KR830000366B1 - B형 간염 감염 예방용 왁찐의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

B형 간염 감염 예방용 왁찐의 제조방법

본 발명은 HBsAg 입자를 주성분으로 하는 B형 간염 감염 예방 왁찐의 제조방법에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 정제과정에 있어서 폴리에틸렌글리콜 분획법을 유효하게 짜 넣으므로서 부작용의 원인으로 될 수 있는 사람의 혈장성분 및 B형 간염 감염성 성분을 제거하고 그위에 항원성을 깨뜨리지 않고 감염성 불활성화 처리를 행하는 것으로서 된 HBsAg를 주성분으로 하는 B형 간염 감염 예방용 왁찐의 제조방법에 관한 것이다.

HBsAg(HBS 항원)은, B형 간염을 일으키는 비루스(HBV)의 구성 성분으로서 알려지고 있지만, 그 대부분은 감염성이 없는 소형입자로서 존재하고 있으며, 사람이나 침팬지이의 혈장 중에서 발견된다.

HBsAg은 전기영동적으로는, 사람의 혈장의 글로불린 담백에 속하고 있다.

HBV에 의한 감염의 예방으로서는, HBS 항체를 함유한 글로불린 제제를 투여하여 수신(受身)면역을 획득시키는 방법도 있으나, 그 효과는 단기간이며 일반적인 비루스 감염의 예방에서 보여지는 것처럼 왁찐에 의한 능동적인 면역이 가장 뛰어나고 있음은 물론이다.

이론적으로 B형 간염에 대한 왁찐은, 먼저 B형 간염 비루스 물질을 단리하고, 그것을 적당한 방법으로 불활성화시키든가, 또는 HBsAg로부터 미변화 비루스를 분리하고, 보충적으로 불활성화 처리하므로서 제공된다. 이 왁찐은, 생체에 투여되었을 때, B형 간염 비루스에 대한 B항체의 생산이 이뤄지므로서 결과적으로 B형 간염의 감염을 예방할 수가 있다.

HBsHg 왁찐의 제조는, 지금까지 수없이 시도되어 왔었다. 비루스의 감염성을 불활성화시키는 방법으로서는, 60℃ 10시간 혹은 100℃ 2분간의 가열 처리를 행하는 방법이 있는데, 가열 처리에서는 HBV에 함유된 핵산(DNA)을 충분히 파괴한다고 하는 보장은 없다. 그로 인하여 오늘날 널리 채용되고 있는 기술은 포르말린 처리에 의한 HBV의 불활성화 처리이다.

또, HBsAg의 단리정제법으로서 가장 일반적으로 채용되고 있는 것은 초원심분리법과 아피니티 크로마토그래피법이다. 이들의 방법을 채용하면 거의 순수한 HBsAg 입자를 얻을 수가 있다. 그러나, 이미 알려진 단리방법은 한결같이 복잡하며 또한 공업적으로 이용하기가 곤란하다. 그 위에 약간 혼재하고 있는 사람의 혈장 담백일지라도 포르말린 처리로서 변성을 받은 것은 이것이 사람에게 투여되었을때, 부작용의 원인으로 되기 때문에 그들은 가능한한 완전히 제거되어 있지 않으면 안된다. 이토록 미소한 양이 혼재하고 있는 사람의 혈장 성분은, 아무리 초원심분리나 아피니티크로마토그래피를 반복하더라도 제거할 수 없고, 그 일부분은 HBsAg와 결합하여 존재하고 있을 것이라는 견해를 갖는 연구자도 더러 있었다.

본 발명의 목적은, HBsAg 입자의 항원성을 잔조시킨채 부작용의 원인으로 될 수 있는 혈장 담백성분을 제거한 다음 HBsAg를 회수하고, 또한 혼재할 염려가 있는 HBV 즉, 데엔입자를 불활성화하고, HBsAg 입자를 주성분으로 하는B형 간염 감염 예방용 왁찐의 공업적 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명자들은, 사람의 혈장 담백의 분획에 있어서, 폴리에틸렌글리콜이 우수한 성능을 발휘하는 것에 착안하고 HBsAg 입자의 정제에 폴리에틸렌글리콜 분획공정을 짜넣기 위한 조건을 검토함에 따라 고수량이며, 순도가 높은 HBsAg 입자를 얻는데 성공하였다.

