PL182103B1 - Sposób oczyszczania powierzchniowego antygenu wirusa Hepatitis B zawierajacego peptyd preS2 oraz szczepionka przeciw wirusowi Hepatitis B PL PL PL - Google Patents
Sposób oczyszczania powierzchniowego antygenu wirusa Hepatitis B zawierajacego peptyd preS2 oraz szczepionka przeciw wirusowi Hepatitis B PL PL PLInfo
- Publication number
- PL182103B1 PL182103B1 PL95311735A PL31173595A PL182103B1 PL 182103 B1 PL182103 B1 PL 182103B1 PL 95311735 A PL95311735 A PL 95311735A PL 31173595 A PL31173595 A PL 31173595A PL 182103 B1 PL182103 B1 PL 182103B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- surface antigen
- cell
- extract
- silica
- buffer solution
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 86
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 28
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 title claims description 20
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 154
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 154
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 154
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 45
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 23
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims abstract description 12
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 84
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 48
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 46
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 42
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 40
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 26
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 25
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 19
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 18
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 18
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 13
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 9
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 claims description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 7
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 claims description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 7
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 229940116357 potassium thiocyanate Drugs 0.000 claims description 7
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 claims description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 6
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 4
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 claims description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 3
- SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N ammonium thiocyanate Chemical compound [NH4+].[S-]C#N SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 3
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 3
- 229920002114 octoxynol-9 Polymers 0.000 claims description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 3
- -1 polyoxyethylene octylphenyl ether Polymers 0.000 claims description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000003113 alkalizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 229940124872 Hepatitis B virus vaccine Drugs 0.000 claims 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract 1
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 7
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 6
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 5
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 4
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 4
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 101710135378 pH 6 antigen Proteins 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 229910002019 Aerosil® 380 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 2
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- QXJJQWWVWRCVQT-UHFFFAOYSA-K calcium;sodium;phosphate Chemical compound [Na+].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O QXJJQWWVWRCVQT-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 150000003567 thiocyanates Chemical class 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002012 Aerosil® Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108010084884 GDP-mannose transporter Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- RXHSGRQJJBSBPN-UHFFFAOYSA-L [Na+].[Na+].Cl.OP([O-])([O-])=O Chemical compound [Na+].[Na+].Cl.OP([O-])([O-])=O RXHSGRQJJBSBPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- HDFXRQJQZBPDLF-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].OC([O-])=O.OC([O-])=O HDFXRQJQZBPDLF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000020442 loss of weight Diseases 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 230000009965 odorless effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
1. Sposób oczyszczania powierzchniowego antygenu wirusa Hepatitis B, zawie- rajacego peptyd preS2 z komórek rekombinacyjnego organizmu, znam ienny tym , ze obej- muje etap rozrywania komórki przy pomocy roztworu buforowego, zawierajacego chaotropowa sól, z wytworzeniem homogenizatu komórek. 17. Szczepionka wedlug zastrz. 16, znam ienna tym , ze do oczyszczania stosuje sie cha- otropowa sól wybrana z grupy, obejmujace tiocyjanian sodu, tiocyjanian potasu, tiocyjanian amonu, chlorowodorek guanidyny i mocznik. PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania antygenu powierzchniowego wirusa Hepatitis B zawierającego peptyd preS2 oraz szczepionka przeciw wirusowi Hepatitis B.
Dokładniej przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania antygenu powierzchniowego wirusa Hepatitis B zawierającego peptyd preS2 z rekombinacyjnej komórki drożdży, obejmujący etap rozrywania komórki, przy czym stracie peptydu preS2 zapobiega się dzięki stosowaniu chaotropowej soli, a następnie ekstrakcji, strącania, adsorpcji na krzemionce i chromatografii kolumnowej.
Hepatitis B jest jednym ze światowych problemów zdrowotnych; około 200 do 300 milionów ludzi na świecie nosi w sobie wirus Hepatitis B (HBV). Infekcja HBV często rozwija się w marskość wątroby i raka komórek wątroby, prowadząc do możliwej śmierci pacjenta.
Do chwili obecnej nie opracowano żadnego środka leczącego Hepatitis B, wobec tego podkreślano znaczenie szczepionek.
Blumberg i in. opisali antygen Australia z krwi pacjentów z Hepatitis B w 1955 roku, a Krugman i in. podawali w 1971 roku sposób aktywnej immunizacji z zastosowaniem podgrzewanego osocza ludzkiego zawierającego HBV, dodając w ten sposób możliwość opracowania szczepionek na Hepatitis B. Następnie pojawiły się w handlu szczepionki pierwszej generacji na Hepatitis B, wytwarzane przez wydzielenie i oczyszczenie antygenu powierzchniowego wirusa Hepatitis B (HBsAg) z osocza krwi pacjentów z Hepatitis B (M. R. Hilleman i in., Develop. Bio. Standard, 54, 3-12 (1983)).
Jednak szczepionki z osocza krwi sprawiają trudności, ponieważ ich oczyszczanie i dezaktywacja sąniedogodne i bardzo kosztowne, źródła ludzkiej krwi są ograniczone, a szczepiona osoba może zarazić się patogenami z użytej krwi.
Tak więc w celu rozwiązania tego problemu zastosowano metody inżynierii genetycznej do otrzymywania szczepionek na Hepatitis B.
Np. Valenzuela i in. opracowali sposób wytwarzania HBsAg w drożdżach (Naturę, 293, 347-350 (1982)). Rekombinacyjny HBsAg (r-HBsAg) składa się głównie z białka S (P25) zawierającego 226 aminokwasów, a po oczyszczeniu tworzy cząstki powierzchniowego antygenu prawie identyczne jak HBsAg wydzielany z osocza krwi.
182 103
Κ. Η. Heermann i in. podali, że białko osłaniające wirusa Hepatitis B zawiera znaczące ilości białka L(preSl+preS2+S: p39) i białka M (preS2+S: p31),jak też białka S (J. Virol., październik, 396-402 (1984)). Wiadomo, że białko preSl odgrywa ważną rolę w niszczeniu wirusa Hepatitis B na wątrobie po infekcji ludzkiego organizmu. Peptyd preS2, złożony z 55 aminokwasów, okazał się pomagać w tworzeniu przeciwciała wobec antygenu powierzchniowego w eksperymentach ze zwierzętami (D. R. Milich i in., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 8168-8172 (1985)).
Ponadto wiadomo, że przeciwciała powstające wobec peptydu preS2 wykazują aktywność obronną wobec infekcji wirusowej (Y. Ito i in,. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, 9174-9178 (1986)). Tak więc szczepionka zawierająca peptyd preS2 może być przydatna w przypadku osoby, która nie potrafi wytwarzać przeciwciał wobec istniejącego antygenu powierzchniowego. Opracowanie takiej szczepionki jest także ważne ze względu na ochronę przed obecnie odkrytymi wariantami wirusa Hepatitis B.
Ponieważ jednak peptyd preS2 jest bardzo wrażliwy ma proteazy obecne w komórkach drożdży, wytwarzanie antygenu powierzchniowego wirusa Hepatitis B zawierającego peptyd preS2 napotkało na liczne trudności. W celu ich przezwyciężenia Kobayashi i in. wytworzyli szczepionkę, którąprodukuje się przez genetyczną modyfikację wrażliwego na proteazy regionu pomiędzy peptydami preS2 i S (J. Bacteriology, 8,1-22 (1988)). Natomiast opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4742158 opisuje sposób wytwarzania szczepionki zawierającej peptyd preS2, w którym peptyd zabezpiecza się przed atakiem proteaz stosując inhibitor proteazy w etapie rozrywania komórki. Jednak nie zbadano dokładnie wpływu genetycznej modyfikacji Kobayashi i in. na aktywność peptydu preS2, i ten sposób nie jest sposobem praktycznym, ponieważ inhibitory proteazy są zbyt kosztowne, aby stosować je w procesie oczyszczania na dużąskalę. Ponadto zawartość peptydu preS2 nie może przekroczyć pewnej wartości niezależnie od ilości dodanych inhibitorów proteazy przy wydłużaniu czasu oczyszczania ze wzrostem skali procesu lub zapotrzebowania.
Europejski opis patentowy nr 0337492 Al opisuje sposób oczyszczania HBsAg z hodowli gatunku Pichia z zastosowaniem tiocyjanianu potasu. Tiocyjanian potasu stosuje się w celu podwyższenia wydajności lipofilowego białka, a cały proces ma na celu oczyszczenie HBsAg zawierającego tylko peptyd S. Gdy HBsAg zawiera ponadto peptyd preS2 złożony z 55 aminokwasów z przodu peptydu S złożonego z 226 aminokwasów, jego właściwości immunologiczne sąpodobne do właściwości antygenu powierzchniowego zawierającego tylko peptyd S, ponieważ antygenność i immunogenność peptydu S są identyczne. Jednak oba powierzchniowe antygeny są w nieunikniony sposób różne pod względem właściwości fizykochemicznych. W szczególności peptyd preS2 jest dostatecznie hydrofilowy, aby ulegać ekspozycji na powierzchni cząstki antygenu, i odpowiednio ma bardzo ważny wpływ na procedurę oczyszczania.
