JPS62502857A - インタ−フエロンα型ポリペプチドの発現をコ−ドするｃＤＮＡ分子、このような分子で形質転換された細菌又は細胞宿主及びこれらの宿主により製造されるインタ−フエロン活性を示すポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ４、工、赳旦から選択した請求の範囲３の宿主。

５、　請求の範囲３又は４の形質転換された宿主により、製造される、α−型イ ンターフェロン活性を有するポリペプチド。

６、　第２図のα−型インターフェロン活性を有するポリペプチド。

７、　請求の範囲５又は６のポリペプチドを治療上有効量投与することからなる 、通常抗ウィルス剤、抗増殖剤又はＮＫ細胞活性化剤で治療する、ヒトを含む哺 乳動物の疾患の治療方法。

明　細　書 インターフェロンα型ポリペプチドの発現をコードするｃＤ　Ｎ　Ａ　このよう な分子で形質転換された細菌又は細びこれらの宿主により　造されるインターフ ェロンを八すポリペブチ゛ 本発明はＩＦＮ−α型のポリペプチドの発現をコードするヌクレオチド配列及び このようなヌクレオチド配列とハイブリダイズするか、又はこのようなヌクレオ チド配列への遺伝暗号の結果として縮重した（　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）配列を 有するｃＤ　Ｎ　Ａ分子に関する。本発明はさらにこのようなｃＤ　Ｎ　Ａ分子 又はその生物学的に活性な両分により形質転換又はトランスフェクションした細 菌又は細胞宿主も包含する。本発明はこのような宿主により製造されるα−８８ 型インターフエロン活性を有するポリペプチドも含んでいる。最後に、本発明は 通常α型インターフェロンを使用して治療する疾患の治療方法も包含する。

インターフェロンは種々の投与法を使用してウィルス及び腫瘍又は癌の治療に用 いられてきた。従って、インターフェロン治療法の範囲を広げうる新規なインタ ーフェロンを見出すことは一般の興味のあることである。本発明の目的は、適当 な宿主内でＩＦＮ−α−８８型のポリペプチドの発現をコードし、それによって 宿主を形質転換して、ヒト白血球インターフェロンの免疫学的又は生物学的活性 と類似した活性を有するポリペプチドを産生するＤＮＡ配列を提供することであ る。

本発明のもう１つの目的は、このようなりＮＡ配列で形質転換又はトランスフェ クションした細菌又は細胞宿主を提供することである。

更にもう１つの目的はこのような形質転換又はトランスフェクションされた宿主 により産生された、α−８８型インターフエロン活性を有するポリペプチドを提 供することである。

本発明の更なる目的は、抗ウィルス活性、抗増殖活性及びＮＫ細胞増強活性を示 す薬剤で通常治療する、ヒトを含む哺乳動物の疾患を治療する方法を提供するこ とである。

これら及び他の目的を達成するために、本発明は添付の第２図に示すヌクレオチ ド配列［α−８８］、又は前記の配列にハイブリダイズしＩＦＮ−α−８８型の ポリペプチドの発現をコードする配列、又は上記定義のヌクレオチド配列への遺 伝暗号の結果として縮重しＩＦＮ−α−８８型のポリペプチドの発現をコードす る配列を提供する。

性な画分て形質転換又はトランスフェクションされた細菌又は細胞宿主も包含す る。このような宿主は」、姐旦種から選択すると好適である。

従って、本発明のＣＤ　Ｎ　Ａ配列は適当な宿主を調節してＩＦＮ−α−８８型 活性を示すポリペプチドを製造することができ、本発明はこのようにして製造さ れたポリペプチドも包含する。

最後に、本発明は、通常インターフェロン殆療法で治療する疾患、すなわち、抗 ウィルス、抗増殖及びＮＫ細胞増強活性を示す薬剤を使用する治療の対象である 疾患について、ヒトを含む哺乳動物を治療する方法も含んでいる。

ここで、添付の図面を参照して非限定的実施例により本発明を説明しよう。

第１図は配列分析にかけた２つのＣＤ　Ｎ　Ａクローン（ＩＦＮ−α−８８及び ＩＦＮ−α−８９）の物理的地図である。下線の矢印は配列決定の戦略を示し、 図の左側には使用した方法を記した。リーダーペプチド内の最初のコドンについ てＧｏｅｄｄｅｌ。

Ｄ、Ｖ、、　Ｌｅｕｎｇ、　ＤＪ、、　Ｄｕｌｌ、Ｔ−、Ｊ、、　Ｇｒｏｓｓ、 　Ｈ，、Ｌａｗｎ、　Ｒ，Ｈ，。

ＨｃＣａｎ旧ｉｓｓ、　Ｒ，、Ｓｅｅｂｕｒｇ、　Ｐ、Ｈ，、Ｕｌｌｒｉｃｈ、 　Ａ、、　Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ、　Ｅ。

及びＧｒａｙ、　Ｐ、Ｗ、　（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　２９０．２０−２６ 、にしたがって、ヌクレオチドに番号をつけた。ＧＯ−尾（ｔａｍ）のヌクレオ チドハ接続しておらず、ＢｓｔＥＩｌ、　Ｈａｏｌｌ［、Ｈｉｎｄ　Ｉ［、Ｐｓ ｔＩ及び３ａｕ３Ａは各制限エンドヌクレアーゼの識別配列をラベルする。

第２図はクローン８８のヌクレオチド配列と予期されるアミノＭ配列を示してい る。λ２Ｃ１（Ｌａｗｎ、　Ｒ，Ｈ，、Ａｄｅｌｍａｎ、　Ｊ、。

Ｄｕｌｌ、Ｔ、Ｊ、、　Ｇｒｏｓｓ、　Ｈ，、Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、及び旧１ ｒｉｃｈ、　Ａ、　（１９８１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１２．１１５９〜１１６２ ）と比較した差異を、この論文の著者らの位置表示を用いて図中に示している。

いくつかのヒトＩＦ〜−α遺伝子と１つのＩＦＮ−β遺伝子は、白血球（Ｎａｇ ａｔａ、　Ｓ、、　Ｔａ１ｒａ、　Ｈ，、’　Ｈａｌｌ、Ａ、、　Ｊｏｈｎｓｒ ｕｄ、　Ｌ、。

５ｔｒｅｕｌｉ、　Ｈ，、Ｅｃｓｏｄｉ、　Ｊ、、　Ｂｏｌｔ、　Ｗ、、　Ｃａ ｎｔｅｌｌ、に０．及びＷｅｉｓｓｍａｎｎ、Ｃ，（１９８０）　Ｎａｔｕｒｅ 　２８４．　３１６−３２０；　Ｃｏｆｆ１ｎｓ、Ｊ、。

（１９８３）、「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ−Ｆｒｏｍ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｔ ｏ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＪ　、Ｔｈｅ　Ｓｏｃ、　Ｇｅ ｎ、　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｓｙｍｐ、　ｖｏｌ　３５．　Ｂｕｒｋｅ、　Ｄ 。

