JPS60197629A - ＨＢｓ抗原の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＢ型肝炎ウィルスの表面抗原（以下ＨＢｓ抗原
と略称する）の精製法、さらに詳しくは、組換えＤＮＡ
技術を利用した組換え体により産生きれるＨＢｓ抗原の
工業的精製法に関するものである。

発明の技術的背景と産業の利用分野 Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎ウィルス（以下ＨＢＶと略称する
）によって起り、疫学的にも、臨床的にも非常に重大な
る問題を含む、いまだ有効な治療対策が見出されていな
い疫病である。これは世界中に広く分布しているが、特
にアジア、アフリカ地域に多発し問題となっている。

予防する対策としては、ＨＢ　ｓ抗原を有効成分とする
ワクチンが最も有効であると考えられ、実用化段階に入
っている。すなわち、キャリアーと称されるＢ型肝炎ウ
ィルス潜伏持続感染者の血漿より得られるＨＢｓ抗原を
高度に精製し、これを不活化してＢ型肝炎ワクチンがつ
くられている。

しかしながら、このように血液由来のワクチンは原料を
血液にもとめるため、またＢ型肝炎ウィルスあるいは他
の血液由来のウィルスなどの感染性の因子の残存を否定
するために、チンパンジーによる安全性確認試験か必要
であること、検定用のチンパンジーの確保が非常に困難
であることなどの問題点もあり、製造上に多くの制約が
ある。

このような懸案を解消する方策として、組換えＤＮＡ技
術を利用して、大腸菌や、酵母菌に）ＩＢｓ抗原蛋白質
をコードするＨＢＶのＤＮＡを導入、発現させることに
より、ワクチンの原材料となるＨＢｓ抗原のみを大量に
作り出す研究が多くの研究者らによって推進されてきた
。最近、これら組換え体による）ＩＢｓ抗原の発現が成
功を収め、特に組換え酵母によるＨＢｓ抗原の産生につ
いては、工業的応用を可能とする段階に至った。なお、
実用化のためには、残された重要課題として、組換え体
によって産生されたＨＢｓ抗原を、ワクチン材料あるい
は診断用試薬材料となしうる程度まで、高度に精製する
方法の開発が挙げられる。

従来技術 血液由来のＨＢｓ抗原の精製法としては、密度勾配遠心
法［Ｖｙａｓ、Ｇ％Ｎ等、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ。

１０８．１１１４（１９７２）］、ポリエチレングリコ
ール分画とゲル゛口過、遠心分離を組み合わせた方法（
特公昭５７−２１２４６）および、硫安塩析とゲル口過
を組み合わせた方法（特開昭５３−３８６１７）などが
提案されている。また組換え体由来めＨＢｓ抗原の精製
を試みた例として、水性二層分配とイオン交換、ゲル口
過を組み合わせた精製法１：Ｈｉ　ｔｚｅｍａｎ、Ｒ，
Ａ等、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
。

１１．２７４５（１９８３）Ｅ等がある。しかしながら
、これらの方法は、組換え体由来のＨＢｓ抗原の精製に
おける種々の問題点に対し、いずれも対処できるもので
はな（、いわんや工業的精製法として適用することは難
かしい。

すなわち、組換え体由来のＨＢｓ抗原を精製するうえで
解決すべき重要な課題は、原材料中の夾雑成分を二とえ
ば組換え由来の蛋白質、脂質類その他の成分が、質的お
よび量的に人血液由来ＨＢｓ抗原の場合と全く異なって
いることであり、またその量が産出されるＨＢ　ｓ抗原
量に比して非常に多いことである。さらに次の問題点と
して本発明者らは夾雑物中に存在する細胞由来のプロテ
アーゼ活性物質によって、ＨＢｓ抗原が急速に失活され
ることを見出した。このためＨＢｓ抗原とプロテアーゼ
活性物質を、出来るだけ早い段階で完全に分離しなけれ
ば、精製工程において収率の大巾な低下をきたしてしま
うという問題点を解決する必要がある。

さらに、組換え体由来ＨＢｓ抗原は、そのアフィニティ
ー（生物学的親和力）の特性が人血液由却Ｂｓ抗原と必
ずしも同一でない面があり、このことも精製においての
重要な問題点の１つである。

これらのことから、先に挙げた血液由来のＨＢｓ抗原の
精製法に関する従来技術のみでは、組換え体由来のＨＢ
ｓ抗原含有にみられる特異条件を克服し充分な精製効果
を発揮することができない。組換え体由来ＨＢ　ｓ抗原
の精製を試みたＨｉｔｚｅｍａｎらの方法等においても
、その精製の内容は、いずれもＨＢｓ抗原の生化学的分
析用の標品をうるためになされたもので、単に分析可能
な程度にまで精製したにすぎず、ワクチンや診断用試薬
に用い得る程度の精製効果を期待しうる方法ではない。

さらに精製工程における収率等も検討されておらず、ま
たプロテアーゼ活性物質等によるＨＢｓ抗原の失活に対
する考慮は全くなされておらず、工業的精製法として応
用しうるものではない。

発明の目的 本発明者らは、組換えＤＮＡ手法により形質転換され、
ＨＢｓ抗原産生能を付与された組換え体によって発現生
成された組換え体に由来するＨＢｓ抗原の工業的精製法
を見出すべく、種々検討を重ねた結果、組換え体の培養
物から得られるＨＢｓ抗原原材料液を珪酸類と接触せし
めれば、珪酸類にＨＢ　ｓ抗原が吸着され、かつ培着細
胞由来の脂質類や夾雑蛋白質の大部分が吸着されないこ
と、および特定の条件下に溶出操作を行なえば、同時に
吸着されていたプロテアーゼ活性物質が選択的に溶出さ
れ、その後に、別の条件下で溶出を行なえば、プロチア
ーゼ活性物質を含まないＨＢｓ抗原含有画分が得られ、
さらに、ゲル口過による中間精製操作ののちに、ハイド
ロキシアパタイトによるアフイニテイクロマトグラフイ
ーを行えば、ＨＢｓ抗原がきわめて高度に精製できるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明の目的は、安全で有効なり型肝炎ワクチ
ンを安定かつ大量に供給することを可能ならしめること
にあり、本発明は、組換えＤＮＡ技術を利用した組換え
体により産生きれるＨＢｓ抗原を、工業的に効率よく、
大量に、しかもきわめて高純度に精製する方法を提供す
るものである。