본 발명은, HBsAg(HBS 항원)을 함유한 사람의 혈청 또는 혈장에서 대부분의 혈장 담백성분을 제거한 조제 HBsAg의 수성현탁액의 PH 를 중성 부근으로 조정하고, 이에 폴리에틸렌글리콜을 5∼6% 가하고, B형 간염에 감염성이 있는 데엔 입자와 면역복합체를 침전시켜 제거하고, 다음에 수성 현탁액의 위맑은 것에 폴리에틸렌글리콜을 추가하고, HBsAg 입자를 침전시켜 모으고, 이를 겔여과와 초원심분리법으로서 입자의 크기 22nm 비중 1.19∼1.21g/㎤인 일정치의 HBsAg 입자를 회수하고, 다시 비루스 불활성화 처리 및 제제화 공정을 거쳐서 B형 간염의 감염성이 없는 사람의 혈장 성분을 함유치 않은 HBsAg 입자를 주성분으로 하는 B형 간염 감염 예방용 왁찐의 제조방법으로서 이뤄진다.

본 발명에 있어서는 건강인 기증의 HBsAg 양성 혈청 혹은 혈장에서 본 항원을 정제하였다. 왁찐 제조용으로서 HBsAg 역가가 향류 전기 영등법(CEP)으로 1 : 16이라 혹은 그 이상의 혈청을 선별하여 사용하면 효율이 좋다.“ad”와“ay”의 고종류로 대별할 수 있는 서브타입은, 개별적으로 취급하였다.

조제 HBsAg의 희수법은 대규모 정제에 적합한 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 콜로이드 규삼염과 같은 콜로이드·겔 상에 있어서의 흡착·용리가 바람직하다. 조자ㅔ HBsAg는 대부분의 혈장 담백성분이 제거되어 있는 것이 바람직하다.

얻어진 조제HBsAg는 폴리에틸렌·글리콜 분획에 의해서 B의 감염성 성분 및 면역 복합체 등의 미소량 협잡물이 침전으로서 제거된다. 폴리에틸렌글리콜(이하 PEG)는 분자량 2,000∼1,000의 것이 사용된다.

처리조건은 수용액을 중성(PH 6∼8), 온도 2∼10℃(저온이 바람직하다)로 유지한다. PEG 농도는, 5∼6%(W/V), 바람직하기로는 5.3∼5.7%(W/V)이다. 처리시간은, 3∼7시간이 일반적이다. 생긴 침전은 협잡물로서 회수한다.

HBsAg를 함유한 위맑은 부분은, PEG 농도를 상승시켜서 HBsAg를 침전으로 하여 회수한다. 그 첨가가 끝난 농도는 10∼20%(W/V)이다.

얻어진 HBsAg를 함유한 침전은, 다음에 HBsAg 입자의 균일화 및 염, 석출제 그 밖에 제조공정 중에 있어서의 첨가물을 제거한다. 이 공정을 위해서는 공지된 관용적인 방법이 이용 가능하다. 예를 들면, 투석법, 겔여과, 초원심분리법 등이다.

겔여과법으로서는, 분자량 수십만∼수백만의 사이의 물질에 적용 가능한 분자 담체 예를 들면 아가로우스(sepharose 4β, 6β), 가교덱스트란 등의 고분자 다당체 과립을 이용한다. HBsAg 분획의 회수는 HBsAg 양성획분을 면역학적 방법에 따라 검정하고, 또한 행한다.

초원심분리방법은, CsCl, 취화나트륨 등의 직선농도 구배(1.10∼1.40g/㎤) 죠널원심분리법이 바람직하다. 입자의 회수는, 1,19∼1.21g/㎤의 밀도 영역에서 행한다.

얻어진 HBsAg 입자를 왁찐으로서 사용하자면, 투석조작에 의한 탈염, 다시 제균여과, 덧붙여서 HBV의 감염성 성분의 잔존에 대한 의구심을 완전히 없애자면, 불활성화 처리를 행한다.

불활성화 처리는, 이상과 같이 하여 정제한 항원을 CEP 역가가 1 : 20으로 되도록 조정한 후 0.1∼0.02%(W/V) 바람직하게로는, 0.04%(W/V) 포로말린을 사용해서 행한다. 포르말린 처리의 종료후 최종 항원역가가, CEP로서 1 : 4로 되도록 조정한다. 최후에 0.22μ의 밀리포어·필터를 사용하여 제균여과를 행한다.

왁찐이 체액으로 들어가서, 체내의 면역기구에 유효하게 작용하여 항체를 생성시킴에 있어서는 여하한 투여량 및 투여방법을 사용하여도 좋다. 또 보조약제, 예를 들면 수산화 알루미늄 혹은 그 밖에 당업자의 주지의 것을 혼합함에 따라 그 작용이 높여진다.

