CN102559737A - 一种人白细胞介素29的变异体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组人白细胞介素29(hIL-29)变异体的制备方法及表达重组hIL-29变异体的毕赤酵母工程菌。本发明的具体制备方法包括以下步骤：1)人工合成引物；2)从健康人外周血单个核细胞经反转录PCR得到hIL-29变异体的编码基因；3)构建含有hIL-29变异体编码基因的重组真核表达载体，融合于毕赤酵母表达调控元件获得重组毕赤酵母工程菌；4)培养重组毕赤酵母工程菌，于培养液添加甲醇诱导毕赤酵母工程菌表达重组hIL-29变异体；5)采用离子交换层析和分子筛层析从培养液上清纯化重组hIL-29变异体。本发明构建的重组毕赤酵母工程菌可进行高密度培养并且分泌型表达重组hIL-29变异体，适用于工业化制备重组人白细胞介素29变异体。
Description
技术领域
本发明涉及一种毕赤酵母制备重组人白细胞介素29变异体的方法及其重组工程菌。属于生物工程领域。
背景技术
人白细胞介素29(interleukin 29，IL-29)是近年发现的一种新的细胞因子，其结构和功能与I型干扰素(interferon，IFN)相似，因此又称为IFN-λ1(Sheppard P，Kindsvogel W，Xu W，et al.(2003)IL-28，IL-29and their class II cytokine receptor IL-28R.Nature Immunol.4(1)：63-68；Kotenko SV，Gallagber G，Baurin W，et al.(2003)IFN-λs mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex.Nature Immunol.4(1)：69-77)。
人IL-29基因定位于19号染色体长臂(19q13.13)，包含5个外显子，其基因结构与IL-10家族成员的基因结构相似，但与I型干扰素的基因结构(只含一个外显子)有明显差异(Onoguchi K，Yoneyama M，Takemura A，et al.(2007)Viral infections activate types I and III interferon genes through a common mechanism.J Biol Chem.282(10)：7576-7581)。IL-29的mRNA全长856bp，其开放读码框为603bp，编码的蛋白质肽链含200个氨基酸残基，肽链氨基端的19个氨基酸残基构成信号肽序列，因此，人IL-29的成熟肽是含181个氨基酸残基的多肽链。IL-29基因表达盒中启动子的结构与I型干扰素的非常相似，都包含与β-干扰素启动子结合蛋白3、干扰素启动子结合蛋白7的结合位点以及至少有一个功能性的核因子κB结合位点。
人IL-29通过与细胞膜上的受体复合物结合，起始信号的转导和发挥生物学作用。IL-29和IL-28共用一个由IL-28R1和IL-10R2组成的异二聚体受体复合物，其中IL-28R1为结合亚基，IL-10R2为辅助亚基。IL-28R1是IL-29和IL-28的共用受体中所特有的结合亚基，对IL-29的细胞应答具有特异性，辅助亚基IL-10R2也是I型干扰素、IL-10、IL-22和IL-26的受体组成部分，其在造血和非造血细胞中普遍表达，对IL-29的细胞应答无特异性(Witte K，Gruetz G，Volk HD，et al.(2009)Despite IFN-lambda receptor expression，blood immune cells，but not keratinocytes or melanocytes，have an impaired response to type III interferons：implications for therapeutic applications of these cytokines.Genes Immun.10(8)：702-714)。
