CN111004317B - 一种犬重组干扰素α7及其制备方法与应用 - Google Patents

一种犬重组干扰素α7及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种犬重组干扰素α7及其制备方法与应用，经密码子优化得到犬重组干扰素α7的核苷酸序列，利用毕赤酵母菌株表达系统表达含有本发明密码子优化了的犬重组干扰素α7基因的重组酵母工程菌，获得分泌表达的高活性犬重组干扰素α7，本发明方法制备得到的犬重组干扰素α7纯度高，纯化后蛋白浓度达到0.55mg/ml，1L重组酵母工程菌的蛋白产量达到150mg，重组蛋白在MDCK细胞上对VSV的抗病毒比活性可达1.85×106IU/mg，研究CaIFN‑α7在真核酵母系统中的表达、发酵和活性，对犬α干扰素早日实现工业化生产具有重要意义。

Description

一种犬重组干扰素α7及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程和生物制品领域，具体涉及一种犬重组干扰素α7及其制备方法与应用。
背景技术
干扰素是一类具有全面抗病毒作用、增强特异性和非特异性免疫应答同时能够对正常细胞和肿瘤细胞生长过程起调节作用的一类重要物质。自从干扰素被发现以来，人们已在各种哺乳类、鱼类、昆虫等动物体内发现了干扰素的存在，证实了干扰素的广泛存在性。根据不同干扰素的基因同源性，结构特点、受体、生物活性的不同将其分为3类即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型干扰素包括IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ和IFN-ω，Ⅱ型只包括γ干扰素，IFN-λ为2003年发现的Ⅲ型干扰素。
犬干扰素-α基因全长为564个核苷酸，编码187个氨基酸，由23个氨基酸的信号肽和164个氨基酸的成熟蛋白组成。CaIFN-α含有6个cys和2个潜在的N-糖基化位点，CaIFN-α4～8与先前报道的亚型CaIFN-α1～3的氨基酸序列同源性为93～100％。根据氨基酸序列和分子系统发育树中，将CaIFN-α分为两组：Ⅰ组为CaIFNα1、2和7组，Ⅱ组为CaIFN-α3，4，5，6和8。
随着人们经济水平的不断快速提高，犬类作为人类生活必不可缺的一部分，其数量必将越来越多。然而犬病毒性疾病作为一种传染率比较高的人兽共患病是悬在人类和犬类头上的一把利剑，随时有可能给人类和犬类的健康造成巨大的伤害。目前尚无十分理想的犬类抗病毒性疾病药物，而犬α干扰素因其抗病毒特性具有巨大的潜力与临床应用价值。我们有理由相信随着我们对这些疾病不断加强重视，对犬α干扰素认识的逐渐加深及基因工程等各个相关学科的进一步发展，作用效果良好的商品化犬α干扰素很快会出现。
目前由于原核表达的重组干扰素不能进行翻译后修饰，与天然干扰素的空间构象有一定差距，其免疫原性较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种犬重组干扰素α7及其制备方法与应用，在不改变犬干扰素α7氨基酸序列的基础上，将密码子优化，进而制备得到可高效表达、高纯度的犬重组干扰素α7。
本发明采取的技术方案为：
一种犬重组干扰素α7，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明还提供了含有所述的犬重组干扰素α7的核苷酸序列的重组表达载体。
进一步地，所述表达载体为pPICZαA-CaIFN-α7。pPICZaA载体是一种毕赤酵母蛋白表达载体，具有高拷贝，以AOX1为启动子，自身带有C-Myc，C-His标签等特点，该载体本身含有alpha分泌信号肽，可以将目的蛋白分泌到胞外。
本发明还提供了含有所述的犬重组干扰素α7的核苷酸序列或所述的重组表达载体的宿主细胞。
所述宿主细胞为毕赤酵母细胞菌株X-33，毕赤酵母作为单细胞生物易于实验室内的基因构建和培养，同时作为真核生物它具有对蛋白翻译后修饰的能力，如蛋白的水解、折叠、二硫键形成和糖基化，因此很多在原核表达系统中表达后没有活性的或活性较低的蛋白能在毕赤酵母表达系统中成功表达。与其它表达系统相比，其具有表达相对较快、操作较简单、实验及生产成本低经济性强且产量较高的特点。
本发明还提供了所述的犬重组干扰素α7的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将所述的犬重组干扰素α7的核苷酸序列基因与载体pPICZαA连接，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5a中，培养后，挑取单菌落，提取质粒，并进行PCR鉴定；
(2)挑取经PCR鉴定及测序正确的菌落进行扩大培养，然后提取重组质粒，将重组质粒线性化，然后经纯化处理；
(3)将步骤(2)得到的线性化重组质粒电转化至毕赤酵母细胞菌株X-33中，先后经孵育、培养至菌落直径1mm；