본 발명의 왁찐은, 근육 또는 피하에, 또는 그 밖의 적당한 수단으로 투여된다. 그 중에서도 근육내 투여가 바람직하다.

이와 같이 하여 얻어진 HBsAg 완찐을, 그 안전성을 확고하게 하자면, HBV가 사람 이외에 감염되는 유일한 동물로서 침팬지이에 투여하였다. 침핀지이는 전혀 감염되지 않았고, 안전하다는 것이 명백해짐과 함께 투여를 받은 침핀지이의 혈중에 HBs 항체의 생성을 본데서, 동시에 HBsAg 왁찐은 HBV의 예방에 유효하다는 것이 시사되었다.

그래서 이 왁찐을 실제로 투석환자에게 투여하였다. 그 결과, 부작용은 보이지 않았고, 왁찐을 투여치 않았든 대조환자와 비교하여 B형 간염의 발생율은 뜻대로 낮았으며, 유효하다는 것이 증명되었다.

[실시예]

(1) 항원재료

HBs 항원은 건강한 기증자의 HBsAg 양성 혈장을 원료로 하여 이것에서 정제하였다.

왁찐 제조용으로서 채용한 혈장은 CEP(하이랜드제 전기 영동장치)에 의한 HBsAg 역가가 1 : 16 내지 그 이상의 것이었다.

HBsAg의 서브타입“ad”와“ay”과는 따로따로 정제하였다.

혈장을 사용했으므로 Mann의 침전법을 행하는 것에 따라 β-리보프로테인과 함께 탈피브린을 행하였다.

(2) 콜로이드 규산염에 의한 HBsAg의 흡착

Mann 침전법의 위맑은 부분에 에어로딜 R380(콜로이드 규산염 : Degusa, 서독)을 2.5%(W/V)가 되도록 첨가하고, 37℃로 3시간 마그네틱·스타아러로서 느슨하게 교반하였다. 반응현탁액을 베코맨 TJ 6 원심분리기로서 1,600 10분간 원심분리하였다. HBsAg를 함유한 에어로딜·펠렛을 1ℓ의 EDTA NaCl 0. 15M의 완충액, PH 7.6으로 4회 세정하였다.

(3) 데옥시코레이트 함유 붕산 완충액에 의한 에어로딜고 부터의 HBsAg 용리 최후의 세정이 종료된후 PH 9의 데옥시코레이트-붕산완충액 붕산나트륨 0.01M, 데옥시 코레이트·나트륨염 0.5%(W/V) 1ℓ을 사용하고, 에어로딜에서 HBsAg를 용리(溶離)하였다.

용출반응은, 마그네틱·스타아러로서, 37℃ 2시간 교반하여 행하였다. 1,600g 10분간의 원심분리(베크맥 TJ 6)에 의하여, 에어로딜을 제거하였다. HBsAg는 원심 위맑은 부분에 함유되어 있다.

(4) PEG 6,000에 의한 분획 및 농축

원심 위맑은 부분의 PH를 N·HCl로서 7.2로 조정하였다. PH가 7 이하에서는 데옥시코레이트가 불용화 석출된다. PEG 6,000을 5.5%(W/V)의 농도가 되도록 첨가하였다. 마그네틱·스타아러로서 10분가 교반, 용해시킨후 4℃로서 5∼6시간 정치하였다. 생긴 침전은 1,600g, 30분간의 원심분리기로서 제거하였다.

HBsAg를 함유한 위맑은 부분은 이에 PEG 6,000 12.5%을 추가하고, 마지막 농도가 18%(W/V)로 되도록 하였다.

10분간 마그네틱·스타아러로서 교반, 용해한후 4℃로서 하루밤 정치하시켰다. 그런 다음 25,000g, 15분간 원심분리하였다(베크맥 J 21). HBsAg는 펠렛에 함유된다.

(5) PEG 6,000 펠렛의 용해

0.017M, 인산나트륨완충액(PH 6.8) 50ml을 펠렛에 가하고 마그네틱·스타아러로서 4시간 교반하여 균질화 하였다. 그렇게 한 다음, 1,600g, 30분간 원심분리하였다. HBsAg 위 맑은 부분(50ml)에 함유된다.

(6) 겔여과 크로마토 그래피

세파덱스 4β 컬럼(K50/100, 직경 50mm, 길이 1m)로서 겔여과를 행하였다(파마마시어·파인·케미컬·업사라·스웨덴). 크로마토 그래피용 겔은, 정상적인 사람의 혈청(50ml)을 컬럼에 통과시켜, 옐비코오트한 것을 사용하였다.

컬럼의 평형화는, PBs 완충액

를 사용하여 행하였다.

