CN1962873A - 一种IFN－λ1的表达方法及其专用表达载体和工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种IFN－λ1的表达方法及其专用表达载体和工程菌。该专用表达载体，是含有IFN－λ1基因表达盒的嗜甲醇酵母表达载体；所述IFN－λ1基因表达盒包括α因子的前导肽编码序列、编码前体IFN－λ1自氨基端第20至200位氨基酸残基的基因序列以及醇氧化酶(AOX)基因的启动子和终止子；所述α因子前导肽具有序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列；所述前体IFN－λ1具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列。本发明为高效、大量、低成本生产IFN－λ1提供了一种有效方法，具有较高的实际应用价值。

Description

一种IFN-λ1的表达方法及其专用表达载体和工程菌

技术领域

本发明涉及IFN-λ1的表达方法及其专用表达载体和工程菌。

背景技术

IFN-λs是最新发现的一类具有抗病毒活性的干扰素样细胞因子，包括IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)和IFN-λ3(IL-28B)。IFN-λs在基因结构上与IL-10家族十分相似，而在氨基酸组成和功能方面与I型IFN更为接近，在IL-10家族和I型IFN之间建立了进化上的联系。IFN-λs，尤其是IFN-λ1的抗病毒活性最强，具有开发成广谱抗病毒药物的潜在价值。

干扰素(interferon，IFN)是人类最早认识的细胞因子，早在1957年Isaacs和Lindenmann就从感染流感病毒的鸡胚中发现了一种具有抗病毒活性的蛋白质，将其称之为interferon并一直沿用至今(Isaacs A.& Lindenmann J.(1957)Virusinterference.I.The interferon.Proc R Soc Lond B Biol Sci.147(927)：258-267.)。在那以后的许多年里，干扰素只是作为病毒复制的抑制物而为人所知。后来越来越多的证据表明IFNs实际上是一类多效因子，除了具有强大的广谱抗病毒活性，还具有抑制细胞增殖、调节细胞分化和免疫调节等多种功能。人类IFNs包括I型IFN家族和II型IFN家族，以及一个新发现的IFN-λs家族。II型IFN家族仅有IFN-γ一个成员，基因位于12号染色体，IFN-γ与受体IFN-γR结合，其功能主要是免疫调节。I型IFN家族包括至少13种IFN-α非等位基因，编码13种亚型的IFN-α，1个IFN-β基因，1个IFN-ω基因，各编码一种IFN，以及了解尚少的IFN-κ和IFN-ε(LaFleur D.W.，Nardelli B.，Tsareva T.，Mather D.，Feng P.，SemenukM.，Taylor K.，Buergin M.，Chinchilla D.，Roshke V.，Chen G.，Ruben S.M.，PithaP.M.，Coleman T.A.& Moore P.A.(2001)Interferon-kappa，a novel type Iinterferon expressed in human keratinocytes. J Biol Chem.276(43)：39765-39771.)。所有I型IFN基因均位于9号染色体，没有内含子，并且所编码蛋白全部使用同一种受体IFN-αβR。鼠类有一种称为limitin的I型IFN，现在命名为IFN-ζ，至今在人类还没有发现其对应物(Oritani K.，Medina K.L.，Tomiyama Y.，Ishikawa J.，Okajima Y.，Ogawa M.，Yokota T.，Aoyama K.，Takahashi I.，KincadeP.W.& Matsuzawa Y.(2000)Limitin：An interferon-like cytokine thatpreferentially influences B-lymphocyte precursors.Nat Med.6(6)：659-666.)。在反刍动物和猪体内还分别存在一种称为滋养层IFN的I型IFN，即IFN-τ和IFN-δ，其功能主要跟这类动物的受孕有关(Kontsek P.，Karayianni-Vasconcelos G.&Kontsekova E.(2003)The human interferon system：characterization andclassification after discovery of novel members.Acta Virol.；47(4)：201-215.)。

2003年，美国的两个研究小组同时报道了一个全新的IFN家族，即IFN-λs(Sheppard P.，Kindsvogel W.，Xu W.，Henderson K.，Schlutsmeyer S.，WhitmoreT.E.，Kuestner R.，Garrigues U.，Birks C.，Roraback J.，Ostrander C.，DongD.，Shin J.，Presnell S.，Fox B.，Haldeman B.，Cooper E.，Taft D.，GilbertT.，Grant F.J.，Tackett M.，Krivan W.，McKnight G.，Clegg C.，Foster D.&Klucher K.M.(2003)IL-28，IL-29 and their class II cytokine receptor IL-28R.Nat Immunol.4(1)，63-68.)，并把它们归入I型IFN。但多数人倾向于把IFN-λs独立归类，甚至已有人把它们归类为III型IFN(Bartlett N.W.，Buttigieg K.，KotenkoS.V.& Smith G.L.(2005)Murine interferon lambdas(type III interferons)exhibit potent antiviral activity in vivo in a poxvirus infection model.JGen Virol.86(6)：1589-1596.)。IFN-λ包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3。其中IFN-λ2和IFN-λ3由同一个基因编码，氨基酸残基序列的相似性达96％，IFN-λ2和IFN-λ1残基序列的同源性也可达81％。同I型IFN不同，IFN-λ基因位于19号染色体，基因中含有多个内含子，其基因结构与IL-10家族成员十分相似，而与IFN-α相差甚远，因此IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3又分别被命名为IL-29、IL-28A和IL-28B。尽管IFN-λs在结构上与IFN-α明显不同，三种IFN-λs也只有15-19％的氨基酸与IFN-α相同，但IFN-λs在功能上与IFN-α十分相似，可被病毒和双链RNA诱生，对水泡性口炎病毒(VSV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)等病毒具有较强的抑制作用(Bobek M.D.，Boyd B.S.& Chisari F.V.(2005)Lambda interferoninhibits hepatitis B and C virus replication. J Virol.79(6)：3851-3854)。