Ｃ０及びＨＯｒｒｉＳ、　Ａ、Ｇ、編、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｌｌｎｉｖｅｒｓ ｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ）又は各々のセルライン（Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、Ｖ、、　 Ｌｅｕｎｇ、　Ｄ、　Ｗ、、　Ｄｕｌｌ、　Ｔ、Ｊ、。

Ｇｒｏｓｓ、　Ｈ，、Ｌａｗｎ、　Ｒ，Ｈ，、ＨｃＣａｎｄｌｉｓｓ、　Ｒ，、 Ｓｅｅｂｕｒｇ、　Ｐ、Ｈ，。

Ｕｌｌｒｉｃｈ、　Ａ、、　Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ、　Ｅ、及びＧｒａｙ、　Ｐ、 Ｗ、（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ２９０、２０−２６；　Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、 　Ｔ、、　５ａｋａｉ、　Ｈ，、Ｆｕｊｉｉ−にｕｒｉｙａｍａ。

Ｈｕｒａｍａｔｓｕ、　Ｈ，、にｏｂａｙａｓｈｉ、　ｓ、及びＳｕｄ、０．　 Ｔ、　（１９７９）　Ｐｒｏｃ。

Ｊａｐａｎ　Ａｃａｄ、　５５．４６４−４６９　）のウィルス誘発−次培養由 来のＣＤＮＡライブラリー中で同定されてきた。今までに、ＩＦＮ−αをコード する８種の主なｍＲＮＡとＩＦＮ−βをコードする１種のｍＲＮＡをＣＤ　Ｎ　 Ａクローンとして単離し、特性化し、そしてそのいくつかをユ、到其内で発現さ せた。続いて、染色体遺伝子の単離及びマツピングが報告されている（Ｃｏｆｆ ｉｎｓ、　Ｊ。

（１９８３）　［Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ−ＦｒｏＩＩＩＭｏｌｅｃｕｌａｒ　 ｔｏ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＪ　、Ｔｈｅ　Ｓｏｃ、　Ｇ ｅｎ、　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｓｙｍｐ、　ｖｏｌ、　３５．　Ｂｕｒｋｅ、 　Ｄ、Ｃ。

及びＨｏｒｒｉｓ、　Ａ、Ｇ、Ｉｑ　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　ｔｌｎｉｖｅｒｓｉ ｔｙ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ、　Ｃ，（１９８１）　ｒｌｎｔｅｒ ｆｅｒｏｎ　１９８１　Ｊ　、ｖｏｌ、　３．　Ｇｒｅｓｓｅｒ、　１．編、ｐ ｐ、　１０１−１３４．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ 　＆　Ｌｏｎｄｏｎ）　）　。従って、ＩＦＮ−α遺伝子は１５メンバ一以上の 多重遺伝子族に広がり、一方、ＩＦＮ−β遺伝子は半数体遺伝子当り１つの非反 復コピーで表わされる。以前の報告によるとＩＦＮ−α遺伝子族の多様性は遺伝 的冬型性（Ｌｕｎｄ、　Ｂ、、　Ｅｄｌｕｎｄ、　Ｔ、、　Ｌｉｎｄｅｎｍｅｉ ｅｒ。

Ｗ、、　Ｍｙ、　Ｔ、、　Ｃｏｆｆ１ｎｓ、　Ｊ、、　Ｌｕｎｄｇｒｅｎ、　Ｅ 、及びｖｏｎ　Ｇａｂａｉｎ、　Ａ。

（１９８４）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８ １．　ｐｌ）　２４３５−３９）及び遺伝子デュブリケータ（ｄｕｐｌｉｃａｔ ｏｒ）　（Ｌａｗｎ、　Ｒ，Ｈ，、Ａｄｅｌｍａｎ、　Ｊ、。

Ｄｕｌｌ、　Ｔ、Ｊ、、　Ｇｒｏｓｓ、　Ｈ，Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、及び旧１ ｒｉｃｈ、　Ａ、、　（１９８１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１２．１１５９−１１６ ２；　Ｕｌｌｒｉｃｈ、　Ａ、、　Ｇｒａｙ、　Ａ、、　Ｇｏｅｄｄｅｌ。

０、ｖ、及びＤｕｌｌ、　Ｔ、Ｊ、　（１９８２）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ 、１５６．４６７−４８６）との両者によるものと思われる。

いくつかのリンパ球セルラインはＩＦＮを産生ずることが報告されている。はと んどのＴセルラインはＩＦＮ−βを産生じ、一方、ＢセルラインはＩＦＮ−α及 びＩＦＮ−βを異なる比率で産生ずる（Ｌａｒｓｓｏｎ、　１．、　Ｌｕｎｄｇ ｒｅｎ、　Ｅ、、　Ｎｉ１ｓｓｏｎｌ、に、及びＳｔｒａｎｎｅｇａｒｄ、　Ｏ ，（１９７９）　Ｄｅｖｅｌｏｐ、　ｂｉｏｌ、　５ｔａｎｄａｒｄ、　４２． １９３−１９７；　Ｈａｔｓｕｙａｍａ、　Ｈ，、Ｈｉｎｕｍａ、　Ｙ、、　Ｗ ａｔａｎａｂｅ、　Ｙ、及びＫａＷａｄｅ。

Ｙ、　（１９８２）　Ｊ、　ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６０．１９１−１９４） 　、バーキットリンパ腫由来のＮａｆｆ１ａｌＶＴａセルラインはヒトＩＦＮを 人聞生産するのに使用されてきた（Ｓｔｒａｎｄｅｒ、　Ｈ，、Ｈｏｇｅｎｓｅ ｎ、　Ｋ、Ｅ、及びＣａｎｔｅｌｌ。

に、　（１９７５）　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１３．１１６ −１１７；　Ｚｏｏｎ、に、Ｃ０゜Ｂｕｃｋｌｅｒ、　Ｃ，Ｅ、、　Ｂｒｉｄｇ ｅｎ、　Ｐ、Ｊ、及びＧｕｒａｒｉ−Ｒｏｔｍａｎ、口、　（１９７８）Ｊ、　 Ｃｌ１ｎ、　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、　７．４４−５１：　Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、　 Ｈ，Ｄ、　（１９８１）　Ｊ。

ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　５６．１７５−１８４　）　。５ｅｎｄａｉウイルス 誘墾によって、約８５％の生物学的活性を有するいくつかの種類のＩＦＮ−αを 産生され（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、　Ｈ，Ｄ、　（１９８１）　Ｊ、　ｇｅｎ、　Ｖ ｉｒｏｌ、　５６．１７５−１８４）、残りはＩＦＮ−βである。しかしながら 、ＩＦＮ−βの比率は様々である。Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈ等（Ｓｔｕｔｔｌ ｅｗｏｒｔｈ、　Ｊ、　。

