CN1661011A - 一种重组人血小板衍生生长因子及其编码基因与表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了种重组人血小板衍生生长因子及其编码基因与表达方法。本发明所提供的重组人血小板衍生生长因子，是由两个B链组成的二聚体，所述B链是具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的多肽或为SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：1相同活性的由SEQ ID №：1衍生的多肽。本发明的重组人血小板衍生生长因子及其B链编码基因与表达方法将在血小板衍生生长因子的应用中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域中一种重组人血小板衍生生长因子及其编码基因与表达方法。
背景技术
血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)是1974年由Ross等首先发现的，最初从血小板中获得，故称为血小板衍生生长因子。PDGF是血清中主要的细胞有丝分裂原，是由18kD的A链和/或16kD的B链通过二硫键相连的二聚体。体内有三种二聚体形式(PDGF-AA，AB，BB)，具有多种生物学功能，是多种细胞的强力丝裂原和趋化物。PDGF可促进皮肤上皮细胞营养代谢，保护皮肤及预防皮肤由于各种原因导致的损伤。PDGF还可以有效地促进皮下胶原细胞的功能，加速皮肤胶原细胞的生长，加速细胞分泌胶原，从而达到抗皱及延缓衰老的作用。
目前研究发现PDGF在损伤修复过程中起重要作用，具有愈伤活性，主要是增加粒状组织形成的活性，美国FDA已批准酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达的人重组血小板衍生生长因子(PDGF-BB)的羧甲基纤维素钠胶(NaCMC)用于远端神经性糖尿病溃疡的治疗，及软组织损伤的临床试验。
PDGF B链是由22号染色体上6个外显子基因产生的。B链基因与正常人细胞中的c-sis基因完全一样，c-sis基因编码的蛋白为分子量27kD，共241个氨基酸的前肽原，它包含有20个氨基酸的信号序列，61个氨基酸的肽原和一个16kD，160个氨基酸的成熟多肽。在成熟B链的C端很可能发生了裂解，形成的最终成熟产物是一12kD，109个氨基酸的多肽。可产生B链蛋白的细胞包括胎儿成纤维细胞、内皮细胞、血小板、巨噬细胞、神经细胞和胸乳腺导管上皮细胞。在生理状态下，PDGF以α颗粒的形式储存于血小板中。
从人血小板提取物中分离纯化的PDGF-BB，通过N端氨基酸分析表明存在三种不同的剪切形式，20％Ser1，45％Thr6及35％Thr33，这些切割的异质性，导致在纯化PDGF中的不均一性。(Hart CE，Bailey M，Curtis DA et al.Purificationof PDGF-AB and PDGF-BB from human platelet extracts and identification ofall three PDGF dimers in human platelets.Biochemistry.1990；29(1)：166-72.)。酿酒酵母表达的109个氨基酸的重组PDGF-BB(Cook AE，Kirwin PM，CraigS et al.Purification and analysis of proteinase-resistant mutants ofrecombinant platelet-derived growth factor-BB exhibiting improvedbiological activity.Biochem J.1992；281：57-65)，N端氨基酸序列同样存在2种主要形式，即109个氨基酸的全长B链和104个氨基酸的缺失B链，导致重组蛋白可能形成3种不同分子量的蛋白混合物，即109个氨基酸全长的和104个氨基酸剪切后的及两者混合的二聚体，且3种蛋白的比例不可控，使得PDGF-BB的精确质量控制较困难。另外，PDGF-BB在酿酒酵母中表达，表达量低(仅为0.4mg/L)，成本高，产物过糖基化，限制了它的广泛使用。
