KR100614221B1

KR100614221B1 - 제초제 저항성 형질전환 도라지의 제조방법

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Publication number: KR100614221B1
Application number: KR1020040098580A
Authority: KR
Inventors: 홍의연; 윤종선; 김익환; 윤태; 김태수; 이양희; 양덕춘; 인준교; 이범수
Original assignee: 충청북도 (관리부서:충청북도 농업기술원)
Priority date: 2004-11-29
Filing date: 2004-11-29
Publication date: 2006-08-21
Also published as: KR20060059477A

Abstract

본 발명은 제초제 저항성 유전자를 도라지에 도입함으로써 제초제 저항성 형질전환 도라지를 제조하는 방법 및 그 방법에 의해 얻어진 형질전환 도라지에 관한 것이다.

본 발명에서는 도라지의 자엽 절편을 사용하여 PAT 유전자를 함유한 아그로박테리움과 접종한 후 항생제를 첨가한 배지에서 선발 과정을 거쳐 형질전환체를 획득하였으며, PCR 분석으로 PAT, NPTⅡ 및 GUS 유전자의 삽입을 확인하였고, RT-PCR 분석에 의하여 PAT 유전자의 DNA가 RNA로 전사되었음을 확인하였다. 또한 배양병 내에서 형질전환된 도라지가 PPT(phosphinothricin) 저항성임을 확인하였다.

도라지, 제초제 저항성, 형질전환, PPT, PAT

Description

제초제 저항성 형질전환 도라지의 제조방법{A transgenic Platycodon grandiflorm resistant to a herbicide}

도 1은 도라지 형질전환용 플라스미드를 나타낸 것이다.

도 2는 아그로박테리움과 공동배양 후 제1 선발배지에 치상된 도라지 자엽과 본엽 절편을 나타낸 것이다.

도 3은 배양 약 3주 후 제1 선발배지의 자엽 절편에서 형성된 부정아를 해부현미경으로 10배 확대한 사진이다.

도 4는 제1 선발배지에 이식한 부정아에서 생장한 도라지 신초를 해부현미경으로 6.3배 확대한 사진이다.

도 5는 배양 약 3주 후 제2 선발배지의 자엽 절편에서 형성된 캘러스를 나타낸 것이다.

도 6은 제3 선발배지에서 이식한 캘러스에서 재분화된 도라지 신초를 해부현미경으로 6.3배 확대한 사진이다.

도 7은 제4 선발배지에서 도라지 형질전환체의 개체별 2차 선발을 나타낸 것이다.

도 8은 일반 도라지와 형질전환된 도라지 잎의 GUS 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 9는 PCR에 의한 PAT 유전자 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 PCR에 의한 NPTII 유전자 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 11은 PCR에 의한 GUS 유전자 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 12는 RT-PCR 분석에 의해 PAT 유전자 전사를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 13은 형질전환된 도라지의 PPT 저항성을 검정한 결과를 나타낸 것이다.

도라지(Platycodon grandiflorm A. De. candolle)는 다년생 식물로 줄기와 잎이 녹색이고 키는 40~100cm 정도 자라며, 흰색 또는 자주색 꽃이 피고 잎은 타원형이고 잎 가장자리는 톱니모양을 하고 있다. 도라지의 뿌리는 반찬으로 이용될 뿐만 아니라 진해, 거담 등의 효과가 있어 약초로도 널리 이용된다. 도라지는 초세가 매우 강한 식물이므로 해발 1,000m의 높은 산 속 등 우리나라의 어디에서나 재배할 수 있는 작물이다. 도라지를 식용으로 사용할 경우 파종후 2년차 가을에 수확하고 약용으로 사용할 경우 3~4년차에 수확하는 것이 좋다.