三种IFN-λs使用同一种与IFN-αβR完全不同的受体IFN-λR，和IFN-αβR同属于II型细胞因子受体家族(Class II cytokine receptor family，CRF2)。IFN-λR由大小两个亚基构成，即大亚基CRF2-12(又称IL-28Rα)和小亚基CRF2-4，其中CRF2-12是IFN-λR特有的亚基。IFN-λR在非造血系统广泛表达，但在白细胞上表达很少，因此，理论上IFN-λs对造血系统的抑制作用应比IFN-α小(Brand S.，Zitzmann K.，Dambacher J.，Beigel F.，Olszak T.，Vlotides G.，Eichhorst S.T.，Goke B.，Diepolder H.& Auernhammer C.J.(2005)SOCS-1 inhibits expression of theantiviral proteins 2’，5’-OAS and MxA induced by the novel interferon-lambdasIL-28A and IL-29.Biochem Biophys Res Commun.331(2)：543-548.)。同所有II型细胞因子受体复合物相似，IFN-λR通过JAK-STAT(Janus kinases-signaltransducers and activators of transcription)通路传递配基信号。IFN-λR主要激活STAT1和STAT2，这一点与IFN-αβR相同，同时IFN-λR还可大量激活STAT3、STAT4和STAT5，与IL-10R十分相似。

嗜甲醇酵母可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长，这是因为其细胞的过氧化物酶体中含有甲醇代谢途径所必需的酶，如醇氧化酶，二羟丙酮合成酶和过氧化氢酶等，其中醇氧化酶(AOX)是甲醇利用途径中的第一个酶，它催化甲醇被氧化成甲醛和过氧化氢。AOX由AOX1和AOX2两个基因编码，AOX2基因与AOX1基因序列相似，有92％的同源性，其编码蛋白有97％的同源性；AOX1基因严格受甲醇诱导和调控，AOX1基因的编码产物在氧化过程中起主要作用。在甲醇培养的细胞中，醇氧化酶可占总蛋白的30％以上，而在以葡萄糖、甘油、乙醇为碳源生长时，则不能检测到AOX的活性。嗜甲醇酵母表达系统兼具原核和真核表达系统的许多优点，安全，经济，操作简单，表达水平高，并能对外源蛋白进行糖基化修饰，表达的蛋白往往具有很好的生物活性。当外源基因随着表达载体进入嗜甲醇酵母胞内后，通过载体上的同源序列整合到酵母基因组DNA中，形成稳定的重组表达菌株。提高目的基因在工程菌中的拷贝数往往可有效提高外源蛋白的表达水平，体外构建多拷贝表达质粒并转化酵母，能在较短时间内得到多拷贝工程菌。

受外源基因是否带有信号肽编码序列的调控，嗜甲醇酵母或以非分泌形式表达外源蛋白，或将外源蛋白分泌到胞外。外源蛋白以非分泌形式表达时，容易受到宿主蛋白酶的降解，同时酵母细胞壁不易裂解，也给后期纯化带来困难。分泌型重组蛋白可以使用自身或异源信号肽，嗜甲醇酵母表达系统最常用的信号肽是来自酿酒酵母交配信息素-α因子(α-factor)的前导肽(Brenner C.& Fuller R.S.(1992)Structuraland enzymatic characterization of a purified prohormone-processing enzyme：secreted，soluble Kex2 protease.Proc Natl Acad Sci.89(3)：922-926.)。

发明内容

本发明的目的是提供一种IFN-λ1的专用表达载体。

本发明所提供的IFN-λ1的专用表达载体，是含有IFN-λ1基因表达盒的嗜甲醇酵母表达载体；所述IFN-λ1基因表达盒包括α因子的前导肽编码序列、编码前体IFN-λ1自氨基端(N端)第20至200位氨基酸残基的基因序列以及醇氧化酶(AOX)基因的启动子和终止子；所述α因子前导肽具有序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列；所述前体IFN-λ1具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列。