毕赤酵母表达系统(Pichia pastoris)是近几年建立的一种真核表达系统(Cereghino J L，Cregg J M.Heterologous protein expression in themethylotrophic yeast Pichia pastoris[J].FEMS Microbiol Rev，2000，24(1)：45-66)，是表达外源蛋白最成功的表达系统之一。由于它既具有原核表达系统繁殖迅速，费用低及操作简便的特点，又具有真核表达系统能对重组蛋白进行正确加工、折叠及适度糖基化的优点。目前已有200多种蛋白在该表达系统中得以表达(Cregg JM，Cereghino JL，Shi JY，et al.Recombinant protein expression inPichia pastoris[J].Mol Biotechnol，2000，16(1)：23-52)。
发明创造内容
本发明的目的是提供一种重组人血小板衍生生长因子及其编码基因。
本发明所提供的重组人血小板衍生生长因子，名称为Thr6-PDGF-BB，是由两条B链组成的二聚体，所述B链是具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的多肽或为SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：1相同活性的由SEQ ID №：1衍生的多肽。
序列表中的SEQ ID №：1由104个氨基酸残基组成。
上述重组人血小板衍生生长因子B链的编码基因，具有下列核苷酸序列之一：
1)序列表中的SEQ ID №：2；
2)编码序列表中SEQ ID №：1多肽序列的多核苷酸；
3)与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能多肽的DNA序列；
4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：2杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS，65℃。
序列表中的SEQ ID №：2由312个碱基组成。
含有本发明的重组人血小板衍生生长因子B链编码基因的载体、细胞系及宿主菌，如pPIC9Kmp和含有pPIC9Kmp的巴氏毕赤酵母GS115，pCdhfrmp和含有pCdhfrmp的CHO/dhfr-细胞株均属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种表达上述重组人血小板衍生生长因子的方法。
本发明所提供的表达重组人血小板衍生生长因子的方法，是将含有上述重组人血小板衍生生长因子B链编码基因的重组表达载体导入宿主，表达得到重组人血小板衍生生长因子。
所述宿主可为酵母菌、大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等。
所述酵母菌优选为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)；所述哺乳动物细胞优选为CHO细胞。所述巴氏毕赤酵母优选为巴氏毕赤酵母GS115。
用于构建所述重组酵母表达载体的出发载体可为在上述宿主中表达外源基因的表达载体，如可在酵母中表达的pPIC9，pPIC9K；可在大肠杆菌中表达的pBV220、pQE30、pET15；可在CHO细胞中表达的pCdhfr1(刘国奇，陈小密，徐静，于长明等携带共扩增基因的CHO细胞表达载体的构建。细胞与分子免疫学杂志2000；16(1)17-19)
本发明的重组人血小板衍生生长因子Thr6-PDGF-BB含104个氨基酸，可在毕赤酵母系统中表达，表达量大于500mg/L，且重组蛋白进行了正确加工、折叠及适度糖基化。Thr6-PDGF-BB表达纯化产物为单一分子量的蛋白纯品，纯度达99％，氨基酸序列均一，肽重复性好，能精确进行质量控制。Thr6-PDGF-BB也可在大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、枯草杆菌等宿主中表达。
本发明的重组人血小板衍生生长因子Thr6-PDGF-BB表达纯化产物的稳定性优于PDGF-BB：同为毕赤酵母表达的蛋白浓度均为1mg/ml的Thr6-PDGF-BB和PDGF-BB相同条件放置4℃12个月后，Thr6-PDGF-BB纯化产物的SDS-PAGE仍为均一的蛋白条带，而PDGF-BB纯化产物除原有的蛋白主带外，还出现多条小分子蛋白带，说明蛋白发生了降解；Thr6-PDGF-BB的比活性仍为7.5×105IU/mg蛋白，而PDGF-BB的比活性下降了40％。试验证明Thr6-PDGF-BB的稳定性优于PDGF-BB。
本发明的重组人血小板衍生生长因子及其B链编码基因与表达方法将在血小板衍生生长因子的应用中发挥重要作用。
附图说明
图1为pPIC9Kmp核酸序列测定图谱
