JPS59101426A

JPS59101426A - Ｂ型肝炎感染予防用ワクチンの製造方法

Info

Publication number: JPS59101426A
Application number: JP57210240A
Authority: JP
Inventors: Takao Omura; 孝男大村; Terufumi Fujiwara; 藤原　照史; Akimasa Omizu; 大水　章正; Satoru Funakoshi; 船越　哲
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1982-11-29
Filing date: 1982-11-29
Publication date: 1984-06-12
Also published as: US4565697A; EP0112506B1; DE3377972D1; EP0112506A2; EP0112506A3; ES527588A0; JPH0585526B2; ES8505820A1; CA1217138A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を主成分と
するＢ型肝炎感染予防用ツクチンの製造方法に関し、さ
らに詳しくは、加熱処理後の精製過程において硫安分画
法、コロイド珪酸塩による吸着、そしＣポリエチレング
リコール分画法を何句に組み入れ、副作用の原因さなる
ヒト血漿成分及びＢ型肝炎感染性成分を除去し、さらに
抗原性を損うこさなく感染性不活化処理を行うことから
なるＨＢｓＡｇを主成分とするＢ型肝炎感染予防用ワク
チン製造方法に関する。

ＨＢｓＡｇは、Ｂ型肝炎を起すウィルス（ＨＢＶ）のａ
酸成分として知られているが、その大部分は感染性のな
い小型粒子として存在しており、ヒトやチンパンジーの
血漿中に見出される。ＨＢＳＡｇは市、欠株動的には、
ヒトの血漿のグロブリン蛋白に属している。

ＨＢＶによる感染の予防としては、ＨＢ８抗体を含むグ
ロブリン製剤を投与して受身免疫を獲得させる方法もあ
るが、その効果は短期間であり一般のウィルス感染の予
防にみられるようにワクチンによる能ｉ１Ｊ免疫が最も
優れていることはいうまでもない。

理論的にｌｄＢ型肝炎に対するワクチンは、まずＢ型肝
炎ウィルス物質を単離し、それを適当な方法で不活性化
させるか、またはＨＢｓＡｇから未又化ウィルスを分離
し、補充的に不活化処理することにより提供される。こ
のワクチンは、生体に投与きれた時、Ｂ型肝炎ウィルス
に対する抗体の産生がもたらされる結果、Ｂ梨肝炎の感
染を予防することができる。

ＨＢｓＡｇワクチンの製造には、これまで数多くの方法
が試みられてきた。ウィルスの感染性を不活化する方法
としては、６０−Ｃ，１０時間或は１００°Ｃ，２分間
の加熱処理を行う方法があるが、加熱処理では、ＨＢＶ
に含捷れる核酸（ＤＮＡ　）を十分に破壊するという保
障はない。そのだめ今日広く採用されつつある技術は、
ホルマリン処理によるＨＢＶの不活化処理である。

ところで、僅に混在しているヒト血漿蛋白でもワクチン
製造時などにホルマリン処理で変性を受けたものは、こ
れがヒトに投与された時、副作用の原因となるため、そ
れらはできるだけ完全に除去されていな、ければならな
い。この徴箪に混在してくるヒト血漿成分は、いくら超
遠心分離やアフィニティークロマトグラフィーを操り返
しても除去し得す、一部ｒ／ｉＨＢｓＡｇと結合して存
在しているものであるとの見方をする研究者もあった。

又、ＨＢＳＡｇの単離精製法として、最も一般に採用さ
れているのは超遠心分離法とアフイニテイクロマトグラ
フイー法である。これらの方法を採用すると殆んど純粋
なＨＢｓＡｇ粒子を得ることができる。しかし、既知の
単離方法は全て複雑であり、かつ工業的に利用すること
が困難である。

本発明の目的は、ＨＢ　８　Ａ　ｇ粒子の抗原性を残存
させたまま副作用の原因となる血漿成分、特にその蛋白
成分を除去し、ＨＢｓＡｇを回収し、さらに混在する恐
れのある）ｉＢＶすなわちゾーン粒子を不活化し、ＨＢ
ｓＡｇ粒子を主成分とするＢ型肝炎感染予防用ワクチン
の工業的製造方法を提供することにある。