Dlatego też opracowano różne sposoby oczyszczania antygenu powierzchniowego wirusa Hepatitis B zawierającego peptyd preS2.
Europejski opis patentowy nr 0130178 Al opisuje sposób oczyszczania HBsAg zawierającego peptyd preS2, charakteryzujący się wydzielaniem powierzchniowego antygenu przy pomocy dwu ciekłych faz wytwarzanych przez dodanie odpowiedniej ilości dekstranu i glikolu do ekstraktu drożdży. Jednak sposób ten jest związany z trudnościami, ponieważ oddzielony powierzchniowy antygen nie jest dostatecznie czysty, proces nie nadaje się do oczyszczania na wielką skalę ze względu na wysoki koszt dekstranu i poli(glikolu etylenowego), nie jest także ekonomiczny ze względu na potrzebę stosowania oddzielnej procedury usuwania zastosowanego środka powierzchniowo czynnego.
Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4742158 opisuje sposób oczyszczania HBsAg zawierającego peptyd preS2, obejmujący: przygotowanie ekstraktu drożdży w obecności różnych inhibitorów proteazy i oczyszczenie otrzymanego stąd antygenu powierzchniowego na serii etapów chromatograficznego rozdzielania z zastosowaniem kolumny z powinowactwem otrzymanej metodą wiązania albuminy ludzkiego osocza z żelową matrycą i kolumny hydrofobowej, z elucjąśrodkiem powierzchniowo czynnym. Jednak sposób ten ma takie wady, jak wyso6
182 103 ki koszt stosowanych inhibitorów proteazy, nieprzystosowanie kolumny z powinowactwem do oczyszczania na dużą skalę, konieczność stosowania specjalnej procedury do usuwania środka powierzchniowo czynnego stosowanego w chromatografii na kolumnie hydrofobowej.
Kobayashi i in. opisali także sposób oczyszczania HBsAg zawierającego peptyd preS2 (J. ofBiotechnology, 8,1-22(1988)). Jednak sposób ten nie nadaje się do stosowania na dużą skalę, ponieważ wykorzystuje kolumnę z immunopowinowactwem, dającą niską wydajność.
Koreański opis patentowy nr 065305 opisuje sposób oczyszczania HBsAg, obejmujący wytrącanie przez zmianę pH oraz chromatografię na krzemionce i anionowymienną. Wadą sposobu jest trudność utrzymania zawartości preS2 na odpowiednim poziomie, ponieważ peptyd ten jest trawiony przez proteazy w czasie wstępnego etapu procesu.
Tak więc istnieje nadal potrzeba opracowania wydajnego sposobu oczyszczania HBsAg zawierającego peptyd preS2.
Głównym celem wynalazku jest sposób oczyszczania antygenu powierzchniowego wirusa Hepatitis B zawierającego peptyd preS2 z rekombinacyjnej komórki drożdży, do stanu czystości pozwalającego na bezpośrednie jego włączenie w skład szczepionki.
Zgodnie z jednym z aspektów wynalazku jego przedmiotem jest sposób oczyszczania antygenu powierzchniowego wirusa Hepatitis B zawierającego peptyd preS2, ulegającego ekspresji w rekombinacyjnym organizmie, znamienny tym, że komórki rekombinacyjne rozrywa się stosując bufor zawierający sól chaotropową.
Ten i inne cele i cechy wynalazku staną się oczywiste z poniższego opisu wynalazku, w powiązaniu z załączonymi rysunkami, na których: figura 1 pokazuje wynik elektroforezy na żelu poliakryloamidowym z 15% dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), weryfikujący zawartość peptydu preS2 w HBsAg, gdy powierzchniowy antygen zawierający peptyd preS2 oczyszcza się w obecności tiocyjanianu potasu jako soli chaotropowej.
Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania antygenu powierzchniowego wirusa Hepatitis B, zawierającego peptyd preS2, ulegającego ekspresji w rekombinacyjnym organizmie, znamienny tym, że komórki rekombinacyjne rozrywa się stosując bufor zawierający sól chaotropową w celu zminimalizowania strat peptydu preS2. Stosowanie bufora zawierającego sól chaotropową do rozrywania komórek ułatwia wytwarzanie cząstek HBsAg i zabezpiecza peptyd preS2 przed atakiem proteazowym, który zachodzi zwykle w początkowym etapie oczyszczania, co pozwala na zachowanie zawartości peptydu na stałym poziomie, aż do zakończenia procesu oczyszczania.
Sposób według wynalazku można stosować do oczyszczania HBsAg, wytwarzanego w dowolnym organizmie rekombinacyjnym, korzystnie rekombinacyjnej komórce drożdży, np. Saccharomyces cerevisiae.
Odpowiednie chaotropowe sole, które można stosować w sposobie według wynalazku, obejmują tiocyjanian sodu, tiocyjanian potasu, tiocyjanian amonu, chlorowodorek guanidyny i mocznik, przy czym korzystny jest tiocyjanian potasu.
Można stosować dowolny konwencjonalny układ buforowy, np. bufor fosforanowy i bufor Tris®, czyli 2-amino-2-hydroksymetylo-l,3-propanodiol, do rozrywania komórek w sposobie według wynalazku; jego pH można korzystnie zmienić do wartości od 6 do 8. Stężenie soli chaotropowej w buforze może się wahać od 1 do 8 M, korzystnie od 1 do 3 M.
Gdy komórkę rekombinacyjną rozrywa się stosując bufor zawierający sól chaotropową opisany powyżej, pozostałą część procesu oczyszczania można prowadzić stosując dowolną kombinację konwencjonalnych etapów oczyszczania, chociaż proces może korzystnie obejmować etapy: (a) dodania środka powierzchniowo czynnego do homogenizatu komórkowego komórek rekombinacyjnych w celu ekstrakcji powierzchniowego antygenu z błony komórkowej, (b) zwiększenia rozpuszczalności i promowania tworzenia cząstek powierzchniowego antygenu w ekstrakcie otrzymanym w etapie (a) przez alkalizację ekstraktu, (c) wytrącenia i usunięcia resztek komórek, lipidów i zanieczyszczających białek z ekstraktu przetwarzanego w etapie (b) przez zakwaszenie i odwirowanie ekstraktu w celu otrzymania roztworu, zawierającego powierzchniowy antygen, (d) zetknięcia roztworu otrzymanego w etapie (c) z krzemionką w celu ad
182 103 sorbowania powierzchniowego antygenu na krzemionce, wymycia zanieczyszczających białek i desorpcji powierzchniowego antygenu z krzemionki przy pomocy bufora, w celu otrzymania frakcji oczyszczonego powierzchniowego antygenu, (e) poddania frakcji oczyszczonego powierzchniowego antygenu otrzymanego w etapie (d) chromatografii na kolumnie hydrofobowej w celu otrzymania frakcji, zawierających powierzchniowy antygen, oraz (f) oczyszczenia chromatograficznie frakcji otrzymanych w etapie (e) techniką sączenia molekularnego w celu otrzymania powierzchniowego antygenu w postaci czystej.
Przykładowe środki powierzchniowo czynne, które można stosować w powyższym etapie (a) do ekstrakcji powierzchniowego antygenu z błony komórkowej, obejmują: Tween® 20 (polisorbit 20, np. monolaurynian polioksyetyleno(20) sorbitanu), Tween® 80 (polisorbit 80, np. monooleinian polioksyetyleno(20) sorbitanu), Triton Χ-100 (eter polioksyetyleno oktylofenylowy) i deoksycholan sodu, przy czym korzystny j est Tween® 20. Środek powierzchniowo czynny można stosować w ilości od 0,1 do 0,5% (wagowo/objętościowo), korzystnie od 0,1 do 0,2% (wagowo/objętościowo), względem ilości homogenizatu komórkowego.
