BG63699B1 - Метод за пречистване на повърхностен антиген на вируса на хепатит в, съдържащ пептида pres2 - Google Patents
Метод за пречистване на повърхностен антиген на вируса на хепатит в, съдържащ пептида pres2 Download PDFInfo
- Publication number
- BG63699B1 BG63699B1 BG100212A BG10021295A BG63699B1 BG 63699 B1 BG63699 B1 BG 63699B1 BG 100212 A BG100212 A BG 100212A BG 10021295 A BG10021295 A BG 10021295A BG 63699 B1 BG63699 B1 BG 63699B1
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- surface antigen
- buffer
- range
- cell
- concentration
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 164
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 164
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 164
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 70
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 50
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 58
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 49
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 45
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 43
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 36
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 31
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 28
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 26
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 20
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 15
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 14
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 13
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 11
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 7
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 5
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 229940116357 potassium thiocyanate Drugs 0.000 claims description 5
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 4
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 claims description 3
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 claims description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 3
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 3
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 2
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 3
- 230000003113 alkalizing effect Effects 0.000 claims 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims 1
- SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N hepatitis b vaccine Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N 0.000 claims 1
- 229940124736 hepatitis-B vaccine Drugs 0.000 claims 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 abstract 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 26
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 10
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 10
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 8
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 7
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 2
- 229910002019 Aerosil® 380 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- RLDQYSHDFVSAPL-UHFFFAOYSA-L calcium;dithiocyanate Chemical compound [Ca+2].[S-]C#N.[S-]C#N RLDQYSHDFVSAPL-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 150000003567 thiocyanates Chemical class 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 102100032965 Myomesin-2 Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000700124 Octodon degus Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000235061 Pichia sp. Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N ammonium thiocyanate Chemical compound [NH4+].[S-]C#N SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- -1 bile acid sodium salt Chemical class 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006477 desulfuration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000023556 desulfurization Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- HDFXRQJQZBPDLF-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].OC([O-])=O.OC([O-])=O HDFXRQJQZBPDLF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229910021424 microcrystalline silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000009965 odorless effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000009993 protective function Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 238000011110 re-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Методът намира приложение за пречистване на повърхностен антиген на вируса на хепатит в, включващ рrе s2 пептид, от клетките на рекомбинантен организъм. Клетките се разпадат с помощта на буфер, съдържащ хаотропична сол.
Description
Изобретението се отнася до метод за пречистване на хепатит В вирусен повърхностен антиген, включващ preS2 пептид, по-специално се отнася до процес за пречистване на хепатит В вирусен повърхностен антиген,включващ preS2 пептид от рекомбинирана клетъчна среда. Методът включва етап на клетъчно разпадане, при който се предотвратява загуба на preS2 пептид чрез използване на хаотропна сол, и последващи извличане, преципитиране, адсорбция на силициев двуокис и колонна хроматография.
Предшестващо състояние на техниката
Хепатит В е един от широко разпространените обществени здравни проблеми като средно около 200-300 милиона от населението на Земята са носители на вируса на хепатит В (HBV).
Инфекцията, причинена от вируса на хепатит В, често преминава в цироза и рак на хепатитната клетка, водещи до вероятна смърт на пациента.
Досега не е открито лекуващо хепатит В средство, поради което се набляга на значимостта на ваксините.
Bumberg et al. извличат Австралийски антиген от кръвта на заразени с хепатит В пациенти през 1955 година.
Krugman et al. съобщават през 1971 година за метод за активна имунизация, използващ топлинно обработен човешки серум, съдържащ вирус на хепатит В, като предлага възможност за създаване на ваксина. Оттогава първите поколения ваксини срещу хепатит В, получени чрез отделяне и филтриране на хепатит В вирусен повърхностен антиген от кръвна плазма на заразени с вируса пациенти, се разпространяват масово (M.R. Hilleman et al., Develop. Bio. Standard, 54, 3-12 (1983)).
Ваксините, получени от кръвна плазма, имат следните недостатъци: процесите им на филтриране и инактивация са трудни за реализация и изискват значителни разходи; доставките на човешка кръв са ограничени; ваксиниран човек може да бъде заразен с патогени от кръвен източник.
За разрешаване на изложените проблеми чрез изследвания в областта на генното инженерство се правят опити за откриване на ваксини срещу хепатит В. Например, Valenzuela et al. реализират процес за производство на хепатит В вирусен повърхностен антиген в клетъчна среда (Nature, 293, 347-350 (1982)).
Рекомбинантният хепатит В вирусен повърхностен антиген (r-HbsAg) се състои основно от S протеин (Р25) с 226 аминокиселини и при филтриране образува повърхностни антигенови частици, които са почти идентични с тези от хепатит В вирусния повърхностен антиген, получен от кръвна плазма.
Heermann et al. правят изявление, че хепатит В вирусният обвиващ протеин съдържа значителни количества от L-протеин (preSl+preS2+-S:P39) и М-протеин (preS2+S:P31), както и S-протеин (J.Virol., Nov., 396-402 (1984)).
Известно е, че preS2 пептидът изпълнява важна роля по отношение на атаката на вируса на хепатит В срещу черния дроб след заразяване на човешкото тяло. PreS2 пептидът, който се състои от 53 аминокиселини, е доказал действието си при формирането на антитела срещу повърхностния антиген при експерименти с животни. (D.R. Milich et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8168-8172 (1985)).
Известно е, че антителата, формирани срещу preS2 пептида, изпълняващ защитна функция срещу вирусна инфекция (Y, Ito et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 9174-9178 (1986)). Нещо повече, ваксина, съдържаща preS2 пептид, може да бъде полезна за човек, който не може да създава антитела срещу съществуващ вече повърхностен антиген. Създаването на такава ваксина е важно и за защитата от инфекция от новооткрити типове на вируса на хепатит В.
Тъй като preS2 пептидът е силно чувствителен към протеаза в клетъчната среда, приготвянето на хепатит В вирусен повърхностен антиген, съдържащ preS2 пептид, се сблъсква с различни трудности. За да бъдат преодолени тези трудности, Kobayashi et al. създават ваксина, която се приготвя чрез генетично видоизменяне на протеаза - чувствителния участък между preS2 и S пептидите (J.Bacteriology, 8,1-22 (1988)); US 4 742 158 разкрива процес за създаване на ваксина, съдържаща preS2 пептид, при която ваксина пептидът се предпазва от протеазна атака чрез прилагане на протеазен задържащ фактор в етапа на разрушаване на клетката.
Ефектът от генетичното видоизменяне по Kobayashi върху активността на preS2 пептида не е изцяло охарактеризиран, а последният споменат процес е практически неприложим, т.к. протеаза задържащите фактори са прекалено скъпи за масово използване в процеса на филтриране. Нещо повече, нивото на preS2 пептида не може да се поддържа извън определено количество независимо от количеството на добавените протеаза-задържащи фактори, когато времето за филтриране се удължи при нарастване по скалата на филтриране или при необходимост.
От ЕР 0 337 492 А1 е известен процес за пречистване на хепатит В вирусен повърхностен антиген от култура на Pichia sp. чрез използване на калиев тиоцианат. Калиевият тиоцианат се прилага за увеличаване количеството на мастноразтворимите протеини, а като цяло процесът има за цел пречистването на хепатит В вирусен повърхностен антиген, съдържащ само S пептид. Когато хепатит В вирусният повърхностен антиген съдържа и preS2 пептид, състоящ се от 55 аминокиселини, преди S пептида, състоящ се от 226 аминокиселини, то той има имунологични качества, подобни на тези на повърхностен антиген, съдържащ само S пептид, защото способностите за образуване на антитела и създаване на имунитет на S пептидната половина са еднакви.
