CZ291024B6 - Způsob izolace povrchového virového antigenu hepatitidy B obsahujícího peptid preS2 a vakcína tento antigen obsahující - Google Patents
Způsob izolace povrchového virového antigenu hepatitidy B obsahujícího peptid preS2 a vakcína tento antigen obsahující Download PDFInfo
- Publication number
- CZ291024B6 CZ291024B6 CZ19953247A CZ324795A CZ291024B6 CZ 291024 B6 CZ291024 B6 CZ 291024B6 CZ 19953247 A CZ19953247 A CZ 19953247A CZ 324795 A CZ324795 A CZ 324795A CZ 291024 B6 CZ291024 B6 CZ 291024B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- surface antigen
- buffer
- cell
- solution
- silica gel
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 155
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 155
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 155
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 66
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 65
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 title claims abstract description 22
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title abstract description 12
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 52
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 78
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 54
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 35
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 35
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 18
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 16
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 14
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 13
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 9
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 8
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 8
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 8
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 7
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 claims description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 6
- KNSPATVVQHLSKI-UHFFFAOYSA-N cyano thiocyanate;sodium Chemical compound [Na].N#CSC#N KNSPATVVQHLSKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 4
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 claims description 4
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 claims description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 3
- 230000003113 alkalizing effect Effects 0.000 claims description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 claims description 3
- -1 polyoxyethylene octylphenyl ether Polymers 0.000 claims description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 3
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 2
- 229920002114 octoxynol-9 Polymers 0.000 claims description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 claims description 2
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 claims description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims 1
- 229940124872 Hepatitis B virus vaccine Drugs 0.000 claims 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 26
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 9
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 7
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 7
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 7
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 4
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 229910002019 Aerosil® 380 Inorganic materials 0.000 description 3
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 3
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N hepatitis b vaccine Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N 0.000 description 2
- 229940124736 hepatitis-B vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108010084884 GDP-mannose transporter Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 102100032965 Myomesin-2 Human genes 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000235061 Pichia sp. Species 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- MYKZLATVIJZNTH-UHFFFAOYSA-N azane;cyano thiocyanate Chemical compound N.N#CSC#N MYKZLATVIJZNTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- HDFXRQJQZBPDLF-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].OC([O-])=O.OC([O-])=O HDFXRQJQZBPDLF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000009965 odorless effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Public Health (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Zp sob izolace virov ho povrchov ho antigenu hepatitidy B obsahuj c ho peptid preS2 z bun k rekombinovan²ch organism , kter² je charakterizov n rozru en m t chto bun k pomoc pufru obsahuj c ho chaotropn s l.\
Description
Způsob izolace povrchového virového antigenu hepatitidy B obsahujícího peptid preS2 a vakcína tento antigen obsahující
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu izolace virového povrchového antigenu hepatitidy B obsahujícího peptid preS2, konkrétně způsobu izolace virového povrchového antigenu hepatitidy B obsahujícího peptid preS2 z rekombinovaných buněk kvasinek, který zahrnuje krok rozrušení, kdy se předchází ztrátě preS2 peptidu použitím chaotropní soli, následnou extrakci, srážení, adsorpci na silikagelu a kolonovou chromatografii.
Dosavadní stav techniky
Hepatitida B je jedním z celosvětových problémů lidského zdraví a 200 až 300 milionů lidí jsou nositeli viru hepatitidy B (HBV). Nakažení HBV často přechází v cirhózu a hepatocelulámí karcinom vedoucí k možné smrti pacienta.
Dosud nebyl vyvinut léčebný prostředek k léčení hepatitidy B a byla zdůrazňována důležitost očkování.
Blumberg a kol. objevili v roce 1955 Australský antigen v krvi pacientů shepatitidou B; Krugman a kol. v roce 1971 oznámili aktivní imunizaci za použití tepelně zpracovaného lidského séra obsahujícího HBV, čímž se nabídla možnost vývoje vakcíny proti hepatitidě B. Nato byla komercializována první generace vakcín proti hepatitidě B, která byla připravena izolací a čištěním virového povrchového antigenu hepatitidy B (HBsAg) z krevní plazmy pacientů s hepatitidou Β (M. R. Hilleman a kol., Develop. Bio. Standard, 54, 3-12 (1983)).
Nicméně vakcíny odvozené z krevní plazmy jsou problematické: způsoby jejich izolace a inaktivace jsou těžkopádné a vyžadují vysoké náklady; zásoby lidské krve jsou omezené a očkované osoby mohou být infikovány patogeny ze zdroje krve.
Proto byly za účelem řešení výše zmíněných problémů při vývoji vakcíny proti hepatitidě B testovány přístupy genetického inženýrství.
Např. Valenzuela a kol. vyvinuli způsob výroby HBsAg kvasinkami (Nátuře, 293, 347-350 (1982)).
Rekombinovaný HBsAg (r-HBsAg) obsahuje zejména S protein (P25) s 226 aminokyselinami a po izolaci vytváří částice povrchového antigenu, které jsou téměř identické se separovanými z krevní plazmy.
K.H. Heermann a kol. uvedli, že virový obalový protein hepatitidy B obsahuje značné množství L-proteinu (preSl + preS2 + S: p39) a M-proteinu (preS2 + S: p31) a také S-proteinu (J. Virol., Nov., 396-402 (1984)). Bylo známo, že preSl peptid hraje důležitou úlohu s ohledem na atak viru hepatitidy B na játra po infikování lidského těla. Při experimentech se zvířaty bylo dokázáno, že peptid preS2 skládající se z 55 aminokyselin pomáhá při tvorbě protilátek proti povrchovému antigenu (D.R. Milich a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82, 8168-8172 (1985)).
Kromě toho bylo známo, že protilátky vytvořené proti peptidu preS2 vykazují obrannou aktivitu proti virové infekci (Y. Ito a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83, 9174-9178 (1986)). Proto je tedy vakcína obsahující peptid preS2 platná u lidí, kteří nemohou vytvářet protilátky proti dříve
-1 CZ 291024 B6 existujícímu povrchovému antigenu. Vývoj této vakcíny je rovněž důležitý pro ochranu proti infekci nedávno objevenou virovou formou hepatitidy B.
Ačkoli je peptid preS2 velmi citlivý k proteázám přítomným v buňkách kvasinek, setkala se příprava povrchového antigenu hepatitidy B obsahujícího peptid preS2 s různými obtížemi. Za účelem překonání těchto obtíží připravil Kobayashi a kol. vakcínu pomocí geneticky modifikovaných proteáza-senzitivních oblastí mezi preS2 aS peptidy (J. Bacteriology, 8, 1-22 (1988)) a US 4 742 158 odkrývá způsob přípravy vakcíny obsahující peptid preS2, kdy je peptid chráněn před atakem proteázy použitím inhibitoru proteázy ve stadiu rozrušení buněk. Ale provedení genetické modifikace aktivity peptidu preS2 Kobayashim nebylo plně charakterizováno a následující způsob není praktický, protože inhibitory proteázy jsou příliš drahé pro použití při izolace velkých množství. A dále nemůže být obsah peptidu preS2 udržen na určité hladině bez množství přidaných inhibitorů proteázy, když se prodlužuje doba izolace s úrovní nebo rostoucími nároky.
EP číslo 0 337 492 Al poskytuje způsob izolace HBsAg z kultury Pichia sp. s použitím thiokyanidu draselného. Thiokyanid draselný se používá pro zvýšení výtěžku lipofilních proteinů a celý proces je zaměřený na izolaci HBsAg obsahujícího pouze S peptid. Pokud HBsAg obsahuje dále peptid preS2 skládající se z 55 aminokyselin vedle S peptidu skládajícího se z 226 aminokyselin, jeho imunologické vlastnosti jsou podobné povrchovému antigenu obsahujícímu pouze S peptid, protože antigenicita i imunogenicita S peptidové části jsou zachovány. Ale tyto dva povrchové antigeny mají nevyhnutelně jiné fyzikálně chemické vlastnosti. Konkrétně je peptid preS2 dost hydrofilní na to, aby byl nechráněný na povrchu částic antigenu a to má následně důležitý vliv na proceduru izolace.
