BG100212A - Метод за пречистване на повърхностен антиген на вируса на хепатит в, съдържащ пептида pres2 - Google Patents
Метод за пречистване на повърхностен антиген на вируса на хепатит в, съдържащ пептида pres2 Download PDFInfo
- Publication number
- BG100212A BG100212A BG100212A BG10021295A BG100212A BG 100212 A BG100212 A BG 100212A BG 100212 A BG100212 A BG 100212A BG 10021295 A BG10021295 A BG 10021295A BG 100212 A BG100212 A BG 100212A
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- surface antigen
- buffer
- process according
- range
- hepatitis
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 163
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 163
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 163
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 65
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 49
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 56
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 49
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 46
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 46
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 28
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 27
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 26
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 22
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 21
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 15
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 15
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 13
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 11
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 7
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 7
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 7
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 6
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 6
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 5
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 claims description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 5
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- -1 bile acid sodium salt Chemical class 0.000 claims description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 229940116357 potassium thiocyanate Drugs 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 claims description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 claims 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims 1
- SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N hepatitis b vaccine Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N 0.000 claims 1
- 229940124736 hepatitis-B vaccine Drugs 0.000 claims 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 abstract description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 25
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 9
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 9
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 8
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 8
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 3
- 229910002019 Aerosil® 380 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 2
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 150000003567 thiocyanates Chemical class 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 102100032965 Myomesin-2 Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 101150115433 SLC26A5 gene Proteins 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101710137302 Surface antigen S Proteins 0.000 description 1
- 241001105470 Valenzuela Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N ammonium thiocyanate Chemical compound [NH4+].[S-]C#N SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- RLDQYSHDFVSAPL-UHFFFAOYSA-L calcium;dithiocyanate Chemical compound [Ca+2].[S-]C#N.[S-]C#N RLDQYSHDFVSAPL-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- HDFXRQJQZBPDLF-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].OC([O-])=O.OC([O-])=O HDFXRQJQZBPDLF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229910021424 microcrystalline silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000009965 odorless effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000009993 protective function Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000011110 re-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Public Health (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Методът намира приложение за пречистване на повърхностен антиген на вируса на хепатит в, включващ рrе s2 пептид, от клетките на рекомбинантен организъм. Клетките се разпадат с помощта на буфер, съдържащ хаотропична сол.
Description
Област на изобретението
Настоящето изобретение се отнася до процес за пречистване на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген, включващ preS2 пептид, и по-специално се отнася до процес за пречистване на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген, включващ preS2 пептид от рекомбинирана клетъчна среда, който процес включва етап на клетъчно разпадане, при който се предотвратява загуба на preS2 пептид чрез използуване на хаотропична сол, и последващи извличане, преципитиране, адсорпция при наличие на силициев двуокис и колонна хроматография.
История на изобретението
Хепатид Бе е един от широко разпространените обществени здравни проблеми като средно около 200-300 милиона от населението на Земята са носители на вируса на хепатит Бе (HBV).
Инфекцията, причинена от вируса на хепатит Бе, често преминава в цироза и рак на хепатитната клетка, водещи до вероятна смърт на пациента.
Досега не е открито лекуващо хепатит Бе средство, поради което се набляга на значимостта на ваксините.
Блумберг извлича Австралийски антиген от кръвта на заразени с хепатит Бе пациенти през 1955 година.
Кругман съобщава през 1971 година за метод за активна имунизация, използуващ топлинно обработен човешки серум, съдържащ вирус на хепатит Бе, като предлага възможност за създаване на ваксина. Оттогава първите поколения ваксини срещу хепатит Бе, получени чрез отделяне и филтриране на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген от кръвна плазма на заразени с вируса пациенти, се разпространяват масово (М. R. Hilleman et al., Develop. Bio. Standard, 54, 3-12 (1983)).
Ваксините, получени от кръвна плазма, имат следните недостатъци: процесите им на филтриране и инактивация са трудни за реализация и изискват значителни разходи; доставките на човешка кръв са ограничени; ваксиниран човек може да бъде заразен с патогени от кръвен източник.
За разрешаване на гореизложените проблеми чрез изследвания в областта на генното инженерство се правят опити за откриване на ваксини срещу хепатит Бе. Например, Валенцуела реализира процес за производство на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген в клетъчна среда (Nature, 293, 347-350(1982)).
