RU1389060C - Способ получени рекомбинатной вакцины к гепатиту В - Google Patents
Способ получени рекомбинатной вакцины к гепатиту ВInfo
- Publication number
- RU1389060C RU1389060C SU864119880A SU4119880A RU1389060C RU 1389060 C RU1389060 C RU 1389060C SU 864119880 A SU864119880 A SU 864119880A SU 4119880 A SU4119880 A SU 4119880A RU 1389060 C RU1389060 C RU 1389060C
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hbsag
- volume
- yeast
- yield
- vaccine
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 5
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 title description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title description 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 title description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 claims description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N hepatitis b vaccine Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940124736 hepatitis-B vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 claims description 2
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 claims 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims 2
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 claims 1
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims 1
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 claims 1
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 claims 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 claims 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 claims 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 claims 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 claims 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 claims 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 claims 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 17
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 16
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 16
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 8
- 239000011265 semifinished product Substances 0.000 description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 7
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000382509 Vania Species 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- HELHAJAZNSDZJO-OLXYHTOASA-L sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O HELHAJAZNSDZJO-OLXYHTOASA-L 0.000 description 1
- HELHAJAZNSDZJO-UHFFFAOYSA-L sodium tartrate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O HELHAJAZNSDZJO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960002167 sodium tartrate Drugs 0.000 description 1
- 239000001433 sodium tartrate Substances 0.000 description 1
- 235000011004 sodium tartrates Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
(46) 30.06„93. Бголо № 24
(21)4119880/13I
(22)1.08.86,
(71)Институт иммунологии и Институт вирусологии АНИ СССР
(72)И.В. Красильников, Н.Н. Грановский , В.М. Жданов, Р.В. Петров,
Б.М. Гирдо и И.Ю. Коткона
-.
(56)Waurpber D . et al., RNAS, 1985, V 82, pp, 6830-683Д.
(54) СПОСОБ ПО.ПУЧЕПИЯ РЕКОМВИНАНТНОЙ ВАКЦИНЫ К ГЕПАТИТУ В
(57)Изобретение относитс к биотехнологии , ,а именно, к получению реком- бинантных вакцин к гепатиту В путем микробиологическогл синтеза. Цель
изобретени - повьшение выхода и чистоты целевого продукта. Способ позво- л ет получать вакцинирующий препарат с выходом 60-67% с содержанием белков JO/S. Штамм дрожжей продуцент HBsAg культивируют на среде, не содержащей фосфат, разрушают клетки на дезинтеграторе, выдел ют и очищают HBsAg путем адсорбционной хроматографии на пористых кремнеземах с элю- цией бикарбонатным буфером рН 9,1-9,5 с последующим ультрацентрифугированием в градиенте плотности 50%-ного раствора тартрата K(Na) и 25%-ного раствора глицерина при соотношении компонентов 1 I,
Изобретение отиоситсч к биотехнологии , в частности к получению реком- бинантных вакцин путем микробиэлоги- ческого синтеза, пыделеии и обработ ки антигена дл приготовлени вакцин- препарата.
Цель изобретени - повышение выход и чистоты целевого продукта.
Пример I. Получение биомас- сы дрожжевых клеток, содержащих НВьЛд. 2-3 крупные колонии дрожжевых ;;леток, штамм ДАН 12/р NMYG 20 (диаметром 3-5 мм), выросшие на среде
10
Пример 4. Адсорбционна хр матографи . К полученному полуфабри кату (280 мл) добавл ет макропорист стекло МПС-2000-ВГХ, предварительно замоченное в воде (объемом стекла 0 мп). Суспензию перемешивают на качалке в течение 2 ч при 4 С. Посл того как стекло ос дет, в супбрната те определ ют содержание HBsAg. В иадосэдке содержитс 0,4 мкг/мп вне сенного антигена. Затем стекло пере нос т в колонку- и промывшот 500 мп 0,05 М фосфатно-солевым буфером. За
(ск. приложение), содержащей 2% ага |е тем.провод т элюирование антигена.
ра. засевают р 200 нп жидкой среды I в колбу объемом 2 л. Культуру инкубируют на качалке при 300--350 об/мин при 30 С в te4eHHe i сут. Концентра- и клеток в конце выращивани соста- 25 йлпйт 2-610 кл./мл. Весь объем купътуры с терильно перенос т в 9-10л срйды , предварительно стерилизо- кип чением 0,5 ч в ферментере.
