽離子聚合物-核酸複合物轉染、磷酸鈣沉澱、聚凝胺-介導的轉染、原生質體融合、多核苷酸在脂質體中的封裝，以及DNA向細胞核中的直接顯微注射。此外，核酸分子可以通過病毒(表達)載體引入哺乳動物細胞。
用作轉染宿主的哺乳動物細胞系是本領域公知的，並且包括許多可獲得的永生化細胞系。這些細胞系包括例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0細胞、SP2細胞、HEK-293T細胞、FreeStyle 293細胞(Invitrogen)、NIH-3T3細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、非洲綠猴腎細胞(COS)、人肝細胞性癌細胞(例如Hep G2)、A549細胞、SK-HEP1、HUH7、Hep-RG和許多其它細胞系。通過確定哪些細胞系具有高表達水準並提供所生產的蛋白質的必要特徵來選擇細胞系。可以使用的其它細胞系是昆蟲細胞系，例如Sf9或Sf21細胞。當將根據本發明的重組表達載體引入哺乳動物宿主細胞時，通過培養宿主細胞一段時間來生產靶蛋白，所述時間足以在宿主細胞中表達靶蛋白，或者更優選地，將靶蛋白分泌到培養宿主細胞的培養基中。可以使用標準蛋白質純化技術從培養基中分離靶蛋白。植物宿主細胞包括例如煙草屬、擬南芥屬、浮萍、玉米、小麥、馬鈴薯等。細菌宿主細胞包括埃希氏菌屬和鏈黴菌屬物種。酵母宿主細胞包括粟酒裂殖酵母、釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母。
上述宿主細胞不涉及使用人胚胎生產的宿主細胞。
上述宿主細胞不涉及通過修飾人種系細胞的遺傳完整性而生產的宿主細胞。
提供以下實施例以更好地理解本發明。這些實施例僅用於說明的目的，而不應被解釋為以任何方式限制本發明的範圍。
本說明書中引用的所有出版物、專利和專利申請均通過引用併入本文。儘管為了清楚理解的目的，已經通過說明和實施例的方式相當詳細地描述了前述發明，本領域普通技術人員根據本發明的教導將容易顯而易見的是，在不背離所附實施方案的精神或範圍的情況下，可以對其進行某些改變和修改。
材料和一般方法 重組 DNA 技術使用標準方法操作DNA，如在Sambrook, J.等人, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2012中所述。根據製造商的方案使用分子生物學試劑。簡言之，生產質粒DNA用於在選擇性抗生素壓力下生長的大腸桿菌細胞中進一步操作，使得質粒不在細胞群中丟失。我們使用商業試劑盒從細胞分離質粒DNA，測量濃度，並將其用於通過限制性內切核酸酶處理或PCR擴增進行克隆。使用連接酶將DNA片段彼此連接，並轉化到細菌細胞中，用於克隆的選擇和進一步的生產。所有所得基因構建體通過限制性圖譜和完全Sanger測序來確認。
DNA 序列測定通過Sanger測序測定DNA序列。在Snapgene Viewer 4.2或更高版本中分析DNA和蛋白質序列並處理序列資料，用於序列產生、作圖、分析、注釋和說明。
培養細胞培養物實驗使用HEK293 (人胚胎腎克隆293細胞系)、HUH7 (人肝細胞癌細胞系)、U87-MG (Uppsala 87惡性神經膠質瘤細胞系)、CHO-K1-S (中國倉鼠卵巢細胞系)和HepG2 (人肝細胞癌細胞系)。將用於生產AAV的懸浮的HEK293細胞在標準條件下在37℃和5% CO
2下在不含FBS和抗生素的完全培養基上培養。用於測試EGFP和AAV產物表達功效的粘附HEK293、HUH7和HepG2細胞在標準條件下在37℃和5% CO
2下在補充有10% FBS、抗生素/抗真菌劑的完全DMEM培養基上培養。用於組織特異性測試的粘附U87-MG和CHO-K1-S細胞在標準條件下在37℃和5% CO
2下在分別補充有10% FBS、抗生素/抗真菌劑的完全EMEM營養培養基和補充有5% FBS、抗生素/抗真菌劑的DMEM/F12培養基上培養。
在達到80-90%匯合時傳代培養細胞。用TrypLE選擇酶(10x)解離細胞單層。使用錐蟲藍染色和使用自動計數II計數器的一次性細胞計數室評估細胞活力。
細胞培養物的轉染為了評估轉染時新啟動子變體的功能活性，我們使用包含表達盒的質粒來表達EGFP和凝固因子的轉基因的各種變體。將模型細胞系以10000個細胞/cm
2的密度預接種到12孔板的孔中。一天后，我們加入相等拷貝數的測試和對照樣品的質粒DNA，作為與Lipofectamine 3000的複合物的一部分。對於基於編碼綠色螢光蛋白(EGFP)的基因的轉基因變體，在轉染後第3天，我們通過流式細胞術測定表達EGFP的細胞的比例和細胞螢光強度。對於基於凝固因子的轉基因變體，在轉染後第7天，我們通過ELISA和顯色測定來測定培養基中凝固蛋白的含量及其活性。完整的模型細胞系用作陰性對照。
AAV 重組載體的病毒顆粒的產生和純化為了生產包含基於凝固因子的轉基因的重組AAV病毒顆粒，我們使用用3種質粒轉染的HEK293生產細胞：
・包含用於表達凝固因子的AAV表達盒的質粒；