Ｈｏｒｓｅｒ、　Ｊ、及びＢｕｒｋｅ、　Ｄ、Ｃ，（１９８３）　Ｅｕｒ、　Ｊ 、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３３゜３９９−４０４　）は、遺伝子は転写されてい るにもかかわらず、検出しうるＩＦＮ−βを産生しないＮａ１ｌｌａｌＷａライ ンについて記載している。。

本発明は、発現されるＩＦＮ遺伝子の特異的な発現及び特性化を分析するために 、Ｈａｍａ　Ｉｗａ細胞のこの亜株内でＩＦＮ蛋白質をコードする優勢なｌｌＲ ＮＡ種の特性化をも含んでいる。

ＴＦＮ−α及びＩＦＮ−βをコードするＣＤＮＡクローンの比は機能的活性とし て得られる比とよく相関することが発見された。部分的配列分析と、物理的マツ ピングから得た結果の比較とに、より、優勢なｍＲＮＡ種はＩＦＮ−αＡとして 記載（Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、Ｖ、、　Ｌｅｕｎｇ、　Ｄ、Ｗ、、　Ｄｕｌｌ、 　Ｔ、Ｊ、、　Ｇｒ、ｏｓｓ、　Ｈ，、Ｌａｗｎ。

Ｒ，Ｈ，、ＨｃＣａｎｄｌｉｓｓ、　Ｒ，、Ｓｅｅｂｕｒｇ、　Ｐ、Ｈ，、Ｕｌ ｌｒｉｃｈ、　Ａ、、　Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ、　Ｅ、及びＧｒａｙ、　Ｐ、Ｗ、 　（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　２９０．２Ｏ−２６）又はＩＦＭ−ａ　２　（ Ｎａｇａｔａ、Ｓ、、Ｔａ１ｒａ、Ｈ，、Ｈａｉｌ、Ａ、、Ｊｏｈｎｓｒｕｄ、 Ｌ、。

５ｔｒｅｕｌｉ、　Ｈ，、Ｅｃｓｏｄｉ、　Ｊ、、　Ｂａ１ｌ、　Ｌ、　Ｃａｎ ｔｅｌｌ、　Ｋ、及びＷｅｉＳＳｍａｎｎ、　Ｃ，（１９８０）　Ｎａｔｕｒｅ 　２８４．３１６−３２０　）及びＩＦＮ−β（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、　Ｔ、、 　５ａｋａｉ、　Ｈ，、Ｆｕｊｉｉ−にｕｒｉｙａｍａ、　Ｙ、Ｈｕｒａｍａｔ ｓｕ。

Ｈｌ、にｏｂａｙａｓｈｉ、　Ｓ、及び５ｕｄｏ、　Ｔ、　（ｊ９７９）　Ｐｒ ｏｃ、　Ｊａｐａｎ　Ａｃａｄ。

５５、４６４−４６９　）されているものに相当することが示された。

１つのｍＲＮ　Ａ種は、以前にはＣＤ　Ｎ　Ａとして同定されなかつたＩＦＮ− αを表わすが、前に報告されたゲノム配列と対応するようであることが発見され た（Ｌｕｎｄ、　Ｂ、、　Ｅｄｌｕｎｄ、　Ｔ、。

Ｌｉｎｄｅｍｅｉｅｒ、　Ｈ，、Ｎｙ、、　Ｔ、、　Ｃｏｆｆ１ｎｓ、　Ｊ、、 　Ｌｕｎｄｇｒｅｎ、　Ｅ、及びｙｏｎ　Ｇａｂａｉｎ、　Ａ、　（１９８４） 　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、印刷中、Ｌａｗｎ 、　Ｒ，Ｈ，、Ａｄｅｌｍａｎ、　Ｊ、、　Ｄｕｌｌ、　Ｔ、Ｊ、、　Ｇｒｏｓ ｓ、　Ｈ，、Ｇｏｅｄｄｅｌ。

Ｄ、及び旧１ｒｉｃｈ、　Ａ、　（１９８１）　５ｃｉｅｎｃｅ　２１２．１１ ５９−１１６２）。ＩＦＮ−βりＯ−ンの全長の配列と共に、主要な蛋白質をコ ードするこのＩＦＮ−αクローンの配列を決定し、ＩＦＮ−β遺伝子の保存する 特性を確認した。

アルカリ性溶菌操作（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，及びＤｏｌｙ、　Ｊ、　（ １９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　７．１５１３〜１５２３） を次のように変更してプラスミドＤＮＡを単離した：細菌培養５００ｄをＯＤ　 ６００で約０．４まで増殖させ、最終濃度１７０ｔｔｓ　／　ｔｄｌとなるよう りＯラムフェニコールを加え、培養物を一晩インキユベートした。細胞を回収し 、（Ｂｉｒｎｂｏｉｉ、　Ｈ，Ｃ，及びＤｏｌｙ、Ｊ、　（１９７９）　Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　７．１５１３−１５２３）に記載の如く、但し 、溶液工を３２１ｄに、溶液■を６４−に、そして溶液■を４８ｍにそれぞれの 容量を増して処理し、溶解物を０．６容のイソプロパツールで沈澱させた。２回 連続の臭化エチジウム／ＣｓＣｌ１平衡密度勾配遠心によりプラスミドＤＮＡを 精製した。

制限酵素はＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　 Ｈｉｃｈ、、　ＬＩＳＡ、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｈａｎｎｈｅｉａ＋　Ｇｍ ｂＨ，Ｈａｎｎｈｅｉｍ、　Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒａｉａｎｙ又はＢｅｔｈｅｓｄａ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、、　Ｇａｉｔｈｅｒ ｓ−ｂｕｒｇ、　Ｈｄ、　ＵＳＡから購入し、販売元の指示に従って使用した。

オリゴデオキシリボヌクレオチドは、５ｑａｒａｌｌｅｌｌａ、　Ｖ、及びにｈ ｏｒａｎａ、　Ｈ，Ｇ。

（１９７２）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　７２．４２７〜４４４に記載のよ うにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｈａｎｎｈａｉｍ ）を使ってトランスファー又は［γ３２Ｐ　］　Ａ　Ｔ　Ｐ　（Ａｍｅｒｓｈａ ｍ、　Ｕに）により５°、！＋をラベルした。

次のように変更したＨａｎｉａｔｉｓ等（Ｈａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｊｅｆ ｆｒｅｙ、　Ａ。

及びＫｌｅｉｄ、口、Ｇ、　（１９７５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７２゜１１８４〜１１８８）に従いニックトランスレー ションを実施した。すなわち、（変性ポリアクリルアミドゲル上で分析して）Ｄ ＮＡを過剰に分解することなく最適な取り込みをうるよう滴定した、５０　ｍＨ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、　５０　ｍＨＮａＣｌ、　１０ｍＨβ−ｍ ｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、　５　ｍＨＭＣＩＣＩ２．８０１：ｉ　（（Ｚ −Ｐ）　ｄＧＴＰ、　５００μＨｄＡＴＰ。