Инкубащ о -ведут в ферментере с ий- 25 тенсивной аэраплей при отношении воздуха к среде по объему не меньше 2: в течение 24-30 ч, при 30 С до концентрации 1,8-2,110 кл./мп. Кой- троль чистоты культуры пройод т мик- 30 роскопированием. Клетки собирают центрифугированием при 10 ОООд S 5-20 мин При 0 и замораживают до -20-40 с.
П р и м е р 2. Цолучение полуфаб-. риката вакцины. Клеточную массу кон- - центрации 1,8-2,1-10 кл./мл размора- , живают, ресуспендируют в 100 мп буфера А (0,01 М NaHjP04 ,0,5 laCl , рН 7,2-7,4) и подвергают разрушению на дезинтеграторе ФУГ-1 при 400450 об/мин при 4 С (согласно инструкции к ФУГтО в течение 10 мин.
Окончанием процесса дезинтеграции служит достижение разрушени клеток
40
использу 0,05 М бикарбонатный буфе рН 9,1, Скорость элюции составл ет 0,2 мл. Антиген элюируетс с фронто бикарбонатного буфера. Полученный концентрат содержит 97% исходной ан тигенной активности и менее 10% тотального содержани белка.-Удельна активность препарата 220 мкг/мл, об ем 24 мл.
Пример 5. Дл адсорбционно хроматографии используют полуфабрикат , полученнь.гй в примере 3s объемо 250 МП. Элюирование провод т бикарб натным буфером рН 9,5. Получают кон центрат с удельной активностью 300 ккг/ьш объемом 22 мп.
Выход 80%,
Пример 6. Адсорбционную хр матографию провод т по примеру 5. Буфер дл элюировани имеет рН 993 Получают концентрат с удельной акти ностью 260 мкг/мл и объемом 25 мп.
Выход HB.sAg составл ет 80%,
Пример 7. Ультрацентрифуги оование в градиенте плотности.
, Ё пробирках объемом 35 мл готов градиент плотности} использу в кач стве т желого раствора 50%-ный кагш
Пример 4. Адсорбционна хроматографи . К полученному полуфабрикату (280 мл) добавл ет макропористое стекло МПС-2000-ВГХ, предварительно замоченное в воде (объемом стекла 0 мп). Суспензию перемешивают на качалке в течение 2 ч при 4 С. После того как стекло ос дет, в супбрнатан- те определ ют содержание HBsAg. В иадосэдке содержитс 0,4 мкг/мп внесенного антигена. Затем стекло перенос т в колонку- и промывшот 500 мп 0,05 М фосфатно-солевым буфером. Затем .провод т элюирование антигена.
использу 0,05 М бикарбонатный буфер рН 9,1, Скорость элюции составл ет 0,2 мл. Антиген элюируетс с фронтом бикарбонатного буфера. Полученный концентрат содержит 97% исходной антигенной активности и менее 10% тотального содержани белка.-Удельна активность препарата 220 мкг/мл, объем 24 мл.
Пример 5. Дл адсорбционной- хроматографии используют полуфабрикат , полученнь.гй в примере 3s объемом 250 МП. Элюирование провод т бикарбо- натным буфером рН 9,5. Получают концентрат с удельной активностью 300 ккг/ьш объемом 22 мп.
Выход 80%,
Пример 6. Адсорбционную хроматографию провод т по примеру 5. Буфер дл элюировани имеет рН 993, Получают концентрат с удельной активностью 260 мкг/мл и объемом 25 мп.
Выход HB.sAg составл ет 80%,
Пример 7. Ультрацентрифуги- оование в градиенте плотности.
, Ё пробирках объемом 35 мл готов т градиент плотности} использу в качестве т желого раствора 50%-ный кагше
90%, контролируемое при микроскопиро- .с во-натриевый тартрат на буфере А, В .вании. Дезинтеграт клеток центрифугируют при 0-20000хд и 4°С в течение 30-40 мин. Надосадочную жидкость собирают и замораживают при минус 20- ид 10 ч. Размороженный материал осветл ют центрифугированием при 10-20000хд и в течение 40 мин. Титр HBsAg в приготовленном полуфабрикате составл ет 20 мкг/мл среды.