発明の構成および効果 本発明は、組換えＤＮＡ技術を利用した組換え体により
産生されるＨＢｓ抗原を精製するに際し、組換え体の培
養物から得られるＨＢｓ抗原原材料液を珪酸類を用いた
吸着クロマトグラフィにかけ、培養細胞由来の脂質類や
夾雑蛋白質等の大部分が除去されかつプロテアーゼ活性
物質を含まないＨＢｓ抗原含有画分を得、次いでゲル口
過による中間精製操作を加えたのち、ハイドロキシアパ
タイトによるアフィニティークロマトグラフィーを行う
ことを特徴とする。

本発明において用いよれる、組換え体由来ＨＢｓ抗原と
は、組換えＤＮＡ技術を用いて、Ｂ型肝炎ウィルスのＤ
ＮＡから取り出されたＨＢｓ抗原をコードする遺伝子を
大腸菌、酵母、動物培養細胞等に導入し、これらを形質
転換させ、ＨＢ　ｓ抗原遺伝子を働かせてＨＢｓ抗原を
産生させることにより得られるものである。これらの方
法は既に公知であり、例えば組換え酵母由来ＨＢ　ｓ抗
原を得る方法の１つとしてハレンズエラ［Ｖａｌｅｎｚ
ｕｅｌａ、Ｎａｔｕｒｅ。

２９８．３４７　（１９８２）および特開昭５８−７７
８２３号〕は、ｐＢＲ３２２プラスミドの増殖起点、２
μプラスミド増殖起点、Ｔｒｐｌ、酵母アルコールデヒ
ドロゲナーゼプロモーター領域からなるシャトルベクタ
ー（ｐＭＡ　５６　）の、酵母アルコールデヒドロゲナ
ーゼプロモーターＨＢｓ遺伝子を結合させたシャトルベ
クター（ｐＨＢｓ１５　）を作製し、このものを酵母に
導入し、形質転換酵母を得、この形質転換酵母を培養し
、ＨＢｓ抗原を産生させている。

また、同じく酵母にＨＢｓ抗原を産生させる柄として、
宮之原らは［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
、ＵＳＡ。

８０．１（１９８３）詔よび特願昭５７−１４２４６０
号〕、２μプラスミドの増殖起点、ｐＢＲ３２２プラス
ミドの増殖起点、酵母染色体の増殖起点、酵母のロイシ
ン巴産生遺伝子、大ｉ菌のアンピシリン耐性遺伝子、お
よび酵母の抑制性酸性フォスファターゼプロモーター領
域からなるシャトルベクター（ｐＡＭ　８２　）　を作
成し、このものの抑制性酸性フォスファターゼプロモー
ター領域にＨＢ　ｓ遺伝子を結合させたシャトルベクタ
ーｐＡＨ２０３を作成し、このものを酵母［ＩＡＨ２２
（ａ、１ｅｕ２．ｈｉｓ４．Ｃａｎ１．Ｃｉｒ＋）　Ｉ
ＩＣ導入し、形質転換酵母を得、これを培養しＨＢｓ抗
原を産生させている。

またヒララマンら［Ｈｉｚｅｍａｎ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、１１　（９）、２７４
５（１９８３）および特開昭５８−１０９４２７号〕は
、酵母菌３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ　）
プロモーター領域に結合させｉこＨＢｓ遺伝子を有する
シャトルベクターを作製し、酵母にＨＢｓ抗原を産生さ
せている。

さらに、野崎ら（第３０回日本ウィルス学会総会、演説
抄録、Ｐ−１０６９（１９８２）および特願昭５７−１
４５０９２号）は、Ｃｏ１１　Ｅｌ、ｐＭＢ　ｌまたは
ｐ１５Ａに由来する大腸菌プラスミドに５Ｖ４ＱＤＮＡ
の複製開始部分を挿入しかつ動物細胞内での複製阻害部
分を欠損させたベクターにＨＢｓ遺伝子を組み込んで組
換えＤＮＡを調整し、この組換えＤＮＡを動物細胞、例
えばマウスＬＴＫ−細胞に作用させて形質転換させ、得
られた形質転換動物細胞を培養しＨＢｓ抗原を産生させ
ている。

この他にも、特開昭５８−５６６８５号、特開昭５８−
９９５号および特開昭５７−３９７８４号において、組
換えＤＮＡ技術を利用して動物細胞にＨＢ　ｓ抗原を産
させる方法が記載されている。

また、本発明におけるＨＢ　ｓ抗原材料液とは、組換え
ＤＮＡ技術を利用して、ＨＢｓ抗原を産生ずるように形
質転換された組換え体、何えば大腸菌あるいは酵母菌等
を、適当な、培地および培養条件で培養して、ＨＢ　ｓ
抗原を産生、蓄積させた後に、この培養物から適当な方
法でＨＢｓ抗原を粗抽出して得られるものである。

抽出の方法は、まず菌体を遠心分離により培養物から分
離し、例えば、０．１４Ｍ塩化ナトリウム添加０．０１
Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７，２）等のｐＨ６〜８程度の適
当な緩衝液中で破壊する。破壊の方法としては、超音波
破砕、グラスビーズ破砕、マントン・ゴーリン破砕、あ
るいは細胞の細胞壁を酵素的に溶解せしめてスフェロプ
ラストとした後、これに界面活性剤を作用させて破壊す
る等の種々の方法を用いうる。この細胞破壊物を低速遠
心分離にかけ、細胞壁破片等を分離し、さらに必要に応
じメンブランフィルタ−で口過してＨＢ　ｓ抗原原材料
とする。