５００μＨｄＣＴＰ、　５００μＨｄＴＴＰ、　５μＨのＤＮＡ　ｐｏｌ、　Ｉ 　（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）及び約０．１ｐｇ　ＤＮａｓｅ　 Ｉ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅａ＋１ｃａｌ　Ｃｏ、。

Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　Ｎｏ、　ＵＳＡ）からなル２０塵ノニツクトランスレー ション反応混合物中で１５℃で１．５時間、約ｓｏｏ　ｎｇのＤＮＡをインキュ ベートした。

３０成の０．１％ＳＤＳと１０ｍＨＥＤＴＡを添加した後、５ｅｐｈａｄｅｘ　 Ｇ−１５０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｕ ｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて前記のラベルしたＤＮＡを精製した。

使用した薬品は市販品のうちで最高の純度のものであった。

細胞の増殖とＩＦＮの誘 Ｎａｍａ　Ｉｗａ細胞はＫａｒｏｌｉｎｓｋａ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｔ、　Ｓｔ ｏｃｋｈｏｌｍ、　ＳｗｅｄｅｎのＯｒ、　Ａ、　Ａｄａｍｓから入手した。セ ルライン及び核型、培養器中での細胞調製法、５ｅｎｄａ　ｉウィルス誘驚及び ＩＦＮ滴定は慣用手段によって実施した。

ＣＤ　Ｎ　Ａライブラリーの［Ｊのためには、５ｅｎｄａ　＋ウィルスと共にイ ンキュベートした後、１００ｊ！どなるまで細菌を増殖させ、１．０００ｇで１ 時間集めた。ウサギ抗Ｉ　ＦＮ−ａ血清はＨｅ１ｓｉｎｋｉ。

ＦｉｎｌａｎｄのＯｒ、に、　Ｃａｎｔｅｌｌから入手したが、この中和価はＩ ＦＮ−αに対し１／４５０，０００．　Ｉ　Ｆ　Ｎ−βに対し１／３，０００で あった。

ウサギ抗ＩＦＮ−β血漬（ＥＢＡ８４６４０）はＥｎｚｏ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 　Ｈｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎ、Ｙ、、　ＵＳ八から購入したが、この°中和価はＩ ＦＮ−αに対し〜３０ｕ／Ｉｄテアリ、Ｉ　ＦＮ−／３１．：対し１．ｔ３００ ，０００　Ｕ／＃ｄ！Ｔ−［つた。中和価はＫａｗａｄｅ　［Ｋａｗａｄｅ、　 Ｙ、　（１９８０）　Ｊ、　ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＲｅｓ、　１．６１〜７０］ が記載のように実施し、中和の程度は中和後に残存する％活性に計算し直した。

ＲＮＡ　の′調　製 リボヌクレオシド−バナジル複合体（Ｂ　ＲＬ　）　（Ｂｅｒｇｅｒ、　Ｓ。

Ｌ、及びＢｉｒｋｅｎｍｅｉｅｒ、　Ｃ，Ｓ、　（’１９７９）　Ｂｉｏｃｈｅ ｍｓｔｒｙ　１８．５１４３〜５１４９）の存在下に細胞質性ＲＮＡをＮａｍａ １ｗａ細胞から抽出し、オリゴ（ｄＴ）セルロース（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖ ｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｗａｌｔｈａｍ、　Ｈａ。

ＵＳＡ　）を通してポリ［Ａ］”　ＲＮＡをＩ！縮シタ＜ＡｖｉＶ、　Ｈ，及Ｕ Ｌｅｄｅｒ、　Ｐ、　（１９７２）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ　６９．　１４０８〜Ｘｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉｓアツセイ（ Ｇｕｒｄｏｎ、　Ｊ、Ｂ、、　Ｌａｎｅ、　Ｃ，Ｄ、、　Ｗｏｏｄｌａｎｄ、　 Ｈ，Ｒ，及びＨａｒｂａｉｘ、　Ｇ、　（１９７１）　Ｎａｔｕｒｅ　２３３． １７７〜１８２　）で約２，０００単位／ｌＩＳの値を示す部分的に精製したＩ ＦＮｍＲＮＡを、Ｗｉｃｋｅｎｓ等（Ｗｉｃｋｅｎｓ、　Ｈ，Ｐ、、　Ｂｕｅｌ ｌ、　Ｇ、Ｎ、及びＳｃｈｉｍｋｅ。

Ｒ，Ｔ、　（１９７８）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５３．　２４８３ 〜２４９５）に記載の条件を用いてＣ［）ＮＡ合成の鋳型として使用した。逆転 写のプライマーとしてオリゴ（ｄ　Ｔ　１２〜１ｇ＞　（Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔ ｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒＣｈ）を使用し、逆転写酵素はＮａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　ＨｅａｌｔｈのＪ。

−１Ｂｅａｒｄから入手した。ｃＤＮＡの＄１ヌクレアーゼ（Ｂｅｔｈ６ｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）処理及び５〜２３％蔗糖勾配で のサイズ分画はＨｏｅｉｊｍａｋｅｒｓ等（ＨｏｅｉｍＩＩｌａｒｋｅｒｓ、　 Ｊ、Ｈ，Ｊ、、　Ｂｏｒｓｔ、　Ｐ。

ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｂｕｒｇ、　Ｊ、、　Ｗｅｉｓｓｍａｎ、　Ｃ，及びＣｒｏｓ ｓ、　Ｇ、Ａ、Ｈ，（１９８０）Ｇｅｎｅ　８．３９１〜４１７）が概説したよ うに実施した。長さ２００塩基対以上のＣＤＮＡ分子はデオキシシチジンでテー リングしく向、。

Ｒｏ及びＤｅｎｇ、　Ｇ、（１９８１）　Ｎｕｃｌｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 　９．　４１７３〜４１８８）、ｐｓｔ（で消化し、デオキシグアノシンで延長 したｐＢ　Ｒ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ、　Ｆ、、　Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ、　Ｒ， Ｌ、、　Ｇｒｅｅｎｅ、　Ｐ、Ｊ、、　Ｂｅｔｌａｃｈ。

Ｈ，Ｃ，、Ｈｅｙｎｅｋｅｒ、　Ｈ，Ｌ、及びＢｏｙｅｒ、　Ｈ，ＩＪ、　（１ ９７７）　Ｇｅｎｅ　２．９５＝１１３）とともニアニーリングした（Ｐｅａｃ ｏｃｋ、　Ｓ、Ｌ、、　Ｈｃｌｖｅｒ、　Ｃ，Ｈ。

及びＨｏｎａｈａｎ、　Ｊ、Ｊ、　（１９８１）　Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈ ｙｓ、＾ｃｔａ　６５５．２４３〜２５０）。得られたプラスミドキメラを用い てＥ、　ｃｏｌｉ株２９４を形質転換した（Ｂｏｃｈｎｅｒ、　Ｂ、Ｒ，、Ｈｕ ａｎｇ、　Ｈ，Ｃ，、５ｃｈｉｅｖｅｎ、　Ｇ、Ｌ。