图2为Thr6-PDGF-BB N末端氨基酸序列测定图谱。
图3为纯化后的Thr6-PDGF-BB SDS-PAGE电泳图谱
图4为纯化后的Thr6-PDGF-BB氨基酸组成分析图谱
图5为纯化后的Thr6-PDGF-BB肽质量指纹图谱
图6为毛细管电泳测定纯化后的Thr6-PDGF-BB的纯度
具体实施方式
实施例1、Thr6-PDGF-BB的表达
一、Thr6-PDGF-BB在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达
1、总RNA的提取
按Trizol试剂盒(Gibcol公司产品)说明书从人早幼粒白血病细胞系HL-60细胞中提取总RNA。
2、逆转录PCR
以提取的RNA为模板进行RT-PCR，扩增PDGF的B链部分基因(从第六个氨基酸Thr起始)，采用Promega公司逆转录试剂盒。
引物序列如下：5’端引物 5’CCG CTC GAG AAA AGA ACC ATT GCT GAG CCG GCCA 3’(带下划线的碱基为Xho I酶切位点序列)；3’端引物 5’G GAA TTC TTA GGTCAC AGG CCG T 3’(带下划线的碱基为EcoR I酶切位点序列)。
于50μl反应体系中进行一步法RT-PCR，反应体系含有AMV/Tfl5×buffer 10μl、dNTP 1mmol/L、25mmol/L MgSO4 2μl、5’端和3’端引物各50pmol、Tfl DNA聚合酶5U、AMV逆转录酶5U及总RNA 50ng。反应条件：48℃逆转录45min，94℃2min灭活逆转录酶；然后进行PCR扩增：先按如下温度程序进行35个循环：94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸40s；最后72℃总延伸7min，回收PCR产物。
3、构建分泌型重组人Thr6-PDGF-BB酵母表达载体pPIC9Kmp
用XhoI及EcoRI酶切步骤2中的PCR产物，与经同样酶切处理的分泌型酵母表达载体pPIC9连接，TSS法转化大肠杆菌，筛选阳性克隆pPIC9mp，SacI及HpaI酶切pPIC9mp，回收含有Thr6-PDGF-BB的基因片断，与经同样酶切处理的分泌型酵母表达载体pPIC9K连接，TSS法转化大肠杆菌，筛选阳性克隆pPIC9Kmp，将阳性菌株送Takara公司进行核酸序列测定，测序结果如图1所示，表明重组表达载体pPIC9Kmp构建成功，其中，插入的Thr6-PDGF-BB的B链编码基因具有序列表中序列2的核苷酸序列，Thr6-PDGF-BB的B链具有序列表序列1的氨基酸残基序列。
4、转化毕赤酵母
重组表达载体pPIC9Kmp经SacI线性化后电转化受体菌GS115，转化条件为1.5kv，25μF。转化产物涂布MD平板，筛选得到his+重组克隆，将每个克隆顺序点种于MM、MD平板，30℃培养2-3d，确定每个菌株的Mut表型。
5、高表达菌株的筛选
将筛选出的his+重组克隆接种于5ml BMGY中，30℃300r/min培养至A6002.0-6.0，室温4000r/min，离心4min。收集的菌体用BMMY悬浮并稀释至A600为1.0，30℃300r/min诱导。每12h补加甲醇至0.5％。诱导48h后收集培养上清，SDS-PAGE检测蛋白表达，选取目的蛋白(28kD左右条带)表达量高的菌株用于发酵培养。
6、发酵培养
采用补料高密度发酵方法进行发酵：从新鲜平板上挑一单菌落到种子培养基BMGY中，30℃，250r/min培养20-25h后，按10％接种量接入50L发酵罐中进行分批培养(用氨水调pH至5左右)，当碳源甘油耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加补料生长培养基(含12mL/L PTM1 50％甘油)，并维持溶氧处于30％左右。当细胞光密度(A600)为500左右时停止补料，甘油耗尽后开始流加甲醇进行诱导表达培养，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧处于30％左右，诱导培养48h后停止流加甲醇，待甲醇消耗完后放罐。
Thr6-PDGF-BB的表达量为500mg/L。而酿酒酵母表达的PDGF-BB表达量仅为0.4mg/L(Cook AE，Kirwin PM，Craig S et al.Purification and analysis ofproteinase-resistant mutants of recombinant platelet-derived growthfactor-BB exhibiting improved biological activity.Biochem J.1992；281：57-65)。