本発明において、）ＩＢｓ抗原原材料液と珪酸類とを接
触せしめる方法としては、ＨＢｓ抗原原材料液に珪酸を
投入旦、撹拌混合するバッチ方法、あるいは珪酸をカラ
ムに充填し、これにＨＢｓ原材料液を通液して吸着せし
めるというカラム法とが知られているが、バッチ法が好
適である。

珪酸類とは一般式Ｓ　ｉＯ２・ｎＨ２Ｏで示される含水
珪酸（シリカゲル）あるいは一般式Ｓ　１０２で示され
る無水珪酸のことであり、本発明においては、これらの
珪酸類を微粉末状あるいは微粒子状に成型したものを用
いる。これらはすでに市販されており、たとえば微粉末
含水珪酸としては商品名ミズカシル（水沢化学制）、サ
イロイド（富士デビイソン製）、シリカゲル等多数のも
のが知られており、これらの何れも用いることができる
。また無水珪酸としてはエアロジル（日本エアロジル製
）等が用いられる。

バッチ法による吸着方法は以下のようにして行なわれる
。）ＬＢｓ抗原原材料液中に珪酸類を投入し、０〜４０
℃、好ましくは４〜２５℃程度にて液と珪酸類を振とう
あるいは撹拌等によって十分混合し、投入した珪酸類に
ＨＢｓ抗原を吸着せしめる。

吸着に要する時間は珪酸類の粒子形状等によって異るが
、微粉末珪酸の場合、通常３０分〜３時間程度で十分で
ある。珪酸類の量は、珪酸類の粒子形状や原材料液中の
ＨＢｓ抗原含有量、夾雑物含量等により最も適した範囲
で選択するのが望ましいが、一般に、粒子径１０μｍ以
下の微粉末珪酸の場合、原材料液に対し５ｗｔ／ｖ％　
程度以下で用いられる。

吸着が終了した後は遠心分離あるいは口過等の手段によ
りＨＢ　ｓ抗原吸着珪酸と上澄液とを分離する。

次に）ＩＢｓ抗原吸着珪酸に対し、第１溶出工程として
、好ましくは２０重量倍以上のＰＨ５〜９程度の緩衝液
、たとえば０．１４Ｍ塩化ナトリウム添加０．０１ＭＩ
Ｊン酸緩衝液等を加える。そして振とうあるいは撹拌混
合等の手段により珪酸類に付着ないしは同時吸着されて
いる夾雑物質を洗浄して追い出す。特にこの工程によっ
て一部同時に珪酸類へ吸着されているプロテアーゼ活性
物質をほとんど完全に洗い出すことができる。

このプロテアーゼ活性物質の存在は実際ＨＢｓ抗原の安
定性に係わる重要な問題であって、これが存在すると原
材料液のＨＢｓ抗原粗抽出液を４℃あるいは一２０℃で
保存しても、わずか１週間はどで、ＨＢ１１抗原のほと
んどが失活してしまうほどの悪影響を与える。さらに精
製の条件によっては、プロテアーゼ活性が更に強まり、
わずかの時間でＨＡｓ抗原が失活してしまうこともある
。

上記の第１溶出工程が終了した後は遠心分離あるいは口
過等により、固液分離し、ＨＢｓ抗原吸着珪酸を回収す
る。必要であればこの操作を２〜３回繰返すことが望ま
しい。

次に第２溶出工程において、珪酸に吸着されたＨＢｓ抗
原を下記溶出液で処理して溶離する。

（１１ｐＨ８以上のホウ酸緩衝液にデオキシコール酸ナ
トリウム塩を加えた液〔例えば、０．０５Ｍホウ酸ナト
リウムーホウ酸緩衝液（ＰＨ９，２）十０．５％デオキ
シコール酸ナトリウム塩〕、（２）ｐＨ９以上の緩衝液
子アンモニア水で声を１０以上に調整した液〔例えば、
０．０５Ｍホウ酸ナトリウム−ホウ酸緩衝液士アンモニ
ア水（ｐＨ１０，５）、または０．０５Ｍ炭酸ナトリウ
ム−炭酸水素ナトリウム緩衝液士アンモニア水（ＰＨ１
０，２）］、（３１ＰＨ１０以上の緩衝液〔例えば、Ｏ
，Ｏ’５　Ｍ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝
液（ＰＨ１０，３）、または０．０５Ｍホウ酸ナトリウ
ムー水酸化ナトリウム緩衝液（ＰＨ１０，５）］これら
の処理のうち（２）および（３）による溶出では、溶出
したＨＢｓ抗原が一部変成したり、ＨＢｓ抗原粒子が互
いに凝集を起し、生物学的活性や物理的性質に変化を生
じさせるという不都合が生じる。その結果、のちの工程
でのＨＢｓの回収率の低下につながることになる。それ
故、この観点からは溶出におけるように、デオキシコー
ル酸の存在がきわめて望ましい。しかしながら、本発明
者らの研究によれば、（１）のデオキシコール酸の存在
系ではＨＢ　ｓ抗原の回収は高い反面、新たに非常に困
難な問題が生起することがわかった。すなわち、ＨＢｓ
抗原をワクチン等に用いるためには溶出物からデオキシ
コール酸を分離する操作が必要であり、これが決して容
易ではなく、シかもデオキシコール酸が存在する溶出物
は次工程以後の精製効率を低下させるなどの不利益があ
って、デオキシコール酸の存在がきわめて望ましくない
ことがわかった。

本発明者らは、この第２溶出工程においてこれらの不利
益を克服してＨＢｓ抗原を有効に溶離する最適条件につ
いて種々検討を加えた結果、ｐＨ１０以上の緩衝液に０
．１〜３Ｍ程度の尿素を添加した′液を用いることによ
りきわめてすぐれた効果が得られることを見出した。