本発明者らは、ＨＢｓＡｇの精製に、硫安分画工程、コ
ロイド珪酸塩による吸着工程、ポリエチンングリコール
分画工程を組合せ、かつこれら各工程における処理条件
について検討を重ねて本発明を完成した。

即ち、本発明は、ｔ（ＢｓＡｇを含有するヒト血漿タン
パクの水溶液に、５０〜７０℃、８〜１２時間の加熱処
理を施し、処理水溶液から硫安の１０〜２０％飽和によ
って沈殿するタンパク質を除去し、次いで硫安の４０〜
５０愕飽和によって沈殿するタンパク質を集め、その水
溶液をコロイド珪酸塩に接触させて、このコロイド珪酸
塩にＨＢＳＡｇを吸着させ、吸着されたＨＢｓＡｇを０
．１〜１．０チデオキシコール酸塩を含有するｐＨ８，
５〜９．５の緩衝液で溶出し、得られた溶出液を中性付
近に調整し、これにポリエチレングリコールを３〜７％
加えて、ＨＢＶと免疫複合体とを沈殿として除去し、次
いで上清にポリエチレングリコールを１５〜２０％加え
て、ＨＢｓＡｇを沈殿として集め、これをｐＨ６〜８の
緩衝液で平衡化した分子量数十万〜数百万の高分子物質
をゲル濾過担体とするゲル濾過を行ないＨＢｓＡｇ画分
を回収し、次いで超遠心分離により粒子の大きさ１８〜
２４　ｎｍ　ｓ比重１．１８−１．２２　ｒ／ｉである
一定値のＨＢｓＡｇを回収し、更にホルマリン濃度１／
ｌ　５００〜ｌ／２５００で、３５〜４０℃、９４〜９
８時間の不活化処理を行ない、次いで２〜６℃で６〜Ｉ
Ｏ日間放置し、得られた不活化ＨＢｓＡｇをｐＨ６〜８
の緩衝液に対して透析後、賦形剤を１〜５％猶・／Ｖ添
加凍結乾燥し、Ｂ型肝炎の感染性のない人血漿成分を含
まないＨＢｓＡｇを主成分とするＢ型肝炎感染予防用ワ
クチンを製造する方法からなる。

本発明において用いられる人の血漿タンパク質は、ＨＢ
ｓＡｇを含むもの、すなわち、実際に人に肝炎を起させ
得るものはもとより、ＨＢｓＡｇ抗原が検出されるもの
であれば、いかなるものであってもよい。すなわち、血
漿、血清及び公知の血漿タンパク分画法によって得られ
る種々のタンパク画分が用いられるが、本発明において
用いられる原料の内、最も好ましいものは、ＨＢｓＡｇ
抗原の分布量が比較的多いα−及びβ−グロブリン画分
である。この画分は他の有用な血漿タンパク画分を１１
ｆＪｌＸする際の副産物であることも原料として用いる
のに都合がよい。また、かかる蛋白質の水溶液としては
、血漿自体、あるいは上記の血漿タン白質を水、たとえ
ば蒸留水などに溶解したものなどが用いられる。

このＨＢｓＡｇを含有するヒト血漿タンパク質を出発原
料として以下の製造工程を経てＢ型肝炎感染予防用ワク
チンを製造する。

（リ　加熱処理（５〜７０°ｃ１８〜１２時間）工程：出発原料のＨＢｓＡｇを含有するヒト血漿タンパク質水
溶液に、所望によりアジ化ナトリウムを、たとえば当該
水溶液ｉｚ当りＯ１〜０，３２添加し溶解させる。溶解
後、ＨＢｓＡｇの感染性は失わせるが、抗原性は失わせ
ない５０〜７０°Ｃ，８〜１２時間の加熱処理を施す。