所述α因子前导肽由85个氨基酸残基组成，自氨基端第83至85位氨基酸残基为KEX2蛋白酶识别位点，其氨基酸残基序列为：Asp-Lys-Arg。前体IFN-λ1由200个氨基酸残基组成，其中自氨基端(N端)第20至200位氨基酸残基由181个氨基酸残基组成。

在上述载体中，α因子前导肽编码序列与编码前体IFN-λ1自氨基端第20至200位氨基酸残基的基因序列形成融合基因，α因子前导肽编码序列位于编码前体IFN-λ1自氨基端第20至200位氨基酸残基的基因的5’端，KEX2蛋白酶识别位点(Asp-Lys-Arg)的编码序列位于所述融合基因的融合区域；所述醇氧化酶(AOX)基因的启动子和终止子分别位于所述融合基因的5’及3’端。

为提高基因的表达效率，所述IFN-λ1基因表达盒在载体中的拷贝数优选为4。

用于构建所述含有IFN-λ1基因表达盒的嗜甲醇酵母表达载体可为任意一种适于外源基因表达的嗜甲醇酵母表达载体，如pA0815等。

以pA0815为出发载体，构建的含有4个拷贝IFN-λ1基因表达盒的嗜甲醇酵母表达载体为pA-4αF-IFNλ1²⁰。

本发明的第二个目的是提供一种表达IFN-λ1的专用工程菌。

本发明所提供的表达IFN-λ1的专用工程菌，是将上述IFN-λ1的专用表达载体导入嗜甲醇酵母中得到的。

所述嗜甲醇酵母可为任意适于蛋白表达的嗜甲醇酵母菌株，如嗜甲醇酵母GS115等。

以嗜甲醇酵母GS115为出发菌株，构建的转化有pA-4αF-IFNλ1²⁰的重组嗜甲醇酵母菌株为BC-IFNλ1²⁰。

为提高转化效率，将所构建的重组表达载体导入嗜甲醇酵母中的方法优选为电穿孔转化法，但也可以采用其它生物工程领域中常用的方法，例如，氯化锂转化法、原生质体转化法等。

本发明的另一个目的是提供一种IFN-λ1的表达和纯化方法。

本发明所提供的IFN-λ1的表达方法，是发酵上述IFN-λ1的专用表达工程菌，经诱导后，对发酵液进行纯化得到IFN-λ1。

发酵重组嗜甲醇酵母时需加入甲醇作为诱导剂，所加入甲醇的浓度为0.5-1.5％，优选为0.5％。所述百分比浓度为体积百分比浓度。

对表达产物进行纯化的方法可为一步性强阳离子交换层析法。

本发明提供了一种IFN-λ1的表达载体、工程菌的构建及该干扰素一步性纯化方法。本发明实现了干扰素IFN-λ1基因在嗜甲醇酵母中的高效分泌性地正确表达，表达水平大于30mg/L，表达的重组蛋白由其前体IFN-λ1中第20位氨基酸至200位氨基酸组成，由181个氨基酸残基组成，且经一步性强阳离子交换层析法纯化后得到的高纯度重组IFN-λ1蛋白具有激活胞内信号蛋白的生物学活性。本发明为高效、大量、低成本生产具有生物活性的IFN-λ1提供了一种有效方法，具有较高的实际应用价值。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。

附图说明

图1为pA-4αF-IFNλ1的构建示意图

图2为含有1、2、3、4拷贝融合基因αF-IFNλ1²⁰表达盒的酵母表达载体的双酶切鉴定结果

图3为BC-IFNλ1²³和BC-IFNλ1²⁰发酵产物的SDS-PAGE和Western blotting检测结果

图4为BC-IFNλ1²³和BC-IFNλ1²⁰4种发酵产物的N端氨基酸测序分析结果

图5为BC-IFNλ1²⁰表达并经纯化的rhIFN-λ1的SDS-PAGE检测结果

图6为rhIFN-λ1诱导Hela细胞内STAT1的磷酸化水平检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有引物合成及测序工作均由上海生工完成，甘油和甲醇百分比浓度为体积百分比浓度，其余溶液百分比浓度均为质量百分比浓度。

