JPS61280438A - Ｂ型肝炎表面抗原の改良単離精製法 - Google Patents

Ｂ型肝炎表面抗原の改良単離精製法

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JPS61280438A
JPS61280438A JP61125590A JP12559086A JPS61280438A JP S61280438 A JPS61280438 A JP S61280438A JP 61125590 A JP61125590 A JP 61125590A JP 12559086 A JP12559086 A JP 12559086A JP S61280438 A JPS61280438 A JP S61280438A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、ワクチンとして有用なり型肝炎表面抗原（Ｈ
Ｂ　ｓＡｇ　）の改良単離精製法およびその調製方法に
関する。
本発明の方法により得られるＨＢｓＡｇ抗原は、１７〜
２０　ｎｍのＨＢＳＡｇ粒子の形態である。これは、ワ
クチンの調製に有用である。
発明の背景 Ｂ型肝炎は、広範囲に広まり、潜在的に致命性のウィル
ス性疾病である。その病原体、即ち、Ｂ型肝炎ウィルス
は、何年も前に、この病気にかかっている患者の血液か
ら単離°されているが、商業的Ｂ型肝炎ワクチンの開発
は、大きな問題に直面している。即ち、Ｂ型肝炎ウィル
スは、（ａ）コアプロティン結合したウィルス性ゲノム
、および免疫原性でないコア抗原（）ＩＢｃＡｇ）を含
有するコア、および［ｂ）免疫原性表面抗原（ＨＢｓＡ
ｇ）を含有するエンベロープからなるゾーン粒子（Ｄａ
ｎｅ　ｐａｒｔｉｃ　−１ｅ）と称する４　２　ｎｍ粒
子である。ＨＢｇＡｇは、形態学的に不均質な複合巨大
分子構造群である。
即ち、これは、タンパク質、炭水化物、糖タンパク質お
よび脂質を含有し、その主成分は、ホスファチジルコリ
ン、コレステリルエステル、コレステロールおよびトリ
グリセリドである。Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶＪでの感
染は、ゾーン粒子の産生ばかりでな（，２２ｎｍ粒子お
よび表面エンベロープの成分を含有するフィラメントの
過剰産生をきたす。これらの２２ｎｍ粒子は、七ツマー
ＨＢｓＡｇタンパク質よりも、約１０００倍免疫原性が
大きいことが知られているが、ＨＢＶの複製および発現
は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで該ウィルスを増殖させるのに適
当な細胞培養系がないため、長い間妨げられてきた。ウ
ィルスを効率よく増殖させることができるｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏの培養系がないため、組換ＤＮＡ技術を用いること
によりＨＢｓＡｇ様分子の合成または別の宿主系におけ
るｌ（ＢｓＡｇの発現のいずれかに対する研究開発がな
された。例えば、ＨＢｓＡｇに関する遺伝子を担うＤＮ
Ａベクターで形質転換された酵母セルからのＨＢｓＡｇ
の発現が報告されており、また、酵母中で合成されたＨ
ＢｓＡｇが直径１７〜２０１ｍで、ヒト細胞から分泌さ
れる２　２　ｎｍ粒子と類似した性質を有する粒子にな
ることが知られている（ピー・バレンツエラら、ネイチ
ャー（Ｐ、ＶＡＬＥＮＺ［ＪＥＬＡ　　ｅｔ　ａｌ、。
Ｎａｔｕｒす、　２９８；３４７−３５０（１９８２）