도라지 재배시 노동력이 가장 많이 드는 것이 제초작업으로 5~8월에 걸쳐 연 간 4~5회 정도 제초작업을 하며 이에 따른 인건비가 많이 소요되는 실정이다. 요즈음과 같이 농촌의 인건비가 비싸고 인력난이 심한 사정을 고려할 때 도라지 재배에서 제초작업의 노동력을 줄이는 것은 대단히 중요한 문제이다. 제초제 저항성 형질전환 도라지를 개발하면 제초제를 1회 살포하는 것으로 제초작업을 마치게 되므로 이러한 문제를 해결할 수 있을 것이다.

제초제 저항성 형질전환 작물을 개발하기 위해서 기존의 연구에서는 주로 방선균의 일종인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)에서 클로닝된 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제(phosphinothricin acetyltransferase, PAT) 유전자를 "bar(Bialaphos Resistance) 유전자"라고 명명하여 사용하여 왔다. PAT(Phosphinothricin Acetyltrans－ferase) 유전자는 포스피노트리신(PPT; phosphinothricin)의 NH₂를 아세틸화하여 글루타민 생성기관의 독성 물질 축적을 방지함으로써 제초제인 바스타에 저항성을 나타내게 된다.

이와 관련된 선행특허로서 한국특허출원 제1998-7008728호는 제초제에 대한 내성을 지닌 벼에 대해 개시한 바 있고, 특허출원 제2003-0019072호는 bar 유전자를 도입하여 형질전환시킨 제초제 저항성 고추 식물체의 제조방법에 대해 개시한 바 있고, 특허출원 제2003-0010830호는 들깨의 형질전환 방법과 그에 의해 생산된 제초제 저항성 들깨에 대해 개시한 바 있다.

그러나 제초제에 저항성을 지닌 도라지의 형질전환 방법에 성공한 연구예는 아직 없었으며, 따라서 본 발명자들은 제초제 저항성 유전자를 이용하여 효과적으 로 형질전환된 도라지를 제조하는 방법을 개발하고자 연구하였다.

한편, 이. 스트라우츠(E. Strauch) 등은 기존의 bar 유전자의 GC 함량이 68.6%인 것을 49%로 낮춘 인공 PPT 저항성 유전자(미국 NCBI GenBank, Nucleotide accession number A02774)를 합성한 바 있으며, 이 유전자는 "phosphinothricin acetyltransferase (PAT) 유전자" 라고 명명하여 사용되고 있다.

본 발명에서는 상기 인공 합성된 PPT 저항성 유전자 즉 "PAT 유전자"를 이용하여 형질전환된 도라지를 제조하고자 하였다.

본 발명의 목적은, 제초제 저항성 유전자를 효과적으로 도라지에 도입시켜 형질전환시키는 방법을 제공하고, 또한 그 방법에 의해 얻어진 제초제 저항성 형질전환체 도라지를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명에서는 비선택성이면서 살포 후 제초 효과가 빨리 나타나고 땅에 떨어지면 분해가 가능한 제초제인 바스타에 저항성을 가지는 형질전환 도라지를 생산할 목적으로, 제초제 저항성인 PAT 유전자를 아그로박테리움 투메파시엔스를 이용하여 도라지에 도입하였고, 유전자의 삽입과 발현을 확인하였으며, 제초제가 투입된 배양병 내에서 형질전환된 도라지가 저항성을 나타내는 것을 확인하였다.

본 발명은 제초제인 바스타에 저항성을 나타내는 PAT 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터로 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환된 아그로박테리움을 도라지의 자엽과 공동배양하는 단계; 상기 공동배양된 도라지의 자엽을 부정아 유도를 위한 선발배지에서 배양하거나 또는 캘러스 유도를 위한 선발배지에서 배양하여 형질전환된 신초를 선발하고 신장시키는 단계; 상기 형질전환된 신초에서 뿌리형성을 유도하는 단계; 상기와 같이 얻어진 도라지를 GUS 유전자 분석, PCR 분석 및 RT-PCR 분석함으로써 도라지 내에 성공적으로 유전자가 도입되어 형질전환되었는지 확인하는 단계; 및 상기 형질전환이 확인된 도라지의 제초제 저항성을 검정하는 단계로 이루어진다.