Двата повърхностни антигена са неминуемо различни във физико-химичните си свойства. preS2 пептидът е достатъчно хидрофилен, за да бъде изложен на повърхността на антигенна частица, и съответно оказва значително влияние върху процедурата на филтриране.
Разработени са различни процеси за филтриране на хепатит В вирусен повърхностен антиген, включващи preS2 пептид.
От ЕР 0 130 178 А1 е известен процес за филтриране на хепатит В вирусен повърхностен антиген, включващ preS2 пептид, който процес се характеризира с отделяне на повърхностния антиген, използват две течни фази, приготвени чрез прибавяне на определени количества декстрин и гликол към клетъчния екстракт. Този процес има следните недостатъци: отделеният повърхностен антиген не е достатъчно пречистен; не е подходящ за широкомащабни проце си на филтриране, т.к. декстранът и полиетиленгликолът са скъпи; процесът е неикономичен благодарение на факта, че за отстраняване на използваните вещества е необходима допълнителна процедура.
От US 4 742 158 е известен процес за филтриране на хепатит В вирусен повърхностен антиген. Процесът се състои от: приготвяне на клетъчен екстракт в присъствието на различни протеаза - забавящи фактори и филтриране на повърхностния антиген чрез серия от стъпки за колонно хроматографично отделяне, използващи сходна по свойства колона, приготвена чрез добавяне на човешки серум албуминов полимер към гел-образната матрица (междуклетъчно вещество), както и хидрофобна колона с активно вещество. Недостатъци на този процес са: използваните задържащи фактори са много скъпи; афинитетната колона не е подходяща за филтриране на големи количества; необходима е специална процедура за отстраняване на вещества, използвани в хидрофобната колонна хроматография.
В Kobayashi et al. също така е представен процес за пречистване на хепатит В вирусен повърхностен антиген, включващ preS2 пептид (J.of Biotechnology, 8, 1-22 (1988)). Този процес не е подходящ за филтриране на големи количества, т.к. се използва имуноафинитетна колона, което дава като резултат малко количество.
В KR 065305 е описан процес за филтриране на хепатит В вирусен повърхностен антиген, който включва pH преципитация и смяна на силициев двуокис и анионни колонни хроматографии. При този процес е трудно поддържането на съдържанието на preS2 пептида на подходящо ниво, т.е. preS2 пептидът се извлича от протеази по време на началния етап на процеса.
Все още съществува необходимост от ефективен процес за пречистване на хепатит В вирусен повърхностен антиген, съдържащ preS2 пептид.
Методът съгласно изобретението се състои в пречистване на хепатит В вирусен повърхностен антиген, включващ preS2 пептид от клетъчна закваска в достатъчно чисто състояние, за да бъде директно приложим във ваксина.
В съответствие с изобретението е представен процес за пречистване на хепатит В вирусен повърхностен антиген, включващ preS2 пептид, изразен в рекомбиниран организъм, характеризиращ се с това, че клетките на последния се разрушават чрез използване на буфер, съдържащ хаотропна сол.
Описание на приложените фигури
С примерно изпълнение на приложената фигура е показан резултата от 15% натриев додецил сулфат поликриламиден гел електрофорезис (SDS-PAGE), който променя съдържанието на preS2 пептида в хепатит В вирусния повърхностен антиген, когато повърхностния антиген, включващ preS2 пептид, се пречиства в присъствието на калиев тиоцианат в ролята на хаотропна сол.
Подробно описание на изобретението
Настоящото изобретение представлява процес за пречистване на хепатит В вирусен повърхностен антиген, включващ preS2 пептид, изразен в рекомбиниран организъм, който се характеризира с това, че клетките на организма се разрушават чрез използване на буфер, съдържащ хаотропна сол, за минимизиране на загубите на preS2 пептид. Използването на буфер, съдържащ хаотропна сол за разпадане на клетките, стимулира образуването на хепатит В вирусни повърхностни частици антиген и защитава preS2 пептида от протеазна атака, която в общия случай се наблюдава по време на началния стадий на филтрирането, и по този начин поддържа съдържанието на preS2 пептида на постоянно ниво до приключване на процеса на пречистване.
Изобретението може да бъде приложено към процес за филтриране на хепатит В вирусен повърхностен антиген, който се получава в който и да е подходящ рекомбиниран организъм, за предпочитане рекомбинирана клетъчна закваска Saccharomyces cerevisiae.
Подходящи хаотропни соли, които могат да бъдат използвани са натриев тиоцианат, калиев тиоцианат, амониев тиоцианат, гуанидиев хидрохлорид и CO(NH); за предпочитане е натриевият тиоцианат.
Всяка общоприета буферна система, например фосфатен буфер и Tris буфер, може да бъде използвана за разпадане на клетката в процеса, обект на изобретението; за предпочитане е pH да бъде в обхвата от 6 до 8. Концентрацията на хаотропна сол в буфера може да варира в диапазона от 1 до 8 М, за предпочитане от 1 до 3 М.
Когато рекомбинираната клетка се разпада чрез буфер с хаотропна сол, останалата част от процеса на пречистване може да се изпълни, като се използва всяко съчетание от общоприетите стъпки за пречистване, независимо че за предпочитане са:
а) прибавяне на вещества към клетъчната хомогенност на рекомбинираната клетка за извличане на повърхностен антиген от клетъчната мембрана;
б) увеличаване на разтворимостта и стимулиране образуването на частици на повърхностния антиген в екстракта, получен при етап (а) чрез придаване електролитни свойства на екстракта;
в) преципитация и отстраняване на клетъчните остатъци, липиди и замърсени протеини от екстракта, обработен през етап (б) чрез окисляване и центрофугиране за получаване на разтвор, съдържащ повърхностния антиген;
г) свиване на получения през етап (в) разтвор със силициев двуокис с цел адсорбиране на повърхностния антиген от силиция, отмиване на замърсените протеини и десорбиране на повърхностния антиген от силициевия двуокис чрез буфер;
д) подлагане на получения през етап (г) пречистен повърхностен антиген на хидрофобна колонна хроматография за получаване на фракции, съдържащи повърхностния антиген, и
е) пречистване на получените през етап (д) фракции чрез гел-филтрираща хроматография за получаване на повърхностен антиген в чист вид.
Подходящи вещества, които могат да се използват през етап (а) за извличане на повърхностния антиген от клетъчната мембрана, включват: Tween 20, Tween 80, Triton Х-100 и натриева сол на жлъчната киселина, като за предпочитане е Tween 20. Веществото може да се използва в диапазона от 0,1 до 0,5% (тегло/обем), за предпочитане от 0,1 до 0,2% (тегло/обем), въз основа на количеството на хомогенните клетки.