およびアール・エイ・ヒツツエマンラ、ニュークレイツ
ク・アシツズ・リサーチ（Ｒ，Ａ、ＨＩＴＺＥＭＡＮＮ
　ｅｔ　ａｌ。
Ｎｕｃｌ、Ａｃ、　Ｒｅｓ、）１１　　：２７４５−２
７６３Ｃ１９８３）参照）。操作処理セル培養物、例え
ば、処理酵母培養物における、組換え技術によるＨＢ　
ｓＡｇの産生は公知である（例えば、ヨーロッパ特許出
願公開第０１０６８２８号；ダブリｉ−・ジエイ・マツ
カリ−ら、ネイチャー（Ｗ、　Ｊ　、ＭｃＡＬＥＥＲｅ
　ｔ　ａ　１　、　。
Ｎａｔｕｒｅ）３旺：　１７８−１８０（１９８ｊ）お
よびシー・イー・カーティーら、アブストラクト０３０
・オブ・ジ・アニュアル・ミーティング・オブ・ジ・ア
メリカン・ソサイエテイーーフォアφマイクロバイオロ
ジー（Ｇ、　Ｅ、ＣＡＲＴＹ　ｅ　ｃ　ａｌ　、　、Ａ
ｂｓｔｒａｃｔＱ３Ｑ　ｏＥ　ｉｅ　ａｎｎｕａｌ　ｍ
ｅｅｔｉｎｇ　ｏｆ　　ｔｈｅ　ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏ
ｃｉｅｔｙ　　Ｅｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）（
１９８４）（第８４回会議、１９８４年３月４日〜９日
〕参照〕。
ＨＢｓＡｇの血漿、血清または他の血液製品または生物
学的液体または処理セル培養物からの抽出および精製方
法を記載した記事および特許も多（ある。
本発明の方法は、ＨＢ　ｓ　Ａｇを産生ずる処理酵母セ
ルに適用し得る。
十分な細胞濃度まで増殖させた処理酵母セル培養物から
のｆ（ＢｓＡｇの抽出および精製は、一般に以下の様な
３つの連続した段階を要する：（１）セル内部からのＨ
Ｂ　ｓＡｇ　　の除去；（２）培地のＨＢ　ｓＡｇでの
濃化： （３）培地からの実質的に全ての汚染物質の除去。
たいていの方法において、工程（１）は、機械的力、例
えば剪断力（例えば、Ｘ−プレスまたはフレンチプレス
）によるか、またはガラスピーズとともに振とうし、最
後に界面活性剤を添加することにより行なう。非イオン
性界面活性剤（トリトンＸ−１００）の使用が、ケイ・
ムレイら、ヨーロピアン・モレキュラ・バイオロジー・
オーガニゼイション・ジー？　−す／ｌ／　ＣＫ、Ｍｔ
ＪＲＲＡＹ　ｅ　ｔ　ａ　１．　、ＴｈｅＥＭＢＯＪ、
）３：＜−１９８４）および前記アール・エイ・ヒツツ
エマンら（ＲｌＡ、ＨＩＴＺＥＭＡＮ　ｅ　ｔ　ａ　ｌ
　、　）により報告されている。
ＨＢｓＡｇを界面活性剤を用いてインキュベートするこ
とにより、粒子が破壊されることも報告されている。こ
の点に関して、 英国特許第２０９３０３９号は、ＨＢｓＡｇを非イオン
性界面活性剤（トリトンＸ−１００，１で処理してポリ
ペプチド混合物を形成し、これをスクロースグラジェン
トを有する水性緩衝溶液の上部に導入し、実質的に界面
活性剤゛を含まず、ポリペプチド混合物のミセルを含有
するフラクションを回収することを開示している。
ヨーロッパ特許第０００５８６４号は、粒子径が少なく
とも２０　ｎｍのＢ型肝炎表面抗原（ＨＢ　ＳＡｇ　）
およびコア抗原（ＨＢＣＡｇ、ｌ　を含有する抗原性物
質を界面活性剤（例えば、ツイーン２０または８０〕と
接触させ、次いで、抗原性組成物を含有する界面活性剤
を水性アルデヒド溶液で処理することを開示している。
得られた生成物は、粒子径２０ｎｍ以下、特に５ｎｍ以
下の粒子である。
日本国特開昭５３−１０４７２４号（ダーウエント・ア
ブストラクト第７５３２４Ａ−１ｉ：りは％ＨＢ　ｓＡ
