RU1776415C - Способ очистки поверхностного антигена вируса гепатита В (НВ @ А @ ) - Google Patents

Abstract

Использование: изобретение может быть использовано дл  создани  высокочувствительных диагностикумов дл  определени  маркеров вируса гепатита В. Цель: повышение иммунореактивности препарата , а также обеспечение стандартно воспроизводимой чистоты и биологической активности препарата при выделении из сыворотки или плазмы HBsAg положительных доноров как с высоким, так и с низким содержанием HBsAg. Сущность изобретени : сыворотку HBsAg положительных доноров фракционируют сульфатом аммони . После первого равновесного центрифугировани  в градиенте плотности раствора галогенида щелочного металла провод т диализ против раствора хлорида натри . Диализат центрифугируют при (17000-33000) хд в течение не менее 1,5 часов. После второго равновесного центрифугировани  провод т диализ против сол ной кислоты с рН 1,9-2,3. Диализат подвергают гидролизу пепсином в ко- личестве 3-15 мкг/мл белка и центрифугируют. Положительный эффект: изобретение позвол ет обеспечить отечественную технологию высококачественным сырьем дл  производства диагностикумов дл  вы влени  вируса гепатита В. w Ј 1 4 О СЛ

Description

Изобретение относитс  к вирусологии, медицинской биохимии и молекул рной биологии и может быть использовано в медицинской промышленности дл  создани  высокочувствительных диагностикумов дл 

определени  маркеров вируса гепатита В, дл  изготовлени  вакцины против гепатита В. а также в лабораторной научно-исследовательской работе.

Пригодность препаратов поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) дл  указанных целей определ етс  их чистотой , нативностью, биологической (иммунологической ) активностью и иммунореактивностью.

Известны способы очистки HBsAg из плазмы и (или) сыворотки HBsAg-положи- тельных доноров, включающие фракционирование исходного материала сульфатом аммони , фракционирование этанолом по Кону, осаждение полиэтиленгликолем, кри- опреципитацию, равновесное центрифугирование , скоростное зональное центрифугирование, обработку п.ротеолити- ческими ферментами, экстракцию хлороформомилиалифатическими фторсодержащими углеводородами, хрома- тографические методы, в том числе биоспецифическую хроматографию (1-4).

Однако эти способы имеют р д недостатков . 8 качестве исходного материала авторы используют сыворотку или плазму с высоким (не ниже 80-150 мкг/мл) содержанием HBsAg, Значительна  часть методик включает обработку высокими концентраци ми протеолитических ферментов или ор- ганическими растворител ми, что отрицательно сказываетс  на нативности препаратов. Большинство методов не по- звол ют получить препараты высокой чистоты . Практически все методы не обеспечивают получение препаратов с высокой иммунореактивностью, концентрацией , а также стандартно воспроизводимой чистоты и биологической активности препаратов .

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому  вл етс  способ, описанный в (5).

Он позвол ет выдел ть HBsAg из различных биологических жидкостей, Метод включает в себ  фракционирование сыворотки или плазмы HBsAg-положительных доноров сульфатом аммони , диализ HBsAg содержащей фракции против физиологического раствора хлористого натри , два равновесных центрифугировани  в градиенте плотности раствора галогенида щелочного металла, повторный диализ обогащенного материала и окончательную очистку препарата осуществл ют ультрацентрифугированием и гельфильтрацией.

Фракционирование исходной плазмы или сыворотки провод т двухступенчато с добавлением сульфата аммони  в виде насыщенного раствора на первой ступени до (27-28%) от насыщени , а на второй - до (42,0-42,5%) от насыщени . Равновесное центрифугирование гомогенного раствора

хлористого цези  провод т последовательно дважды с начальными плотност ми (1,19-1,24) г/см3 и (1,25-1.26) г/см3 соответственно .

Использование этого метода позвол ет получить препарат HBsAg с химической чистотой не ниже 90%, с довольно высокой биологической (иммунологической) активностью (титр в ВИЭФ 1/256-1/512) и с иммунореактивностью 80-85%.

Препараты, полученные по прототипу, были апробированы в радиоиммунологической тест-системе на иммунореактивность по способу (6).

Основной недостаток способа заключаетс  в том, что он не позвол ет получить препарате иммунореактивностью выше 80- 85%.

Цель изобретени  - повышение имму- нореактивности и чистоты препарата при выделении из сыворотки или плазмы HBsAg положительных доноров как с высоким, так и с низким содержанием HBsAg.

Поставленна  цель достигаетс  тем, что в способе, включающем двухступенчатое фракционирование сыворотки HBsAg положительных доноров сульфатом аммони , диализ против хлорида натри , два центрифугировани  диализата в градиенте плотности раствора галогенида щелочного металла, повторный диализ и выделение целевого продукта дифференциальным центрифугированием , после первого центрифугировани  дополнительно провод т диализ против раствора хлорида натри  и центрифугирование при (17000-33000) хд в течение не менее 1,5 часов, а повторный диализ провод т против раствора сол ной кислоты с рН 1,9-2,3 и в полученный диализат внос т пепсин в количестве 3-15 мкг/мг белка.