及びＡｍｅｓ、　Ｂ、Ｎ、（１９８０）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４３ ．９２６〜９３３　）。

ＤａＣＩｅｒｔ及びＥｈｒｌｉｃｈ　（Ｄａｇｅｉｔ、　Ｈ，及びＥｈｒｌｉｃ ｈ、　Ｓ、Ｄ、　（１９７９）Ｇｅｎｅ、　６．　２３〜２８）に従い、コンピ テント細胞を調製した。形質転換後、テトラサイクリン２０埒／　Ｉｄ金含有る し一寒天プレート上で組換え体クローンを選択した。

本明細書の第１表のオリゴデオキシリボヌクレオチドは、固相ホスファイト法（ Ｃｈｏｗ、　Ｆ、、　Ｋｅｍｐｅ、　Ｔ、及びＰａ１ｍ、　Ｇ、　（１９８１） Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、・９．２８０７〜２８１７）を使用し、 ＫａｖｉＧｅｎ　ＡＢ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、　Ｓｗｅｄｅｎ）が合成し、供給 した。

ｃＤ　Ｎ　Ａクローンの単離とスクリーニング各クローニングを順番の列に入れ 、−晩増殖させ、Ｗｈａｔｍａｎ５４１の１紙に移し、クロラムフェニコールを ２５０埒／　ｄに増強し、Ｇｅｒｇｅｎ等（Ｇｅｒｇｅｎ、Ｊ、Ｐ、、５ｔｅｒ ｎ、Ｒ，Ｈ及び−ｅｎｓｉｎｋ、Ｐ、Ｃ。

ら　（１９７９）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　７．２１１５〜２ １３６）が記載したようにハイブリダイゼーション用にＩＩした。Ｗａｌｌａｃ ｅ、　Ｒ，Ｂ、。

Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｈ，Ｊ、、　１ｌｉｒｏｓｅ、　Ｔ、、　Ｈｉｙａｋｅ、　 Ｔ、、　Ｋａｗａｓｈｉｍａ、　Ｅ、Ｈ。

及びＩｔａｋｕｒａ、に、　（１９８１）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ｓ、　９．８７９〜８９４．に一記載のように、Ｐ紙を予めハイブリダイズさせ 、３２ＰでラベルしたＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、洗浄した。ハイブ リダイゼーション及び最後の洗浄ステップの温度は１３　ｍａｒでは３７℃、１ ５　ｉｅｒでは４２℃であった。

Ｄ’　Ｎ　Ａ配列の決定 関連フラグメントをファージＭ１３のクローニングベクターｔｉｐ？、　ｍｐ　 ８及びｎａｐ　９にクローニングしくＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、、　Ｃｒｅａ、　 Ｒ。

及びＳｅｅｂｕｒｇ、　Ｐ、Ｈ，（１９８１）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅｓ、　９．３０９〜３２１；Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、及びＶｉｅｉｒａ、　 Ｊ、　（１９８２）　Ｇｅｎｅ　１９．２６９〜２７６）、Ｊ。

ｃｏｌｉ株ＪＭ１０３内に形質転換した（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、、　Ｃｒｅａ 、　Ｒ，及びＳｅｅｂｕｒｇ、　Ｐ、Ｈ，（１９８１）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅｓ、　９．３０９〜３２１）。

ニックトランスレーションしたＩＦＮ−ｃＤＮＡをプローブとして使用し、プラ ークハイブリダイゼーション（ａｅｎｔｏｎ、　Ｗ、Ｄ。

及び口ａｖｉｓ、　ＲＪ、　（１９７７）　５ｃｉｅｎｃｅ　１９６　、１８０ 〜１８２　）によりファージが有するＩＦＮ遺伝子の配列を同定した。ファージ から一本鎖の鋳型ＤＮＡを単離した（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、、　Ｃｒｅａ、　 Ｒ，及びＳｅｅｂｕｒｇ、　Ｐ、Ｈ，（１９８１）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、　９．３０９〜３２１）。第１表に概説したプレライマー又はＭ１ ３ユニバーサルブライマーを使用して、ジデオキシ鎖終結法（Ｓａｎｇｅｒ、　 Ｆ、、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ。

及びＣ０ｕｌＳＯｎ、＾、Ｒ，（１９７７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４゜５４６３〜５４６７　）によりＤＮＡ配列を決 定した。

Ｈａｘａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔ　（Ｈａｘａｍ、＾、Ｈ９及びＧ１１ｂｅｒｔ、 　Ｗ、　（１９８０）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＥｎｘｙｒＱｏｌ、　６５．４９９〜５ ６０）に従って、配列の少ない部分（第１図）を分析した。鋳型として二本鎖Ｄ ＮＡを使って短い挿入物を有するクローンのいくつかの配列決定をした。ｉｓ　 ｍｅｒとのジデオキシ鎖終結反δを始める前にＢｉｏ−Ｇｅｔ　ＡＳ　ｙａカラ ム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂ、、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃａ、　ＵＳＡ）でプ ラスミドを精製した（Ｗａｌｌａｃｅ、　Ｒ，Ｂ、　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｈ，Ｊ ｌ、　Ｓｕｇｇｓ、　Ｈｉｙｏｓｈｉ、に、、　Ｂｈｕｔｔ。

Ｒ及びＩｔａｋｌＪｒａ、に、　（１９８１）　Ｇｅｎｅ　１６．２１〜２６） 。

５ｅｎｄａ　ｉウィルスで誘壬したＩＦＮ−αとＩＦＮ−βの産生の比は使用し たセルライン内で実験毎に様々であった。ＣＤＮＡライブラリーを調製するため に使用した特別の培養サイクルをＩＦＮ産生についてモニターした。結果は本明 細書中の第２表に示す。ＩＦＮ−αについてのみアッセイしたＭＤＢＫ細胞は、 ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βの両者についてアッセイしたＷｉｓｈセルラインにつ いて測定した活性の５５％であった。抗体中和実験によってＩＦＮ−α及びＩＦ Ｎ−βの比が５５％〜４５％であることを確認した。

ｃＤ　Ｎ　Ａライブラリーの構築 上記のようにＣＤ　Ｎ　Ａを合成することによって約６．０００コロニーの細菌 のＣＤＮＡライブラリーを得、使用したＮａ１ｌａｌＷａ亜株からのＲＮＡにプ ライムした。Ｃｈａｎｏ等（Ｃｈａｎｔ、　Ａ、Ｃ，Ｙ、。