ｇ粒子を（１）非イオン性界面活性剤（即ち、７〜１０
のオキシエチレン鎖を有するポリオキシエチレンアルキ
ルフェニル）　、（２）タンパク質変性剤（即ち、尿素
またはグアニジン）、および（３）所望により還元剤の
存在下に加熱する方法を開示している。得られた生成物
は、１０〜２０ｎｍの粒子径を有する。日本国特開昭５
０−１６０４２０号（ダーウエント・アブストラクト第
２７４２０Ａ号月よ、ＨＢｓＡｇを異なった界面活性剤
で処理して、サブユニット生成物を産生ずる方法を開示
している。
西ドイツ国特許出願第２６１１７２３号は、抗原を脱脂
界面活性剤の存在下で加温することにより、ＨＢｓＡｇ
球状粒子を得る方法を開示している。
米国特許第４１１３７１２号は、ＨＢｓＡｇを、はぼ中
性のｐＨの脱脂質可能な界面活性剤を含有する塩化ナト
リウム等張溶液中で加熱することにより調製される一種
のポリペプチドサブユニットからなるＦＩＩＳｓＡｇ粒
子を開示している。
米国特許第４４８１１８９号は、界面活性剤（例えば、
非イオン性界面活性剤つと接触させることにより、血漿
および血清誘導体を滅菌化する方法を開示している。
工程（２）および（３）は、種々の技術、とりわけ、コ
ロイド状シリカ、更に詳しくは、「アエロジル（’ＡＥ
λ０５ＩＬＩ）」（デグッサ社（西独）　（ＤＥＧＵＳ
　ＳＡ　、　Ｆｒａｎｃ　ｆｏｒ　ｔ　、　ＦＲＧ　）
　ヨり市販の製品）を用いた吸着／脱着を取り入れたも
のである。
かかる技術は、以下に示す°文献に記載されている： ダブリュー・ジエイ・エム・デュイメルら、フオクス・
サンギニス（Ｗ、　Ｊ　、Ｍ、　Ｄ（ＪＩＭＥＬ　ｅｔ
　ａ　ｌ　、。
Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、）２３：２４９〜２５５（１９７２
）ジエイ・ビロットら、ジャーナル・サブ・クリニカル
・マイクロバイオロジー（Ｊ、ＰＩＬＬＯＴ　ｅｔ　ａ
ｌ、。
Ｊ　、　ＣＩｉｎ６ＭｉｃｒＣｌ１ｎ６．）　４　：２
０５−／２０７（１９７６）およびモレキュラ・イムノ
ロジー（Ｍｏ　ｌ　ｅ　ｃ　、　Ｉｒｒｒａ＋ｎｏｌ　
。
）炎１；５３〜６０（１９８４） エフ・バリンら、アニュマル・マイクロバイオロジー（
パスツール研究所）　ＣＦ、ＢＡＲＩＮ　ｅｔ　ａｌ、
。
Ａｎｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌす（Ｉｎｓｔ、Ｐａ５ｔ
ｅｕす１２９Ｂ　：た 前記文献では、せいぜい、吸着さｇ、、ｍＢｓＡｇのフ
ラクション（即ち、約６０％）を、溶出液にデオキシコ
レートを添加せずに回収する（低イオン強度の緩衝液で
溶出する場合に、最も良い結果が得られる）ことを示唆
しているのみである。
他の研究（シーブケら、アクタ・バンロジカ・マイクロ
バイオロジー・エト・イムノロシカ・スカンジナビ力、
セクションＢ　（ＳＩＥＢＫＥ　ｅｔ　ａｌ、。
ＡＣｔａ　Ｐａｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５ｃａ
ｎｄ、　５ｅｃｔｉｏｎ　Ｂ）炙免　：　　９３５−９
３６（１９７２月こおいては、オーストラリア抗原は、
２％ツイーン８０により、アエロジルから一部溶出され
、同様に、界面活性剤の存在下で、吸着されにくいこと
が指摘されている。
発明の開示 シリカゲルへの吸着およびデオキシコリン酸緩衝液を用
いた脱着を取り入れた公知の技術を、非イオン性界面活
性剤を添加することにより得られる後培養ＨＢｓＡｇ産
生セルの溶解物から得られる上清に適用する場合、破裂