A tak byly vyvinuty různé způsoby izolace povrchového antigenu hepatitidy B obsahujícího peptid preS2.
EP číslo 0 130 178 Al popisuje způsob izolace HBsAg obsahujícího peptid preS2, který je charakterizován separací povrchového antigenu použitím dvou kapalných fází, které jsou připraveny přidáním vhodného množství dextranu a glykolu k extraktu kvasinek. Ale tento způsob je problematický: separovaný povrchový antigen není dostatečně čistý a není vhodný pro izolaci ve velkém množství, protože dextran i ethylenglykol jsou drahé a ekonomicky nevhodná je i nutnost dodatečného odstranění použité povrchově aktivní látky.
US 4 742 158 popisuje způsob izolace HBsAg obsahujícího peptid preS2, který zahrnuje přípravu kvasinkového extraktu za přítomnosti různých proteáz inhibitorů a izolaci povrchového antigenu od těchto látek sérií kolonových chromatografií za použití afinitní kolony připravené zakotvením albuminového polymeru z lidského séra na gelovou matrici a hydrofobní kolonovou eluci povrchově aktivní látkou. Ale tento způsob má některé nevýhody: inhibitory proteázy použité při tomto způsobu jsou velmi drahé, afinitní kolona není vhodná k dělení velkých množství a k odstranění povrchově aktivní látky použité při hydrofobní kolonové chromatografii je zapotřebí speciální metody.
M Kobayashi a kol. rovněž zveřejnili způsob izolace HBsAg obsahujícího peptid preS2 (J. of Biotechnology, 8, 1-22 (1988)). Ale tento způsob není vhodný pro izolaci velkých množství, protože používá imunoafinitní kolonovou chromatografii, jejímž výsledkem je malý výtěžek.
Korejský patent 065305 uvádí způsob izolace HBsAg, který zahrnuje pH srážení, iontově výměnnou a kolonovou chromatografii na silikagelu. Tento způsob má tu nevýhodu, že je těžké udržet obsah preS2 peptidu na uspokojivé hladině, protože je částečně odbouráván proteázou v inicializačním stadiu procesu.
-2 CZ 291024 B6
Z těchto důvodů stále existuje potřeba efektivního způsobu izolace HBsAg obsahujícího peptid preS2.
Podstata vynálezu
Primárním předmětem předkládaného vynálezu je získání způsobu izolace virového povrchového antigenu hepatitidy B obsahujícího peptid preS2 z kvasinkových buněk v dostatečné čistotě k přímému použití do vakcíny.
Ve shodě s jedním aspektem předkládaného vynálezu je získání způsobu izolace virového povrchového antigenu hepatitidy B obsahujícího peptid preS2, který je přenesen do rekombinovaného organismu a je charakterizován:
(a) rozrušením buňky pomocí pufru obsahujícího chaotropní sůl, čímž se získá buněčný homogenát;
(b) přidáním povrchově aktivní látky k buněčnému homogenátu získanému v kroku (a), čímž se extrahuje povrchový antigen z buněčné membrány buněk;
(c) alkalizací extraktu se zvýší rozpustnost a podpoří se vznik částic povrchového antigenu v extraktu získaném v kroku (b);
(d) vysrážením a odstraněním buněčných zbytků, lipidů a kontaminujících proteinů z extraktu z kroku (c), okyselením a odstředěním extraktu, čímž se získá roztok obsahující povrchový antigen;
(e) uvedením roztoku z kroku (d) do kontaktu se silikagelem, čímž dojde k adsorpci povrchového antigenu na silikagel, vymytím kontaminujících proteinů adesorpcí povrchového antigenu ze silikagelu za použití pufru, čímž se získá frakce čištěného povrchového antigenu;
(f) provedením hydrofobní kolonové chromatografie s frakcí čištěného povrchového antigenu získaného v bodu (e), čímž se získá frakce obsahující povrchový antigen; a (g) čištěním frakce získané v kroku (f) gelovou filtrační chromatografií se separací podle velikosti, čímž se získá povrchový antigen v čisté formě.
Stručný popis schématu
Následující a jiné objekty a hlavní body předkládaného vynálezu budou zřejmé z následujícího popisu vynálezu ve spojení s doprovodným schématem, kde:
obr. 1 ukazuje výsledek 15% dodecylsíran sodný polyakrylamid gelové elektroforézy (SDSPAGE), který potvrzuje přítomnost preS2 peptidu v HBsAg, po izolaci povrchového antigenu obsahujícího peptid preS2 v přítomnosti thiokyanidu sodného jako chaotropní soli.
Podrobný popis vynálezu
Předkládaný vynález zahrnuje způsob izolace virového povrchového antigenu hepatitidy B obsahujícího peptid preS2, který je přenesen do rekombinovaného organismu aje charakterizován rozrušením rekombinovaných buněk pufrem obsahujícím chaotropní sůl což vede k minimalizaci ztráty peptidu preS2. Použití pufru obsahujícího chaotropní sůl pro rozrušení buněk podporuje tvorbu částic HBsAg a chrání peptid preS2 před atakem proteázy, který obecně
-3CZ 291024 B6 nastává během inicializačního stadia izolace, čímž je zvýšen obsah peptidů preS2 na konstantní úroveň až do konce izolace.
Způsob, kterého se týká předkládaný vynález, je aplikován na způsob izolace HBsAg, který je produkován v jakémkoli vhodném rekombinovaném organismu, zvláště v buňkách kvasinek např. Saccharomyces cerevisiae.
Vhodná chaotropní sůl v předkládaném vynálezu zahrnuje thiokyanid sodný, thiokyanid draselný, thiokyanid amonný, guanidium hydrochlorid a močovinu, s výhodou thiokyanid sodný.
Pro rozrušení buněk ve způsobu v předkládaném vynálezu byly použity běžné pufry, např. fosforečnanový a Tris pufr. Nastavené pH bylo mezi 6 a 8. Koncentrace chaotropní soli v pufru byla 1 až 8 M, s výhodou 1 až 3 M.
Pokud byly rekombinované buňky rozrušeny pufrem obsahujícím chaotropní sůl, jak je popsáno výše, byl zbytek čisticího způsobu proveden kombinací běžných čisticích postupů, třebaže nejčastěji zahrnuje kroky:
b) přidání povrchově aktivní látky k buněčnému homogenátu z rekombinovaných buněk, za účelem extrakce povrchového antigenu z buněčné membrány;
c) zvýšení rozpustnosti a podpora tvorby částic povrchového antigenu v extraktu získaném v kroku b) alkalizací extraktu;
d) srážení a odstranění buněčných zbytků, tuků a kontaminujících bílkovin z extraktu upraveného vc) okyselením a následným odstředěním extraktu za získání roztoku obsahujícího povrchový antigen;
e) spojení roztoku získaného v kroku d) se silikagelem kadsorbci povrchového antigenu na silikagelu, vymytí kontaminujících bílkovin adesorpce povrchového antigenu ze silikagelu použitím pufru za získání frakce izolovaného povrchového antigenu;
f) podrobení frakce izolovaného povrchového antigenu získané v kroku e) hydrofobní kolonové chromatografii za získání frakcí obsahujících izolovaný povrchový antigen; a
g) čištění frakcí získaných v kroku f) gelovou filtrační chromatografií se separací podle velikosti za získání povrchového antigenu v čisté formě.
Typická povrchově aktivní látka použitá ve výše uvedeném kroku b) pro extrakci povrchového antigenu z buněk zahrnuje: polysorbát 20 (Tween 20), polysorbát 80 (Tween 80), polyoxyethylen-oktylfenylether (Triton X-100) adeoxycholát sodný, přednostně však polysorbát 20. Povrchově aktivní látka byla použita v množství 0,1 až 0,5 g na 100 cm3 buněčného homogenátu, s výhodou 0,1 až 0,2 g na 100 cm3 buněčného homogenátu.
