SE468251B - Reningsprocess foer interferon - Google Patents

Description

10 5 20 25 30 35 11/2 F' små 291 _ och reproducerbarhet av läkemedel.

Föreliggande uppfinning har som huvudsyfte att tillhanda- hålla ett förfarande för tillverkning av högrenat leukocytinter- feron för kliniskt bruk.

Ett annat ändamål med uppfinningen är att tillhandahålla ett reningsförfarande som är mycket reproducerbart, relativt billigt och relativt lätt att utföra. För dessa och andra ända- så, mål som framgår av följande beskrivning, avser föreliggande upp- finning förfarande för rening av rå-interferon från humana leu- kocyter, varvid nämnda förfarande innefattar följande steg: a) applicering av en lösning av nämnda rå-interferon på en immunoaffinitets-adsorbtionskolonn; b) eluering av det adsorberade interferonet från nämnda ko- lonn med användande av en buffertlösning; c) koncentrering av eluatet från steg b) med en tiocyanatlös- ning genom fällning eller jonbytarkromatografi; och d) återvinning av det fällda interferonet erhållet i steg c).

I ett sådant förfarande är det föredraget att använda för framställning av en immunoaffinitetsadsorbtionskolonn ett rekom- binant interferon för framställning av det antiserum, från vil- ket polyklonala antikroppar isoleras och kovalent bindes till kolonnmatrisen.

Förfarandet enligt uppfinningen utföres företrädesvis un- der användning av ett ytterligare steg för koncentrering av elu- atet från immunoaffinitetsadsorbtionskolonnen under användning av en jonbytarkolonn. Interferonet elueras lämpligen från en sådan jonbytarkolonn genom höjning av pH. Sådan pH-höjning kan erhållas genom applicering av en buffertlösning på kolonnen. _ Förutom fällningssteget under användning av exempelvis en tiocyanatlösning kan förfarandet innefatta ytterligare ett fäll- ningssteg, vari interferonet som erhålles från sådan fällning åter utfälles i etanol innan det återvinnas. e Efter den enkla eller dubbla utfällningen unöerkaetas det erhållna interferonet företrädesvis gelfiltrering, och de önska- t de utkommande fraktionerna med absorbans vid 280 nm uppsamlas och tillvaratas.

Vid fällningssteget är det föredraget att använda en lös- ning av kaliumtiocyanat. Andra fällningsmedel är triklorättik- 10 15 20 25 30 35 468 251 syra och ammoniumsulfat. Eluering av interferonet fràn jonbytar- kolonnen för koncentrering av eluatet fràn föregàende steg utfö- res lämpligen genom applicering av en buffertlösning i syfte att höja pH. Sàdan pH-höjning utföres företrädesvis till ett pH över neutralt, såsom till ca 8 eller högre.

Uppfinningen innefattar även ett renat humant leukocytin- terferon närhelst det framställts genom häri beskrivet förfaran- de.

Föreliggande uppfinning kommer nu att ytterligare illust- reras genom konkreta exempel, vilka emellertid ej far tolkas såsom inskränkande uppfinningens omfattning i annan grad än som framgår av bilagda patentkrav.

EXEMPEL 1 Framställning av antiserum Vid framställningen av antiserum används friska och ej tidigare immuniserade getter. Antigenet som används vid immuni- seringen är ett rekombinant interferon, K-88, tillverkat vid Umeå Universitet och beskrivet i detalj i den publicerade euro- peiska patentansökningen nr. 86903650.9, publiceringsnummer 0263 102. Detta rekombinanta interferon är upplöst i fysiologisk fosfatbuffert och den specifika aktiviteten av lösningen är un- gefär 2x105 IU/mg. Denna lösning är administrerad till getterna tillsammans med "Freund's complete adjuvant" vid det första im- muniseringstillfället. Därefter sker immunisering med “Freund's inclompete adjuvant“ en gång per vecka eller var 14:e dag i volymer från 0,2 ml till 1,0 ml.

Tappningen av getterna sker fràn halsvenen var 14:e dag efter tredje immuniseringen. Det tappade blodet undersöks med avseende på anti-interferon-antikroppsinnehåll samt ospecifik bindning. Antikroppsinnehàllet analyseras med en assay som mäter neutraliserande titer, d.v.s. den mäter hur stor mängd interfe- ron som inaktiveras av antikropparna i ett interferonsensitivt biologiskt system. Ospecifik bindning mäts genom konventionell Western Blot. 150-200 ml blod tappas normalt vid varje tappningstillfäl- le. Det nytappade blodet får sta ett dygn i kylskåp varvid det koagulerar. Därefter centrifugeras det och serumet hälla av.