Экспериментально установлено, что применение после первого равновесного центрифугировани  диализа против физиологического раствора хлорида натри  и последующегодифференциального центрифугировани  при (17000-33000) хд в течение не менее 1,5 часа позвол ет получить дополнительную очистку целевого препарата.

Подобранное экспериментальным путем количество пепсина (3-15 мкг/мг белка) позвол ет увеличить степень очистки препарата и при этом сохранить его биологическую (иммунологическую) активность.

Использование дифференциального ультрацентрифугировани  позвол ет сконцентрировать препарат и провести его очистку от продуктов ферментативного гидролиза.

Таким образом, двухступенчатое фракционирование исходной сыворотки или плазмы с помощью насыщенного раствора сульфата аммони , диализ против хлорида натри , два центрифугировани  диализата в градиенте плотности раствора CsCI, повторный диализ и выделение целевого продукта дифференциальным центрифугированием в совокупности с дополнительным проведением после первого центрифугировани  диализа против раствора хлорида натри  и центрифугировани  при 17000-33000 хд в течение не менее 1,5 часов, проведением повторного диализа против раствора сол ной кислоты с рН 1.9- 2,3 и внесением в полученный диализат пепсина в количестве 3-15 мкг/мл белка дают возможность получить препарат HBsAg с иммунореактивностью не ниже 90% {по прототипу 80-85%), с химической чистотой не ниже 95% (не ниже 90% по прототипу) и высокой биологической (иммунологической) активностью (1/512-1/1024) по данным ВИ- ЭФ (1/256-1/512 по прототипу) с концентрацией препарата в растворе 1-2 мг/мл.

Способ по сн етс  следующими примерами .

Пример 1. По сн ет реализацию способа со средними значени ми режимов стадий. Берут 500 мл плазмы или сыворотки, содержащей HBsAg по данным ВИЭФ 1/8, добавл ют 190 мл насыщенного раствора сульфата аммони , перемешивают и выдерживают в течение 2-3 ч при 2-10°С. По истечении заданного времени провод т центрифугирование на центрифуге G2-2I Beckman, ротор IA-14, 12000 об/мин (22100 хд) при температуре 5°С 30 мин. Осадок отбрасывают, к надосадочной жидкости приливают 176 мл насыщенного раствора сульфата аммони , перемешивают и выдерживают в течение 2-3 ч при 2-10°С, центрифугируют на центрифуге G2-2I Beckman, ротор IA-14,12000 об/мин (22100 хд)30 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок раствор ют в 200 мл дистиллированной воды , довод т объем до 500 мл дистиллированной водой, приливают 366 мл насыщенного раствора сульфата аммони , перемешивают, выдерживают в течение 2-3 ч при 2-10°С и центрифугируют в тех же услови х . Надосадочную жидкость отбрасывают , осадок раствор ют в 200 мл дистиллированной воды и диализуют против 5 л 0,14 М раствора хлористого натри  при комнатной температуре (18-25°С) в течение 48 ч с четырехкратной сменой диализного раствора. Диализат центрифугируют на центрифуге G2-21 Beckman. ротор IA-14, 12000 об/мин (22100 хд), при 20°С. 1 ч, осадок отбрасывают. Осветленный диализат довод т до 300 мл 0,14 М раствором хлористого натри .

Затем в полученном растворе раствор ют хлористый цезий до плотности 1,21 г/см3 и провод т центрифугирование (центрифуга Z-8-70 Splnco, Beckman, ротор 70 Ti, 60000 об/мин - 275000 хд, при 20°С, 60 часов). Образовавшийс  градиент плотности рас0 твора хлористого цези  раздел ют на фракции объемом по 1 мл. Фракции, содержащие HBsAg по данным ВИЭФ, объедин ют, диализуют против 2 л 0,14 М раствора хлористого натри  в течение 20 часов с

5 четырехкратной сменой диализного раствора . Диализат центрифугируют на центрифу- reG2-21 Beckman, ротор IA-20,18000об/мин (25300 хд), при 20°С, 2 ч, осадок отбрасывают . В надосадочную жидкость доливают ди0 стиллированную воду до 160 мл, добавл ют хлористый цезий до плотности 1,26 г/см3 и провод т второе равновесное центрифугирование (центрифуга Z-8-70 Splnco, Beckman, ротор 70.1 Ti, 60000 об/мин 5 260000 xg, 20°C, 60 ч). Образовавшийс  градиент плотности раствора хлористого цези  раздел ют на фракции объемом по 1 мл. Фракции, содержащие HBsAg в ВИЭФ объедин ют и диализуют против 2 л раствора

0 сол ной кислоты с рН 2,0 в течение 20 ч с четырехкратной сменой диализного раствора , диализат осветл ют центрифугированием на центрифуге G2-21 Beckman, ротор IA-20, 18000 об/мин (25300 хд), 20°С, 60

5 мин. В осветленный раствор внос т протео- литический фермент (пепсин, Serva, ca 15 milli Anson units/mg) из расчета 10 мкг/мг белка в растворе, перемешивают и выдерживают при 37°С в термостате в тече0 ние 14 ч.