なお、所望により既知の安定剤を添加して処理をおこな
うこともできる。

（２）硫安（１０〜２０％飽和）分画上程・前記加熱処
理工程後の当該水溶液を硫安ｌＯ〜２０％飽和分画する
ことによって沈殿するタンパク質を除去する。当該分画
は、たとえば加熱処理後の当該水溶液をｐＨ６〜４（好
ましくは塩酸、硫酸等にて調整する）に調整し、硫安を
ｌＯ〜２０チ飽相になるように添加し、たとえば３〜５
℃にて３０〜１２０分間攪拌することによって行われる
。かくして沈澱したタンパク質は、たとえば３０〜１２
０分間靜置して生装した沈＃を遠心分Ｍ、（通常、６０
００−８００Ｏｒ、ｐ、ｍ、、　　ｌ　Ｏ〜Ｂ　０分間
）に付して除去し、遠心上清を回収することによって分
離除去される。

（３）硫安（４０〜５０チ飽相）分画工程・上記遠心上
清から硫安４０〜５０％飽和分画によって沈澱するタン
パク質を回収する。当該分画は、通常ｐＨ６〜８にて行
われ、ｐＨの調整には適材水酸化アルカリ（例、水酸化
ナトリウム）が使用される。また、温度条件は３〜５°
Ｃであることが好捷しく、まだ分画Ｉ／′ｉａＯ〜１２
０分間攪拌することによって行うことか好ましい。攪拌
終了後、たとえば３０〜１２０分間静゛置与することに
よって沈澱が生成する。この沈澱の回収は、好ましくは
遠心分！（通常、６０００−８００Ｏｒ、ｐ、ｍ、。

１０〜３０分間）にて行われる。

（４）　　コロイド珪酸塩による吸着処理工程：コロイ
ド珪酸塩としてはシリカケル、ケイ酸アルミン酸マグネ
シウム、ケインウ土、酸性白土、カオリンなどが用いら
れる。当該工程は、たとえば次の如くして行われる。

まず、前記硫安分画工程にて得られた沈澱タンパク質を
、ｐＨ６〜８の緩衝液（たとえば、リン酸緩衝液）に溶
解し、要すれば透析、清澄、除菌濾過を行った後コロイ
ド珪酸塩を、好ましくは１〜４％（ｗ／ｖ）となるよう
に添加して攪拌する。

攪拌１度は８６−３８°Ｃ１攪拌時間１−１２−４時間
が好ましい。

ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇを吸着したコロイド珪酸塩は、たとえ
ば遠心分ＩＩ＋通常、２０００−４００Ｏｒ、ｐ、ｍ、
、　　１０〜２０分間）によって回収される。回収され
た当訪コロイド′５Ｆ−酸塩は、ｐＨ７〜８の緩衝液（
たとえば０．１〜０．２Ｍのエチレンジアミン四酢酸等
のキレート剤、　　０．１〜０．２Ｍの塩化ナトリウム
等の無機塩等からなるｐ　Ｈ７−８の緩衝液等にて洗浄
することが好ましい。

（５）デオキシコール酸塩含何緩慟液（ｐ）１８．５〜
９．５）による溶出：本工程は、上記工程で吸着されたＨＨｓＡｇを溶出する
工程であり、デオキシコール酸塩としてはアルカリ金鳥
塩（たとえば、ナトリウム塩）などの塩が用いられる。