7、蛋白纯化
将发酵液经连续流离心机离心后，对20mM PB超滤，上样于装填SP XL Sepharose的阳离子交换柱，用含1mol/L NaCl的PBS洗脱；洗脱液加(NH4)2SO4至1mol/L，上样于平衡好的Phenyl Sepharose FF疏水层析柱，20mmol/L PB洗脱目的蛋白；目的蛋白峰上样于pH7.2，20mmol/L PB，0.15mol/L NaCl平衡的Superdex 75凝胶过滤柱，收集洗脱峰。洗脱峰的15％SDS-PAGE结果如图3所示，表明该洗脱峰只有一条带。图3中，M为蛋白Marker；1为纯化后的蛋白。
8、毕赤酵母表达的Thr6-PDGF-BB的重组蛋白鉴定
按目前通用的Edman化学降解法对纯化后的Thr6-PDGF-BB进行了N末端氨基酸序列测定，结果如图2所示，表明N末端15个氨基酸序列依次为TIAEP AMIAE CKTRT，与理论一致，说明该重组蛋白N端加工正确，未发生不正确剪切。
利用氨基酸自动分析仪对纯化后的Thr6-PDGF-BB进行了氨基酸组成分析，结果如图4所示，表明1mol的Thr6-PDGF-BB中含有0.0794mol天冬氨酸(D)残基，含有0.0191mol丝氨酸(S)残基，含有0.1434mol谷氨酸(E)残基，含有0.0151mol甘氨酸(G)残基，含有0.0096mol组氨酸(H)残基，含有0.1115mol精氨酸(R)残基，含有0.0676mol异亮氨酸(I)残基，含有0.0943mol丙氨酸(A)残基，含有0.068mol脯氨酸(P)残基，含有0.0202mol半胱氨酸(C)残基，含有0mol酪氨酸(Y)残基，含有0.1182mol缬氨酸(V)残基，含有0.0085mol甲硫氨酸(M)残基，含有0.0823mol赖氨酸(K)残基，含有0.0334mol苯丙氨酸(F)残基，含有0.0486mol亮氨酸(L)残基，含有0.0807mol苏氨酸(T)残基，结果与理论值一致。
肽图分析与氨基酸序列和组成分析合并研究，可作为蛋白质一级结构的精确鉴别。经化学裂解法后利用Voyager Biospectrometer飞行质谱工作站，对纯化后的Thr6-PDGF-BB进行了肽质量指纹图谱测定，结果如图5所示，表明肽图与参照品一致，进一步证明蛋白结构正确和工艺的稳定性。
利用灵敏度和分辨率都较高的BECKMAN P/ACE SYSTEM 5500毛细管电泳仪，测定了纯化后的Thr6-PDGF-BB纯度，结果如图6所示，表明Thr6-PDGF-BB的纯度达到了99％。
9、毕赤酵母表达的Thr6-PDGF-BB的生物活性测定
采用NIH 3T3细胞株/MTT法测定纯化后的Thr6-PDGF-BB生物活性，其中NIH 3T3细胞株购自中国药品生物制品检定所，效价校正参考品为PDGF-BB国际标准品，IS94/728，购自英国NIBSC。具体方法如下：消化和收集NIH 3T3细胞，配成细胞悬液，接种于96孔板，37℃、5％CO2条件下培养18-24h。吸取各孔上清，分别加入梯度稀释的样品液和标准品液，37℃、5％CO2条件下培养64-72h。加入MTT溶液，培养5h后，加入DMSO裂解液，室温放置30min后比色，测定波长510nm处的OD值，按下式计算Thr6-PDGF-BB的生物活性：样品生物活性＝国际标准品生物活性×(样品稀释倍数÷标准品预稀释倍数)×(样品半效稀释倍数÷标准品半效稀释倍数)。结果表明毕赤酵母表达的Thr6-PDGF-BB(比活性为7.5×105IU/mg)的生物学活性高于同系统表达的109个氨基酸的PDGF-BB(比活性为5×105IU/mg)，更高于酿酒酵母表达的PDGF-BB(比活性为1×104IU/mg)。(Cook AE，Kirwin PM，Craig S et al.Purification and analysis of proteinase-resistant mutants of recombinantplatelet-derived growth factor-BB exhibiting improved biological activity.Biochem.J.1992；281：57-65)。将纯化后的Thr6-PDGF-BB和同为毕赤酵母表达的蛋白浓度均为1mg/ml的Thr6-PDGF-BB和PDGF-BB相同条件放置4℃12个月后，进行以下操作：
1)进行15％SDS-PAGE电泳，结果表明Thr6-PDGF-BB纯化产物仍为均一的蛋白条带，而PDGF-BB纯化产物除原有的蛋白主带外，还出现多条小分子蛋白带，说明蛋白发生了降解；