Провод т дифференциальное центрифугирование (центрифуга Z-8-70 Spinco, Beckman, ротор SW 55 Ti, 55000 об/мин - 290000 xg, 10°C, 150 мин). Образовавшийс 

5 на дне пробирок осадок раствор ют в 5 мл 0,14 М раствора хлористого натри .

Полученный таким образом препарат HBsAg имеет следующие характеристики: объем 5 мл, концентраци  белка 2,3 мг/мл,

0 химическа  чистота 97%. иммунореактив- ность92%, титр в ВИЭФ 1/1024.

Пример 2. По сн ет необходимость диализа и осветлени  HBsAg содержащих фракций после первого равновесного цент5 рифугировани  в градиенте плотности хлорида цези .

HBsAg выдел ют из 500 мл плазмы, имеющей титр в ВИЭФ 1 /4 по примеру 1 до стадии объединени  фракций, содержащих HB.sAg по данным ВИЭФ после первого

равновесного центрифугировани  в градиенте плотности хлорида цези . При этом определ ют кратность очистки полученного объединенного препарата (6). Затем провод т диализ против 2 л 0,14 М раствора хлористого натри  в течение 20 ч с четырехкратной сменой диализного раствора , после чего диализат центрифугируют на центрифуге G2-21 Beckman, ротор IA-20, 18000 об/мин (25300 хд), при 20°С, 2 ч, осадок отбрасывают и определ ют кратность очистки в надосадочной жидкости, Результаты приведены в табл. 1.

Табл. 2 по сн ет выбор времени центрифугировани .

Пример 3. По сн ет выбор рН раствора сол ней кислоты. HBsAg выдел ют из 500 мл плазмы, имеющей титр HBsAg в ВИ- ЭФ 1 /8, по примеру 1 до стадии выделени  и объединени  HBsAg содержащих фракций после второго равновесного центрифу- гировани  в градиенте плотности хлористого цези . Дл  проведени  диализа готов т растворы сол ной кислоты с рН (1,1), (1,5), (1,9), (2,3), (2,7) и провод т диализ против этих растворов в течение 20 часов с четырехкратной сменой диализных растворов . Диализат центрифугируют на центрифуге G2-21 Beckman, ротор IA- 20, 18000 об/мин (25300 хд), 20°С, 60 мин. В осветленном растворе определ ют титр HBsAg по данным ВИЭФ (табл. 3).

Пример 4. По сн ет выбор концентрации пепсина.

HBsAg выдел ют из плазмы, имеющей титр HBsAg в ВИЭФ 1/4, по примеру 1, до стадии осветлени  после диализа против раствора сол ной кислоты. Далее в осветленный раствор внос т пепсин из расчета 2, 3, 10, 15, 30, 50 мкг/мг белка в растворе, выдерживают при 37°С в термостате в течение 14 ч, после чего провод т дифференциальное центрифугирование на центрифуге Z-8-70 Splnco, Beckman, ротор SW 55 TI, 55000 об/мин (290000 хд), 10°С, 150 мин.

Дл  каждой концентрации пепсина определ ют содержание HBsAg в осадке по данным ВИЭФ (табл. 4).

Затем дл  каждой концентрации пепсина определ ют иммунореактивность полученного препарата HBsAg (табл. 5).

Положительный эффект - социальный - заключаетс  в обеспечении отечественной технологии высококачественным сырьем в производстве диагностикумов дл  вы влени  вируса гепатита В. Это позволит более полно вы вл ть носителей HBsAg среди Д0- норов, усилить контроль за качеством препаратов крови, обеспечить проведение специфической иммунопрофилактики в

Claims (1)

1. группах повышенного риска по гепатиту В. Формула изобретени  Способ очистки поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), включающий двухступенчатое фракционирование сыворотки HBsAg-положительных доноров сульфатом аммони , диализ против хлорида натри , два центрифугировани  диализата в градиенте плотности раствора га огенида щелочного металла, повторный диализ и выделение целевого продукта дифференциальным центрифугированием, отличающийс  тем. что, с целью повышени  иммунореактивности и чистоты антигена, после первого центрифугировани  дополнительно провод т диализ против раствора хлорида натри  и центрифугирование при 17000-33000 хд в течение не менее 1,5 ч, а повторный диализ провод т против раствора сол ной кислоты с рН 1,9-2,3 и в полученный диализат внос т пепсин в количестве 3-15 мкг/мг белка.

   Стади  очистки

   До диализа и центрифугировани  После диализа и центрифугировани 

   Таблица 1

   Кратность очистки препарата

   1 1,2

   45

   Таблица 2

   Таблица 3

   Таблица 4

   Таблица 5