За увеличаване на разтворимостта на повърхностния антиген в клетъчната хомогенност и подпомагане образуването на частиците му се препоръчва увеличаване на pH на повърх ностния антигенов екстракт в обхват οτΙ 1,0 до
13.5 чрез използване на основа, за предпочитане натриев хидроокис и калиев хидроокис. Този процес на придаване на електролитни свойства се счита, че подпомага образуването на частиците на хепатит В вирусния повърхностен антиген чрез увеличаване на междумолекулната дисулфидна връзка и отделяне на замърсените протеини от повърхностния антиген чрез увеличената разтворимост. След това е препоръчително екстрактът да се остави при стайна температура в интервала от 0 до 30°С за време от 0,5 до 1 h. Тогава екстрактът се окислява, за да преципитират клетъчните отпадъци, липиди и замърсени протеини, при което pH на екстракта се намалява до обхват от
4.5 до 6,0. Киселините, които могат да бъдат използвани в този етап, включват всяка една от неорганичните или органични киселини, като за предпочитане е от 10 до 30% разтвор на оцетната киселина. Киселинната реакция може да бъде изпълнена при температурен интервал от 0 до 30°С за време от 0,5 до 2 h, като за предпочитане е да се разбърква разтворът.
Окисленият екстракт се центрофугира за отстраняване на явилите се като резултат от преципитацията вещества и за получаване на повърхността на екстракта на течност, съдържаща повърхностния антиген. Преимущество на тази процедура е фактът, че в един етап на обикновено центруфигиране се отстраняват клетъчните отпадъци, липиди и замърсени протеини и съдържанието на повърхностен антиген е високо благодарение на първоначалния етап на разтваряне на повърхностния антиген в областта на наситено състояние на pH.
Увеличаването и след намаляването на pH на клетъчния екстракт стабилизира свойството за образуване на частици на повърхностния антиген и е ефикасно при отстраняването на липидите и замърсените протеини.
Когато се използва тиоцианат като хаотропна сол в етапа на клетъчно разпадане, в етапа на окисляване може да се отдели неприятна миризма. Самата тиоцианатова сол е безцветно, без мирис и безвредно съединение, а тиоцианатовият йон е напълно стабилен в разтвор. Нещо повече, миризмата, получена по време на окислителния процес, се счита, че произхожда от реакциите на тиоцианата с някои вещества в клетъчния екстракт. Тази миризма може да бъде поносима за оператора в случаите на малко по обем пречистване, но при по-големи количества е препоръчително да се отстрани тиоцианатът преди етапа на окисляване.
Например, тиоцианатът може да бъде отстранен чрез прибавяне на подходяща сол към клетъчния екстракт с цел приципитиране на тиоцианатната сол заедно с някои от замърсените протеини веднага след получаването им, т.е. етап (а), отстраняване на преципитиралите вещества, т.е. центрофугиране, и филтриране на получената течност. Повърхностният антиген не се втвърдява по време на тази процедура. Отстраняването на тиоцианата се осъществява успоредно с отстраняването на част от замърсените протеини, което улеснява последващите процеси на пречистване.
Предпочитаните соли, които могат да се използват в процедурата на обезмирисяване на тиоцианата, включват соли на заредени аниони, например натриев сулфат и амониев сулфат, в концентрация от 8 до 15% (тегло/обем). След извличане на повърхностния антиген от клетъчната мембрана се прибавя солта като реакцията може да протече при стайна температура за 0,5 до 2 h със или без разбъркване. Получените преципитирали вещества се отстраняват по някой от общоприетите методи, например центрофугиране, за получаване на течност, съдържаща повърхностния антиген.
Получената течност се подлага на повторно филтриране за отстраняване на тиоцианата и сулфата. Използваният през този етап буфер е препоръчително да има pH в интервала от 6 до 8. При завършване на процедурите по обработка със сол, центрофугиране и филтриране получената течност се подлага на процесите, описани в етапи (б) и (в).
Течността, получена през етап (в), в която се съдържа повърхностният антиген, се обработва със силиций, използва се колонен или сериен метод като последният е за предпочитане.
Подходящ вид силиций за приложение през този етап е микрокристалният силиций с площ от 100 до 500 m2/g като за предпочитане е Aerosil 380 (Дегуса, Германия). Течността, съдържаща повърхностния антиген, осъществява контакт със силиция при pH в интервала от б до 8 и температурен интервал от 4 до ЗО°С за време от 2 до 16 h при усърдно разбъркване. Количеството на сухия силициев двуокис за адсорбцията на повърхностния ан тиген е препоръчително да бъде около 5% (тегло/тегло) въз основа на теглото на клетъчната маса.
Повърхностният антиген - силициев комплекс, се отделя от разтвора по един от об- 5 щоприетите методи, например центрофугиране. След това комплексът се измива три пъти с буфер с pH в интервала от 6 до 8, аа предпочитане - натриев фосфатен, натриев хлориден буфер, за отстраняване на утаените замърсени 10 протеини от силиция.
Повърхностният антиген може да бъде отделен от силициевия двуокис чрез свързване на комплекса с подходящ буфер за около 2 h. Буфер с pH в интервала от 8,8 до 11,0, за 15 предпочитане - натриев карбонатен-натриев бикарбонатен буфер, е подходящ за използване през тази стъпка. Буферът може да съдържа урея с концентрация от 1 до 8 М и активно вещество - за предпочитане натриева сол на 20 жлъчната киселина, с концентрация от 0,1 до 0,3 wt%. Тогава силицият се отстранява от разтвора по някой от общоприетите методи, например центрофугиране, за получаване на течност, съдържаща повърхностния антиген. 25 Когато натриевата сол на жлъчната киселина се използва по време на десорбцията, се налага отстраняването му чрез повторно филтриране.
Получената по посочения начин течност, 30 съдържаща повърхностния антиген, може впоследствие да се пречисти с хидрофобно колонна хроматография, в която хидрофобният клей е препоръчително да бъде агаров гел с пенилова утайка. 35
Преди контакта между течността и хидрофобния клей, последният се еквалибрира с буфер с pH в диапазона от 8,8 до 11,0, който може да бъде същият буфер, използван в предишната стъпка. Препоръчително е буферът 40 да съдържа урея с концентрация от 1 до 4 М за отстраняване на максимална степен на замърсените протеини, които са по-малко хидрофобни в сравнение с повърхностния антиген. Тогава течността, съдържаща повърхностния 45 антиген, се прекарва през колоната, за да влезе в контакт със запълващия материал. Колоната се измива основно с еквалибрирания буфер, съдържащ 10-40 wt% етилен гликол.
Хидрофобната колонна хроматография 50 представлява ефикасен процес на пречистване, в който повечето от оставащите замърсени вещества в течността след силициевата адсорбция могат да бъдат отстранени. В частност повишаващите температурата материали, трудно отстраними по някой от общоприетите методи, могат да бъдат отстранени през тази стъпка. Уреята и етилен гликолът, които остават във фракциите, съдържащи повърхностния антиген, могат да бъдат отстранени, например чрез диализа или повторно филтриране, при които за предпочитане се използва буфер с pH в интервала от 6 до 8.
Фракциите, съдържащи повърхностния антиген, получен от хидрофобната колонна хроматография, впоследствие се пречистват чрез клей изключваща гел филтрираща хроматография до степен, в която пречистеният антиген може да бъде използван при приготвянето на ваксина.
Най-удачните полярни матрици, които могат да бъдат използвани като колонен запълващ материал включват агаров тел, декстринов гел и полиакриламиден гел с молекулно тегло с най-малка прагова стойност 1 000 000, за предпочитане - от 5 000 до 500 000. Клей изключващата гел филтрираща хроматография се осъществява чрез преминаване на фракциите, съдържащи повърхностния антиген, през колона, еквалибрирана с Tris или фосфатен буфер с pH в интервала от 6 до 8, която съдържа натриев хлорид с концентрация от 0,1 до 0,2 М и промиване на повърхностния антиген със същия буфер.