2)按照上述方法进行生物活性检测的结果表明，Thr6-PDGF-BB的比活性仍为7.5×105IU/mg蛋白，而PDGF-BB的比活性从5×105IU/mg下降为3×105IU/mg蛋白，下降了40％。
二、Thr6-PDGF-BB在大肠杆菌中的表达
1、Thr6-PDGF-BB的表达
设计引物：上游引物，CGG AAT TCA TGA CCA TTG CTG AGC 下游引物，CGG CATCCT TAT CAG GTC ACA GGC CGT GCA，分别在两端引入EcoRI和BamHI酶切位点，以pPIC9Kmp为模板扩增Thr6-PDGF-BB的B链编码基因，其中，反应程序为先按如下温度程序进行30个循环：94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸40s；最后72℃总延伸7min，回收PCR产物。将回收的PCR产物用限制性内切酶EcoRI和BamHI消化，与经过同样处理的原核表达载体pBV220连接，转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆。将阳性克隆经30℃过夜活化，次日以2％比例接种于LB培养基，30℃培养至对数生长期(A600＝0.4-0.6)，立即转入42℃水浴摇床，200r/min培养4h，诱导目的蛋白的表达。离心，重悬沉淀，超声破碎菌体，将沉淀物和上清进行SDS-PAGE，确定目的蛋白主要以包涵体的形式表达。包涵体经2mol/L尿素洗涤2次，8mol/L尿素变性溶解，溶解上清进行Superdex75凝胶过滤，纯化的样品在复性缓冲液(100mmol/L Na2HPO4、100mmol/L NaH2PO4、0.1mmol/LGSSG、1mmol/L GSH、0.1％PEG)4℃复性24h，获得目的蛋白。
2、大肠杆菌表达的Thr6-PDGF-BB的生物活性测定
测定方法同上述毕赤酵母表达的Thr6-PDGF-BB的生物活性测定。结果表明大肠杆菌表达的Thr6-PDGF-BB比活性为1×105IU/mg，而同系统表达的PDGF-BB比活性为7×104IU/mg。
三、Thr6-PDGF-BB在哺乳动物细胞中的表达
1、Thr6-PDGF-BB的表达
设计引物：上游引物C CTC GAG ACC ATG GAC CAT TGC TGA GCC GGC C下游引物GC GTCGAC TTA TCA GGT CAC AGG CCG TGC A，分别在5’端，3’端引入酶切位点XhoI及SalI，5’端引入起始密码子ACC ATG G，以pPIC9Kmp为模板扩增Thr6-PDGF-BB的B链编码基因，其中，反应程序为先按如下温度程序进行30个循环：94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸40s；最后72℃总延伸7min，回收PCR产物。将回收的PCR产物用限制性内切酶XhoI及SalI消化，与经过同样处理的表达载体pCdhfr1(刘国奇，陈小密，徐静，于长明等携带共扩增基因的CHO细胞表达载体的构建。细胞与分子免疫学杂志2000；16(1)17-19)连接，转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆pCdhfrmp，提取质粒已备转染。转染采用脂质体法，转染试剂Lipofectamine plus(购自Gibco公司)。CHO/dhfr-细胞株购自ATCC，转染24h后，换新鲜IMDM培养液(含10％的透析胎牛血清)，之后每4d换液一次。经过2周的培养，待细胞形成克隆，挑取单个克隆于24孔板中继续培养，收集上清检测目的蛋白的表达，阳性克隆用1×10-6mol/L氨甲喋呤(MTX)进行加压筛选以提高表达量。Thr6-PDGF-BB的表达量为100μg/每106个细胞/d。
2、哺乳动物细胞表达的Thr6-PDGF-BB的生物活性测定
测定方法同上述毕赤酵母表达的Thr6-PDGF-BB的生物活性测定。结果表明哺乳动物细胞表达的Thr6-PDGF-BB比活性为1×106IU/mg，而同系统表达的PDGF-BB比活性为7×105IU/mg。
序列表
<160>2
<210>1
<211>104
<212>PRT
<213>人属人(Homo sapiens)
<400>1
Thr Ile Ala Glu Pro Ala Met Ile Ala Glu Cys Lys Thr Arg Thr Glu
1 5 10 15