본 발명에서는 비선택성이면서 살포 후 제초 효과가 빨리 나타나고 땅에 떨어지면 분해가 가능한 제초제인 바스타에 저항성을 가지는 형질전환 도라지를 생산할 목적으로, 제초제의 유효성분인 PPT(phosphinothricin)에 저항성을 나타내는 유전자 즉 "PAT 유전자"를 아그로박테리움 투메파시엔스를 이용하여 도라지에 도입하였다.

본 발명에서 사용되는 도라지 형질전환용 발현벡터는, 식물형질전환용 바이너리 벡터에 선발 표지 유전자인 NPT Ⅱ 유전자(카나마이신 내성 유전자), 35S-35S-AMV-PAT 유전자-Tnos 및 GUS 유전자를 재조합시켜 얻어진 pBinSyn 플라스미드이다.

본 발명에서 사용되는 도라지 형질전환용 아그로박테리움 균주는, 통상적으 로 사용되는 아그로박테리움이면 어떠한 균주라도 무방하나, 본 발명에서는 구체적으로 아그로박테리움 투메파시엔스 MP 90을 사용하였다.

본 발명에서는 pBinSyn 플라스미드를 아그로박테리움 투메파시엔스 MP 90에 도입하여 형질전환시킨 도라지 자엽 절편으로부터, 직접 부정아를 유도하여 형질전환체를 선발하는 방법을 제시하며 또는 캘러스를 유도함으로써 형질전환체를 선발하는 방법을 제시한다.

본 발명에서는 특히 도라지의 자엽을 이용함으로써 성공적으로 형질전환된 도라지를 제조하는 방법을 제시한다. 도라지의 경우 실제적으로 형질전환을 위한 구체적인 공정 조건을 확립하기 어려웠으며, 예를 들어 도라지의 본엽을 사용할 경우에는 형질전환이 전혀 이루어지지 않았는데, 본 발명에서는 도라지의 자엽을 이용함으로써 효과적으로 형질전환 도라지를 제조할 수 있음을 밝혔다.

본 발명에서는 상기와 같은 방법으로 생산된 형질전환 도라지가 실제로 외래 유전자(목적 유전자)를 포함하고 있는지 확인하기 위하여, GUS 유전자 분석, PCR 분석 및 RT-PCR 분석을 수행하였고, 그 결과 외래 유전자가 형질전환 도라지 내에 성공적으로 도입되어 안정적으로 발현되고 있음을 확인하였다.

또한 본 발명에서는 형질전환이 확인된 도라지를 제초제가 투입된 배양병 내에서 배양함으로써 형질전환 도라지의 제초제 저항성을 확인하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 작용을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 형질전환용 유전자 및 아그로박테리움 배양

도라지 종자는 70% 에탄올에 30초간 침지하여 기포를 제거하고 멸균수에 2분간 세척한 후, 다시 3% 차아염소산 나트륨에 15분간 침지하여 소독하고 멸균수로 2분, 5분 및 15분간 3회 세척한 후, MS 배지에 파종하여 무균적으로 발아시켰으며 파종후 8일 된 자엽과 20일 된 본엽을 절단하여 형질전환 재료로 사용하였다.

본 발명에서 사용한 제초제 저항성 유전자는 이. 스트라우츠 등이 기존의 bar 유전자의 GC 함량이 68.6%인 것을 49%로 낮춘 인공 합성 PPT 저항성 유전자(미국 NCBI GenBank, Nucleotide accession number A02774) 즉, "phosphinothricin acetyltransferase 유전자(이하 "PAT 유전자"로 표기)" 이다.

