RU2122430C1 - Способ очистки поверхностного антигена вируса гепатита b, содержащего пре s2 пептид, из рекомбинантных клеток дрожжей, вакцина для иммунизации против гепатита b - Google Patents
Способ очистки поверхностного антигена вируса гепатита b, содержащего пре s2 пептид, из рекомбинантных клеток дрожжей, вакцина для иммунизации против гепатита b Download PDFInfo
- Publication number
- RU2122430C1 RU2122430C1 RU95120587A RU95120587A RU2122430C1 RU 2122430 C1 RU2122430 C1 RU 2122430C1 RU 95120587 A RU95120587 A RU 95120587A RU 95120587 A RU95120587 A RU 95120587A RU 2122430 C1 RU2122430 C1 RU 2122430C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- surface antigen
- buffer
- peptide
- hepatitis
- concentration
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 129
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 129
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 129
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 19
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 15
- 230000003053 immunization Effects 0.000 title claims description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 title claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 title abstract description 17
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 51
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims abstract description 18
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims abstract description 17
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims abstract 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 57
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 41
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 39
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 27
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 14
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 13
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 11
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 10
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 8
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 7
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 6
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 4
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 229940116357 potassium thiocyanate Drugs 0.000 claims description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 4
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 claims description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 2
- SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N ammonium thiocyanate Chemical compound [NH4+].[S-]C#N SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 2
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 claims 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 abstract description 27
- 239000010703 silicon Substances 0.000 abstract description 27
- -1 silicon anhydride Chemical class 0.000 abstract description 27
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 abstract description 7
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 38
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 7
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 4
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 229910002019 Aerosil® 380 Inorganic materials 0.000 description 3
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 150000003567 thiocyanates Chemical class 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- RXHSGRQJJBSBPN-UHFFFAOYSA-L [Na+].[Na+].Cl.OP([O-])([O-])=O Chemical group [Na+].[Na+].Cl.OP([O-])([O-])=O RXHSGRQJJBSBPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003113 alkalizing effect Effects 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004332 deodorization Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- HDFXRQJQZBPDLF-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].OC([O-])=O.OC([O-])=O HDFXRQJQZBPDLF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229910021424 microcrystalline silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- QSHGUCSTWRSQAF-FJSLEGQWSA-N s-peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 QSHGUCSTWRSQAF-FJSLEGQWSA-N 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Public Health (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Способ предназначен для очистки поверхностного антигена вируса гепатита B, содержащего пре S2 пептид и может быть использован в биотехнологии и иммунологии для приготовления вакцины против гепатита B. Рекомбинантные клетки дрожжей, экспрессирующие поверхностный антиген, разрушают в буфере, содержащем хаотропную соль и ПАВ. Экстракт подщелачивают до pH 11,0-13,5, после чего подкисляют до pH 4,5-6,0. Дальнейшую очистку антигена проводят путем адсорбции на ангидриде кремния, десорбции буфером, содержащим мочевину, и гель-фильтрацией. Способ позволяет уменьшить разрушение антигена протеазами. Вакцина, содержащая пре S2 пептид, активна в отношении различных вариантов вируса гепатита B. 2 с. и 13 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к способу очистки поверхностного антигена вируса гепатита B, содержащего пре S2 пептид; и более конкретно к способу очистки поверхностного антигена вируса гепатита B, содержащего пре S2 пептид из рекомбинантной дрожжевой клетки, который включает стадию разрыва клетки, и где потере пре S2 пептида препятствует использование хаотропной соли, с последующей экстракцией, осаждением, адсорбцией на ангидриде кремния и колоночной хроматографией.
Предпосылки изобретения
Гепатит B является одним из наиболее распространенных в мире заболеваний и считают, что приблизительно 200 - 300 миллионов людей являются носителями вируса гепатита В ("HBV"). Заражение HBV часто развивается в цирроз печени и печеночно-клеточный рак, что может привести к смерти.
Гепатит B является одним из наиболее распространенных в мире заболеваний и считают, что приблизительно 200 - 300 миллионов людей являются носителями вируса гепатита В ("HBV"). Заражение HBV часто развивается в цирроз печени и печеночно-клеточный рак, что может привести к смерти.
До настоящего времени не было получено средство лечения гепатита B, и поэтому было уделено особое внимание получению вакцин.
Blumberg и др. выделили Австралийский антиген из крови больных гепатитом B в 1955 г.; и Krugman и др. опубликовали в 1971 г. метод активной иммунизации, использующий термообработанную сыворотку человека, содержащую HBV, дающий возможность получать вакцины против гепатита B. После этого на рынке появилось первое поколение вакцин против гепатита B, которые готовились отделением и очисткой поверхностного антигена вируса гепатита B (HBsAg) из плазмы крови больных гепатитом B (M.R. Hilleman и др. Develop. Bio. Standart, 54, 3 - 12 (1983)).
Однако вакцины, полученные из плазмы крови, имеют ряд недостатков: их способы очистки и инактивации трудоемки и требуют больших затрат, запасы человеческой крови ограничены и привитый субъект может быть заражен патогенами из источника крови.
Соответственно с тем, чтобы решить упомянутые проблемы, в разработке вакцин против гепатита B пытались применить методы генной инженерии.
Например, Valenguela и др. разработали способ получения HBsAg в дрожжах (Nature, 293, 347 - 350 (1982)). Рекомбинантный HBsAg (r-HBsAg) состоит преимущественно из S белка (P25), имеющего 226 аминокислот, и при очистке он образует частицы поверхностного антигена, которые почти идентичны частицам HBsAg, отделенным от плазмы крови.
K. H. Heermann и др. заявили, что белок вирусной оболочки гепатита B содержит значительные количества L-белка (пре S1 + пре S2 + S : p 39) и M-белка (пре S2 + S : p31), а также S-белок (J. Virol. Nov., 396 - 402 (1984)). Как известно, пре S1 пептид играет важную роль во влиянии вируса гепатита B на печень после его внедрения в человеческое тело. В экспериментах на животных было доказано, что пре S2 пептид, который состоит из 55 аминокислот, помогает образованию антител против поверхностного антигена. (D.R. Milich и др. Proc. Natl. Acad. Sci., США, 82, 8168 - 8172 (1985)).
Кроме того, известно, что антитела, выработанные против пре S2 пептида, демонстрируют защитную активность против вирусной инфекции (Y. Ito и др., Proc. Natl. Acad. Sci., США, 83, 9174 - 9178 (1986)). Поэтому вакцина, содержащая пре S2 пептид, может быть полезна лицу, которое не может вырабатывать антитела против пре - существующего поверхностного антигена. Разработка такой вакцины также важна для защиты против заражения недавно открытыми вариантами вируса гепатита B.
Однако поскольку пре S пептид очень чувствителен к протеазам, присутствующим в дрожжевой клетке, получение поверхностного антигена вируса гепатита B, содержащего пре S пептид, столкнулось с различными трудностями. Чтобы их преодолеть Kobayashi и др. получили вакцину, которая готовится путем генетической модификации чувствительной к протеазе области между пре S2 и S пептидами (J. Bacteriology, 8, 1 - 22(1988)); и патент США N 4742158 раскрывает способ получения вакцины, содержащей пре S пептид, в котором пептид защищен от разрушения протеазой использованием ингибитора протеазы на стадии разрыва клетки. Однако действие генетической модификации Kobayashi и др. на активность пре S2 пептида не было охарактеризовано полностью, и последний способ не представляется практичным, поскольку в способе массовой очистки использовать ингибиторы протеазы слишком дорого. Кроме того, уровень пре S2 пептида нельзя сохранить за пределами определенного количества независимо от количества добавляемых ингибиторов протеазы, если время очистки увеличивается по мере увеличения масштаба очистки или повышения требований.