本工程の具体例は、前工程にて得られた吸着物を、０．
１〜１％デオキシコール酸塩を含有するｐ　Ｈ８，５〜
９，５の緩衝液を用いて溶出することによって行われる
。次いで、遠心分離（例、２０００−４００Ｏｒ、ｐ、
ｍ、、１０−２０分間）を行い、口Ｂ　ｓ　Ａ　ｇの溶
出液を回収する０（６）　　ポリエチレングリコール分
画工程：（１）　　ポリエチレングリコール分画（３〜
７チ（ｗ／ｖｌ工程；コロイド珪酸塩による吸Ｉ処理工程で得られり粗製ＨＢ
ｓＡｇは、ポリエチレングリコール（油帛量２０００〜
１００００）による分画によってＨＢｓＡｇ及び免疫複
合体等の徴漱夾雑物カニ沈殿として除去される。このポ
リエチレングリコール分画工程はコロイド珪酸塩による
ＨＢｓＡｇ吸看、溶出液にポリエチレングリコールを８
〜７（Ｗ／■）、好ましくは５−６　％　（ｗ／ｖ　）
になるように添加することによって行われ、その際のｐ
Ｈは中性付近（６〜８）であり、２〜ｌＯ°Ｃの温度下
にて１１０〜６０号間攪拌し、次いで８〜７時間そのま
ま静置することによって実施される。かくして生じた沈
殿物は夾雑物として遠心分子＠（例、１０００−５００
Ｏｒ、ｐ、ｍ、、２０−４０分間）によって除去して、
上清を回収する。

（１１）ポリエチレングリコール分画工程（１５１１＼
＼〜２０％（ｗ／ｖ）　　）：得られた遠心上清に上記と同様の条件下ポリエチレング
リコール（通常、分子量２０００〜１００００　）を１
５−２０％（ｗ／ｖ）になるように添加して沈ａｔ回収
する。通帛、ポリエチレングリコール添加後２〜ｌＯ°
Ｃの温度下にてｌＯ〜６０分間捗拌し、次いで１６〜２
０時間靜置する装置によって実施され、生じたＨＢｓＡ
ｇを含有する沈殿タンパク賀を遠心分離（例、８０００
−１２００Ｏｒ、ｐ、ｍ、、　　４０−５０分間）によ
り回収する。回収した沈殿タンノくり賀はｐＨ６〜８の
リン酸緩衝液等の緩衝液に溶解する。

（７）　ゲルい過工程ニゲル濾過法としては、分子量数十万〜数白万の間の物質
に適用できる分子ふるい担体供えはアガロース（５ｅｐ
ｈａｒｏｓｅ　４Ｂ、　　６Ｂ　ｌ、架橋デキストラン
等の高分子多糖体顆粒を利用する。

ポリエチレングリコール分画工程から得られたＨＢｓＡ
ｇを含む沈殿タンパク賃水溶液号子ふるい担体にアプラ
イし、ｐＨ６〜８のリン酸緩衝液等の緩衝液で溶出し、
ＨＢｓＡｇ画分を回収する。なお、ＨＢＳＡｇ画分の回
収は、ＨＢｓＡｇ陽性画分を免疫学的方法によって検定
し、おこなう。

（８）超遠心分離工程：本工程での超遠心分離方法としては、塩化セシウム直線
密度勾配（１，０５−１，８５’ｉ／ＣｒＩ）ゾーナル
遠心分離法が好ましく、この方法は具体的には次の通り
である。

まず、密度１．０５〜１．８５Ｆ／−の塩化セシウム液
を用いて容量１．７００−のゾーナルローター内に密度
勾配を作製する。作製後、前のケル濾過工程で得たＨＢ
ｓＡｇ画分を注入し、次いでｍ７Ｊのケル濾過工程で使
用したｐＨ６〜８のリン酸緩衝液等の緩衝液を５０〜１
００−注入し、３００００〜Ｂ　４０００ｒ、ｐ−ｍ−
＋で３５〜４０時間超遠心分離を行なう。

ＨＢｓＡｇ画分）回収は、粒子の大きさ１１８−２４ｎ
、就中約２２　ｎｍ　、　　１．１８−１．２２　ｆ／
ｃｔＩｌの密度領域より行なう。

（９）　　ホルマリンによる不活化処理工程：かくして
精製された）ｉＢｓＡｇの濃度を要すれば８００〜５０
０μ？／ｍｌＫなるように自整する。次いでホルマリン
を終濃度で１／１５００〜ｌ／２５００になるように加
え、たとえば、３５〜４０°Ｃ１９４〜９８時間置き、
文に２〜ｉ　ｏ　”ｃで６〜１０日間放置する。