实施例1、IFN-λ1的表达

一、IFN-λ1专用表达载体的构建

1、IFN-λ1基因的扩增

抽取健康中国人外周血10mL，用Ficoll密度梯度离心法分离淋巴细胞，使用RPMI 1640培养液(HyClone公司产品)37℃培养，CO₂浓度5.5％。细胞长至约60％丰度时，加入干扰素诱生剂poly(I)·poly(C)(浙江万马制药)至100μg/mL刺激淋巴细胞，使之转录IFN-λ1 mRNA，37℃继续孵育20h。离心收获细胞，使用TRIZOL试剂(Invitrogen)并依照产品说明书提取细胞总RNA。取出10μg RNA作为模板，使用Promega公司的反转录试剂盒并参照试剂盒说明书用AMV逆转录酶和引物Oligo(dT)，48℃ 45min进行逆转录反应，以获得前体IFN-λ1的cDNA。反应结束后，取5μL反应液作为模板，采用套式PCR技术扩增IFN-λ1 cDNA。第一轮PCR使用引物IFNλ1-F1(5’-TTGGACCGTGGTGCTGGTGACTTTG-3’)和IFNλ1-R1(5’-CAGCGCATAAATAAGGTGTGGGGTGTCAGG-3’)，PCR反应体系为：dNTP(2.5mM)2μL，IFNλ1-F1和IFNλ1-F1(10μM)各2.5μL，cDNA 5μL，Vent DNA聚合酶(NEB公司)0.5μL，10×PCR缓冲液2.5μL，加去离子水至25μL；反应条件为：先94℃30s，55℃ 30s，72℃ 1min，共30个循环；然后72℃ 8min。第二轮PCR以第一轮PCR产物为模板，使用引物IFNλ1-F2(5’-CCCACTTCCAAGCCCACCACAAC-3’)和IFNλ1-R2(5’-CG GAATTCGTGGGGTGTCAGGTGGACTCAG-3’带下划线碱基为限制性内切酶EcoRI的识别位点，斜体加黑部分碱基为终止密码子)进行扩增，PCR反应体系为：dNTP(2.5mM)4μL，IFNλ1-F2和IFNλ1-R2(10μM)各5μL，模板1μL，Vent DNA聚合酶1μL，10×PCR缓冲液5μL，加去离子水至50μL；反应条件为：先94℃ 2min；然后94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，共30个循环，然后72℃延伸8min。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约550bp的目的片段，用限制性内切酶EcoRI酶切后，克隆入经限制性内切酶XmnI和EcoRI双酶切的载体pMAL-c2X(NEB公司)中。转化大肠杆菌DH5α菌株，筛选阳性克隆，将含有IFN-λ1 cDNA的重组质粒载体命名为pMAL-IFNλ1，对其进行测序，结果所克隆的IFN-λ1 cDNA具有序列表中SEQ ID №：1自5’端第67至603位碱基的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №：1由603个碱基组成，其编码序列为自5’端第1至603位碱基，编码序列表中SEQ ID №：2前体IFN-λ1的氨基酸序列。DNA测序结果表明所克隆的IFN-λ1 cDNA编码SEQ ID №：2中自氨基端(N端)第23(Gly²³)至200位氨基酸序列，并且Lys⁴⁰(SEQ ID №：2自N端第40位氨基酸残基)的密码子为AAG(SEQID №：1自5’端第118-120位碱基)，而非文献报道的AAA(施国民，张锦海，李越希&吴玉章.人白细胞介素29的cDNA克隆和序列分析.中国生物工程杂志.2004，24(10)：34-37.；李明才何韶衡.人白细胞介素(IL)-28和IL-29基因的克隆与序列分析.细胞与分子免疫学杂志.2004，20(5)：635-637.)，此差异可能为单核苷酸多态性或源自RT-PCR过程中的碱基错配。

二、构建含有4拷贝融合基因αF-IFNλ1表达盒的酵母表达载体

IFN-λ1的前体蛋白由200个氨基酸残基构成(序列表中的SEQ ID №：2)。使用专业软件SignalP 3.0 Server对其信号肽进行预测，预测结果表明IFN-λ1的信号肽长19aa(序列表中SEQ ID №：2自N端第1-19位氨基酸残基)，而IFN-λ1的发现者认为其信号肽长22aa(序列表中SEQ ID №：2自N端第1-22位氨基酸残基)(KotenkoS.V.，Gallagher G.，Baurin V.V.，Lewis-Antes A.，Shen M.，Shah N.K.，LangerJ.A.，Sheikh F.，Dickensheets H.& Donnelly R.P.(2003)IFN-lambdas mediateantiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex.Nat Immunol.4(1)，69-77.)。根据上述两种不同的预测结果，设计了2种扩增不含其信号肽的IFN-λ1基因的5’端引物IFNλ1-F3：5’-GGGGTATCTTTGGATAAAAGACCCACTTCCAAGCCCACC-3’和IFNλ1-F4：5’-GTATCTTTGGATAAAAGAGGTCCTGTTCCCACTTCCAAGCCCACC-3’(斜体加黑部分分别为两种成熟IFN-λ1的N末端氨基酸的密码子，其5’端的核苷酸顺序为酵母α因子前导肽的3’末端顺序)，编码的氨基酸分别始自IFN-λ1前体蛋白氨基酸序列第23位的Pro²³和第20位的Gly²⁰。