Za účelem zvýšení rozpustnosti povrchového antigenu v buněčném homogenátu a podpory tvorby částic, je nej lepší zvýšit pH extraktu povrchového antigenu na 11,0 až 13,5 použitím báze, s výhodou hydroxidu sodného a hydroxidu draselného. Tento způsob alkalizace byl zvolen za účelem podpory tvorby částic HBsAg za zesílení intermolekulámí disulfidické vazby a disociace kontaminujících proteinů z HBsAg prostřednictvím zvýšení rozpustnosti. Následně byl extrakt ponechán stát při teplotě od 0 do 30 °C po dobu 0,5 až 1 hodiny.
Pak byl extrakt okyselen za vysrážení buněčných zbytků, tuků a kontaminujících proteinů, kdy je pH sníženo na 4,5 až 6,0. V tomto kroku byly použity organické i anorganické kyseliny, s výhodou 10 až 30 % octová kyselina. Okyselení bylo provedeno při 0 až 30 °C po dobu 0, 5 až
-4CZ 291024 B6 hodin, s výhodou za míchání. Okyselený extrakt byl odstředěn za odstranění vzniklé sraženiny a získání roztoku obsahujícího povrchový antigen. Tato procedura je výhodná tím, že se v jednom kroku odstředění odstraní buněčné zbytky, tuky a kontaminující bílkoviny zároveň a výtěžek povrchového antigenu je vysoký následkem předešlého kroku rozpuštění povrchového antigenu v oblasti vysokého pH.
Zvýšení a následné snížení pH buněčného extraktu stabilizuje schopnost povrchového antigenu tvořit částice a je velmi účinné při odstraňování tuků a kontaminujících bílkovin.
Bohužel pokud je v kroku rozrušování buněk jako chaotropní sůl použit thiokyanid, dochází při okyselení k uvolnění odporného zápachu. Thiokyanidová sůl je sama o sobě neškodná látka bez barvy a zápachu a thiokyanidový iont je v roztoku stabilní. A tedy zápach uvolněný v kroku okyselení vzniká zřejmě v souvislosti s reakcí thiokyanidu s některou z látek v buněčném extraktu. Tento zápach je pro pracovníky snesitelný, pokud se jedná o izolaci v malém měřítku, ale při zpracování velkých množství je vhodné zmíněný thiokyanid před okyselením odstranit.
Thiokyanid byl s výhodou odstraněn přidáním vhodné soli k buněčnému extraktu za vysrážení thiokyanidu spolu s některými kontaminujícími proteiny ihned po výše zmíněném kroku b), odstředěním adiafiltrací vzniklého roztoku. Povrchový antigen se v průběhu této procedury nesráží. Dále je odstranění thiokyanidu spojeno s odstraněním části kontaminujících proteinů, které usnadňuje následující procedury izolace.
K odstranění zápachu byly s výhodou přidány soli vícemocných aniontů, např. síran sodný a síran amonný na koncentraci 8 až 15 g na 100 cm3 buněčného extraktu. Sůl se přidává po extrakci povrchového antigenu z buněčné membrány a směs se nechá reagovat za laboratorní teploty 0,5 až 2 hodiny bez míchání. Vzniklá sraženina se odstraní běžnými způsoby, např. odstředěním, za získání roztoku obsahujícího povrchový antigen. Vzniklý roztok se podrobí opakované diafiltraci za odstranění thiokyanidu a síranu. V tomto kroku se s výhodou používá pufr s pH 6 až 8. Po přidání soli, odstředění a diafiltraci byl vzniklý roztok podroben krokům c) a d).
Roztok získaný v kroku d), který obsahuje povrchový antigen, byl podroben chemickému působení silikagelu za použití kolonové nebo dávkové metody, s výhodou dávkové metody. Pro tento krok je vhodný mikrokrystalický silikagel s povrchem 100 až 500 m2/g, s výhodou byl použit Aerosil 380 (Degussa, Germany). Roztok obsahující povrchový antigen se spojí s vodnou suspenzí silikagelu při pH 6 až 8 a při teplotě 4 až 30 °C se intenzivně míchá 2 až 16 hodin. Množství suchého silikagelu pro adsorpci povrchového antigenu bylo s výhodou 5 % (hmotnostní) z váhy buněčného koláče jako základu. Komplex povrchový antigen-silikagel se z roztoku oddělí běžnými metodami, např. odstředěním.
Následně byl komplex promyt např. pufrem s pH 6 až 8, s výhodou pufrem fosforečnan sodný chlorid sodný, za odstranění zbytku kontaminujících proteinů ze silikagelu. Povrchový antigen byl ze silikagelu desorbován vhodným pufrem za 2 hodiny. Konkrétně byl v tomto kroku použit pufr s pH 8,8 až 11,0, s výhodou uhličitan sodný - hydrogenuhličitan sodný. Pufr dále obsahoval močovinu v koncentraci 1 až 8 M a povrchově aktivní látku, s výhodou deoxycholát sodný v koncentraci 0,1 až 0,3 g na 100 cm3 pufru. Silikagel pak byl z roztoku odstraněn použitím běžných způsobů, např. odstředěním, za získání roztoku obsahujícího povrchový antigen. Bohužel, pokud se použije při desorpci deoxycholát sodný, je nezbytné jej odstranit opakovanou diafiltraci.
Roztok získaný předcházejícím postupem, který obsahuje povrchový antigen, byl dále čištěn hydrofobní kolonovou chromatografií, kde byl s výhodou jako hydrofobní fáze použit agarózový gel s fenylovými zbytky. Před spojením roztoku s hydrofobní fází byla tato ekvilibrována pufrem s pH 8,8 až 11,0 který byl stejný jako v předešlém kroku. Pufr s výhodou obsahoval močovinu
-5 CZ 291024 B6 v koncentraci 1 až 4 M za účelem maximálního odstranění kontaminujících bílkovin, které jsou méně hydrofobní než povrchový antigen.
Následně byl roztok obsahující povrchový antigen nalit na kolonu za spojení sjejí náplní. Kolona byla důkladně promyta rovnovážným pufrem obsahujícím 10 až 40 hmotn. % ethylenglykolu za odstranění poměrně slabě adsorbovaných kontaminujících proteinů z materiálu náplně. Povrchový antigen navázaný na hydrofobní fázi byl vymyt rovnovážným pufrem obsahujícím 60 až 80 hmotn. % ethylenglykolu.
Tato hydrofobní kolonová chromatografie představuje velmi účinný čisticí krok, kdy byla odstraněna většina zbylých nečistot roztoku po adsorpci na silikagelu. Touto metodou byly odstraněny především pyrogenní látky, které se jinak běžnými metodami odstraňují těžko. Močovina a ethylenglykol, obsažené ve frakcích obsahujících povrchový antigen byly odstraněny např. dialýzou nebo opakovanou diafiltrací, kdy byl s výhodou použit pufr s pH 6 až 8.
Frakce obsahující povrchový antigen, získané hydrofobní kolonovou chromatografií, byly dále čištěny gelovou filtrační chromatografií se separací podle velikosti až do té míry, že izolovaný antigen mohl být použit pro přípravu vakcíny.
Příkladem polární matrice, která byla použita jako náplň do kolony je agarózový gel, dextranový gel a polyakrylamid s maximální propouštěnou hodnotou molekulové hmotnosti 1 000 000, s výhodou 5000 až 500 000. Gelová filtrační chromatografie se separací podle velikosti byla provedena nalitím frakcí obsahujících povrchový antigen na kolonu ekvilibrovanou Tris nebo fosforečnanovým pufrem spH 6 až 8, který obsahoval chlorid sodný v koncentraci 0,1 až 0,2 M, a elucí povrchového antigenu stejným pufrem.
Frakce obsahující povrchový antigen byly spojeny a čistota povrchového antigenu a přítomného peptidu preS2 byla zjištěna pomocí SDS-PAGE. Jak bylo ověřeno různými experimenty v následujících Příkladech, povrchový antigen izolovaný způsobem, jehož se týká předkládaný vynález, je tak čistý a obsah peptidu preS2 je tak vysoký, že izolovaný antigen může být přímo použit pro přípravu vakcíny.