본 유전자는 선발 표지 유전자인 GUS-NPT Ⅱ 유전자와 PAT 유전자로 이루어져 있고, 식물형질전환용 바이너리 벡터에 재조합되었다(도 1). 본 재조합 벡터는 한국 경희대학교 생명과학부 양덕춘 교수가 캐나다 식물유전공학연구소의 Keller 박사로부터 공여받아 디스암드 티이 플라스미드(disarmed Ti plasmid)를 함유하고 있는 아그로박테리움 투메파시엔스 MP 90에 도입하였고, 이를 다시 양덕춘 교수로부터 무상으로 분양받은 후, 아그로박테리움과 50% 글리세롤을 4:1로 혼합하여 -80℃에 보관하였다.

글리세롤에 저장된 아그로박테리움을 YEP 고체배지[트립톤(Trypton) 10g/L, 효모 추출물(Yeast Extract) 10g/L, NaCl 5g/L, D-글루코오스(D-glucose) 2g/L, pH 7.2; 아가(Agar) 1.2% 첨가; 배지 멸균후 카나마이신(Kanamycin) 25μg/ml 와 겐타마이신(Gentamycin) 25μg/ml 첨가] 표면에 선을 그어 접종하여 28℃에서 3일간 배양한 후, 단일 콜로니를 YEP 액체배지[트립톤(Trypton) 10g/L, 효모 추출물(Yeast Extract) 10g/L, NaCl 5g/L, D-글루코오스(D-glucose) 2g/L, pH 7.2; 배지 멸균후 카나마이신(Kanamycin) 25μg/ml 와 겐타마이신(Gentamycin) 25μg/ml 첨가) 5mL에 접종하여 28℃에서 200rpm으로 1일간 배양하였다. 배양이 끝난 아그로박테리움 500㎕를 1/10 MS 액체배지(설탕 3% 첨가) 20mL에 희석하여 형질전환용으로 사용하였다.

실시예 2 : 도라지의 형질전환 및 형질전환체 선발

도라지 종자를 MS 배지에 파종하여 발아된 자엽(파종 후 8일 경과, 본엽이 전개되지 않은 상태)의 절편과 본엽(파종 후 20일 경과)의 절편을 아그로박테리움 용액(아그로박테리움 500㎕와 1/10 MS 액체배지 20mL)에 넣고 몇 번 흔들어 준 후 15분간 침지하였다. 아그로박테리움으로 접종된 도라지 자엽의 절편과 본엽의 절편을 멸균된 여과지에 살짝 대어 액체를 제거한 후 1/10 MS 고체배지에 올려 놓고 25℃에서 암상태로 48시간 동안 공동배양하였다. 공동배양이 끝난 후 선발배지에서 형질전환체를 획득하기 위해 2가지 방법을 적용하였다.

(1) 제 1 방법 : 자엽 절편에서 직접 부정아를 유도하는 방법

공동배양이 끝난 자엽의 절편과 본엽의 절편을 멸균된 여과지에 살짝 대어 아그로박테리움을 닦은 후 부정아 유도를 위한 제 1 선발배지[MS배지 + NAA 0.2mg/L + BA 1mg/L + 설탕3%, pH 5.8; 겔라이트 3g/L; 카나마이신(Kanamycin) 100mg/L + 카베니칠린(Carbenicillin) 500mg/L 첨가]에 치상하였다. 배양접시당 자엽 절편과 본엽 절편을 각각 10개씩 10개의 배양접시에 총 100개씩 치상하였으며(도 2-1, 2-2), 25℃로 유지되는 배양실에서 명배양하였다.

3~4주 후 제 1 선발배지의 자엽 절편 일부에서 부정아가 형성되었고(도 3),형질전환되지 않은 자엽 절편은 갈변되어 고사하였으며, 본엽 절편에서는 신초가 형성되지 않고, 갈색으로 변하여 고사하였다. 제 1 선발배지에서 형성된 부정아를 새로 조제한 선발배지에 옮겨서 신초의 생장을 유도하였다(도 4). 선발배지에서 생존한 신초를 뿌리 형성용 배지(MS 배지 + NAA 0.1mg/L 첨가)로 옮겨 뿌리의 형성을 유도하였다. 제 1 선발배지에 치상한 100개의 자엽 절편 중에서 최종적으로 2개의 형질전환(추정)체를 선발하였다.