以pMAL-IFNλ1质粒为模板，分别使用引物对IFNλ1-F3和IFNλ1-R2以及引物对IFNλ1-F4和IFNλ1-R2扩增IFN-λ1基因，PCR反应体系为：2.5mM dNTP 4μL，引物(10μM)各5μL，模板0.5μL，Vent DNA聚合酶1μL，10×PCR缓冲液5μL，加去离子水至50μL；反应条件为：先94℃ 4min；然后94℃ 1min，55℃ 1min，72℃1min，共30个循环；最后72℃ 8min。同时以含有酿酒酵母α因子编码基因的酵母表达载体pA0815-αF-EGF(黄秉仁，蔡良琬，廖洪涛，唐申秀，周海涛.人工合成表皮生长因子基因在甲基营养型酵母中的高效表达.中国生物化学与分子生物学报1998，14(5)512-517)为模板，在引物αFactor-F：

5’-G GAATTCACCATGAGATTTCCTTCAATTTTT-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I的识别位点，斜体加黑部分碱基为起始密码子)和αFactor-R：

5’-TCTTTTATCCAAAGATACCCCTTCTTCT-3’的引导下，PCR扩增酿酒酵母α因子前导肽的编码序列。所述α因子前导肽具有序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列，序列表中的SEQ ID №：3由85个氨基酸残基组成(即图4 KEX2位点前的序列)，其C末端为KEX2蛋白酶识别位点(Asp-Lys-Arg)，便于产生具有天然N末端的重组蛋白。然后分别以所扩增的两种不含其自身信号肽的IFN-λ1基因和α因子前导肽编码区的DNA序列为模板，使用引物αFactor-F和IFNλ1-R2，用重叠PCR的方法扩增α因子前导肽编码区和不含其自身信号肽的IFN-λ1基因的融合基因的序列，α因子前导肽编码区位于IFN-λ1基因的5’端，将获得的两种融合基因分别命名为αF-IFNλ1²³和αF-IFNλ1²⁰，PCR反应体系为：等摩尔比的IFN-λ1和α因子前导肽DNA，2.5mM dNTP 8μL，Vent DNA聚合酶2μL，10×PCR缓冲液8μL，加去离子水至80μL，先94℃ 1min，42℃ 1min，72℃ 1min，5个循环后，向反应液中加入10×PCR缓冲液2μL，引物αFactor-F和IFNλ1-R2各10μL，再94℃ 2min；然后94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，共30个循环；最后72℃ 8min。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果分别扩增出了约820bp的DNA片段(注：两种融合基因仅相差9bp)，与预期结果相符。回收并纯化该融合基因αF-IFNλ1²⁰的DNA片段，将其用限制性内切酶EcoRI酶切后，克隆入经EcoRI酶切的酵母表达载体pA0815(该载体包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的启动子和转录终止子(5’AOX1和3’AOX1)，购自Invitrogen公司)中，得到含有融合基因αF-IFNλ1²⁰的重组表达载体，命名为pA-αF-IFNλ1²⁰。利用限制性内切酶BamH I和Bgl II将融合基因αF-IFNλ1的表达盒从载体pA-αF-IFNλ1²⁰上切下，用BamH I单酶切pA-αF-IFNλ1²⁰使其线性化，将融合基因αF-IFNλ1²⁰的表达盒和线性化的pA-αF-IFNλ1²⁰用T4 DNA连接酶连接，使2个αF-IFNλ1²⁰的表达盒串联在一起。将连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，筛选阳性克隆，提质粒，用BamH I和Bgl II双酶切鉴定串联的正、反向，正向串联的表达盒由于BamHI和Bgl II同尾酶序列连接而消除了BamH I位点，用BamH I和Bgl II双酶切不会再出现αF-IFNλ1的单拷贝表达盒，将含有正向2拷贝αF-IFNλ1²⁰表达盒的质粒命名为pA-2αF-IFNλ1²⁰，在pA-2αF-IFNλ1²⁰基础上可进一步构建含有更多αF-IFNλ1表达盒拷贝数的嗜甲醇酵母表达载体。按照上述同样的方法，最终得到含有3拷贝αF-IFNλ1²⁰表达盒的重组表达质粒，命名为pA-3αF-IFNλ1²⁰以及含有4拷贝αF-IFNλ1²⁰表达盒的重组表达质粒，命名为pA-4αF-IFNλ1²⁰，其构建示意图如图1所示。在上述载体的构建过程中，含有1、2、3、4拷贝αF-IFNλ1²⁰表达盒的嗜甲醇酵母表达载体的BamHI和Bgl II双酶切鉴定结果如图2所示(泳道1为lambda DNA/HindIII；泳道2为空载体pA0815；泳道3为pA-αF-IFNλ1²⁰；泳道4为pA-2αF-IFNλ1²⁰，4.0kb的载体片段和4.2kb的2拷贝表达盒重叠在一起；泳道5为pA-3αF-IFNλ1²⁰；泳道6为pA-4αF-IFNλ1²⁰)，酶切鉴定结果表明所构建的重组嗜甲醇酵母表达载体正确。用上述同样方法得到了含有4拷贝αF-IFNλ1²³表达盒的重组嗜甲醇酵母表达载体，命名为pA-αF-IFNλ1²³。

