KR100245488B1 - 신규 식물 유전자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 플라보노이드 -3',5' - 수산화효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 이 DNA를 함유하는 재조합체 DNA 및 이 재조합체 DNA로 식물을 형질 전환함으로써 본래 갖고 있지 않은 색소 패턴을 갖는 식물에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]
신규 식물 유전자
[기술분야]
본 발명은, 유전자 재조합 DNA 기술을 사용하여 식물 또는 식물 세포를 육종 개량하는 기술에 관한 것이다. 더 상세히는, 플라보노이드-3',5'-수산화효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA (이하, 플라보노이드 -3',5' - 수산화 효소를 코드하는 DNA 라고도 한다.)를 함유하는 재조합체 DNA로 식물세포 또는 식물을 형질 전환함으로써, 외래성의 색소패턴을 갖는 신규 식물 세포 또는 식물을 육종하는 기술에 관한 것이다.
[배경기술]
종래, 식물의 꽃이나 과실의 색을 변화시키는 것은 품종간의 교배에 의하여 행해지고 있다. 이 경우 교배는 같은 종내나 아니면 거의 같은 속내에 한정되기 때문에, 식물종에 따라서는 도저히 부여하기 곤란한 색이 있다. 예를 들면, 파랑 장미나 카네이션은 육종가의 오랜기간의 노력에도 불구하고 얻어지지 못하고 있다.
근년에, 재조합 DNA 기술에 의하여 종이나 속의 벽을 넘은 육종이 가능하게 되어, 종래의 교배 육종에서는 얻어지지 못했던 새로운 색소패턴을 갖는 신품종의 육성이 기대되고 있다.[Plant Molecular Biology, Vol. 13, p. 287 - 294 (1989)]. 예를 들면, 색소 생합성계 효소의 하나인 디히드로폴라본올 - 4 - 환원효소의 유전자를 옥수수로부터 클론화하여 페튜니어에 도입함으로써, 종래에 없던 벽돌색의 페튜니어를 만들어낸 예가 보고되어 있다 [일본 특개평 2 - 2305 ; Nature, Vol. 330, p.677 - 678 (1987)]. 또, 페튜니어의 칼콘 합성효소의 유전자를 센스 또는 안티센스 방향으로 도입하여 유전자 발현을 부분적으로 정지시킴으로써 새로운 색소 패턴을 만들어낸 예도 보고되어 있다.[Nature, Vol. 333, p.866 - 869, 1988 ; The Plant Cell, Vol. 2, p.279 -289, 1990 ; The Plant Cell, Vol. 2, p.291 - 299, 1990].
청계나 적계의 화색에 관하여는 안토시아닌 색소의 합성경로는 페튜니어등에서 유전학적, 생화학적으로 상세하게 조사되어 있다 [Petunia, K. C. Sink 편집, Springer Verlag, p.49 - 76, 1984 ; The Flavonoids, J.B. Harborne 편집, Chapman and Hall, p.399 - 425, 1988 ; Molecular Approaches to Crop Improvement, E. S. Denis ＆amp; D. J. Rewerin 편집, Springer Verlag, p.127 - 148, 1991]. 이에 의하면 안토시아닌의 B 환의 3' 위와 5' 위의 수산화의 유무가 화색에 큰 영향을 미치며, 일반적으로 B 환의 수산화의 정도가 높을수록 푸름이 더함이 제시되어 있다. 이들 수산기는 안토시아닌의 전구체인 플라바논 또는 디히드로플라본올의 단계에서 도입된다. 이 수산화반응을 촉매하는 효소로서는 3' 위만을 수산화하는 플라보노이드 - 3' - 수산화효소 및 3' 위와 5' 위 모두를 수산화하는 플라보노이드-3',5'-수산화효소의 2 종이 알려져 있다. 푸른 페튜니어에서는 양자의 효소를 가지나, 빨간 페튜니어에서는 전자만이다. 또, 장미, 카네이션, 국화등의 식물에서는 3' 위와 5' 위의 양자가 수산화된 안토시아닌은 존재하지 않으므로, 후자의 효소는 존재하지 않는다고 생각되고 있다.
이들 수산화효소는 미크로솜막에 국재하며, NADPH를 보효소로서 요구한다. 또 각종 저해제에 대한 거동으로부터 시토크롬 P450 효소군에 속한다고 예상되고 있다 [＆quot;The Flavonoids＆quot;, J. B. Harborne 편집, Chapman ＆amp; Hall, p.399 - 425, 1988 ; Molecular Approaches to Crop Improvement, E. S. Denis ＆amp; D. J. Rewerin 편집, Springer Verlag, P.127 - 148, 1991].
시토크롬 P450은 진핵생물 및 원핵생물에 널리 존재하며, 스테로이드등 중요지질의 생합성이나 지용성물질의 산화대사반응을 관장하는 효소군이다. 고등동물에서는 백종이상의 분자종으로써된 수퍼 패밀리를 형성하고 있다 [J. Biol. Chem., Vol. 266, p.13469 - 13472, 1991 ; Pharmacol. Rev., Vol. 40, p.243 - 283, 1988]. 식물에서는 신남산 - 4 -수산화효소나 카우렌산화효소등의 시토크롬 P450에 속한다고 생각되고 있다 [Plant Physiol., Vol. 96, p.669 - 674, 1991]. 또 아보카도로부터 기능불명의 시토크롬 P450 효소유전자가 클론화되어 있다 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 87, p.3904 - 3908, 1990]. 많은 시토크롬 P450 효소의 아미노산 배열의 비교에 의하면, 헴 (heme) - 결합영역의 배열이 보존되어 있음이 알려져 있다 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 85, p.7221 - 7225, 1988 ; Pharmacol. Rev., Vol. 40, p.243 - 288, 1988].
플라보노이드-3',5'-수산화효소는, 페튜니어에 있어서는 Hf - 1 및 Hf - 2의 2개의 우성유전자에 코드되어 있다. 각각은 아이소자임의 관계에 있으며, Hf -1의 쪽이 보다 강하게 발현하고 있다 [Petunia, K. C. Sink 편집, Springer Verlag, p.49 - 76, 1984].
또, 버베나의 그 효소의 성질이 보고되어 있다 [Z. Naturforsch., Vol. 37c, p.19 - 23, 1982].
그리고, 페튜니어의 청색 색소 델피니딘의 생합성계의 관건효소 3',5' - 수산화효소를 클론화하였다는 보고는 이미 있었으나 (1991년 8월 26일, Nikkei Biotech), 클론화한 이 효소유전자는 식물중에서 발현시켜서, 식물중의 색소를 변환시킨 예는 알려져 있지 않다.
[발명의 개시]
본 발명에 의하면, 플라보노이드-3',5'-수산화효소 활성을 갖고, 그리고 배열번호 1, 배열번호 63 또는 64로 표시되는 아미노산 배열로 나타나는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 및 이 DNA와 하이브리다이즈하는 DNA, 이들 DNA 또는 그 배열의 일부를 벡터 DNA에 조입하여서된 재조합체 DNA 및 이 재조합체 DNA를 보유하는 식물세포 또는 식물을 제공한다.
이 DNA, 즉 플라보노이드-3',5'-수산화효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 재조합 DNA 기술을 사용하여 식물 세포 또는 식물에 조입함으로써 신규한 색소패턴을 갖는 식물을 육종할 수가 있다.
본 발명에 있어서의 DNA로서는, 플라보노이드-3',5'-수산화효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 즉 배열번호 1, 배열번호 63 또는 배열번호 64로 표시되는 아미노산 배열로 나타나는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 또는 이와 하이브리다이즈 하는 DNA (이하, hDNA라 한다.) 이면 어느것이나 무방하다. hDNA는, 2 × SSC (0.3M 염화나트륨, 0.03M 시트르산 나트륨, pH 7.0) 중, 50℃의 조건하에서 배열번호 1, 배열번호 63 또는 배열번호 64로 표시되는 아미노산 배열로 나타나는 폴리펩티드를 코드하는 DNA와 하이브리다이즈하는 DNA 이면 된다.
그리고, 배열번호 63 또는 배열번호 64로 표시되는 아미노산 배열로 나타나는 폴리펩티드를 코드하는 DNA는, 배열번호 1로 표시되는 아미노산 배열로 나타나는 폴리펩티드를 코드하는 DNA와, 상기 조건하에서 하이브리다이즈한다.
또, 상기한 바와 같은 DNA의 일부의 염기 배열이 삭제 또는 다른 염기 배열로 치환된 DNA 이라도 플라보노이드-3',5'-수산화효소 활성을 갖고 있는 폴리펩티드를 코드하고 있으면 모두 본 발명의 DNA에 포함된다.
DNA의 공급원으로서는, 플라보노이드-3',5'-수산화효소를 갖는 식물의 게놈 DNA, 또는 이 효소 발현 부위로부터 추출한 mRNA로부터 역전사 효소를 사용하여 합성한 cDNA를 들수 있다. 이 효소를 갖는 식물로서는, 예를 들면, 페튜니어(가지과), 팬지(제비꽃과), 프리무라(취란화과), 델피늄(미나리아제비과), 스위트피(콩과), 용담(용담과), 도라지(도라지과), 물망초(지치과), 지양화(범의기과), 버베나(버베나과), 드라이플라워(닭의잘풀과), 창포(창포과), 히아신스(백합과), 토르코도라지(용담과), 캄파뉴라(도라지과) 등을 들수 있다.
본 발명에 있어서는, 먼저 플라보노이드-3',5'-수산화효소가 시토크롬 P450의 일종이라는 예상에 의하여, 시토크롬 P450의 헴결합 영역의 아미노산배열 (이하, 코어배열이라 한다.)을 코드하는 DNA 배열을 PCR을 사용하여 증폭 단리한다.
코어 배열은 시토크롬 P450의 분자종 중에서도 또 여러가지의 생물종중에서도 공통성이 높은 영역이다. 이제까지 단리된 시토크롬 P450 배열의 80% 이상의 제1도에 나타낸 코어배열을 갖고 있다 [DNASISTMData CD, 009 - 1 및 2 ; Hitachi Software Engineering Co., Ltd., 1990]. 그러므로, 화살표로 나타낸 부분의 아미노산 배열을 코드할 수 있는 DNA 배열을 역산하여, 이 영역을 코드하는 DNA 배열을 PCR법으로 증폭단리하기 위하여 배열번호 2로부터 17에 나타낸 순방향(sense) 프라이머 16 종류 및 배열번호 18로부터 29에 나타낸 역방향(antisense) 프라이머 12 종류를 화학합성한다. 순방향 프라이머는 각각 18 염기로 구성된 합성 올리고뉴클레오티드이다. 각 순방향 프라이머는 Pro -Phe - Gly 또는 Pro - Phe - Ser를 코드하는 8 염기로써된 DNA 배열 16종류의 하나를 3' 말단에 가지며 Gly 또는 Ser인 코돈의 제3염기에 상응하는 DNA 염기가 결여되어 있다. 순방향 프라이머는 제한 효소 EcoRI의 인지 부위를 포함하는 10 염기로써된 DNA 배열을 5' 말단에 갖는다. 역방향 프라이머는 각각 18 염기로 구성된 합성 올리고뉴클레오티드이다. 각 역방향 프라이머는 Cys - Xxx - Gly (단, Xxx 는 Ile, Met, Leu, Phe, Val, Ala, Pro 중의 어느 하나)을 코드하는 8 염기로써된 DNA 배열 12 종류의 하나에 대한 상보적 DNA 배열을 3' 말단에 가지며 코돈의 제3염기 Gly에 상응하는 DNA 염기를 결여하고 있다. 코돈의 제2염기 Xxx에 상응하는 DNA 염기는 N으로 표시되는 A, C, G 및 T의 어느 하나일 수 있다. 역방향 프라이머는 제한효소 BamHI의 인지부위를 포함하는 10 염기로써된 DNA 배열을 5'말단에 갖는다.
이들 합성 DNA 프라이머를 조합하여 PCR을 행함으로써 코어배열을 코드하는 여러가지 DNA 단편을 증폭 단리할 수가 있으므로 그 DNA 배열을 알수가 있다. 시토크롬 P450은 여러가지 분자종으로써된 수퍼 패밀리를 형성하고 있으므로, 하나의 주형 DNA로부터 다종류의 코어배열이 얻어짐이 기대된다. 본 발명의 과정에 있어서도 배열신호 30에서 44에 나타낸 15종류의 코어배열을 얻을수가 있었다.
이와 같이 하여 알수가 있는 다종류의 코어배열중 어느 것이 목적하는 배열인지를 추정할 필요가 있다. 본 발명에 있어서는, 특정한 코어 배열의 발현의 유무와 이 효성활성의 유무가 유전적으로 연쇄해 있는지 아닌지를 조사함으로써 목적배열을 추정하고 있다. 유전적 연쇄를 조사하기 위하여는, 먼저 이 효소를 본래 갖고 있는 페튜니어 (청색화의 재배종)와 이 효소를 결손한 변이주인 페튜니어 (적색화의 재배종)를 교배하여, 이 효소의 유무에 관하여 유전적으로 (1 : 1) 분리한 집단을 만든다. 다음에, 이 집단의 각 개체의 화변에 있어서 특정한 코어배열이 발현되어 있는지 없는지를 조사한다. 만일 이 효소의 유무와 특정한 코어배열의 발현의 유무가 얼치 (유전적 연쇄) 하면 그 코어배열이 이 효소의 유전자의 일부라고 추정된다.