(2) 제 2 방법 : 자엽 절편에서 캘러스를 유도하고 신초를 재분화하는 방법

공동배양이 끝난 자엽의 절편과 본엽의 절편을 멸균된 여과지에 살짝 대어 아그로박테리움을 닦은 후 캘러스 유도를 위한 제 2 선발배지[MS배지 + 2,4-D 2mg/L + 설탕3%, pH 5.8; 겔라이트 3g/L; 카나마이신(Kanamycin) 100mg/L + 카베니칠린(Carbenicillin) 500mg/L 첨가)에 치상하였다. 선발배지별로 배양접시당 자엽 절편과 본엽 절편을 각각 10개씩 10개의 배양접시에 총 100개씩 치상하였고, 25℃로 유지되는 배양실에서 암배양하였다.

2~3주 후부터 제 2 선발배지의 자엽 절편에서 캘러스가 형성되었으며, 형질전환되지 않은 자엽 절편은 갈변되어 고사하였으며(도 5), 본엽 절편에서는 캘러스가 형성되지 않고, 갈색으로 변하여 고사하였다. 제 2 선발배지에서 형성된 캘러스를 1회 계대배양한 후 신초를 재분화시키기 위하여 캘러스를 제 3 선발배지(MS배지 + NAA 1.86mg/L(10μmole) + BA 2.25mg/L(10μmole) + 설탕3%, pH 5.8; 겔라이트 3g/L; 카나마이신(Kanamycin) 100mg/L + 카베니칠린(Carbenicillin) 500mg/L 첨가)에 옮겨 주었고, 약 4주후 신초가 재분화되었다(도 6). 제 3 선발 배지에서 형성된 다수의 신초는 한 개체씩 분리하여 제 4 선발배지(MS배지 + NAA 1.86mg/L(10μmole) + BA 2.25mg/L(10μmole) + 설탕3%, pH 5.8; 겔라이트 3g/L; 카나마이신(Kanamycin) 100mg/L + 카베니칠린(Carbenicillin) 250mg/L 첨가)로 옮겨주었고(도 7), 여기서 생존한 신초를 뿌리 형성용 배지(MS 배지 + NAA 0.1mg/L 첨가)로 옮겨 뿌리의 형성을 유도하였다. 제 2 선발배지에 치상한 100개의 자엽 절편 중에서는 5개의 자엽 절편에서 캘러스가 형성되었고, 캘러스를 증식함에 따라 73개의 재분화된 형질전환(추정)체를 획득하였다.

실시예 3 : 형질전환된 도라지의 유전자 분석

(1) GUS(β-glucuronidase) 유전자 분석

GUS 유전자의 도입 및 발현을 확인하기 위하여 일반 도라지(대조군)와 형질전환체의 잎을 X-Gluc 용액[X-GlcA 250μg/mL, NaH₂PO₄13.8mg/mL, 트리톤(Triton) X 100 0.05%, 99.9% 메탄올 20%, 증류수 약 80mL, 합계 100mL, pH 7.0]에 침지하고 37℃에서 24시간 반응시킨 후, 청색이 잘 보이도록 95% 에탄올에 24시간 담가서 엽록소를 제거하고, 해부 현미경하에서 10배 확대하여 사진을 촬영하였다.

선발배지에서 선발된 형질전환(추정) 도라지와 일반 도라지(대조군)의 잎을 사용하여 GUS 활성을 조사한 결과, 일반 도라지의 잎에서는 청색 반응이 전혀 일어나지 않았으나(도 8-1), 선발배지에서 선발된 도라지는 대부분 강한 청색 반응을 나타내었다(도 8-2). 이러한 결과는 유전자가 잘 도입되어 발현되었음을 의미하는 것으로, GUS 양성 반응을 보인 식물체들이 형질전환체임을 증명하는 것이다.