(4)将步骤(3)得到的阳性克隆菌的重组菌X33/pPICZαA-CaIFN-α7在BMGY培养基中培养至菌体OD600值为2-6，离心，菌体沉淀用诱导培养基BMMY稀释至OD600值为1～2，培养4～5天，每隔24h补加甲醇至终浓度为1％进行诱导培养，然后离心收集上清；经纯化后，即可得到犬重组干扰素-α7蛋白。
本发明还提供了所述犬重组干扰素α7在制备抗VSV病毒药物中的应用。
本发明提供的犬重组干扰素α7可进一步制备成的生物制品进而应用到抗病毒药物中，所述生物制品优选为冻干制剂。
与现有技术相比，本发明将密码子优化后的核苷酸序列基因定向克隆至毕赤酵母表达质粒中构建重组质粒，重组质粒转化至毕赤酵母感受态细胞，制备重组菌，通过优化甲醇诱导条件、诱导浓度、诱导时间，蛋白收获时间等优化酵母的发酵、表达，采用亲和层析的方法进行纯化，有效提高了产物的产量，从而获得高产量、高纯度、高活性的犬重组干扰素-α7，本发明中的犬干扰素α7重组蛋白的抗病毒活性为1.02×106IU/mL，比活性为1.85×106IU/mg，。
附图说明
图1为pPICZαA-CaIFN-α7载体的构建示意图；
图2为线性化的pPICZαA-CaIFN-α7质粒电泳图，图中泳道1为pPICZαA
-CaIFN-α7质粒，泳道2为SacI线性化的pPICZαA-CaIFN-α7质粒，M:DL 5000DNAMarker；
图3为重组菌X33/pPICZαA-CaIFN-α7的PCR鉴定结果。图中泳道1-10为1-10克隆的基因组DNA的PCR扩增产物，11为毕赤酵母X33/pPICZαA基因组DNA的PCR产物，12为阴性对照，M:DL2000DNA Marker；
图4为重组菌X33/pPICZαA-CaIFN-α7的表达产物的SDS-PAGE鉴定结果。泳道1-10为克隆株诱导72h时的培养上清，11为毕赤酵母X33/pPICZαA诱导72h时的培养上清，M为蛋白分子量Marker；
图5为重组菌X33/pPICZαA-CaIFN-α7的表达产物的Western blot鉴定结果。泳道1为毕赤酵母X33/pPICZαA诱导72h时的培养上清，泳道2-5为克隆株诱导72h时的培养上清，M为预染蛋白分子量Marker；
图6为犬重组干扰素-α7蛋白纯化产物SDS-PAGE分析图。泳道1:上样样品，泳道2:流穿样品，泳道3:40mM咪唑洗脱液，M为蛋白分子量Marker；
图7为犬重组干扰素-α7蛋白纯化产物Western blot分析图。1:纯化样品，M:为预染蛋白分子量Marker；
图8为重组菌X33/pPICZαA-CaIFN-α7的表达产物的生物活性检测结果,C为细胞对照组，V为病毒对照组。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1编码犬干扰素-α7的基因序列优化及引物的设计和合成
本发明根据GenBank中犬干扰素-α7的cDNA序列(NM_001006654.1)如SEQ ID No.2所示，优化密码子，合成目的基因序列。编码犬干扰素-α7的基因的密码子使用了毕赤酵母最偏爱的密码子。优化后的犬干扰素-α7的基因序列如SEQ ID No.3所示，其编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID No.1所示。
实施例2pPICZαA-CaIFN-α7表达载体的构建
将实施例1中的如SEQ ID No.3所示的CaIFN-α7基因片段与载体pPICZαA用EcoRⅠ和NotI进行双酶切，回收双酶切片段，CaIFN-α7基因片段与载体pPICZαA按3：1的摩尔比16℃连接过夜，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5a，涂板于含Zeocin(25ug/mL)的低盐LB平板上，37℃培养16-24h。挑取单菌落，提取质粒，进行PCR鉴定并送生工公司测序。pPICZαA-CaIFN-α7载体的构建示意图见图1。
实施例3酵母细胞的电穿孔转化及高表达量转化子的筛选
挑取经PCR鉴定及测序正确的菌落进行扩大培养，选取天根生化试剂有限公司的高纯质粒大提试剂盒，按照说明书进行质粒提取。按Invitrogen Pichia Expression Kit操作指南制备毕赤酵母X33感受态细胞。用限制性内切酶SacI线性化重组质粒，于37℃金属浴中酶切5h。线性化体系见表1。
表1
Figure BDA0002337050880000051
Figure BDA0002337050880000061
然后使用乙醇沉淀回收线性化的质粒。将线性化的质粒加入0.1倍体积3mol/LNaAc(PH5.2)和2.5倍体积无水乙醇，-20℃放置大于30min，4℃，14,000r/min离心20min，倒掉上清液。加入700μL 75％乙醇漂洗，高速离心数分钟后，弃上清，重复一遍。EP管倒置于超净台吸水纸上约10分钟，尽量去除水分和残留乙醇，20μL ddH2O重溶，定量后置于冰上备用。并用one-drop检测回收后质粒浓度。线性化并且纯化后的pPICZαA-CaIFN-α7质粒进行凝胶电泳，结果与预期一致，结果见图2。