・包含血清型AAV6/AAV5的Cap基因和血清型AAV2的Rep基因的質粒。使用可變閱讀框，每個基因編碼若干蛋白質產物；
・包含AAV衣殼組裝和包裝所需的Ad2腺病毒基因的質粒。
轉染後72小時，裂解細胞，然後使用過濾、層析法和超離心方法純化和濃縮病毒顆粒。病毒顆粒的滴度通過定量PCR用對重組病毒基因組區特異的引物和樣品測定，並表示為每1 ml病毒基因組的拷貝數。
細胞培養物的轉導將HUH7細胞系以10,000個細胞/cm
2的密度預接種到12孔板的孔中。在細胞附著於粘附底物後，以500,000 vg/細胞的MOI引入AAV製劑。在轉導後第7天，通過ELISA和顯色測定來測定培養流體中凝固蛋白的水準和活性。在6個獨立的實驗中進行涉及評估培養流體中凝固蛋白的水準和活性的研究。完整細胞用作陰性對照。
使用流式細胞術測定表達 EGFP 報告蛋白的細胞的比例和細胞螢光強度為了評估EGFP報告蛋白在流式細胞螢光計上的表達，在轉染後第3天，將預先製備的緩衝液和碘化丙啶(PI)的混合物以1 μl PI的速率以每1 ml緩衝液10 μg/ml的濃度加入到細胞沉澱中。將未用PI染色的和未用質粒DNA (同種型)轉染的細胞轉移到96孔微板的孔中以評估補償，將緩衝液/PI混合物加入到微板的剩餘孔中以測量具有PI的對照和樣品。將細胞樣品轉移到微板後，在無光條件下孵育5分鐘。孵育後，將具有測試細胞樣品的微板載入到流式細胞儀中用於分析。流式細胞術用於測定包含EGFP的細胞的百分比，以及螢光信號的平均強度。每個樣品以三個技術重複(分析事件的數目不小於10,000)測量。
通過 ELISA 測定凝固因子蛋白的量通過非競爭性固相酶免疫測定(ELISA)的夾心法評估HUH7細胞用靶候選物轉染和轉導後培養流體中凝固因子蛋白的含量。簡言之，將稀釋在商業緩衝液中的培養流體樣品轉移到用一級凝固因子特異性抗體敏化的96孔微板。相同的微板裝載用於繪製校準曲線的標準品，對照。將板在37℃的溫度下孵育1小時。在引入生物素化的抗體、辣根過氧化物酶綴合的鏈黴抗生物素蛋白溶液和四甲基聯苯胺(TMB)底物之前，用緩衝液洗滌微板孔。接著，引入具有生物素化的檢測凝固因子特異性抗體的溶液，並將微板在37℃的溫度下孵育30分鐘。將鏈黴抗生物素蛋白辣根過氧化物酶綴合物溶液加入到所得複合物中，並將板在37℃的溫度下孵育30分鐘。引入TMB溶液以顯現酶反應。在達到所需程度的染色強度後，將終止溶液加入到所有孔中以終止反應。停止反應後，測量光密度。通過標準樣品校準曲線將顯色染色標準化，考慮預稀釋因子，來測量測試樣品中凝固因子的濃度。
通過 ELISA 測定凝固因子蛋白的活性水準使用顯色測定評估HUH7細胞用靶候選物和對照樣品轉染和轉導後培養基中凝固因子蛋白的活性。該測定基於這樣的事實，即，在鈣離子、磷脂和因子IXa存在下，因子X轉化為活化形式Xa，因子VIII在反應中起輔因子的作用，並且因子X活化的速率與因子VIII的水平線性相關。簡言之，將在商業緩衝液中稀釋的培養基樣品、用於繪製校準曲線的標準品和對照物轉移至96孔微板。接著，使樣品在37℃的溫度下經受孵育3分鐘，接著將包含因子IXa、因子X、凝血酶、СаCl
2和磷脂的因子試劑溶液引入到微板孔中。然後，在37℃的溫度下將微板孵育4分鐘，接著將顯色底物溶液S-2765+I-2581引入孔中。然後將板在37℃的溫度下孵育7分鐘。在達到所需的染色強度程度後，將20%乙酸溶液加入到所有孔中以終止反應。然後測量微板孔中溶液的光密度。通過標準樣品校準曲線將顯色染色標準化，考慮初步稀釋，測量測試樣品中凝固因子的活性。
實驗室動物的體內研究В6.129S-F8tm1Smoc凝固因子缺陷小鼠(年齡6-8周的雄性)用於實驗。通過單次靜脈內注射到尾靜脈中將產物施用于動物。將不含AAV的緩衝液溶液施用於陰性對照組動物。在注射當天，在施用產物之前，然後在引入表達載體之後第70天，進行血漿取樣。所有動物測試都完全遵循ARRIVE指導方針進行。
統計資料分析結果指示平均值±標準差(SD)，單向方差分析(ANOVA)隨後Dunnett's多重配對比較用於比較實驗結果，並且確定它們是統計學顯著的。
實施例 1 。為了增加目的基因的表達水準，在設計遺傳構建體時，我們使用一組基於轉錄因子結合位點開發的啟動子(SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)。這些核苷酸序列作為表達盒的一部分，通過轉染模型細胞系(HEK293、HUH7、U87-MG、CHO-K1-S和HepG2)在體外測試，所述表達盒由對應於SEQ ID NO:16的序列的左手(第一) ITR (反向末端重複)、選自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的啟動子、目的基因、聚腺苷酸化信號(SEQ ID NO:17)、右手(第二) ITR (SEQ ID NO:18)組成，其中目的基因可以是綠色螢光蛋白(GFP)序列或凝固級聯蛋白序列。將包含左手(第一) ITR (SEQ ID NO:16)、目的基因、聚腺苷酸化信號(SEQ ID NO:17)、右手(第二) ITR (SEQ ID NO:18)的表達盒用作對照。圖1和圖2還顯示包含補充有組成型巨細胞病毒(CMV)病毒啟動子的表達盒的相同元件的另外的對照。