용출유속 : 120ml/h.

HBsAg 양성획분은 CEP로서 검지한후, 푸울하고 아미콘·셀(XM 100 멤브랜·다이어프로)로서 최종액량 50ml가 되도록 농축하였다.

(7) 염화세슘·직선농도구배·죠널초원심분리

염화세슘·직선농도구배(밀도 : 1.10∼1.40)·죠널초원심분리는, 죠널 : 로우터(형 Ti 14 베크맨 L5.65)를 사용하여 43, 000rpm 20시간 행하였다. HBsAg 양성획분(1.18∼1.22)를 푸울하고, 9% 염화나트륨에 대해 투석하였다.

(8) 불활설황 처리

이상과 같이 하여 정제한 항원은, CEP 역가가 1 : 20으로 되도록 조정하였다. 서브타입“ad”와“ay”는, 각각 역가와 액량이 동등하게 되도록 푸울하고 나서, 포르말린(30%) 처리하였다.

이 포르말린 처리는 1/2500의 농도(0.04%)로서 37℃로 48시간 두고, 이어서 4℃로 8일간 방치하였다.

포르말린 처리가 끝나면, 최종항원역가가 CEP로서 1 : 4로 되도록 조정하였다. 최후에 0.22β의 밀리포어·필터를 사용하여 제균여과를 행하였다.

(9) 보조약제(아듀밴트)의 첨가.

멸균한 수산화 알루미늄 현탁액을 마지막 농도가 0.1%로 되도록 첨가하였다.

[실험예]

a) 침팬지이를 이용한 안전성 시험. 대규모제조로서 만든 왁찐을 다석마리의 침팬지에 사용하여 안전성을 조사했든바, HBV에 감염되었다는 생화학적 내지는 혈청학적인 증거는 인정되지 않았다. 그리고 또, 바이오프시(간의 생성검사)로서 조직학적으로 조사하여도 긴질환은 보이지 않았다. 농축 HBsAg 왁찐(CEP 역가 1 : 8) 5.0ml을 1개월 간격으로서 2회, 침팬지이에 정맥 주사하였다. 그런 다음 3∼4개월 후에, 동일 왁찐 제제 1.0ml을 이번에는 근육주사하였다. 처음의 투여로부터 6개월간, 침팬지이 다섯마리 중 어느 것도 실험실적 내지 조직학적으로 보아서 간장해는 보이지 않았다. HBsAg도 항 HBC도 함께 검출되지 않았다. 자기 면역 응답의 가능성도 생각되므로, 왁찐을 투여한 침팬지이에 대해, 항글로불린 항체를 위시하여 결핵, 항미토콘드리아, 항평활균항체의 유무를, 라텍스테스트로서 조사하였다. 그 결과, 어느 침팬지이에도 자기 항체를 볼 수 없었다.

b) 침팬지이 다섯마리를 이용하여 안전성 시험 및 효력시험을 행한 다음, 본 왁찐제제를 353명의 사람에게 투여하였다. 왁찐으로서의 유효성은, HBsAg에 대한 체액성 면역응답(항 HBs 항체)의 출현과, 왁찐투여 피검자, 왁진 미투여 피검자의 역학적 (疫學的) 연구에 의해서 평가하였다. 면역후 2년간에 성적을 통해서, 본 왁찐제제가 H B 감염의 위험성이 높은 환경하에서 예방효과를 발휘한다는 것이 증명되었다.

본 왁찐 제제를 투여한 피검자의 어느 누구도, 자기 면역질환을 나타낸 임상적 내지 생물학적인 증후를 나타내지 않았다.

Claims (1)

1. HBsAg(HBs 항원)을 함유한 사람의 혈청 또는 혈장에서 대부분의 혈장담백성분을 제거한 조제 HBsAg의 수성현탁액을 중성 부근으로 조정하고, 이에 폴리에틸렌글리콜을 5∼6% 가하고, B형 간염에 감염성이 있는 데엔입자와 면역복합체와를 침전으로 해서 제거하고, 다음에 위맑은 부분에 폴리에틸렌글리콜을 추가하여, HBsAg 입자를 침전으로 해서 모으고 이를 겔여과와 초원심분리법으로서 입자의 크기 22nm, 비중 1.19∼1.21g/㎤인 일정치의 HBsAg 입자를 회수하고, 다시 비루스 불활성화처리, 제제화공정을 거쳐서 B형 간염의 감염성이 없는 사람의 혈장성분을 함유치 않는 HBsAg 입자를 주성분으로 하는 B형 간염 감염 예방용 왁찐의 제조방법.