かくして得られた不活化ＨＢｓＡｇ溶液は、ｐ　Ｈ６〜
８の０．０１−０．０５Ｍ　ＩＪリン酸緩衝液の緩衝液
を用いて、好ましくは３０時間以上透析を行なう。

透析後、要すれば除菌濾過を行ない、同様の緩衝液にて
、濃度が６０〜１００μｆ／ｍｇ　　になるようにＩＩ
Ｅし、これにマンニット、乳糖、デンゾなどこの技術分
野で既知の賦形剤を１〜５％ｓｖ／ｖ　添加する。添加
後、小分は分注、凍結乾燥しＢ型肝炎感染予防用ワクチ
ンを得る。

本発明ワクチンは、その免疫能を高めるために、免疫補
助剤に吸着させて吏用することが好ましい。

免疫補助剤としては水酸化アルミニウム、硫酸アルミニ
ウムなどが用いられる。

水酸化アルミニウムなどの免疫補助剤を加えたもの’を
凍結乾燥した場合、水酸化アルミニウムケル粒子に変化
がみられるので、本発明ワクチンをリウムｇ）で溶解し
、その後免疫補助剤水懸濁液（たとえば、水酸化アルば
ニウム懸濁液）を加えてＨＢｓＡｇを吸着させ、注射剤
として投与することが好ましい。

従って、本発明ワクチンは、ワクチン凍結乾燥品、溶剤
、免疫補助剤よりなるキットの形態きしておくことが好
ましい。

なお、ＨＢｓＡｇはその９８％以上が水酸化アルミニウ
ム懸濁液添加後２０秒以内に水酸化アルミニウムに吸着
さ、ｆ′１．る０なお、不発明ワクチンは、筋肉、皮下等に（好ｉしくけ
皮下Ｙ非紅口投与さｎる。

本発明のワクチンは、Ｂ型肝炎の感染性がなく、また人
血漿成分を含まないので極めて安全であると共に凍結乾
燥品としたので、 ■　長期医存が司能である ■　チメロサール（水銀防腐剤）を含有しない■　水酸
化アルミニウムで懸濁されていないので、医存中に析出
した不溶性異物を確認できる ■　濃度をかえて用いることができる ■　ＨＢｓＡｇ抗原価の測定が６ｆ能である（失活のチ
ェック）などの特有の効果を有するものである。

実施例本発明ワクチンの安全性を（府かめるために、ＨＢｓＡ
ｇがヒト以外に感染する唯一の動物として知られている
チンパンジーに投与した。投与量は２頭に２０μＶ（成
人１回投与量）、別の２頭に２〜（成人１回投与量の１
００倍量）で、いずれも静脈内に投与した。投与後７カ
月の観察期間中、４頭のチンパンジーは肝機能検査、血
液学的検査、肝生検およびＨＢｓＡｇ検査において１虜
であり、特にＨＢｃ抗体の発現を認めなかつたことから
、安全であることが証明された。

そこでこのワクチンを少数の健康人志願者に投与し、臨
床第１層試験を行った。その結果、安全性確認のだめの
諸検査（副作用、肝機能検査、血液学的検査）に異常／
／′ｉ、認められず、まだＨＢｓＡｇおよびＨＢＣ抗体
の発現がなかったことがら、このワクチンはヒトにおい
ても安全であることが証明された。またワクチンの投与
を受けた全員にＨＢｓＡｇ抗体の産生がみられたこおか
ら、このワクチンはＨＢｓＡｇ感染の予防に有効である
ことが示唆された。

以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施
例に限定されるものではない。実施例中ＲＰＨＡ価は、
試料のＢＢｓＡｇ抗原価を逆受身赤血球凝集反応法（特
開昭５０−１２２２７号）によってアンテイヘプセル（
ミドリ十字社製）を用いて測定した数値である。