當綠色螢光蛋白序列用作目的基因時，作為啟動子區的SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的所有核酸提供表達EGFP報告蛋白的細胞的比例增加 (圖1-3)和EGFP螢光強度增加(圖4-5)。當使用凝固因子序列作為目的基因時，我們還觀察到與使用不含啟動子區的目的基因的核酸相比，凝固蛋白的生產(圖6)和活性(圖7)水準增加。因此，核酸(SEQ ID NO:1-15)在轉染模型細胞系(Huh7、CHO-K1-S和HepG2)時，作為具有各種轉基因變體的表達盒的一部分表現出啟動子活性。
實施例 2 。為了測量具有啟動子活性的開發的核酸序列(SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)的組織特異性，在模型細胞系(HEK293、HUH7、U87-MG、CHO-K1-S和HepG2)上轉染時，體外測試核苷酸序列，作為由對應於SEQ ID NO:16的序列的左手(第一) ITR (反向末端重複)、啟動子(SEQ ID NO:1-15)、目的基因、聚腺苷酸化信號(SEQ ID NO:17)、右手(第二) ITR (SEQ ID NO:18)組成的表達盒的一部分，其中目的基因可以由EGFP蛋白序列或編碼凝固級聯蛋白的核酸表示。包含左手(第一) ITR (SEQ ID NO:16)、目的基因、聚腺苷酸化信號(SEQ ID NO:17)、右手(第二) ITR (SEQ ID NO:18)的表達盒用作對照。此外，在圖8、10、11和12中，使用包含補充有巨細胞病毒(CMV)病毒啟動子區的表達盒的相同元件的對照。
與使用不含啟動子區的核酸相比，為啟動子區的SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的所有核酸提供表達EGFP報告蛋白的細胞的比例增加(圖8和9)以及在肝細胞來源細胞系中EGFP螢光強度增加(圖10-13)。因此，核酸(SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)在肝細胞來源的細胞中具有組織特異性啟動子活性。
實施例 3 。我們生產了基於AAV的表達載體，其在SEQ ID NO:8、11和14的核酸的控制下包含編碼轉基因(凝固因子)的表達盒，所述表達盒具有啟動子活性。通過體外轉導Huh7細胞檢查所述表達載體。使用不含啟動子區的基於AAV的表達載體作為對照。
與使用不含啟動子區的表達載體相比，使用包含SEQ ID NO:8、11和14的核酸的表達載體導致凝固蛋白的生產(圖14)和活性(圖15)水準增加。與對照相比，使用包含SEQ ID NO:8和11的核酸的基於不同血清型的AAV的表達載體表現出凝固蛋白的生產(圖16)和活性(圖17)水準增加。結果對應於轉染Huh7細胞時獲得的資料(圖6和7)。因此，在模型細胞系轉導時，核酸(SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)在作為具有各種轉基因變體的表達載體遞送時表現出啟動子活性。
實施例 4 。為了測量作為體內表達載體一部分的SEQ ID NO:8和11的核酸的啟動子活性，我們生產了基於AAV的產物，其中轉基因是在SEQ ID NO:8或11的核酸的控制下的凝固因子。接著，將測試產物施用於В6.129S-F8tm1Smoc實驗室小鼠。用於稀釋病毒產物的不含AAV顆粒的緩衝液用作陰性對照。AAV產物通過靜脈內流體注射到尾靜脈的方式一次性施用於動物。在注射當天施用產物前(第0天)，然後在施用後第70天進行血漿取樣。
體內研究顯示，在使用在SEQ ID NO:8和11的核酸的控制下包含凝固因子基因序列的測試藥物的情況下，在施用產物後第70天，在動物血漿中觀察到凝固因子及其活性的量顯著增加(圖18-19)。因此，當作為基於AAV的表達載體在體內遞送時，SEQ ID NO:8和11的核酸表現出啟動子活性。
[
圖 1]是顯示在對應於SEQ ID NO:1和2的核酸序列的啟動子控制下表達EGFP報告蛋白的細胞的螢光比例增加的圖。
轉染後表達EGFP的細胞的比例：
1-具有EGFP轉基因但沒有啟動子區的表達盒(對照)；
2-具有EGFP轉基因並補充有巨細胞病毒(CMV)病毒啟動子區的表達盒(對照)；
3-在對應於SEQ ID NO:2的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
4-在對應於SEQ ID NO:1的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒。
[
圖 2]是顯示在對應於SEQ ID NO:3-7和SEQ ID NO:11-14的核酸序列的啟動子控制下表達EGFP報告蛋白的細胞的螢光比例增加的圖。
轉染後表達EGFP的細胞的比例：
1-具有EGFP轉基因但沒有啟動子區的表達盒(對照)；