この方法は、例えば、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム−炭酸
水素ナトリウム緩衝液（ＰＨ１０，５）＋１Ｍ尿素にて
溶出することにより達成され、ＨＢｓ抗原の回収率がき
わめて高く、かつＨＢｓ抗原の変成や生物学的あるいは
物理的性質の変化がほとんど生じない。この溶出は、通
常、温度Ｏ〜４０℃、好ましくは４〜３５℃程度で、３
０分〜３時間程度振とうあるいは撹拌混合することによ
り行なわれる。このときの溶出液の用量は、用いる珪酸
量に対し１５倍〜３０倍程度であり、溶出処理後、溶液
を常法により遠心分離器にかけてＨＢｓを含有する上清
を得る。

上述の珪酸塩を用いる吸着クロマトグラフィならびに尿
素添加緩衝液による溶出方法は下記のような特長を有す
る。

（ｉ）　ＨＢｓ抗原原材料液中に含まれるＨＢｓ抗原の
９５％以上が回収されて精製効果がすぐれている〔ラジ
オイムノアッセイ法：　ＡＵＳＲＩＡ−ＩＩ（グイナボ
ット社製）にて測定〕。

φ）溶出液の比活性： ［ＩＨＢＳ抗原蛋白質含量（μｆｊ／ｍｏ１ン全蛋白質
含量（〜／ｍｏｌ）　〕　が原材料液に比し約１０倍と
なり、きわめて精製効率が高い。

（ｉｔ　プロテアーゼ活性物質はほぼ完全に除去される
。溶出液はそのままあるいはμ４７．２に調整したのち
、４℃で１ケ月保存しても、ＨＢｓ抗原の力価はほとん
ど減少しない。

尿素存在下に溶出させることは、上述のような数々のす
ぐれた特長を示すとともに、その後の精製工程の効果も
加わってＨＢｓ抗原を取得する上できわめて有利である
。また溶出工程でデオキシコール酸等の界面活性物質も
含まれていないので、余分の精製操作が不要で、効率的
であり、かつ品質の安全性も保たれるという利点がある
。

本発明において、珪酸を用いる吸着クロマトグラフィに
より精製されたＨＢｓ抗原をさらに晶度に精製するには
、ＨＢｓ抗原溶出液に、例えば、１゜チ程度の希酢酸を
用いてＰＨ６，５〜８程度に調整し、ついでゲル口過に
付す。この際、所望ζこより、フォローファイバー限外
濾過器等を用いてＨＢｓ抗原を約５〜１０倍に濃縮して
からゲル口過に付す。

ゲル口過坦体としては、排除限界分子量１０万〜１００
万程度の分画能をもつゲルを用い、ＨＢｓ抗原をボイド
量に相当する溶出量から始まる最初のピークフラクショ
ンに集め、低分子量の夾雑物質と分離する方法が効率も
よく、すぐれた効果を示す。ソノような担体としては、
セファロースＣＬ−５Ｂ（ファルマシア社製）、セルロ
ファインＧＣ−７００（チッソ社製）等の種々のものが
市販されており、これらが利用可能である。

ゲル口過の方法は常法でよく、たとえば０．１４Ｍ塩化
す）　ＩＪウム添加リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で平衡
化されたゲル充填カラムに上記珪酸吸着クロマトグラフ
ィにより精製されたＨＢｓ抗原含有液を通液し、つづい
て上記緩衝液を通液してＨＢｓ抗原と夾雑物を分子サイ
ズにより分画し、ＨＢｓ抗原を含有するフラクションを
分取する。この操作により、ＨＢｓ抗原の比活性ぼ３〜
１０倍に上昇する。

かくして得られた精製ＨＢｓ抗原を、さらに蔗糖超遠心
分離あるいは塩化セシウム超遠心分離等の常法により精
製し、最終的にＢ型肝炎ワクチンに供することのできる
ＨＢｓ抗原精製標品を得ることもできるが、ハイドロキ
シアパタイトを用いた吸着クロマトグラフィによる精製
を行なえば、きわめて効果的にＨＢ　ｓ抗原精製標品が
得られる。

このハイドロキシアパタイトによる吸着クロマトグラフ
ィは、例えば、０；１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７
，２）で平衡化しておいたノ１イドロキシアパタイトカ
ラムに、同緩衝液に対して透析した上記ゲルロ過精製Ｈ
Ｂｓ抗原液を通液し、ＨＢ　ｓ抗原を吸着させる。平衡
化緩衝液でカラムを充分に洗浄したのち、例えば、０．
５　Ｍ　ＩＪン酸カリウム緩衝液（ＰＨ７，２）を用い
て溶出し、ＨＢｓ抗原を含むフラクションを集める。こ
の操作によりＨＢｓ抗原の比活性は１０〜２０倍程度上
昇する。

このハイ１０キシアパタイトによるｆｆ　裏操作（７）
のちに、透析、濃縮後、蔗糖超遠心分離にかければきわ
めて高度に精製されたＨＢｓ抗原精製標品が得られる。

本発明方法によれば、Ｂ型肝炎ワクチン製剤化に供する
ことができるＨＢｓ抗原精製標品を出発原料のＨＢ　ｓ
抗原原材料液から４０％以上の高収率で得ることができ
、工業的にきわめてすぐれた精製法である。