W celu zwiększenia rozpuszczalności powierzchniowego antygenu w homogenizacie komórkowym i promowania tworzenia jego cząstek korzystne jest zwiększenie pH ekstraktu powierzchniowego antygenu do wartości od 11,0 do 13,5 przy pomocy zasady, korzystnie wodorotlenku sodu i potasu. Proces alkalizacji sprzyja prawdopodobnie tworzeniu cząstek HBsAg przez wzmocnienie międzycząsteczkowego wiązania dwusiarczkowego i dysocjację zanieczyszczających białek do HBsAg dzięki zwiększonej rozpuszczalności. Następnie ekstrakt korzystnie pozostawia się w temperaturze od 0 do 30°C na czas od 0,5 do 1 godziny. Ekstrakt zakwasza się z kolei w celu wytrącenia resztek komórek, lipidów i zanieczyszczających białek, obniżając pH do wartości od 4,5 do 6,0. Przykładowe kwasy, jakie można stosować w tym etapie, obejmują dowolne kwasy nieorganiczne lub organiczne, korzystnie jest to 10 do 30% roztwór kwasu octowego. Reakcję zakwaszania można prowadzić w temperaturze od 0 do 30°C przez 0,5 do 2 godzin, korzystnie z mieszaniem. Zakwaszony ekstrakt odwirowuje się w celu usunięcia wytworzonych osadów i otrzymania supematantu zawierającego powierzchniowy antygen. Procedura ta jest korzystna, ponieważ w jednym prostym etapie odwirowania usuwa się jednocześnie resztki komórek, lipidy i zanieczyszczające białka, a wydajność powierzchniowego antygenu jest wysoka dzięki wstępnemu rozpuszczeniu go przy wysokiej wartości pH.
Podwyższanie i następnie obniżanie pH ekstraktu komórek stabilizuje właściwość tworzenia cząstek przez powierzchniowy antygen i przyczynia się do bardzo skutecznego usuwania lipidów i zanieczyszczających białek.
Jednak przy stosowaniu w etapie rozrywania komórek tiocyjanianu jako soli chaotropowej, w etapie zakwaszania może się pojawić nieprzyjemny zapach. Sama sól tiocyjanianowa jest bezbarwna, bez zapachu i nieszkodliwa, a jon tiocyjanianowy dość trwały w roztworze. Uważa się więc, że zapach powstający w etapie zakwaszania pochodzi z reakcji tiocyjanianu z pewnymi substancjami z ekstraktu komórek. Zapach ten może być znośny dla obsługującego przy oczyszczaniu w małej skali, ale w dużej skali korzystnie jest usunąć tiocyjanian przed etapem zakwaszania.
Na przykład tiocyjanian można korzystnie usuwać dodając do ekstraktu komórek odpowiednią sól w celu wytrącenia soli tiocyjanianowej wraz z pewną ilością zanieczyszczających białek bezpośrednio po etapie (a), usuwając osady przez np. odwirowanie i filtrując przez membranę powstały supematant. Powierzchniowy antygen nie wytrąca się w czasie tej procedury. Ponadto usuwanie tiocyjanianu prowadzi się równocześnie z usuwaniem części zanieczyszczających białek, co ułatwia proces dalszego oczyszczania.
Korzystne sole, jakie można stosować przy odwadnianiu, obejmują sole anionów kilkuwartościowych, np. siarczan sodu i amonu, w stężeniach od 8 do 15% (wagowo/objętościowo). Po ekstrahowaniu powierzchniowego antygenu z błony komórkowej dodaje się sól i pozwala się reakcji biec w temperaturze pokojowej przez 0,5 do 2 godzin z mieszaniem lub bez mieszania. Powstałe osady można usuwać w konwencjonalny sposób, np. przez odwirowanie, otrzymując supematant zawierający powierzchniowy antygen. Powstały supematant poddaje się wielokrotnemu procesowi filtracji przez membrany w celu usunięcia tiocyjanianu i siarczanu. Bufor stoso
182 103 wany w tym etapie ma korzystnie pH od 6 do 8. Po zakończeniu etapów obróbki solą, odwirowania i diafiltracji powstały supematant poddaje się procesom z etapu (b) i (c).
Supematant z etapu (c) zawierający powierzchniowy antygen traktuje się krzemionką na kolumnie lub w sposób periodyczny, przy czym korzystny jest sposób periodyczny. Odpowiednią krzemionką do stosowania w tym etapie jest krzemionka mikrokrystaliczna o powierzchni właściwej od 100 do 500 m2/g, a korzystnie Aerosil® 380 (Degussa, Niemcy). Supematant zawierający powierzchniowy antygen styka się z zawiesiną krzemionki przy pH od 6 do 8 i temperaturze od 4 do 30°C przez czas od 2 do 16 godzin z intensywnym mieszaniem. Ilość osuszonej krzemionki do adsorpcji powierzchniowego antygenu wynosi korzystnie około 5% (wagowych) względem masy placka filtracyjnego z komórek. Kompleks powierzchniowego antygenu z krzemionką oddziela się od roztworu stosując konwencjonalne sposoby, np. odwirowanie.
Następnie kompleks przemywa się, np. trzykrotnie buforem o pH od 6 do 8, korzystnie buforem fosforan sodu-chlorek sodu, w celu usunięcia pozostałych zanieczyszczających białek z krzemionki. Powierzchniowy antygen można desorbować z krzemionki stykając kompleks z odpowiednim buforem przez około 2 godziny. W tym etapie można stosować bufor o pH od 8,8 do 11,0, korzystnie bufor węglan sodu-wodorowęglan sodu. Bufor może ponadto zawierać mocznik w stężeniu od 1 do 8M i środek powierzchniowo czynny, korzystnie deoksycholan sodu, w stężeniu do 0,1 do 0,3% wagowych. Krzemionkę usuwa się następnie z roztworu w konwencjonalny sposób, np. przez odwirowanie, otrzymując supematant zawierający powierzchniowy antygen. Jednak przy stosowaniu deoksycholanu sodu w etapie desorpcji konieczne jest jego usunięcie przez wielokrotną filtrację przez membranę.
Supematant otrzymany powyżej zawierający powierzchniowy antygen można dalej oczyścić metodą chromatografii na kolumnie hydrofobowej, przy czym żywica hydrofobowa jest korzystnie żelem agarowym z resztami fenylowymi. Przed zetknięciem supematantu z żywicą hydrofobową wypełniacz, to jest żywicę hydrofobową równoważy się buforem o pH od 8,8 do 11,0, który może być tym samym buforem co bufor z poprzedniego etapu. Bufor może korzystnie zawierać mocznik w stężeniu od 1 do 4M, aby w jak największym stopniu usunąć zanieczyszczające białka, które są mniej hydrofobowe niż powierzchniowy antygen.
Następnie supematant zawierający powierzchniowy antygen przepuszcza się przez kolumnę w celu zetknięcia z zawartą w niej substancją. Kolumnę starannie przemywa się buforem równoważącym zawierającym 10-40% wagowych glikolu etylenowego w celu usunięcia względnie słabo adsorbowanych zanieczyszczających białek z wypełnienia. Następnie powierzchniowy antygen związany z żywicą hydrofobową eluuje się buforem równoważącym zawierającym 60 do 80% wagowych glikolu etylenowego.
Taka chromatografia na kolumnie hydrofobowej reprezentuje bardzo wydajny etap oczyszczania, w którym można usunąć większość pozostałych zanieczyszczeń z supematantu po etapie adsorpcji na krzemionce. W szczególności można tu usunąć pirogenne substancje trudne do usunięcia w konwencjonalny sposób. Mocznik i glikol etylenowy pozostałe we frakcjach zawierających powierzchniowy antygen można usunąć np. przez dializę lub wielokrotnąfiltrację przez membranę, przy czym korzystnie stosuje się bufor o pH od 6 do 8.
Frakcje zawierające powierzchniowy antygen otrzymane metodą chromatografii na kolumnie hydrofobowej oczyszcza się dalej metodą wykluczającej rozmiary filtracyjnej chromatografii żelowej do stanu czystości powierzchniowego antygenu pozwalającego na jego wykorzystanie do wytwarzania szczepionki.
Przykładowo polarne matryce, które można stosować jako wypełniacze kolumn, obejmują np. żel agarowy, żel dekstranowy i żel poliakryloamidowy o wartości odcięcia masy cząsteczkowej co najmniej 1000000, korzystnie od 5000 do 500000. Wykluczającą rozmiary filtracyjną chromatografię żelową prowadzi się przepuszczając frakcje zawierające powierzchniowy antygen przez kolumnę równoważoną buforem Tris lub fosforanowym o pH od 6 do 8, zawierającym chlorek sodu w stężeniu od 0,1 do 0,2 M, i eluując powierzchniowy antygen tym samym buforem.
Frakcje zawierające powierzchniowy antygen łączy się i określa czystość powierzchniowego antygenu i zawartego w nim peptydu preS2 metodąSDS-PAGE. Jak wskazująróżne ekspe
182 103 rymenty w poniższych przykładach, oczyszczony według wynalazku powierzchniowy antygen j est tak czysty i zawiera tak dużo peptydu preS2, że oczyszczony antygen można stosować bezpośrednio do wytwarzania szczepionki.
Poniższe przykłady i przykład porównawczy mają dalej zilustrować wynalazek bez ograniczania jego zakresu.
Ponadto procenty podane poniżej ciała stałego w ciele stałym, cieczy w cieczy i ciała stałego w cieczy są oparte odpowiednio na stosunkach wagowo/wagowych, objętościowo/objętościowych i wagowo/objętościowych, jeśli nie podano w danym przypadku inaczej.