Европейский патент N 0337492 A1 предлагает способ очистки HBsAg от культуры Pichia с использованием тиоцианата калия. Тиоцианат калия используется для увеличения выхода липофильных белков, и весь способ направлен на очистку HBsAg, содержащего только S пептид. Если HBsAg еще содержит пре S2 пептид, состоящий из 55 аминокислот перед S пептидом, состоящим из 226 аминокислот, он обладает иммунологическими свойствами, напоминающими свойства поверхностного антигена, содержащего только S пептид, поскольку антигенность и иммуногенность S-пептидной половины одинаковы. Однако два поверхностные антигена очень различны по своим физико-химическим свойствам. В частности, пре S2 пептид достаточно гидрофилен при расположении на поверхности антигенной частицы и, следовательно, имеет важное влияние на процесс очистки.
Поэтому были разработаны различные способы очистки поверхностного антигена вируса гепатита B, содержащего пре S2 пептид.
Европейский патент N 0130178 A1 описывает способ очистки HBsAg, содержащего пре S2 пептид, который характеризуется отделением поверхностного антигена использованием двух жидких фаз, которые готовятся добавлением подходящего количества декстрана и гликоля к дрожжевому экстракту. Однако этот способ не снимает проблем, которые заключаются в том, что отделенный поверхностный антиген недостаточно чист, он не пригоден для процесса очистки в большом масштабе, так как декстран и полиэтиленгликоль дороги, и он не экономичен, поскольку требуется дополнительная процедура для удаления используемого ПАВ.
В патенте США N 4 742 158 предлагается способ очистки HBsAg, содержащего пре S2 пептид, который включает подготовку дрожжевого экстракта при наличии различных ингибиторов протеазы и очистку из него поверхностного антигена серией стадий колоночно-хроматографического отделения с использованием аффинной колонны, в которой полимер альбумина человеческой сыворотки прикреплен к гелевой матрице, а также гидрофобной колонны с элюированием ПАВ. Однако этот способ также имеет ряд недостатков: используемые в способе ингибиторы протеазы являются очень дорогостоящими, аффинная колонна не пригодна для очистки в промышленных масштабах и требуется специальная операция для удаления ПАВ, используемого в гидрофобной колоночной хроматографии.
M. Kobayashi и др. предложили также способ очистки HBsAg, содержащего пре S2 пептид (J. Biotechnology 8, 1 - 22 (1988). Однако этот способ не пригоден для очистки в промышленных масштабах, так как используют иммуноаффинную колонну, которая дает низкий выход.
В патенте Кореи N 065 305 описывается способ очистки HBsAg, который включает pH преципитацию и колоночные хроматографии на ангидриде кремния и анионном обмене. Этот способ имеет недостаток в том, что трудно поддерживать содержание пре S2 пептида на нужном уровне, так как на первоначальной стадии способа пре S2 пептид переваривается протеазами.
Поэтому существует необходимость эффективного способа очистки HBsAg, содержащего пре S2 пептид.
Сущность изобретения
Основной задачей изобретения является обеспечение способа очистки поверхностного антигена вируса гепатита B, содержащего пре S2 пептид, из дрожжевой клетки в достаточно чистом виде, позволяющей непосредственно его ввести в вакцину.
Основной задачей изобретения является обеспечение способа очистки поверхностного антигена вируса гепатита B, содержащего пре S2 пептид, из дрожжевой клетки в достаточно чистом виде, позволяющей непосредственно его ввести в вакцину.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предлагается способ очистки поверхностного антигена вируса гепатита B, содержащего пре S пептид, который экспрессирован в рекомбинантном организме, и способ отличается тем, что клетки рекомбинантного организма разрываются с использованием буфера, содержащего хаотропную соль.
Краткое описание чертежей
Вышеупомянутая и другие задачи настоящего изобретения и его особенностей будут очевидны из следующего описания изобретения и чертежа, на котором
показан результат электрофореза в 15% додецилсульфате натрия полиакриламидном геле (SDS - PAGE), который подтверждает содержание пре S2 пептида в HBsAg, когда поверхностный антиген, содержащий преS2 пептид, очищается в присутствии тиоцианата натрия в качестве хаотропной соли.
Вышеупомянутая и другие задачи настоящего изобретения и его особенностей будут очевидны из следующего описания изобретения и чертежа, на котором
показан результат электрофореза в 15% додецилсульфате натрия полиакриламидном геле (SDS - PAGE), который подтверждает содержание пре S2 пептида в HBsAg, когда поверхностный антиген, содержащий преS2 пептид, очищается в присутствии тиоцианата натрия в качестве хаотропной соли.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение предусматривает способ очистки поверхностного антигена вируса гепатита B, содержащего пре S2 пептид, экспрессированный в рекомбинантном организме, при этом способ характеризуется тем, что клетки рекомбинантного организма разрываются с использованием буфера, включающего хаотропную соль, с тем, чтобы свести к минимуму потерю пре S2 пептида. Использование буфера, содержащего хаотропную соль для разрыва клеток, способствует образованию частиц HBsAg и защищает пре S2 пептид от действия протеазы, которое обычно имеет место на первоначальной стадии очистки, что сохраняет пре S2 пептида на постоянном уровне до завершения процесса очистки.
Настоящее изобретение предусматривает способ очистки поверхностного антигена вируса гепатита B, содержащего пре S2 пептид, экспрессированный в рекомбинантном организме, при этом способ характеризуется тем, что клетки рекомбинантного организма разрываются с использованием буфера, включающего хаотропную соль, с тем, чтобы свести к минимуму потерю пре S2 пептида. Использование буфера, содержащего хаотропную соль для разрыва клеток, способствует образованию частиц HBsAg и защищает пре S2 пептид от действия протеазы, которое обычно имеет место на первоначальной стадии очистки, что сохраняет пре S2 пептида на постоянном уровне до завершения процесса очистки.
Способ настоящего изобретения можно применять к способу очистки HBsAg, который продуцируется в любом из подходящих рекомбинантных организмов, предпочтительно рекомбинантной дрожжевой клетке, например Saccharomyces cerevisiae.
Подходящие хаотропные соли, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают тиоцианат натрия, тиоцианат калия, тиоцианат аммония, гуанидий гидрохлорид и мочевину, при этом лучше всего использовать тиоцианат натрия.
Для разрушения клетки в способе изобретения приемлема любая традиционная буферная система, например фосфатный буфер и Трис буфер, pH предпочтителен в диапазоне от 6 до 8. Концентрация хаотропной соли в буфере может составлять от 1 до 8 М, лучше от 1 до 3 М.
Когда рекомбинантная клетка разрывается с использованием буфера, содержащего хаотропную соль, как описано выше, остальной процесс очистки можно проводить, используя любую комбинацию стадий традиционной очистки, хотя предпочтительный вариант включает следующие стадии:
а) добавление ПАВ к клеточному гомогенату рекомбинантных клеток для экстракции поверхностного антигена из мембран клеток;
б) повышение растворимости и ускорение образования частиц поверхностного антигена в экстракте, полученном в стадии а) подщелачиванием экстракта;
в) осаждение и удаление остатков клеток, липидов и примесей белков и экстракта, обработанного на стадии б), окислением и затем центрифугированием экстракта, чтобы получить раствор, содержащий поверхностный антиген;
г) взаимодействие раствора, полученного на стадии в), с ангидридом кремния для адсорбции поверхностного антигена на нем, вымывания примесей белков и десорбции поверхностного антигена из ангидрида кремния с использованием буфера для получения фракции очищенного поверхностного антигена;
д) проведение гидрофобной колоночной хроматографии фракции очищенного поверхностного антигена, полученного на стадии г), для получения фракций, содержащих поверхностный антиген; и
е) очистка фракций, полученных на стадии д) гель-фильтрационной хроматографией, методом молекулярных сит с получением поверхностного антигена в чистом виде.
а) добавление ПАВ к клеточному гомогенату рекомбинантных клеток для экстракции поверхностного антигена из мембран клеток;
б) повышение растворимости и ускорение образования частиц поверхностного антигена в экстракте, полученном в стадии а) подщелачиванием экстракта;
в) осаждение и удаление остатков клеток, липидов и примесей белков и экстракта, обработанного на стадии б), окислением и затем центрифугированием экстракта, чтобы получить раствор, содержащий поверхностный антиген;
г) взаимодействие раствора, полученного на стадии в), с ангидридом кремния для адсорбции поверхностного антигена на нем, вымывания примесей белков и десорбции поверхностного антигена из ангидрида кремния с использованием буфера для получения фракции очищенного поверхностного антигена;
д) проведение гидрофобной колоночной хроматографии фракции очищенного поверхностного антигена, полученного на стадии г), для получения фракций, содержащих поверхностный антиген; и
е) очистка фракций, полученных на стадии д) гель-фильтрационной хроматографией, методом молекулярных сит с получением поверхностного антигена в чистом виде.