Příklady provedení vynálezu
Následující Příklady a Srovnávací příklady jsou určeny pouze pro ilustraci a prezentaci předkládaného vynálezu a nelze je pokládat za omezení rámce vynálezu.
Kromě toho procentuální obsahy uvedené níže pro pevnou látku v pevné směsi, kapalinu v kapalné a pevnou látku v kapalné směsi jsou hmotn. % a hmotn./objem % bez jinak určené specifikace.
Příklad 1 (Krok 1) Rozrušení kvasinkových buněk
Rekombinované Saccharomyces cerevisiae KCTC 0098BP, které jsou schopné poskytnout povrchový antigen hepatitidy B obsahující peptid preS2, byly kultivovány při 27 °C v 30 1YEPD prostředku (1 % kvasinkového extraktu, 2% kvasinkové peptonové výživy, 1,6% glukózy). Takto získaný 70 g kvasinkový buněčný koláč byl smísen se 140 ml pufru 1 (50mM Tris, pH 7,2; 1M thiokyanid sodný, 0,15M chlorid sodný, lOmM ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA) a lmM fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) a směs byla přidána do kontejneru kuličkové
-6CZ 291024 B6 třepačky (Biospec Products. OKLA, USA) obsahujícího 210 ml skleněných kuliček s průměrem 0,5 mm.
Kontejner byl ponořen do lázně led-voda a kuličková třepačka byla třikrát zapnuta v 15minutových intervalech pokaždé na 5 minut. Vzniklý buněčný homogenát byl oddělen od skleněných kuliček, skleněné kuličky byly promyty 210 ml pufru 1 a takto získaný roztok byl spojen s buněčným homogenátem.
(Krok 2) Extrakce a rozpuštění povrchového antigenu
K buněčnému homogenátu získanému v Kroku 1 bylo přidáno 0,1 g polysorbátu 20 na 100 cm3 buněčného homogenátu a směs byla míchána za laboratorní teploty 2 hodiny.
Roztok byl alkalizován přídavkem 5N hydroxidu sodného na pH 11,5 a míchán za laboratorní teploty 1 hodinu. Vzniklý roztok byl okyselen přídavkem 20 % octové kyseliny na pH 5,2 a míchán za laboratorní teploty 30 min a pak ponechán stát 30 min.
Roztok byl odstředěn při 8 °C za odstranění buněčných zbytků a sraženiny.
Roztok obsahující povrchový antigen byl neutralizován přídavkem 5N hydroxidu sodného na pH 7,2. Objem roztoku v této fázi postupu byl 300 ml.
(Krok 3) Adsorpce a desorpce za použití silikagelu
Suchý silikagel byl smíšen s vodou za přípravy 5 % suspenze (suchá váha/objem suspenze), 70 ml této suspenze bylo přidáno k roztoku získanému v Kroku 2 a tato směs byla míchána za laboratorní teploty 2 hodiny. Vzniklý roztok byl odstřeďován při 5500 otáčkách.min'1 10 min za odstranění kapalného podílu a usazený silikagel s adsorbovaným povrchovým antigenem byl dvakrát promyt fosforečnanovým pufrem (pH 7,2) obsahujícím 0,15M chlorid sodný.
Promytý silikagel byl přidán k 70 ml 50mM uhličitanového pufru obsahujícího 1 M močovinu a směs byla míchána za laboratorní teploty 1 hodinu za desorpce povrchového antigenu ze silikagelu. V tomto stadiu měl pufr pH 9,2. Roztok byl odstřeďován (Beckman JAM rotor) při 12 000 otáčkách.min130 min za získání kapaliny obsahující povrchový antigen.
Množství povrchového antigenu hepatitidy B v roztoku bylo 6,5 mg podle Auzyme aparátu (Abbot. USA).
Srovnávací příklad
Stejná procedura jako v Příkladu 1 byla zopakována s tím, že pufr 1 neobsahoval thiokyanid sodný za získání roztoku izolovaného povrchového antigenu. Následkem toho množství povrchového antigenu hepatitidy B v roztoku bylo 7,1 mg podle Auzyme aparátu.
Roztoky povrchového antigenu získané v Příkladu 1 a Srovnávacím příkladu byly podrobeny 15% dodecylsíran sodný polyakrylamid gelové elektroforéze (SDS-PAGE) a následnému vyvolání stříbrem. Výsledek je na obr. 1, kde dráhy 1 a 2 představují roztoky povrchového antigenu získané v Příkladu 1 a Srovnávacím příkladu. A zde ukazuje proužek nedotčeného proteinu a B a C proteinové fragmenty jako výsledek ataku proteázy.
Jak je vidět na obr. 1, byl způsobem, kterého se týká předkládaný vynález, ve vysokém výtěžku izolován z kvasinkových buněk povrchový antigen s vysokým obsahem peptidu preS2.
-7CZ 291024 B6
Příklad 2 (Krok 1) Rozrušení kvasinkových buněk
Rekombinované Saccharomyces cerevisiae KCTC 0098BP, které jsou schopné poskytnout povrchový antigen hepatitidy B obsahující peptid preS2, byly kultivovány při 27 °C v 300 1 YEPD prostředku. Takto získaný 3kg kvasinkový buněčný koláč byl smíchán se 6 1 pufru 1 a směs byla dvakrát prolita přes Dynomíll (Glenmills, Japan) obsahující 3 1 skleněných kuliček s průměrem 0,5 mm při 10 °C a průtoku 650 ml/min za rozrušení kvasinkových buněk. Vzniklý buněčný homogenát byl oddělen od skleněných kuliček, skleněné kuličky byly promyty 9 1 pufru 1 a takto získaný roztok byl spojen s buněčným homogenátem. Množství HBsAg v roztoku bylo 754 mg podle Auzyme aparátu.
(Krok 2) Extrakce a rozpuštění povrchového antigenu
K buněčnému homogenátu získanému v Kroku 1 bylo přidáno 0,1 g polysorbátu 20 na 100 cm3 buněčného homogenátu a směs byla míchána za laboratorní teploty 2 hodiny.
Roztok byl alkalizován přídavkem 5 N hydroxidu sodného na pH 11,5 a míchán za laboratorní teploty 1 hodinu. Vzniklý roztok byl okyselen přídavkem 20 % octové kyseliny na pH 5,2 a míchán za laboratorní teploty 30 min a pak ponechán stát 30 min.
Roztok byl odstředěn při 8 °C za odstranění buněčných zbytků a sraženiny.
Roztok obsahující povrchový antigen byl neutralizován přídavkem 5 N hydroxidu sodného na pH 7,2. Objem roztoku byl nakonec 121 a množství HBsAg v roztoku bylo 1250 mg podle Auzyme aparátu.
Výtěžek povrchového antigenu byl 165,8 hmotn. % vzhledem k základnímu množství povrchového antigenu zjištěnému v Kroku 1. Tento neočekávaně vysoký výtěžek je výsledkem vlivu povrchově aktivní látky a báze, který zvyšuje antigenicitu a podporuje rozpustnost povrchového antigenu.
(Krok 3) Adsorpce a desorpce za použití silikagelu
Roztok získaný v Kroku 2 byl zředěn dvojnásobným objemem 0,15 M chloridu sodného a pak adsorbován na silikagelu (Aerosil 380) v souladu s následující procedurou. Suchý silikagel byl smíšen s vodou za přípravy 10 % suspenze (suchá váha/objem suspenze), 1,5 1 této suspenze bylo přidáno k roztoku získanému v Kroku 2 a tato směs byla míchána při 4 °C přes noc.
Vzniklý roztok byl odstřeďován 10 min při 5500 otáčkách.min'1 za odstranění kapalného podílu a usazený silikagel s adsorbovaným povrchovým antigenem byl dvakrát promyt fosforečnanovým pufrem (pH 7,2) obsahujícím 0,15M chlorid sodný.