実施例 つぎに参考例および実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明する。

参考例 宮之原らの方法（特願昭５７−１４２４６０号に従い・
Ｈ’Ｂ　ｓ抗原産生能を有する形質転換酵母を調製し、
ついでＨＢＳ抗原を産生させる。

（１）ＨＢｖＤＮＡの調製 （リウイルスＤＮＡの調製 ＨＢｓ抗原陽性かつＨＢｅ抗原陽性の供血者（血清型ａ
ｄｒ　）からのヒト血！２１０人分のプール７０〇−を
５＋００　Ｏｒｐｍで′２０分間遠心分離し、不溶物を
除去する。これを４℃にて１ｓ、ｏ　ｏ　ｏ　ｒｐｍで
８時間遠心分離し、得られた沈査を緩衝液（１０ｍＭト
リス−ＨＣｌ　、０．１ＭＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡ：
ｐＨ７，５）１０−に再溶解させ、３０チの蔗糖を含有
する遠沈管の頂部に重層させる。これを４℃にて３９．
０００　ｒＰｍで４時間遠心分離し、得られた沈査を上
記と同じ緩衝液に再溶解させる。

ついで、ＨＢＶのもつＤＮＡポリメラーゼによる反応を
、６７ｍＭ　トリｘ　ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、８０ｍ
Ｍ　ＮＨ４Ｃｌ　、　２５　ｍＭ　ＭｇＣ１２，０，５
％（ｗ／ｖ％。

以下同じ）タージトールＮＰ−４Ｑ、０．１チ２−メル
カプトエタノール、３３０μＭのｄＣＴＰ（デオキシシ
チジントリホスフェート）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノ
シントリホスフェート）、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシ
ントリホスフェート）、０．５μＭα−（３２ＰｌｄＴ
ＴＰ（デオキシチミジントリホスフェート）の混合液５
００μｌ中で３７℃にて３０分間行なう。これにざらに
ｄＴＴＰを最終濃度３３０μＭになるように加え、３７
℃で３時間反応させ、これに同容量の１００　ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ　溶液を加える。このＤＮＡポリメラーゼ反応に
より、ＤＮＡ中の一本鎖部分が修複され、〔３２Ｐ〕ラ
ベル化された材料を得、これを蔗糖の３０％、２０％お
よび１０％水溶液を段階的に重層した遠心管の頂部に重
層し、４℃にて３９．００　Ｏｒｐｍで４゜５時間遠心
分離する。

ついでＤＮＡに強く結合している蛋白質を消化するため
に、上記で得られた沈査を１ｒＩ９／−プロナーゼＥお
よび０．２％ラウリル硫酸ナトリウムの混合液２００μ
ｌ中で３７℃にて３時間処理したのち、ＤＮＡをフェノ
ール２００μｌ−で２回抽出し、ついでエーテルで振っ
てフェノール溶媒を除去するとＨＢＶＤＮＡ溶液を得る
。このＤＮＡは２、５　ｘ　１０６ＣＰｍ／ｐ９　（Ｄ
比放射活性’ｆ：示り、、制限酵素消化に充分使用し得
る。

（ｉ）ＨＢｖＤＮＡのクローン化 前記の方法で調製された環状二本鎖のＨＢＶＤＮＡを、
下記のようにしてまずλフアージシャロン１６ＡＤＮＡ
をベクターとしてクローン化し、さらに公知のプラスミ
ドｐＡＣＹＣ１７７をベクターとして再クローン化を行
なう。

（５）λフアージシャロン１６Ａ宿主−ベクター系によ
るクローン化： ＨＢＶＤＮＡ２０　ｎｇを１０ｍＭ　トリｘ　−ＨＣＩ
（ＰＨ７，４）、７ｍＭＭｇＣ１２、Ｉ　Ｑ　□　ｍＭ
　ＮａＣ１。

７ｍＭ２−メルカプトエタノールの混液２ｏμｌ中にて
制限エンドヌクレアーゼＸｈｏｌ　により３７℃にて２
時間処理したのち、フェノール２０μｌにて抽出し、つ
いでエーテル抽出後、その水層に２倍容量の冷エタノー
ルを加えてＤＮＡを沈殿させる。この混液を一７０℃で
１時間保持したのち１ｏ、ｏ　ｏ　ｏ　ｒｐｍにて５分
間遠心分離して沈殿するＤＮＡを回収する。分離した沈
査をｌＱｍＭト＋）　ス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）およ
びｌ　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａの混液５μｌに溶解させる
。ついで、このＨＢＶＤＮＡと等モル量の前記と同様に
して制限酵素ＸｈｏＩ　により開裂されたλフアージシ
ャロン１６ＡＤＮＡ（ＸｈｏＩ認識部位を１個所有する
）とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ
　（ＰＨ７，４）、Ｉ　Ｑ　ｒｎＭ　Ｍ　ｇ　Ｃ１２、
ｌＱｍＭ　ジチオスレイトール、１００μｇ／−十血清
アルブミン、Ｑ、　５　ｍＭ　ＡＴＰ　および０．５μ
ｌ酵素調製物との混液）１０μｌを用いて４℃で１８時
間反応混合液を前記と同様にしてフェノール抽出、エー
テル処理およびエタノール沈殿に付し、得られた沈査を
１０ｍＭ？リスーＨＣｌ　（ｐＨ７，４）および１ｍＭ
ＥＤＴ混液１０μｌ中に溶解させる。

上記のようにしてアニールさ誓たＤＮＡより、ｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏパッヶーヅング操作（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８巻、２９９〜３０９を参照）
によりλフアージを形成させ、さらに大腸菌ＤＰ５　Ｑ
ＳｕｐＦを指示菌としてＬ−寒天平板（２３０１Ｘ　２
３　ａａ　）上に１０４個のプラークを形成させる。

これらプラークのうちからＨＢＶＤＮＡを維持している
ファージにより形成されたプラークを選び出すために、
前記で調製した３２ｐ−ラベルされたＨＢＶＤＮＡをプ
ローブとしてプラークハイブリダイゼーションを行なイ
（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９６巻、１８０頁、１９７７を参
照）、目的とするファージを複数分離する。

（Ｂ）プラスミドｐＡｃＹｃ１７７をベクターとした再
クローン化： 上記（５）で得られたＨＢＶＤＮＡを保持するファージ
について「生化学実験講座、核酸の化学Ｉ」５４〜６５
頁に記載される方法に従い、大腸菌ＤＰ５Ｑ−５ｕｐＦ
を感染筒としてファージＤＮＡを調製する。得られたＤ
ＮＡを前記の制限酵素Ｘｈ。