Примеры ПАВ, которые могут использоваться на стадии а) для экстракции поверхностного антигена из клеточной мембраны, включают: Твин 20, Твин 80, Тритон X-100 и деоксихолат натрия, предпочтительно Твин 20. ПАВ может использоваться в количестве от 0,1 до 0,5% (вес/об.), предпочтительно от 0,1 до 0,2% (вес/об.) от количества клеточного гомогената.
Чтобы повысить растворимость поверхностного антигена в клеточном гомогенате и улучшить образование его частиц, рекомендуется повысить pH экстракта поверхностного антигена до 11,0 - 13,5 использованием основания - предпочтительно гидроксида натрия и гидроксида калия. Этот процесс подщелачивания способствует образованию частиц HBsAg за счет увеличения межмолекулярной дисульфидной связи и диссоциации примесей белков от HB sAg в результате повышенной растворимости. После этого экстракту лучше дать выстояться при температуре от 0 до 30oC в течение 0,5 - 1,0 часа.
Затем экстракт подкисляют для осаждения остатков клеток, липидов и примесей белков, при этом pH экстракта доводят до 4,5 - 6,0. На этой стадии можно использовать любую из неорганических или органических кислот, хотя предпочтителен 10 - 30% раствор уксусной кислоты. Реакцию подкисления можно проводить при температуре от 0 до 30o в течение времени от 0,5 до 2 часов, лучше с перемешиванием. Подкисленный экстракт центрифугируется для удаления полученных осадков и получения надосадочной жидкости, содержащей поверхностный антиген. Преимущество этого процесса заключается в том, что одна стадия обычного центрифугирования удаляет одновременно остатки клеток, липида и примеси белков, при этом выход поверхностного антигена высок благодаря предшествующей стадии растворения поверхностного антигена при высоких значениях pH.
Повышение и затем снижение pH клеточного экстракта стабилизирует образование частиц поверхностного антигена и является очень эффективным для удаления липидов и примесей белков.
Однако, когда на стадии разрыва клеток используется тиоцианат в качестве хаотропной соли, во время окисления может выделяться неприятный запах. Сама соль тиоцианата представляет собой безвредное соединение без цвета и запаха, и ион тиоцианата достаточно стабилен в растворе. Поэтому можно считать, что запах, появляющийся на стадии окисления, возникает от реакций тиоцианата с некоторыми веществами в клеточном экстракте. В случае очистки в небольшом количестве оператор может перенести этот запах, но при работе с большими масштабами желательно удалить тиоцианат до стадии окисления.
Например, тиоцианат можно удалить добавлением подходящей соли к клеточному экстракту для осаждения соли тиоцианата вместе с некоторыми примесями белков непосредственно после стадии а) удалением осадков, например центрифугированием, и диафильтрацией полученного надосадочного слоя жидкости. Поверхностный антиген не осаждается во время этого процесса. Кроме того, удаление тиоцианата проводится параллельно с удалением части примесей белков, что облегчает процессы дальнейшей очистки.
Предпочтительные соли, которые можно применять при дезодорации, это соли многозарядных ионов, например сульфат натрия и сульфат аммония в концентрации от 8 до 15% (вес/об.). После экстракции поверхностного антигена из клеточной мембраны добавляется соль, и реакция протекает при комнатной температуре в течение 0,5 - 2 часов при перемешивании или без него. Полученные осадки можно удалить традиционным методом, скажем центрифугированием, чтобы получить надосадочную жидкость, содержащую поверхностный антиген. Полученная надосадочная жидкость подвергается повторным процессам диафильтрации для удаления тиоцианата и сульфата. Буфер, используемый на этой стадии, предпочтительно имеет pH от 6 до 8. Когда стадии солевой обработки, центрифугирования и диафильтрации завершены, полученная надосадочная жидкость подвергается способам стадий б) и в).
Надосадочная жидкость, полученная в стадии в), которая содержит поверхностный антиген, обрабатывается ангидридом кремния с использованием колонного или периодического процесса, при этом предпочитается периодический процесс. Приемлемым ангидридом кремния для использования в этой стадии является микрокристаллический ангидрид кремния с площадью поверхности от 100 до 500 м2/г, и желательно использовать Aerosil 380 (Degussa, Германия). Надосадочная жидкость, содержащая поверхностный антиген, контактирует с суспензией ангидрида кремния при pH от 6 до 8 и температуре от 4 до 30oC в течение 2 - 16 часов с энергичным перемешиванием. Количество осушенного ангидрида кремния для адсорбции поверхностного антигена составляет предпочтительно около 5% (вес/вес) от веса клеточного осадка. Комплекс поверхностный антиген-ангидрид кремния выделяется из раствора традиционным способом, например центрифугированием.
После этого комплекс промывается, например, три раза буфером с pH от 6 до 8, предпочтительным буфером является фосфат натрия - хлорид натрия для удаления остаточных примесей из ангидрида кремния. Поверхностный антиген можно десорбировать из ангидрида кремния взаимодействием комплекса с подходящим буфером в течение приблизительно 2 часов. На этой стадии можно использовать буфер с pH от 8,8 до 11,0, желательно буфер карбоната натрия - бикарбоната натрия. Буфер может также содержать мочевину в концентрации от 1 до 8 М и ПАВ, желательно деоксихолат натрия, в концентрации от 0.1 до 0.3 вес.%. Затем ангидрид кремния извлекается из раствора традиционным способом, например центрифугированием, чтобы получить надосадочную жидкость, содержащую поверхностный антиген. Однако, когда на стадии десорбции используется диоксихолат натрия, необходимо удалить его повторной диафильтрацией.
Надосадочная жидкость, полученная выше, которая содержит поверхностный антиген, может затем очищаться гидрофобной колоночной хроматографией, в которой гидрофобной смолой является предпочтительно агарозный гель с остатками фенила. До внесения надосадочной жидкости материал заполнения, т.е. гидрофобная смола уравновешивается буфером, pH которого от 8,8 до 11,0, и который может быть аналогичным описанным в предшествующей стадии. Буфер может содержать мочевину в концентрации от 1 до 4 М, чтобы максимально удалить примеси белков, которые менее гидрофобны, чем поверхностный антиген.
Затем надосадочная жидкость, содержащая поверхностный антиген, пропускается через колонну и контактирует в ней с заполняющим материалом. Колонна тщательно промывается уравновешивающим буфером, содержащим 10 - 40 вес.% этиленгликоля, чтобы удалить относительно слабо адсорбированные примеси белков из заполняющего материала. Затем поверхностный антиген, связанный с гидрофобной смолой, элюируется уравновешивающим буфером, содержащим 60 - 80% этиленгликоля.
Эта гидрофобная колоночная хроматография представляет собой очень эффективную стадию очистки, в которой большая часть оставшихся примесей в надосадочной жидкости после стадии адсорбции ангидридом кремния удаляется. В частности, пирогенные материалы, которые трудно удалить традиционным способом, можно извлечь на этой стадии. Мочевину и этиленгликоль, которые остаются во фракциях, содержащих поверхностный антиген, можно удалить, например, диализом или повторной диафильтрацией, в которых желательно использовать буфер с pH от 6 до 8.
Фракции, содержащие поверхностный антиген, полученные из гидрофобной колоночной хроматографии, далее очищаются гель-фильтрационной хроматографией методом молекулярных сит до такой степени, что очищенный антиген можно использовать в приготовлении вакцины.
Иллюстративные полярные матрицы, которые можно использовать в качестве заполняющего колонну материала, включают, например, агарозный гель, декстрановый гель и полиакриламидный гель с пределом эксклюзии по меньшей мере 1 000 000, предпочтительным интервалом фракционирования является от 5 000 до 500 000. Гель-фильтрационная хроматография методом молекулярных сит проводится пропусканием фракций, содержащих поверхностный антиген, через колонку, уравновешенную Трис или фосфатным буфером с pH от 6 до 8, который содержит хлорид натрия в концентрации от 0,1 до 0,2 М и элюированием поверхностного антигена тем же буфером.