Promytý silikagel byl přidán k3 I 50mM uhličitanového pufru (pH 9,5) obsahujícího 1M močovinu a směs byla míchána za laboratorní teploty 2 hodiny za desorpce povrchového antigenu ze silikagelu. V tomto stadiu měl pufr pH 9,2. Roztok byl odstřeďován při 8700 otáčkách.min'130 min za získání kapaliny obsahující povrchový antigen.
Množství HBsAg v roztoku bylo 895 mg podle Auzyme aparátu (výtěžek: 118,7 hmotn. %).
-8CZ 291024 B6 (Krok 4) Hydrofobní kolonová chromatografie
K roztoku získanému v Kroku 3 obsahujícímu povrchový antigen byla přidána močovina tak, že její koncentrace byla 4M a vzniklý roztok byl nalit na fenylagarózovou kolonu ekvilibrovanou 50mM uhličitanovým pufrem (pH 9,2) obsahujícím 4M močovinu. Kolona byla promyta stejným pufrem obsahujícím 20 % ethylenglykolu a pak byl přidán stejný pufr obsahující 60 % ethylenglykolu za účelem vymytí povrchového antigenu.
Frakce obsahující povrchový antigen byly spojeny a zfiltrovány přes Amicon diafiltrační systém (Amicon, USA) s maximální molekulovou hodnotou 100 000 za odstranění močoviny a ethylenglykolu z eluátu a vzniklý roztok byl zakoncentrován pomocí stejného systému.
Množství HBsAg ve filtrátu bylo 546 mg podle Auzyme aparátu (výtěžek: 72,4 hm. %).
(Krok 5) Gelová filtrační chromatografie
Kolona byla naplněna 8 1 Sepharosy CL-48 (Pharmacia, USA) a ekvilibrována fosforečnanovým pufrem (pH 7,2) obsahujícím 0,15M chlorid sodný. Koncentrát obsahující povrchový antigen, který byl získán v Kroku 4 byl nalit na kolonu a eluován stejným pufrem, za získání frakcí obsahujících povrchový antigen.
Množství HBsAg (zahrnující nedotčený antigen i fragmenty po ataku proteázy) ve spojených frakcích bylo 540 mg podle Auzyme aparátu (výtěžek: 71,6 hm. %) a čistota povrchového antigenu byla 98,2 %. Obsah peptidu preS2 ve veškerém povrchovém antigenu byl podle SDS-PAGE 75 %. Roztok takto získaného izolovaného povrchového antigenu byl zfiltrován přes filtr mající velikost pórů 0,2 μιη (Corning, USA) a filtrát byl uložen při 4 °C.
Příklad 3 (Krok 1) Rozrušení kvasinkových buněk
Rekombinované Saccharomyces cerevisiae KCTC 0098BP byly kultivovány při 27 °C v 300 1 YEPD prostředku. Takto získaný 4 kg kvasinkový buněčný koláč byl smíchán s 8 1 pufru 1 a směs byla dvakrát prolita přes Dynomill (Glenmills, Japan) obsahující 3 1 skleněných kuliček s průměrem 0,5 mm při 10 °C a průtoku 650 ml/min za rozrušení kvasinkových buněk.
Vzniklý buněčný homogenát byl oddělen od skleněných kuliček, skleněné kuličky byly promyty 12 1 pufru 1 a takto získaný roztok byl spojen s buněčným homogenátem.
(Krok 2) Extrakce a rozpuštění povrchového antigenu
K buněčnému homogenátu získanému v Kroku 1 bylo přidáno 0,1 g polysorbátu 20 na 100 cm3 buněčného homogenátu a směs byla míchána za laboratorní teploty 2 hodiny.
Ke směsi byl přidán nasycený roztok síranu amonného na konečnou koncentraci 10 g na 100 cm a směs byla míchána za laboratorní teploty 1 hodinu. Vzniklý roztok byl odstředěn při 8 °C za odstranění buněčných zbytků a sraženiny.
Roztok byl zfiltrován na Amicon diafiltračním systému (Amicon, USA) s maximální molekulovou hodnotou 100 000 za použití 20mM Tris pufru (pH 7,5) za účelem odstranění thiokyanidu a síranu sodného a zkoncentrován za použití stejného systému na konečný objem 6 1.
-9CZ 291024 B6
Koncentrát byl alkalizován přídavkem 5N hydroxidu sodného na pH 11,5 a míchán za laboratorní teploty 1 hodinu. Vzniklý roztok byl okyselen přídavkem 20 % octové kyseliny na pH 5,2 a míchán za laboratorní teploty 30 min a pak ponechán stát 30 min. Roztok byl odstředěn při 8 °C za odstranění buněčných zbytků a sraženiny.
Roztok byl neutralizován přídavkem 5N hydroxidu sodného na pH 7,2 a množství HBsAg v roztoku bylo 1400 mg podle Auzyme aparátu.
(Krok 3) Adsorpce a desorpce za použití silikagelu
Roztok získaný v Kroku 2 byl adsorbován na silikagelu (Aerosil 380) v souladu s následující procedurou. Suchý silikagel byl smísen s vodou za přípravy 10% suspenze (suchá váha/objem suspenze), 2 I této suspenze byly přidány k roztoku získanému v Kroku 2 a tato směs byla míchána při 4 °C přes noc.
Vzniklý roztok byl odstřeďován 10 min při 5500 otáčkách.min'1 za odstranění kapalného podílu a usazený silikagel s adsorbovaným povrchovým antigenem byl dvakrát promyt fosforečnanovým pufrem (pH 7,2) obsahujícím 0,15M chlorid sodný.
Promytý silikagel byl přidán k 4 1 50mM uhličitanového pufru (pH 9,5) obsahujícího 1M močovinu a směs byla míchána za laboratorní teploty 2 hodiny za desorpce povrchového antigenu ze silikagelu. V tomto stadiu měl pufr pH 9,2. Roztok byl odstřeďován při 8700 otáčkách.min'1 30 min za získání kapaliny obsahující povrchový antigen.
Množství HBsAg v roztoku bylo 840 mg podle Auzyme aparátu (výtěžek: 118,7 %).
(Krok 4) Hydrofobní kolonová chromatografie
K roztoku získanému v Kroku 3 obsahujícímu povrchový antigen byla přidána močovina tak, že její koncentrace byla 4 M a vzniklý roztok byl nalit na fenylagarózovou kolonu ekvilibrovanou 50mM uhličitanovým pufrem (pH 9,2) obsahujícím 4M močovinu. Kolona byla promyta stejným pufrem obsahujícím 20 % ethylenglykolu a pak byl přidán stejný pufr obsahující 60 % ethylenglykolu za účelem vymytí povrchového antigenu.
Frakce obsahující povrchový antigen byly spojeny a zfiltrovány přes Amicon diafiltrační systém (Amicon, USA) s maximální molekulovou hodnotou 100 000 za odstranění močoviny a ethylenglykolu z eluátu a vzniklý roztok byl zakoncentrován pomocí stejného systému.
Množství HBsAg ve filtrátu bylo 527 mg podle Auzyme aparátu (výtěžek: 72,4 hm. %).
(Krok 5) Gelová filtrační chromatografie
Kolona byla naplněna 8 I Sepharosy CL-48 (Pharmacia, USA) a ekvilibrována fosforečnanovým pufrem (pH 7,2) obsahujícím 0,15M chlorid sodný. Koncentrát obsahující povrchový antigen, který byl získán v Kroku 4, byl nalit na kolonu a eluován stejným pufrem, za získání frakcí obsahujících povrchový antigen.
Množství virového povrchového antigenu hepatitidy B ve spojených frakcích bylo 480 mg podle Auzyme aparátu (výtěžek: 71,6 hm. %) a čistota povrchového antigenu byla 98,9%. Obsah peptidu preS2 ve veškerém povrchovém antigenu byl podle SDS-PAGE 75 %. Roztok takto získaného izolovaného povrchového antigenu byl zfiltrován přes filtr mající velikost pórů 0,2 pm (Coming, USA) a filtrát byl uložen při 4 °C.