특정한 코어배열이 화변에 있어서 발현해 있는지 없는지를 조사하기 위하여, 본 발명에 있어서는, SSP(single specific primer) 폴리머라아제 연쇄반응 (PCR)이라 불리우는 방법을 사용하고 있다. SSP · PCR은 [Biochemistry Biophysics Research Communication, Vol. 167, p.504 ∼ 506, 1990]에 기재된 방법이다. 이에 의하여 코어배열 근방의 DNA 배열을 증폭하고, 그 산물의 유무를 조사할 수가 있다. 먼저 코어배열을 코드하는 DNA 배열을 기초로하여 특이적인 DNA 프라이머를 합성한다. 본 발명에 있어서는 배열번호 45 로부터 59에 나타낸 15 종류의 DNA (K 프라이머 01 ∼ 15)를 합성하여, 특이적인 DNA 프라이머로 하였다. 페튜니어 되돌림 교배집단의 각 개체의 화변으로부터 cDNA를 조제하고, 적당한 제한효소로 절단한 후, 이것과 절단 말단이 일치하는 적당한 이중가닥합성 (DNA 카세트라 불리움.)을 각각 리가아제를 사용하여 연결하여 주형으로 한다.
본 발명에 있어서는, 배열번호 60 및 61에 나타낸 합성 DNA을 아닐링시켜 카세트로서 사용하였다. 배열번호 60에 나타낸 합성 DNA는 카세트용 프라이머로서도 겸용하였다. 카세트를 연결한 주형 DNA에 대하여, 특이적인 프라이머와 카세트용 프라이머의 사이에서 PCR을 행함으로써, 코어배열 근방의 DNA 배열을 증폭시킨다. 이산물의 유무가 특정한 코어배열의 발현의 유무를 반영하고 있다.
검색의 결과, 페튜니어 되돌림 교배집단에 있어서, 배열번호 58에 나타낸 특이적인 프라이머 (K 14)를 사용한 SSP·PCR에 의하여 증폭되는 산물 (약 85bp)의 유무가, 이 효소활성의 유무와 완전히 연쇄하였다. 이 프라이머는 배열번호 43에 나타낸 코어배열에 의하여 설계되어 있으므로, 배열번호 43에 나타낸 배열이 효소의 코어배열이라고 추정된다. 그러므로, 배열번호 43에 의하여 새로이 배열번호 62에 나타낸 프라이머 (J 14)를 합성하여 SSP·PCR을 행한 결과, 약 280bp의 산물의 유무가 효소 활성의 유무와 완전히 연쇄하였다. 배열번호 43에 나타낸 코어 배열이 목적하는 배열이라고 강하게 시사된다.
이리하여 증폭된 약 280bp의 산물은 이 효소를 코드하는 cDNA 배열의 일부라고 추정된다. 그러므로, 페튜니어 화변 cDNA 라이브러리를 예를 들면 Maniatis등의 저서에 기재한 방법에 의하여 작성하여, 상기 산물을 프로브로서 검색함으로써, 배열번호 1에 나타낸 완전길이의 cDNA 배열을 얻을 수가 있다. 이 배열을 이 효소를 갖지 않은 식물중에 발현시켜, 이 효소활성을 조사함으로써 본 배열이 이 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 임이 증명된다. 본 발명에 있어서는, 담배 및 페튜니어의 이 효소를 갖지 않은 품종에 배열번호 4에 나타낸 DNA를 도입하여 발현시킨 결과, 이 효소의 활성이 확임됨으로써, 증명되었다.
DNA의 클로닝은, 예를 들면 페튜니어의 화변으로부터 추출한 mRNA로부터 역전사 효소를 사용하여 합성한 cDNA를 재료로 하여 행할 수가 있다.
DNA의 클로닝 및 DNA 해석의 일반적 수법에 관하여는, 예를 들면 [Molecular Cloning a Laboratory Manual, 제 2 판, J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (이하, Maniatis 등의 저서라 함)].에 기재된 방법에 따라서 행할 수가 있다.
통상의 PCR의 수법에 관해서는, [PCR Technology, H. A. Ehrlich 편집, Stockton Press, 1989; PCR Protocols, M. A. Innis, D. H. Gerfand, J. J. Sninsky, T. J. White 편집, Academic Press, 1990]등에 기재한 방법에 따라서 행할수가 있다.
DNA의 염기배열 결정은, 예를 들면 Taq DideoxyTM터미네이터 사이클 시퀀싱 키트 (ABI 사제)와 모델 373A DNA 시퀀싱 시스템 (ABI 사제) 을 사용하는 등의 방법에 의하여 행할수가 있다.
이와 같이 하여서 얻어지는 배열번호 1에 나타낸 페튜니어의 이 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 배열의 전부 또는 일부를 하이브리드화 프로브로서 사용하는 상법에 의하여, 전기한 여러가지의 공급원의 어느 식물로부터도 배열이 유사한 이 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 단편을 클로닝할 수가 있다.
본 발명에 있어서는 상기한 수법에 의하여, 토르코도라지를 공급원으로하여 배열번호 63에 나타낸 아미노산 배열로 나타내는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를, 캄파뉴라를 공급원으로 하여 배열번호 64에 나타낸 아미노산 배열로 나타내는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 클로닝하고 있다.
이 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 단편을 이 효소를 갖지 않은 숙주식물에 도입하여, 발현시킴으로써 안토시아닌 색소의 3' 위와 5' 위를 수산화하여, 숙주식물에 새로운 색을 갖도록 할 수가 있다. 숙주 식물의 예로서는, 장미(장미과), 카네이션(술패링이꽃과), 페튜니어(가지과), 담배(배과), 국화(국화과), 스톡(유채과), 베고니어(추해당과), 금어초(금어초과), 동백(동백과), 백합(백합과), 난(난과) 등을 들수가 있다.
또 이 효소를 갖는 식물종으로서 이 DNA 단편을 안티센스 또는 센스 방향으로 도입·발현시킴으로써, 그 식물이 본래 갖는 이 효소활성을 저해할 수도 있다. [Nature, Vol. 333, p.866 - 869, 1988 ; The Plant Cell, Vol. 2, p.279 - 289, 1990 ; The Plant Cell, Vol, 2, p.291 - 299, 1990]. 이와 같은 방법에 의하여 종래에 없는 색소패턴을 갖는 식물 품종의 육종이 가능하게 된다.
이 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 단편을 도입하여 식물중에서 발현시키기 위하여는 이 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 영역의 상류에 적당한 프로모우터를 접속할 필요가 있다. 식물중에서 작용하는 프로모우터로서는 칼리플라워 모자이크 비루스 (CaMV)의 35S 프로모우터 [Cell, Vol. 21, p.285 - 294, 1980]를 들수가 있다. 또 부위 특이적으로 작용하는 프로모우터의 예로서는, 화변에서만 강하게 작용하는 페튜니어의 칼콘 합성효소 (CHS) 유전자의 프로모우터 [Plant Molecular Biology, Vol. 15, p.95 - 109, 1990]를 들수가 있다. 이와 같은 프로모우터의 어느하나를 접속함으로써 식물중에서 발현시킬 수가 있다. 그리고, 게놈 DNA로부터 이 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 클로닝했을때에는 이미 본래의 프로모우터가 접속해 있는 가능성이 있으며, 이때는 굳이 다른 프로모우터를 접속할 필요는 없다.
또한, 이 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA의 하류에 전사종결의 터미네이터 [EMBO Journal, Vol. 7, p.791 - 799, 1988]를 접속함으로써, 효율적인 발현을 기대할 수 있다.
또 DNA가 도입된 식물세포 또는 식물체를 선발하는데 적당한 마커가 접속되어 있음이 바람직하다. 마커로서는 예를 들면 카나마이신 내성유전자 및 하이그로마이신 내성유전자 [Plant Molecular Biology, Vol. 5, p.299 - 302, 1985]를 들수 있다. 식물세포 또는 식물에의 DNA 도입에 아그로박테륨속 미생물을 사용할 경우에는, 식물 염색체중에 삽입하고자 하는 배열의 양단에 Ti 플라스미드 유래의 경계 배열을 접속할 필요가 있다 [Nature, Vol. 313, p.191 - 196, 1985]. 또 아그로박테륨속 미생물중에서 플라스미드로서 안정하게 유지되기 위한 배열이 접속되어 있을 필요가 있다. 이상과 같은 조건을 충족하는 식물의 발현 벡터로서 예를 들면, pBIl21 (Clonetech 사제)을 들수가 있다.
상기와 같은 벡터에 조입한 이 DNA 단편을 식물에 도입하여, 유전적으로 안정한 형질전환 식물을 얻는 방법으로서는 다음과 같은 것을 들수가 있다.
① 쌍자엽 식물에 있어서는, 근두암종병 병원세균 아그로박테륨 튜메파시엔스 (Agrobacterium Tumefaciens)를 경유하여 DNA를 도입하는 방법 [Methods in Enzymology, Vol. 118, p. 627 - 640, 1986], ② DNA를 금이나 텅스텐등의 미립자와 함께, 고속으로 식물세포에 타입함으로써 세포핵에 취입시켜서, 염색체에 조입하는 방법 [고속 미립자법 ; Plant Molecular Biology, Vol. 11, p.433 - 439, 1989, Bio/Technology, Vol. 9, p.1080 - 1085, 1991],③ 식물 세포를 세포벽 분해효소로 처리하여 프로토프라스트를 만들고, 염화칼슘이나 폴리에틸렌 글리콜과 함께 DNA를 취입시키는 방법 [Nature, Vol. 296, p.72 - 74, 1982 ; Nature, Vol. 319, p.791 - 793, 1986]을 들수 있다. ①의 방법의 경우, 도입하고자 하는 DNA를 pBI121등의 2 원성벡터 [Nucleic Acids Research, Vol. 12, p.8711 - 8721, 1984]에 조입해 놓으면 효율적이다. ②의 방법에 의하면 단자엽 식물등 아그로박테륨속 미생물이 감염하지 않는 식물에도 DNA를 도입할 수가 있다. 이상과 같은 방법에 의하여, 벡터에 조입한 이 DNA 단편을 식물세포에 도입한 후, 약제 내성등의 적당한 마커 유전자를 이용함으로써, 도입 DNA가 안정적으로 염색체에 조입되어 있는 식물세포를 선발한다. 이와 같은 세포를 분화 유도함으로써 신규한 색소 패턴을 갖는 형질전환 식물을 얻을 수가 있다.
이와 같이하여 얻어지는 형질 전환식물에 있어서는 도입한 이 DNA 단편이 유전적으로 안정하게 유지되어 있다. 즉, 형질 전환 식물을 영양번식적으로 증식하든지 아니면 자식 또는 타식에 의하여 종자를 취하든지함으로써, 이 DNA 단편을 반영구적으로 유지해 나갈 수가 있다.
또, 형질전환 식물을 종래 품종과 교배하여 유전자를 조합함으로써, 최초의 형질 전환 식물과는 다른 색소 패턴을 갖는 신품종을 육종해 갈 수가 있다.
이리하여, 예를 들면 장미나 카네이션등과 같이 3' 위와 5' 위가 동시에 수산화된 것과 같은 안토시아닌 색소를 갖지 않은 식물에, 그와 같은 색소을 생성시킴으로써, 종래에 없는 청색이나 자색의 품종을 만드는 기술이 제공된다.
[도면의 간단한 설명]
제 1 도는 공지의 시토크롬 P450 아미노산 배열의 80% 이상이 갖고 있는 코어배열이다.
[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]
[실시예 1] : 시토크롬 P450 유전자 코어배열의 PCR 증폭단리와 구조결정
(1) 프라이머의 합성
시토크롬 P450 유전자 배열의 일부를 다음과 같이 폴리머라아제 연쇄반응(PCR)에 의하여 증폭 단리하였다. 시토크롬 P450은 수많은 분자로써된 수퍼 패밀리를 형성하고 있는데, 서로의 아미노산 배열은 그다지 공통성이 높지 않다. 그러나 헴이 결합하는 영역의 배열 (코어 배열)은 비교적 공통이다.
이제까지 단리된 시토크롬 P450 배열의 80% 이상이 제 1 도에 나타낸 코어배열을 갖고 있다. 여기서 화살표로 나타낸 부분의 아미노산 배열을 코드할 수 있는 DNA 배열을 역산하여, 이 영역을 코드하는 DNA 배열을 PCR법에 의하여 증폭단리하기 위하여 프라이머 DNA를 DNA 합성기 Cyclone PlusTM(Milligen/Biosearch 사제)을 사용하여 화학 합성하였다. 배열번호 2로부터 17에 나타낸 순방향 프라이머 16 종류 및 배열번호 18로부터 29에 나타낸 역방향 프라이머 12 종류이다.