実施例ＩＲＰ　ＨＡ法でＨＢｓＡｇ抗原価１　：　４，０００を
示すプール血漿５０ｔを６０°Ｃで１０時間加熱後、ｐ
ＨをＩＮ塩酸で５にＭ裂し、これに硫安を１５チ飽和に
なるように添加し、４°Ｃで６０分間攪拌する。

次いで６０分間靜静置、生成した沈殿を遠心分離（７０
００ｒ、ｐ、ｍ、、２０分間）除去を行ない上清を得る
。丈にこの上清をＩＮ水酸化ナトリウムでｐＨ７に調整
し、これに硫安を４５％飽和になるように添加し、４　
’Ｃで６０分間作拌する。次いで、６０分間静置した後
、生じた沈殿を遠心分離（７０００ｒ、ｐ、ｍ、、２０
分間）により回収する。回収した沈殿タンパク質をｐＨ
７のリン酸緩衝液に溶解し、溶解後、ケイ酸アルミン酸
マグネシウム〔エアロジルＲ３８０、Ｄｅｇｕｓａ社製
〕を２．５％（ｗ／ｖｌになるように添加し、８７°Ｃ
で８時間攪拌する。攪拌後、ＨＢ８Ａｇを吸着したケイ
酸アルミン酸マグネシウムを遠心分離（８＋００Ｏｒ、
ｐ、ｍ、’＋１５分間）により回収する。回収したＨＢ
ｓＡｇ吸看ケイ酸液ルミン酸マグネシウムを０．１５Ｍ
の工チレンジアミン四酢酸と０．１５Ｍの塩化ナトリウ
ムからなるｐ　Ｈ７，５の緩衝液にて洗浄する。洗浄後
、０５チデオギシコール酸ナトリウムを含有するｐＨ９
，０の緩衝液で吸着されたＨＢｓＡｇを溶出する。次い
で、遠心分Ｒ（８，００Ｏｒ、ｐ、ｍ、、１５分間）を
行ないＨＢｓＡｇの溶出液を回収する。得られる溶出液
は、ＩＮ塩酸でｐＨ７に調整し、ポリエチレングリコー
ル（分子量６ｏＯｏ　）ｆ５．５％（ｗ／ｖ）になるよ
うに添加し、４°Ｃで３０分間攪拌し、次いで５時間静
置する。静置後、遠心分離（８０００ｒ、ｐ、ｍ−，３
０分間）し、上清を回収する。

得た遠心上清にポリエチレングリコールを１８％（ｗ／
ｖ）になるよ５に添加し、４°Ｃにて３０分間攪拌し、
次で１８時時間静置る。生じた沈殿タンパク賃ヲ遠心分
離（１ｏｏｏｏｒ、ｐ、ｍ、、４５分間）により回収す
る。回収した沈殿タンパク質１ｐＨ７のリン酸緩衝液に
溶解する。このｌ（ＢｓＡｇを含有緩衝液で展開してＨ
ＢｓＡｇ画分分を得る。得られるＨＢｓＡｇ画分を塩化
セシウム直線密度勾配（１，０５〜１．８５ｆＡ　ｌゾ
ーナル遠心分離（８２００Ｏｒ、ｐ。

ｍ、、８７時間）により１．１８〜１．２２　ｆ／ｌｒ
ｉの密度領域よりＨＢｓＡｇ画分を回収する。回収した
ＨＢ　ｓ　Ａｇ画分は、４０（ｕｎ／ｍｔの濃度になる
ようにｐＨ７のリン酸緩衝液で調整した後、］／２００
０のホルマリン濃度で、８７°Ｃに９６時聞装き、次い
で４℃に８日間放置する。放置後、ｐＨ７の０．０２Ｍ
　ＩＪリン酸緩衝液対して透析し、残存するホルマリン
を除去して不活化ＨＢｓＡｇ溶液を得た。