三、转化嗜甲醇酵母及其重组子的筛选

大量提取并纯化质粒pA-4αF-IFNλ1²⁰，取出10μg质粒用限制性内切酶Sal I充分消化，用酚；氯仿抽提去除酶，乙醇沉淀DNA，将线性质粒溶于10μL TE中。将嗜甲醇酵母GS115(his4缺陷型菌株，自身不能在缺乏组氨酸的培养基上生长)接种于50mL YPD培养基(1％酵母抽提物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中，30℃培养至OD₆₀₀＝1.3-1.5，1500g、4℃离心5min收集菌体细胞。将菌体先后用25mL冰水和1M冰山梨醇溶液洗涤，最后重悬于100μL 1M冰山梨醇溶液中。取出80μL，加入10μg线性质粒pA-4αF-IFNλ1²⁰，用电穿孔法转化该嗜甲醇酵母，将转化有pA-4αF-IFNλ1²⁰的重组酵母菌株命名为BC-IFNλ1²⁰，用上述同样方法得到转化有pA-4αF-IFNλ1²³的重组酵母菌株，命名为BC-IFNλ1²³。将两种转化菌涂布于组氨酸缺陷型MD培养基(1.34％YNB，4×10^-5％生物素，2％葡萄糖)上，筛选His⁺重组酵母菌株(重组菌株整合了野生型his4基因，因而可以利用组氨酸缺陷型培养基筛选转化菌株)，结果各筛选得到200余个重组克隆。

四、IFN-λ1在嗜甲醇酵母中的表达、表达产物的检测、N端测序分析及其纯化

1、IFN-λ1在嗜甲醇酵母中的表达

对步骤三获得的其中26个BC-IFNλ1²³克隆和10个BC-IFNλ1²⁰克隆进行表达水平的检测。具体方法为：在50mL离心管中用5mL BMG培养基(100mM磷酸钾，pH6.0，1.34％ YNB，4×10^-5％生物素，1％甘油)培养Mut⁺型重组酵母菌株，30℃培养36 h使菌体密度达到OD₆₀₀＝2-3。室温离心，弃去上清，将菌体重悬于10mL BMM培养基(100mM磷酸钾，pH6.0，1.34％ YNB，4×10^-5％生物素，0.5％甲醇)中，30℃继续培养诱导IFN-λ1表达。每24h取出1mL样品保存，并向剩余培养液中补加甲醇至终浓度为0.5％以维持诱导，96h后终止诱导。

2、表达产物的SDS-PAGE和Western Blotting检测

收集步骤1全部留存的样品，12000rpm离心10s，取上清，加入4×SDS加样缓冲液，煮沸5min，用SDS-PAGE和Western Blotting检测IFN-λ1的表达情况，表达样品每份取25μL，先进行15％SDS-PAGE分离蛋白，银染染色，再进一步进行WesternBlotting鉴定，所用的一抗为羊抗人IFN-λ1单克隆抗体(R&D Systems，USA)，二抗为兔抗羊IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司进口分装)，使用增强化学发光试剂盒(北京威格拉斯公司)并按试剂盒说明书进行显影。SDS-PAGE和Western blotting检测结果如图3所示(A：BC-IFNλ1²³发酵产物的SDS-PAGE检测结果；B：BC-IFNλ1²³发酵产物的Western blotting检测结果；C：BC-IFNλ1²⁰发酵产物的SDS-PAGE检测结果；D：BC-IFNλ1²⁰发酵产物的Western blotting检测结果)，以Pro²³或Gly²⁰为N末端的成熟IFN-λ1分别由178和181个氨基酸残基组成，理论分子量分别为19.7kDa和20.0kDa。BC-IFNλ1²⁰经发酵产生单一的重组IFN-λ1(rhIFN-λ1)，分子量约为22kDa，且在最适条件下，BC-IFNλ1²⁰摇瓶培养的表达量大于30mg/L。而BC-IFNλ1²³的发酵产物存在3种不同分子量的蛋白。