Фракциите, съдържащи повърхностния антиген, са комбинирани и чистотата на повърхностния антиген и съдържащия се в него preS2 пептид са определени със SDS-PAGE.
Проверен в различни експерименти в следващите примери, повърхностният антиген, пречистен съгласно процеса, обект на настоящото изобретение, е така пречистен и съдържанието на preS2 пептида в него е достатъчно наситено, че пречистеният антиген може директно да се използва при приготвяне на ваксина.
Следващите примери допълнително илюстрират настоящото изобретение без да ограничават обхвата му. Процентите, представени в тях за твърдо вещество в твърда смес, течност в течност и твърдо вещество в течност, са на основата на тегло/тегло, обем/обем и тегло/ обем съответно, ако не е указано друго.
Пример 1.
(Етап 1) Разпадане на клетката
Рекомбинираният Saccharomyces cerevisiae VCTC 0098BP, който е в състояние да изяви хепатит В повърхностен антиген, включващ preS2 пептид, е култивиран при 27°С в 30 1 от YEPD среда (1 % екстракт, 2% пептон, 1,6% глюкоза). 70 g от клетъчното вещество, получено по този начин, са смесени с 140 ml буфер 1 (50 шМ Tris, pH 7,2, 1 М натриев тиоцианат, 0,15 И натриев хлорид, 10 тМ етилен диамин, тетра оцетна киселина (EDTA) и 1 тМ фенил метил сулфонил флуорид (PMSF), а сместа е в контейнер с уред за разбиване (Биоспек Продъктс, Окла, САЩ), съдържащ 210 ml стъклени зърна с диаметър 0,5 mm.
Контейнерът е потопен в ледена вода и уредът за разбиване се задейства три пъти на 15-минутни интервали, всеки от които е с времетраене 5 min. Получената клетъчна хомогенност е отделена от стъклените зърна, последните са измити с 210 ml от буфер 1 и полученият разтвор се смесва с клетъчната хомогенност.
(Етап 2) Извличане и разпадане на повърхностния антиген
Към клетъчната хомогенност, получена през етап 1, са прибавени 0,1% (тегло/обем) от Tween 20 и сместа се разбърква при стайна температура за 2 h.
Разтворът е приспособен към pH 11,5 чрез прибавяне на 5 N натриев хидроокис и е разбъркван за 1 h при стайна температура. Полученият разтвор е приспособен към pH 5,2 чрез добавяне на 20% оцетна киселина, разбъркван е при стайна температура за 30 min, след което е оставен да престои в продължение на 30 min. Разтворът е центрофугиран при 8°С за отстраняване на клетъчните остатъци заедно с преципитиралите вещества.
Течността, съдържаща повърхностния антиген, е приспособена към pH 7,2 чрез прибавяне на 5 N натриев хидроокис. В този момент количеството на течността е 300 ml.
(Етап 3) Адсорбция и десорбция чрез използване на силициев двуокис
Сухият силициев двуокис е смесен с вода за получаване на 5% разтвор (сухо тегло/ обем разтвор), 70 ml от който е добавен към течността, получена през стъпка 2, като сместа се разбърква за 2 h при стайна температура. Полученият разтвор се центрофугира при 5500 ob./min за 10 min за отстраняване на течността, а преципитиралият силициев двуокис, адсорбирал повърхностния антиген, се промива два пъти с фосфатен буфер (pH 7,2), съдържащ 0,15 М натриев хлорид.
Промитият силициев двуокис се прибавя към 70 ml от 50 тМ карбонатен буфер (pH 9,5), съдържащ 1 М урея, като сместа се разбърква при стайна температура за 1 h до отделяне на повърхностния антиген от силициевия двуокис. В този момент буферът показва pH 9,2. Разтворът се центрофугира (Бекман Ja 14 ротор) при 12000 ob./min за 30 min с цел получаване на течност, съдържаща повърхностния антиген.
Количеството хепатит В вирусен повърхностен антиген в течността е около 6,5 mg при измерване с Auzyme апаратура (Абот, САЩ).
Пример за сравнение.
Процедурите, посочени в пример 1, се повтарят с изключение на това, че натриевият тиоцианат не е включен в буфер 1 за получаване на пречистен разтвор на повърхностен антиген. Като резултат количеството на хепатит В вирусен повърхностен антиген в течността е около 7,1 mg при измерване с Auzyme апаратура.
Разтворите на повърхностния антиген, получени в примера и примера за сравнение, са подложени на действието на 15% натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел електрофореза (SDS-PAGE), последвана от сребристо оцветяване. Резултатът е посочен на фиг. 1, където линии 1 и 2 представляват разтвори на повърхностния антиген, получени в пример 1 и примера за сравнение съответно. Тук А изразява цяла протеинова връзка; В и С изобразяват протеиновите фрагменти, получени от протеазната атака.
Както е показано на фиг. 1, повърхностният антиген, включващ високо съдържание на preS2 пептид, може да бъде пречистен от клетъчна среда в съответствие с процеса, обект на настоящото изобретение.
Пример 2.
(Етап 1) Разпадане на клетъчната среда Рекомбиниран Saccharomyces cerevisiae КСТС 0098ВР, който е в състояние да изрази хепатит В повърхностен антиген, включващ preS2 пептид, се култивира при 27°С в 300 1 YEPD среда. 3 kg клетъчно вещество, получено по този начин, се смесва с 61 буфер 1 и получената смес преминава два пъти през Диномил (Гленмилс, Япония), съдържащ 3 1 стъклени зърна с диаметър 0,5 mm, при 10°С и скорост на потока 650 ml/min за разрушаване на кле тьчната среда.
Получената клетъчна хомогенност се отделя от стъклените зърна. Те се измиват с 9 1 от буфер 1. Отмитият разтвор се смесва с клетъчната хомогенност. Количеството хепатит В вирусен повърхностен антиген в течността е около 754 mg при измерване с Auzyme апаратура.
(Етап 2) Извличане и разпадане на повърхностния антиген
Към клетъчната хомогенност, получена през стъпка 1, се прибавя 0,1% (тегло/обем) от Tween 20 като сместа се разбърква за 2 h при стайна температура.
Разтворът се приспособява към pH 11,5 чрез прибавяне на 5 N натриев хидроокис и се разбърква за 1 h при стайна температура. Полученият разтвор се приспособява към pH 5,2 чрез добавяне на 20% оцетна киселина; разбърква се за 30 min при стайна температура, след което се оставя да престои за 30 min.
Разтворът се центрофугира при 8°С за отстраняване на клетъчните остатъци заедно с преципитиралите вещества.
Течността, съдържаща повърхностния антиген, се приспособява към pH 7,2 чрез добавяне на 5 N натриев хидроокис. Като резултат обемът на течността е около 12 1, а количеството на хепатит В вирусен повърхностен антиген в нея е около 1,250 mg, измерени с Auzyme апаратура.
Количеството повърхностен антиген е 165,8% на основата на количеството повърхностен антиген, определено през стъпка 1. Този неочаквано висок резултат се дължи главно на общите действия на течността и електролита, които увеличават антигенността и улесняват разтворимостта на повърхностния антиген.
(Етап 3) Адсорбция и десорбция при наличието на силициев двуокис
Течността, получена след етап 2, се размива двукратно с 0,15 М натриев хлорид и след това се адсорбира от силициевия двуокис в съответствие със следната процедура: сухият силициев двуокис се смесва с вода за получаване на 10% полутечен разтвор (сухо тегло/обем на разтвора), 1,51 от който се прибавя към течността, получена при стъпка 2, сместа се разбърква за една нощ при температура 4°С.