50
качестве, легкого раствора используют 25%-ный раствор глицерина на буфере (суммарный объем градиента 20-25 мл) На градиент соЬтношени компонентов концентрат после адсорбциЬнной хрома тографии объемом I2 МП на одну пробирку . Ультрацентрифугирование прово д т 14-20 ч при 25 тыс. об./мин на SW 27-роторе при 4 С. После ультрацентрифугировани градиент фракциони руют, во фракци х определ ют содержание HBsAg, объедин ют фракции, содержащие более 10% антигена, нанесен ного на градиент. Получают 6 мл преПример 3. Полуфабрикат вак- цины готов т аналогично, но врем замораживани 18 ч, получают полуфабрикат с титром 30 мкг/мл среды.
во-натриевый тартрат на буфере А, В
качестве, легкого раствора используют 25%-ный раствор глицерина на буфере А (суммарный объем градиента 20-25 мл). На градиент соЬтношени компонентов концентрат после адсорбциЬнной хроматографии объемом I2 МП на одну пробирку . Ультрацентрифугирование провод т 14-20 ч при 25 тыс. об./мин на SW 27-роторе при 4 С. После ультрацентрифугировани градиент фракционируют , во фракци х определ ют содержание HBsAg, объедин ют фракции, содержащие более 10% антигена, нанесенного на градиент. Получают 6 мл препарата с удельной активностью 760 мкг/мп.
Выход 85%.
Пример 8. Ультрацентрифуги- рование осуществл ют по примеру 7, используют концентрат по примеру 5. Получают 8 мл препарата с удельной актй1&ностью 800 мкг/мп,
Выход 97,0%.
Пример 9. Используют концентрат по примеру 6. Ультрацентрифугирование провод т,как в примере 7. Получают 6 мл препарата с удельной активностью 780 мкг/мп.
Выход 70%.
Пример 10. Приготовление вакцинного препарата осуществл ют следующим образом. Объединенную фракцию объемом 6 МП с удельной активно- стью 760 мкг/мп диализуют против буфера А, после диализа препарат труют через фильтр с диаметром 0,45 мкл, определ ют в нем концентрацию антигена, получают 8 мп с удель- ной активностью 550 мкг/мп, развод т физраствором до концентрации 15мкг/мл Полученную суспензию перемешивают пе риодически в течение 2-18 ч и разливают в ампулы. Получают вакцинный препарат.
Выход антигена 60%.
Объем серии 280 мл. Содержание примесей, по данным электрофореза, в полиакрйламндном геле ,составл ет около 10%.
Пример 11. Объединенную фракцию, полученную по примеру 9, диализуют и фильтруют через фильтр диаметром 0,45 мкм. Получают препара объемом 10 МП, содержащий 600 мкг/мп HB.sAg. В препарат добавл ют стерильн гидроокись алюмини до конечиой концентрации 1 мг/мл и суспензию развод т стерильно физраствором до 400 мл Из полученного раствора отбирают аликвоты 1объемом 25 мп) на анализы, остальное разлнвают в ампулы. Вакцинна парти содержит 15 мкг/мп антиге иа, количество белковых примесей со- ставл ет не более 10%.
Выход антигена составл ет 67Z от исходного полученного полуфабриката.
Пример 12. Объединенную фракции, полученную по примеру 10, диапнэуют, фильтруют и развод т ана- логично примеру II. Получают вакцин- иую серию, объем которой составл ет 300 МП.
Выход антиг вна 60% от исходного, полученного в полуфабрикате.
Содержание примесей в вакц1тн том препарате, по данным электрофореза, полиакрйламндном геле составл ет не более 10%.
Вакцинный препарат (конечный продукт ) имеет следующие характеристики им yнизиpyющa доза 1 мп; рН препарата 7,6-7,8; количество белка в дозе не более 20 мкг/мп; количество HBsAg не менее 5 мкг/мл; содержание примесных белков - не более 10% от общего количества белка; содержание гидроокиси А - не более 1,2 мг/доза.
Препарат стерилен, неинфекционён, нетоксичен.
Препарат способен индуцировать синтез антител, специфических к HBsAg, у животных и человека.
Пример 13. Получение рекомбинант иой вакцины к гепатиту В из штамма-продцента дрожжей ДВУ 746 (pNMYG 20).
Приготовление биомассы, разрушение « очистку и получение .готового препарата провод т последовательно по примерам I, 2, 4, 7, 10,
Получают вакцинный препарат с выходом 58%. Объем серии вакцины 95мл, содержание антигена 12 мкг/мл, содержание примесей по данным электрофореза - не более 10%.
П р и м е р 1А. Получение реком- бинантчой вакцины к гепатиту В из штамма-продуцента дрожжей ДАН I2 (pHMYG 39-54).