Фракции, содержащие поверхностный антиген, соединяются вместе, и чистота поверхностного антигена и пре S2 пептида, содержащегося в нем, определяется SDS-PAGS. Результаты различных экспериментов, описанных в последующих примерах, свидетельствуют о высокой чистоте поверхностного антигена, очищенного способом настоящего изобретения, и высоком содержании в нем пре S2 пептида для возможности непосредственного использования очищенного антигена в приготовлении вакцины.
Приведенные ниже примеры иллюстрируют настоящее изобретение, не ограничивая его объем.
Кроме того, указанные ниже процентные величины для твердых веществ и твердой смеси, жидких в жидкой и твердых в жидкой, представляют собой соотношения вес/вес, об./об. и вес/об.
Пример 1
(Стадия 1) Разрушение дрожжевой клетки
Рекомбинантные клетки Saccharamyces cerevisiae KCTC 0098BP, которые способны экспрессировать поверхностный антиген гепатита B, содержащий пре S2 пептид, культивируют при 27oC в 30 л среды YEPD (1% дрожжевой экстракт, 2% дрожжевой пептон, 1,6% глюкоза). 70 г полученной таким образом дрожжевой клеточной массы смешивают со 140 мл буфера 1/50 мМ Трис, pH 7,2, 1 М тиоцианат натрия, 0,15 М хлорид натрия, 10 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), и смесь помещают в контейнер для размельчения (Biospec Products, OKLA, США), содержащий 210 мл стеклянных шариков с диаметром 0,5 мм.
(Стадия 1) Разрушение дрожжевой клетки
Рекомбинантные клетки Saccharamyces cerevisiae KCTC 0098BP, которые способны экспрессировать поверхностный антиген гепатита B, содержащий пре S2 пептид, культивируют при 27oC в 30 л среды YEPD (1% дрожжевой экстракт, 2% дрожжевой пептон, 1,6% глюкоза). 70 г полученной таким образом дрожжевой клеточной массы смешивают со 140 мл буфера 1/50 мМ Трис, pH 7,2, 1 М тиоцианат натрия, 0,15 М хлорид натрия, 10 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), и смесь помещают в контейнер для размельчения (Biospec Products, OKLA, США), содержащий 210 мл стеклянных шариков с диаметром 0,5 мм.
Контейнер погружают в ледяную воду и мешалку включают 3 раза по 5 минут с интервалом 15 минут. Полученный клеточный гомогенат отделяют от стеклянных шариков, промывают их 210 мл буфера 1 и промывочный раствор объединяют с клеточным гомогенатом.
(Стадия 2) Экстракция и растворение поверхностного антигена
К клеточному гомогенату, полученному в (Стадии 1), добавляют 0,1% (вес/об.) Твин 20 и смесь перемешивают при комнатной температуре 2 часа.
К клеточному гомогенату, полученному в (Стадии 1), добавляют 0,1% (вес/об.) Твин 20 и смесь перемешивают при комнатной температуре 2 часа.
pH раствора доводят до 11,5 добавлением 5N гидроксида натрия и перемешивают его при комнатной температуре 1 час. pH полученного раствора доводят до 5,2 добавлением 20% уксусной кислоты, перемешивают его при комнатной температуре 30 минут и затем оставляют на 30 минут.
Раствор центрифугируют при 8oC для удаления клеточных остатков вместе с осадками.
pH надосадочной жидкости, содержащей поверхностный антиген, доводят до 7,2 добавлением 5N гидроксида натрия. В этот момент объем надосадочной жидкости составляет около 300 мл.
(Стадия 3) Адсорбция и десорбция с использованием ангидрида кремния.
Высушенный ангидрид кремния смешивают с водой с получением 5% суспензии (сухой вес/объем суспензии) к надосадочной жидкости, полученной в (Стадии 2), добавляют 70 мл этой суспензии и смесь перемешивают при комнатной температуре 2 часа. Полученный раствор центрифугируют со скоростью 5,500 об/мин 10 минут для удаления надосадочного слоя жидкости и полученный ангидрид кремния, на котором адсорбировался поверхностный антиген, промывают два раза фосфатным буфером (pH 7,2), содержащим 0,15 М хлорид натрия.
Промытый ангидрид кремния вносят в 70 мл 50 мМ карбонатного буфера (pH 9,5), содержащего 1 М мочевину, и смесь перемешивают при комнатной температуре 1 час с целью десорбции поверхностного антигена из ангидрида кремния. При этом pH буфера составляет 9,2. Раствор центрифугируют (ротор Beckman JA 14) со скоростью 12,000 об/мин в течение 30 минут с получением надосадочной жидкости, содержащей поверхностный антиген.
Количество поверхностного антигена вируса гепатита B в надосадочной жидкости составляет около 6,5 мг при измерении оборудованием (набором) Auqyme (Abbott, США).
Сравнительный пример
Повторяют те же процедуры, что в примере 1, за исключением того, что тиоцианат натрия не включают в буфер 1, чтобы получить раствор очищенного поверхностного антигена. В результате количество поверхностного антигена вируса гепатита B в надосадочной жидкости при измерении набором Auqyme составляет 7,1 мг.
Повторяют те же процедуры, что в примере 1, за исключением того, что тиоцианат натрия не включают в буфер 1, чтобы получить раствор очищенного поверхностного антигена. В результате количество поверхностного антигена вируса гепатита B в надосадочной жидкости при измерении набором Auqyme составляет 7,1 мг.
Растворы поверхностного антигена, полученные в примере и сравнительном примере, подвергают электрофорезу в 15% додецилсульфате натрия-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) с последующим окрашиванием серебром. Результат показан на чертеже, на котором колонки 1 и 2 представляют растворы поверхностного антигена, полученные в примере 1 и сравнительном примере соответственно. Здесь A показывает полосу интактного белка; и B и C - фрагменты белка в результате разрушения протеазой.
Как показано на чертеже, поверхностный антиген с высоким содержанием пре S2 пептида, можно очистить из дрожжевых клеток в соответствии со способом настоящего изобретения, и выход его будет высоким.
Пример 2
(Стадия 1) Разрушение дрожжевой клетки
Рекомбинантные клетки Saccharomyces cerevisiae KCTC 0098BP, способные экспрессировать поверхностный антиген гепатита B, содержащие пре S2 пептид, культивируют при 27oC в 300 л среды YEPD. 3 кг полученной таким образом дрожжевой клеточной массы смешивают с 6 л буфера 1 и смесь дважды пропускают через Dynomill (Glenmills, Япония), содержащую 3 л стеклянных шариков диаметром 0,5 мм при 10oC со скоростью протока 650 мл/мин для разрушения дрожжевых клеток.
(Стадия 1) Разрушение дрожжевой клетки
Рекомбинантные клетки Saccharomyces cerevisiae KCTC 0098BP, способные экспрессировать поверхностный антиген гепатита B, содержащие пре S2 пептид, культивируют при 27oC в 300 л среды YEPD. 3 кг полученной таким образом дрожжевой клеточной массы смешивают с 6 л буфера 1 и смесь дважды пропускают через Dynomill (Glenmills, Япония), содержащую 3 л стеклянных шариков диаметром 0,5 мм при 10oC со скоростью протока 650 мл/мин для разрушения дрожжевых клеток.
Полученный клеточный гомогенат отделяют от стеклянных шариков, стеклянные шарики промывают 9 л буфера 1 и промывочный раствор объединяют с клеточным гомогенатом. При измерении набором Augyme количество HBsAg в надосадочной жидкости составило около 754 мг.
(Стадия 2) Экстракция и растворение поверхностного антигена
К клеточному гомогенату, полученному в (Стадии 1), добавляют 0,1% (вес. /об.) Твин 20 и смесь перемешивают при комнатной температуре 2 часа.