(2) PCR 분석

도라지 형질전환체의 게놈내에 PAT, NPTⅡ, GUS 유전자가 삽입되었는지를 확인하기 위하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하였다. GUS 반응에서 양성으로 확인된 형질전환도라지 4개체와 일반 도라지(대조군)의 잎을 취해 디엔이지 플랜트 미니 키트(DNeasy Plant Mini Kit; QIAGEN, Cat. number 69104)를 사용하여 유전 DNA(genomic DNA)를 추출하였다.

PCR은 티지그라디언트 써머사이클러(TGradient Thermocycler; Biometra사)를 사용하였고, 핫스타트 피씨알 프레믹스(HotStart PCR PreMix; Bioneer Cat. number K-5050)에 DNA 20ng(2μL), 포워드(forward) 프라이머 와 리버스(reverse) 프라이머 각각 20 pmole(2μL) 및 멸균수 14μL를 첨가하여 총량 20μL로 하였다.

PCR 조건은 95℃에서 15분간 핫스타타크 DNA 폴리머라아제(HotStarTaq DNA Polymerase)를 활성화시킨 후, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분간 반응을 35회 반복하였으며, 72℃에서 10분간 증폭시켰다. PCR 반응이 끝난 후 생성된 산물 3μL를 1.2% 또는 1.5% 아가로스 겔에서 100V로 45분간 전기영동하고, 사이토 60(Syto 60; 미국 Molecular Probes社 Catalog No. S11342)으로 30분간 염색한 후 증류수에 15분간 담가서 탈색하고, 오딧세이(Odyssey; 미국 LI-COR社의 Infrared Imaging System)로 사진 촬영하여 유전자의 삽입 여부를 확인하였다.

사용한 프라이머로는 PAT 유전자(SIZE : 371bp)의 증폭을 위하여 포워드 5'- CTACAGTGAACTTTAGGACAGAGCC-3', 리버스 5'-GTAACTGGCCTAACT GGCCTTG-3'을 사용하였고, NPTⅡ 유전자(SIZE : 700bp)의 증폭을 위하여 포워드 5'-GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3', 리버스 5'-ATCGGGAGCGGC GATACCGTA-3'을 사용하였으며, GUS 유전자(SIZE : 515bp)의 증폭을 위하여 포워드 5'-CGGGCAACGTCTGGTATC-3', ㄹ리버스 5'-TTGCAAAGTCCCG CTAGTG-3'을 사용하였다.

GUS 반응에서 양성으로 확인된 형질전환 도라지 4개체와 일반 도라지(대조군)의 잎에서 유전 DNA를 추출한 후 PAT, NPTⅡ 및 GUS 유전자에 대한 PCR 분석을 실시하였다. PAT 유전자로 371bp의 PCR 산물을 증폭하는 프라이머를 제작하여 PCR을 수행한 결과 형질전환 도라지에서는 모두 PAT 유전자의 PCR 밴드를 확인할 수 있었으나, 일반 도라지에서는 밴드가 없었다(도 9). 한편 PAT 유전자와 같은 운반체에 들어 있으며, 표지 유전자로 사용된 NPTⅡ 유전자와 GUS 유전자를 PCR로 분석하였다. 형질전환 도라지에서는 700bp에서 NPTⅡ 유전자의 PCR 밴드가 형성되었고(도 10), 515bp에서 GUS 유전자의 PCR 밴드가 형성 되었으나(도 11), 일반 도라지에서는 밴드가 없었다. 이상의 결과에서 형질전환 도라지의 염색체 안에 도입하고자 하는 유전자가 잘 삽입되었음이 확인되었다.