-10CZ 291024 B6
Příklad 4
Imunogenicita peptidů S a preS2 v povrchových antigenech získaných v Příkladech 2 a 3 (dále značených povrchový antigen 2 a povrchový antigen 3) byla potvrzena v souladu s následujícími pokusy na morčatech.
ml (200 g/ml) povrchového antigenu 2 nebo 3 byl smísen s 18 ml fosforečnanového pufru (pH7,2) obsahujícího 0,15M chlorid sodný a směs byla zfiltrována pomocí filtrační stříkačky mající vnitřní průměr 0,2 pm. Filtrát byl smíchán s 1 ml 3 % alhydrogelu (Superfos Biosector, Dánsko). Tato procedura byla provedena ve sterilních podmínkách na čistém stole.
Každému z jedenácti morčat vážících 350 g byl dvakrát v intervalu 15 dnů podán pod kůži 1 ml dříve připraveného kompozita povrchového antigenu 2 nebo 3. Po 30 dnech po první injekci byly morčatům odebrány krevní vzorky a byla z nich připravena séra. Séra byla analyzována pomocí Ausab aparátu a byla zjištěna 100% tvorba protilátek proti S peptidu povrchového antigenu nebo 3 a GMTs hodnoty povrchového antigenu 2 a 3 byly 33,38 a 29,77 mlU/ml.
Stupeň tvorby protilátek proti peptidu preS2 byl zjišťován v souladu s následující procedurou. 50 μΐ (1 mg/ml) peptidu preS2 s 26 N-koncovými aminokyselinami, který byl připraven pomocí peptidového syntetizátoru (Applied Biosystems, USA) za požití automatizované syntézy peptidu na pevné fázi, a 20 μΐ (10 mg/ml) póly L-lysinu bylo přidáno k 200 μΐ 50mM octanového pufru (pH 4,5). Ke směsi bylo přidáno 10 μΐ 1 % EDC (l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid) a vzniklá směs byla reagována 1 hodinu při 37 °C. Tato směs pak byla zředěna 20 ml lOmM uhličitanového pufru (pH 9,6) a nanesena na mikrotitrační desku ELISA s 96 jamkami, 200 μΐ do každé jamky. Deska byla inkubována 20 h za laboratorní teploty za adsorpce peptidu na povrchu jamek a pak třikrát omyta destilovanou vodou.
Do jamek bylo přidáno 250 μΐ/jamku PBS obsahujícího 0,5 % kaseinu a mikrotitrační deska byla inkubována přes 2 h za laboratorní teploty za účelem prevence jakýchkoli nespecifických reakcí, ke kterým později dochází. Do každé jamky byl přidán pozitivní a negativní regulátor a 200 μΐ/jamku sér morčat, která byla postupně desetkrát zředěna PBS (pokusná skupina). Mikrotitrační deska byla inkubována 4 h za laboratorní teploty a pak pětkrát omyta TTBS pufrem (0,9% chlorid sodný, 0,05 % polysorbátu 20, 10 mM Tris, pH 7,5). Roztok obsahující morčecí anti-morče protilátku značenou křenovou peroxidázou (HRP), který byl zředěn 4000násobným objemem PBS obsahujícím 0,5 % kaseinu byl nanesen do jamek (200 μΐ/jamku). Výsledná mikrotitrační deska s jamkami byla inkubována při 37 °C 1 hodinu a pětkrát omyta TTBS pufrem.
Nato bylo přidáno do každé jamky 200 μΐ živného roztoku pro křenovou peroxidázu, který byl připraven rozpuštěním 200 μg tetramethylbenzidinu (TMB) v 20 μΐ DMSO, přidáním 10 ml 0,lM octanového pufru (pH 5,1) a 20 μΐ 30 % peroxidu vodíku a doplněním objemu roztoku na 20 ml destilovanou vodou, a reagováno do vývoje zbarvení. Dále bylo do každé jamky přidáno 50 μΐ 1 N kyseliny sírové k zastavení vývoje zbarvení a byla změřena optická hustota každé jamky při 450 nm Microplate snímačem (Dynatech MR5000, USA).
Pokud byla optická hustota pokusné skupiny větší než určitá hodnota (dvojnásobek hodnoty optické hustoty negativního provedení), bylo stanoveno, že se vytvořily protilátky proti peptidu preS2 a byla spočtena morčata s pozitivní protilátkovou reakcí.
Výsledkem toho bylo, že povrchové antigeny 2 i 3 vyvolaly 100 % tvorbu protilátek.
- 11 CZ 291024 B6
Příklad 5
Za účelem zjištění imunogenicity peptidu S apreS2 v povrchových antigenech 2 a 3 byly provedeny následující pokusy na myších, 1 ml (200 pg/ml) povrchového antigenu 2 nebo 3 byl smísen s 18 ml fosforečnanového pufru (pH 7,2) obsahujícího 0,15M chlorid sodný a směs byla zfiltrována pomocí filtrační stříkačky mající vnitřní průměr 0,2 pm. Filtrát byl smísen s 1 ml 3 % alhydrogelu (Superfos Biosector, Dánsko).
Vzniklý roztok obsahující 10 pg/ml povrchového antigenu 2 nebo 3 byl zředěn alhydrogelovým ředidlem (připraveným rozpuštěním alhydrogelu) na konečnou koncentraci 0,15 % a fosforečnanovým pufrem (pH 7,2) obsahujícím 0,15M chlorid sodný za přípravy 4 vzorků (0,01; 0,03; 0,09; 0,27 ng/ml) povrchového antigenu. Kontejnery obsahující vzorky byly dostatečně míchány, aby se předešlo srážení alhydrogelu. Tato procedura byla provedena ve sterilních podmínkách na čistém stole.
Osmdesát 5 týdnů starých myší bylo rozděleno do osmi skupin po deseti a každé myši byl peritoneálně (pobřišnice) podán dříve připravený zředěný roztok povrchového antigenu 2 nebo 3. Po 28 dnech od podání byly od všech myší odebrány krevní vzorky a byla z nich připravena séra. Tvorba protilátek proti S peptidu v povrchovém antigenu 2 nebo 3 byla analyzována pomocí Ausab aparátu (Abbot, USA) a stupeň jejich tvorby je uveden v Tabulce 1.
Tabulka 1
| Koncentrace povrchového antigenu (ng/ml) | Stupeň tvorby protilátek proti povrchovému antigenu (%) | |
| Povrchový antigen 2 | Povrchový antigen 3 | |
| 0,01 | 10 | 10 |
| 0,03 | 20 | 40 |
| 0,09 | 80 | 60 |
| 0,27 | 90 | 100 |
Protilátky proti preS2 peptidu v povrchovém antigenu 2 nebo 3 byly stanoveny v souladu s postupem v Příkladu 4 a stupeň jejich tvorby je uveden v Tabulce 2.
Tabulka 2
| Koncentrace povrchového antigenu (ng/ml) | Stupeň tvorby protilátek proti povrchovému antigenu (%) | |
| Povrchový antigen 2 | Povrchový antigen 3 | |
| 0,01 | 10 | 10 |
| 0,03 | 20 | 40 |
| 0,09 | 80 | 60 |
| 0,27 | 90 | 100 |
Efektivní dávka 50 (ED50) peptidu S apreS2 byla kalkulována podle příslušného způsobu (Finney. D. J., Probit Analysis, 1971) za použití výše získaného stupně tvorby protilátek. Výsledkem toho byla ED50 v povrchovém antigenu 2 peptidu S 0,0580 ng/ml a peptidu preS2 0,0577 ng/ml a v povrchovém antigenu 3 peptidu S 0,0455 ng/ml a peptidu preS2 0,0469 ng/ml. Protože je ale obsah peptidu preS2 v povrchovém antigenu 2 nebo 3 75 %, ED50 peptidu preS2 se považuje za nižší než jsou spočtené hodnoty získané výše.