させたセルの透明な上清が得られないだけでなく、コロ
イド状シリカからの脱着にデオキシコリン酸を用いてモ
、ＨＢＳＡｇが部分的にしか脱着されず、−万、セファ
ロース４Ｂ−ＣＩ！上クロマトグラフィーにより示され
る如（、通常の位置（Ｋｄ　：０．２５　）に肝炎抗原
が検出されないことから、酵母粒子が破壊されているこ
とが判明した。
スクロース中勾配遠心分離°によって、０．５％（Ｗ／
Ｖ）　　トＩＪトンＸ−１００の存在下で酵母セルの破
壊を行なった場合、ＨＢ　ｓＡｇ粒子の構造は無傷でな
くなるが、−万、０．５％（ｖ／ｖ　）ポリソルベート
（例えば、ポリソルベート２０）をトリトンＸ−１００
にかえた場合、無傷のＨＢ　ｓ　Ａ　ｇの収率が、実質
的に向上することも判明した。
さらに、ポリソルベート非イオン性界面活性剤（例えば
、ポリソルベート２０または８０）で破裂させた酵母セ
ルの上清を、尿素（最終濃度２〜６Ｍまで〕で補足した
場合、（例えば、室温にて３０分間撹拌することにより
〕部分的に清澄化された溶液が得られることが判明した
。
さらに、該清澄化溶液をアエロジルで処理することによ
り、尿素／非イオン性界面活性剤添加剤を前に用いたデ
スオキシコレート添加剤にかえた場合、低いイオン強度
の緩衝液系で、ＨＢｓＡｇが完全に脱着され得ることが
判明した。
この様にして行なわれるＨＢ　ｓＡｇ脱着の完全性は。
脱着されたコロイド状シリカにおいて、２２にのバンド
が存在しないことにより示され、単離されたＨＢｓＡｇ
が、約２２　ｎｍの粒子となり、これを被験動物に非経
口投与すると、高いレベルの）ＬＢｓＡｇ抗体が惹起さ
れることが判明した。
従って、本発明の第１の目的は、ワクチンの目的に有用
ｆｊ　Ｂ型肝炎表面抗原を、発現されたＨａｓＡｇを有
する処理酵母セルの培養物から調製する改良された方法
であって、非イオン性界面活性剤、更に詳しくは、ポリ
ソルベート（例えば、０．３％Ｖ／Ｖポリンルベート２
０または８０）の存在下にセルを破裂させ、これに尿素
を添加して最終濃度を２〜６Ｍにして清澄化ＨＢｓＡｇ
溶液を得（例えば、室温にて３０分間撹拌することによ
る〕、ＨＢｓＡｇをコロイド状シリカ（アエロジルなど
〕上に吸着させ（例えば、４℃にて一夜撹拌することに
よる〕、ＨＢｓＡｇを、最終濃度８Ｍの尿素、および非
イオン性界面活性剤、更に詳しくは、ポリソルベート（
例えば、最終濃度０．１〜１チのポリソルベート２０ま
たは８０）で補足した低イオ９．５．３７℃にてＨＢｓ
Ａｇを°脱着すらζ特徴とする方法を提供することであ
る。
脱着物は、精製ＨＢｓＡｇ粒子を含有し、これは、公知
の技術、例えば、限外濾過、アガロース上クロマトグラ
フィー、硫酸デキストラン／塩化カルシウムを用いた沈
降および透析などに従って、さらに処理することができ
る。
本発明を、以下の実施例により説明する。
実施例１ 培養物１１につき乾燥セル重量３０ｇまで増殖させたＨ
ＢｓＡｇを発現する処理酵母セル培養菌のペレット化セ
ル８０Ｌｉ（湿潤セル重量）　ヲＮａ２ＨＰＯ４水性溶
液（７，０９８ｆ／／１）１５０尻ｇ中に懸濁させる。
コノ懸濁液を４％ＣＷ／Ｖ）ＥＤＴＡ溶液３ｒｎｌ、ポ
リソルベート２０　０．９　ａｔおよびフッ化フェニル
メチルスルホニル（ＰＭＳＦＪ　　６０〜を含有すルイ
ンプロパノール９０ｍ１で補足する。ＮａＯＨ（１０％
ｗ／ｖ水中溶液）でｐＨを８．１に調節する。懸濁液を
水浴中で冷却し、冷ガラスビｉズホモジナイザーに２度
通して破裂させる。ホモジネートを次いで１３０００　
ｆＪにて３０分間遠心操作に付す。