取100μL所制备的酵母感受态菌X-33，与10μL(10-15μg)线性化后的重组表达质粒混合，移入0.2cm的预冷的电转化杯中，轻轻将液体震到杯底，立即冰浴5min。擦干水汽，置于电转仪上，设定电转化参数，选择电转参数：电压1500v，电容25μF，电阻200Ω，电击时间4～5ms，立即进行电转化。
电转后立即向电转杯中加入1mL预冷的1mol/L的山梨醇，迅速混合均匀，将混合物转移到一个新的1.5mL的EP管中，30℃温箱孵育1～2h，不要摇动。取100μL菌液分别涂布于含100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL Zeocin的YPDS平板上30℃培养箱倒置培养3～5天，观察转化子的生长。至菌落直径1mm即可。同时，以未经电击转化的DNA和X33菌体混合物涂板，作为阴性对照。
将平板上长出的单菌落用灭菌枪头挑取后，在10μL的水中使细胞分散，再将这支枪头在一块新的预标记的MD平板上，轻轻蘸一下，以保存这株单克隆。将MD平板放于30℃恒温培养箱培养3～5天待长出克隆菌落。将挑取的模板在沸水浴中煮沸10min，液氮中冻存30min，沸水浴中煮沸10min，12000r/min离心5min，取上清作为模板，分别利用AOX基因上的一段序列作为上游引物5′AOX1:5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′
和目的基因上的一段序列作为下游引物
CaIFNα7-rprimer：5′-TCTACCGATCTCAGCTCTAA-3′进行PCR鉴定。
反应体系见表2：
表2
PCR反应体系 体积(μL)
2X Premix 10
Forward Primer 10μM 1
Reverse Primer 10μM 1
模板 0.5
加dd H<sub>2</sub>O至 20
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃1min，58℃30s，72℃30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。
将PCR后的产物用1.0％的琼脂糖凝胶核酸电泳，紫外凝胶成像仪下观察电泳结果。如图3所示。结果显示挑选的10个克隆的PCR产物与预期大小一致。
实施例4重组酵母工程菌的诱导表达及鉴定
将实施例3得到的10个阳性克隆的重组菌X33/pPICZαA-CaIFN-α7和空载体转化酵母菌X-33/pPICZαA单克隆分别接种于20-30mL BMGY培养基中，30℃220rpm/min培养16～20h左右，至菌体OD600值为2-6，1500～3 000g，室温离心10min，弃去培养基，收集菌体。菌体沉淀用25mL BMMY培养基稀释至OD600值为1～2，28℃、220rpm/min培养4～5d，每隔24h补加甲醇至终浓度为1％。
诱导培养结束后，收集培养上清液，然后将样品加入蛋白Loading buffer，100℃煮沸10min，取10μL样品上样，进行SDS-PAGE电泳及western blot检测。SDS-PAGE(图4)及Western blot(图5)检测结果表明：分泌上清在24KD和27KD左右可见明显的目的条带，这是由于毕赤酵母具有对外源重组蛋白翻译后修饰的作用，可对重组蛋白进行糖基化修饰，会存在N-糖基化修饰不完全的问题，而重组犬干扰素具有两个N-糖基化位点(在78～80位和133～135位)，因此由于糖基化修饰不完全而得到相对分子量不同的两条带。根据1-10克隆表达量，选定6号克隆用于后续实验。
实施例5重组pPICZαA-CaIFN-a7的纯化及考马斯亮蓝法蛋白定量
将6号克隆接种于5mL YPD种子液中，过夜培养后，转接到50mL BMGY中，30℃摇床220r/min培养16h～20h。用已灭菌离心管1500～3 000g常温离心10min，用诱导培养基BMMY稀释菌体至OD600值1～2，28℃，220rpm/min培养4～5d，每隔24h补加甲醇至终浓度为1％。诱导培养结束后，收集培养上清经0.45μm的滤器过滤后，利用亲和层析柱进行亲和层析，具体步骤为：
冲洗：用纯水清洗Ni2+螯合亲和层析柱及仪器管道。
平衡：待纯水冲10个柱体积后，用3～5个柱体积Buffer A(50mM Tris,100mM NaClpH7.4)进行平衡。
上样：当在线检测电导率值及280nm波长吸收值平稳后，开始进样。
平衡：上完样后，用Buffer A过层析柱，洗去未结合的杂蛋白。
洗脱：用不同浓度咪唑的Elution Buffer(50mM Tris,100mM NaCl,500mMImidazole，pH7.4)冲洗，收集目的蛋白。