人IL-29与I型干扰素共享相同的Jak-STAT信号传导途径，激活相同的Jak-STAT(janus kinase-signal transducer of transcription)信号转导途径，促进一组共同的基因表达。IL-29首先与其受体复合物形成IL28R1-IL29-IL10R2三元络合物，然后通过定位在细胞内的两条受体链转导信号，启动信号级联反应，使STAT1、STAT2、STAT3、STAT4和STAT5的酪氨酸残基 磷酸化，然后促使ISGF3(干扰素刺激基因3)进入细胞核与ISRE(干扰素刺激应答元件)相互作用，从而产生效应(Zhou Z，Hamming OJ，Ank N，et al.(2007)Type III interferon(IFN)induces a type I IFN-like response in a restricted subset of cells through signaling pathways involving both the Jak-STAT pathway and the mitogen-activated protein kinases.J Virol.81(14)：7749-7758)。因此，IL-29表现出一些与I型干扰素相同的性质，如抗病毒、抗增殖、体内抗肿瘤以及免疫调节等生物学活性。
研究发现，人体表达IL-28R1的细胞谱系较少，人体不同器官的IL-28R1表达水平有明显差异。在胃肠道、呼吸系统、心脏和一些腺体细胞的IL-28R1高水平表达，而大脑细胞表达水平最低(Katrin W，Ellen W，Robert S，et al.(2010)IL-28A，IL-28B，and IL-29：Promising cytokines with type I interferon-like properties.Cytokine & Growth Factor Reviews.21(4)：237-251)。这种受体分布的组织差异性，提示IL-29的生物学作用具有较独特的细胞靶向性，即IL-29作用的靶细胞呈局限性，由此可避免IL-29对多种细胞产生广泛的生物学效应，从而有效的降低毒性作用。
已有研究表明，对IL-28B肽链中的氨基酸残基进行诱变，可使IL-28B变异体的抗病毒活性发生显著改变(Gad HH，Dellgren C，Hamming OJ，et al.(2009)Interferon{lambda}is functionally an interferon but structurally related to the interleukin-10family.J.Biol.Chem.284，20869-20875)。由于IL-28B与IL-29的同源性高达81％，而且两者共用相同的受体，由此提示IL-29变异体具有潜在的临床应用前景，有希望研制开发出临床疗效高而副作用比I型干扰素更小的新一代干扰素药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用酵母表达重组人IL-29变异体(hIL-29t)的制备方法及其酵母工程菌。
本发明提供的技术方案如下：
(1)本发明的第一方面，提供一种hIL-29变异体的重组真核表达载体，该载体是将pPIC9KM(源于Invitrogen公司，经本实验室改造并已申请专利，申请号为：201110410391.0)与本发明所述的hIL-29变异体编码基因(SEQ ID No：1)经过重组而获得，该重组真核表达载体为pPIC9KM-hIL-29t，如图1所示；该重组载体表达的产物是肽链中有2个氨基酸残基发生突变的hIL-29变异体(SEQ ID No：2)；而且，本发明将pPIC9KM的α因子中的限制性内切酶Xho I识别位点CTC GAG与蛋白酶Kex2的识别位点GAG AAA AGA(编码产物为Glu-Lys-Arg)，通过PCR方法引入hIL-29变异体编码基因(SEQ ID No：1)的氨基端，使该重组真核表达载体表达的hIL-29变异体(SEQ ID No：2)的肽链不会因引入限制性内切酶位点而增加额外的氨基酸残基。
(2)本发明的第二方面，提供一种表达人IL-29变异体的重组酵母工程菌GS115/hIL-29t，该工程菌是毕赤酵母GS115(Invitrogen公司)被本发明所述的重组真核表达载体pPIC9KM-hIL-29t转化而获得，而且pPIC9KM中的信号肽基因序列与hIL-29变异体的编码基因均已整合到该工程菌的基因组中，因此该工程菌可分泌性表达hIL-29变异体至培养液中。
(3)本发明的第三方面，提供一种制备hIL-29变异体肽的方法，该方法包括以下步骤：
a)培养上述重组酵母工程菌，于培养液中添加0.5～1％(v/v)的甲醇为诱导剂，诱导重组酵母工程菌表达hIL-29变异体；