순방향 프라이머는 각각 18 염기로 구성된 합성 올리고뉴클레오티드이다. 각 순방향 프라이머 Pro - Phe - Gly 또는 Pro - Phe - Ser을 코드하는 8염기로써된 DNA 배열 16 종류의 하나를 3' 말단에 가지며, Gly 또는 Ser인 코돈의 제 3 염기에 상응하는 DNA 염기가 결여되어 있다. 순방향 프라이머는 제한효소 EcoRI의 인지부위를 포함하는 10염기로써된 DNA 배열을 5' 말단에 갖는다. 역방향 프라이머는 각각 18 염기로 구성된 합성 올리고뉴클네오티드이다. 각 역방향 프라이머는 Cys - Xxx - Gly (단, Xxx 은 Ile, Met, Leu, Phe, Val, Ala, Pro 중의 어느 하나)을 코드하는 8 염기로써된 DNA 배열 12 종류의 하나에 대한 상보적 DNA 배열을 3' 말단에 가지며 코돈의 제 3 염기 Gly에 상응하는 DNA 염기를 결여하고 있다. 코돈의 제 2 염기 Xxx에 상응하는 DNA 염기는 N으로 표시되는 A, C, G 및 T의 어느 하나일 수 있다. 역방향 프라이머는 제한효소 BamHI의 인지부위를 포함하는 10 염기로써된 DNA 배열을 5' 말단에 갖는다.
각 프라이머는, 5μM 농도의 수용액으로서 사용하였다.
(2) 페튜니어 화변으로부터 mRNA의 추출
[Analitical Biochemistry, vol. 163, p.16 - 20, 1987]에 기재된 방법을 개변하여 행하였다. 즉, 온실에서 재배한 페튜니어 [Petunia hybrida ; 품종 팔콘 블루 (Sakata Seed 사제)]의 꽃봉오리로부터 화변부를 절취하여, 습중, 10g을 유발에 넣고 액체 질소을 붓고 동결하여 유봉으로 파쇄하였다. 이에 20ml의 RNA 추출완충액 [8M 구아니딘 염산, 20mM 메스완충액 (pH7.0), 20mM EDTA, 50mM 메르캅토에탄올]을 가하고, 10ml의 페놀·클로로포름·이소아밀 알콜 (25 : 24 : 1) 혼액을 가하고 잘 혼합하고, 10,000 × g로 10 분간 원심하여 상층을 분취하였다. 다시 20ml의 페놀·클로로포름·이소아밀알콜 (25 : 24 : 1) 혼액을 가하고 잘 혼합한후, 10,000 × g로 10분간 원심하여 상층을 분취하였다. 이에 14ml의 에탄올과 4ml의 1M 초산을 가하고, -70℃에 1시간 방치한 후 10,000×g로 10분간 원심하여 침전을 취했다. 침전을 10ml의 물에 용해하고, 3ml의 10M 염화리튬을 가하여 혼합하고, 4℃에서 2시간 방치한 후, 10,000 × g로 10분간 원심하여 침전을 취했다. 침전을 10ml의 70% 에탄올로 세정하고, 진공중에서 건조시켜, 1ml의 용출완충액 [10 mM 트리스 염산 완충액 (pH7.5), 1 mM EDTA, 0.1% 도데실 황산나트륨 (SDS)]에 용해하고, 200μl의 01igotexTMdT 30(Takara Shuzo 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 약 3㎍의 폴리 (A) mRNA을 정제하였다.
(3) 페튜니어 화변 mRNA로부터 cDNA의 합성
상기의 mRNA을 주형으로하여, cDNA 합성 시스템 Plus RPN1256(Amersham 사제)을 사용하여 첨부한 매뉴얼에 따라서, 올리고 dT 프라이머로부터 cDNA을 합성하였다. 약 2㎍의 이중가닥 cDNA가 수득되었다.
(4) 시토크롬 P450 공통배열의 PCR 증폭
주형 DNA로서 상기의 cDNA 1㎍의 25μl의 PCR 완충액 [10mM 트리스 염산 완충액 (pH 8.3), 1.5mM 염화마그네슘, 25mM 염화칼륨, 0.05% Tween 20, 100μM dATP, 100μM dCTP, 100μM dGTP, 100μM dTTP]에 용해하였다. 0.5ml 용의 마이크로원심 튜브에 넣고, 프라이머로서 (1)에서 합성한 순방향 프라이머 (1 종류) 1μl 및 역방향 프라이머 (1 종류) 1μl을 가하고 혼합하여, 0.5단위의 Taq DNA 폴리머라아제 (Perkin - Elmer Cetus 사제)를 혼합하고, 10μl의 광유를 중층하였다. 반응은 DNA Thermal Cycler (Perkin - Elmer Cetus 사제)에 의하여, 93℃에서 30초간 37℃에서 1분간을 3사이클 행한 후, 93℃에서 30초간 55℃에서 1분간을 37사이클을 행하였다.
순방향 프라이머 16종류와 역방향 프라이머 12종류의 모든 조합, 192가지에 대하여 상기의 조건으로 PCR을 행하였다.
그리고 PCR은 [PCR Technology, H.A. Ehrlich 편집, Stockton Press, 1989 및 PCR Protocols, M. A. Innis, D. H. Gerfand, J. J. Sninsky ＆amp; T.J. White 편집, Academic Press, 1990]을 참고로 하여 행하였다.
(5) PCR 산물의 클로닝
상기의 반응 생성물은 Maniatis등의 저서에 기재된 방법에 따라서, 10% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 걸어 에티듐 브로마이드 염색한 결과, 순방향과 역방향의 192 가지의 조합중 23의 조합에 있어서 약 50 bp의 DNA 밴드를 검출하였다. 각각의 DNA 밴드를 Maniatis 등의 저서에 기재된 방법에 따라서, 절출하여 추출정제하였다. 이것을 각각 50μl의 H완충액 [50mM 트리스 염산 완충액 (pH 7.5), 10mM 염화마그네슘, 1mM 디티오트레이톨, 100mM 염화나트륨]에 용해하고, 10단위의 제한 효소 BamHI (Takara Shuzo 사제) 및 10 단위의 제한 효소 EcoRI (Takara Shuzo 사제)을 가하고, 37℃에서 3시간 반응시킨다. 반응액에 150μl의 에탄올을 가하여 -80℃에서 10분간 방치하고, 10,000 × g로 10분간 원심하여, 침전을 200μl의 70% 에탄올로 세정한 후 진공 건조하였다. 이것을 10μl의 TE 완충액 [10mM 트리스 염산 완충액 (pH 7.5), 1mM EDTA]에 용해하였다.
5μg의 플라스미드 벡터 pUC 19 (Takara Shuzo 사제)을 50μl의 H완충액에 용해하고, 10단위의 제한 효소 BamHI (Takara Shuzo 사제) 및 10단위의 제한효소 EcoRI (Takara Shuzo 사제)을 가하고, 37℃에서 3시간 반응시켰다. 반응액에 150μl의 에탄올을 가하고, -80℃에서 10분간 방치하고, 10,000 × g로 10분간 원심하여, 침전을 200μl의 70% 에탄올로 세정한 후 진공 건조하였다. 이를 100μl의 TE 완충액에 용해하였다.
상기에서 얻어진 벡터 용액 (1μl)과 약 50bp의 DNA 단편 용액 (10μl)을 혼합하고, DNA 라이게이션 키트 (Takara Shuzo 사제)를 사용하여, 이 키트에 첨부한 매뉴얼에 따라서, 16℃에서 30분간 연결 반응을 행하였다. 반응액의 용량은 60μl이었다. 반응액 2μl을 수용능력이 큰 세포 E. Coli JM 109 (Toyobo 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 형질 전환하였다. Maniatis등의 저서에 기재된 방법에 따라서, X-gal 암피실린 LB 한천배지 [1·% 박토 트립톤 (Difco 사제), 0.5% 박토 이스트 엑스트랙트 (Difco 사제), 1% 염화나트륨, 40μg/ml X-gal, 40μg/ml 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드 (IPTG), 100μg/ml 암피실린, 1.5% 박토한천 (Difco 사제)] 상에서 37℃에서 20시간 배양하였다. 생성한 백색 콜로니를 단리 배양하여, 플라스미드 DNA을 추출 정제하였다.
(6) PCR 산물의 DNA 염기 배열의 결정
상기와 같이 취득한 합계 108 클론의 삽입단편의 염기 배열을 Taq DideoxyTM터미네이터 사이클 시퀀싱 키트 (ABI 사제)를 사용하여 모델 373A DNA 시퀀싱 시스템 (ABI 사제)에 의하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 결정하였다. 그결과, 시트크롬 P450 유전자에 있어서의 배열번호 30으로부터 44에 나타낸 15종류의 코어배열이 결정되었다.
[실시예 2] : 페튜니어 되돌림 교배 집단의 작출
(1) 화변 색소의 분석
화변의 색소 분석은 [phytochemical Methods, J.B. Harbone 편집, p.64, Chapman ＆amp; Hall, 1989]에 기재된 방법에 의하여, 안토시아닌을 안토시아니딘으로 변환하여 행하였다. 즉, 화변 0.1 ∼ 0.5g을 절취하고, 1ml의 2N 염산을 가하고, 95℃에서 40분간 가열한 후 실온으로 되돌렸다. 300μl의 초산에틸을 가하고 잘 혼합한 후 정치하여, 상층의 초산에틸을 제거하였다. 잔사를 80℃에서 3분간 가열하여 초산 에틸을 증발시키고, 실온으로 되돌렸다. 100μl의 이소아밀알콜을 가하고 잘 혼합한 후 정치하여, 상층의 이소아밀알콜층을 분취하였다. 1 ∼ 5μl을 셀룰로스 박층 플레이트 (Merck 사제)에 스폿팅하여, 용매계 1(농염산 : 초산 : 물 = 3 : 30 : 10) 또는 용매계 2 (n - 부탄올 : 초산 : 물 = 4 : 1 : 5)을 사용하여 전개하여, 색소 스폿의 Rf 치와 색조로부터 안토시아니딘을 동정하였다. 또, Hitachi 이온크로마토 시스템 (L6200 형펌프 및 L4200 형 검출기를 사용)에 의하여, YMC - Pack OSD - A 역상 컬럼 (YMC 사제)을 사용하여, 물 : 초산 : 메탄올 = 71 : 10 : 19을 이동상으로하여 분석을 행하였다 [최신 고속 액체 크로마토그래피, 응용편 II, p.528, Hirokawa Shoten, 1983]. 표준품으로서, 시판의 사아니딘, 델피니딘, 페오니딘 및 마루비딘 (모두 Extrasynthese 사제)을 사용하여, 안토시아니딘을 동정하였다.
(2) 페튜니어의 되돌림 교배 집단의 작출
페튜니어의 교배는 페튜니어 [Petunia, K.C. Sink 편집, p.180 - 202, Springer Verlag, 1984]에 기재된 방법에 의하여 행하였다. 청색계 페튜니어 품종 퍼플 죠이 (Purple Joy) (NPI Seeds 사제)와 적색 페튜니어 품종 팔콘 레드 (Falcon Red) (Sakata Seed 사제) 과를 교배하여 잡종을 얻는다. 이것을 팔콘 레드에 되돌림 교배하여 얻은 잡종의 화변의 안토시아니딘을 분석하여, 이것이 델피니딘인 개체를 하나 선택하여 팔콘 레드에 되돌림 교배하였다. 이와 같이 하여 합계 4회 되돌림 교배하여 얻은 잡종 집단 18 개체의 화변의 안토시아니딘을 조사한 결과, 델피니딘을 부여하는것 (델피니딘 타입이라 한다.) 이 10개체, 시아니딘을 부여하는 것 (시아니딘 타입이라 한다.) 이 8개체 이었다. 화변의 색은 전자가 회자색, 후자가 적색이었다.
(3) 플라보노이드-3',5'-수산화효소 활성의 검출
플라보노이드-3',5'-수산화효소 활성의 검출은 [Z.Naturforsch, Vol. 37c, p.19 - 23, 1982]에 기재된 방법을 개변하여 행하였다. 즉 꽃망울의 화변부 5g (습중)을 취하고, 2.5g의 석영사 (Sigma 사제), 2.5g의 Dow × 1 x 2 (The Dow Chemical 사제) 및 10ml의 효소 추출액 [0.1M 인산칼륨 완충액 (pH 7.5), 20% 글리세롤, 10mg/ml 아스코르빈산나트륨]을 가하고, 0℃에 놓고, 유발중 유봉으로 파쇄하였다. 12,000×g로 20분간 원심한 상청 10ml에 대하여, 0.4ml의 1M 염화마그네슘을 가하여 혼합하고, 0℃에 10분간 놓은 다음, 17,000×g로 20분간 원심하여 첨전을 얻었다. 이것을 최종용량 500μl로 되도록 소량의 효소추출 완충액에 현탁하여 미크로솜 분획으로 하였다.