Przykład 1 (Etap 1) Rozrywanie komórki drożdży
Rekombinacyjny Saccharomyces cerevisiae KCTC 0098BP, zdolny do ekspresji powierzchniowego antygenu wirusa Hepatitis B zawierającego peptyd preS2, hodowano w temperaturze 27°C w 30 1 medium YEPD (1% ekstraktu z drożdży, 2% peptonu drożdży, 1,6% glukozy). Tak otrzymane 70 g placka z komórek drożdży zmieszano ze 140 ml bufora 1 (50 nM Tris, pH 7,2, 1 M tiocyjanian sodu, 0,15 M chlorek sodu, 10 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) i 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu), i mieszaninę dodano do pojemnika wytrząsarki kulkowej (Biospec Products, OKLA, U.S.A.) zawierającego 210 ml szklanych kulek o średnicy 0,5 mm.
Pojemnik zanurzono w wodzie z lodem i uruchomiono wytrząsarkę trzykrotnie w odstępach co 15 minut, za każdym razem na 5 minut. Powstały homogenizat komórek oddzielono od kulek, przemyto kulki 210 ml buforu 1 i roztwór przemywający połączono z homogenizatem.
(Etap 2) Ekstrakcja i rozpuszczanie powierzchniowego antygenu
Do homogenizatu komórek otrzymanego w (etapie 1) dodano 0,1% (wagowo/objętościowo) Tween 20 i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
Roztwór ustawiono na pH 11,5 dodatkiem 5 N wodorotlenku sodu i mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Powstały roztwór ustawiono napH 5,2 dodatkiem 20% kwasu octowego, mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut i pozostawiono na 30 minut.
Roztwór odwirowano w temperaturze 8°C usuwając resztki komórek wraz z osadami.
Supematant zawierający powierzchniowy antygen ustawiono na pH 7,2 dodatkiem 5 N wodorotlenku sodu. W tym etapie objętość supematantu wynosiła około 300 ml.
(Etap 3) Adsorpcja i desorpcja przy zastosowaniu krzemionki
Osuszoną krzemionkę zmieszano z wodą otrzymując 5% zawiesinę (sucha masa/objętość zawiesiny), 70 ml zawiesiny dodano do supematantu otrzymanego w (etapie 2) i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Powstały roztwór odwirowywano przy 5500 obrotach na minutę przez 10 minut w celu usunięcia supematantu, i strąconą krzemionkę z zaadsorbowanym powierzchniowym antygenem przemyto dwukrotnie buforem fosforanowym (pH 7,2) zawierającym 0,15 M chlorku sodu.
Przemytą krzemionkę dodano do 70 ml 50 mM węglanowego bufom (pH 9,5) zawierającego 1 M mocznik i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę desorbując powierzchniowy antygen z krzemionki. W tym miejscu bufor miał pH 9,2. Roztwór odwirowano (Beckman JAM) przy 12000 obrotów na minutę przez 30 minut otrzymując supematant zawierający powierzchniowy antygen.
Ilość powierzchniowego antygenu wirusa Hepatitis B w supematancie wynosiła około 6,5 mg po zmierzeniu zestawem Auzyme (Abbott, U.S.A.).
Przykład 2 (porównawczy)
Powtórzono procedury z przykładu 1 Jednak nie dołączając tiocyjanianu sodu do bufom 1, w celu otrzymania roztworu oczyszczonego powierzchniowego antygenu. W wyniku tego ilość powierzchniowego antygenu wirusa Hepatitis B w supematancie wynosiła około 7,1 mg po zmierzeniu zestawem Auzyme.
Roztwory powierzchniowego antygenu otrzymane w przykładach 1 i 2 poddano elektroforezie na żelu poliakryloamidowym z 15% dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), a następnie barwieniu srebrem. Wynik pokazano na fig. 1, na której ścieżki 1 i 2 reprezentują roztwory
182 103 powierzchniowego antygenu otrzymane odpowiednio w przykładzie 1 i 2. A oznacza nietknięte pasmo białka, a B i C fragmenty powstałe w wyniku ataku proteazy.
Jak pokazuje fig. 1, powierzchniowy antygen zawierający dużo peptydu preS2 można wydzielić z komórek drożdży z dużą wydajnością zgodnie ze sposobem według wynalazku.
Przykład 3 (Etap 1) Rozrywanie komórki drożdży
Rekombinacyjny Saccharomyces cerevisiae KCTC 0098BP, zdolny do ekspresji powierzchniowego antygenu wirusa Hepatitis B zawierającego peptyd preS2, hodowano w temperaturze 27°C w 3001 medium YEPD. Tak otrzymane 3 kg placka z komórek drożdży zmieszano z 61 bufora 1 i przepuszczono dwukrotnie przez Dynomill (Glenmill) zawierający 31 szklanych kulek o średnicy 0,5 mm, w temperaturze 10°C przy natężeniu przepływu 650 ml na minutę, w celu rozerwania komórek drożdży.
Powstały homogenizat komórek oddzielono od szklanych kulek, przemyto kulki 91 buforu 1 i roztwór przemywający połączono z homogenizatem. Ilość HBsAg w supematancie wynosiła około 754 mg po zmierzeniu zestawem Auzyme.
(Etap 2) Ekstrakcja i rozpuszczanie powierzchniowego antygenu
Do homogenizatu komórek otrzymanego w (etapie 1) dodano 0,1% (wagowo/objętościowo) Tween 20 i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
Roztwór ustawiono na pH 11,5 dodatkiem 5 N wodorotlenku sodu i mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Powstały roztwór ustawiono na pH 5,2 dodatkiem 20% kwasu octowego, mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut i pozostawiono na 30 minut.
Roztwór odwirowano w temperaturze 8°C usuwając resztki komórek wraz z osadami.
Supematant zawierający powierzchniowy antygen ustawiono na pH 7,2 dodatkiem 5 N wodorotlenku sodu. W wyniku tego końcowa objętość supematantu wynosiła około 12 1, a ilość HBsAg w supematancie wynosiła około 1250 mg po zmierzeniu zestawem Auzyme.
Wydajność powierzchniowego antygenu wynosiła 165,8% względem ilości powierzchniowego antygenu oznaczonej w (etapie 1). Ta niespodziewanie wysoka wydajność wynika głównie z połączonego działania środka powierzchniowo czynnego i zasady, zwiększających antygenność i polepszających rozpuszczalność powierzchniowego antygenu.
(Etap 3) Adsorpcja i desorpcja przy zastosowaniu krzemionki
Supematant otrzymany w (etapie 2) rozcieńczono dwukrotną objętością 0,15 M chlorku sodu i adsorbowano na krzemionce (Aerosil 380) zgodnie z następującą procedurą. Osuszoną krzemionkę zmieszano z wodą otrzymując 10% zawiesinę (sucha masa/objętość zawiesiny), 1,5 1 zawiesiny dodano do supematantu otrzymanego w (etapie 2) i całość mieszano w temperaturze 4°C przez noc.
Powstały roztwór odwirowywano przy 5500 obrotach na minutę przez 10 minut w celu usunięcia supematantu, i strąconą krzemionkę z zaadsorbowanym powierzchniowym antygenem przemyto dwukrotnie buforem fosforanowym (pH 7,2) zawieraj ącym 0,15 M chlorku sodu.
Przebytąkrzemionkę dodano do 3150 mM węglanowego bufom (pH 9,5) zawierającego 1M mocznik i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny desorbując powierzchniowy antygen z krzemionki. W tym miejscu bufor miał pH 9,2. Roztwór odwirowano przy 8700 obrotach na minutę przez 30 minut otrzymując supematant zawierający powierzchniowy antygen.
Ilość HBsAg w supematancie wynosiła około 895 mg po zmierzeniu zestawem Auzyme (wydajność 118,7%).
(Etap 4) Chromatografia na kolumnie hydrofobowej
Do supematantu otrzymanego w (etapie 3) zawierającego powierzchniowy antygen dodano mocznik do końcowego stężenia 4 M i powstały roztwór przepuszczono przez kolumnę fenyloagarowąrównoważoną 50 mM buforem węglanowym (pH 9,2) zawierającym 4 M mocznika. Kolumnę przemyto tym samym buforem zawierającym 20% glikolu etylenowego. Następnie ten sam bufor zawierający 60% glikolu etylenowego podano na kolumnę w celu eluowania powierzchniowego antygenu.
182 103
Eluowane frakcje zawierające powierzchniowy antygen połączono i przesączono w układzie diafiltracji Amicon (Amicon, U.S.A.) o wartości odcięcia masy cząsteczkowej 100000, w celu usunięcia mocznika i glikolu etylenowego w eluacie, a powstały przesącz zatężono w tym samym układzie.
Ilość HBsAg w supematancie wynosiła około 546 mg po zmierzeniu zestawem Auzyme (wydajność 72,4%).