Полученият разтвор се центрофугира при 5500 ob./min в продължение на 10 min за отстраняване на течността като преципитиралият силициев двуокис, адсорбирал повърхностния антиген, се промива два пъти с фосфатен буфер (pH 7,2), свдьржащ 0,15 М натриев хлорид.
Промитият силициев двуокис се прибавя към 3 1 от 50 тМ карбонатен буфер (pH 9,5), съдържащ 1 М урея, като сместа се разбърква за 2 h при стайна температура с цел десорбиране на повърхностния антиген от силициевия двуокис. В този момент буферът показва pH 9,2. Разтворът се центрофугира при 8700 ob./min за време 30 min с цел· получаване на течността, съдържаща повърхностния антиген.
Количеството хепатит В вирусен повърхностен антиген е около 895 mg, измерени с Auzyme апаратура (съдържание: 118,7%).
(Етап 4) Хидрофобна колонна хроматография
Към течността, получена през етап 3 и съдържаща повърхностния антиген, се прибавя урея за получаване на крайна концентрация 4 М. Полученият разтвор се прекарва през пенил агарова колона, еквалибрирана с 50 шМ карбонатен буфер (pH 9,2), съдържащ 4 М урея. Колоната се измива със същия буфер, съдържащ 20% етилен гликол; след това същият буфер, съдържащ 60% етилен гликол, се прибавя към колоната с цел получаване на повърхностния антиген.
Фракциите, съдържащи повърхностния антиген, се комбинират и филтрират с Амикон диафилтрираща система (Амикон, САЩ) с молекулярна прагова стойност 100 000 за отстраняване на уреята и етилен гликола; полученият филтрат се концентрира чрез същата система.
Количеството на хепатит В вирусния повърхностен антиген във филтрата е около 546 mg, измерени с Auzyme апаратура (съдържание: 72,4%).
(Етап 5) Гел филтрираща хроматография
1 от Сефароза CL-4B (Фармация, САЩ) се пълнят в колона и се еквалибрират с фосфатен буфер (pH 7,2), съдържащ 0,15 М натриев хлорид. Концентратът, съдържащ повърхностния антиген, получен през стъпка 4, се прекарва през колоната и се промива със същия буфер за получаване на фракции, съдържащи повърхностния антиген.
Количеството хепатит В вирусен повърхностен антиген (вкл. и фрагментите, дължащи се на протеазната атака) в обединените фракции е около 540 mg, измерени с Auzyme апаратура (съдържание: 71,6%); чистотата на повърхностния антиген е измерена около 75% чрез SDS-PAGE. Пречистеният разтвор, съдържащ повърхностния антиген, получен по този начин, се филтрира през 0,2 μ филтър (Корнинг, САЩ) и филтратът се съхранява при температура 4°С.
Пример 3.
Разпадане на клетъчната проба
Рекомбинираната Saccharomyces cerevisiae КСТС 0098ВР е култивирана при 27°С в 300 1 YEPD среда, 4 kg клетъчна проба, получена по този начин, се размесва с 8 1 от буфер 1 и сместа се прекарва два пъти през диномил (Гленмил, Япония), съдържащ 31 стъклени зърна с диаметър 0,5 mm при 10вС и скорост на потока 650 ml/min за разпадане на клетъчната проба.
Получената клетъчна хомогенност се отделя от стъклените зърна, последните се измиват с 12 1 от буфер 1, като полученият разтвор се смесва с клетъчната хомогенност.
(Етап 2) Извличане и разтваряне на повърхностния антиген
Към клетъчната хомогенност, получена през стъпка 1, се добавя 0,1% (тегло/обем) Tween 20 като сместа се разбърква при стайна температура в продължение на 2 h.
Към разтвора се прибавя наситен разтвор на амониев сулфат до достигане на концентрация 10% като сместа се разбърква при стайна температура в продължение на 1 h. Полученият разтвор се центрофугира при температура 8°С с цел отстраняване на клетъчните остатъци заедно с преципитиралите вещества.
Получените на повърхността на разтвора вещества се филтрират със система за диафилтриране Амикон (Амикон, САЩ) с прагова молекулярна стойност от 100 000 като се използва 20 mM Tris буфер (pH 7,5) за отстраняване на тиоцианата и натриевия сулфат в тях, след което, като се използва същата система, се достига до крайна стойност на концентрацията от 6 1.
Концентратът се приспособява към pH
11,5 чрез прибавяне на 5 N натриев хидроокис и се разбърква при стайна температура в продължение на 1 h. Полученият разтвор се приспособява към pH 5,2 чрез прибавяне постепенно на 20% оцетна киселина и се разбърква в продължение на 30 min при стайна температура, след което се оставя да престои 30 min. Разтворът се центрофугира при 8°С за отстра няване на клетъчните остатъци заедно с преципитиралите вещества.
Получените на повърхността на разтвора вещества се приспособяват към pH 7,2 с добавяне на 5 N натриев хидроокис, при което се установява, че количеството на хепатит В вирусен повърхностен антиген е около 1,400 mg при измерване с Auzyme апаратура.
(Етап 3) Адсорбция и десорбция при използване на силициев двуокис
Веществата по повърхността на разтвора, получени през стъпка 2, се адсорбират от силициев двуокис (Аерозил 380) в съответствие със следната процедура: сухият силициев двуокис се смесва с вода до получаване на 10% полутечен разтвор (сухо тегло/обем), 2 1 от който се добавят към получените вещества през стъпка 2 като новополучената смес се разбърква при 4°С за една нощ.
Полученият разтвор се центрофугира при 5500 ob./min в продължение на 10 min за отстраняване на получените на повърхността му вещества, а преципитиралият силициев двуокис, адсорбирал повърхностния антиген, се измива два пъти с фосфатен буфер (pH 7,2), съдържащ 0,15 М натриев хлорид.
Измитият силициев двуокис се прибавя към 4 1 от 50 тМ карбонатен буфер (pH 9,5), съдържащ 1 М урея като сместа се разбърква при стайна температура в продължение на 2 h с цел десорбция на повърхностния антиген от силициевия двуокис. В този момент буферът показва pH 9,2. Разтворът се центрофугира при 8700 ob./min за получаване на веществата по повърхността му, съдържащи повърхностния антиген.
Количеството на хепатит В вирусен повърхностен антиген в получените на повърхността на разтвора вещества е около 840 mg при измерване с апаратура Auzyme.
(Етап 4) Хидрофобна колонна хроматография
Към веществата, получени през етап 3, съдържащи повърхностния антиген, се добавя урея до получаване на крайна концентрация 4 М. Полученият разтвор се прекарва през пенил агарова колона, която е еквалибрирана с 50 шМ карбонатен буфер, съдържащ 4 М урея. Колоната се измива със същия буфер, съдържащ 20% етилен гликол. След това същият буфер, съдържащ 60% етилен гликол, се прибавя към колоната за отделяне на повърхностния антиген.
Отделените фракции, съдържащи повърхностния антиген, се рекомбинират и филтрират с помощта на диафилтрираща система Амикон (Амикон, САЩ) с прагова молекулярна стойност 100 000 за отстраняване на уреята и етилен гликола. Полученият филтрат се концентрира с помощта на същата система.
Количеството на хепатит В вирусния повърхностен антиген е около 527 mg при измерване с апаратура Auzyme.