100μl의 미크로솜 분획을 400μl의 반응 혼합물 [0.1M 인산칼륨 완충액 (pH 7.5), 20% 글리세롤, 10mg/ml 아스코르빈산나트륨, 0.25μM NADPH (Sigma 사제), 0.25mM 디히드로퀘르세틴 (Sigma 사제)]에 혼합하고, 25℃에서 30분간 반응시켰다. 250μl의 초산에틸을 가하고 혼합하여, 정치한 후 상층 (초산에틸층)을 취하여 초산에틸을 증발시킨 잔사를 10μl의 초산에틸에 용해하였다. 5μl을 셀룰로스 박층 플레이트(Merck 사제)에 스폿팅하여, 용매계 3 (클로로포름 : 초산 : 물 = 10 : 9 : 1)을 사용하여 전개하였다. 자외선 조사에 의하여 검출되는 플라보노이드를 Rf 치로부터 동정한 결과, 플라보노이드-3',5'-수산화효소에 의하여 디히드로퀘르세틴이 디히드로미리세틴으로 변환된 사실을 확인하였다.
상기의 되돌림 교배집단종 델피니딘 타입은 이 효소 활성을 갖고 있고, 시아니딘 타입로부터는 이 효소 활성은 검출되지 않았다. 또 청색계 페튜니어 품종 팔콘 블루 (Falcon Blue) (Sakata Seed 사제), 퍼플 죠이(NPI Seeds 사제)는 이 효소활성을 갖고 있었으나, 적색계 페튜니어 품종 팔콘 레드 (Sakata Seed 사제), 팔콘 사몬 (Falcon Salmon) (Sakata Seed 사제)로부터는 이 효소활성은 검출되지 않았다.
[실시예 3] : 시토크롬 P450 코어배열로부터의 SSP·PCR
(1) K 프라이머의 활성
실시예 1 (6)에서 얻어진 배열번호 30로부터 44로 나타낸 15종류의 시토크롬 P450 코어배열에 의하여, 배열번호 45로부터 59로 나타낸 15종류의 PCR 프라이머를 DNA 합성 사이클론 플러스 (Milligen/Biosearch 사제)를 사용하여 화학 합성하였다. 각 프라이머는 5μM 농되의 수용액으로 사용하였다. 각각을 K15 프라이머로 명명하고 ,이들을 k프라이머로 총칭한다. k프라이머는 코어의 아미노산 배열의 c말단글리신의 코돈으로부터 시작하여 n 말단 방향으로 향하는 17 염기로 된 합성 DNA프라이머이며, 배열번호 30 으로부터 44 로 나타냄 코어 DNA배열의 32번째의 염기로부터 시작하여 16번째의 연기에 이르는 배열에 대응한다.
(2) 카세트 및 카세트용 프라이머의 합성
배열번호 60 및 61 로 나타낸 올리고 뉴클레오티드를 DNA합성 사이클론플러스 (Milligen/Biosearch사제) 를 사용하여 화학 합성하였다. 각 프라이머는 5μM 농도의 수용액으로서 사용하였다. 각각을 K01 로부터 K15 프라이머로 명명하고, 이들을 K 프라이머로 총칭한다. K. 프라이머는 코어의 아미노산 배열의 C 말단글리신의 코돈으로부터 시작하여 N 말단 방향으로 향하는 17 염기로 된 합성 DNA 프라이머이며, 배열번호 30 으로부터 44 로 나타낸 코어 DNA 배열의 32 번째의 염기로부터 시작하여 16 번째의 염기에 이르는 배열에 대응한다.
(2) 카세트 및 카세트용 프라이머의 합성.
배열번호 60 및 61 로 나타낸 올리고 뉴틀레오티드를 DNA 합성 사이클론 플러스 (Milligen/Biosearch 사제) 를 사용하여 화학합성하고, 각각 20μM 농도의 수용액으로 하였다. 양자를 100μl씩 혼합한 것을 95℃에서 10분간 가열한 후 50℃에서 1시간 보온하여, 이중가닥 DNA로 하였다. 이것을 카세트로 부른다. 이 카세트의 한쪽 말단은 CG 돌출형의 부착 말단으로되어 있으므로, 제한효소 HinPI, MaeII, MspI, TthHB8I 등에 의한 절단 말단과 효율적으로 연결한다.
또 따로 배열번호 60 올리고뉴클레오티드를 5μM의 수용액으로 하고, 이것을 카세트용 프라이머로 한다.
(3) 페튜니어 화변 cDNA의 합성
실시예 2에서 작출한 되돌림 교배 집단중, 델피니딘 타입 4 개체와 시아니딘 타입 2 개체씩 선정, 실시예 1 (2), (3)에 기재한 방법에 의하여 화변의 mRNA 추출하여 cDNA를 합성하였다. 또 팔콘 블루, 팔콘 레드, 팔콘 사몬, 퍼플 죠이의 화변 cDNA도 같이 하여 취득하였다.
(4) cDNA의 TthHB8I 절단과 카세트의 연결
상기 (3)에서 얻어진 10 종류의 cDNA 각 0.1μg을 50μl의 H 완충액에 용해하고, 1 단위의 제한효소 TthHB8I (Takara Shuzo 사제)을 가하고, 65℃에서 1시간 반응시켰다. 5μl의 페놀·클로로포름 (1 : 1) 혼액을 가하고 혼합하여, 150μl의 에탄올을 가하고, -80℃에서 10분간 놓고, 10,000 × g로 10분간 원심하여, 침전을 200μl의 70%에탄올로 세정한 후 진공 건조하였다. 이것을 9μl의 TE 완충액에 용해하였다.
각각 1μl의 카세트를 가하고, DNA 라이게이션 키트 (Takara Shuzo 사제)을 통하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 16℃에서 30분간 연결반응을 행하였다. 반응액의 용량은 60μl이었다.
(5) K 프라이머와 카세트용 프라이머 사이의 PCR
상기 반응액을 주형으로하여, K 프라이머 (01 ∼ 15)와 카세트용 프라이머 사이에 PCR을 행하면, 근방의 제한효소 부위까지의 배열을 증폭할 수가 있다.
상기의 반응액 1μl을 주형으로하고, 이에 각 K 프라이머 1μl와 카세트용 프라이머 1μl을 가하고 25μl의 PCR 완충액에 혼합하였다. 0.5ml의 마이크로 원심 튜브에 넣고, 0.5 단위의 Taq DNA 폴리머라아제 (Perkin - Elmer Cetus 사제)을 가하고 혼합하여, 10μl의 광유를 중층하였다. 반응은 DNA Thermal Cycler (Perkin - Elmer Cetus 사제)에 의하여, 93℃에서 30초간 55℃에서 1분간의 사이클을 40회 행하였다. 반응 산물을 Maniatis 등의 저서에 기재된 방법에 따라서 10% 폴리아크릴아미드겔 전기영동 걸어서 에티듐 브로마이드 염색하고 자외선 조사하여 DNA 밴드를 해석하였다.
그결과, K14 프라이머를 사용한 SSP·PCR에 있어서, 팔콘 블루, 퍼플 죠이, 델피니딘 타입 되돌림 교배개체 (4 개체)의 각 cDNA (6 종류)을 주형으로 했을때 얻어지는 약 85bp의 DNA 밴드가 팔콘 레드, 팔콘 사몬, 시아니딘 타입 되돌림 교배 개체 (2 개체)의 각 cDNA (4 종류)을 주형으로 했을때는 검출되지 않음이 명백해졌다. 즉, 약 85bp의 SSP·PCR 산물의 유무와 이 효소 활성의 유무가 유전적으로 연쇄해있음이 판명되었다. 다른 프라이머에 있어서는 그와 같은 산물은 검출되지 않았다. K14 프라이머는 배열번호 43으로 나타내는 코어 배열에 의하여 설계되어 있으므로, 배열번호 43이 이 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 배열의 일부일 가능성이 시사되었다.
(6) J14 프라이머의 합성
K14 프라이머를 합성하는 기초로된 배열번호 43으로 나타내는 시토크롬 P450 유전자 코어배열에 의하여, 배열번호 62로 나타내는 프라이머를 DNA 합성기 사이클론 플러스 (Milligen/Biosearch 사제)를 사용하여 화학형성하였다. 이를 J14 프라이머로 명명하고, 5μM 농도의 수용액으로서 사용하였다.
(7) cDNA의 HinPI 절단과 카세트의 연결
상기 (3)에서 얻어진 10종류의 cDNA 각 0.1㎍를 50μl의 M 완충액 [10mM 트리스 염산 완충액 (pH 7.5), 10mM 염화마그네슘, 1mM 디티오트레이톨, 50mM 염화나트륨]에 용해하고, 1 단위의 제한효소 Hin PI (New England Biolabs 사제)을 가하고, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 5μl의 페놀·클로로포름 (1 : 1) 혼액을 가하여 혼합하고, 150μl의 에탄올을 가하고, -80℃에서 10분간 놓고, 10,000 ×g로 10분 원심하여, 침전을 200μl의 70% 에탄올로 세정한 후 진공 건조하였다. 이를 9μl의 TE 완충액에 용해하였다. 각각에 1μl의 카세트를 가하고 DNA 라이게이션 키트 (Takara Shuzo 사제)를 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 16℃에서 30분간 연결 반응을 행하였다. 반응액의 용량은 60μl이었다
(8) J14 프라이머와 카세트용 프라이머 사이의 PCR
상기의 반응액 1μl을 주형으로 하고, 이에 J14 프라이머 1μl와 카세트용 프라이머 1μl을 가하고, 25μl의 PCR 완충액에 혼합하였다. 0.5ml용의 마이크로원심 튜브에 넣고, 0.5 단위의 Taq DNA 폴리머라아제 (Perkin - Elmer Cetus 사제)를 가하고 혼합하여, 10μl의 광유를 중층하였다. 반응은 DNA Thermal Cycler (Perkin - Elmer Cetus 사제)에 의하여, 93℃에서 30초간 55℃에서 1분간의 사이클을 40회 행하였다. 반응산물을 Maniatis 등의 저서에 기재된 방법에 따라서 10% 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 걸고 에티듐 브로마이드 염색하여 자외선 조사하여 DNA 밴드를 해석하였다.
그결과, J14 프라이머를 사용한 SSP·PCR에 있어서, 팔콘 블루, 퍼플 죠이, 델피니딘 타입 되돌림 교배 개체 (4 개체)의 각 cDNA (6 종류)을 주형으로 했을때 얻어지는 약 280bp의 DNA 밴드가 팔콘 레드, 팔콘 사몬, 시아니딘 타입 되돌림 교배 개체 (2 개체)의 각 cDNA (4 종류)을 주형으로 했을때는 검출되지 않았다. 즉, 약 280bp의 SSP·PCR 산물의 유무와 이 효소활성의 유무가 유전적으로 연쇄하여 있음이 판명되었다. 배열번호 43으로 나타내는 코어배열이 이 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 배열의 일부일 가능성이 강력하게 시사되었다.
[실시예 4] : 플라스미드 pEAK14의 취득과 구조결정
페튜니어 화변 cDNA을 적당한 백터에 조입하여 라이브러리를 만든다. 실시예 3에서 얻어진 280bp의 SSP·PCR 산물을 프로브로서 얻어진 라이브러리의 검색을 행하고, 하이브리다이즈하는 클론을 취득하여 클론의 염기 배열을 결정한다.
(1) 페튜니어 화변 cDNA 라이브러리의 구축
실시예 1 (3)에서 얻어진 페튜니어 (팔콘 블루)의 화변 cDNA 1㎍을 cDNA 클로닝 시스템 λgt 10·RPN 1257 (Amersham 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서 클로닝하였다. 최종 산물을 λ DNA 시험관내 패키징 키트 Giga Pack Gold (Stratagene 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서 패키징 반응을 행하였다. 적당히 희석한 패키징 반응물을 첨부한 매뉴얼에 따라서, 대장균 NM 514 주 (Amersham 사제)에 감염시켜, 직경 15cm의 플라스틱 플레이트 (Iwaki Glass 사제) 중의 LB 한천 배지 [1% 박토 트립톤 (Difco 사제), 0.5% 박토 이스트 엑스트랙트 (Difco 사제), 1% 염화나트륨, 1.5% 박토 한천 (Difco 사제)] 상에 전개하고, 플레이트당 약 10,000 개의 플라크를 발생시켰다. 합계 5 장의 플레이트를 작성하였다.
(2) 프로브 DNA의 방사능 표시
실시예 3에서 얻어진 약 280bp의 PCR 산물을 폴리아크릴아미드겔로부터 절출하여, Maniatis 등의 저서에 기재된 방법에 따라서 추출정제하였다. 약 50ng의 DNA를 MultiprimeTMDNA 표지 시스템 (Amersham 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, [α-32P] dCTP (Amersham 사제)로 표지하였다.
(3) 플라크·하이브리드화에 의한 검색
실시예 4 (1)에서 얻어진 5매의 플레이트상의 플라크를 Maniatis 등의 저서에 기재된 방법에 따라서, 나일론 필터 (MSI 사제)로 옮기고 알칼리 변성후 90℃에서 3시간 가열하여 고정하였다. 이에 실시예 4 (2)에서 표지한 프로브 DNA를 가하고, Maniatis 등의 저서에 기재된 방법에 따라서, 하이브리드화를 행하여, 최종적으로 60℃의 0.1 × SSC (15mM 염화나트륨, 1.5mM 시트르산 나트륨, pH 7.0)중에서 세정한 필터를 오토라디오 그래피에 걸어서, 양성클론을 검색하였다. 합계 11개의 양성클론이 얻어졌다. 이중의 하나를 선택하여 Maniatis 등의 저서에 기재된 방법에 따라서, 파지를 증식하여 DNA을 추출하였다.