(Etap 5) Chromatografia żelowa filtracyjna
Sepharose CL-4B (Pharmacia, U.S.A.) umieszczono w kolumnie i zrównoważono buforem fosforanowym (pH 7,2) zawierającym 0,15 M chlorku sodu. Koncentrat zawierający powierzchniowy antygen, otrzymany w (etapie 4) przepuszczono przez kolumnę i eluowano tym samym buforem otrzymując frakcje zawierające powierzchniowy antygen.
Ilość HBsAg (nietkniętego i fragmentów z atalu proteazowego) w połączonych frakcjach wynosiła około 540 mg, po zmierzeniu zestawem Auzyme (wydajność 71,6%), a czystość powierzchniowego antygenu wynosiła około 98,2%. Zawartość peptydu preS2 w całości powierzchniowego antygenu oznaczono metodą SDS-PAGE na około 75%. Oczyszczony roztwór powierzchniowego antygenu otrzymany w taki sposób przesączono przez filtr 0,2 pm (Corning, U.S.A.), a przesącz przechowywano w temperaturze 4°C.
Przykład 4 (Etap 1) Rozrywanie komórki drożdży
Rekombinacyjny Saccharomyces cerevisiae KCTC 0098BP hodowano w temperaturze 27°C w 3001 medium YEPD. Tak otrzymane 4 kg placka z komórek drożdży zmieszano z 81 bufora 1 i mieszaninę przepuszczono dwukrotnie przez Dynomill (Glenmills, Japonia) zawierający 31 szklanych kulek o średnicy 0,5 mm, w temperaturze 10°C przy natężeniu przepływu 650 ml na minutę, w celu rozerwania komórek drożdży.
Powstały homogenizat komórek oddzielono od szklanych kulek, przemyto kulki 121 bdforu 1 i roztwór przemywający połączono z homogenizatem.
(Etap 2) Ekstrakcja i rozpuszczanie powierzchniowego antygenu
Do homogenizatu komórek otrzymanego w (etapie 1) dodano 0,1% (wagowo/objętościowo) Tween 20 i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
Do roztworu dodano nasycony roztwór siarczanu amonu do końcowego stężenia 10% i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Powstały roztwór odwirowano w temperaturze 8°C w celu usunięcia resztek komórek wraz z osadami.
Supematant przesączono w układzie diafiltracji Amicon (Amicon, U.S.A.) o wartości odcięcia masy cząsteczkowej 100000 z 20 mM buforem Tris (pH 7,5), w celu usunięcia tiocyjanianu i siarczanu sodu, a następnie zatężono w tym samym układzie do końcowej objętości 6 1.
Koncentrat ustawiono na pH 11,5 dodatkiem 5 N wodorotlenku sodu i mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Powstały roztwór ustawiono na pH 5,2 dodatkiem 20% kwasu octowego, mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut i pozostawiono na 30 minut. Roztwór odwirowano w temperaturze 8°C usuwając resztki komórek wraz z osadami.
Supematant zawierający powierzchniowy antygen ustawiono na pH 7,2 dodatkiem 5 N wodorotlenku sodu, a ilość HBsAg w supematancie wynosiła około 1400 mg po zmierzeniu zestawem Auzyme.
(Etap 3) Adsorpcja i desorpcja przy zastosowaniu krzemionki
Supematant otrzymany w (etapie 2) adsorbowano na krzemionce (Aerosil 380) zgodnie z następującąprocedurą. Osuszoną krzemionkę zmieszano z wodą otrzymując 10% zawiesinę (sucha masażobjętość zawiesiny), 21 zawiesiny dodano do supematantu otrzymanego w (etapie 2) i całość mieszano w temperaturze 4°C przez noc.
Powstały roztwór odwirowywano przy 5500 obrotach na minutę przez 10 minut w celu usunięcia supematantu, i strąconą krzemionkę z zaadsorbowanym powierzchniowym antygenem przemyto dwukrotnie buforem fosforanowym (pH 7,2) zawierającym 0,15 M chlorku sodu.
Przemytą krzemionkę dodano do 4150 mM węglanowego bufom (pH 9,5) zawierającego 1 M mocznik i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny desorbując powierzch
182 103 niowy antygen z krzemionki. W tym miejscu bufor miał pH 9,2. Roztwór odwirowano przy 8700 obrotach na minutę otrzymując supematant zawierający powierzchniowy antygen.
Ilość HBsAg w supematancie wynosiła około 840 mg po zmierzeniu zestawem Auzyme.
(Etap 4) Chromatografia na kolumnie hydrofobowej
Do supematantu otrzymanego w (etapie 3) zawierającego powierzchniowy antygen dodano mocznik do końcowego stężenia 4 M i powstały roztwór przepuszczono przez kolumnę fenyloagarową równoważoną 50 mM buforem węglanowym (pH 9,2) zawierającym 4 M mocznika. Kolumnę przemyto tym samym buforem zawierającym 20% glikolu etylenowego. Następnie ten sam bufor zawierający 60% glikolu etylenowego podano na kolumnę w celu eluowania powierzchniowego antygenu.
Eluowane frakcje zawierające powierzchniowy antygen połączono i przesączono w układzie diafiltracji Amicon (Amicon, U.S.A.) o wartości odcięcia masy cząsteczkowej 100000, w celu usunięcia mocznika i glikolu etylenowego w eluacie, a powstały przesącz zatężono w tym samym układzie.
Ilość HBsAg w supematancie wynosiła około 527 mg po zmierzeniu zestawem Auzyme.
(Etap 5) Chromatografia żelowa filtracyjna
Sepharose CL-4B (Pharmacia, U.S.A.) umieszczono w kolumnie i zrównoważono buforem fosforanowym (pH 7,2) zawierającym 0,15 M chlorku sodu. Koncentrat zawierający powierzchniowy antygen, otrzymany w (etapie 4) przepuszczono przez kolumnę i eluowano tym samym buforem otrzymując frakcje zawierające powierzchniowy antygen.
Ilość powierzchniowego antygenu wirusa Hepatitis B w połączonych frakcjach wynosiła około 480 mg, o zmierzeniu zestawem Auzyme, a czystość powierzchniowego antygenu wynosiła około 98,9%. Zawartość peptydu preS2 w całości powierzchniowego antygenu oznaczono metodą SDS-PAGE na około 75%. Oczyszczony roztwór powierzchniowego antygenu otrzymany w taki sposób przesączono przez filtr 0,2 pm (Corning, U.S.A.), a przesącz przechowywano w temperaturze 4°Ć.
Przykład 5
Immunogenności peptydów S i preS2 z powierzchniowych antygenów otrzymanych w przykładach 3 i 4 (dalej nazywanych „powierzchniowy antygen 3” i „powierzchniowy antygen 4”) potwierdzono zgodnie z następującymi doświadczeniami z zastosowaniem świnek morskich.
ml (200 pg/ml) powierzchniowego antygenu 3 lub 4 zmieszano z 18 ml bufora fosforanowego zawierającego 0,15 M chlorku sodu i mieszaninę przesączono przez filtr strzykawkowy 0,2 pm. Przesącz zmieszano z 1 ml 3% alhydrożelu (Superfos Biosector, Dania). Powyższą procedurę prowadzono w warunkach sterylnych na czystym stole.
Każdą z jedenastu świnek morskich ważącą około 350 g zaszczepino podskórnie 1 ml kompozycji powierzchniowego antygenu 3 lub 4, dwukrotnie w odstępie 15 dni. Po 30 dniach od pierwszego zastrzyku pobrano od każdej świnki próbki krwi i oddzielono osocza. Po analizie zestawem Ausab® (Abbott, U.S.A.) ustalono, że szybkości tworzenia przeciwciał wobec peptydów S z powierzchni antygenów 3 lub 3 wynosiły 100%, a GMT powierzchniowych antygenów 3 i 4 odpowiednio 33,38 i 29,77 mlU/ml.
Szybkość tworzenia przeciwciał wobec peptydu preS2 określono zgodnie z poniższą procedurą. 50 μΐ (1 mg/ml) peptydu preS2 z N-terminalnymi 26 aminokwasami, syntetyzowanego przy pomocy syntezatora peptydów (Applied Biosystems, U.S.A.) z automatyczną syntezą w fazie stałej, i 20 pl (10 mg/ml) poli-L-lizyny dodano do 200 μΐ 50 mM bufora octanowego (pH 4,5). Do mieszaniny dodano 10 pl 1% EDC (l-etylo-3-(3-dimetylo-aminopropylo)karbodiimidu) i powstałą mieszaninę poddano reakcji w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Powstały produkt rozcieńczono 20 ml lOmM bufora węglanowego (pH 9,6) i dodano do studzienek płytki testu ELISA z 96 studzienkami w ilości 200 pl na studzienkę. Płytkę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 20 godzin, aby umożliwić adsorpcję peptydu na ściankach studzienek, i przemyto trzykrotnie wodą destylowaną.