К клеточному гомогенату, полученному в (Стадии 1), добавляют 0,1% (вес. /об.) Твин 20 и смесь перемешивают при комнатной температуре 2 часа.
pH раствора доводят до 11,5 добавлением 5N гидроксида натрия и перемешивают при комнатной температуре 1 час. pH полученного раствора затем доводят до 5,2 добавлением 20% уксусной кислоты, перемешивают при комнатной температуре 30 минут и затем оставляют на 30 минут.
Раствор центрифугируют при 8oC для удаления клеточных остатков вместе с осадками.
pH надосадочной жидкости, содержащей поверхностный антиген, доводят до 7,2 добавлением 5N гидроксида натрия. В результате окончательный объем надосадочной жидкости составляет около 12 л и количество HBsAg в надосадочной жидкости - около 1,250 мг при измерении набором Augyme.
Выход поверхностного антигена составил 165,8% от количества поверхностного антигена, определенного в (Стадии 1). Этот неожиданно высокий выход имел место в основном благодаря комбинированным действиям ПАВ и щелочи, что повысило антигенность и способствовало растворимости поверхностного антигена.
(Стадия 3) Адсорбция и десорбция с использованием ангидрида кремния
Надосадочную жидкость, полученную на (Стадии 2), разбавляют двойным объемом 0,15 М хлорида натрия и затем адсорбируют на ангидриде кремния (Aerosil 380) в соответствии со следующей методикой. В осушенный ангидрид кремния добавляют воду для получения 10% суспензии (сухой вес/объем суспензии), 1,5 л которой добавляют к надосадочной жидкости, полученной в (Стадии 2), и смесь перемешивают при 4oC всю ночь.
Надосадочную жидкость, полученную на (Стадии 2), разбавляют двойным объемом 0,15 М хлорида натрия и затем адсорбируют на ангидриде кремния (Aerosil 380) в соответствии со следующей методикой. В осушенный ангидрид кремния добавляют воду для получения 10% суспензии (сухой вес/объем суспензии), 1,5 л которой добавляют к надосадочной жидкости, полученной в (Стадии 2), и смесь перемешивают при 4oC всю ночь.
Полученный раствор центрифугируют со скоростью 5,500 об/мин 10 минут для удаления надосадочной жидкости и осажденный ангидрид кремния, на котором адсорбировался поверхностный антиген, промывают дважды фосфатным буфером (pH 7,2), содержащим 0,15 М хлорид натрия.
Промытый ангидрид кремния добавляют к 3 л 50 мМ карбонатного буфера (pH 9,5), содержащего 1 М мочевину, и смесь перемешивают при комнатной температуре 2 часа, чтобы десорбировать поверхностный антиген из ангидрида кремния. В этот момент pH буфера составляет 9,2. Раствор центрифугируют со скоростью 8,700 об/мин 30 минут для получения надосадочной жидкости, содержащей поверхностный антиген.
При измерении набором Augyme количество HBsAg в надосадочной жидкости составило около 895 мг (выход: 118,7%).
(Стадия 4) Гидрофобная колоночная хроматография
К надосадочной жидкости, полученной в (Стадии 3), содержащей поверхностный антиген, добавляют мочевину до окончательной концентрации в 4 М и полученный раствор пропускают через фенил-агарозную колонку, уравновешенную 50 мМ карбонатным буфером (pH 9,2), содержащим 4 М мочевину. Колонку промывают тем же буфером, содержащим 20% этиленгликоль; затем тот же буфер, содержащий 60% этиленгликоль, добавлялся к колонке для элюирования поверхностного антигена.
К надосадочной жидкости, полученной в (Стадии 3), содержащей поверхностный антиген, добавляют мочевину до окончательной концентрации в 4 М и полученный раствор пропускают через фенил-агарозную колонку, уравновешенную 50 мМ карбонатным буфером (pH 9,2), содержащим 4 М мочевину. Колонку промывают тем же буфером, содержащим 20% этиленгликоль; затем тот же буфер, содержащий 60% этиленгликоль, добавлялся к колонке для элюирования поверхностного антигена.
Элюированные фракции, содержащие поверхностный антиген, объединяют и фильтруют с помощью диафильтрационной системы Amicon (Amicon, США) с молекулярной величиной отсечения 100,000, чтобы удалить мочевину и этиленгликоль в элюате, и полученный фильтрат концентрируют с использованием той же системы.
Количество HBsAg в фильтрате составило около 546 мг при измерении набором Augyme (выход: 72,4%).
(Стадия 5) Гель-фильтрационная хроматография 8 л Sepharose CL - 4B (Pharmacia, США) погружают в колонку и уравновешивают ее фосфатным буфером (pH 7,2), содержащим 0,15 М хлорид натрия. Концентрат, содержащий поверхностный антиген, который был получен в (Стадии 4), пропускают через колонку и элюируют тем же буфером с получением фракций, содержащих поверхностный антиген.
Количество HBsAg (включающего и интактный антиген, и его фрагменты, подвергшиеся разрушению протеазой) в объединенных фракциях составило приблизительно 540 мг при измерении набором Augyme (выход: 71,6%), и чистота поверхностного антигена была около 98,2%. При измерении SDS-PAGE содержание пре S2 пептида в общем количестве поверхностного антигена составило около 75%. Раствор очищенного поверхностного антигена, полученного таким образом, фильтруют через фильтр в 0,2 мк (Corning, США), и фильтрат хранят при 4oC.
Пример 3
(Стадия 1) Разрушение дрожжевой клетки.
(Стадия 1) Разрушение дрожжевой клетки.
Рекомбинантные клетки Saccharomyces cerevisiae КСТС 0098ВР культивируют при 27oC в 300 л среды YEPD, 4 кг полученной дрожжевой клеточной массы смешивают с 8 л буфера 1 и смесь пропускают дважды через Dynomill (Glenmills, Япония), содержащую 3 л стеклянных шариков с диаметром 0,5 мм при 10oC со скоростью протока 650 мл/мин, чтобы разрушить дрожжевые клетки.
Полученный клеточный гомогенат отделяют от стеклянных шариков, промывают их 12 л буфера 1 и промывочный раствор объединяют с клеточным гомогенатом.
(Стадия 2) Экстракция и растворение поверхностного антигена.
К клеточному гомогенату, полученному в (Стадии 1), добавляют 0,1% (вес/об.) Твин 20 и смесь перемешивают при комнатной температуре 2 часа.
К раствору добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до окончательной концентрации в 10% и смесь перемешивают при комнатной температуре 1 час. Полученный раствор центрифугируют при 8oC для удаления остатков клеток вместе с осадками.
Надосадочную жидкость отфильтровывают с помощью диафильтрационной системы Amicon (Amicon, США) с молекулярной величиной отсечения 100,000 с использованием 20 мМ Трис буфера (pH 7,5) с целью удаления тиоцианата и сульфата натрия в ней и затем концентрируют с использованием той же системы до окончательного объема, равного 6 л.
pH концентрата доводят до 11,5 добавлением 5N гидроксида натрия и перемешивают при комнатной температуре 1 час. pH полученного раствора доводят до 5,2 постепенным добавлением 20% уксусной кислоты, перемешивают при комнатной температуре 30 минут и затем оставляют на 30 минут. Раствор центрифугируют при 8oC для удаления остатков клеток вместе с осадками.
pH надосадочной жидкости доводят до 7,2 добавлением 5N гидроксида натрия, и при измерении набором Augyme количество HBsAg в ней составило около 1,400 мг.
(Стадия 3) Адсорбция и десорбция с использованием ангидрида кремния.
Надосадочную жидкость, полученную на (Стадии 2), адсорбируют на ангидриде кремния (Aerosil 380) в соответствии со следующей методикой. Осушенный ангидрид кремния смешивают с водой с получением 10% суспензии (сухой вес/объем суспензии), 2 л суспензии добавляют к надосадочной жидкости, полученной в (Стадии 2), и смесь перемешивают при 4oC всю ночь.
Полученный раствор центрифугируют со скоростью 5,500 об/мин 10 минут для удаления надосадочной жидкости и осажденный ангидрид кремния, на котором адсорбировался поверхностный антиген, промывают дважды фосфатным буфером (pH 7,2), содержащим 0,15 М хлорид натрия.