実施例２実施例１で得た不活化ＨＢｓＡｇ溶液の濃度を８０ｐｆ
／ｍｌに調整し、２％（ｗ／ｖ）マンニット添加、除菌
ｐ過後、］０ｒｎＩ！容バイアル瓶に２．５ゴずり小分
は分注、凍結乾燥することによりＢ型肝炎感染予防用ワ
クチンを得た。

このようにして得られた乾燥Ｂ型肝炎感染予防用ワクチ
ンには溶剤と免疫補助剤が添付されるが、それらの製造
は以下のようにして竹りだ。溶剤は１．６％塩化ナトリ
ウム液をアンプルに２．５−分注しオートクレーブ滅菌
した。免疫補助剤けｒ　ＡｔｕＧｅｌ　Ｓ　、　２％　
サスペンション」（セルバ社、西ドイツ）を注射用蒸留
水で０．１％＃度とし、アンプルに２．５ｍｔ分注しオ
ートクレーブ滅菌した。

特許出願人　株式会社ミドリ十字代理人弁理士高島　−ｊｎｒｍＪｆ！［手続補正書（白化）昭］１５８年５月＆３日特許庁長官　　　　　　　殿１、事件の表示昭和５７年　特　許　願第２１０２４０号３、補正をす
る者　　　　　　　　　　　　　　の製造方法事件との
関係　　４寺Ｊ′「出願人７、補正の対象（１）すＪ細書の特許請求の範囲ケ別紙の通りに訂正す
る○ （２）明細書第６頁、第１θ行に「％」とああン「％（
ｗ　／　ｖ月に訂正する。

（３）同省第６頁、第１２〜１３行の「上清にポリエチ
レングリコールｉ１５〜２０％加えて」とあるを［上清
のポリエチレングリコール濃度葡１５〜２０％（ｗ／ｖ
）とし」に訂正する。

（４）回書第６頁、第１５行の［ｔグツ呵濾過担体とす
る」ケ「に適用できるケル濾過担体勿用いて」に訂正す
る。

（５）同書第７頁、第４行に「性のない」とあるを「性
がなく、」に訂正する。

（（ｉ）回書第８頁、第１Ｏ行にｒＨＢｓＡｇＪとある
勿「Ｂ型肝炎」に訂正″Ｔる。

（７）回書第８頁、第１８行に「６〜４」とある紮「４
〜６」に訂正する。

（８）同曹第９頁、第１１行の「アルカリ」の次に「金
属」紮加入丁ゐ。

（９）同壱第１３頁、第７行の「水溶液」の次に［？」
？加入する。

（ト）同誉第１４貝、第２行にｒ　３００００〜３４０
００Ｊとある勿ｒ３０，０００〜３４，０ＯＯＪに訂正
する００◇　同書第１４負、第１９行に「デンゾ」とあゐケ「
グリシン」に訂正する。

（６）回書第１７頁、第１２行のｒＡｇＪｋ”削除丁？
「によりＰ＃六し」１：訂正Ｉり。

Ｑ’（ｌ　　同り第１９Ｊｊ、ｉｓ行ニｒ　６０００　
Ｊ　Ｌア、ｂ勿ｒ　６．０００　Ｊに訂正する。

（へ）同誉第１９頁、第１１行にｒ　３　（１００Ｊと
あるｉｒ亀０００」に訂正する。

頭　同書第１９頁、第１５行にｒｌｏｏｏｏＪとあ／）
’ｋｒｌＯ，０ＯＯＪに訂正する。

Ｏη　回書第２０頁、第２行にｒ　３２０００　Ｊとあ
ゐ才ｒ３２，０ＯＯＪに訂正する。

別　　　紙特許請求の範囲Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ　）　ｋ含有するヒト血
漿タンパク質の水溶液に、５０〜７０’Ｃ８〜１２時間
の加熱処Ｆｌ−施し、処理水溶液から硫安のｌ。