Ｎｕｒｎｂｅｒｇ、　Ｊ、Ｈ，、Ｋａｕｆｍａｎ、　Ｒ，Ｊ、、　Ｅｈｒｌｉｃ ｈ、　Ｈ，Ａ、、　５ｃｈｉｉｋｅ。

Ｒ，Ｔ、及びＣｏｈｅｎ、　Ｓ、Ｎ、　（１９７８）　Ｎａｔｕｒｅ　２５７． ６１７〜６２３　）によるクローニング法に従って、ベヒクルｐｓ　Ｒ３２２の Ｐ　ｓｔ　１部位にＣＤ　Ｎ　Ａを結合させた。コロニーハイブリダイゼーショ ンによるライブラリーのスクリーニングに２つの合成オリゴヌクレオチド（第１ 表）使用した。１つは、４８６〜５００　（Ｇｏｅｄｄｅｌによるヌクレオチド の表示（ｐ１２参照）−今までに特性化された（Ｃｏｌｌｉｎｓ、　Ｊ、　（１ ９８３）　「Ｉｎｔｅｒ４ｅｒｏｎｓ−Ｆｒｏｍ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｔ。

Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＪ　、　Ｔｈｅ　Ｓｏｃ、　Ｇｅｎ 、　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｓｙｍｐ、ｖｏｌ。

３５、　ｔｓｕｒｋｅ、　Ｄ、Ｃ，Ａｚｅ　Ｈｏｒｒｉｓ、　Ａ、Ｇ、編、Ｃａ ｍｂｒｉｄｇｅ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ；　Ｗｅｉｓｓｍａｎ、　Ｃ ，（１９８１）　ｒＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　１９８１　Ｊ　、　ｖｏｌ、　３゜ Ｇｒｅｓｓｅｒ、　１．　ＩＱ、　ｐｐ、　１０１−１３４．＾ｃａｄｅｍｉｃ 　Ｐｒｅｓｓ　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　＆Ｌｏｎｄｏｎ）　）主要なＩＦＮ−α配 列に保持されていることが判明している領域の間の１５ヌクレオチドに相補的で あるように作成された。もう１つのものはＩＦＮ−βといくっがのＩＦＮ−αに ツイテ同定された（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、　Ｔ、、　Ｈａｎｔｅｉ、　Ｎ、、　 Ｓｃｈｗａｒｚｓｔｅｉｎ、　Ｈ，、Ｎａｇａｔａ、　Ｓ、、　Ｈｕｒａｍａｔ ｓｕ、　Ｈ，、及びＷｅｉｓｓｍａｎ、　Ｃ，（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ　２Ｂ ５．　５４７〜５４９）ように、−２０９〜２２１の１３ヌクレオチドの範囲に 相補的であるように作成された。前記のハイブリダイゼーション条件を使うと、 ８個のコロニーが１５−ｍａｒと、６個のコロニーが１３−ｍａｒとハイブリダ イズすることが判った。

１５−１１８ｒとハイブリダイズするコロニーは１３−ｍｅｒとの信号を同様に 与えることはないことを特記すべきである。しかしながら、オリゴヌクレオチド スクリーニングが偽陽性信号を与えるかもしれなイ（Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、Ｖ 、、　Ｌｅｕｎｇ、　Ｄ、Ｗ、、　Ｄｕｌｌ、　Ｔ、Ｊ、。

Ｇｒｏｓｓ、　Ｈ，Ｌａｗｎ、　Ｒ，Ｈ，、ＨｃＣａｎｄｌｉｓｓ、　Ｒ，、Ｓ ｅｅｂｕｒｇ、　Ｐ、　Ｈ，。

旧１ｒｉｃｈ、　Ａ、、　Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ、　Ｅ、及びＧｒａｙ、　ＰＪ、 、　（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ２９０、　２０〜２６）ので、保持するこれら ｃＤ　Ｎ　Ａクローンの全てが真のＩＦＮ−α及びＩＦＮ−β配列であると予想 することは不可能であった。従って、ライブラリーを再スクリーニングするため には、発表されている型と同様のＩＦＮ−α又はＩＦＮ−βを夫々コードする少 なくとも１つのクローンを同定するこプライマーとして１５−ｍａｒを使う診断 用範囲（ｄ　１ａＱｎｏｓｔ　１ｃｓｔｒｅｔｃｈ　）の配列決定によりＩＦＮ −αクローンの存在を明らかにした。この目的のためには、配列決定操作用の一 本鎖の鋳型を得るためにＣＤ　Ｎ　Ａ挿入物をＭ１３ベクター内で再クローン化 するか、又は二本鎖プラスミドＤＮＡを上記のように配列決定用マトリックスと して直接使用した。８個の挿入物の長さにより、そのうちの３つは２００ヌクレ オチド以上を、３つは約８０ヌクレオチドを解読した。残りの挿入物はヌクレオ チドの診断用範囲を確立するには短すぎた。

上記領域を配列決定すると、５つはＩＦＮ−Ｇ２又はＩＦＮ−αＡと表わされる 以前に紹介され、配列決定されたｃＤＮＡと同一であった（Ｓｔｒｅｕｌｉ、　 Ｈ，、Ｎａｇａｔａ、　Ｓ、　Ａｍ　Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ、　Ｃ。

（１９８Ｇ）　５ｃｉｅｎｃｅ　２０９．１３４３−１３４７；　Ｇｏｅｄｄｅ ｌ、　Ｄ、Ｖ、、　Ｌｅｕｎｇ、　Ｄ。

獣、　ロｕｌｌ、Ｔ、Ｊ、、Ｇｒｏｓｓ、Ｈ，、Ｌａｗｎ、Ｒ，Ｈ，、ＨｃＣａ ｎｄｌｉｓｓ、Ｒ，。

Ｓｅｅｂｕｒｇ、　Ｐ、Ｈ，、Ｕｌｌｒｉｃｈ、　Ａ、、　Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ 、　Ｅ、及びＧｒａｙ、　Ｐ、Ｗ。

（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　２９０．２Ｏ−２６）。しかしながら、８８と表 わされる１つの挿入物は以前に記載されたＩＦＮ−αのｃＤＮＡクローンの相同 領域と比較して顕著な差異を示した。さらに、エンドヌクレアーゼＰＳｔＩでキ メラプラスミドを開裂することによって、ＣＤ　Ｎ　Ａ挿入物をその大きさに従 って分析した。挿入物の大きさの測定により、それらのうちの２つ゛のみがコー ド領域全体を有することができ、その残りは切断されたＣＤＮＡ挿入物であるこ とが明らかとなった。

ＩＦＮ−βをコー゛するｃＤ　Ｎ　Ａクローンの０多数の１３−１ｅｅｒに結合 する候補を、ＩＦＮ−βに特徴的な内部圧旦工部位の存在について精査した（Ｔ ａｎｉｇｕｃｈｉ、　Ｔ、、　０ｈｎｏ。

Ｓ、、　Ｆｕｊｉｉ−にｕｒｉｙａｎａ、　Ｙ、及びＨｕｒａｍａｔｓｕ、　Ｈ ，（１９８０）　Ｇｅｎｅ　１０゜１１〜１５）。挿入物のうちの２つが内部に ｐｓｔ工部工部布していた。これらＣＤＮＡクローンの大きさは全ＩＦＮ−βを コードするに十分であることが判った。それらの検出に使用したオリゴヌクレオ チドは上記のように部分的な配列分析のために使用前に記載されていた（Ｄｅｒ ｙｎｃｋ、　Ｒ，、Ｃｏｎｔｅｎｔ、　Ｊ、、　ＤｅｃｌｅｒｃＱ。