Detta serum innehållande antikroppar mot interferon renas sedan 10 15 20 25 30 35 fi68 251 vidare som beskrivs nedan.

EXEMPEL 2 Framställning av immuno-affinitetsadsorbtionskolonn.

Antiserat erhållet i Exempel 1 fälls med 25 g ammoniumsul- fat per 100 g antiserum under långsam omröring i centrifugflas- kor som sedan får stå över natten. Följande dag centrifugeras antiserat med 4000 g i 30 min. Överlösningen hälls av och fäll- ningen tvättas två gånger med ammoniumsulfat 1,75 mol/l för att minska mängden av hemoglobin och albumin. Fällninen överförs till dialysslangar och dialysen utförs alternerande mot vatten och natriumacetatbuffert 0,05 M NaAc, 0,021 M HAC, pH 5,0.

Under dialysen bildas en fällning som består av lipoprote- iner, och fällningen avlägsnas genom centrifugering vid 4000 g i 30 min. Överlösningen som innehåller gammaglobulin appliceras på' en kolonn innehållande DEAE Sepharose FF<3(25 ml packad gel per -100 ml utgångsantiserum) bringad i jämvikt med acetatbuffert pH 5,0. Det dialyserade antiserat tillåts passera genom kolonnen och elueras med ungefär en kolonnvolym av acetatbuffert.

Volym: 445 ml Absorbans 280 nm: 35,2 IgG-koncentration: 25,3 mg/ml Totalt IgG: 11,3 g Utbyte: 16 mg IgG/ml serum Det immunoglobulin-innehållande eluatet dialyseras mot kopplingsbuffert, natriumbikarbonat 0,1 mol/l och natriumklorid 0,5 mol/l.

Br-CN-aktivering av Sepharose 4B.

Sepharose tvättas med destillerat vatten med hjälp av en glastratt och sugs till torrhet. Ungefär 40-60 g gel per g IgG vägs upp och suspenderas i kaliumfosfatbuffert 2 mol/l pH 11,0.

Gelslurryn kyls ned på ett isbad. BrCN upplöses i vatten 0,05-0,1 g BrCN/ml. 3,3 g BrCN/100 g torrsugen gel sätts till och sepharosen aktiveras under 10 min med hjälp av lätt omröring med en magnetomrörare. Gelslurryn överförs till en glastratt och tvättas med kallt destillerat vatten tills neutral reaktion av eluatet erhålls. Den aktiverade gelen blandas med immunoglo- bulinlösningen och inkuberas vid rumstemperatur över natten íx få 10 15 20 25 30 35 468 251 med lätt omröring.

Gelen överförs sedan till en glastratt och filtratet ana- lyseras med avseende pà proteininnehàll genom mätning av A280.

Gelen suspenderas sedan àter i kopplingsbuffert och glycin 0,1 mol/1 sätts till för att blockera återstående kopplingsställen och gelen inkuberas i minst 1 timme vid rumstemperatur. Efter blockeringsproceduren tvättas gelen upprepade gånger med fosfat- buffert 0,02 mol/l, natriumklorid 0,2 mol/1 pH 7,0 och citronsy- ra 0,1 mol/l, natriumklorid 0,15 mol/1. Gelen lagras i fosfat- buffrad salin med 0,04% natriumazid som konserveringsmedel.

Kopglingsprocedur. 750 ml Sepharose 4B tvättas med 2,5 l destillerat vatten i en glastratt och sugs torr. Den torra gelen väger 520 g. Gelen suspenderas i 500 ml kaliumfosfatbuffert 2,0 mol/1 pH 11,0 och kyls i isbad. 17,3 g BrCN upplöses i 200 ml vatten och sätts till gelslurryn och gelen aktiveras i 10 min. Gelen tvättas med 7 l kallt destillerat vatten. Eluatet uppvisar då neutralt pH.

Gelen blandas med immunoglobulinfraktionen som dialyserats mot kopplingsbuffert, natriumbikarbonat 0,1 mol per l, natrium- klorid 0,5 mol/1 pH 8,5 och inkuberas över natt vid rumstempera- tur. Följande dag filtreras gelen och tvättas med en volym av kopplingsbuffert och proteinkoncentrationen i filtratet och i tvättvätskan bestäms med hjälp av A230.