(3) RT-PCR 분석

DNA에 담겨있는 유전정보가 발현되기 위해서는 RNA로 전사된 후, 그 유전정보가 단백질로 번역되는 과정을 거치게 된다. DNA가 RNA로 전사되었는가를 확인하기 위하여 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction; 역전사 중합효소 연쇄반응) 방법을 이용하였다.

GUS 반응에서 양성으로 확인된 형질전환체와 일반 도라지(대조군)의 잎을 취해 알엔이지 플랜트 미니 키트(RNeasy Plant Mini Kit; QIAGEN, Cat. number 74903)를 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. RT-PCR은 한국 바이오니어(Bioneer)社의 RT/PCR 프리믹스(Premix)(Catalog No. K-2055, M-MLV reverse transcriptase, RNase inhibitor, thermostable DNA polymerase dNTPs, tracking dye 및 침강제 함유)를 사용하여 하나의 튜브(tube)내에서 일괄적으로(one-step) 수행되었다.

먼저 주형 RNA 4ng(4μL)과 리버스 프라이머 20pmol(2μL)을 멸균된 튜브에 혼합한 후, 이 혼합액을 70℃에서 5분간 반응시켜 한 가닥의 꼬여 있는 RNA를 펴주고, 얼음에 5분간 잠겨두었다. 혼합액 6μL와 포워드 프라이머 20pmol(2μL)을 RT-PCR 프레믹스 튜브(Premix tube)에 넣고, 0.1% 디에틸 피로카보네이트 용액(DEPC water; ciethyl pyrocarbonate water) 12μL를 넣어 총량 20μL로 맞췄다.

일괄(One-Step) RT-PCR 조건은 47℃에서 30분간 역전사 반응(cDNA를 합성) 후, 94℃에서 5분간 RTase를 불활성화시키고, 94℃에서 30초, 60℃에서 15초, 72℃에서 45초간 반응을 총 30회 반복하였으며, 72℃에서 5분간 증폭시켰다. 프라이머는 PAT 유전자(SIZE : 371bp) 즉, 포워드 5'- CTACAGTGAACTTTAGGACAGAGCC-3', reverse 5'-GTAACTGGCCTAACT GGCCTTG-3'을 사용하였다. RT-PCR이 끝난 후 생성된 산물 3μL를 1.2% 아가로스 겔에 적재하고, 100V로 45분간 전기영동한 후, 사이토 60(Syto 60; 미국 Molecular Probes社 Catalog No. S11342)으로 30분간 염색하고 증류수에 15분간 담가서 탈색하여 오딧세이(Odyssey; 미국 LI-COR社의 Infrared Imaging System)로 사진을 촬영하였다.

GUS 반응에서 양성으로 확인된 형질전환체와 일반 도라지(대조군)의 잎을 취해 전체 RNA를 추출하고, 하나의 튜브내에서 일괄적으로 RT-PCR을 수행한 결과 형질전환 도라지에서는 모두 371bp에서 PAT 유전자의 밴드가 형성되었으나, 일반 도라지에서는 밴드가 형성되지 않았다(도 12). 이러한 결과는 외부 유전자인 PAT 유전자가 DNA에서 RNA로 전사되었음을 의미하는 것으로, PAT 유전자가 도라지에 성공적으로 도입되어 형질전환되었음이 확인되었다.

실시예 4 : 형질전환된 도라지의 제초제 저항성 검정

GUS(β-glucuronidase) 유전자 분석, PCR 분석 및 RT-PCR 분석을 통하여 형질전환이 확인된 도라지에서 제초제 저항성 유전자(PAT 유전자)가 안정적으로 발현되고 있는지를 확인하기 위하여 제초제가 투입된 배양병 내에서 제초제 저항성을 검정하였다.