粗抽出上清１６０ｍ／を、尿素の最終濃度を４Ｍとし、
室温にて３０分間撹拌して、ＨＢｓＡｇ粒子を汚染酵母
細胞膜から分離し、これに、０．３％（、Ｖ／Ｖ）ポリ
ソルベート２０および４Ｍ尿素を含有する５０ｍＭリン
酸緩衝液（ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ０Ｈ）　（ｐＨ７，２
）中子備洗浄したアエロジル■３８０（，２，５％ｗ／
ｖ）を添加する。溶液を室温にて一夜撹拌し、ＨＢＳＡ
ｇ粒子をシリカ粒子上に最大量吸着させる。
コロイド状シリカを次いで６５００Ｓ’にて１５分間遠
心操作に付し、２５０　ｒｔｔｅの１０％（Ｗ／Ｖ）Ｎ
ａＣｌで２回洗浄する。
洗浄シたシリカを、０．５％（Ｖ／Ｖ　）ポリソルベー
ト２０および尿素（最終濃度８Ｍ）で補足した１　０　
ｍＭホウ酸緩衝液ＰＨ９，０（Ｎａ２Ｂ４０７／Ｉ″ｌ
Ｃ１！〕中に懸濁させ、懸濁液を３７℃にて４時間撹拌
する。
脱着したコロイド状シリカを、次いで、２７０００ｇに
て３０分間遠心操作に付し、最大量のコロイド状シリカ
粒子を沈降させる。
スクロースグラジェント中の勾配遠心分離および電子顕
微鏡により、直径約２２ｎｍの粒子形態で抗原が存在す
ることがわかる。
脱着物を、１０００００　　ダルトンのカットオフを有
するカートリッジを備えたＡＭＩＣＯＮ　ＤＯＣアミコ
ン・コーポレイション（ＡＭＩＣＯＮ　Ｃ０ＲＰ。
ＩＪＡＮＶＥＲ５、ＭＡ　、　ＵＳＡ）　ヨり市販の装
置）で１５扉ｅに濃縮し、０．３％（Ｖ／Ｖ　）ポリソ
ルベート２０を含有する１０．ｍＭｌ−ロメタモール／
ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８，０）中平衡化されたセファロー
ス（ＳＥＰＨＡＲＯ３Ｅ、）４Ｂ−ＣＪ（−ファーマシ
ア・ファイン・ケミカルズ（ｐＨＡＲＭＡＣＩＡ　ＦＩ
ＮＥ　ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ。
Ｌｌｐｐｓ　ａｌ　ａ　、Ｓｗｅｄｅｎ　）より製造・
販売されているアガロースゲル９上刃ラム（φ２゜５ｃ
ｍＸ１００ｃｍ）に付す。
抗原含有ピーク（Ｋｄ、＝０．２５　）を、最終濃度Ｏ
Ｊ％（Ｗ／■つの硫酸デキストラフ　（、ＭＷ　５（１
０００）および最終濃度４　Ｑ　ｍＭのＣａ　ＣＺ’　
２で処理する。
過剰の硫酸デキストランは、１０ｍＭ　トロメタモール
／ＨＣＪ緩衝１（ＰＩ（８゜０）中４０　ｍＭ　Ｂａ％
溶液に対して透析すること（こより沈殿する。透析物３
０ｍ１をＣｓＣ４勾配遠心操作に付し２、ＨＢｓＡｇＢ
ｓＡｇ含有ビーフ９ｍる。
前記工程の異なる段階でのＨＢ　ｓ　Ａｇの精製を第り
表１こまとめる。
５０５−ＰＡＧＥゲルによる走査分析により、最終生成
物は、ＨＢｓＡｇに関し、少なくとも９８％純粋である
ことがわかる。
実施例２ 培萎物１であたり乾燥セル重量３０ｙまで増殖させたＨ
ＢｓＡｇを発現する処理酵母培養菌のベレット化セル（
湿潤セル重量８０ｇ〕をＮａ　２ＨＰＯ，ｉ水性溶液（
７，０９８！／ｌ　）１５０ｒａｌ中に懸濁させる。
コノ懸濁液を４％（ｗ／ｖ　）　ＥＤＴＡ溶液３　ｒｎ
ｌ、ボ、リソルベート２０　０．９ｍ／？およびフッ化
フェニルメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）６０〜ヲ含有
スルインプロパツール９ｆｌｅで補足する。Ｎａ０Ｈ（
、１０％Ｗ／Ｖ水中溶’／１７．）でｐｉ−ｉ　８．１
に調整する。懸濁液を水浴中で冷却し、冷ガラスピーズ