A250 filtrat: 184 mg protein A280 tvättvätska: Totalt: 165 mg protein 349 mg protein Kopplingseffektivitetz 96,91 Gelen àtersuspenderas i kopplingsbuffert med glycin 0,1 mol/1 för att blockera återstående aktiverade ställen i en tim- me. Gelen tvättas med fosfatbuffert pH 7,0 och citronsyra. Gelen lagras i fosfatbuffrad salin med 0,04% natriumazid som konser- veringsmedel.

EXEMEEL 3 Produktion av rå-interferon I denna produktion används "buffy coats" för att tillverka 10 15 20 25 30 35 468 251 rà-interferon. "Buffy coats" är en biprodukt vid sjukhusens blodcentraler. De "buffy coats" som används är ej äldre än 48 timmar och de flesta av dem är ej äldre än 24 timmar.

För att framställa leukocyter fran buffy coats lyseras de röda blodcellerna genom tillsats av ammoniumklorid till en slut- ff' lig koncentration av 0,83%. Efter ca 10 min vid rumstemperatur centrifugeras leukocyterna i en korgcentrifug med ett flöde av 300 ml per min. Leukocyterna suspenderas i PBS. Denna process Ü upprepas en gäng och de erhållna leukocyterna tillsätts sedan odlingsmediet.

De renade leukocyterna suspenderas i Eagels MEM med föl- jande tillsatser; Neomycin 25 ug/ml Trícin 3 mg/ml 4% human plasma fälld med 6% polyetylenglykol 6000 (Inglot A et al, Acta Virol. 19; 250-254, 1975) Användning av PEG-fraktionerad plasma i stället för G- -gamma-serum är den enda större skillnaden från originalmetoden enligt Cantell. Cellerna används i koncentrationer om 107 celler per ml i 4-liters rundkolvar innehållande ca 2,0 l i varje. Vat- tenbadet omrörs med magnetomrörare och termostateras vid 37°C.

De odlade cellerna “primas" genom tillsats av rå-interferon 100 units/ml. Två timmar efter “primingen“ tillsätts Sendai-virus ungefär 150 hemagglutinerande enheter per ml (ungfär 40 ml Sen- dai-virus per 1). Efter 20 timmar vid 37° avlägsnas leukocyterna genom centrifugering eller filtrering. Rå-interferonet kan lag- ras i maximalt 7 dagar före rening.

EXEMPEL 4 Koncentrering av ra-interferon Rà-interferonlösningen som erhållits i enlighet med Exem- pel 3 koncentreras genom ultrafiltrering med ett filtronsystem MW 10.000 filter, Innan ultrafiltreringen äger rum filtreras f rä-interferonet genom ett 0,45 um membran (Hillipore, Prostak) för att avlägsna cellrester. Interferonlösningen koncentreras ungefär 5 gånger.

Q! 10 15 20 25 30 35 Ja.

O\ CD BD U"| ...a EXEMPEL 5 Affinitetskromatografi av rà-interferon Affinitetskolonnen (BP 113/15, Pharmacia, gelvolym ungefär 1 l) som erhàllits sàsom beskrivits i Exempel 2 är ekvilibrerad med 0,02 M Tris-HCl 0,2 M NaCl 0,001 M EDTA pH 8,0 (Tris- -buffert). Interferonlösningen som erhållits i Exempel 4 får sedan passera genom kolonnen med ett flöde av ungefär 4 l per timme. Efter det att Interferon-lösningen har passerat genom kolonnen, tvättas kolonnen med en Tris-buffert tills absorbansen av eluatet är 0 eller nästan 0.

Affinitetskolonnen desorberas med 0,1 M citronsyra,-0,15 M NaCl pH 2,0. Citronsyrebufferten passerar genom kolonnen med ett flöde av ungefär 3 l per timme. Denna surgöring av kolonnen re- sulterar i desorbtion av interferonet som varit adsorberat till kolonnen. Desorbtionen fortsättes till dess att absorbansen vid 280 nm upphört, och den uppsamlade interferonlösningen tillvara- tas. Volymen är ungefär 5 1.

EXEMPEL 5 Koncentrering av desorberat interferon Den utvunna interferonlösningen fràn Exempel 5 appliceras pà en jonbytarkolonn (S-Sepharose®) ekvilibrerad med citronsyra- buffert pH 2,0. Jonbytaren tvättas sedan med citronsyrebuffert och interferonet elueras genom höjning av pH genom tillsats av Tris-buffert som medför en pH-ökning till ungefär pH 8.