(4) 플라스미드 벡터에의 서브클로닝
약 5㎍의 상기 파지 DNA을 20μl의 H 완충액에 용해하고, 10단위의 제한효소 BamHI (Takara Shuzo 사제)을 가하여, 30℃에서 2시간 반응시켰다. 반응 산물을 0.8%의 GTG 아가로스 겔 (Takara Shuzo 사제)을 사용한 전기 영동에 의하여 분리하고, 약 1.9 Kb의 삽입 DNA 단편을 절출하여, SUPRECTM- 01 (Takara Shuzo 사제)을 사용하고, 첨부한 매뉴얼에 따라서 추출 정제하였다.
이것을 10μl의 TE 완충액에 용해하고, 0.2㎍의 PUC 18BamHI BAP (Pharmacia 사제)을 가하였다. DNA 라이게이션 키트 (Takara Shuzo 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 16℃에서 30분간 연결 반응을 행하였다. 반응액의 용량은 60μl이었다. 반응액 2μl을 수용능력이 큰 세포 E. coli JM 109 (Toyobo 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 형질 전환하였다. Maniatis 등의 저서에 기재된 방법에 따라서 X - gal 암피실린 LB 한천 배지상에서 37℃에서 20시간 배양하였다. 생성한 백색 콜로니를 단리 배양하여, 플라스미드 DNA을 추출 정제하였다. 이 플라스미드를 pEAK14라 명명하였다.
(5) DNA 염기 배열의 결정
플라스미드 pEAK14에 함유된 페튜니어 cDNA 유래의 약 1.9Kb의 염기배열을 킬로시퀀스용 삭제 키트 (Takara Shuzo 사제) 및 Taq DideoxyTM터미네이터 사이클 시퀀싱 키트 (ABI 사제)를 사용하여, 모델 373 A DNA 시퀀싱 시스템 (ABI 사제)에 의하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서 결정하였다. 배열은, 배열해석 소프트웨어 DNASISTM·(Hitachi Software Engineering 사제)을 사용하여 해석하였다.
그결과, 배열번호 1로 나타내는 1824bp의 DNA 염기 배열이 얻어졌다. 116번째의 염기로부터 시작하여 1633번째의 염기로 끝나는, 506개의 아미노산 잔기로써된 폴리펩티드를 코드하는 오픈 리딩 프레임이 발견되었다. 이 폴리펩티드의 아미노산 배열을 이제까지 발견된 아보카도의 시토크롬 P450의 아미노산 배열 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol.87, p.3904 - 3908, 1990]과 약 33%의 상동성이 확인되었다. 이 오픈 리딩 프레임을 AK 14 배열이라고 명명하였다.
[실시예 5] : AK14 배열의 식물 발현 벡터에의 조입
(1) 5' 비 - 코딩영역에 있는 ATG 배열의 삭제.
실시예 4 (4)에서 얻어진 플라스미드 pEAK14를 2㎍ 취하고, 20μl의 H 완충액에 용해하고, 10 단위의 제한 효소 BamHI (Takara Shuzo 사제)을 가하고, 30℃에서 2시간 반응시켰다. 반응 산물을 0.8%의 GTG 아가로스겔 (Takara Shuzo 사제)을 사용하여 전기 영동에 의하여 분리하고, 약 1.9kb의 삽입 DNA 단편을 절출하고, SUPRECTM- 01 (Takara Shuzo 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서 추출 정제하였다.
이를 50μl의 BAL 31 완충액 [20mM 트리스 염산 완충액 (pH 8.0), 600mM 염화나트륨, 12mM 염화칼슘, 12mM 염화마그네슘, 1mM EDTA]에 용해하고 1 단위의 BAL31 뉴클레아제 - S(Takara Shuzo 사제)을 가하여 30℃에서 1분간 반응시킨후, 5μl의 페놀 : 클로로포름 (1 : 1) 혼액을 가하고 혼합하여 반응을 정지시켰다. 이에 150μl의 에탄올을 가하고, -80℃에서 10분간 놓고, 10,000 × g로 10분간 원심하여, 침전을 200μl의 70% 에탄올로 세정한 후 진공 건조하였다. 이를 50μl의 클레노우 (K1enow) 완충액 [50mM 트리스 염산 완충액 (pM 7.5), 10mM 염화마그네슘, 1mM 디티오트레이톨, 100μM dATP, 100μM dCTP, 100μM dGTP, 100μM dTTP]에 용해하고, 1 단위의 클레노우 단편 (Takara Shuzo 사제)를 가하여 30℃에서 30분간 반응시켰다. 150μl의 에탄올을 가하고, -80℃에서 10분간 놓고, 10,000 × g로 10분간 원심하여, 침전을 200μl의 70% 에탄올로 세정한 후 진공 건조하였다. 이를 10μl의 TE 완충액에 용해하여, DNA 용액을 얻었다.
(2) 플라스미드 벡터에의 서브클로닝.
1㎍의 pUC19 (Pharmacia 사제)를 50μl의 Sma 완충액 [10mM 트리스 염산 완충액 (pH 7.5), 10mM 염화마그네슘, 1mM 디티오트레이톨, 20mM 염화칼륨]에 용해하고, 10 단위의 제한효소 SmaI (Takara Shuzo 사제)을 가하고 30℃에서 2시간 반응시켰다. 150μl의 에탄올을 가하고, -80℃에서 10분간 놓고, 10,000 × g로 10분간 원심하여, 침전을 200μl의 70% 에탄올로 세정한 후 진공 건조하였다. 이를 50μl의 CIP 완충액 [50mM 트리스 염산 완충액 (pH 9.0), 1mM 염화마그네슘, 0.1mM 염화아연, 1mM 스페르미딘]에 용해하고, 0.1 단위의 송아지 장 알칼리성 포스파타아제 (Boehringer Mannheim 사제)를 가하여 37℃에서 30분간, 56℃에서 30분간 반응시킨후, 5μl의 페놀 ; 클로로포름 (1 : 1) 혼액을 가하고 혼합하여 반응을 정지시켰다. 이에 150μl의 에탄올을 가하고, -80℃에서 10분간 놓고, 10,000 × g로 10분간 원심하여, 침전을 200μl의 70% 에탄올로 세정한 후 진공 건조하였다. 이를 10μl의 TE 완충액 [10 mM 트리스 염산 완충액 (pH 7.5), 1mM EDTA]에 용해하여 벡터 DNA 용액을 얻었다.
상기 벡터 DNA 용액 1μl와 실시예 5 (1)에서 얻어진 DNA 용액 2μl을 혼합하고, DNA 라이게이션 키트 (Takara Shuzo 사제)를 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 16℃에서 30분간 연결 반응을 행하였다. 반응액의 용량은 18μl이었다. 반응액 2μl을 수용능력이 큰 세포 E. Coli JM109 (Toyobo 사제)를 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 형질 전환 하였다. Maniatis 등의 저서에 기재된 방법에 따라서, X - gal 암피실린 LB 한천배지상에서 37℃로 20시간 배양하였다. 생성한 백색콜로니를 단리 배양하여, 플라스미드 DNA을 추출 정제하였다. 이 플라스미드를 pEAK 14S라 명명하였다.
pEAK14S에 있어서의 pUC19 벡터에 유래하는 SmaI 부위와의 연결부의 DNA 염기 배열을 해석한 결과, pEAK14S는 배열번호 1로 나타내는 배열중 1번째로부터 91번째의 배열을 결실하고 있음이 판명되었다. 또 삽입방향은 AK14 배열의 아미노 말단측에 pUC19 벡터 BamHI 부위가 접속하는 방향임이 명백해졌다.
(3) 식물의 발현벡터 pBI121에의 서브클로닝
pEAK14S를 1㎍ 취하고, 50μl의 M 완충액에 용해하고, 10 단위의 제한 효소 SacI (Takara Shuzo 사제) 및 10 단위의 제한 효소 XbaI (Takara Shuzo 사제)를 가하여, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 반응 산물을 0.8%의 GTG 아가로스 겔 (Takara Shuzo 사제)을 사용하여 전기 영동에 의하여 분리하고, 약 1.9Kb의 삽입 DNA 단편을 절출하고, SUPRECTM- 01 (Takara Shuzo 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 추출 정제하였다. 이를 10μl의 TE 완충액에 용해하였다.
유사하게, 식물의 발현벡터 pBI121 (GUS 유전자 융합 시스템 : Clonetech 사제)을 1㎍ 취하고, 50μl의 M 완충액에 용해하고, 10단위 제한효소 ScaI (Takara Shuzo 사제) 및 10 단위의 제한 효소 XbaI (Takara Shuzo 사제)을 가하여, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 반응 산물을 0.8%의 GTG 아가로스 겔 (Takara Shuzo 사제)을 사용한 전기 영동에 의하여 분리하고, 약 11Kb의 벡터 DNA 단편을 절출하고, SUPRECTM- 01 (Takara Shuzo 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서 추출정제하였다. 이것을 10μl의 TE 완충액에 용해하였다.
상기에서 얻어진 약 1.9Kb의 AK14DNA 단편을 함유하는 TE 완충액과 약 11Kb의 벡터 DNA 단편을 함유하는 TE 완충액을 각 1μl씩 혼합하고, DNA 라이게이션 키트 (Takara Shuzo 사제)를 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 16℃에서 30분간 연결 반응을 행하였다. 반응액의 용량은 12μl 이었다. 반응액 2μl을 수용능력이 큰 세포 E. Coli JM 109 (Toyobo 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서 형질 전환하였다. Maniatis 등의 저서에 기재된 방법에 따라서, 카나마이신 LB 한천배지 [1% 박토트립톤 (Difco 사제), 0.5% 박토 이스트 엑스트랙트 (Difco 사제), 1% 염화나트륨, 50ug/ml 카나마이신, 1.5g 박토한천 (Difco 사제)] 상에서 37℃에서 20시간 배양하였다. 생성한 콜로니를 단리 배양하여, 플라스미드 DNA을 추출정제하였다. 이 플라스미드를 pBAK 14로 명명하였다.
(4) pBAK14의 아그로박테륨 튜메파시엔스 LBA4404에의 도입
GUS 유전자 융합 시스템 (Clonetech 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서 3 어버이 교배를 행하고, pBAK 14를 아그로박테륨 튜메파시엔스 LBA4404에 도입하였다. pBAK14을 보유하는 대장균 JM109 주 및 pRK 2013을 보유하는 대장균 HB101 주 (Clonetech 사제)를 각각 1ml의 카나마이신 LB 액체배지 [1% 박토 트립톤 (Difco 사제), 0.5% 박토 이스트 엑스트랙트 (Difco 사제), 1% 염화나트륨, 50㎍/ml 카나마이신]중에서 37℃에서 12시간 진탕 배양하였다. 한편, pAL4404를 보유하는 아그로박테륨 튜메파시엔스 LBA4404 (Clonetech 사제)를 1ml의 스트렙토마이신 LB 액체 배지 [1% 박토 트립톤 (Difco 사제), 0.5% 박토 이스트 엑스트랙트 (Difco 사제), 1% 염화나트륨, 300㎍/ml 스트렙토마이신] 중에서 28℃에서 36시간 진탕 배양하였다. 3종의 균의 배양균체를 5,000×g로 10 분간의 원심으로 모아, 각각을 1ml의 물로 세정한 후 소량의 물에 현탁하여 혼합하고, 전량을 LB 한천배지상에 도포하여, 28℃에서 20시간 배양하였다. 얻어진 균체를 50㎍/ml의 카나마이신 및 300㎍/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 LB 한천배지상에 도포하여, 28℃에서 2밤 배다. 생성된 콜로니를 단리하고, pBAK14 및 pAL4404을 보유하는 아그로박테륨 튜메파시엔스 LBA4404주를 얻었다.
[실시예 6] : AK14 배열의 담배에의 도입과 발현
(1) 아그로박테륨속 미생물을 사용하는 담배에의 도입
실시예 5에서 얻어진 pBAK 14 및 pAL4404을 보유하는 아그로박테륨 튜메파시엔스 LBA 4404 주를 50㎍/ml의 카나마이신 및 300㎍/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 10ml의 LB 액체배지 [1% 박토트립톤 (Difco 사제), 0.5% 박토 이스트 엑스트랙트 (Dfico 사제), 1% 염화나트륨]로 28℃에서 40시간 진탕배양하고, 5,000 × g로 10분간의 원심으로 균체를 모으고, 10ml의 물로 세정한 후 등량의 물에 현탁하였다.