ホモジナイザーに２回通すことにより破裂させる。ホモ
ジネートを次いで１３０００ｆｊにて３０分間遠心操作
に付す。
粗抽出物上清１６０ＷＬｌを、尿素の最終濃度を４Ｍに
なるよう（こし、室温（こて、３０分間撹拌して、汚染
酵母細胞膜からＨＢｓＡｇを除去し、これに０３％（Ｖ
／Ｖ）ポリソルベート２０および４Ｍ尿素を含有する５
　Ｑ　ｍＭリン酸緩衝液（Ｎ　ａ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４，／Ｉ
Ｎ　ａＯＨ）（ｐＨ７，２）中子備洗浄したアエロジル
ｏ３８０（２，５％ｗ／ｖ）を添加する。溶液を４℃に
て一夜撹拌し、シリカ粒子上に最大量のＨＢｓＡｇ粒子
を吸着させる。
コロイド状シリカを次いで６５００ｆにて１５分間遠心
操作に付し、１０％ＣＷ／すＮａＣＪ　２５０　ｍｅず
つで２回洗浄する。
洗浄したシ＋）４を０．５％い／Ｖ）゛ポリソルベート
２０および尿素（最終濃度８Ｍ）で補足した１０ｍＭ硼
酸緩衝液（Ｎａ２Ｂ４０７／ＨＣ１り（ｐＨ９，０）８
０ｍｅ中に懸濁させ、該懸濁液を３７℃にて４時間撹拌
する。
脱着したコロイド状シリカを、次いで２７００Ｏｆにて
３０分間遠心分離し、最大量のコロイド状シリカ粒子を
沈降させる。
尿素を透析により除去するために、脱着物を１００００
０　ダルトンのカットオフを有するカートＩＪ　”７ジ
を備えたＡＭＩＣＯＮ　　ＤＣ中、］　ＱｍＭトロメタ
モール／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，５）　に対して透析し
、流速１０ｄ／時にて、１０　ｍＭ　？ロメタモール／
ＨＣ１！緩衝液（ｐＨ７，５）で平衝化したヘキシルア
ガロース（ファーマシア・ファイン・ケミカルズ（ｐＨ
ＡＲＭＡＣＩＡ　ＦＩＮＥ　ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ　、Ｌ
ｌｐｐ　ｓ　ａ　ｌ　ａ　、　Ｓｗｅｄｅｎ　）　ヨり
製造・販売されている製品）２５ａｅのカラムに付す。
カラムを１０ｍＭトロメタモール／ＨＣ１緩衝Ｈ（ｐＨ
７，５）で洗浄し、エチレングリコールおよび最終濃度
ＩＭのＮａＣＪで補足した１０ｍＭ１−ロメタモーノＬ
／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，５）の５０１５０（Ｖ／り混
合物で溶出し、その後、最終濃度４Ｍの尿素で補足した
１０ｍＭ　トロメタモール／ＨＣ／緩衝液（ｐＨ７，５
）で溶出する。
前記工程の異なる段階でのＨＢｓＡｇの精製を第■表に
まとめる。
５Ｄ５−ＰＡＧＥゲルによる走査分析により、最終生成
物は、ｔ（ＢｓＡｇに関して少な（とも９７％純粋であ
ることが示される。
実施例３ 実施例を同じ方法で、ただし、ヘキシノげガロースをフ
ェニルアガロース（ファーマシアｅファイン参ケミカル
ズ（ｐＨＡ■仏ＣＩＡ　ＦＩＮＥ　ＣＨＥＭＩＩＣＡＬ
Ｓ　、　Ｌｌｐｐｓａｌａ　、　Ｓｗｅｄｅｎ］Ｃより
製造されている製品）２５ａｅにかえる。
一連のＨＢｓＡｇ精製工程および最終生成物中のＨＢｓ
Ａｇ含量は、実施例２で得られたものと類似している。
実施例４ ＮａＣＪ、リン酸緩衝液（Ｎａ２）（１）０４／ＮａＨ
２ＰＯ４）およびアルヒドロゲル（ＡＬＨＹＤｋＯＧＥ
Ｌｏ）（スペルホス・エキスポート・カンパニー（ＳＵ
ＰＥＲＰＨＯ５ＥＸＰＯＲＴ　Ｃｏ、、　Ｃｏｐｅｎｈ
ａｇｅｎ　、ＤｅｍｍａｒＪより製造販売されている水
酸化アルミニウムゲル〕（最終濃度は各々、０．９％（