용량 450mL 배양병에 MS 배지 100mL를 분주하여 멸균한 후, 제초제 바스타의 원료로 사용되는 포스피노트리신(phosphinothricin, PPT; Duchefa Cat. number P0159) 10mg/L와 카베니실린 250mg/L를 첨가한 후 형질전환 도라지와 일반 도라지(대조군)를 함께 배지 내에 이식하고, 3주간 배양하면서 제초제 처리에 따른 경시적 변화를 조사하였다.

형질전환 도라지를 종자를 파종하여 발아된 대조군(일반 도라지)과 비교할 때 형태적으로 차이가 없는 정상이었다. 포스피노트리신(PPT)을 처리한 배지에 식물체를 이식할 당시 대조군의 초장이 형질전환 도라지의 초장보다 다소 길었다. 이식후 3일 까지는 제초제의 영향이 거의 없었으며(도 13-1), 이식 6일후에는 대조군 식물체 잎의 약 30%가 갈색으로 변하였으나, 형질전환체는 정상이었다(도 13-2). 이식 9일후에는 대조군 식물체의 잎과 줄기의 약 40~50%가 갈색으로 변하였으나, 형질전환체는 새로운 잎이 출현하기 시작하였고(도 13-3), 이식 3주후에는 대조군 식물체의 잎과 줄기가 100%가 갈색으로 변하여 완전히 고사하였으나, 형질전환 도라지는 아무런 피해없이 정상적인 생장을 계속하여 새로운 잎이 전개되고 뿌리의 생장이 관찰되었으며(도 13-4), 형질전환 도라지가 포스피노트리신(PPT) 저항성 도라지임이 확인되었다.

상시 실시예를 통해 설명한 바와 같이, 도라지의 자엽 절편을 사용하여 PAT 유전자를 함유한 아그로박테리움과 접종한 후 항생제를 첨가한 배지에서 선발 과정을 거쳐 형질전환체를 획득하였으며, PCR 분석으로 PAT, NPTⅡ 및 GUS 유전자의 삽입을 확인하였고, RT-PCR 분석에 의하여 PAT 유전자의 DNA가 RNA로 전사되었음을 확인하였다. 또한 배양병 내에서 형질전환된 도라지가 포스피노트리신(PPT) 저항성임을 확인하였다.

이러한 형질전환된 도라지가 농가에서 재배된다면 손 제초 대신 제초제인 바스타를 1회 살포하는 것으로 제초작업을 마치게 되므로 노동력을 절감할 수 있을 것이며, 바스타는 토양에서 쉽게 분해되기 때문에 환경 오염에도 큰 영향을 미치지 않을 것으로 기대되므로 이는 환경 및 농업 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

PAT 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터로 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 형질전환시키는 단계;

상기 형질전환된 아그로박테리움을 도라지의 자엽과 공동배양하는 단계;

상기 공동배양된 도라지의 자엽을 선발배지(MS배지 + NAA 0.2mg/L + BA 1mg/L + 설탕3%, pH 5.8; 겔라이트 3g/L; Kanamycin 100mg/L + Carbenicillin 500mg/L 첨가)에서 배양하여 직접 부정아를 유도함으로써 형질전환된 신초를 선발하고 신장시키는 단계; 및

상기 형질전환된 신초에서 뿌리형성을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제초제 저항성 형질전환 도라지의 제조방법.
PAT 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터로 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 형질전환시키는 단계;

상기 형질전환된 아그로박테리움을 도라지의 자엽과 공동배양하는 단계;

상기 공동배양된 도라지의 자엽을 선발배지(MS배지 + 2,4-D 2mg/L + 설탕3%, pH 5.8; 겔라이트 3g/L; Kanamycin 100mg/L + Carbenicillin 500mg/L 첨가)에서 배양하여 캘러스를 유도함으로써 형질전환된 신초를 선발하고 신장시키는 단계; 및

상기 형질전환된 신초에서 뿌리형성을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제초제 저항성 형질전환 도라지의 제조방법.
제1항 또는 제2항의 방법으로 제조된 제초제 저항성 형질전환 도라지.