Ｅ、、　Ｖｏｌｃｋａｅｒｔ、　Ｇ、、　Ｔａｖｅｒｎｉｅｒ、　Ｊ、、　Ｄｅ ｖｏｓ、　Ｒ，及びＦｉｅｒｓ。

Ｗ、（１９８０）　Ｎａｔｕｒｅ　２８５．５４２〜５４７）Ｉ　Ｆ　Ｎ−βと 同一であることが確認された。

同定されたＩＦＮ−α　びＩＦＮ−をコー゛　ＣＩＦＮ−Ｇ２に類似のＩＦＮ− αをコードするｃＤＮＡクローン２３３７及びＩＦＮ−βをコードするｃＤＮＡ クローン９９をプローブとして使用してｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニン グした。調べた６、０００のコロニーのうち、１４はＩＦＮ−α２プローブと結 合し、２１はＩＦＮ−βクローンと結合した。ハイブリダイゼーションの条件は ストリンジェント（Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）であった（上記参照）。ＴＦＮ−βプ ローブにハイブリダイズするＣＤＮＡクローンに対するＩＦＮ−αプローブにハ イブリダイズするＣＤＮＡクローンの比は２／３であった。ライブラリー中のＩ ＦＮクローンの全頻度は０．６％であった。

２つのｃＤＮＡクローンで同定したコロニーは２つのオリゴヌクレオチドで同定 したものと全く同じではなかったく第３表参照）。ＩＦＮ−αｃ［）　Ｎ　Ａプ ローブとハイブリダイズする１４コロニーの内、６つはＩＦＮ−αに特異的とさ れている１５　ｍｅｒで同定された。ＩＦＮ−β　ＣＤＮＡとハイブリダイズす るコロニーのうち２つだけがαとβとに特異的であるとされている１３１ｅｒで 同定された。

ＩＦＮ−α８８とＩＦＮ−βをコードする２つのｃＤＮＡ欠且二之艮１１ ２つのＩＦＮクローン８９と８８は各々ＩＦＮ−βと普通ではないＩＦＮ−αを コードしている可能性があるので、配列決定用に選択した。ｃＤ　Ｎ　Ａ挿入物 の配列決定のための２つの方法は次の通りであった。

ｉ）　Ｓａｎｇｅｒ等（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、及び Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、Ｒ。

（１９７７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７４． 　５４６３〜５４６７）に従って、Ｍ　１３１Ｄ８又は−ｐ９内に再クローニン グしたサブフラグメントを配列決定した。このために、プライマーとして、ユニ バーサルＭ１３プライマー及び２つの合成オリゴヌクレオチドを使用した。

ｉｉ）　Ｈａｘａｉ及びＧ１１ｂｅｒｔの方法（Ｈａｘａｍ、　Ａ、Ｈ，及びＧ １１ｂｅｒｔ、　Ｈ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６５．４９９〜５６０ンに従って、ＤＢ　 Ｒ３２２にサブフラグメントを再クローニングしてから問題の７ラグメントを配 列決定した。

第１図に配列決定法を概説している。第２図では、ヒトのゲノムライブラリーで 最近発見されたＩＦＮ−α遺伝子配列（ｔａｗｎ、　Ｒ，Ｈ，、Ａｄｅｌｍａｎ 、　Ｊ、、　Ｄｕｌｌ、　Ｔ、Ｊ、、　Ｇｒｏｓｓ、　Ｈ，Ｇｏｅｄｄｅｌ、　 Ｄ。

及び旧１ｒｉｃｈ、　Ａ、　（１９８１）　５ｃｉｅｎｃｅ　２１２．１１５９ 〜１１６２）と共に、確定した配列と予想アミノ酸配列を図示する。ＩＦＮ−β ＣＤ　Ｎ　Ａ配列は、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ等（Ｔａｎｉａｕｃｈｉ、　Ｔ１．０ ｈｎＯ，Ｓ、。

Ｆｕｊｉｉ−にｕｒｉｙａｍａ、　Ｙ、及びＨｕｒａｍａｔｓｕ、　Ｈ，（１９ ８０）　Ｇｅｎｅ　１０．１１〜１５）が記載のように、コドン３０の第３番目 の塩基が異なるだけで、Ｆｉｅｒｓ等（Ｄｅｒｙｎｃｋ、　Ｒ，、Ｃｏｎｔｅｎ ｔ、　Ｊ、、口ｅｃＩｅｒｃｑ、　Ｅ、。

Ｖｏｌｃｋａｅｒｔ、　Ｇ、、　Ｔａｖｅｒｎｉｅｒ、　Ｊ、、　Ｄｅｖｏｓ、 　Ｒ，及びＦｏｅｒｓ、　Ｗ。

（１９８０）　Ｎａｔｕｒｅ　２８５．５４２−５４７）が以前に発表したもの と完全な一致を示した。

生物学的活性 １、鶴〃巨Ｕ 第２図に示す配列（アミノ酸１〜１６６）でコードされた蛋白質を、ｔｒｐプロ モーターの制御下に」、姐旦内で発現させ、免疫アフィニティ力ラムで精製し、 ２つのテスト細胞、牛ＭＤＢＫ細胞とヒトＷｉｓｈ羊膜細胞で抗ウィルス活性を アッセイした。感染ウィルスとしてＶｅｓｉｃｕｌａｒ　Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｌＶｉｒｕｓを使用−して上記セルラインに於いて抗ウィルス活性をテストした （［ｅａｎｄｅｒｓｏｎ。

Ｔ、、　Ｈｉｌｌｏｒｎ、　Ｖ、、　Ｌａｒｓｓｏｎ、　Ｅ−Ｌ、及びしｕｎｄ ｇｒｅｎ、Ｅ、Ｊ、、、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１２９：　４９０〜４９４．１９８２）。活性は国際単位／Ｉｎｇ蛋白質で示し 、国際単位は６９／１９参照調製物（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉ ｏｎ　）で決定する。蛋白質はＩＦＮ−αに特異的な多りローナル性つサギ抗− ＩＦＮ抗体を使いサンドインチ型のＥＬＩＳＡ法で測定した（Ｃｌａｒｋ、　Ｂ 、Ｒ，及びＥｎｇｖａｌｌ、　Ｅ、、　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ 　（Ｈａｇｇｉｏ。

Ｅ、　Ｔ、編）　、ｐｐ、１６７〜１７９．　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、１９８０参照 ）。