Do studzienek dodano PBS zawierający 0,5% kazeiny w ilości 250 pl na studzienkę i płytkę inkubowano w temperaturze pokojowej przez ponad 2 godziny, aby zapobiec jakimkolwiek nie
182 103 specyficznym późniejszym reakcjom. Do każdej ze studzienek dodano pozytywne i negatywne próbki kontrolne oraz 200 μΐ każdego osocza świnek morskich, rozcieńczonego seryjnie dziesięciokrotnie PBS (grupa eksperymentalna). Płytkę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 4 godziny, a następnie przemyto pięciokrotnie buforem TTBS (0,9% chlorku sodu, 0,05% Tween 20,10 mM Tris, pH 7,5). Do studzienek dodano roztwór zawierający świńskie anty-świnka morska przeciwciało znaczone peroksydazą chrzanu (HRP), rozcieńczone 4000-krotną objętością PBS zawierającego 0,5% kazeiny, w ilości 200 μΐ na studzienkę. Powstałą mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę i przemyto 5-krotnie buforem TTBS.
Następnie do każdej studzienki dodano 200 μΐ roztworu substratu dla peroksydazy chrzanu, otrzymanego przez rozpuszczenie 200 gg tetrametylobenzydyny (TMB) w 20 gl DMSO, dodanie 10 ml 0,1 M bufora octanowego (pH 5,1) i 20 μΐ 30% nadtlenku wodoru i powiększenie objętości roztworu do 20 ml dodatkiem destylowanej wody, i poddano reakcji aż do pojawienia się koloru. Do powstałego produktu dodano 50 gl 1N kwasu siarkowego na każdą studzienkę dla powstrzymania powstawania koloru. Określono O.D. każdej studzienki przy długości fali 450 nm przy pomocy czytnika Microplate (Dynatech MR5000, U.S.A.).
Gdy O.D. grupy eksperymentalnej było wyższe od wartości odcinającej (podwójna wartość O.D. negatywnej próby kontrolnej), stwierdzono powstawanie przeciwciała wobec peptydu preS2 i policzono świnki morskie, u których wystąpiła pozytywna reakcja przeciwciała.
W wyniku doświadczenia stwierdzono, że oba powierzchniowe antygeny 3 i 4 wykazują 100% szybkość tworzenia przeciwciał.
Przykład 6
W celu określenia immunogenności peptydów S i preS2 z powierzchniowych antygenów 3 i 4 przeprowadzono następujące doświadczenia z zastosowaniem myszy. 1 ml (200 gg/ml) powierzchniowego antygenu 3 lub 4 zmieszano z 18 ml bufora fosforanowego (pH 7,2) zawierającego 0,15 M chlorku sodu i mieszaninę przesączono przez filtr strzykawkowy 0,1 gm. Przesącz zmieszano z 1 ml 3% alhydrożelu (Superfos Biosector, Dania).
Powstały roztwór zawierający 10 gg/ml powierzchniowego antygenu 3 lub 4 rozcieńczono alhydrożelowym rozcieńczalnikiem (otrzymanym przez rozcieńczenie alhydrożelu) do końcowego stężenia 0,15% buforem fosforanowym (pH 7,2) zawierającym 0,15 M chlorku sodu, otrzymując 4 próbki zawierające 0,01, 0,03, 0,09 i 0,27 ng/ml powierzchniowego antygenu. Pojemniki zawierające próbki wytrząsano w dostatecznym stopniu do zapobiegania wytrącenia alhydrożelu. Powyższą procedurę prowadzono w warunkach sterylnych na czystym stole.
pięciotygodniowych myszy podzielono na 8 grup po 10 myszy i każdą mysz zaszczepiono dootrzewnowe 1 ml każdym z rozcieńczonych roztworów powierzchniowego antygenu 3 lub 4 wytworzonych powyżej. Po 28 dniach od zastrzyku pobrano od każdej myszy próbki krwi i oddzielono osocza. Określono zawartość przeciwciał wobec peptydu S przy pomocy zestawu Ausab (Abbott, U.S.A.), a szybkości tworzenia przeciwciał wobec peptydów S z powierzchni antygenów 3 lub 4 podano w tabeli 1.
Tabela 1
| Stężenie powierzchniowego antygenu (ng/ml) | Szybkość powstawania przeciwciała wobec powierzchniowego antygenu (%) | |
| powierzchniowy antygen 3 | powierzchniowy antygen 4 | |
| 0,01 | 10 | 10 |
| 0,03 | 20 | 40 |
| 0,09 | 80 | 60 |
| 0,27 | 90 | 100 |
182 103
Zawartość przeciwciał wobec peptydu preS2 określono jak w przykładzie 5, a szybkość tworzenia przeciwciał wobec peptydów preS2 z powierzchni antygenów 3 lub 4 podano w tabeli 2.
Tabela 2
| Stężenie powierzchniowego antygenu (ng/ml) | Szybkość powstawania przeciwciała wobec powierzchniowego antygenu (%) | |
| powierzchniowy antygen 3 | powierzchniowy antygen 4 | |
| 0,01 | 10 | 10 |
| 0,03 | 20 | 40 |
| 0,09 | 80 | 60 |
| 0,27 | 90 | 100 |
Skuteczną dawkę 50 (ED50) peptydów S i preS2 obliczono metodą probit (Finney, D. J., Probit Analysis, 1971) stosując szybkości tworzenia przeciwciał otrzymane powyżej. Otrzymano ED50 peptydów S i preS2 z powierzchniowego antygenu 3 równe odpowiednio 0,0580 i 0,0577 ng/ml, a peptydów S i preS2 z powierzchniowego antygenu 4 równe odpowiednio 0,0455 i 0,0469 ng/ml. Jednak ze względu na 75% zawartości peptydu preS2 w powierzchniowym antygenie 3 lub 4, ED50 peptydu preS2 jest uważane za niższe od wartości otrzymanej powyżej.
Jak pokazują powyższe przykłady, powierzchniowy antygen wirusa Hepatitis B zawierający dużą ilość peptydu preS2 i silnie immunogenne peptydy S i preS2, można otrzymać z rekombinacyjnych komórek drożdży sposobem według wynalazku.
Wynalazek opisano powyżej w odniesieniu do pewnych specyficznych odmian, jednak należy rozumieć, że możliwe są różne modyfikacje i zmiany wynalazku dokonywane przez fachowców, które także mieszczą się w zakresie wynalazku zdefiniowanego w załączonych zastrzeżeniach.
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.
Cena 4,00 zł.
Claims (30)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób oczyszczania powierzchniowego antygenu wirusa Hepatitis B, zawierającego peptyd preS2 z komórek rekombinacyjnego organizmu, znamienny tym, że obejmuje etap rozrywania komórki przy pomocy roztworu buforowego, zawierającego chaotropową sól, z wytworzeniem homogenizatu komórek.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się chaotropowąsól wybranąz grupy, obejmującej tiocyjanian sodu, tiocyjanian potasu, tiocyjanian amonu, chlorowodorek guanidyny i mocznik.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się chaotropową sól o stężeniu w roztworze buforowym od 1 do 8 M.
- 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ponadto (a) dodaje się środek powierzchniowo czynny do homogenizatu komórkowego w celu ekstrakcji powierzchniowego antygenu z błony komórkowej, (b) zwiększa się rozpuszczalność i promuje tworzenie cząstek powierzchniowego antygenu w ekstrakcie otrzymanym w etapie (a) przez alkalizację ekstraktu, (c) wytrąca się i usuwa resztki komórek, lipidów i zanieczyszczających białek z ekstraktu przetwarzanego w etapie (b) przez zakwaszenie i odwirowanie ekstraktu w celu otrzymania roztworu, zawierającego powierzchniowy antygen, (d) styka się roztwór otrzymany w etapie (c) z krzemionką w celu adsorbowania powierzchniowego antygenu na krzemionce, wymycia zanieczyszczających białek i desorpcji powierzchniowego antygenu z krzemionki przy pomocy bufora, w celu otrzymania frakcji oczyszczonego powierzchniowego antygenu, (e) poddaje się frakcję oczyszczonego powierzchniowego antygenu otrzymanego w etapie (d) chromatografii na kolumnie hydrofobowej w celu otrzymania frakcji, zawierających powierzchniowy antygen, oraz (f) oczyszcza się chromatograficznie frakcje otrzymane w etapie (e) techniką sączenia molekularnego w celu otrzymania powierzchniowego antygenu w postaci czystej.
- 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że ponadto dodaje się sól do ekstraktu komórek otrzymanego w etapie (a) lub (b), usuwa się resztki komórek i zanieczyszczenia i poddaje się supematant filtracji przez membranę przed etapem (c).
- 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako środek powierzchniowo czynny w etapie (a) stosuje się polisorbit 20, polisorbit 80, eter polioksyetyleno oktylofenylowy lub deoksycholan sodu.