Ｉの反応条件下で２時間消化したのち、この反応液を０
．７５％アガロースゲル電気泳動にかけ、分離した３、
２ＫｂのＨＢＶＤＮＡをＤＥＡＥ紙（東洋ｐ紙製）に吸
着させてベクターＤＮＡと分離し、ついでＩＭＮａＣｌ
　溶液にて溶出し、両端がＸｈ。

ｌ末端となったＨＢＶＤＮＡを得る。

つぎにプラスミドＰＡＣＹＣ１７７ＣＣｈａｎｇ。

Ａ、Ｃ，Ｙ、、Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｎ、、Ｊ、Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、。

１３４．１１４１〜１１５６（１９７８）Ｊ（このもの
はＸｈｏＩ切断部位を１個所有し、それはカナマイシン
耐性遺伝子の中に存在する）を同様にＸｈｏＩにて消化
し、その生成物をフェノール抽出、エーテル処理および
エタノール沈殿により精製する。ツイテ、ＸｈｏＩ開裂
されたＰＡｃＹｃ１７７トｘｈＯ１末端−ＨＢｖＤＮＡ
とを分子比１：５で混合し、前記Ｔ４　Ｄ　Ｎ　Ａ　＋
）ガーゼの反応条件下に１８時間アニールさせる。

大腸菌Ｘ１７７６の培養液を高木東歌編著「遺伝子操作
実験法」第１６１項に記載の方法で調製された菌液０．
１−に、上記アニールされたＤＮＡ調製物１０μｌを加
えてよく混合させ、０℃で２５分間放置したのち、アン
ピシリン（２０ｐｇ／ｍｌ）、α−ビオチン（１μｇ／
−）、ヅアミノピメリン酸（１００μｇ／ｍｌ）、チミ
ン（２０ｐｇ／ｆｆｌ／）を含有するＬ−寒天プレート
上に塗抹して３７℃で一夜培養する。出現したコロニー
について、カナマイシン（２０ｐｇ／−Ｊ）　を含む寒
天プレートとアンピシリン（２０μｇ／ｒｎ／）を含む
寒天プレートにそれぞれ対応させて塗抹し、アンピシリ
ンを含むプレートでのみ増殖したコロニーを選択する。

得られたコロニー数個について、「代謝」第１７巻、第
４「リパーゼ」第８１〜８９頁（１９８０）に記載され
る方法に従いプラスミドを調製する。得られたプラスミ
ドをｐ　ＨＢ　Ｖと称す。

このｐ　ＨＢ　Ｖを制限酵素Ｘｈｏｌで処理すると３．
２Ｋｂの全ＨＢ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントが得られ
る。

（２）　シャトルベクターＰＡＭ８２の調製酵母５２８
８ＣＤＮＡバンクより得られた抑制性酸性ホスファター
ゼを構成する６００００ダルトンのポリペプチド（Ｐ２
Ｏ）の遺伝子を含む約８０００塩基対（８Ｋｂ）の制限
酵素Ｅ（ｏＲ１断片を大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２の
ＥｃｏＲＩ部位に挿入して得られるプラスミドを出発材
料とし、これを制限酵素Ｓａｌ　１で切断し、さらにＴ
４ＤＮＡリガーゼにより再アニールさせてｐＢＲ３２２
の５ａｌＩ部位から酸性ホスファターゼ遺伝子断片の５
．２ｉｃｂ側を失なったプラスミドｐＡＴ２５（これは
ｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子を含むＥｃｏＲ
Ｉ部位からＳａｌ　１部位までの約３．７Ｋｂの断片と
酵母の酸性ホスファターゼ遺伝子のＥｃｏＲ１部位から
５ａ１１　部位までの約２，８Ｋｂの断片がそれぞれ対
応する末端同士で結合したプラスミドである）を得る。

つぎに、このＰＡＴ２５のＥｃｏＲ１部位に、プラスミ
ドＹＲＰ７をＥｃｏＲＩ処理することによって得られる
ａｒｓｌおよび”Ｉ”ｒｐｌ遺伝子を含む１．４Ｋｂの
ＥｃｏＲＩ断片を挿入してプラスミドｐＡＴ２６を得る
（このａｒｓ　ｌ　−Ｔｒｐ　ｌを含む断片は、そのＴ
ｒｐｌ遺伝子内に制限酵素Ｂｉｎｄ　ＩＩＩ　の認識部
位を１個有する）。

上記ＰＡＴ２６のＨｉｎｄ　ＩＩＩ　部位に、プラスミ
ドｐｓＬＥｌをＨｉｎｄ　ＩＩＩで処理して得られる酵
母（７）Ｌｅｕ２および２　μｏｒｉを含む１４ｉｎｄ
　ＩＩＩ　断片を挿入してシャトルベクターｐＡＴ７７
を得る。

このｐＡＴ７７をサツカロミセス・セレビシェＡＨ２２
に組込んだもの（サツカロミセス・セレビシェＡＨ２２
／ｐＡＴ７７　）は微工研柴寄第３，２４号として寄託
している。

上記の方法で得られたｐＡ　Ｔ　７７　（１μｇ）をＳ
ａｌ　ｌで開裂したのち、２０ｍＭトリス−ＨＣＩ（Ｐ
Ｈ８，２）、１２　ｍＭｃａｃ１２．１２ｒｎＭＭ　ｇ
　Ｃ１２，０，２ＭＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡ溶液５０
　ｔｔｌ：中で０゜ＩＵのエキソヌクレアーゼＢＡＬ３
１を３０秒〜１分間作用させる。ついでフェノール抽出
、エタノール沈殿を行なったのち、Ｘｈｏｌ　リンカ−
１ｐｍｏｌとＴ４ＤＮＡリガーゼの反応条件下で１２時
間結合を行なう。この反応溶液で大腸菌Ｘ１７７６を形
質転換し、得られたアンピシリン耐性の形質転換体より
プラスミドＤＮＡを調製し、各ＤＮＡについてマキサム
−ギルバートの方法（Ｍａｘａｍ。