Промытый ангидрид кремния добавляют к 4 л 50 мМ карбонатного буфера (pH 9,5), содержащего 1 М мочевину, и смесь перемешивают при комнатной температуре 2 часа для десорбции поверхностного антигена с ангидрида кремния. В этот момент величина pH буфера равна 9,2. Раствор центрифугируют с скоростью 8,700 об/мин с получением надосадочной жидкости, содержащей поверхностный антиген.
При измерении набором Augyme количество HBsAg в надосадочной жидкости составило около 840 мг.
(Стадия 4) Гидрофобная колоночная хроматография.
К надосадочной жидкости, полученной в (Стадии 3), содержащей поверхностный антиген, добавляют мочевину до окончательной концентрации в 4 М, и полученный раствор пропускают через фенил-агарозную колонку, уравновешенную 50 мМ карбонатным буфером (pH 9,2), содержащим 4 М мочевину. Колонку промывают тем же буфером, содержащим 20% этиленгликоль; затем тот же буфер, содержащий 60% этиленгликоль, вносят в колонку для элюирования поверхностного антигена.
Элюированные фракции, содержащие поверхностный антиген, объединяют и фильтруют с помощью дифракционной системы Amicon (Amicon, США) с молекулярной величиной отсечения 100,000, чтобы удалить мочевину и этиленгликоль в элюате, и полученный фильтрат концентрируют с использованием той же системы.
При измерении набором Augyme количество HBsAg в фильтрате составило около 527 мг.
(Стадия 5) Гель-фильтрационная хроматография
8 л Sepharose CL-4B (Pharmacia, США) помещают в колонку и уравновешивают фосфатным буфером (pH 7,2), содержащим 0,15 М хлорид натрия. Концентрат, содержащий поверхностный антиген, который был получен в Стадии 4, пропускают через колонку и элюируют тем же буфером для получения фракций, содержащих поверхностный антиген.
8 л Sepharose CL-4B (Pharmacia, США) помещают в колонку и уравновешивают фосфатным буфером (pH 7,2), содержащим 0,15 М хлорид натрия. Концентрат, содержащий поверхностный антиген, который был получен в Стадии 4, пропускают через колонку и элюируют тем же буфером для получения фракций, содержащих поверхностный антиген.
Количество поверхностного антигена вируса гепатита B в объединенных фракциях составило около 480 мг при измерении набором Augyme, в чистота поверхностного антигена была около 98,8%. При измерении SDS-PAGE содержание пре S2 пептида в общем количестве поверхностного антигена составило около 75%. Раствор очищенного поверхностного антигена, полученный таким образом, фильтруют через фильтрат в 0,2 мк (Corning, США) и фильтрат хранят при 4oC.
Пример 4.
Иммуногенность S и пре S2 пептидов в поверхностных антигенах, полученных в примерах 2 и 3 (далее упоминаются как "поверхностный антиген 2" или "поверхностный антиген 3"), подтверждалась следующими экспериментами, в которых использовались морские свинки.
1 мл (200 мкг/мл) поверхностного антигена 2 или 3 добавляют к 18 мл фосфатного буфера (pH 7,2), содержащего 0,15 М хлорид натрия и смесь фильтруют через фильтрующий шприц в 0,2 мк. Фильтрат вносят в 1 мл 3% алгидро-геля (Superfos, Biosector, Дания). Указанную процедуру проводят в асептических условиях.
Каждой из 11 морских свинок весом около 350 г подкожно вводят 1 мл композиции поверхностного антигена 2 или 3, приготовленной выше, инъекции делают дважды с интервалом в 15 дней. После 30 дней со дня первой инъекции кровь каждой морской свинки берут на анализ и получают из нее сыворотку. При анализе сыворотки набором Ausab (Abbott, США) показатели продуцирования антител против S пептидов поверхностного антигена 2 или 3 составили 100%, геометрические значения титров (GMT) поверхностного антигена 2 и 3 составили 33,38 и 29,77 мИЕ/мл соответственно.
Показатель продуцирования антител против пре S2 пептида определяют в соответствии со следующей процедурой. 50 мкл (1 мг/мл) пре S2 пептида, имеющего N-концевые 26 аминокислот, которые синтезировались синтезатором пептида (Applied Biosystems, США) с использованием автоматизированного твердофазного синтеза пептидов, и 20 мкл (10 мг/мл) поли L-лизина добавляют к 200 мкл 50 мМ ацетатного буфера (pH 4,5). В смесь вносят 10 мкл 1% EDC (1-этил-3-(3-диметил-аминопропил)карбодиимида), реакцию проводят при 37oC в течение 1 часа. Затем ее разбавляют 20 мл 10 мМ карбонатного буфера (pH 9,6) и наносят на лунки 96-луночного ELISA планшета в количестве 200 мкл/лунку. Планшет инкубируют при комнатной температуре 20 часов, позволяя адсорбироваться пептиду на поверхности лунки, и затем промывают 3 раза дистиллированной водой.
PBS (физиологический раствор с фосфатным буфером), содержащий 0,5% казеина, наносят на лунки в количестве 250 мкл/лунку; и планшет инкубируют при комнатной температуре более 2 часов с тем, чтобы исключить любые неспецифические реакции, которые могли бы иметь место позднее. В каждую лунку довносят положительные и отрицательные контрольные растворы и 200 мкл серийно разбавленных в 10 раз PBS сыворотки каждой морской свинки (экспериментальная группа). Планшет инкубируют при комнатной температуре 4 часа и затем промывают 5 раз буфером TTBS (0,9% хлорид натрия, 0,05% Твин 20, 10 мМ Трис, pH 7,5). Раствор, содержащий свиное антитело к антителу морской свинки, помеченное пероксидазой хрена обыкновенного (HRP), разбавленный 4000-кратным объемом PBS, содержащим 0,5% казеина, наносят на лунки в количестве 200 мкл/лунку. Планшет инкубируют при 37oC 1 час и промывают 5 раз буфером TTBS.
После этого к каждой лунке добавляют 200 мкл раствора, являющегося субстратом для пероксидазы хрена обыкновенного, который готовят растворением 200 мкг тетраметилбензидина (ТМВ) в 20 мкл ДМСО, добавлением 10 мл 0,1 М ацетатного буфера (pH 5,1) и 20 мкл 30% перекиси водорода и доведением объема раствора до 20 мл добавлением дистиллированной воды. Реакцию ведут до появления цвета. Затем к каждой лунке добавляют 50 мкл 1N серной кислоты, чтобы остановить появление цвета; и данные наблюдений по каждой лунке определяют на длине волны 450 нм планшет-ридером Microplate (Dynatech MP 5000, США).
Если данные наблюдений экспериментальной группы были выше предела эксклюзии (больше величины данных отрицательного контроля в два раза), подтверждалось, что имела место выработка антител против пре S2 пептида и просчитывалось количество морских свинок, которые показали положительную реакцию на антитело.
В результате оба поверхностных антигена 2 и 3 дали 100% показатель выработки антитела.
Пример 5
Чтобы определить иммуногенность S и пре S2 пептидов в поверхностных антигенах 2 и 3, проводились следующие эксперименты на мышах. 1 мл (200 мкг/мл) поверхностного антигена 2 или 3 добавляют к 18 мл фосфатного буфера (pH 7,2), содержащего 0,15 М хлорид натрия, и смесь фильтруют через фильтрующий шприц в 0,2 мк. Фильтрат смешивают с 1 мл 3% ангидро-геля (Superfos, Biosector, Дания).
Чтобы определить иммуногенность S и пре S2 пептидов в поверхностных антигенах 2 и 3, проводились следующие эксперименты на мышах. 1 мл (200 мкг/мл) поверхностного антигена 2 или 3 добавляют к 18 мл фосфатного буфера (pH 7,2), содержащего 0,15 М хлорид натрия, и смесь фильтруют через фильтрующий шприц в 0,2 мк. Фильтрат смешивают с 1 мл 3% ангидро-геля (Superfos, Biosector, Дания).