- 7. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się w etapie (a) środek powierzchniowo czynny w stężeniu od 0,1 do 0,5% (wagowo/objętościowo) względem objętości homogenizatu komórkowego.
- 8. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że w etapie (b) ustawia się odczyn pH ekstraktu komórkowego z etapu (a) na 11,0 do 13,5.
- 9. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że w etapie (c) ustawia się odczyn pH ekstraktu komórkowego na 4,5 do 6,0.
- 10. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się w etapie (d) krzemionkę o powierzchni właściwej od 100 do 500 m2/g.
- 11. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że w etapie (d) desorbuje się powierzchniowy antygen z krzemionki stosując roztwór buforowy o pH od 8,8 do 11,0, zawierający mocznik w stężeniu od 1 do 8 M i środek powierzchniowo czynny w stężeniu od 0,1 do 0,3% wagowych.
- 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jako środek powierzchniowo czynny stosuje się deoksycholan sodu.182 103
- 13. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako hydrofobową żywicę w etapie (e) stosuje się żel agarowy z grupami fenylowymi.
- 14. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że chromatografię na kolumnie hydrofobowej w etapie (e) prowadzi się przepuszczając frakcję zawierającą powierzchniowy antygen przez kolumnę równoważoną roztworem buforowym równoważącym o pH wahającym się od 8,8 do 11,0 i zawierającym mocznik w stężeniu od 1 do 4 M, przemywając kolumnę roztworem buforowym, równoważącym, zawierającym 10-40% glikolu etylenowego i eluując powierzchniowy antygen roztworem buforowym równoważącym zawierającym 60-80% glikolu etylenowego.
- 15. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że chromatograficzne sączenie molekularne w etapie (f) prowadzi się przepuszczając frakcję, zawierającąpowierzchniowy antygen przez kolumnę równoważoną roztworem buforowym 2-amino-2-hydroksymetylo-1,2-propanodiolu lub fosforanowym o pH od 6 do 8 i zawierającym chlorek sodu w stężeniu od 0,1 do 0,2 M i eluując powierzchniowy antygen tym samym buforem.
- 16. Szczepionka przeciwko wirusowi Hepatitis B, zawierająca oczyszczony powierzchniowy antygen wirusa Hepatitis B zawierający peptydpreS2, znamienna tym, że powierzchniowy antygen został oczyszczony z komórek rekombinacyjnego organizmu sposobem obejmującym etap rozrywania komórki przy pomocy roztworu buforowego, zawierającego chaotropową sól, z wytworzeniem homogenizatu komórek.
- 17. Szczepionka według zastrz. 16, znamienna tym, że do oczyszczania stosuje się chaotropową sól wybraną z grupy, obejmujące tiocyjanian sodu, tiocyjanian potasu, tiocyjanian amonu, chlorowodorek guanidyny i mocznik.
- 18. Szczepionka według zastrz. 16, znamienna tym, że do oczyszczania stosuje się chaotropową sól o stężeniu w roztworze buforowym od 1 do 8 M.
- 19. Szczepionka według zastrz. 16, znamienna tym, że ponadto podczas oczyszczania (a) dodaje się środek powierzchniowo czynny do homogenizatu komórkowego w celu ekstrakcji powierzchniowego antygenu z błony komórkowej, (b) zwiększa się rozpuszczalność i promuje tworzenie cząstek powierzchniowego antygenu w ekstrakcie otrzymywanym w etapie (a) przez alkalizację ekstraktu, (c) wytrąca się i usuwa resztki komórek, lipidów i zanieczyszczających białek z ekstraktu przetwarzanego w etapie (b) przez zakwaszenie i odwirowanie ekstraktu w celu otrzymania roztworu zawierającego powierzchniowy antygen, (d) styka się roztwór otrzymany w etapie (c) z krzemionką w celu adsorbowania powierzchniowego antygenu na krzemionce, wymycia zanieczyszczających białek i desorpcji powierzchniowego antygenu z krzemionki przy pomoc bufora, w celu otrzymania frakcji oczyszczonego powierzchniowego antygenu, (e) poddaje się frakcję oczyszczonego powierzchniowego antygenu otrzymanego w etapie (d) chromatografii na kolumnie hydrofobowej w celu otrzymania frakcji zawierających powierzchniowy antygen, oraz (f) oczyszcza się chromatograficznie frakcje otrzymane w etapie (e) techniką sączenia molekularnego w celu otrzymania powierzchniowego antygenu w postaci czystej.
- 20. Szczepionka według zastrz. 19, znamienna tym, że ponadto podczas oczyszczania dodaje się sól do ekstraktu komórek otrzymanego w etapie (a) lub (b), usuwa się resztki komórek i zanieczyszczenia i poddaje się supematant filtracji przez membranę przed etapem (c).
- 21. Szczepionka według zastrz. 19, znamienna tym, że jako środek powierzchniowo czynny w etapie (a) stosuje się polisorbit 20, polisorbit 80, eter polioksyetyleno oktylofenylowy lub deoksycholan sodu.
- 22. Szczepionka według zastrz. 19, znamienna tym, że stosuje się w etapie (a) środek powierzchniowo czynny w stężeniu od 0,1 do 0,5% (wagowo/objętościowo) względem objętości homogenizatu komórkowego.
- 23. Szczepionka według zastrz. 19, znamienna tym, że w etapie (b) ustawia się odczyn pH ekstraktu komórkowego z etapu (a) na 11,0 do 13,5.
- 24. Szczepionka według zastrz. 19, znamienna tym, że w etapie (c) ustawia się odczyn pH ekstraktu komórkowego na 4,5 do 6,0.
- 25. Szczepionka według zastrz. 19, znamienna tym, że w etapie (d) stosuje się krzemionkę o powierzchni właściwej od 100 do 500 m2/g.182 103
- 26. Szczepionka według zastrz. 19, znamienna tym, że w etapie (d) desorbuje się powierzchniowy antygen z krzemionki stosując roztwór buforowy o pH od 8,8 do 11,0, zawierający mocznik w stężeniu od 1 do 8 M i środek powierzchniowo czynny w stężeniu od 0,1 do 0,3% wagowych.
- 27. Szczepionka według zastrz. 26, znamienna tym, że jako środek powierzchniowo czynny stosuje się deoksycholan sodu.
- 28. Szczepionka według zastrz. 19, znamienna tym, że jako hydrofobową żywicę w etapie (e) stosuje się żel agarowy z grupami fenylowymi.
- 29. Szczepionka według zastrz. 19, znamienna tym, że chromatografię na kolumnie hydrofobowej w etapie (e) prowadzi się przepuszczając frakcję, zawierającąpowierzchniowy antygen przez kolumnę równoważoną roztworem buforowym równoważącym o pH wahającym się od 8,8 do 11,0 i zawierającym mocznik w stężeniu do 1 do 4 M, przemywając kolumnę roztworem buforowym równoważącym, zawierającym 10-40% glikolu etylenowego i eluując powierzchniowy antygen roztworem buforowym równoważącym zawierającym 60-80% glikolu etylenowego.