2-在對應於SEQ ID NO:4的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
3-在對應於SEQ ID NO:5的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
4-在對應於SEQ ID NO:6的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
5-在對應於SEQ ID NO:7的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
6-在對應於SEQ ID NO:13的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
7-在對應於SEQ ID NO:14的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
8-在對應於SEQ ID NO:11的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
9-在對應於SEQ ID NO:12的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
10-在對應於SEQ ID NO:3的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒。
[
圖 3]是顯示在對應於SEQ ID NO:8-10和15的核酸序列的啟動子控制下表達EGFP報告蛋白的細胞的螢光比例增加的圖。
轉染後表達EGFP的細胞的比例：
1-具有EGFP轉基因但沒有啟動子區的表達盒(對照)；
2-在對應於SEQ ID NO:8的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
3-在對應於SEQ ID NO:10的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
4-在對應於SEQ ID NO:9的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
5-在對應於SEQ ID NO:15的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒。
[
圖 4]是顯示在對應於SEQ ID NO:3-7和SEQ ID NO:11-14的核酸序列的啟動子控制下表達EGFP報告蛋白的細胞的螢光強度增加的圖。
轉染後表達EGFP的細胞的螢光強度：
1-具有EGFP轉基因但沒有啟動子區的表達盒(對照)；
2-在對應於SEQ ID NO:4的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
3-在對應於SEQ ID NO:5的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
4-在對應於SEQ ID NO:6的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
5-在對應於SEQ ID NO:7的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
6-在對應於SEQ ID NO:13的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
7-在對應於SEQ ID NO:14的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
8-在對應於SEQ ID NO:11的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
9-在對應於SEQ ID NO:12的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
10-在對應於SEQ ID NO:3的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒。
[
圖 5]是顯示在對應於SEQ ID NO:8-10和15的核酸序列的啟動子控制下表達EGFP報告蛋白的細胞的螢光強度增加的圖。
轉染後表達EGFP的細胞的螢光強度：
1-具有EGFP轉基因但沒有啟動子區的表達盒(對照)；
2-在對應於SEQ ID NO:8的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
3-在對應於SEQ ID NO:10的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
4-在對應於SEQ ID NO:9的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