(Етап 5) Филтрираща хроматография
1 Sepharose CL-4B (Фармация, САЩ) се пълнят в колона и се еквалибрират с фосфатен буфер (pH 7,2), съдържащ 0,15 М натриев хлорид. Концентратът, съдържащ повърхностния антиген, получен през стъпка 4, се прекарва през колоната като се използва същият буфер за получаване на фракциите, съдържащи повърхностния антиген.
Количеството на хепатит В вирусен повърхностен антиген в комбинираните фракции е около 480 mg при измерване с апаратура Auzyne, чистотата на повърхностния антиген е около 98,9%. Съдържанието на preS2 пептид в цялото количество повърхностен антиген е измерено около 75% чрез SDS-PAGE. Пречистеният разтвор с повърхностен антиген, получен по този начин, се филтрира през 0,2 μ филтър (Корнинг, САЩ) като филтратът се съхранява при температура 4°С.
Пример 4.
Имунологичните свойства на S и preS2 пептидите в повърхностния антиген, получен в примери 2 и 3 (разглеждани от тук нататък като “повърхностен антиген 2” и “повърхностен антиген 3”) са потвърдени в съответствие със следните опити с морски свинчета.
ml (200 pg/ml) от повърхностен антиген 2 или 3 се смесва с 18 ml фосфатен буфер (pH 7,2), съдържащ 0,15 М натриев хлорид, като се филтрира през 0,2 μ шприц филтър (Суперфос Биосектор, Дания). Процедурата е изпълнена в стерилна среда.
Всяко от морските свинчета, тежащи около 350 g всяко, е инжектирано подкожно с 1 ml повърхностен антиген 2 или 3 двукратно през интервал от 15 дни. След 30 дни от първото инжектиране са взети кръвни проби от всяко от морските свинчета, от които проби е извлечен серум. Когато серумът е анализиран с Ausab апаратура (Абот, САЩ), степента на образуване на антитела срещу S пептидите на повърхностен антиген 2 или 3 са 100%, GMT на повърхностни антигени 2 и 3 са 33,38 и 29,77 mIU/ml съответно.
Степента на формиране на антитела срещу preS2 пептида е определена в съответствие със следната процедура: 50 μΐ (1 mg/ml) presS2 пептид с N-крайни 26 аминокиселини, синтезирани с пептиден синтезатор (Приложни Биосистеми, САЩ), прилагащ автоматизирана твърдо-фазна пептидна синтеза, и 20 μΐ (10 mg/ml) поли L-лизин се прибавят към 200 μΐ от 50 mM оцетен буфер (pH 4,5). Към сместа се прибавят 10 μΐ от 1 % EDC (1-етил-3-(3-диметил-аминопропил)кародиимид) и получената смес влиза в реакция при температура 37°С за 1 h. Получената смес се размива с 20 ml от 10 mM карбонатен буфер (pH 9,6) и се прибавя към проба от 96-пробна ELISA пластина в количество 200 μΙ/проба. Пробата престоява в инкубационен период от 20 h при стайна температура с цел адсорбиране на пептида в повърхността на посявката, след което се измива три пъти с дестилирана вода.
PBS, съдържащ 0,5% казеин, се прибавя към посевките в количество 250 μΐ/посявка. Пробата престоява в инкубационен период при стайна температура за повече от 2 h, така че да се избегнат каквито и да е неспецифични реакции впоследствие. Към всяка от посевките се извършват проверки за положителен и отрицателен резултат и се прибавят 200 μΐ от серума от всяко от морските свинчета, периодично размиван по десет пъти с PBS (експериментална група). Пробата престоява в инкубационен период от 4 h при стайна температура, след което се промива пет пъти с TTBS буфер (0,9% натриев хлорид, 0,05% Tween 20, 10 mM Tris, pH 7,5). Разтвор, включващ porcine анти-антитела в морските свинчета, белязани с хрянова пероксидаза (HRP), размита с 4000 единици обем PBS, съдържащ 0,5% казеин, се прибавя към пробите в количество 200 μΐ/προба. Получените проби остават в инкубационен период 1 h при 37°С и се промиват 5 пъти с TTBS буфер.
След това 200 μΐ от субстратния разтвор за хрян пероксидазата, подготвен чрез разтваряне на 200 pg тетраметил бензидин (ТМВ) в 20 μΐ DMSO, прибавяне на 10 ml от 0,1 М оцетен буфер (pH 5,1) и 20 μΐ от 30% хидроген прекис към него и получавайки 20 ml разтвор чрез добавяне на дестилирана вода, се доба10
| вят към всяка от пробите, които реагират до смяна на цвета. Към получения разтвор се добавят 50 μΐ 1N сярна киселина за всяка от пробите с цел спиране промяната на цвета. O.D. на всяка от пробите се определя при дължина на вълната 450 шп с Microplate четящо устройство (Динатех MR5000, САЩ). Когато O.D. на експерименталната група е по-висок от праговата стойност (два пъти стойността на O.D. при отрицателна контролна проба) се установява образуването на антитела срещу preS2 пептида, при което се отчита броят на морските свинчета с положителна реакция на създаване на антитела. Като резултат, и двата повърхностни антигена - 2 и 3, показват 100% степен на създаване на антитела. Пример 5. С цел определяне имунологичните свойства на S и preS2 пептиди в повърхностни антигени 2 и 3 се провежда следният експеримент с мишки: 1 m (200 gg/ml) от повърхностен антиген 2 или 3 се смесва с 18 ml фосфатен буфер (pH 7,2), съдържащ 0,15 М натриев хлорид, като сместа се филтрира през 0,2 μ шприц | филтър. Филтратът се смесва с 1 ml от 3% алхидро гел (Суперфор Биосектор, Дания). Полученият разтвор, съдържащ 10 pg/ml повърхностен антиген 2 или 3, се размива с 5 разтвор на алхидро гел (получен при размиване на алхидро гел) до получаване на крайна концентрация 0,15% с фосфатен буфер (pH 7,2), съдържащ 0,15 М натриев хлорид, за получаване на 4 проби със съответно 0,01, 0,03, 0,09 10 и 0,27 ng/ml повърхностен антиген. Банките, съхраняващи пробите, се разклащат за предотвратяване преципитацията на алхидро гел. Тази процедура се изпълнява в стерилна среда. 15 Осемдесет мишки на възраст 5 седмици са разделени в осем групи, всяка състояща се от по 10 мишки, като всяка от тях се инжектира с 1 ml от всеки от размитите разтвори на повърхностен антиген 2 или 3. След 28 дни от 20 инжектирането са взети кръвни проби от всяка мишка за получаване на серум. Антителата срещу S пептида се определят с Ausab апаратура (Абот, САЩ). Степените на образуване на антитела срещу S пептида в повърхностен 25 антиген 2 или 3 са показани в таблица 1. |
| Концентрация на побърх. антиген | Степен на образуване на антитела срещу повърхностен антиген (%) Повърхностен Повърхностен антиген 2 антиген 3 |
| 0.01 0.03 0.09 0.27 | 10 10 20 40 80 60 90 100 |
Антителата срещу preS2 пептида са определени в съответствие с метода по Пример 4, а степените на образуване на антитела срещу preS2 пептида в повърхностен антиген 2 илиЗ са дадени в табл. 2:
| Концентрация на повърхн. антиген (ng/ml) | Степени на образуване на антитела срещу повърхн. • антиген (%) Повърхностен Повърхностен антиген 2 антиген 3 |
| 0.01 0.03 0.09 0.27 | 10 10 20 40 80 60 90 100 |
Ефективните дози 50(EDJO) S и preS2 пептиди са изчислени по probit метода (Фини, Пробит анализи, 1971) използвайки степените на формиране на антитела, получени по-горе. Като резултат EDJ0 на S и preS2 пептидите в повърхностен антиген 2 са 0,0580 и 0,0577 ng/ml съответно, а тези на S и preS2 пептидите в повърхностен антиген 3 са 0,0455 и 0,0469 ng/ml съответно. Тъй като съдържанието на preS2 пептид в повърхностен антиген 2 или 3 е 75%, стойността на EDJ0 на preS2 пептида се счита по-ниска от получената по-горе.