EXEMPEL 7 Fällning av interferon med kaliumtiocïanat _ Till den fràn Exempel 6 erhållna interferonlösningen sätts försiktigt 5 M kaliumtiocyanat under omröring till en slutkon- centration av 0,5 M kaliumtiocyanat. (Viktförhàllande Ifn:HSA ca 1:5-10.) Saltsyra (IM) tillsätts tills pH har sjunkit fràn 8 till ungefär 2,0. Den opalescenta fällningen centrifugeras vid 5000 rpm i 30 min (Beckman J-21). Överlösningen tillvaratas för- siktigt.

EXEMPEL 8 Fällning med etanol Interferonfällningen från kaliumtiocyanatfällningen i 10 15 20 25 30 -f Exerfipgls72ušplslammas i 95%-ig sur etanol tillsammans med HSA (viktförhàllande interferon till HSA ungefär 1:5-10) (ungefär 300 ml.) vid en temperatur av -20°C. Uppslamningen centrifugeras i 30 min vid 5000 rpm. Den interferoninnehàllande överlösningen àtervinns och dess pH ökas sakta till pH 8 genom tillsättning av 0,1 M NaOH. Fällningen centrifugeras sedan i 30 min vid 5000 rpm. (Beckman J-21). Överlösningen tillvaratas och fällningen upplöses i 10 ml 0,15 M natriumfosfatbuffert + 0,5 M KSCN, pH 8,0.

EXEMPEL 9 Gelfiltrering av den ugplösta fällningen Den från Exempel 8 erhallna interferonlösningen centrifu- geras och gelfiltreras pá en kolonn (2,5x90 cm, AcA-54, IBF, Frankrike). Den med UV-ljus (280 nm) detekterade interferontop- pen tillvaratas sedan. Renheten av det erhållna interferonet är ungefär 80% och vid analys i ett Western blot system befinnes den innehålla alla interferonkomponenter som áterfinnes i ett ra-interferon av Cantell-typ.

Förfarandet enligt denna uppfinning erbjuder manga förde- lar, bland vilka kan nämnas: effektiv eliminering av risken för virusinfektion, höga utbyten, enkelt och pålitligt att utföra.

Exemplen som beskrivits här ovan skall inte ses som av- gränsande av uppfinningen. De har presenterats endast i avsikt att illustrera och beskriva uppfinningen. Många modifikationer och variationer är möjliga för fackmannen i ljuset av den be- skrivna uppfinningen. Avsikten är att omfattningen av uppfin- ningen skall definieras av de bilagda kraven.

MQ 'H

Claims (7)

10 15 20 25 30 35
1. PATENTKRAV ' 12 Förfarande för rening av ett humant rå-leukocytinterfe- ron innefattande stegen: a) applicering av en lösning av nämnda rå-interferon på en immunoaffinitetsadsorbtionskolonn; b) eluering av det adsorberade interferonet från nämnda ko- lonn under användning av en buffertlösning med surt pH; c) koncentrering av eluatet erhållet från steg b) genom en- dera utfällning med en tiocyanatlösning eller jonbytarkromato- grafig- d) utfällning av det interferon som är närvarande i eluatet härrörande från steg C) med en tiocyanatfällning; e) återutfällning av interferonet härrörande från steg d) i vatten~etanol vid ett basiskt pH; f) tillvaratagande av det i steg e) erhållna interferonet.
2. 2. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att eluatet från steg b) koncentreras under användning av en jonbytarkolonn, varvid interferonet elueras från nämnda kolonn genom höjning av pH över neutralt värde medelst tillförsel av en buffertlösning till kolonnen.
3. 3. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att eluatet från steg b) koncentreras genom utfällning under användning av tiocyanat, triklorättiksyra eller ammoniumsulfat.
4. 4. Förfarande enligt något av de föregående patentkraven, kännetecknat därav, att det från utfällningen erhållna interfa- ronet underkastas gelfiltrering, varvid den effluent som visar absorbans vid 280 nm tillvaratas.
5. 5. Förfarande enligt något av de föregående patentkraven, vari den i steg a) använda kolonnen innehåller polyklonala anti- kroppar erhållna genom immunisering under användning av ett re- kombinant interferon.
6. 6. Förfarande enligt något av de föregående patentkraven, kännetecknat därav, att utfällningen i steg c) utföres med en lösning av kaliumtiocyanat.
7. 7. Förfarande enligt något av de föregående patentkraven, kännetecknat därav, att all utfällning utföres i närvaro av al- bumin.