- 30. Szczepionka według zastrz. 19, znamienna tym, że chromatografię techniką sączenia molekularnego w etapie (f) prowadzi się przepuszczając frakcję, zawierającą powierzchniowy antygen przez kolumnę równoważoną roztworem buforowym 2-amino-2-hydroksymetylo-1,2-propanodiolu lub fosforanowym o pH wahającym się od 6 do 8 i zawierającym chlorek sodu w stężeniu od 0,1 do 0,2 M i eluując powierzchniowy antygen tym samym buforem.* * *
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR19940033594 | 1994-12-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL311735A1 PL311735A1 (en) | 1996-06-24 |
| PL182103B1 true PL182103B1 (pl) | 2001-11-30 |
Family
ID=19400952
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL95311735A PL182103B1 (pl) | 1994-12-10 | 1995-12-08 | Sposób oczyszczania powierzchniowego antygenu wirusa Hepatitis B zawierajacego peptyd preS2 oraz szczepionka przeciw wirusowi Hepatitis B PL PL PL |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6362320B1 (pl) |
| EP (1) | EP0716094B1 (pl) |
| KR (1) | KR960023066A (pl) |
| CN (1) | CN1057532C (pl) |
| AR (1) | AR002006A1 (pl) |
| AT (1) | ATE264341T1 (pl) |
| BG (1) | BG63699B1 (pl) |
| BR (1) | BR9505739A (pl) |
| CA (1) | CA2164672C (pl) |
| CO (1) | CO4480040A1 (pl) |
| CZ (1) | CZ291024B6 (pl) |
| DE (1) | DE69532878T2 (pl) |
| DK (1) | DK0716094T3 (pl) |
| ES (1) | ES2217272T3 (pl) |
| JO (1) | JO1885B1 (pl) |
| PE (1) | PE56396A1 (pl) |
| PL (1) | PL182103B1 (pl) |
| PT (1) | PT716094E (pl) |
| RO (1) | RO113308B1 (pl) |
| RU (1) | RU2122430C1 (pl) |
| TR (1) | TR199501557A2 (pl) |
| UY (1) | UY24112A1 (pl) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA79735C2 (uk) * | 2000-08-10 | 2007-07-25 | Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. | Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах |
| KR100405174B1 (ko) * | 2001-02-02 | 2003-11-12 | 씨제이 주식회사 | 재조합 β형 간염바이러스 표면항원의 정제방법 |
| RU2205023C1 (ru) * | 2002-05-14 | 2003-05-27 | Закрытое акционерное общество "Медицинские технологии - "МТХ" | Способ получения поверхностного антигена вируса гепатита в из рекомбинантных клеток дрожжей hansenula polymorpha и вакцина для иммунизации против гепатита в |
| CN1997895A (zh) * | 2004-05-19 | 2007-07-11 | 株式会社先端生命科学研究所 | 乙型肝炎病毒的检测方法 |
| GB0522765D0 (en) * | 2005-11-08 | 2005-12-14 | Chiron Srl | Combination vaccine manufacture |
| RU2314125C1 (ru) * | 2006-04-25 | 2008-01-10 | Закрытое акционерное общество "Вектор-БиАльгам" | Способ получения инактивированной вакцины против вируса гепатита а |
| KR100948127B1 (ko) * | 2007-06-27 | 2010-03-18 | 주식회사 중앙백신연구소 | 복합호흡기 질환 돼지의 조직유제를 함유하는 백신 조성물 |
| BR112015005937A2 (pt) | 2012-09-17 | 2017-07-04 | Grace W R & Co | meios e dispositivos cromatográficos |
| FR2997222B1 (fr) * | 2012-10-19 | 2015-01-16 | Alstom Technology Ltd | Dispositif d'etablissement et/ou de coupure de courant a contacts permanents a usure reduite |
| US11389783B2 (en) | 2014-05-02 | 2022-07-19 | W.R. Grace & Co.-Conn. | Functionalized support material and methods of making and using functionalized support material |
| PL3302784T3 (pl) | 2015-06-05 | 2022-01-17 | W.R. Grace & Co.-Conn. | Adsorbentowe środki klarujące do bioprzetwarzania oraz sposoby ich wytwarzania i stosowania |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5340926A (en) * | 1983-03-25 | 1994-08-23 | Celltech, Limited | Process for the recovery of recombinantly produced protein from insoluble aggregate |
| US4649192A (en) * | 1985-05-30 | 1987-03-10 | Smith Kline-Rit | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate |
| US4816564A (en) * | 1986-01-31 | 1989-03-28 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
| DE3883596T2 (de) * | 1987-03-09 | 1994-02-17 | Merck & Co Inc | Reinigung von rekombiniertem Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen. |
| EP0310178A1 (en) * | 1987-09-30 | 1989-04-05 | Merck & Co. Inc. | Recovery of pres2+S antigen |
| EP0314240A3 (en) * | 1987-10-26 | 1990-03-28 | Merck & Co. Inc. | Process for purifying recombinant hepatitis antigens |
| US5004688A (en) * | 1988-04-15 | 1991-04-02 | Phillips Petroleum Company | Purification of hepatitis proteins |
| US5030720A (en) * | 1988-09-01 | 1991-07-09 | Merck & Co., Inc. | Pres2+S hepatitis B vaccine derived from plasma |
| EP0384058A1 (en) * | 1989-02-09 | 1990-08-29 | Development Center For Biotechnology | Isolation of hepatitis B surface antigen from transformed yeast cells |
| CU22290A1 (es) * | 1990-10-08 | 1995-01-31 | Cigb | Procedimiento para la obtencion de antigeno de superficie del virus de la hepatitis b de superior capacidad inmunoganica y su uso en un preparado vacunal |
-
1995
- 1995-11-29 KR KR1019950044795A patent/KR960023066A/ko active Granted
- 1995-12-07 CO CO95057860A patent/CO4480040A1/es unknown
- 1995-12-07 JO JO19951885A patent/JO1885B1/en active
- 1995-12-07 PE PE1995286655A patent/PE56396A1/es not_active Application Discontinuation
- 1995-12-07 CA CA002164672A patent/CA2164672C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-08 PT PT95119383T patent/PT716094E/pt unknown
- 1995-12-08 RO RO95-02141A patent/RO113308B1/ro unknown
- 1995-12-08 DK DK95119383T patent/DK0716094T3/da active
- 1995-12-08 AT AT95119383T patent/ATE264341T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-12-08 ES ES95119383T patent/ES2217272T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-08 BG BG100212A patent/BG63699B1/bg unknown
- 1995-12-08 CZ CZ19953247A patent/CZ291024B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-12-08 DE DE69532878T patent/DE69532878T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-08 RU RU95120587A patent/RU2122430C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-12-08 PL PL95311735A patent/PL182103B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-12-08 EP EP95119383A patent/EP0716094B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-11 UY UY24112A patent/UY24112A1/es not_active IP Right Cessation
- 1995-12-11 AR ARP950100498A patent/AR002006A1/es active IP Right Grant
- 1995-12-11 BR BR9505739A patent/BR9505739A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-12-11 CN CN95120408A patent/CN1057532C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-11 TR TR95/01557A patent/TR199501557A2/xx unknown
-
1999
- 1999-11-02 US US09/432,300 patent/US6362320B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR960023066A (ko) | 1996-07-18 |
| DK0716094T3 (da) | 2004-07-26 |
| BR9505739A (pt) | 1997-12-23 |
| CZ324795A3 (en) | 1996-06-12 |
| CN1132211A (zh) | 1996-10-02 |
| AR002006A1 (es) | 1998-01-07 |
| BG100212A (bg) | 1996-12-31 |
| UY24112A1 (es) | 1996-05-10 |
| BG63699B1 (bg) | 2002-09-30 |
| RU2122430C1 (ru) | 1998-11-27 |
| ES2217272T3 (es) | 2004-11-01 |
| EP0716094B1 (en) | 2004-04-14 |
| KR0177254B1 (pl) | 1999-04-01 |
| DE69532878D1 (de) | 2004-05-19 |
| US6362320B1 (en) | 2002-03-26 |
| CN1057532C (zh) | 2000-10-18 |
| PL311735A1 (en) | 1996-06-24 |
| EP0716094A1 (en) | 1996-06-12 |
| DE69532878T2 (de) | 2005-06-09 |
| RO113308B1 (ro) | 1998-06-30 |
| PE56396A1 (es) | 1996-12-14 |
| CO4480040A1 (es) | 1997-07-09 |
| ATE264341T1 (de) | 2004-04-15 |
| JO1885B1 (en) | 1997-12-15 |
| CZ291024B6 (cs) | 2002-12-11 |
| CA2164672A1 (en) | 1996-06-11 |
| PT716094E (pt) | 2004-08-31 |
| CA2164672C (en) | 2004-06-22 |
| TR199501557A2 (tr) | 1997-03-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5559847B2 (ja) | ワクチンに使用するためのｈｂｖ抗原の精製 | |
| US4649192A (en) | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate | |
| PL182103B1 (pl) | Sposób oczyszczania powierzchniowego antygenu wirusa Hepatitis B zawierajacego peptyd preS2 oraz szczepionka przeciw wirusowi Hepatitis B PL PL PL | |
| AU2001282073A1 (en) | Purification of HBV antigens for use in vaccines | |
| KR910008643B1 (ko) | B형 간염 비루스 표면항원(HBs 항원)의 정제 방법 | |
| JPS60197629A (ja) | ＨＢｓ抗原の精製方法 | |
| JPH0585526B2 (pl) | ||
| US5011915A (en) | Process for purifying recombinant hepatitis antigens | |
| US6991929B1 (en) | Hepatitis A vaccines | |
| EP0005864B1 (en) | Antigenic composition useful as a vaccine or vaccine intermediate, and process for preparing same | |
| EP0294071A2 (en) | Hepatitis B vaccines made with pre-formed aluminum hydroxide gels, and processes thereof | |
| EP0314240A2 (en) | Process for purifying recombinant hepatitis antigens | |
| KR100194247B1 (ko) | 재조합 b형 간염 표면 항원의 정제방법 | |
| KR0159716B1 (ko) | B형 간염 표면 항원의 정제방법 | |
| JPS61103895A (ja) | ＨＢｓＡｇの精製方法 | |
| KR100254828B1 (ko) | 재조합 효모로 부터 발현된 b형 간염 항원의 추출 방법 | |
| RU2205023C1 (ru) | Способ получения поверхностного антигена вируса гепатита в из рекомбинантных клеток дрожжей hansenula polymorpha и вакцина для иммунизации против гепатита в | |
| TWI311563B (en) | Method for production a stable,immunogenic hepatitis b vaccine without trace of thiomersal | |
| JPH01196293A (ja) | Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の抽出方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20061208 |