結　果　： ＩＦＮ−α８８の比活性（ＩＵ／ＩＲｇ蛋白質）ＭＤＢＫ　Ｗｉｓｈ ８．４Ｘ１０　ｔｌ／■蛋白質　９．７ｘ１０”０７ｍｇ蛋白質２、抗増殖活性 バーキットリンパ腫由来のＤａｕｄ　ｉと急性リンパ球白血病由来のＭ　Ｎ　６ ０の２つの８−リンパ球セルラインについて抗増殖作用をテストした。細胞はそ れらの通常の培地で５日間増殖させ、ＩＦＮを０．０１．　０．１及び１０ｇ／ １ｌｌＩ！！の濃度で添加し、生存細胞を毎日数えた（　Ｌｅａｎｄｅｒｓｏｎ 、　Ｔ、及びＬｕｎｄｇｒｅｎ、　Ｅ、　Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ。

［１ａｕｄ　ｉ細胞は２４時間後から阻止され始め、９６時間後には増殖は停止 した。ＩＦＮに対し感受性がより弱いＭ　Ｎ　６０セルラインは４８時間後に増 殖抑制を示し、１　ｎｇ／−では９６時間、０．１ｎｇ／−では１２０時間で増 殖は停止した。

’３．　ＮＫ＝細胞増強活性 天然のキラー細胞に対する作用は、標的細胞としてに５６２エリスロミエロイド （ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｅｌｏｉｄ）細胞を使用し、４時間の５１　ｃ　ｒの放出 についてアッセイし、細胞溶解活性をモニターした（　Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ、 　Ａ、及びＬｕｎｄｇｒｅｎ、　Ｅ、　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　 ６２：３６７〜３７６、１９８１）。０．１ｎ（１／ａｔ！と１０ｇ／−の両者 で対照と比較して顕著な増強が見られた。従って、抗ウィルス活性、抗増殖活性 及びＮＫ細胞増強活性を有するので、アッセイした活性はＩＦＮのそれであるこ とが判明した。

第２図のｃＤ　Ｎ　Ａ分子を挿入したプラスミドを含有するＪ。

ｃｏｌｉ細胞は寄託番号ＤＮＳ　３２６１としてＤＳＨ，Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓ ａｍｎ＋Ｉｕｎｇｙｏｎ　Ｈｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託し、受託の日 付は１９８５年３月１１日であった。

（Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、Ｖ、、　Ｌｅｕｎｇ、　Ｄ、Ｗ、、　Ｄｕｌｌ、　Ｔ 、Ｊ、、　Ｇｒｏｓｓ、　Ｈ，。

Ｌａｗｎ、　Ｒ，Ｈｌ、　ＨｃＣａｎｄｌｉｓｓ、　Ｒ，、Ｓｅｅｂｕｒｇ、　 Ｐ、）１．、　Ｕｌｌｒｉｃｈ、　Ａ、。

’／ｅｌｖｅｒｔｏｎ、　Ｅ、及びＧｒａＶ、　Ｐ、Ｉ４．　（１９８１）　Ｎ ａｔｕｒｅ　２９０．２０−２６　）第　１　表 合成オリゴデオキシリボヌクレオチド。

この表はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用したオリゴヌク レオチドを示している。オリゴヌクレオチドと完全に相補的であるＩＦＮ遺伝子 を示している（２．７．８゜４２）。位置はＧｏｅｄｄｅ　１等（２）に従って 示す。

配　列　相補性を示す相手 ５°−ＣＡＡＣＣＴＣＣＣＡＧＧＣＡＣ−３°　１５−ｍｅｒ　ＩＦＮ−αＡ； 　−α、；　−ａＣ；ＩＦＮ−αＤ；−αＨ；α［；−αに ＩＦＮ−α２Ｃ１−α２ｈ；−α８８ ５’−ＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧ−３’　１３−ｍｅｒ　、ＩＦト（ＺＢ：　 −（ＺＣ；　−α０；ＩＦＮ−αＦニーαＧ；−α［： 及びＩＦＮ−β 第　２　表 Ｎａｎ＋ａ１ｗａ　Ｉ　Ｆ　Ｎの中和 ＨＤＢＫ　誓１ｓｈ Ｆ　１４４　８３０ゝ　１５００ Ｆ　１４４　＋抗−α　＜　１　１５０Ｆ１４４＋抗−β　８３０　７５０ Ｆ１４４＋抗−α十抗−β　ＮＴ　＜　１前記のように、１００ｊ！の規模で増 殖（１”　１４４）を実施した。混合実験では、抗−αは１／１００希釈で、抗 −βは１／１０希釈で使用した。

傘Ｕ／＆！は参照調製物６９／１９に対し較正した。

第　３　表 合成オリゴヌクレオチド及び全長を有するＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βプローブを 用いるＣＤＮＡライブラリーのスクリーニング。表では、実験１において２つの オリゴヌクレオチド（１５ｍｅｒ、　１３　ｍｅｒ）で同定されたクローンの数 とＩＦＮ−ａＡ　（２３３７）又はＩＦＮ−β（８９）をコードするｃＤＮＡク ローンの数を要約している。更に、実験２では各プローブと交差ハイブリダイズ するコロニーの数を示している。

１５−ｍｅｒ　１３−ｍＢ　クローン　クローン実　験　１ 一次スクリーニング　８　６　１４　２１実　験　２ 交差ハイブリダイゼー ションプローブ １５−０ｅｒ　Ｏ８０ １３−１ｅｅｒ　ＯＯ２ クローン２３３７１）　８　０　０ クローン８９２）０２　０ 手続補正口 チド ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　力ビビトルム・アー・べ− ６、補正により増加する発明の数 ８、補正の内容 い９．、、Ｎ１ａＰｊｌ　Ａｏｅ１１１＋１１゜、。ＰＣ丁／ＳＥＢ６１００２ ２Ｂ１ｍｍｕｎＭＩＡＤ６＋１ｃｊＩＩＩＩＩＮ＠、ＰＣＴ／ＳＥ８６１００２ ２８

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．第２図のヌクレオチド配列（α−８８）：又は前記配列とハイブリダイズし ＩＦＮ−α型のポリペプチドの発現をコードする配列；又は上記定義のヌクレオ チド配列への遺伝暗号の結果として縮重しＩＦＮ−α型のポリペプチドの発現を コードする配列を有するｃＤＮＡ分子。
2. ２．第２図のヌクレオチド配列（α−８８）を有するｃＤＮＡ分子。
3. ３．請求の範囲１又は２のｃＤＮＡ分子で形質転換された細菌又は細胞宿主。
4. ４．Ｅ．ｃｏｌｉから選択した請求の範囲３の宿主。
5. ５．請求の範囲３又は４の形質転換された宿主により製造される、α−型インタ ーフェロン活性を有するポリペプチド。
6. ６．第２図のα−型インターフェロン活性を有するポリペプチド。
7. ７．請求の範囲５又は６のポリペプチドを治療上有効量投与することからなる、 通常抗ウィルス剤、抗増殖剤又はＮＫ細胞活性化剤で治療する、ヒトを含む哺乳 動物の疾患の治療方法。