Ｗ／す、２０　ｍＭおよびＡｌ（ＯＨ）３０．１５％（
Ｗ／Ｖ）まで、最終ｐＨ６，９）を添加することにより
、タンパク質含量を１０μグ／ｒｒｔｌに調節する。
調製物を滅菌し、各々１　ｖｔｌ投与単位のワクチンを
入れた２ｍｌガラスバイアル中に分散させる。
実施例５ 種々の希釈度の実施例４のワクチン調製物の投与単位を
、５群の５週令のスイス・マウスに、腹腔西経路で投与
する。
投与の２８日後、被験動物から血液を採取し、ＡｔｊＳ
　Ａ　Ｂｅ法（ＡＵＳＡＢは、アボット・ダイアグノス
ティック・プロダクツ社（ＡＢＢＯＴＴ　Ｄｉａ−ｇｎ
ｏｓｔｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ＧｍｂＨ，Ｗ４ｅｓｂ
ａｄｅｎ、ＦＲＧ）により製造・販売されているテスト
キットの登録商標）により、各サンプルについて血清抗
ＨＢｓ滴定量を測定する。
同時（こ、同じワクチン・スケジュールに従って、実施
例４の技術（ただし、コロイド状シリカの工程なしくこ
実施例１の技術番こより調製した抗原を用いる）により
得られたワクチン調製物の同じ希釈度の投与単位を、５
群の５週令スイスマウスに投与する。
この比較試験の結果を、第■表（こ示す。表中、ｔＡ＋
は、尿素を用いた本発明の技術により得られたワクチン
に関するものであり、−万、（Ｂｌは、コロイド状シリ
カの段階のない方法により得られるワクチンに関するも
のである。
第　　　ｍ　　表

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）Ｂ型肝炎表面抗原を産生し、非イオン性界面活性
    剤、更に詳しくは、ポリソルベートの存在下に破裂させ
    た処理酵母セルの上清をコロイド状シリカで処理するこ
    とによるＢ型肝炎表面抗原の単離精製法であつて、尿素
    を添加することにより該上清を清澄化し、抗原をコロイ
    ド状シリカ上に吸着させ、尿素および非イオン性界面活
    性剤で補足した低イオン性緩衝液（ｐＨ８〜９．５）を
    用いて抗原を脱着させることを特徴とするＢ型肝炎表面
    抗原の単離精製法。
  2. （２）尿素を、最終濃度が２〜６Ｍになるまで添加する
    ことにより、上清の清澄化を行なう前記第（１）項の方
    法。
  3. （３）清澄化工程を４℃にて行なう前記第（１）項また
    は第（２）項の方法。
  4. （４）低イオン強度緩衝液が１０ｍＭである前記第（１
    ）項〜第（３）項いずれか１つの方法。
  5. （５）低イオン強度緩衝液に、最終濃度８Ｍまで尿素を
    補足する前記第（１）項〜第（４）項いずれか１つの方
    法。
  6. （６）脱着を３７℃にて行なう前記第（１）項〜第（５
    ）項いずれか１つの方法。
  7. （７）低イオン強度緩衝液に補足する非イオン性界面活
    性剤がポリソルベートである前記第（１）項〜第（６）
    項いずれか１つの方法。
  8. （８）ポリソルベートがポリソルベート２０または８０
    である前記第（７）項の方法。
  9. （９）ポリソルベートの最終濃度が０．１〜１％（ｖ／
    ｖ）である前記第（７）項または第（８）項の方法。
JP61125590A 1985-05-30 1986-05-29 Ｂ型肝炎表面抗原の改良単離精製法 Granted JPS61280438A (ja)

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