b)离心培养液去除菌体和不溶物，收集培养液上清经过超滤浓缩和透析除盐处理；
c)除盐后的培养上清用强阳离子交换层析柱分离纯化培养液中的hIL-29变异体，收集含有hIL-29变异体的洗脱液；
d)将含有hIL-29变异体的洗脱液用分子筛层析方法进一步纯化；
e)用SDS-PAGE和Western blotting方法分析鉴定纯化的hIL-29变异体。
附图说明
图1为重组真核表达质粒pPIC9KM-hIL-29t的构建图谱
图2为人IL-29变异体编码基因的PCR扩增结果
图3为重组真核表达质粒pPIC9KM-hIL-29t的双酶切鉴定结果
图4为纯化的重组hIL-29变异体的SDS-PAGE检测结果
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法，这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
下述实施例中，所有PCR引物的合成和DNA序列的测定均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成；所用的培养基如无特别说明均按毕赤酵母表达手册(Invitrogen公司)的配方进行配制。
实施例一、人IL-29变异体编码基因的克隆
1.设计和合成PCR引物
根据GenBank中的人IL-29基因序列和pPIC9KM载体的α因子信号肽序列，用Oligo 7软件设计一对特异性引物如下：
上游引物：5’-CTCGAGAAAAGAGGCCCTGTCCCCACTTCC-3’
下游引物：5’-GCGGCCGCTCAGGTGGACTCAGGGTGG-3’；
在上游引物中加入了限制性内切酶Xho I识别位点(CTCGAG)和蛋白酶Kex2的识别位点(GAGAAAAGA，编码产物为Glu-Lys-Arg)，下游引物中加入了Not I位点(GCGGCCGC)，扩增产物的大小约560bp。
2.人IL-29变异体编码基因的克隆
用RNA提取试剂Trizol(BBI公司)按说明书操作，从健康中国人外周血单个核细胞(PBMC)提取细胞总RNA；取提取的总RNA 1μL作为模板，用反转录试剂盒(TaKaKa公司)按说明书操作，经反转录扩增得到IL-29前体的cDNA；反转录结束后，取反应液5μL作为模板，用上述特异性引物进行PCR扩增IL-29变异体的编码基因，反应条件如下：94℃2min，94℃30s→58℃30s→72℃1min，30个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2所示；用EZ-10柱式DNA回收试剂(BBI公司)回收纯化约560bp的目的基因片段；将纯化的目的基因片段于克隆载体pUCm-T(BBI公司)相连，构建为重组质粒并命名为pUCm-29t；将重组质粒pUCm-29t转化感受态大肠杆菌JM109，接种于含IPTG和X-gaL的氨苄青霉素LB培养板，37℃培养16h，挑取阳性菌落接种液体LB培养基扩增，提取重组质粒进行测序，测序结果如SEQ ID No：1所示。测序结果经DNAMAN软件分析并与GenBank中的人IL-29的cDNA序列进行比对，结果显示重组质粒pUCm-29t中的目的基因有2个碱基发生变异，这2个发生变异的碱基分别是：第91位碱基由T(胸腺嘧啶)突变为C(胞嘧啶)，由该碱基组成的三联体密码由TTC突变为CTC，该三联体密码编码的第31位氨基酸残基由苯丙氨酸(Phe)突变为亮氨酸(Leu)；第272位碱基由T(胸腺嘧啶)突变为C(胞嘧啶)，由该碱基组成的三联体密码由CTG突变为CCG，该三联体密码编码的第91位氨基酸残基由亮氨酸(Leu)突变为脯氨酸(Pro)，如SEQ ID No：2所示。
实施例二、构建表达人IL-29变异体的重组真核表达载体
取质粒pUCm-29t和载体pPIC9KM(源于Invitrogen公司，经本实验室改造并已申请专利，申请号为：201110410391.0)分别用限制性内切酶Xho I和Not I进行双酶切，回收约560bp的目的基因片段和载体pPIC9KM的大片段，用T4DNA连接酶(BBI公司)于16℃水浴连接16h，将连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，接种于含卡那霉素的LB培养板，37℃培养过夜，挑取阳性菌落接种液体LB培养基扩增，提取重组真核表达质粒并命名为pPIC9KM-hIL-29t；用Xho I和Not I对重组真核表达质粒pPIC9KM-hIL-29t进行双酶切鉴定，同时进行测序鉴定，双酶切鉴定结果如图3所示，酶切出的大片段和小片段分别与载体pPIC9KM和目的基因的大小相符合，测序结果证实pPIC9KM-hIL-29t中的人IL-29变异体的编码基因序列与pUCm-29t中的完全一致。