3、表达产物的N端氨基酸测序分析

IFN-λ1具有一个N糖基化位点，为确定上述获得的4种蛋白是αF-IFNλ1前体蛋白在不同的位点进行切割而形成的产物，还是因糖基化程度不同而造成的分子量有异，对4种蛋白进行了N末端氨基酸测序。具体方法为：取4种表达蛋白各15μg，用15％ SDS-PAGE进行分离，电泳结束后将凝胶放在CAPS电印迹缓冲液(10mM CAPS，10％甲醇)浸泡5min。PVDF膜用甲醇浸湿后放入CAPS缓冲液中，将凝胶和膜按顺序夹于转移装置，200mA低温转移2h。取出PVDF膜，用去离子水略为漂洗，甲醇浸泡10s，考马斯兰染色。PVDF膜脱色后用去离子水充分漂洗，剪下着色的IFN-λ1蛋白带，用Procise 491蛋白测序仪(AB，USA)检测N末端3-6个氨基酸序列。测序结果如图4所示(A：BC-IFNλ1²⁰表达产物，KEX2蛋白酶切除α因子前导肽序列，产生了预期的由181个氨基酸残基组成的rhIFN-λ1；B：BC-IFNλ1²³表达产物，αF-IFNλ1²³融合蛋白分别在第[1]、[2]、[3]位被未知蛋白酶切割，Pro抑制KEX2在Glu-Lys-Arg羧基端切割，带下划线氨基酸残基为N-糖基化位点)，表明这4种蛋白具有不同的N末端氨基酸，BC-IFNλ1²⁰表达的IFN-λ1N末端氨基酸为Gly(见图4中的A)，和预期结果相符。而BC-IFNλ1²³表达的3种IFN-λ1均是αF-IFNλ1前体蛋白非正常加工的产物，其中2种蛋白的切割位点位于α因子前导肽的C端，导致重组IFN-λ1的N端分别带有α因子前导肽序列的11aa和9aa，第3种蛋白在IFN-λ1序列内部切割，因而缺失了成熟IFN-λ1 N端的13aa(见图4中的B)。在BC-IFNλ1²³菌株中，αF-IFNλ1融合蛋白上的KEX2蛋白酶识别位点Asp-Lys-Arg紧邻Pro。Pro是20种α-氨基酸中唯一的亚氨基酸(imino acid)，它的α-氮原子和侧链基团共价结合，形成吡咯环，同时又通过另一个酰胺键和C端的氨基酸残基结合，造成C_α-N键不能旋转。因此，Pro具有很强的刚性，当其处于α螺旋中时，会严重阻碍其C端氨基酸的α-氨基与前一个折叠中的羰基形成氢键，从而在α螺旋中引入一个固定的结(kink)(Duclohier H.(2004)Helical kink and channel behaviour：a comparativestudy with the peptaibols alamethicin，trichotoxin and antiamoebin.EurBiophys J.33(3)：169-174)。Pro赋予蛋白抵抗各种外力的刚性，同时，Pro生成的肽键对各种蛋白水解酶都有很强的抵抗力，在哺乳动物中仅有极少的几种蛋白酶能够水解X-Pro或Pro-X(X指任何氨基酸)肽键(Cunningham D.F.& O’Connor B.(1997)Proline specific peptidases.Biochim Biophys Acta.1343(2)：160-186.)。因此，KEX2酶对αF-IFNλ1²³融合蛋白加工的失败，源于Pro抑制了KEX2对识别位点的水解，所产生的三种重组蛋白，应系其它蛋白酶作用后的产物。上述分析结果表明BC-IFNλ1²⁰的表达产物为正确的rhIFN-λ1。

4、rhIFN-λ1的纯化

IFN-λ1是一种碱性蛋白，其理论pI值为9.08，极易于和阳离子交换介质结合，因此使用SP-Sepharose Fast Flow层析柱(FPLC，购自Amersham公司)纯化BC-IFNλ1²⁰的表达产物，即rhIFN-λ1。在pH6.0-8.0的缓冲体系内rhIFN-λ1均能与SP SepharoseFF结合，但在pH7.0-7.5之间结合力最强。用PBS平衡缓冲液洗去层析柱中未与介质结合的杂蛋白，随后使用蛋白层析buffer A(1mol/L NaCl，0.05mol/L PBS，pH将7.0)和buffer B(0.05mol/L PBS，pH7.0)洗脱rhIFN-λ1。收集的洗脱液在PBS缓冲液中透析去除蛋白中的盐分，经PEG20000浓缩后再次透析，得到纯化的rhIFN-λ1。对纯化产物进行SDS-PAGE检测，检测结果如图5所示，经过一步纯化，去除了重组酵母菌培养上清中的大部分杂蛋白。用Bradford法测定蛋白浓度，同时结合SDS-PAGE检测结果，推算出rhIFN-λ1的回收率，高于70％，纯度约为95％。

实施例2、rhIFN-λ1的活性检测

IFNs通过激活JAK-STAT通路发挥其抗病毒作用，能否上调磷酸化STATs的水平是判断IFN有无活性的重要依据(Dumoutier L.，Tounsi A.，Michiels T.，SommereynsC.，Kotenko S.V.& Renauld J.C.(2004)Role of the interleukin(IL)-28receptor tyrosine residues for antiviral and antiproliferative activity ofIL-29/interferon-lambda 1：similarities with type I interferon signaling.J Biol Chem.279(31)：32269-32274.)。使用不同浓度的rhIFN-λ1刺激人宫颈癌Hela细胞，作用一定时间后裂解细胞，用pY-STAT1(701位Tyr发生磷酸化)抗体(CellSignaling Technology，USA)检测细胞裂解液中pY-STAT1含量的变化。Hela细胞复苏后以2×10⁵细胞/孔接种于12孔板，新生牛血清浓度为0.5％(北京元亨圣马生物技术研究所)。48h后换新鲜DMEM培养基(Dulbecco’s modified eagle’s medium，HyClone公司)，37℃继续培养2h。吸去培养基，加入含有不同浓度(100-400ng/mL)实施例1获得的经纯化的rhIFN-λ1的DMEM培养基，以重组人IFNα2a(rhIFNα2a，Roche公司)作为阳性对照，37℃孵育15-45min。取出培养板置于冰上，刮下细胞并转入1.5mL离心管。2000rpm、4℃离心2min，弃去培养基，细胞用冰冷的PBS(pH7.4)洗一遍。加入50μL 1×SDS加样缓冲液，煮沸5min。12000rpm室温离心5min，将上清进行8％ SDS-PAGE分离，用Western Blotting检测磷酸化信号转导和转录激活因子1(pY-STAT1)，一抗和二抗分别使用兔抗人pY-STAT1和羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司进口分装)，以β-actin为量参。结果如图6所示，同IFNα2a相似，rhIFN-λ1可在短时间内引起细胞内STAT1磷酸化。