5-在對應於SEQ ID NO:15的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒。
[
圖 6]是顯示在使用表現出啟動子活性並對應於SEQ ID NO:3、11和14的序列的核酸時凝固蛋白的生產水準增加的圖。
轉染時凝固蛋白的生產水準：
1-具有凝固因子轉基因但沒有啟動子區的表達盒(對照)；
2-其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:3的核酸序列的啟動子控制下的表達盒；
3-其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:11的核酸序列的啟動子控制下的表達盒；
4-其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:14的核酸序列的啟動子控制下的表達盒。
[
圖 7]是顯示在使用表現出啟動子活性並對應於SEQ ID NO:3、11和14的序列的核酸時凝固蛋白的活性水準增加的圖。
轉染時凝固蛋白的活性水準：
1-具有凝固因子轉基因但沒有啟動子區的表達盒(對照)；
2-其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:3的核酸序列的啟動子控制下的表達盒；
3-其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:11的核酸序列的啟動子控制下的表達盒；
4-其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:14的核酸序列的啟動子控制下的表達盒。
[
圖 8]是在Huh7和U87細胞系上新生產的序列的組織特異性的測量的圖，其顯示在對應於SEQ ID NO:3-7和SEQ ID NO:11-14的核酸序列的啟動子控制下表達EGFP報告蛋白的細胞的比例增加。
轉染後表達EGFP的細胞的比例：
1-具有EGFP轉基因但沒有啟動子區的表達盒(對照)；
2-在對應於SEQ ID NO:4的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
3-在對應於SEQ ID NO:5的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
4-在對應於SEQ ID NO:6的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
5-在對應於SEQ ID NO:7的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
6-在對應於SEQ ID NO:13的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
7-在對應於SEQ ID NO:14的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
8-在對應於SEQ ID NO:11的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
9-在對應於SEQ ID NO:12的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
10-在對應於SEQ ID NO:3的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒。
[
圖 9]是在Huh7、HepG2和HEK293細胞系上新生產的序列的組織特異性的測量的圖，其顯示在對應於SEQ ID NO:7和11的核酸序列的啟動子控制下表達EGFP報告蛋白的細胞的比例增加。
轉染後表達EGFP的細胞的比例：
1-具有EGFP轉基因但沒有啟動子區的表達盒(對照)；
2-在對應於SEQ ID NO:7的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
3-在對應於SEQ ID NO:11的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒。
[
圖 10]是在CHO細胞系上生產的序列的組織特異性的測量的圖，其顯示在對應於SEQ ID NO:1和2的核酸序列的啟動子控制下表達EGFP報告蛋白的細胞的螢光強度增加。
轉染後表達EGFP的細胞的螢光強度：
1-具有EGFP轉基因但沒有啟動子區的表達盒(對照)；
2-具有EGFP轉基因並補充有巨細胞病毒(CMV)病毒啟動子區的表達盒(對照)；
3-在對應於SEQ ID NO:2的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
4-在對應於SEQ ID NO:1的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒。
[