25℃에서 무균적으로 계대한 담배 (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR - 1)의 잎을 1 cm 각으로 잘라, 상기의 균 현탁액에 침지하고, 멸균한 여지로 닦은후에 1㎍/ml의 6 - 벤질아데닌, 0.3㎍/ml의 1 - 나프탈렌초산, 3% 수크로스 및 0.2% 겔라이트를 함유하는 MS 배지 [Physiol. Plant., Vol. 15, p.473 - 497, 1962] (이하, 고형 PD 4 배지라함.)에 배축면을 위로하여 놓고, 25℃에서 2,500 럭스의 연속광 조명하에서 2일간 배양하였다. 다음에 500㎍/ml의 클라포란 (주사용, Hoechst Japan 주식회사 제) 및 200㎍/ml의 카나마이신을 함유하는 고형 PD 4 배지에 이식하여 배양하고, 그후는 2 주간마다 같은 배지에 계식하였다. 배양개시후 약 1개월간에서 부정아가 유도되었으므로 눈부분을 절취하여 500㎍/ml의 클라포란 및 50㎍/ml의 카나마이신을 함유하는 MS 배지에 계식하여 발근시켰다. 발근한 재생식물 고체는 무균성을 확인한 후 포트에 이식하고, 인공기상기 속에서 25℃로 재배하였다. 이와 같이하여 형질 전환 식물을 얻었다.
(2) 형질 전환된 담배 (이하, 형질 전환 담배라한다.)의 잎에 이어서의 효소 활성의 검출
상기와 같이 하여서 얻어진 형질 전환 담배의 잎 20g으로부터, 실시예 2 (3)에 기재한 방법에 따라서 미크로솜 분획을 조제하고, 플라보노이드 -3',5' - 수산화효소 활성의 검출을 행하였다. 대조로서 형질 전환되지 않은 담배의 잎으로부터 미크로솜 분획을 사용하였다. 그결과 형질 전환 담배의 미크로솜 분획으로부터만, 디히드로퀘르세틴을 디히드로미리세틴으로 변환하는 이 효소활성이 검출되었다.
(3) 형질 전환 담배의 화변에 있어서의 색소의 변화
형질 전환 담배의 형질 전환 되어 있지 않은 담배의 화변으로부터, 실시예 2 (1)에 기재한 방법에 따라서 안토시아니딘을 조제하여, 분석하였다. 그결과, 형질 전환되어 있지 않은 담배에서는 시아니딘만이 검출된데 대하여, 형질 전환 담배로부터 시아니딘과 함께 거의 등량의 델피니딘이 검토되었다.
화색을 일본원예 식물 표준색표 (재단 법인 일본 색채 연구소)와 비교한 결과, 형질 전환 담배의 화색을 색표 번호 8904 내지 8905에 해당하고, 형질 전환되어 있지 않은 담배의 화색은 색표번호 9503 내지 9504에 해당하였다. 즉, 형질 전환 식물의 쪽이 푸르름을 띠고 있었다.
[실시예 7] : AK14 배열의 핑크색 페튜니어 품종에의 도입과 발현
(1) 아그로박테륨속 미생물을 사용한 페튜니어에의 도입
무균적으로 계대한 페튜니어 [Petunia hybrida, 품종 팔콘 핑크 베인 (Falcon Pink Vein), Sakata Seed 사제)의 잎에, 실시예 6과 같은 방법으로 pBAK14와 pAL4404를 보유하는 아그로박테륨 튜메파시엔스 LBA 4404주를 감염시켜, 카나마이신 내성의 형질 전환 식물을 얻었다.
(2) 형질 전환된 페튜니어의 화변에 있어서의 색소의 변화
상기의 형질 전환된 페튜니어의 화변으로부터 실시예 2 (1)에 기재한 방법에 따라서 안토시아니딘을 조제하고, 형질 전환되어 있지 않은 페튜니어 (팔콘 핑크 베인)를 대조로하여 비교하였다. 그결과, 대조로부터는 거의 검출되지 않은 말비딘 및 델피니딘이 형질전환한 페튜니어로부터 주성분으로서 검출되었다. 그리고 대조에 있어서는 페오니딘이 주성분이었다.
화변 중심부의 화색을 일본 원예식물 표준색표 (재단법인 일본 색채 연구소)와 비교한 결과, 형질 전환 페튜니어의 화색은 색표번호 9206 내지 9207에 해당하고, 형질 전환되어 있지 않은 페튜니어 (팔콘 핑크 베인)의 화색은 색번호 9204 내지 9205에 해당하였다. 즉 형질전환 페튜니어의 쪽이 푸르름을 띠고 있었다.
[실시예 8] : AK14 배열의 장미에의 도입과 발현
(1) 아그로박테륨속 미생물을 사용한 장미에의 도입
무균적으로 계대한 장미 (Rose Hybrida cv. deep red)의 잎에, 실시예 6 (1)과 같은 방법으로, pBAK14와 pAL4404를 보유하는 아그로박테륨 튜메파시엔스 LBA4404 주를 감염시켰다. 0.01㎍/ml 6-벤질아데닌, 10㎍/ml 2,4-디클로로페녹시초산, 3% 수크로스 및 0.2% 겔라이트를 함유하는 MS 배지 (이하, 고형 BE 배지라 한다.) 에 놓고, 25℃에서 2,500럭스의 연속광 조명하에서 2일간 배양하였다. 500㎍/ml의 클라포란을 함유하는 고형 BE 배지에 이식하고, 7일후에 500㎍/ml의 클라포란 및 200㎍/ml의 카나마이신을 함유하는 고형 BE 배지에 이식하였다. 그후는 2주간마다 같은 배지에 계식하였다. 약 2개월후에 약 20g의 카나마이신 내성 캘러스가 얻어졌다.
(2) 장미 캘러스에 있어서의 효소 활성 발현
실시예 8 (1)에서 얻어진 캘러스로부터, 실시예 2 (3)에 기재된 방법에 따라서 미크로솜 분획을 조제하고, 플라보노이드-3',5'-수산화효소 활성의 검출을 행하였다. 대조로서 형질 전환하여 있지 않은 장미 캘러스로부터 조제한 미크로솜 분획을 사용하였다. 그결과, 형질 전환 캘러스의 미크로솜 분획으로부터만, 디히드로퀘르세틴을 디히드로미리세틴으로 변환하는 이 효소활성이 검출되었다.
[실시예 9] : AK14 배열의 카네이션에의 도입과 발현
(1) pBAK14의 아그로박테륨 리조게네스 (Agrobacterium rhizogenes) NIAES1724 주에의 도입
실시예 5 (4)에 기재된 것과 같은 방법에 의하여 아그로박테륨 리조게네스 NIAES 1724 주 (일본 농림수산성·생물자원 연구소로부터 입수)에 pBAK14을 도입하였다. 단, 대장균 균주로서 JM103을 사용하고, 스트렙토마이신 대신에 날리딕신산 (Sigma 사제) 25㎍/ml을 사용하였다.
(2) 아그로박테륨속 미생물을 사용한 카네이션에의 AK14 배열의 도입
카네이션 (Dianthus caryophillus cv. Nora)의 꽃망울의 화변에, 실시예 6 (1)과 같은 방법으로, pBAK14를 보유하는 아그로박테륨 리조게네스 NIAES1724 주를 감염시켰다. 0.3㎍/ml 6-벤질아데닌, 0.3㎍/ml 나프탈렌 초산, 3% 수크로스 및 0.2% 겔라이트를 함유하는 고형 MS 배지상에 놓고, 25℃에서 2,500럭스의 연속광 조명하에서 3일간 배양하였다. 250㎍/ml의 클라포란을 함유하는 동배지에 이식하고, 7일후 250㎍/ml의 클라포란 및 300㎍/ml의 카나마이신을 함유하는 동배지에 이식하였다. 그후에는 2주간마다 같은 배지에 계식하였다. 약 4개월후에 약 10g의 카나마이신 내성 모상근이 얻어졌다.
(3) 카네이션 모상근에 있어서의 효소 활성 발현
실시예 9 (2)에서 얻어진 모상근으로부터 실시예 2 (3)에 기재한 방법에 따라서 미크로솜 분획을 조제하고, 플라보노이드-3',5'-수산화효소 활성의 검출을 행하였다. 대조로서 pBAK14를 갖지 않는 아그로박테륨 리조게네스 NIAES1724 주를 감염시켜서 얻은 모상근으로부터 조제한 미크로솜 분획을 사용하였다. 그 결과, 형질 전환 모상근의 미크로솜 분획으로부터만, 디히드로퀘르세틴을 디히드로미리세틴으로 변환하는 이 효소 활성이 검출되었다.
[실시예 10] : 이종식물 게놈 DNA 중의 AK14 유사 배열의 검출
(1)식물의 게놈 DNA의 조제
페튜니어 [Petunia hybrida, 품종 퍼플 죠이 : NPI Seeds 사제], 니코티아나 [Nicotiana affinis, 품종 F1 도미노 (F1 Domino) : Daiichi Seed 사제], 에조린도 [Gentiana triflora, 품종 쟈포니카 (Japonica)], 스위트피 [Lathyrus odoratus, 품종 로얄 딥 블루 (Royal Deep Blue) : Daiichi Seed 사제], 팬지 [Viola tricolor, 청색 품종], 프라무라 [Primula polyantha, 자색품종], 토르코 도라지 [Eustoma russellianum 품종 로얄 라이트 퍼플 : Takii Seed 사제], 캄파뉴라 [Campanula medium, 담자색 품종], 델피늄 [Delphinium hybridum, 담청색 품종], 히아신스 [Hyacinthus orientalis, 자색 품종]의 각 식물의 녹엽 10 ∼ 20g을 동결 건조한후, [DNA Cloning A Practical Approach, Vol. 2, p.103, 1985, IRL Press]에 기재된 방법에 따라서 게놈 DNA을 추출하였다.
(2) 게놈 DNA 블롯의 작성.
실시예 10 (1)에서 얻어진 게놈 DNA를 각 5㎍취하고, 20μl의 H 완충액에 용해하여, 10단위의 제한 효소 EcoRV (Takara Shuzo 사제)을 가하고, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 이를 Maniatis 등의 저서에 기재된 방법에 따라서, 0.8%의 아가로스 겔 전기 영동하여, 알칼리 변성하여 중화한후, 나일론 필터 (MSI 사제)에 옮기고, 90℃에서 3시간 가열하여 고정하여, 게놈 DNA 블롯으로 하였다.
(3) AK14 배열 프로브의 방사능 표지
실시예 4에서 얻어진 pEAK14을 1㎍ 취하고, 20μl의 H 완충액에 용해하고, 10 단위의 제한효소 BamHI (Takara Shuzo 사제)을 가하고, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 반응산물을 0.8% GTG 아가로스겔 (Takara Shuzo 사제)을 사용한 전기 영동에 의하여 분리하고, 약 1.9Kb의 삽입 DNA 단편을 절출하여, SUPRECTM- 01 (Takara Shuzo 사제)을 사용하고, 첨부한 매뉴얼에 따라서 추출 정제하였다. 이 AK14 배열을 함유한 DNA 단편을 50ng 취하고, MultiprimeTMDNA 표지 시스템 (Amersham 사제)을 사용하고, 첨부한 매뉴얼에 따라서, [α -32P] dCTP (Amersham 사제)로써 표지하였다.
(4) 하이브리드화
실시예 10 (2)에서 얻어진 게놈 DNA 불롯과 (3)의 표지 프로브를 사용하여 Maniatis 등의 저서에 기재된 방법에 따라서 하이브리드화를 행하고, 최종적으로 50℃의 2 ×SSC (0.3M 염화나트륨, 0.03M 시트르산 나트륨, pH 7.0)로써 30분간씩 2회 세정하였다. 필터를 X선 필름(New RX : Fuji Photo Film 사제)을 사용한 오토라디오그래피에 건 결과 페튜니어 (퍼플 죠이), 니코티아나, 에조린도, 토르코도라지, 캄파뉴라의 각 DNA에 있어서는 명료한 밴드가 확인되었다. 스위트피 및 프리무라에 있어서는 불명료하지만 하이브리드화하는 벤드가 확인되었다. 즉, 이들 식물의 게놈 DNA 중에는 AK14 배열과 하이브리드화 하는 유사배열이 존재하고 있음이 나타났다.
[실시예 11] : 이종식물 화변 cDNA 중의 AK14 유사배열의 검출
(1) 화변 cDNA의 조제
페튜니어 (Petunia hybrida, 품종 퍼플 죠이 : NPI Seeds 사제), 니코티아나 (Nicotiana affinis, 품종 FI 도미노 : Daiichi seed 사제), 에조린도 (Gentiana triflora, 품종 쟈포니카), 토르코도라지 [Eustoma russellianum, 품종 로얄 라이트 퍼플 : Takii Seed 사제], 캄파뉴라 [Campanula medium 담자색 품종]의 각 식물의 꽃봉오리로부터 화변부를 약 10g씩 수확하고, 실시예 1(2)에 기재한 방법에 따라서 mRNA을 추출하였다. 이들을 주형으로하여 cDNA 합성 시스템 플러스 RPN1256 (Amersham 사제)을 사용하고 첨부한 매뉴얼에 따라서, 이중가닥 cDNA을 합성하였다.
(2) cDNA 블롯의 작성
상기 cDNA 약 0.1㎍ 씩을 Maniatis 등의 저서에 기재된 방법에 따라서, 0.8%의 아가로스 겔중을 전기 영동하고, 알칼리 변성하여 중화한후, 나일론 필터 (MSI 사제)에 옮기고, 90℃에서 3시간 가열하고 고정하고, cDNA 블롯으로 하였다.