Приготовление биомассы, разрушение , очистку и получение конечного продукта провод т по примерам 1, 3, 6, 9.
Выход рекомбинантного антигена составл ет 67% от содержащегос в 1полуфабрикате.
Парти объемом 375 мп содержит 15 мкг/мп антигена, содержание примесей - не более 10%.
Пример 15. Данные по синтезу рекомбинантного HBsAg в штаммах- продуцентах дрожжей при культивировании в различных средах приведены в таблице.
1:4
1:256
Продолжение таблицы
Опыт Штамм-продуцент
Определение HBsAg в РПГА
среда I
I
среда It
3 1
1:2 1:8
2 ДАН 12/pHMYG 39/5А 1:4
1:8
Claims (1)
- Таким образом, синтез рекомбинант- него HBsAg намного выше при испольэо- кан и дл культивировани ереды 2. 5Формула изобретениСпособ получени рекомбинантной вакцииы к гепатиту В, включающий культивирование штамма дрожжей про- . дуцента HBsAg иа питательной среде, 2 ДВУ 7A6/PHMYG 20 1:2 Г:128 разрушение клеток, выделение и очистку антигеиа, отличающий- 1:128 с тем, что, с целью повышени выхода и чистоты целевого продукта, 1:1024 культивирование провод т иа бесфосf5 фатиой среде, а выделение и очистку 1:2048 провод т, использу адсорбционнуюхроматографию на пористых кремнезе- 1:2048 мах, с элюцией бйкарбонатны Г буфером рН 9,1...9,5 и последующее ультраВрем культивировани - 24 ч, центрифугирование в градиенте плотно- Антигеи определ ли в экстрактах апи- сти 50%-ного раствора тартрата К(Ма) квот клеток дрожжей при одииаковых и 25%-иого раствора глицерина при услови х разрушерги и экстракции. . соотношении компонентов 1:1.( ... . .,ПриложениеСостав сред культивировани дрожжей и микробиологического синтеза HBsAg (на 1л.)Компоненты (в г) . КС1 КН.РО, Nad Глюкоза MgSO CaClj АспарагинВитамины (в мкг) Тиамин Рибофлавин Пиридоксин Никотииова кислота Пара-аминобензойна кислота 190-210Пантотенат кальциИпозитол13890601,9-2,1,9-2,1(в мкг)99-10199-1019,9-10,19,9-10,09,9-10,19,9-10,19,9-10,19,9-10,«9-5149-5
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU864119880A RU1389060C (ru) | 1986-08-13 | 1986-08-13 | Способ получени рекомбинатной вакцины к гепатиту В |
| FR878711426A FR2602681B1 (fr) | 1986-08-13 | 1987-08-11 | Procede de preparation d'un vaccin recombinant contre l'hepatite b |
| IT8721644A IT1228928B (it) | 1986-08-13 | 1987-08-12 | Procedimento per l'ottenimento di un vaccino ricombinante contro l'epatite b. |
| DE19873726879 DE3726879A1 (de) | 1986-08-13 | 1987-08-12 | Verfahren zur herstellung von rekombinanten vakzinen gegen hepatitis b |
| JP62200080A JPS6399021A (ja) | 1986-08-13 | 1987-08-12 | Ｂ型肝炎に対する組換えワクチンの製造方法 |
| CN198787106697A CN87106697A (zh) | 1986-08-13 | 1987-08-13 | 制备乙型肝炎复合疫苗的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU864119880A RU1389060C (ru) | 1986-08-13 | 1986-08-13 | Способ получени рекомбинатной вакцины к гепатиту В |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU1389060C true RU1389060C (ru) | 1993-06-30 |
Family
ID=21257472
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU864119880A RU1389060C (ru) | 1986-08-13 | 1986-08-13 | Способ получени рекомбинатной вакцины к гепатиту В |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6399021A (ru) |
| CN (1) | CN87106697A (ru) |
| DE (1) | DE3726879A1 (ru) |
| FR (1) | FR2602681B1 (ru) |
| IT (1) | IT1228928B (ru) |
| RU (1) | RU1389060C (ru) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69013471T2 (de) * | 1989-12-05 | 1995-03-30 | Merck & Co Inc | Methode zur Stabilisierung von rekombinanten Hepatitis-B-Virus-Oberflächenproteinen aus Hefe. |