Ａ、＆　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｗ、　；Ｐｒｏ、Ｎ、Ａ、
Ｓ、、　７４　、　５５Ｑ〜５６４を参照）に従い、塩
基配列を調べ、ＢＡＬ３１処理により除去された酸性ホ
スファターゼ遺伝子領域を決定する。これら中からホス
ファターゼ構造遺伝子領域が完全に除去されたプラスミ
ドＰＡＭ８２を得る。

ホスファターゼ構造遺伝子の産物Ｐ６０の最初のアミノ
酸であるメチオニンをコードするコドンＡＴＧのＡを＋
１として、ＰＡＭ８２は−３３まで除去されたものであ
る。なお、このＰＡＭ８２をサツカロミセス・セレビシ
ェＡＨ２２に組込んだもの（サツカロミセス・セレビシ
ェＡＨ２２／ＰＡＭ８２）は微工研条寄第３１３号とし
て寄託している。

（３１ＨＢｓ遺伝子発現プラスミドＰＡＨ２０３の調製 プラスミドｐＨＢＶをＸ１ｎｏＩ　で処理して得られる
ＨＢＶＤＮＡと、Ｘｈｏｌで開裂されたシャトルベクタ
ーＰＡＭ８２を分子比５：１でＴ４ＤＮＡリガーゼによ
りアニールさせたのち、この反応溶液で大腸菌Ｘ１７７
６を形質転換する。得られたアンピシリン耐性の形質転
換体よりプラスミドＤＮＡを調製し、これらについて制
限酵素ＸｈｏＩ、Ｘｂａ　Ｉ、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで分析
することにより、ベクターへのＨＢＶＤＮＡの組込みお
よびその方向を確認する。

選び出されたプラスミドｐＡＨ２０３はベクタ−のホス
ファターゼプロモーターの下流にＩ（ＢＶＤＮＡがＨＢ
ｓ遺伝子、ＨＢｃ遺伝子の順に並ぶ向きに挿入されたも
のであり、これらがＨＢ　ｓ　Ａｇ遺伝子発現プラスミ
ドである。

（４）形質転換酵母の調製 酵母としてサツカロミセス・セレビシェＡＨ２２Ｃａ　
１ｅｕ２ｈｉｓ４　Ｃａｎ１（Ｃｘｒ　））　（微工研
条寄第３１２号）を用い、これをＹＰＤ培地（２％ポリ
ヘフトン、１％イーストエキス、２％グルコース）１０
０−に接種し、３０℃で一晩培養したのち、遠心して集
菌する。滅菌水２０ｉにて菌体を洗浄し、ついで１．２
Ｍソルビトールおよび１００μｇ／−／チモリアーゼ６
０．０００（生化学工業基）の溶液５ｒｎ！、に懸濁さ
せ、３０℃で約３０分保ち、スフェロプラスト化する。

ついで、スフェロプラストを１．２Ｍソルビトール溶液
で３回洗浄したのち、２Ｍソルビトール、１０ｍＭＣａ
Ｃｌ２および１０ｍＭトリス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）の
溶液０．６−に懸濁させ、その６０μｌずつを小試験管
に分注する。これに前記（３）で調製した組換えプラス
ミドｐＡＨ２０３溶液３０μｌを加え、充分混合しタッ
チ、さらニ０．１　Ｍ　Ｃａ　Ｃｌ　２　（３μｌ）を
加えて最終濃度１０　ｍＭ　Ｃａ　Ｃｌ　２とし、室温
に５〜１０分間放置する。ついでこれに、２０％ボ１ノ
エチレングリコール４０００、Ｉ　Ｑ　ｒｎＭ　Ｃａ　
Ｃｌ　２および１０　ｍＭ　トｌ）ス−ＨＣｌ　（ｐＨ
７，５）溶液ｌｄずつを加えて混合し、室温に約２０分
間放置する。この混合液０．２ｍｌずつを４５℃に保温
された再生培地（２２％ソルビトール、２チグルコース
、０．７％イーストニトロゲンベースアミノ酸、２％Ｙ
ＰＤ、２０μｇ７々ヒスチジン、３饅寒天）１〇−に加
え、軽く混合させ、予め準備された１、２゛ノルビ計−
ル含有最小培地（０，７’％イーストニトロゲンベース
アミノ酸、２％グルコース、２０μｇ／ｒｎ！ヒスチヅ
ン、２％寒天）プレートに重層し、固化させたのち、３
０℃で培養してロイシンｌト要求性酵母のコロニーを得
る。このコロニーを２０μｇ／ｍ１．ヒスチジンヲ含ム
バルクホルダーミニマルメデイウＡ　ＣＴｏｈｅ、Ａ、
ｅｔ　ａｌ　；Ｊ、Ｂａｃｈｔｅｒｏｌ　、。

１１３．７２７〜７３８（１９７３）を参照〕１こて培
養して形質転換酵母サツカロミセス・セレビシェｐＡＨ
２０３を得る。

（５）形質転換酵母の培養による■ＢＳ抗原の産生 前記（４）で得られた形質転換酵母を、２０μｇ／ｒｎ
ｌヒスチジンを含むバルクホルダーミニマムメディウム
１０ｍ！、に接種し、３０℃で２４時間培養を行う。こ
の培養物を、２０μｇ／ｍ／ヒスチジンを含むバルクホ
ルダーミニマムメディウム１０１！に植えつぎ、３０℃
で撹拌下、約４８時間培養する。対数増殖期にある菌体
を遠心して集菌し、これをリン酸を含まない最小培地（
バルクホルダーミニマムメディウムに含まれるＫ　Ｈ２
Ｐ　Ｏ、ｔをＫＣ１！で置換し、さらに２０μｇ／Ｉ／
ヒスチヅンを加えたもの）１Ｍに菌数的４　Ｘ　Ｉ　Ｑ
６ｃｅ１１　ｇ／ｒｎｌになるように懸濁し、３０℃に
て撹拌下約２４時間培養を続けたのち、４０００回転、
１０分間の遠心により菌体を集め菌体的１２０ｇを得る
。