Полученный раствор, содержащий 10 мкг/мл поверхностного антигена 2 или 3, разбавляют с разбавителем ангидро-геля (который готовился разбавлением алгидро-геля) до окончательной концентрации в 0,15% фосфатным буфером (pH 7,2), содержащим 0,15 М хлорид натрия, чтобы получить 4 образца с содержанием 0,01, 0,03, 0,09 и 0,27 нг/мл поверхностного антигена соответственно. Контейнеры, содержащие образцы, встряхивают во избежание осаждения алгидро-геля. Указанную процедуру проводят в стерильных условиях на чистом столе.
80 мышей возрастом 5 недель разделяют на 8 групп, каждая из 10 мышей и каждой мыши внутрибрюшинно вводят 1 мл каждого из разбавленных растворов поверхностного антигена 2 или 3, подготовленных выше. Через 28 дней после инъекции от каждой мыши берут пробы крови на анализ и из них делают сыворотку. Наличие антител против S пептида определялось набором Ausap (Abbott, США), и показатели выработки антител против S пептидов в поверхностном антигене 2 или 3 указаны в таблице 1.
Наличие антител к пре S2 пептиду определялось в соответствии с методикой, описанной в примере 4, и показатели выработки антител к пре S2 пептидам в поверхностном антигене 2 или 3 представлены в таблице 2.
Эффективную дозу (ЭД50) S и пре S2 пептидов рассчитывают методом единиц вероятности (Finney D.J. Probit Analisis, 1971) с использованием показателей выработки антител, полученных выше. В результате ЭД50 S и пре S2 пептидов в поверхностном антигене 2 составила 0,0580 и 0,0577 нг/мл соответственно и S и пре S2 пептидов в поверхностном антигене 3 - 0,0455 и 0,0469 нг/мл соответственно. Однако, поскольку содержание пре S2 пептида в поверхностном антигене 2 или 3 составляет 75%, ЭД50 пре S2 пептида считают ниже расчетной величины, полученной выше.
Как показано в вышеописанных примерах, поверхностный антиген вируса гепатита B с высоким содержанием пре S2 пептида и высокими иммуногенными свойствами S и пре S2 пептидов можно получить из рекомбинантных дрожжевых клеток в соответствии с настоящим изобретением.
Хотя изобретение было описано по конкретным вариантам, специалистам данной области техники понятно, что допустимы различные модификации и изменения изобретения, которые входят в его объем, определенный прилагаемой формулой.
Claims (14)
1. Способ очистки поверхностного антигена вируса гепатита В, содержащего пре S2 пептид, из рекомбинантных клеток дрожжей, включающий культивирование рекомбинатных клеток дрожжей, разрушение клеток в буфере, содержащем хаотропную соль, центрифугирование гомогената клеток, контактирование полученного супернатанта с диоксидом кремния, десорбцию поверхностного антигена из диоксида кремния буфером, содержащим мочевину, гельфильтрацию фракции, содержащей поверхностный антиген, с последующим получением фракции, содержащей целевой продукт, отличающийся тем, что до стадии центрифугирования к гомогенату клеток добавляют ПАВ, полученный экстракт подщелачивают до pH 11,0 - 13,5, затем подкисляют до pH 4,5 - 6.0
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что хаотропную соль выбирают из группы, состоящей из тиоцианата натрия, тиоцианата калия, тиоцианата аммония, хлорида гуанидия и мочевины.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что хаотропную соль выбирают из группы, состоящей из тиоцианата натрия, тиоцианата калия, тиоцианата аммония, хлорида гуанидия и мочевины.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что хаотропную соль используют в концентрации 1 - 8 М.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадии гельфильтрации дополнительно проводят гидрофобную колоночную хроматографию.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве гидрофобной смолы используют агарозный гель, содержащий фенильные группы.
6. Способ по п.4, отличающийся тем, что гидрофобную колоночную хроматографию проводят через колонку, уравновешенную буфером, содержащим мочевину в концентрации 1 - 4 М, pH 8,8 - 11,0, затем колонку промывают уравновешивающим буфером, содержащим 10 - 40 вес.% этиленгликоля и поверхностный антиген элюируют тем же буфером, содержащим 60 - 80 вес.% этиленгликоля.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что к экстракту клеток дополнительно добавляют подходящую соль, затем остатки клеток и примесей удаляют, а надосадочную жидкость подвергают диафильтрации.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве ПАВ используют Твин 20, или Твин 80, или Тритон Х-100, или дезоксихолат натрия.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что ПАВ используют в концентрации 0,1 - 0,5% (вес./об.) от объема гомогената клеток.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что диоксид кремния используют с площадью поверхности 100 - 500 м2/г.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что десорбцию поверхностного антигена с диоксида кремния проводят буфером, pH 8,8 - 11,0, содержащим мочевину в концентрации 1 - 8 М и ПАВ в концентрации 0,1 - 0,3 вес.%.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что в качестве ПАВ используют дезоксихолат натрия.
13. Способ по п.1, отличающийся тем, что гельфильтрацию проводят с использованием декстранового или полиакриламидного геля с молекулярной величиной отсечения 1 000 000.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что гельфильтрацию проводят через колонку, уравновешенную Трис или фосфатным буфером с pH 6 - 8, содержащим хлорид натрия в концентрации 0,1 - 0,2 М, поверхностный антиген элюируют тем же буфером.
15. Вакцина для иммунизации против гепатита В, включающая поверхностный антиген вируса гепатита В, продуцированный рекомбинантной клеткой дрожжей, в эффективном количестве и по крайней мере один из физиологически приемлемых компонентов, выбранный из группы носитель, разбавитель или адъювант, отличающийся тем, что в качестве антигена вируса гепатита В используют поверхностный антиген, содержащий пре S2 пептид, очищенный по способу п.1.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR19940033594 | 1994-12-10 | ||
KR94-33594 | 1994-12-10 | ||
KR9433594 | 1994-12-10 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU95120587A RU95120587A (ru) | 1998-02-27 |
RU2122430C1 true RU2122430C1 (ru) | 1998-11-27 |
Family
ID=19400952
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU95120587A RU2122430C1 (ru) | 1994-12-10 | 1995-12-08 | Способ очистки поверхностного антигена вируса гепатита b, содержащего пре s2 пептид, из рекомбинантных клеток дрожжей, вакцина для иммунизации против гепатита b |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6362320B1 (ru) |
EP (1) | EP0716094B1 (ru) |
KR (1) | KR960023066A (ru) |
CN (1) | CN1057532C (ru) |
AR (1) | AR002006A1 (ru) |
AT (1) | ATE264341T1 (ru) |
BG (1) | BG63699B1 (ru) |
BR (1) | BR9505739A (ru) |
CA (1) | CA2164672C (ru) |
CO (1) | CO4480040A1 (ru) |
CZ (1) | CZ291024B6 (ru) |
DE (1) | DE69532878T2 (ru) |
DK (1) | DK0716094T3 (ru) |
ES (1) | ES2217272T3 (ru) |
JO (1) | JO1885B1 (ru) |
PE (1) | PE56396A1 (ru) |
PL (1) | PL182103B1 (ru) |
PT (1) | PT716094E (ru) |
RO (1) | RO113308B1 (ru) |
RU (1) | RU2122430C1 (ru) |
TR (1) | TR199501557A2 (ru) |
UY (1) | UY24112A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2444374C2 (ru) * | 2005-11-08 | 2012-03-10 | Новартис Вэксинес Энд Дайэгностикс Срл | Получение вакцин, содержащих поверхностный антиген вируса гепатита в и поверхностно-активное вещество |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