Val Phe Glu Ile Ser Arg Arg Leu Ile Asp Arg Thr Asn Ala Asn Phe
20 25 30
Leu Val Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Gln Arg Cys Ser Gly Cys Cys
35 40 45
Asn Asn Arg Asn Val Gln Cys Arg Pro Thr Gln Val Gln Leu Arg Pro
50 55 60
Val Gln Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg Lys Lys Pro Ile Phe Lys
65 70 75 80
Lys Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp His Leu Ala Cys Lys Cys Glu Thr
85 90 95
Val Ala Ala Ala Arg Pro Val Thr
100
<210>2
<211>312
<212>DNA
<213>人属人(Homo sapiens)
<400>2
accattgctg agccggccat gatcgccgag tgcaagacgc gcaccgaggt gttcgagatc 60
tcccggcgcc tcatagaccg caccaacgcc aacttcctgg tgtggccgcc ctgtgtggag 120
gtgcagcgct gctccggctg ctgcaacaac cgcaacgtgc agtgccgccc cacccaggtg 180
cagctgcgac ctgtccaggt gagaaagatc gagattgtgc ggaagaagcc aatctttaag 240
aaggccacgg tgacgctgga agaccacctg gcatgcaagt gtgagacagt ggcagctgca 300
cggcctgtga cc 312
Claims (10)
1、一种重组人血小板衍生生长因子，是由两个B链组成的二聚体，所述B链是具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的多肽或为SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：1相同活性的由SEQ ID №：1衍生的多肽。
2、权利要求1所述的重组人血小板衍生生长因子B链的编码基因，具有下列核苷酸序列之一：
1)序列表中的SEQ ID №：2；
2)编码序列表中SEQ ID №：1多肽序列的多核苷酸；
3)与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能多肽的DNA序列；
4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：2杂交的核苷酸序列。
3、含有权利要求2所述重组人血小板衍生生长因子B链编码基因的载体、细胞系及宿主菌。
4、根据权利要求3所述的载体、细胞系及宿主菌，其特征在于：所述载体为pPIC9Kmp或pCdhfrmp；所述宿主菌为含有pPIC9Kmp的巴氏毕赤酵母GS115；所述细胞系为含有pCdhfrmp的CHO/dhfr-细胞株。
5、一种表达权利要求1所述重组人血小板衍生生长因子的方法，是将含有重组人血小板衍生生长因子B链编码基因的重组表达载体导入宿主，表达得到重组人血小板衍生生长因子。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述宿主为酵母菌，大肠杆菌，哺乳动物细胞，昆虫细胞或枯草杆菌。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述酵母菌为巴氏毕赤酵母。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述巴氏毕赤酵母为巴氏毕赤酵母GS115；所述重组表达载体为pPIC9Kmp。
9、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述宿主为CHO细胞。
10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述CHO细胞为CHO/dhfr-细胞株；所述重组表达载体为pCdhfrmp。
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