Както е показано в изложените примери, хепатит В вирусен повърхностен антиген с високо съдържание на preS2 пептид и с високи имунологични свойства на S и preS2 пептиди може да бъде получен от рекомбинирана клетъчна среда в съответствие с настоящото изобретение.
Claims (16)
1. Метод за пречистване на хепатит В вирусен повърхностен антиген, включващ preS2 пептид, от клетки на рекомбиниран организъм, който процес се състои от следните етапи:
(a) деструкция на клетките, използвайки буфер, съдържащ хаотропна сол за получаване на клетъчна еднородност;
(b) прибавяне на повърхностноактивно вещество към клетъчната еднородност, получена в етап (а), за отделяне на повърхностен антиген от клетъчната мембрана;
(c) увеличаване на разтворимостта и подпомагане на формирането на частиците от повърхностния антиген в екстракта, получен в етап (Ь), чрез алкализиране на екстракта;
(d) преципитиране и отстраняване на клетъчните отпадъци, липиди и протеинови замърсявания от екстракта, обработен в етап (с), чрез алкализиране и последващо центрофугиране на екстракта за получаване на разтвор, съдържащ повърхностния антиген;
(e) взаимодействие на разтвора, получен в етап (d), със силициев двуокис за адсорбиране на повърхностния антиген от силициевия двуокис, отмиване на замърсяващите протеини и десорбиране на повърхностния антиген от силициевия двуокис чрез използване на буфер за получаване на фракция от пречистен повърхностен антиген;
(f) подлагане на фракцията, получена в етап (е), на хидрофобна колонна хроматография за получаване на фракции, съдържащи повърхностния антиген; и (g) пречистване на фракциите, получени в етап (f), чрез изключваща размера гел филтрираща хроматография за получаване на повърхностния антиген в чист вид.
2. Метод за пречистване на хепатит В вирусен повърхностен антиген, включващ preS2 пептид, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че хаотропната сол се избира от групата, както следва: натриев тиоцианат, калиев тиоцианат, гуанидиев хлорид и урея.
3. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че концентрацията на хаотропната сол в буфера е в диапазона от 1 до 8 М.
4. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че включва следните етапи: прибавяне на натриев сулфат или амониев сулфат към клетъчния екстракт, получен в етап (Ь) или (с), до концентрация в диапазона от 8 до 15% (w/v); отстраняване на клетъчните отпадъци и замърсявания; и подлагане на полученото на повърхността вещество на диафилтриране, предхождащо етап (d).
5. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че веществата, използвани през етап (а), са Tween 20, Tween 80, Тритон X - 100 или натриев диоксихолат.
6. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че концентрацията на веществото, използвано през етап (а), е в диапазона от 0,1 до 0,5% (w/v) въз основа на обема на клетъчната хомогенност.
7. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че клетъчният екстракт, получен през етап (а), се приспособява към pH в диапазона от 11,0 до 13,5 през етап (Ь).
8. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че pH на клетъчния екстракт е в диапазона от 4,5 до 6,0 през етап (с).
9. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че силициевият двуокис, използван при етап (d), е от 100 до 500 m2/g.
10. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че повърхностният антиген се отделя от силициевия двуокис при етап (d), като се използва буфер с диапазон на pH от 8,8 до 11,0 при съдържание на урея с концентрация в границите от 1 до 8 М и вещество за отделяне с концентрация от 0,1 до 0,3 wt%.
11. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че използването на веществото за отделяне е натриев диоксихолат.
12. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че хидрофобната смола, използвана през етап (е), е агаров гел, съдържащ фенилови групи.
13. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че хидрофобната колонна хроматография през етап (е) се осъществява чрез преминаване на фракцията, съдържаща повърхностния антиген, през колона, еквилибрирана с буфер с pH в диапазона от 8,8 до 11,0 и съдържа урея с концентрация в границите от 1 до 4 М като колоната се промива с буфер, съдържащ 10-40 wt% елитен гликол, а повърхностният антиген отделен с еквилибриран буфер, съдържащ 60-80 wt% етилен гликол.
14. Метод съгласно претенция 1, харак- теризиращ се с това, че изключващата размера хроматография през етап (f) се осъществява в присъствието на декстринов гел или полиакриламиден гел с молекулярно тегло със 5 стойност, най-малко 1000000.
15. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че изключващата размера хроматография през етап (f) се осъществява чрез преминаване на фракцията, съдържаща повърхност10 ния антиген през еквилибрирана колона с Tris или с фосфатен буфер, който има pH в диапазона от 6 до 8 и съдържа натриев хлорид с концентрация в границите от 0,1 до 0,2 М, и отделяне на повърхностния антиген със същия буфер.
15
16. Ваксина срещу хепатит В вирус, съдържаща повърхностния антиген, пречистен в съответствие с метода съгласно претенция 1.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR19940033594 | 1994-12-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG100212A BG100212A (bg) | 1996-12-31 |
| BG63699B1 true BG63699B1 (bg) | 2002-09-30 |
Family
ID=19400952
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG100212A BG63699B1 (bg) | 1994-12-10 | 1995-12-08 | Метод за пречистване на повърхностен антиген на вируса на хепатит в, съдържащ пептида pres2 |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6362320B1 (bg) |
| EP (1) | EP0716094B1 (bg) |
| KR (1) | KR960023066A (bg) |
| CN (1) | CN1057532C (bg) |
| AR (1) | AR002006A1 (bg) |
| AT (1) | ATE264341T1 (bg) |
| BG (1) | BG63699B1 (bg) |
| BR (1) | BR9505739A (bg) |
| CA (1) | CA2164672C (bg) |
| CO (1) | CO4480040A1 (bg) |
| CZ (1) | CZ291024B6 (bg) |
| DE (1) | DE69532878T2 (bg) |
| DK (1) | DK0716094T3 (bg) |
| ES (1) | ES2217272T3 (bg) |
| JO (1) | JO1885B1 (bg) |
| PE (1) | PE56396A1 (bg) |
| PL (1) | PL182103B1 (bg) |
| PT (1) | PT716094E (bg) |
| RO (1) | RO113308B1 (bg) |
| RU (1) | RU2122430C1 (bg) |
| TR (1) | TR199501557A2 (bg) |
| UY (1) | UY24112A1 (bg) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA79735C2 (uk) * | 2000-08-10 | 2007-07-25 | Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. | Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах |
| KR100405174B1 (ko) * | 2001-02-02 | 2003-11-12 | 씨제이 주식회사 | 재조합 β형 간염바이러스 표면항원의 정제방법 |
| CN1997895A (zh) * | 2004-05-19 | 2007-07-11 | 株式会社先端生命科学研究所 | 乙型肝炎病毒的检测方法 |
| GB0522765D0 (en) * | 2005-11-08 | 2005-12-14 | Chiron Srl | Combination vaccine manufacture |
| KR100948127B1 (ko) * | 2007-06-27 | 2010-03-18 | 주식회사 중앙백신연구소 | 복합호흡기 질환 돼지의 조직유제를 함유하는 백신 조성물 |
| KR102196230B1 (ko) | 2012-09-17 | 2020-12-29 | 더블유.알. 그레이스 앤드 캄파니-콘. | 크로마토그래피 매질 및 장치 |
| FR2997222B1 (fr) * | 2012-10-19 | 2015-01-16 | Alstom Technology Ltd | Dispositif d'etablissement et/ou de coupure de courant a contacts permanents a usure reduite |
| CN107847907A (zh) | 2014-05-02 | 2018-03-27 | 格雷斯公司 | 官能化载体材料以及制备和使用官能化载体材料的方法 |
| KR102566292B1 (ko) | 2015-06-05 | 2023-08-10 | 더블유.알. 그레이스 앤드 캄파니-콘. | 흡착성 바이오프로세싱 정화제와 이의 제조 및 사용 방법 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5340926A (en) * | 1983-03-25 | 1994-08-23 | Celltech, Limited | Process for the recovery of recombinantly produced protein from insoluble aggregate |
| US4649192A (en) * | 1985-05-30 | 1987-03-10 | Smith Kline-Rit | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate |
| EP0291146B1 (en) * | 1987-03-09 | 1993-09-01 | Merck & Co. Inc. | Purification of recombinant hepatitis b surface antigen |
| EP0310178A1 (en) * | 1987-09-30 | 1989-04-05 | Merck & Co. Inc. | Recovery of pres2+S antigen |
| EP0314240A3 (en) * | 1987-10-26 | 1990-03-28 | Merck & Co. Inc. | Process for purifying recombinant hepatitis antigens |
| US5004688A (en) * | 1988-04-15 | 1991-04-02 | Phillips Petroleum Company | Purification of hepatitis proteins |
| US5030720A (en) * | 1988-09-01 | 1991-07-09 | Merck & Co., Inc. | Pres2+S hepatitis B vaccine derived from plasma |
| EP0384058A1 (en) * | 1989-02-09 | 1990-08-29 | Development Center For Biotechnology | Isolation of hepatitis B surface antigen from transformed yeast cells |
| CU22290A1 (es) * | 1990-10-08 | 1995-01-31 | Cigb | Procedimiento para la obtencion de antigeno de superficie del virus de la hepatitis b de superior capacidad inmunoganica y su uso en un preparado vacunal |
-
1995
- 1995-11-29 KR KR1019950044795A patent/KR960023066A/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-12-07 JO JO19951885A patent/JO1885B1/en active
- 1995-12-07 PE PE1995286655A patent/PE56396A1/es not_active Application Discontinuation
- 1995-12-07 CA CA002164672A patent/CA2164672C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-07 CO CO95057860A patent/CO4480040A1/es unknown
- 1995-12-08 AT AT95119383T patent/ATE264341T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-12-08 CZ CZ19953247A patent/CZ291024B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-12-08 RU RU95120587A patent/RU2122430C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-12-08 DK DK95119383T patent/DK0716094T3/da active
- 1995-12-08 RO RO95-02141A patent/RO113308B1/ro unknown
- 1995-12-08 PT PT95119383T patent/PT716094E/pt unknown
- 1995-12-08 ES ES95119383T patent/ES2217272T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-08 PL PL95311735A patent/PL182103B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-12-08 BG BG100212A patent/BG63699B1/bg unknown
- 1995-12-08 EP EP95119383A patent/EP0716094B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-08 DE DE69532878T patent/DE69532878T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-11 AR ARP950100498A patent/AR002006A1/es active IP Right Grant
- 1995-12-11 CN CN95120408A patent/CN1057532C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-11 UY UY24112A patent/UY24112A1/es not_active IP Right Cessation
- 1995-12-11 TR TR95/01557A patent/TR199501557A2/xx unknown
- 1995-12-11 BR BR9505739A patent/BR9505739A/pt not_active Application Discontinuation
-
1999
- 1999-11-02 US US09/432,300 patent/US6362320B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT716094E (pt) | 2004-08-31 |
| BG100212A (bg) | 1996-12-31 |
| KR0177254B1 (bg) | 1999-04-01 |
| RU2122430C1 (ru) | 1998-11-27 |
| TR199501557A2 (tr) | 1997-03-21 |
| DK0716094T3 (da) | 2004-07-26 |
| UY24112A1 (es) | 1996-05-10 |
| CZ324795A3 (en) | 1996-06-12 |
| BR9505739A (pt) | 1997-12-23 |
| DE69532878D1 (de) | 2004-05-19 |
| CO4480040A1 (es) | 1997-07-09 |
| CA2164672A1 (en) | 1996-06-11 |
| EP0716094B1 (en) | 2004-04-14 |
| AR002006A1 (es) | 1998-01-07 |
| EP0716094A1 (en) | 1996-06-12 |
| DE69532878T2 (de) | 2005-06-09 |
| CA2164672C (en) | 2004-06-22 |
| PL182103B1 (pl) | 2001-11-30 |
| JO1885B1 (en) | 1997-12-15 |
| RO113308B1 (ro) | 1998-06-30 |
| PL311735A1 (en) | 1996-06-24 |
| KR960023066A (ko) | 1996-07-18 |
| ES2217272T3 (es) | 2004-11-01 |
| ATE264341T1 (de) | 2004-04-15 |
| US6362320B1 (en) | 2002-03-26 |
| CN1132211A (zh) | 1996-10-02 |
| CN1057532C (zh) | 2000-10-18 |
| CZ291024B6 (cs) | 2002-12-11 |
| PE56396A1 (es) | 1996-12-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5151023A (en) | Hepatitis a,b-combined adjuvanted vaccine | |
| CA1240265A (en) | Lyophilized hepatitis b vaccine | |
| CA1066191A (en) | Hepatitis b vaccine | |
| BG63699B1 (bg) | Метод за пречистване на повърхностен антиген на вируса на хепатит в, съдържащ пептида pres2 | |
| US4164565A (en) | Vaccine for active immunization containing hepatitis B surface antigen and associated antigen | |
| US4565697A (en) | Process for producing a hepatitis B infection preventing vaccine | |
| KR910008643B1 (ko) | B형 간염 비루스 표면항원(HBs 항원)의 정제 방법 | |
| US4118478A (en) | Vaccine manufacture for active immunization containing hepatitis B surface antigen and associated antigen | |
| WO1981000050A1 (en) | Process for producing hepatitis b vaccine | |
| EP0005864B1 (en) | Antigenic composition useful as a vaccine or vaccine intermediate, and process for preparing same | |
| EP0294071A2 (en) | Hepatitis B vaccines made with pre-formed aluminum hydroxide gels, and processes thereof | |
| KR100194247B1 (ko) | 재조합 b형 간염 표면 항원의 정제방법 | |
| JPS61103895A (ja) | ＨＢｓＡｇの精製方法 | |
| SU728720A3 (ru) | Способ получени вакцины против гепатита в | |
| KR0159716B1 (ko) | B형 간염 표면 항원의 정제방법 | |
| KR930012107B1 (ko) | 한국형 c형 간염 바이러스의 특이 항원인 khcv 403 단백질의 정제방법 | |
| JPS60258127A (ja) | Ｂ型肝炎ワクチンの製造方法 | |
| KR100254828B1 (ko) | 재조합 효모로 부터 발현된 b형 간염 항원의 추출 방법 | |
| CN85101017A (zh) | 冻干的b型肝炎疫苗 |