实施例三、重组真核表达质粒转化酵母GS115及其高拷贝重组工程菌的筛选
提取经测序鉴定的pPIC9KM-hIL-29t，用限制性内切酶Sal I酶切后，用0.7％的琼脂糖凝 胶电泳分离并回收线性化的pPIC9KM-hIL-29t；将线性化的pPIC9KM-hIL-29t与酵母GS115感受态细胞混合后，按照毕赤酵母表达手册(Invitrogen公司)的方法进行电转化。
将转化产物涂布于不含His的MD培养板，30℃培养2～3天，挑选MD平板上生长旺盛的优势菌落接种于含0.5mg/mL G418的YPD平板，30℃培养2～3天，挑选生长旺盛的优势菌落接种于含1mg/mL G418的YPD平板，30℃培养2～3天，如此重复培养并依次增加G418浓度至4mg/mL，从含4mg/mL G418的YPD平板筛选得到高拷贝整合的毕赤酵母重组工程菌GS115/hIL-29t。
实施例四、人IL-29变异体的诱导表达、纯化及分析
将重组工程菌GS115/hIL-29t接种BMGY培养基，于30℃、250rpm/min条件下振荡培养至菌液OD600为2～3时，转换为BMMY培养基继续培养，每隔24h加入终浓度为1％的甲醇诱导表达，连续培养96h，离心收集培养上清，先用SDS-PAGE检测培养上清中hIL-29变异体的表达情况，然后用羊抗人IL-29多克隆抗体(R＆D公司)进行Western blotting鉴定表达的hIL-29变异体。将培养上清先用截流分子量为10kDa的超滤膜浓缩，再用SP-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化产物经SDS-PAGE检测和Western blotting鉴定，SDS-PAGE结果显示纯化的重组hIL-29变异体为单一蛋白条带，其分子量为20kDa，如图4所示；Western blotting结果显示单一反应条带。
Claims (6)
1.一种人白细胞介素29变异体的重组真核表达载体，其特征在于，所述的重组真核表达载体中插入了人白细胞介素29变异体的编码基因。
2.如权利要求1所述的重组真核表达载体中的人白细胞介素29变异体的编码基因，其DNA的核苷酸序列对应于序列表中的SEQ ID NO：1，该序列中第91位碱基由T(胸腺嘧啶)突变为C(胞嘧啶)，由该碱基组成的三联体密码由TTC突变为CTC；该序列中第272位碱基由T(胸腺嘧啶)突变为C(胞嘧啶)，由该碱基组成的三联体密码由CTG突变为CCG。
3.如权利要求1所述的重组真核表达载体中的人白细胞介素29变异体的编码基因，其编码产物的氨基酸序列对应于序列表中的SEQ ID NO：2，该序列中第31位氨基酸残基由苯丙氨酸(Phe)突变为亮氨酸(Leu)、第91位氨基酸残基由亮氨酸(Leu)突变为脯氨酸(Pro)。
4.一种重组毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述的重组毕赤酵母的染色体中整合有权利要求1所述的人白细胞介素29变异体的编码基因，并且分泌表达重组人白细胞介素29变异体至培养液中。
5.一种制备重组人白细胞介素29变异体的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)用适当的培养液，培养权利要求4所述的重组毕赤酵母工程菌；
(2)在培养液中添加适当的诱导剂，诱导重组毕赤酵母工程菌分泌表达重组人白细胞介素29变异体；
(3)从培养液中分离纯化出重组毕赤酵母分泌表达的重组人白细胞介素29变异体。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所用的培养液为BMGY培养液和BMMY培养液；步骤(2)所用的诱导剂为甲醇，添加甲醇的终浓度为培养液体积的0.5～1％；步骤(3)所用的分离纯化方法为先用强阳离子型离子交换层析分离培养液中的重组人白细胞介素29变异体，再用凝胶过滤层析得到纯化的重组人白细胞介素29变异体。
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