| CN103012594B (zh) * | 2011-09-22 | 2015-09-02 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种运载猪圆环病毒抗原表位蛋白的纳米载体及应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2400365A1 (fr) * | 1977-08-16 | 1979-03-16 | Pasteur Institut | Procede de purification d'antigene hbs, antigene hbs purifie et composition immunogene le contenant |
| JPS59101426A (ja) * | 1982-11-29 | 1984-06-12 | Green Cross Corp:The | Ｂ型肝炎感染予防用ワクチンの製造方法 |
| KR850001534A (ko) * | 1983-08-22 | 1985-03-30 | 제임스 에프. 나우톤 | 형질전환된 효모로 부터 유도된 면역원성 HBsAg |
| JPS60197629A (ja) * | 1984-03-16 | 1985-10-07 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ＨＢｓ抗原の精製方法 |
| US4649192A (en) * | 1985-05-30 | 1987-03-10 | Smith Kline-Rit | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate |
| EP0232410A4 (en) * | 1985-08-15 | 1988-01-25 | Amgen | CLEAVAGE PROCESS AND BUFFER FOR THE EXTRACTION OF HEPATITIS B SURFACE ANTIGENS FROM YEAR CELLS. |
-
1986
- 1986-08-13 RU SU864119880A patent/RU1389060C/ru active
-
1987
- 1987-08-11 FR FR878711426A patent/FR2602681B1/fr not_active Expired - Fee Related
- 1987-08-12 JP JP62200080A patent/JPS6399021A/ja active Pending
- 1987-08-12 IT IT8721644A patent/IT1228928B/it active
- 1987-08-12 DE DE19873726879 patent/DE3726879A1/de not_active Withdrawn
- 1987-08-13 CN CN198787106697A patent/CN87106697A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2602681B1 (fr) | 1990-05-18 |
| CN87106697A (zh) | 1988-10-05 |
| JPS6399021A (ja) | 1988-04-30 |
| IT8721644A0 (it) | 1987-08-12 |
| FR2602681A1 (fr) | 1988-02-19 |
| IT1228928B (it) | 1991-07-10 |
| DE3726879A1 (de) | 1988-03-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6149917A (en) | Industrial production process for a vaccine against Japanese encephalitis virus and vaccine produced | |
| US4664912A (en) | Process for the large scale production of rabies vaccine | |
| CN111925452B (zh) | 猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用 | |
| CN113845576B (zh) | 重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白及其应用 | |
| EP0204680B1 (fr) | Procédé d'isolement et de purification de l'antigène de surface de l'hépatite B | |
| RU2005117338A (ru) | Продуцирование il-21 в прокариотических клетках-хозяевах | |
| CN111718951A (zh) | 重组新型冠状病毒covid-19 s蛋白、其制备方法及应用 | |
| CN111778168B (zh) | 高效表达ca10病毒样颗粒的汉逊酵母工程菌及其应用 | |
| CN112011556B (zh) | 一种猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用 | |
| JP2538224B2 (ja) | 百日咳抗原の精製 | |
| CN110951814B (zh) | 利用基因工程环氧合酶-1和基因工程前列腺素e合成酶-1制备前列腺素e1的方法 | |
| CN108823245A (zh) | 一种病毒样颗粒的纯化方法 | |
| RU1389060C (ru) | Способ получени рекомбинатной вакцины к гепатиту В | |
| WO2018188639A1 (zh) | 猪流行性腹泻病毒s蛋白及其亚单位疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN113896773A (zh) | 重组fcv抗原及猫嵌杯病毒基因工程亚单位疫苗 | |
| CN114540393B (zh) | 一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒及其构建方法和应用 | |
| KR20240005684A (ko) | 바이오컨쥬게이트 생산 방법 | |
| CN106868035A (zh) | 一种重组马Interferon‑alpha‑1的制备方法 | |
| RU2322504C1 (ru) | Способ получения генно-инженерного инсулина человека | |
| CN108570098B (zh) | 一种百日咳多种抗原成分的分离纯化方法 | |
| WO2024183695A1 (zh) | 一种纯化病毒样颗粒的方法和用途 | |
| JPS5852227A (ja) | 淋菌からの免疫原性複合体 | |
| CN109943490A (zh) | 一种广东虫草原生质体制备及复苏方法 | |
| RU2603729C2 (ru) | Рекомбинантная вакцина для профилактики вирусного гепатита в (варианты) | |
| CN117003895B (zh) | 一种含有IL2、Fc和PADRE的gE融合蛋白及其制备方法和应用 |