圖 11]是在HepG2細胞系上生產的序列的組織特異性的測量的圖，其顯示在對應於SEQ ID NO:1和2的核酸序列的啟動子控制下表達EGFP報告蛋白的細胞的螢光強度增加。
轉染後表達EGFP的細胞的螢光強度：
1-具有EGFP轉基因但沒有啟動子區的表達盒(對照)；
2-具有EGFP轉基因並補充有巨細胞病毒(CMV)病毒啟動子區的表達盒(對照)；
3-在對應於SEQ ID NO:2的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
4-在對應於SEQ ID NO:1的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒。
[
圖 12]是在Huh7和U87細胞系上生產的序列的組織特異性的測量的圖，其顯示在對應於SEQ ID NO:3-7和SEQ ID NO:11-14的核酸序列的啟動子控制下表達EGFP報告蛋白的細胞的螢光強度增加。
轉染後表達EGFP的細胞的螢光強度：
1-具有EGFP轉基因但沒有啟動子區的表達盒(對照)；
2-在對應於SEQ ID NO:4的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
3-在對應於SEQ ID NO:5的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
4-在對應於SEQ ID NO:6的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
5-在對應於SEQ ID NO:7的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
6-在對應於SEQ ID NO:13的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
7-在對應於SEQ ID NO:14的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
8-在對應於SEQ ID NO:11的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
9-在對應於SEQ ID NO:12的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
10-在對應於SEQ ID NO:3的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒。
[
圖 13]是在Huh7、HepG2和HEK293細胞系上生產的序列的組織特異性的測量的圖，其顯示在對應於SEQ ID NO:7和11的核酸序列的啟動子控制下表達EGFP報告蛋白的細胞的螢光強度增加。轉染後表達EGFP的細胞的螢光強度：
1-具有EGFP轉基因但沒有啟動子區的表達盒(對照)；
2-在對應於SEQ ID NO:7的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒；
3-在對應於SEQ ID NO:11的核酸序列的啟動子控制下具有EGFP轉基因的表達盒。
[
圖 14]是顯示當在對應於SEQ ID NO:3、8、11和14的啟動子區控制下遞送基於AAV的表達載體形式的包含凝固因子序列的表達盒時凝固蛋白生產水準增加的圖。
轉導時凝固蛋白的生產水準：
1-包含具有凝固因子轉基因但沒有啟動子區的盒的表達載體(對照)；
2-包含其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:8的核酸序列的啟動子控制下的盒的表達載體；
3-包含其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:11的核酸序列的啟動子控制下的盒的表達載體；
4-包含其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:14的核酸序列的啟動子控制下的盒的表達載體；
5-包含其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:3的核酸序列的啟動子控制下的盒的表達載體；
[
圖 15]是顯示當在對應於SEQ ID NO:3、8、11和14的啟動子區控制下遞送基於AAV的表達載體形式的包含凝固因子序列的表達盒時凝固蛋白活性水準增加的圖。
轉導時凝固蛋白的活性水準：
1-包含具有凝固因子轉基因但沒有啟動子區的盒的表達載體(對照)；
2-包含其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:8的核酸序列的啟動子控制下的盒的表達載體；
3-包含其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:11的核酸序列的啟動子控制下的盒的表達載體；
4-包含其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:14的核酸序列的啟動子控制下的盒的表達載體；