〜２０％飽和によって沈澱Ｔるタンパク質ケ除去し、次
いで硫安の４０〜５０％飽和によって沈澱テるタフバク
質を集め、その水溶液全コロイド珪酸塩に接触させて、
このコロイド珪酸塩にＨＢｓＡｇを吸泊場せ、吸宸さｎ
たＨＢｓＡｇヶ０．１−１％デオキシコール酸塩を含有
するｐ　Ｈ８，５〜９．５の緩衝液で溶出し、得らｎた
溶出液ケ中性付近に調整し、これにポリエチレングリコ
ールを３〜７％（ｗ／ｖ）加えて、Ｂ型肝炎ウィルス（
ＨＢＶ）と免疫複合体と會沈澱として除去し、次いで上
清のポリエチレングリコール濃度紮１５〜２０％（Ｗ／
Ｖ　）丸湿、ＨＢｓＡｇ　′？Ｉ：沈澱として集め、こ
れ？ｐＨ６〜８の緩衝液で平衡化した分子量数十万〜数
百万の高分子物質に適用できるグル１過担体全用いてゲ
ル５濾過ゲ行ないＨＢｓＡｇ　　画分ケ回収し、次いで
超遠心分離により粒子の大ささ１１８〜２４ｎｍ、比重
１．１８〜１．２２１１７ｃｄ′ｔ１″ある一定値のＨ
ＢｓＡｇ勿回収し、更にホルマリン濃Ｗ　ｌ／１５ｏｏ
−１／２５００で、３５〜４０’Ｃ１９４〜９８時間の
不活化処理２行ない、次いで２〜６℃で６〜１０日間放
置し、得らｎ、＊不活化ＨＢｓＡｇ　　ｋｐＨ６〜８の
ａ緩衝液に対して透析後、賦形剤ｔ１〜５％ｗ　／　ｖ
添加を凍結乾燥し、Ｂ型肝炎の感染性がなく、人血漿成分を含
まないＨＢａＡｇ　　ｆ主成分と了るＢ型肝炎感染予防
用ワクチンの製造法。

Claims

【特許請求の範囲】

Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇｌを含有するヒト血漿タ
ンパク質の水溶液・に、５０〜７０°Ｃ，８〜１２時間
の加熱処理を施し、処理水溶液から硫安の１０〜２０％
飽和によって沈殿するタンパクを除去し、次いで硫安の
４０〜５０チ飽和によって沈殿するタンパク質を集め、
その水溶液をコロイド珪酸塩に接触させて、このコロイ
ド珪酸塩にＨＢｓＡｇを吸看させ、吸看されたＨＢｓＡ
ｇを０．１〜・１・１％デオキシコール酸塩を含有する
ｐＨ８，５〜９．５の緩衝液で溶出し、得られた溶出液
を中性゛伺近に調整し、これにポリエチレングリコール
を８〜７％（Ｗ／Ｖ）加えて、Ｂｐ肝炎ウィルス（ＨＢ
Ｖ）と免疫？１合体とを沈殿として除去し、次いで上溝
にポリエチレングリコールを１５〜２０　Ｔｏ　（ｗ／
ｖ　）加えて、ＨＢｓＡｇを沈殿として集め、これをｐ
Ｈ６〜８の緩衝液で平衡化した分子量数＋ｈ〜数百乃の
高分子物質をゲル濾過担体とするゲル濾過を行ないＨＢ
ｓＡｇ画分を回収し、次いで超遠心分離により粒子の大
きさ１８１８−２４ｎ比重１．１８−１．２２ｆ／−で
ある一定値のＨＢ　ｓ　Ａｇを回収し、更にホルマリン
濃度１／１５００〜ｌ／２５００で、３５〜４０℃、９
４〜９８時間の不活化処理を行ない、次いで２〜６　’
Ｃで６〜ｌＯ日間放置し、得られた不活化ＨＨｓＡｇを
ｐ）１６〜８の緩衝液に対して透析後、賦形剤を１〜５
チ■・／Ｖ　添加、凍結乾燥し、Ｂ型肝炎の感染性のな
い人血漿成分を含まない）１ＢｓＡｇを主成分とする８
％肝炎感染予防用ワクチンの製造法。