- 12CZ 291024 B6
Jak ukazují výše uvedené Příklady, může být v souladu s předkládaným vynálezem zrekombinovaných kvasinkových buněk získán povrchový antigen hepatitidy B s vysokým obsahem peptidu preS2 a s vysoce imunogenními peptidy S a preS2.
Srovnávací příklad
Postup podle příkladu 1 byl zopakován s tím rozdílem, že krok přidání 5M hydroxidu sodného, kterým se pH roztoku upravilo na hodnotu 11,5 (v kroku 2), byl vynechán. Antigenicita roztoku získaného po odstředění byla pouze 63 % antigenicity pozorované v příkladu 1, zatímco optická hustota při 600 nm měla hodnotu 1,76, což je významně více než hodnota optické hustoty 0,07 pozorovaná v příkladu 1. Tyto výsledky ukazují, že pokud se vynechá krok alkalizace, antigenicita se sníží a množství kontaminujících proteinů se zvýší.
Konkrétně má krok získaný v příkladu 1 o 47 % vyšší antigenicitu než roztok získaný ve srovnávacím příkladu. Toto zvýšení antigenicity je způsobeno zvýšením výtěžku HbsAg-PreS2, zatímco způsob podle srovnávacího příkladu produkuje hlavně HbsAg obsahující peptid S s nízkou antigenicitou.
Ačkoli byl vynález popsán s ohledem na výše zmíněnou specifickou konkretizaci, tímto se říká, že ve vynálezu mohou být provedeny různé modifikace a změny technikami používanými v tomto oboru, na které se vynález rovněž vztahuje jak je uvedeno v připojených nárocích.
Claims (16)
1. Způsob izolace povrchového virového antigenů hepatitidy B obsahujícího peptid preS2 z buněk rekombinovaného organismu, vyznačující se tím, že se (a) rozruší buňky pomocí pufru obsahujícího chaotropní sůl, čímž se získá buněčný homogenát;
(b) přidá povrchově aktivní látka k buněčnému homogenátu získanému v kroku (a), čímž se extrahuje povrchový antigen z buněčné membrány buněk;
(c) alkalizací extraktu zvýší rozpustnost a podpoří se vznik částic povrchového antigenů v extraktu získaném v kroku (b);
(d) vysráží a odstraní se buněčné zbytky, lipidy a kontaminující proteiny z extraktu z kroku (c) okyselením a odstředěním extraktu, čímž se získá roztok obsahující povrchový antigen;
(e) uvádí roztok z kroku (d) do kontaktu se silikagelem, čímž dojde k adsorpci povrchového antigenů na silikagel, vymyjí se kontaminující proteiny adesorbuje se povrchový antigen ze silikagelu za použití pufru, čímž se získá frakce čištěného povrchového antigenů;
(f) provádí hydrofobní kolonová chromatografie s frakcí čištěného povrchového antigenů získaného v kroku (e), čímž se získá frakce obsahující povrchový antigen; a (g) čistí frakce získané v kroku (f) gelovou filtrační chromatografií se separací podle velikosti, čímž se získá povrchový antigen v čisté formě.
- 13 CZ 291024 B6
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že v kroku (a) se použije pufr obsahující chaotropní sůl vybranou ze skupiny skládající se zthiokyanidu sodného, guanidiumchloridu a močoviny.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že v kroku (a) se použije pufr s koncentrací chaotropní soli 1 až 8 M.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se dále přidá síran sodný nebo síran amonný k buněčnému extraktu získanému v kroku (b) nebo (c) v koncentraci 8 až 15 g na 100 cm3 buněčného extraktu, a následně se odstraní buněčné zbytky a kontaminující příměsi; a roztok se podrobí diafiltraci ještě před krokem (d).
5. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se v kroku (b) použije povrchově aktivní látka, kterou je polysorbát 20, polysorbát 80, polyoxyethylen-oktylfenylether nebo deoxycholát sodný.
6. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se v kroku (b) použije povrchově aktivní látka v koncentraci 0,1 až 0,5 g na 100 cm3 buněčného homogenátu.
7. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se v kroku (c) alkalizuje buněčný extrakt získaný v kroku (b) na pH 11,0 až 13,5.
8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se v kroku (d) upraví pH buněčného extraktu na 4,5 až 6,0.
9. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že v kroku (e) se použije silikagel s povrchem 100 až 500 m2/g.
10. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se v kroku (e) desorbuje povrchový antigen ze silikagelu za použití pufru s pH 8,8 až 11,0 a obsahem močoviny, jejíž koncentrace je 1 až 8 M, a povrchově aktivní látky v množství 0,1 až 0,3 g na 100 cm3 pufru.
11. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se jako povrchově aktivní látka použije deoxycholát sodný.
12. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako hydrofobní stacionární fáze v kroku (f) použije agarózový gel s fenylovými skupinami.
13. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že hydrofobní kolonová chromatografie v kroku (f) se provádí nanesením frakce obsahující povrchový antigen na kolonu ekvilibrovanou vyrovnávacím pufrem s pH 8,8 až 11,0 obsahujícím močovinu, jejíž koncentrace je 1 až 4 M; promyje se kolona vyrovnávacím pufrem obsahujícím 10 až 40% hmotnostních ethylenglykolu; a eluuje se povrchový antigen vyrovnávacím pufrem obsahujícím 60 až 80% hmotnostních ethylenglykolu.
14. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se gelová filtrační chromatografie se separací podle velikosti v kroku (g) provádí pomocí dextranového gelu nebo polyakrylamidu s maximální propouštěnou hodnotou molekulové hmotnosti 1 000 000.
15. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se gelová filtrační chromatografie se separací podle velikosti v kroku (g) provádí nanesením frakce obsahující povrchový antigen na kolonu ekvilibrovanou Tris nebo fosforečnanovým pufrem spH 6 až 8 obsahujícím chlorid
- 14CZ 291024 B6 sodný, jehož koncentrace je 0,1 až 0,2 M; a následně se eluuje povrchový antigen stejným pufrem.