(3) 하이브리드화
실시예 10 (3)과 같은 방법으로 방사능 표지한 AK14 배열 프로브를 조제하고, 실시예 10 (4)와 같은 방법으로 상기 cDNA 블롯에 하이브리드화를 행하였다. 최종적으로 50℃의 2 × SSC에서 30분간씩 2회 세정한 필터를 오토라디오그래피에 건 결과, 어느 식물에 있어서나 약 2Kb의 부근에 명료한 밴드가 확인되었다. 즉, 이들 식물의 화변 cDNA 중에도 AK14 배열과 하이브리드화하는 유사배열이 존재하고 있음이 나타났다.
[실시예 12] : 토르코도라지 및 캄파뉴라로부터의 AK14 유사 배열의 클로닝
(1) 화변 cDNA 라이브러리의 구축
토르코도라지 (Eustoma russelianum, 품종 로알 라이트 퍼플 : Takii Seed 사제], 캄파뉴라 [Campanula medium, 담자색 품종]의 각 식물의 꽃봉오리로부터 화변부를 약 20g씩 수확하고, 실시예 1 (2)에 기재한 방법에 따라서 mRNA를 추출하였다. 이들을 주형으로하여 SuperscriptTM람다 시스템 (BRL Life Technologies 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 각각 이중가닥 cDNA을 합성하여 λgt22 벡터에 클로닝하였다.
최종산물의 각각을 λDNA 시험관내 패키징 키트 Giga Pack Gold (Stratagene 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 패키징 반응을 행하였다. 적당히 희석한 패키징 반응물을 첨부한 매뉴얼에 따라서 대장균 Y1090 (r-) (BRL Lift Technologies 사제)에 감염시켜, 직경 15cm의 플라스틱 플레이트 (Iwaki Glass 사제) 중의 LB 한천배지 [1% 박토트립톤 (Difco 사제), 0.5% 박토 이스트 엑스트랙트 (Difco 사제), 1% 염화나트륨, 1.5% 박토 한천 (Difco 사제)] 상에 전개하고, 플레이트당 약 10,000 개의 플라크를 생성시켰다. 토르코도라지와 캄파뉴라로부터 각 5매의 플레이트를 작성하여, cDNA 라이브러리로 하였다.
(2) 플라크 하이브리드화에 의한 검색
실시예 12 (1)에서 얻어진 5매의 플레이트상의 플라크를 Maniatis등의 저서에 기재된 방법에 따라서 나일론 필터 (MSI 사제)에 옮기고, 알칼리 변성후 90℃에서 3시간 가열하여 고정하였다. 이에 실시예 11 (3)과 같은 방법으로 방사능 표지한 프로브 DNA를 가하고, Maniatis 등의 저서에 기재된 방법에 따라서, 하이브리드화를 하였다. 최종적으로 50℃의 2 ×SSC (0.3M 염화나트륨, 0.03M 시트르산 나트륨, pH7.0)로 세정한 필터를 오토라디오그래피에 걸고, 양성 클론을 검색하였다. 토르코도라지의 라이브러리로부터 12개의, 캄파뉴라의 라이브러리로부터는 7개의 양성클론이 각각 얻어졌다. 이중 하나씩을 취하여, Maniatis 등의 저서에 기재된 방법에 따라서, 파지를 증식하여 DNA을 추출하였다.
각각 약 5㎍의 파지 DNA을 20μl의 H 완충액에 용해하고, 10 단위의 제한효소 NotI (Takara Shuzo 사제) 및 10 단위의 제한효소 Sa1I (Takara Shuzo 사제)을 가하고, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 반응산물을 0.8%의 GTG 아가로스 겔 (Takara Shuzo 사제)을 사용한 전기 영동에 의하여 분리하고, 약 2Kb의 삽입 DNA 단편을 각각 절출하고, SUPRECTM- 01 (Takara Shuzo 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 추출 정제하고, 각각 10μl의 TE 완충액에 용해하였다.
(3) 플라스미드 벡터에의 서브클로닝
약 1㎍의 플라스미드 벡터 pBluescript IIKS＋의 DNA (Stratagene 사제)을 20μl의 H 완충액에 용해하고, 10 단위의 제한효소 NotI (Takara Shuzo 사제) 및 10 단위의 제한효소 SalI (Takara Shuzo 사제)을 가하고, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 반응산물을 0.8%의 GTG 아가로스 겔 (Takara Shuzo 사제)을 사용한 전기 영동에 의하여 분리하고, 약 3Kb의 벡터 DNA 단편을 절출하고, SUPRECTM- 01 (Takara Shuzo 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 추출 정제하여, 10μl의 TE 완충액에 용해하였다.
실시예 12 (2)에서 얻어진 2 종류의 삽입 DNA 단편을 각 4μl 취하고, 상기 벡터 DNA 단편 1μl을 각각 가하고, DNA 라이게이션 키트 (Takara Shuzo 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 16℃에서 30분간 연결 반응을 행하였다. 반응액의 용량은 30μl 이었다. 2종류의 반응액 각 2μl을 수용능력이 큰 세포 E. Coli JM109 (Toyobo 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 형질 전환 하였다. Maniatis 등의 저서에 기재된 방법에 따라서, X - gal 암피실린 LB 한천배지상에서 37℃에서 20시간 배양하였다. 생성한 백색 콜로니를 각각 하나씩 단리하고 배양하여 플라스미드 DNA을 추출정제하였다. 토르코도라지의 라이브러리에 유래하는 플라스미드를 pETg1, 캄파뉴라의 라이브러리에 유래하는 플라스미드를 pEKal라 명명하였다.
(4) DNA 염기 배열의 결정
플라스미드 pETgl 및 pEKal에 함유되는, 화변 cDNA에 유래하는 DNA 단편의 염기 배열을, 킬로시퀀스용 삭제 키트 (Takara Shuzo 사제) 및 Taq DideoxyTM터미네이터 사이클 시퀀싱 키트 (ABI 사제)를 사용하여, 모델 373A DNA 시퀀싱 시스템 (ABI 사제)에 의하여 첨부한 매뉴얼에 따라서 결정하였다. 배열은, 배열해석 소프트웨어 DNASISTM(Hitachi software Engineering 사제)을 사용하여 해석하였다.
그 결과, 토르코도라지로부터 배열번호 63으로 나타내는 2174 bp의 DNA 염기 배열이 얻어졌다. 92번째의 염기로부터 시작하여 1621번째의 염기로 끝나는, 510개의 아미노산 잔기로써된 폴리펩티드를 코드하는 오픈 리딩 프레임이 발견되었다. 이 폴리펩티드의 아미노산 배열은 AK14의 아미노산 배열과 74% 상동성이 확인되었다. 이 오픈 리딩 프레임을 Tg1 배열이라 명명하였다.
캄파뉴라로부터는 배열번호 64로 나타내는 1927 bp의 DNA 염기배열이 얻어졌다. 180번째의 염기로부터 시작하여 1748번째의 염기로 끝나는, 523개의 아미노산 잔기로써된 폴리펩티드를 코드하는 오픈 리딩 프레임이 발견되었다. 이 폴리펩티드의 아미노산 배열은 AK14의 아미노산 배열과 66%의 상동성이 확인되었다. 이 오픈 리딩 프레임을 kal 배열이라 명명하였다.
[실시예 13] : Tgl 및 Kal의 식물 발현 벡터에의 조입
(1) 식물의 발현벡터 pBI121에의 서브클로닝
pETgl을 1㎍ 취하고, 50μl의 H 완충액에 용해하고 10단위의 제한효소 SalI (Takara Shuzo 사제)을 가하고, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 150μl의 에탄올을 가하고, -80℃에서 10분간 놓고, 10,000 × g로 10분간 원심하여, 침전을 200μl의 70% 에탄올로 세정한 후 진공 건조하였다. 이를 50μl의 클레노우 완충액에 용해하고, 1 단위의 클레노우 단편 (Takara Shuzo 사제)을 가하여 30℃에서 30분간 반응시켰다. 150μl의 에탄올을 가하고, -80℃에서 10분간 놓고, 10,000 ×g로 10분간 원심하여, 침전을 200μl의 70% 에탄올로 세정한 후 진공건조하였다. 이를 50μl의 M 완충액에 용해하고, 10 단위의 제한효소 SacI (Takara Shuzo 사제)를 가하고, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 반응산물을 0.8%의 GTG 아가로스 겔 (Takara Shuzo 사제)을 사용하여 전기 영동에 의하여 분리하고, 약 2.2kb의 삽입 DNA 단편을 절출하고, SUPRECTM- 01 (Takara Shuzo 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 추출정제하여, 10μl의 TE 완충액에 용해하였다.
또 pEKal을 1㎍ 취하고, 50μl의 H 완충액에 용해하고, 10 단위의 제한효소 SalI (Takara Shuzo 사제)을 가하고, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 150μl의 에탄올을 가하고, -80℃에서 10분간 놓고, 10,000 × g로 10분간 원심하여, 침전을 200μl의 70% 에탄올로 세정한 후 진공 건조하였다. 이를 50μl의 클레노우 완충액에 용해하여, 1 단위의 클레노우 단편 (Takara Shuzo 사제)을 가하고 30℃에서 30분간 반응시켰다. 150μl의 에탄올을 가하고, -80℃에서 10분간 놓고, 10,000 × g로 10분간 원심하여, 침전을 200μl의 70% 에탄올로 세정한 후 진공 건조하였다. 이를 50μl의 완충액에 용해하고, 0.5 단위의 제한효소 SacI (Takara Shuzo 사제)을 가하고, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 산물을 0.8%의 GTG 아가로스 겔 (Takara Shuzo 사제)을 사용하여 전기 영동에 의하여 분리하고, 약 1.9kb의 삽입 DNA 단편을 절출하고, SUPRECTM- 01 (Takara Shuzo 사제)을 사용하여, 첨부의 매뉴얼에 따라서, 추출정제하고, 10μl의 TE 완충액에 용해하였다.
식물의 발현벡터 pBI121 (GUS 유전자 융합 시스템 : Clonetech 사제)을 1㎍ 취하고, 50μl의 Sma 완충액 [10mM 트리스 염산 완충액 (pH7.5), 10mM 염화마그네슘, 1mM 디티오트레이톨, 20mM 염화칼륨]에 용해하고, 10단위의 제한효소 SmaI (Takara Shuzo 사제)을 가하고 30℃에서 2시간 반응시켰다. 150μl의 에탄올을 가하고, -80℃에서 10분간 놓고, 10,000 × g로 10분간 원심하여, 침전을 200μl의 70% 에탄올로 세정한 후 진공 건조하였다. 이를 50μl의 M 완충액에 용해하고, 10 단위의 제한효소 SacI (Takara Shuzo 사제)을 가하고, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 반응 산물을 0.8%의 GTG 아가로스 겔 (Takara Shuzo 사제)을 사용한 전기 영동에 의하여 분리하고, 약 11kb의 벡터 DNA 단편을 절출하고, SUPRECTM- 01 (Takara Shuzo 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 추출 정제하여 10μl의 TE 완충액에 용해하였다.
벡터 DNA 단편을 함유하는 TE 완충액과 pETgl의 삽입 DNA 단편을 함유하는 TE 완충액을 1μl씩 혼합하고, DNA 라이게이션 키트 (Takara Shuzo 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 16℃에서 30분간 연결 반응을 행하였다. 반응액의 용량은 12μl이었다. 반응액 2μl을 수용능력이 큰 세포 E. Coli JM109 (Toyobo 사제)를 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 형질 전환하였다. Maniatis 등의 저서에 기재된 방법에 따라서, 카나마이신 LB 한천배지 [1% 박토 트립톤 (Difco 사제), 0.5% 박토이스트 엑스트랙트 (Difco 사제), 1% 염화나트륨, 50㎍/ml 카나마이신, 1.5% 박토한천 (Difco 사제)] 상에서 37℃로 20시간 배양하였다. 생성된 콜로니의 하나를 단리 배양하고, 플라스미드 DNA을 추출 정제하였다. 이 플라스미드를 pBTgl로 명명하였다. pBTgl은 토르코 도라지 유래의 AK14 유사 cDNA 배열 Tgl을 식물의 발현벡터 pBI121에 조입하여서된 플라스미드이다.
벡터 DNA 단편을 함유하는 TE 완충액과 pEKal의 삽입 DNA 단편을 함유하는 TE 완충액을 1μl씩 혼합하고, DNA 라이게이션 키트 (Takara Shuzo 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서, 16℃에서 30분간 연결반응을 행하였다. 반응액의 용량은 12μl이었다. 반응액 2μl을 수용능력이 큰 세포 E. Coli JM 109 (Toyobo 사제)을 사용하여, 첨부한 매뉴얼에 따라서 형질 전환하였다. Maniatis 등의 저서에 기재된 방법에 따라서, 카나마이신 LB 한천배지 [1% 박토 트립톤 (Difco 사제), 0.5% 박토 이스트 엑스트랙트 (Difco 사제), 1% 염화나트륨, 50㎍/ ml 카나마이신, 1.5% 박토한천 (Difco 사제)] 상에서 37℃에서 20시간 배양하였다. 생성한 콜로니의 하나를 단리 배양하여, 플라스미드 DNA을 추출 정제하였다. 이 플라스미드를 pBKal라 명명하였다. pBKal은 캄파뉴라 유래의 AK14 유사 cDNA 배열 Kal을 식물의 발현벡터 pBI121에 조입하여서된 플라스미드이다.