実施例１ 参考例と同様の培養操作を繰返して蓄積した菌体的Ｉ　
Ｋｇに、０．１４Ｍ塩化ナトリウム添加０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，２）５１！を加え、これを６００．７
００に９Ａ　の圧力でマントン・ゴーリン破砕機にかけ
菌体を破壊する。菌体破壊物を遠心にかけ、粗大菌体破
片を分離して、ＨＢｓ　抗原８．０ηを含有する原材料
液５Ｊを得る。

この原材料液５Ｉ！中に、微粉含水珪酸であるミズカシ
ルＰ−５２６（水沢化学制）０．１５ＫＰを投入し、１
０℃で４時間、激しく撹拌してＨＢｓ　抗原を珪酸に吸
着せしめる。その後３．５００γｐｍで１０分間遠心分
離し、上清を除去し、沈渣に０．１４Ｍ塩化ナトリウム
添加リン酸緩衝液（ＰＨ７，２）５ｆｆを加えて、１０
℃にて３時間撹拌し、その後、３．５００γｐｍ　で１
０分間遠心分離にかけ、上清を除去し、ＨＢｓ　抗原吸
着珪酸の沈渣を得、さらに０．１４Ｍ塩化ナトリウム添
加リン酸緩衝液（ＰＨ７，２）５ｒを加えて再度上記操
作を実施し、第１溶出工程を終える。

第１溶出工程終了後、ＨＢｓ　抗原を吸着した珪酸ニ、
０．０５Ｍ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリラム緩衝液
（ＰＨ１０，５）に尿素をＩＭ／ｌの濃度となるよう加
えた液２．５１！を加えて、３７℃で２時間激しく撹拌
して第２溶出工程に処する。その後、３．５０　Ｏｒｐ
ｍで１０分間遠心分離し、ＨＢｓ抗原を含有する上清２
．５ｔ！を回収する。

この珪酸を用いた吸着クロマトグラフィにより精製され
たＨＢｓ抗原含有液に、１０％酢酸水溶液を徐々ｌこ添
加して、ｐＨを７．２に調整したのち、フォローファイ
バー限外濾過器（旭化成社製）を用いて、約３００Ｉｎ
／にまで濃縮し、これを０．０５Ｍ塩化カリウム添加０
．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ＰＨ７，２）で平衡化さ
れたセファロースＣＬ−６８（ファルマシア社製）カラ
ム（ゲル量的１０で月こ通液し、上記緩衝液で押し出し
てゲル口過を行う。抗ＨＢｓ　抗体を用いた逆受身血球
凝集反応で分析し、ＨＢｓ抗原を含有するフラクション
をプールしてゲルロ過精製ＨＢｓ’抗原液１．８Ｊを得
る。

このゲルロ過精製ＨＢｓ抗原液を、０．０５Ｍ塩化カリ
ウム添加０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，２）
で平衡化されたハイドロキシアパタイト（ＢＤＨケミカ
ル社製：　Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅ　−５ｐｈ
ｅｒｏｉｄａｌ　）カラム（ゲル量８００ｄ）に通液し
、ＨＢｓ抗原を吸着せしめる。前記緩衝液で充分に洗浄
したのち、０．０５Ｍ塩化カリウム添加０．５Ｍリン酸
カリウム緩衝液を通液して、ＨＢｓ抗原を溶出し、精製
ＨＢｓ抗原含有液を得る。各工程におけるＨＢｓ抗原の
収率、精製度およびプロテアーゼ活性物質含量を第１表
に示す。本方法によって得られた精製ＨＢ　ｓ抗原は夾
雑物も少く、蔗糖ステップ超遠心分離にかけることによ
り、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析にお
いて、ＨＢｓ抗原の単一バンドを示すきわめて高純度な
ＨＢｓ抗原精製標品を得ることができる。

第１表 １）　ラジオイムノアッセイ法、ＡＵＳＲＩＡ−Ｉｆ（
ダイナボット社製）にて、ヒト由来ＨＢ　ｓ抗原精製標
品を対照品として測定した。

ク　原材料液の比活性値（ＨＢｓ抗原含量（μｇ／Ｔｎ
ｌ）／全蛋白質含量（η／−りを１としたときの各両分
の相対比活性値

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）　組換えＤＮＡ手法により形質転換されＨＢ　ｓ
   抗原産生能を付与された組換え体によって発現生成され
   たＨＢｓ抗原を精製するにあたり、ＨＢ　ｓ抗原原材料
   を珪酸類を用いた吸着クロマトグラフィにかけることを
   特徴とするＨＢｓ抗原の精製方法。
2. （２）　ＨＢｓ抗原原材料が、組換え体細胞を超音波破
   砕、グラスビーズ破砕、マントン・ゴーリン破砕、ある
   いは界面活性剤処理等により破壊して得られるＨＢｓ抗
   原粗抽出物である前記第（１）項記載の方法。
3. （３）口８８抗原原材料を珪酸類を用いた吸着クロマト
   グラフィにかけて吸着せしめたのち、０．１〜３Ｍ程度
   の尿素を添加したｐＨ９以上の緩衝液で溶出する前記第
   （１）項記載の方法。 （４１ＨＢｓ抗原を精製するにあたり、ＨＢｓ抗原原材
   料を珪酸類を用いた吸着クロマトグラフィにかけ、しか
   るのちに、ゲル口過操作を経て、ハイドロキシアパタイ
   トに上る吸着クロマトグラフィを行なうことを特徴とす
   るＨＢｓ抗原の精製方法。