16. Vakcína proti viru hepatitidy B, vyznačující se tím, že obsahuje povrchový 5 antigen izolovaný způsobem podle nároku 1.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR19940033594 | 1994-12-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ324795A3 CZ324795A3 (en) | 1996-06-12 |
| CZ291024B6 true CZ291024B6 (cs) | 2002-12-11 |
Family
ID=19400952
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19953247A CZ291024B6 (cs) | 1994-12-10 | 1995-12-08 | Způsob izolace povrchového virového antigenu hepatitidy B obsahujícího peptid preS2 a vakcína tento antigen obsahující |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6362320B1 (cs) |
| EP (1) | EP0716094B1 (cs) |
| KR (1) | KR960023066A (cs) |
| CN (1) | CN1057532C (cs) |
| AR (1) | AR002006A1 (cs) |
| AT (1) | ATE264341T1 (cs) |
| BG (1) | BG63699B1 (cs) |
| BR (1) | BR9505739A (cs) |
| CA (1) | CA2164672C (cs) |
| CO (1) | CO4480040A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ291024B6 (cs) |
| DE (1) | DE69532878T2 (cs) |
| DK (1) | DK0716094T3 (cs) |
| ES (1) | ES2217272T3 (cs) |
| JO (1) | JO1885B1 (cs) |
| PE (1) | PE56396A1 (cs) |
| PL (1) | PL182103B1 (cs) |
| PT (1) | PT716094E (cs) |
| RO (1) | RO113308B1 (cs) |
| RU (1) | RU2122430C1 (cs) |
| TR (1) | TR199501557A2 (cs) |
| UY (1) | UY24112A1 (cs) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA79735C2 (uk) * | 2000-08-10 | 2007-07-25 | Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. | Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах |
| KR100405174B1 (ko) * | 2001-02-02 | 2003-11-12 | 씨제이 주식회사 | 재조합 β형 간염바이러스 표면항원의 정제방법 |
| RU2205023C1 (ru) * | 2002-05-14 | 2003-05-27 | Закрытое акционерное общество "Медицинские технологии - "МТХ" | Способ получения поверхностного антигена вируса гепатита в из рекомбинантных клеток дрожжей hansenula polymorpha и вакцина для иммунизации против гепатита в |
| US20090017443A1 (en) * | 2004-05-19 | 2009-01-15 | Advanced Life Science Institute, Inc. | Method for Detection of Hepatitus B Virus |
| GB0522765D0 (en) * | 2005-11-08 | 2005-12-14 | Chiron Srl | Combination vaccine manufacture |
| RU2314125C1 (ru) * | 2006-04-25 | 2008-01-10 | Закрытое акционерное общество "Вектор-БиАльгам" | Способ получения инактивированной вакцины против вируса гепатита а |
| KR100948127B1 (ko) * | 2007-06-27 | 2010-03-18 | 주식회사 중앙백신연구소 | 복합호흡기 질환 돼지의 조직유제를 함유하는 백신 조성물 |
| AU2013330344B2 (en) | 2012-09-17 | 2018-07-05 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Chromatography media and devices |
| FR2997222B1 (fr) * | 2012-10-19 | 2015-01-16 | Alstom Technology Ltd | Dispositif d'etablissement et/ou de coupure de courant a contacts permanents a usure reduite |
| WO2015168383A1 (en) | 2014-05-02 | 2015-11-05 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Functionalized support material and methods of making and using functionalized support material |
| US10695744B2 (en) | 2015-06-05 | 2020-06-30 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Adsorbent biprocessing clarification agents and methods of making and using the same |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5340926A (en) * | 1983-03-25 | 1994-08-23 | Celltech, Limited | Process for the recovery of recombinantly produced protein from insoluble aggregate |
| US4649192A (en) * | 1985-05-30 | 1987-03-10 | Smith Kline-Rit | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate |
| US4816564A (en) * | 1986-01-31 | 1989-03-28 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
| EP0291146B1 (en) * | 1987-03-09 | 1993-09-01 | Merck & Co. Inc. | Purification of recombinant hepatitis b surface antigen |
| EP0310178A1 (en) * | 1987-09-30 | 1989-04-05 | Merck & Co. Inc. | Recovery of pres2+S antigen |
| EP0314240A3 (en) * | 1987-10-26 | 1990-03-28 | Merck & Co. Inc. | Process for purifying recombinant hepatitis antigens |
| US5004688A (en) * | 1988-04-15 | 1991-04-02 | Phillips Petroleum Company | Purification of hepatitis proteins |
| US5030720A (en) * | 1988-09-01 | 1991-07-09 | Merck & Co., Inc. | Pres2+S hepatitis B vaccine derived from plasma |
| EP0384058A1 (en) * | 1989-02-09 | 1990-08-29 | Development Center For Biotechnology | Isolation of hepatitis B surface antigen from transformed yeast cells |
| CU22290A1 (es) * | 1990-10-08 | 1995-01-31 | Cigb | Procedimiento para la obtencion de antigeno de superficie del virus de la hepatitis b de superior capacidad inmunoganica y su uso en un preparado vacunal |
-
1995
- 1995-11-29 KR KR1019950044795A patent/KR960023066A/ko active Granted
- 1995-12-07 PE PE1995286655A patent/PE56396A1/es not_active Application Discontinuation
- 1995-12-07 CA CA002164672A patent/CA2164672C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-07 JO JO19951885A patent/JO1885B1/en active
- 1995-12-07 CO CO95057860A patent/CO4480040A1/es unknown
- 1995-12-08 PT PT95119383T patent/PT716094E/pt unknown
- 1995-12-08 BG BG100212A patent/BG63699B1/bg unknown
- 1995-12-08 DK DK95119383T patent/DK0716094T3/da active
- 1995-12-08 RU RU95120587A patent/RU2122430C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-12-08 ES ES95119383T patent/ES2217272T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-08 DE DE69532878T patent/DE69532878T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-08 RO RO95-02141A patent/RO113308B1/ro unknown
- 1995-12-08 PL PL95311735A patent/PL182103B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-12-08 EP EP95119383A patent/EP0716094B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-08 AT AT95119383T patent/ATE264341T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-12-08 CZ CZ19953247A patent/CZ291024B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-12-11 BR BR9505739A patent/BR9505739A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-12-11 AR ARP950100498A patent/AR002006A1/es active IP Right Grant
- 1995-12-11 CN CN95120408A patent/CN1057532C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-11 TR TR95/01557A patent/TR199501557A2/xx unknown
- 1995-12-11 UY UY24112A patent/UY24112A1/es not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-11-02 US US09/432,300 patent/US6362320B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BG63699B1 (bg) | 2002-09-30 |
| EP0716094A1 (en) | 1996-06-12 |
| PT716094E (pt) | 2004-08-31 |
| CN1132211A (zh) | 1996-10-02 |
| PE56396A1 (es) | 1996-12-14 |
| CO4480040A1 (es) | 1997-07-09 |
| PL182103B1 (pl) | 2001-11-30 |
| RU2122430C1 (ru) | 1998-11-27 |
| BG100212A (bg) | 1996-12-31 |
| KR0177254B1 (cs) | 1999-04-01 |
| EP0716094B1 (en) | 2004-04-14 |
| DE69532878T2 (de) | 2005-06-09 |
| CA2164672A1 (en) | 1996-06-11 |
| DE69532878D1 (de) | 2004-05-19 |
| CA2164672C (en) | 2004-06-22 |
| BR9505739A (pt) | 1997-12-23 |
| UY24112A1 (es) | 1996-05-10 |
| CZ324795A3 (en) | 1996-06-12 |
| CN1057532C (zh) | 2000-10-18 |
| JO1885B1 (en) | 1997-12-15 |
| ES2217272T3 (es) | 2004-11-01 |
| AR002006A1 (es) | 1998-01-07 |
| DK0716094T3 (da) | 2004-07-26 |
| KR960023066A (ko) | 1996-07-18 |
| ATE264341T1 (de) | 2004-04-15 |
| RO113308B1 (ro) | 1998-06-30 |
| TR199501557A2 (tr) | 1997-03-21 |
| PL311735A1 (en) | 1996-06-24 |
| US6362320B1 (en) | 2002-03-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5559847B2 (ja) | ワクチンに使用するためのｈｂｖ抗原の精製 | |
| KR940005588B1 (ko) | 효모에서 b형 간염 바이러스 단백질을 제조하는 방법 | |
| US4649192A (en) | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate | |
| CZ291024B6 (cs) | Způsob izolace povrchového virového antigenu hepatitidy B obsahujícího peptid preS2 a vakcína tento antigen obsahující | |
| AU2001282073A1 (en) | Purification of HBV antigens for use in vaccines | |
| JP4523164B2 (ja) | ワクチン | |
| KR101320702B1 (ko) | 절단된 ｈｂｃ 코어 단백질과 사포닌계 보조제를 포함하는백신 | |
| EP0005864A1 (en) | Antigenic composition useful as a vaccine or vaccine intermediate, and process for preparing same | |
| EP0294071A2 (en) | Hepatitis B vaccines made with pre-formed aluminum hydroxide gels, and processes thereof | |
| EP1256804B1 (en) | HBcAg expression and diagnostic and therapeutic uses | |
| KR100194247B1 (ko) | 재조합 b형 간염 표면 항원의 정제방법 | |
| KR0159716B1 (ko) | B형 간염 표면 항원의 정제방법 | |
| RU2205023C1 (ru) | Способ получения поверхностного антигена вируса гепатита в из рекомбинантных клеток дрожжей hansenula polymorpha и вакцина для иммунизации против гепатита в | |
| ES2393963T3 (es) | Expresión de HBcAg y utilizaciones terapéuticas y de diagnóstico | |
| TWI311563B (en) | Method for production a stable,immunogenic hepatitis b vaccine without trace of thiomersal | |
| KR100254828B1 (ko) | 재조합 효모로 부터 발현된 b형 간염 항원의 추출 방법 | |
| JPS60258127A (ja) | Ｂ型肝炎ワクチンの製造方法 | |
| HK1126228B (en) | Vaccines comprising truncated hbc core protein plus saponin-based adjuvants |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20061208 |