(2) pBTgl 및 pBKal의 아그로박테튬 튜메파시엔스 LBA4404 주에의 도입
실시예 5 (4)에 기재한 3 어버이 교배법을 사용하여, pBTgl 및 pBKal을 각각 아그로박테륨 튜메파시엔스 LBA 4404 주에 도입하였다.
[실시예 14] : Tgl 및 Kgl의 담배에의 도입과 발현
(1) 아그로박테륨속 미생물을 사용한 담배에의 도입
실시예 6 (1)에 기재한 것과 같은 방법에 의하여, 담배 (Nicotiana Tabacum cv. petit Havana SR-1)의 엽편에 실시예 13 (2)에서 얻은 2 종류의 아그로박테륨을 각각 감염시켜, 카나마이신 내성의 형질 전환 담배를 각각 얻었다.
(2) 형질 전환 담배의 잎에 있어서의 효소 활성의 검출.
상기와 같이 하여서 얻어진 형질 전환 담배 각 1주의 잎 20g로부터, 실시예 2 (3)에 기재한 방법에 따라서 미크로솜 분획을 조제하고, 플라보노이드-3',5'-수산화효소 활성의 검출을 행하였다. 그 결과, 모든 형질 전환 담배의 미크로솜 분획으로부터도, 디히드로퀘르세틴을 디히드로미리세틴으로 변환하는 이 효소활성이 검출되었다. 형질 전환되어 있지 않은 담배의 잎으로부터 조제한 미크로솜 분획으로부터는 이 효소활성은 검출되지 않았다.
(3) 형질 전환 담배의 화변에 있어서의 색소의 변화
형질전환 담배와 형질 전환되어 있지 않은 담배의 화변으로부터, 실시예 2 (1)에 기재한 방법에 따라서 안토시아니딘을 조제하고, 분석하였다. 그 결과, 형질 전환되어 있지 않은 담배에서는 시아니딘만이 검출된데 대하여, 모든 형질 전환 담배로부터도 시아니딘과 함께 거의 등량의 델피니딘이 검출되었다.
화색을 일본원예식물 표준색표 (재단법인 일본 색체 연구소)와 비교한 결과, 형질 전환 담배의 화색은 색표 번호 8904 내지 8905에 해당하고, 형질 전환되어 있지 않은 담배의 화색은 색표 번호 9503 내지 9504에 해당하였다. 즉 형질 전환 식물의 쪽이 푸르름을 띠고 있었다.
[산업상의 이용 가능성]
본 발명에 의하여, 식물의 꽃이나 과실이 본래 갖고 있지 않은 색소 패턴을 갖는 식물을 제공할 수가 있다.
배열표
배열번호 : 1
배열의 길이 : 1824
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 (가닥 형태) : 2 본쇄 (이중가닥)
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : cDNA - mRNA
기원
생물명 : 페튜니어 (Petunia hybrida)
주명 : 팔콘 블루 (Sakata Seed)
배열의 특징
116..1633 P CDS
배열
배열번호 : 2
배열의 길이 : 18
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄 (단일가닥)
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
TCGAATTCTN CCATTCGG 18
배열번호 : 3
배열의 길이 : 18
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
TCGAATTCTN CCATTTGG 18
배열번호 : 4
배열의 길이 : 18
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
TCGAATTCTN CCCTTCGG 18
배열번호 : 5
배열의 길이 : 18
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
TCGAATTCTN CCCTTTGG 18
배열번호 : 6
배열의 길이 : 18
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
TCGAATTCTN CCGTTCGG 18
배열번호 : 7
배열의 길이 : 18
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
TCGAATTCTN CCGTTTGG 18
배열번호 : 8
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Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ile Cys Pro Gly
5 10
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배열의 종류 : cDNA -mRNA
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생물명: 페튜니어 (Petunia hybrida)
주명 : 팔콘 블루 (Sakata Seed 사제)
조직의 종류 : 꽃봉오리의 화변 주연부
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CCN TTT GGT GCT GGA AGA CGT ATA TGT CCN GG 32
Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Pro Gly
5 10
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배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : cDNA -mRNA
기원 :
생물명: 페튜니어 (Petunia hybrida)
주명 : 팔콘 블루 (Sakata Seed 사제)
조직의 종류 : 꽃봉오리의 화변 주연부
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CCN TTT GGT GCT GGT CGA AGA ATA TGC CCN GG 32
Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Pro Gly
5 10
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배열의 길이 : 32
배열의 형 : 핵산
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토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : cDNA -mRNA
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생물명: 페튜니어 (Petunia hybrida)
주명 : 팔콘 블루 (Sakata Seed 사제)
조직의 종류 : 꽃봉오리의 화변 주연부
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CCN TTT GGG ACT GGT CGA CGA ATT TGT CCN GG 32
Pro Phe Gly Thr Gly Arg Arg Ile Cys Pro Gly
5 10
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배열의 형 : 핵산
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생물명: 페튜니어 (Petunia hybrida)
주명 : 팔콘 블루 (Sakata Seed 사제)
조직의 종류 : 꽃봉오리의 화변 주연부
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CCN TTT GGC TCG GGA AGA CGA TCT TGT CCN GG 32
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly
5 10
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배열의 형 : 핵산
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배열의 종류 : cDNA -mRNA
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생물명: 페튜니어 (Petunia hybrida)
주명 : 팔콘 블루 (Sakata Seed 사제)
조직의 종류 : 꽃봉오리의 화변 주연부
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CCN TTT GGT GCT GGT AGA AGA GTG TGT CCN GG 32
Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Val Cys Pro Gly
5 10
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배열의 길이 : 32
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : cDNA -mRNA
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생물명: 페튜니어 (Petunia hybrida)
주명 : 팔콘 블루 (Sakata Seed 사제)
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CCN TTT GGA GTA GGC CTA AGA ATG TGC CCN GG 32
Pro Phe Gly Val Gly Leu Arg Met Cys Pro Gly
5 10
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생물명: 페튜니어 (Petunia hybrida)
주명 : 팔콘 블루 (Sakata Seed 사제)
조직의 종류 : 꽃봉오리의 화변 주연부
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CCN TTT GGT GGA GGA CCA CGG CGA TGT CCN GG 32
Pro Phe Gly Gly Gly Pro Arg Arg Cys Pro Gly
5 10
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생물명: 페튜니어 (Petunia hybrida)
주명 : 팔콘 블루 (Sakata Seed 사제)
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CCN TTT GGT GTT GGT AGG AGG AGT TGC CCN GG 32
Pro Phe Gly Val Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly
5 10
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배열의 형 : 핵산
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생물명: 페튜니어 (Petunia hybrida)
주명 : 팔콘 블루 (Sakata Seed 사제)
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CCN TTC GGA GTC GGC CCC AAA ATG TGC CCN GG 32
Pro Phe Gly Val Gly Pro Lys Met Cys Pro Gly
5 10
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쇄의 수 : 2 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
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기원 :
생물명: 페튜니어 (Petunia hybrida)
주명 : 팔콘 블루 (Sakata Seed 사제)
조직의 종류 : 꽃봉오리의 화변 주연부
배열 :
CCN TTC GGT GGA GGA CCA AGA AAA TGC GTN GG 32
pro Phe Gly Gly Gly Pro Arg Lys Cys Val Gly
5 10
배열번호 : 41
배열의 길이 : 32
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : cDNA -mRNA
기원 :
생물명: 페튜니어 (Petunia hybrida)
주명 : 팔콘 블루 (Sakata Seed 사제)
조직의 종류 : 꽃봉오리의 화변 주연부
배열 :
CCN TTC GGC TTT GGT CCT CGA AAA TGC GTN GG 32
Pro Phe Gly Phe Gly Pro Arg Lys Cys Val Gly
5 10
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배열의 길이 : 32
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : cDNA -mRNA
기원 :
생물명: 페튜니어 (Petunia hybrida)
주명 : 팔콘 블루 (Sakata Seed 사제)
조직의 종류 : 꽃봉오리의 화변 주연부
배열 :
CCN TTT GGC AGT GGT TTC TGT TCA TGT CCN GG 32
Pro Phe Gly Ser Gly Phe Cys Ser Cys Pro Gly
5 10
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배열의 길이 : 32
배열의 형 : 핵산
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배열의 종류 : cDNA -mRNA
기원 :
생물명: 페튜니어 (Petunia hybrida)
주명 : 팔콘 블루 (Sakata Seed 사제)
조직의 종류 : 꽃봉오리의 화변 주연부
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CCN TTT GGT GCT GGA CGA AGA ATT TGT GCN GG 32
Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly
5 10
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배열의 길이 : 32
배열의 형 : 핵산
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배열의 종류 : cDNA -mRNA
기원 :
생물명: 페튜니어 (Petunia hybrida)
주명 : 팔콘 블루 (Sakata Seed 사제)
조직의 종류 : 꽃봉오리의 화변 주연부
배열 :
CCN TTT GGT GGT GGA AGA AGG ATA TGT CCN GG 32
Pro Phe Gly Gly Gly Arg Arg Ile Cys Pro Gly
5 10
배열번호 : 45
배열의 길이 : 17
배열의 형 : 핵산
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배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
CCNGGGCAAA TCCTCCT 17
배열번호 : 46
배열의 길이 : 17
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
CCNGGACATA TACGTCT 17
배열번호 : 47
배열의 길이 : 17
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
CCNGGGCATA TTCTTCG 17
배열번호 : 48
배열의 길이 : 17
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
CCNGGACAAA TTCGTCG 17
배열번호 : 49
배열의 길이 : 17
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
CCNGGACAAG ATCGTCT 17
배열번호 : 50
배열의 길이 : 17
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
CCNGGACACA CTCTTCT 17
배열번호 : 51
배열의 길이 : 17
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
CCNGGGCACA TTCTTAG 17
배열번호 : 52
배열의 길이 : 17
배열의 형 : 핵산
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토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
CCNGGACATC GCCGTGG 17
배열번호 : 53
배열의 길이 : 17
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
CCNGGGCAAC TCCTCCT 17
배열번호 : 54
배열의 길이 : 17
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
CCNGGGCACA TTTTGGG 17
배열번호 : 55
배열의 길이 : 17
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
CCNACGCATT TTCTTGG 17
배열번호 : 56
배열의 길이 : 17
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
CCNACACATT TTCGAGG 17
배열번호 : 57
배열의 길이 : 17
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
CCNGGACATG AACAGAA 17
배열번호 : 58
배열의 길이 : 17
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
CCNGCACAAA TTCTTCG 17
배열번호 : 59
배열의 길이 : 17
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
CCNGGACATA TCCTTCT 17
배열번호 : 60
배열의 길이 : 24
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
TGATCCGGAA TTCGTGCCAT CAAG 24
배열번호 : 61
배열의 길이 : 26
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
CGCTTGATGG CACGAATTCC GGATCA 26
배열번호 : 62
배열의 길이 : 15
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 다른 핵산 (합성 DNA)
배열 :
CCNTTTGGTG CTGGA 15
배열번호 : 63
배열의 길이 : 2174
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : mRNA - cDNA
기원 :
생물명 : 토르코도라지 (Eustoma russellianum)
배열의 특징 :
92..1621 P CDS
배열
배열번호 : 64
배열의 길이 : 1927
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2 본쇄
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : cDNA - mRNA
기원
생물명 ; 캄파뉴라 (Campanula medium)
배열의 특징
180..1748 P CDS
배열 :
배열번호 : 65
배열길이 : 506
배열의 형 : 아미노산
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 폴리펩티드
배열번호 : 66
배열길이 : 510
배열의 형 : 아미노산
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 폴리펩티드
배열번호 : 67
배열길이 : 523
배열의 형 : 아미노산
토폴로지 : 직쇄상
배열의 종류 : 폴리펩티드

Claims (7)

  1. 플라보노이드-3',5'-수산화효소 활성을 가지며, 배열번호 65, 배열번호 66 또는 배열번호 67로 표시된 아미노산 배열로 나타나는 폴리펩티드를 코드하는 DNA.
  2. 제1항의 DNA를 벡터 DNA에 조입하여서 된 재조합체 DNA.
  3. 플라보노이드-3',5'-수산화효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 제1항의 DNA 단편과 벡터 DNA 단편으로써된 재조합체 DNA를 식물에 보유시켜, 이 폴리펩티드를 코드하는 DNA의 유전 정보에 의한 색소를 발현하는 능력을 갖는 식물을 육성시켜, 얻어진 이 식물을 채취함을 특징으로 하는 식물의 제조법.
  4. 배열번호 2로부터 배열번호 29까지에 표시한 염기배열을 갖는 프라이머 DNA.
  5. 제4항의 DNA와 3' 말단 8염기의 배열이 일치하는 프라이머 DNA.
  6. 제4 또는 5항의 DNA를 프라이머로 한 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 법에 의하여, 시토크롬 P450 효소의 헴결합 영역의 아미노산 배열을 코드하는 유전자 단편을 증폭단리하는 방법.
  7. 배열번호 65, 66 및 67 중 어느 하나로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
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JP44963/92 1992-03-02
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