将纯化过程中收集的组分经过SDS-PAGE分析，见图6。SDS-PAGE检测结果显示：重组菌株表达的犬重组干扰素-α7蛋白分子量在24KD左右，分子量大小与预期的目的蛋白大小一致。应用凝胶成像系统软件进行扫描分析结果表明目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的50％，具有较好的表达量，蛋白产量为150mg。
将洗脱组分透析到pH7.4Tris-HCl缓冲体系中，考马斯亮蓝法检测蛋白定量，纯化后的犬重组干扰素-α7蛋白浓度为0.55mg/mL。
实施例6表达产物的Western blot鉴定
纯化后的犬重组干扰素-α7加入蛋白loading buffer，100℃煮沸10min，取10μL煮沸后样品上样，选用15％的SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后的聚丙烯酰胺凝胶通过电湿转移系统以300mA，60min的参数电转移至PVDF膜上。取出PVDF膜用5％脱脂奶粉的TBST中37℃封闭1h，弃去液体；用TBST洗膜，加入Anti-His单克隆抗体，4℃孵育过夜；用TBST洗膜，加入含1:10000稀释的HRP-山羊抗小鼠的单克隆抗体37℃孵育1h；用TBST洗膜，用DAB显色液直接显色，拍照记录。如图7所示。Western-blot结果显示：表达产物能与单克隆抗体特异性结合，并在24KD和27KD处有较为明显的反应条带，与SDS-PAGE结果一致，说明该表达产物具有良好地免疫反应性。
实施例7犬重组干扰素-α7生物活性检测
采用微量细胞病变抑制法，在MDCK-VSV系统上测定实施例5纯化的犬重组干扰素-α7的抗病毒活性
待测品溶液的制备：将干扰素在96孔细胞培养板中，从1︰20000开始依次做2倍梯度稀释，每个稀释度做一个复孔，共做10个稀释度(1～10孔)。
将长满单层细胞瓶内培养液弃去，用PBS洗2次后消化和收集细胞，用营养液配制成每毫升含3.0×105～4.0×105个细胞的细胞悬液，接种于上述96孔细胞培养板中，每孔100μl，于37℃、5％CO2条件下培养24小时；弃去细胞培养板中的上清液，将备用的VSV病毒液(－80℃保存)用维持液稀释至100TCID50/0.1mL后，按每孔100μl加入细胞板各孔中，然后置37℃、5％CO2培养箱内，第11号孔为细胞对照C，不加干扰素保护也不加VSV病毒液，仅加细胞悬液；第12号孔为病毒对照V，不加干扰素保护，仅加VSV病毒液。
培养18～24h，观察细胞半数病变数量，以出现50％细胞病变的最高稀释度为一个干扰素单位(IU)。按照Reed-muench法计算犬干扰素α7重组蛋白的活性(IU/mg)。结果表明犬干扰素α7重组蛋白的抗病毒活性为1.02×106IU/mL(见图8)，比活性为1.85×106IU/mg。综上所述，本发明的犬干扰素α7重组蛋白具有较好的体外抗病毒活性。
上述参照实施例对一种犬重组干扰素α7及其制备方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽九川生物科技有限公司；芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司
<120> 一种犬重组干扰素α7及其制备方法与应用
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 492
<212> PRT
<213> 犬重组干扰素α7的氨基酸序列
<400> 1
1 Cys His Leu Pro Asp Thr His Gly Leu Arg Asn Trp Arg Val Leu Thr Leu Leu Gly Gln
21 Met Arg Arg Leu Ser Ala Gly Ser Cys Asp His Tyr Thr Asn Asp Phe Ala Phe Pro Lys
41 Glu Leu Phe Asp Gly Gln Arg Leu Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Met
61 Thr Gln Lys Val Phe His Leu Phe Cys Pro Asp Thr Ser Ser Ala Pro Trp Asn Met Thr
81 Leu Leu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu Gln Leu Asp Asp Leu Glu Ala Cys Pro
101 Leu Gln Glu Ala Gly Leu Ala Glu Thr Pro Leu Met His Glu Asp Ser Thr Leu Arg Thr
121 Tyr Phe Gln Arg Ile Ser Leu Tyr Leu Gln Asp Arg Asn His Ser Pro Cys Ala Trp Glu
141 Met Val Arg Ala Glu Ile Gly Arg Ser Phe Phe Ser Ser Thr Ile Leu Gln Glu Arg Ile