5-包含其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:3的核酸序列的啟動子控制下的盒的表達載體；
[
圖 16]是顯示當在對應於SEQ ID NO:8和11的啟動子區控制下遞送基於rAAV5或rAAV6的表達載體形式的包含凝固因子序列的表達盒時凝固蛋白生產水準增加的圖。
轉導時凝固蛋白的生產水準：
1-包含具有凝固因子轉基因但沒有啟動子區的盒的表達載體(對照)；
2-包含其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:11的核酸序列的啟動子控制下的盒的表達載體；
3-包含其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:8的核酸序列的啟動子控制下的盒的表達載體。
[
圖 17]是顯示當在對應於SEQ ID NO:8和11的啟動子區控制下遞送基於rAAV5或rAAV6的表達載體形式的包含凝固因子序列的表達盒時凝固蛋白活性水準增加的圖。
轉導時凝固蛋白的活性水準：
1-包含具有凝固因子轉基因但沒有啟動子區的盒的表達載體(對照)；
2-包含其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:11的核酸序列的啟動子控制下的盒的表達載體；
3-包含其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:8的核酸序列的啟動子控制下的盒的表達載體。
[
圖 18]是顯示當作為基於AAV的表達載體體內遞送至В6.129S-F8tm1Smoc小鼠時在對應於SEQ ID NO:8和11的核酸的啟動子區控制下凝固因子蛋白水準增加的圖。
注射後動物血漿中凝固因子蛋白的水準：
1-沒有AAV的對照溶液(陰性對照)。
2-包含其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:8的核酸序列的啟動子控制下的盒的基於AAV的表達載體。
3-包含其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:11的核酸序列的啟動子控制下的盒的基於AAV的表達載體。
[
圖 19]是顯示當作為基於AAV的表達載體體內遞送至В6.129S-F8tm1Smoc小鼠時在對應於SEQ ID NO:8和11的核酸的啟動子區控制下凝固因子的活性水準增加的圖。
注射後動物血漿中凝固因子蛋白的水準：
1-沒有AAV的對照溶液(陰性對照)。
2-包含其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:8的核酸序列的啟動子控制下的盒的基於AAV的表達載體。
3-包含其中凝固因子轉基因在對應於SEQ ID NO:11的核酸序列的啟動子控制下的盒的基於AAV的表達載體。
TW202413647A_112121217_SEQL.xml
Claims (8)
- 一種具有啟動子活性之核酸，其包含選自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的核苷酸序列。
- 一種表達盒，其包含如請求項1所述的核酸和可操作地連接的轉基因。
- 如請求項2所述的表達盒，其中所述轉基因編碼蛋白質或小抑制性核酸。
- 如請求項3所述的表達盒，其中所述轉基因編碼選自因子VIII或其功能變體、因子IX或其功能變體、SMN1蛋白(存活運動神經元蛋白)、SARS-cov2的RBD-S多肽或治療性抗體的蛋白質。
- 一種表達載體，其包含如請求項1所述的核酸或如請求項2-4中任一項所述的表達盒。
- 如請求項5所述的表達載體，其是質粒、AAV、慢病毒或腺病毒。
- 如請求項6所述的表達載體，其是選自以下AAV血清型的AAV：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、rAAV.rh8、rAAV.rhlO、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-l、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2.6、rAAV2.8、rAAV2.9、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。
- 一種用於生產靶產物或如請求項5-7中任一項所述的表達載體的宿主細胞，其包含如請求項1所述的核酸或如請求項2-4中任一項所述的表達盒。
Applications Claiming Priority (1)
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| RURU2022115853 | 2022-06-10 |
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