UA79735C2 (ru) * | 2000-08-10 | 2007-07-25 | Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. | Очищение антигенов вируса гепатита b (hbv) для использования в вакцинах |
KR100405174B1 (ko) * | 2001-02-02 | 2003-11-12 | 씨제이 주식회사 | 재조합 β형 간염바이러스 표면항원의 정제방법 |
DE602005025626D1 (de) * | 2004-05-19 | 2011-02-10 | Advanced Life Science Inst Inc | Verfahren zum nachweis von hepatitis-b-virus |
KR100948127B1 (ko) * | 2007-06-27 | 2010-03-18 | 주식회사 중앙백신연구소 | 복합호흡기 질환 돼지의 조직유제를 함유하는 백신 조성물 |
KR102196230B1 (ko) | 2012-09-17 | 2020-12-29 | 더블유.알. 그레이스 앤드 캄파니-콘. | 크로마토그래피 매질 및 장치 |
FR2997222B1 (fr) * | 2012-10-19 | 2015-01-16 | Alstom Technology Ltd | Dispositif d'etablissement et/ou de coupure de courant a contacts permanents a usure reduite |
ES2929099T3 (es) | 2014-05-02 | 2022-11-24 | Grace W R & Co | Material de soporte funcionalizado y métodos de fabricación y uso de material de soporte funcionalizado |
JP2018517559A (ja) | 2015-06-05 | 2018-07-05 | ダブリュー・アール・グレース・アンド・カンパニー−コーンW R Grace & Co−Conn | 吸着性バイオプロセス清澄化剤並びにその製造及び使用方法 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5340926A (en) * | 1983-03-25 | 1994-08-23 | Celltech, Limited | Process for the recovery of recombinantly produced protein from insoluble aggregate |
US4649192A (en) * | 1985-05-30 | 1987-03-10 | Smith Kline-Rit | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate |
ATE93891T1 (de) * | 1987-03-09 | 1993-09-15 | Merck & Co Inc | Reinigung von rekombiniertem hepatitis-boberfl|chen-antigen. |
EP0310178A1 (en) * | 1987-09-30 | 1989-04-05 | Merck & Co. Inc. | Recovery of pres2+S antigen |
EP0314240A3 (en) * | 1987-10-26 | 1990-03-28 | Merck & Co. Inc. | Process for purifying recombinant hepatitis antigens |
US5004688A (en) * | 1988-04-15 | 1991-04-02 | Phillips Petroleum Company | Purification of hepatitis proteins |
US5030720A (en) * | 1988-09-01 | 1991-07-09 | Merck & Co., Inc. | Pres2+S hepatitis B vaccine derived from plasma |
EP0384058A1 (en) * | 1989-02-09 | 1990-08-29 | Development Center For Biotechnology | Isolation of hepatitis B surface antigen from transformed yeast cells |
CU22290A1 (es) * | 1990-10-08 | 1995-01-31 | Cigb | Procedimiento para la obtencion de antigeno de superficie del virus de la hepatitis b de superior capacidad inmunoganica y su uso en un preparado vacunal |
-
1995
- 1995-11-29 KR KR1019950044795A patent/KR960023066A/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-12-07 CO CO95057860A patent/CO4480040A1/es unknown
- 1995-12-07 PE PE1995286655A patent/PE56396A1/es not_active Application Discontinuation
- 1995-12-07 CA CA002164672A patent/CA2164672C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-07 JO JO19951885A patent/JO1885B1/en active
- 1995-12-08 DK DK95119383T patent/DK0716094T3/da active
- 1995-12-08 EP EP95119383A patent/EP0716094B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-08 PT PT95119383T patent/PT716094E/pt unknown
- 1995-12-08 AT AT95119383T patent/ATE264341T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-12-08 DE DE69532878T patent/DE69532878T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-08 ES ES95119383T patent/ES2217272T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-08 RO RO95-02141A patent/RO113308B1/ro unknown
- 1995-12-08 PL PL95311735A patent/PL182103B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-12-08 BG BG100212A patent/BG63699B1/bg unknown
- 1995-12-08 RU RU95120587A patent/RU2122430C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-12-08 CZ CZ19953247A patent/CZ291024B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-12-11 TR TR95/01557A patent/TR199501557A2/xx unknown
- 1995-12-11 CN CN95120408A patent/CN1057532C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-11 BR BR9505739A patent/BR9505739A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-12-11 AR ARP950100498A patent/AR002006A1/es active IP Right Grant
- 1995-12-11 UY UY24112A patent/UY24112A1/es not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-11-02 US US09/432,300 patent/US6362320B1/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2444374C2 (ru) * | 2005-11-08 | 2012-03-10 | Новартис Вэксинес Энд Дайэгностикс Срл | Получение вакцин, содержащих поверхностный антиген вируса гепатита в и поверхностно-активное вещество |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1132211A (zh) | 1996-10-02 |
JO1885B1 (en) | 1997-12-15 |
PL311735A1 (en) | 1996-06-24 |
ES2217272T3 (es) | 2004-11-01 |
CZ324795A3 (en) | 1996-06-12 |
PE56396A1 (es) | 1996-12-14 |
US6362320B1 (en) | 2002-03-26 |
DE69532878T2 (de) | 2005-06-09 |
ATE264341T1 (de) | 2004-04-15 |
CZ291024B6 (cs) | 2002-12-11 |
CN1057532C (zh) | 2000-10-18 |
EP0716094A1 (en) | 1996-06-12 |
CA2164672A1 (en) | 1996-06-11 |
AR002006A1 (es) | 1998-01-07 |
CO4480040A1 (es) | 1997-07-09 |
KR0177254B1 (ru) | 1999-04-01 |
DE69532878D1 (de) | 2004-05-19 |
BG100212A (bg) | 1996-12-31 |
BR9505739A (pt) | 1997-12-23 |
EP0716094B1 (en) | 2004-04-14 |
KR960023066A (ko) | 1996-07-18 |
TR199501557A2 (tr) | 1997-03-21 |
UY24112A1 (es) | 1996-05-10 |
PL182103B1 (pl) | 2001-11-30 |
DK0716094T3 (da) | 2004-07-26 |
BG63699B1 (bg) | 2002-09-30 |
RO113308B1 (ro) | 1998-06-30 |
PT716094E (pt) | 2004-08-31 |
CA2164672C (en) | 2004-06-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2721699B2 (ja) | 肝炎蛋白質の精製 | |
US4857317A (en) | Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them | |
JPS63105693A (ja) | 細胞から親油性タン白の抽出方法 | |
KR880002586B1 (ko) | B형 간염 바이러스 표면 항원의 정제방법 | |
RU2122430C1 (ru) | Способ очистки поверхностного антигена вируса гепатита b, содержащего пре s2 пептид, из рекомбинантных клеток дрожжей, вакцина для иммунизации против гепатита b | |
JPH0450294B2 (ru) | ||
JPH07177882A (ja) | A型肝炎ウイルス(hav) の精製方法、こうして精製されたウイルス及びそれを含むワクチン組成物 | |
KR910008643B1 (ko) | B형 간염 비루스 표면항원(HBs 항원)의 정제 방법 | |
JPS6136228A (ja) | 肝炎表面抗原の精製方法 | |
JPH0585526B2 (ru) | ||
US5011915A (en) | Process for purifying recombinant hepatitis antigens | |
JP3148895B2 (ja) | 精製方法 | |
EP0294071A2 (en) | Hepatitis B vaccines made with pre-formed aluminum hydroxide gels, and processes thereof | |
EP0005864A1 (en) | Antigenic composition useful as a vaccine or vaccine intermediate, and process for preparing same | |
KR100194247B1 (ko) | 재조합 b형 간염 표면 항원의 정제방법 | |
KR0159716B1 (ko) | B형 간염 표면 항원의 정제방법 | |
JPS61103895A (ja) | HBsAgの精製方法 | |
RU2080876C1 (ru) | Способ получения очищенных частиц поверхностного антигена гепатита в, очищенная частица поверхностного антигена гепатита в человека и вакцина против гепатита в | |
RU2205023C1 (ru) | Способ получения поверхностного антигена вируса гепатита в из рекомбинантных клеток дрожжей hansenula polymorpha и вакцина для иммунизации против гепатита в | |
KR100254828B1 (ko) | 재조합 효모로 부터 발현된 b형 간염 항원의 추출 방법 | |
KR0122431B1 (ko) | 당함량이 낮은 바이러스 표면 항원 입자의 제조 방법 | |
KR930012107B1 (ko) | 한국형 c형 간염 바이러스의 특이 항원인 khcv 403 단백질의 정제방법 | |
KR19990000368A (ko) | B형 간염 표면 항원의 정제방법 | |
KR930012108B1 (ko) | 한국형 c형 간염 바이러스의 특이항원인 khcv ub 897 단백질의 정제방법 | |
JPH0574599B2 (ru) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20061209 |