161 Arg Arg Lys Glu
<210> 2
<211> 492
<212> DNA
<213> 犬重组干扰素α7优化前的基因序列
<400> 2
cacctgcccg acacccacgg cctgcgcaac tggagggtcc tgacgctcct gggacagatg 60
aggagactct ccgccggctc ttgtgaccac tacaccaatg actttgcctt ccccaaggag 120
ctgtttgatg gccagcggct ccaggaggcg caggccctct ctgtggtcca cgtgatgacc 180
cagaaggtct tccacctctt ctgcccggac acgtcctctg ctccttggaa catgactctc 240
ctggaggaac tgtgctcggg gctctctgag cagctggatg acctggaggc ctgtcccctg 300
caggaggcgg ggctggccga gacccccctc atgcatgagg actccaccct gaggacctac 360
ttccaaagga tctccctcta cctgcaagac aggaaccaca gcccgtgtgc ctgggagatg 420
gtccgagcag aaatcgggag atccttcttc tcctcgacaa tcttgcaaga aagaatcagg 480
aggaaggaat ga 492
<210> 3
<211> 492
<212> DNA
<213> 犬重组干扰素α7优化后的基因序列
<400> 3
tgtcatttgc cagatactca cggtttgaga aactggagag ttttgacttt gttgggtcaa 60
atgagaagat tgtctgctgg ttcttgtgat cattacacta acgatttcgc tttccctaag 120
gaattgtttg atggtcaaag attgcaagag gctcaagctt tgtctgttgt tcatgttatg 180
actcaaaagg ttttccactt gttctgtcca gatacttctt ctgctccttg gaacatgact 240
ttgttggaag agttgtgttc tggtttgtct gaacaattgg atgatttgga ggcttgtcca 300
ttgcaagaag ctggtttggc tgagactcct ttgatgcatg aagattctac tttgagaact 360
tacttccaaa gaatctcttt gtatttgcaa gatagaaatc actctccatg tgcttgggaa 420
atggttagag ctgagatcgg tagatctttc ttttcttcta ctatcttgca agaaagaatt 480
agaagaaagg ag 492

Claims (7)

1.一种犬重组干扰素α7基因，其特征在于，所述犬重组干扰素α7基因的核苷酸序列如SEQ ID No .3所示。
2.含有如权利要求1所述的犬重组干扰素α7基因的核苷酸序列的重组表达载体。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为pPICZαA-CaIFN-α7。
4.含有如权利要求1所述的犬重组干扰素α7基因的核苷酸序列或如权利要求2所述的重组表达载体的宿主细胞。
5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞菌株X33。
6.一种犬重组干扰素α7的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）将权利要求1所述的犬重组干扰素α7基因的核苷酸序列基因与载体pPICZαA连接，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5a中，培养后，挑取单菌落，提取质粒，并进行PCR鉴定；
（2）挑取经PCR鉴定及测序正确的菌落进行扩大培养，然后提取重组质粒，将重组质粒线性化，然后经纯化处理；
（3）将步骤（2）得到的重组质粒电转化至毕赤酵母细胞菌株X33中，先后经孵育、培养至菌落直径1mm；
（4）将步骤（3）得到的阳性克隆菌的重组菌X33/pPICZαA-CaIFN-α7在BMGY培养基中培养至菌体OD600值为2-6，离心，菌体沉淀用诱导培养基BMMY稀释至OD600值为1~2，培养4~5天，每隔24h补加甲醇至终浓度为1％进行诱导培养，然后离心收集上清；经纯化后，即可得到犬重组干扰素-α7蛋白。
7.如权利要求1所述的犬重组干扰素α7基因在制备抗VSV病毒药物中的应用。
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