序列表

<160>3

<210>1

<211>603

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>1

atggctgcag cttggaccgt ggtgctggtg actttggtgc taggcttggc cgtggcaggc     60

cctgtcccca cttccaagcc caccacaact gggaagggct gccacattgg caggttcaag     120

tctctgtcac cacaggagct agcgagcttc aagaaggcca gggacgcctt ggaagagtca     180

ctcaagctga aaaactggag ttgcagctct cctgtcttcc ccgggaattg ggacctgagg     240

cttctccagg tgagggagcg ccctgtggcc ttggaggctg agctggccct gacgctgaag     300

gtcctggagg ccgctgctgg cccagccctg gaggacgtcc tagaccagcc ccttcacacc     360

ctgcaccaca tcctctccca gctccaggcc tgtatccagc ctcagcccac agcagggccc     420

aggccccggg gccgcctcca ccactggctg caccggctcc aggaggcccc caaaaaggag     480

tccgctggct gcctggaggc atctgtcacc ttcaacctct tccgcctcct cacgcgagac     540

ctcaaatatg tggccgatgg gaacctgtgt ctgagaacgt caacccaccc tgagtccacc     600

tga                                                                   603

<210>2

<211>200

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>2

Met Ala Ala Ala Trp Thr Val Val Leu Val Thr Leu Val Leu Gly Leu

1               5                   10                  15

Ala Val Ala Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys

            20                  25                  30

Gly Cys His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Ala

        35                  40                  45

Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys

    50                  55                  60

Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg

65                  70                  75                  80

Leu Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala

                85                  90                  95

Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp

            100                 105                 110

Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Leu

        115                 120                 125

Gln Ala Cys Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly

    130                 135                 140

Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu

145                 150                 155                 160

Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu

                165                 170                 175

Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg

            180                 185                 190

Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr

        195                 200

<210>3

<211>85

<212>PRT

<213>酵母属酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>3

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1               5                   10                  15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

            20                  25                  30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

        35                  40                  45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

    50                  55                  60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65                  70                  75                  80

Ser Leu Asp Lys Arg

                85

Claims (9)

1、IFN-λ1的专用表达载体，是含有IFN-λ1基因表达盒的嗜甲醇酵母表达载体；所述IFN-λ1基因表达盒包括α因子的前导肽编码序列、编码前体IFN-λ1自氨基端第20至200位氨基酸残基的基因序列以及醇氧化酶基因的启动子和终止子；所述α因子前导肽具有序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列；所述前体IFN-λ1具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列。

2、根据权利要求1所述的专用表达载体，其特征在于：所述α因子前导肽编码序列与编码前体IFN-λ1自氨基端第20至200位氨基酸残基的基因序列形成融合基因，α因子前导肽编码序列位于编码前体IFN-λ1自氨基端第20至200位氨基酸残基的基因的5’端；所述醇氧化酶基因的启动子和终止子分别位于所述融合基因的5’及3’端。

3、根据权利要求1或2所述的专用表达载体，其特征在于：所述IFN-λ1基因表达盒在载体中的拷贝数为4。

4、根据权利要求3所述的专用表达载体，其特征在于：所述含有IFN-λ1基因表达盒的嗜甲醇酵母表达载体为pA-4αF-IFNλ1²⁰。

5、表达IFN-λ1的专用工程菌，是将权利要求1所述的IFN-λ1的专用表达载体导入嗜甲醇酵母中得到的。

6、根据权利要求5所述的专用工程菌，其特征在于：所述用于构建表达IFN-λ1专用工程菌的出发菌株为嗜甲醇酵母GS115。

7、根据权利要求6所述的专用工程菌，其特征在于：所述专用工程菌为BC-IFNλ1²⁰。

8、一种IFN-λ1的表达方法，是发酵权利要求5所述的IFN-λ1的专用表达工程菌，经诱导后，对发酵产物进行纯化得到IFN-λ1。

9、根据权利要求8所述的表达方法，其特征在于：所述对表达产物进行纯化的方法为一步强阳离子交换层析法。

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