Рекомбинираният хепатит Бе вирусен повърхностен антиген (r-HBsAg) се състои основно от S протеин (Р25) с 226 аминокиселини и при филтриране образува повърхностни антигенови частици, които са почти идентични с тези от хепатит Бе вирусния повърхностен антиген, получен от кръвна плазма.
К. X. Хеерман прави изявление, че хепатит Бе вирусният обвиващ протеин съдържа значителни количества от L-протеин (preS1+preS2+S:P39) и М-протеин (preS2+S:P31), както и S-протеин (J. Virol., Nov., 396-402 (1984)).
Известно е, че preS2 пептидът изпълнява важна роля по отношение на атаката на вируса на хепатит Бе срещу черния дроб след заразяване на човешкото тяло. PreS2 пептидът, който се състои от 53 аминокиселини, е доказал действието си при формирането на антитела срещу повърхностния антиген при експерименти с животни. (D. R. Milich et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 82, 8168-8172 (1985)).
Известно е, че антителата, формирани срещу preS2 пептида, изпълняват защитна функция срещу вирусна инфекция (Y. Ito et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 83, 9174-9178 (1986)). Нещо повече, ваксина, съдържаща preS2 пептид, може да бъде полезна за човек, който не може да създава антитела срещу съществуващ вече повърхностен антиген. Създаването на такава ваксина е важно и за защитата от инфекция от новооткрити типове на вируса на хепатит Бе.
Тъй като preS2 пептидът е силно чувствителен към протеаза в клетъчната среда, приготвянето на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген, съдържащ preS2 пептид, се сблъсква с различни трудности. За да бъдат преодолени тези трудности, Кобаяши създава ваксина, която се приготвя чрез генетично видоизменяне на протеаза-чувствителния участък между preS2 и S пептидите (J. Bacteriology, 8,1-22(1988)); U. S. патент No 4,742,158 разкрива процес за създаване на ваксина, съдържаща preS пептид, при която ваксина пептидът се предпазва от протеазна атака посредством употреба на протеазен задържащ фактор в етапа на разрушаване на клетката.
Ефектът от генетичното видоизменяне по Кобаяши върху активността на preS2 пептида не е изцяло охарактеризиран, а последният споменат процес е практически неприложим, т. к. протеаза задържащите фактори са прекалено скъпи за масово използуване в процеса на филтриране. Нещо повече, нивото на preS2 пептида не може да се поддържа извън определено количество независимо от количеството на добавените протеаза-задържащи фактори, когато времето за филтриране се удължи при нарастване по скалата на филтриране или при необходимост.
Европейски патент No 0337 492 А1 предлага процес за пречистване на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген от култура на Pichia sp, посредством използуване на калиев тиоцианат. Калиевият
-3тиоцианат се прилага за увеличаване количеството на мастноразтворимите протеини, а като цяло процесът има за цел пречистването на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген, съдържащ само S пептид. Когато хепатит Бе вирусният повърхностен антиген съдържа и preS2 пептид, състоящ се от 55 аминокиселини, преди S пептида, състоящ се от 226 аминокиселини, то той има имунологични качества, подобни на тези на повърхностен антиген, съдържащ само S пептид, защото способностите за образуване на антитела и създаване на имунитет на S пептидната половина са еднакви.
Двата повърхностни антигена са неминуемо различни във физико-химичните си свойства. В частност preS2 пептидът е достатъчно хидрофилен, за да бъде изложен на повърхността на антигенна частица, и съответно оказва значително влияние върху процедурата на филтриране.
Разработени са различни процеси за филтриране на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген, включващи preS2 пептид.
Европейски патент No 0130178 А1 описва процес за филтриране на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген, включващ preS2 пептид, който процес се характеризира с отделяне на повърхностния антиген, използувайки две течни фази, приготвени чрез прибавяне на определени количества декстран и гликол към клетъчния екстракт. Този процес притежава следните недостатъци: отделеният повърхностен антиген не е достатъчно пречистен; не е подходящ за широкомащабни процеси на филтриране, т. к. декстранът и полиетилен гликолът са скъпи; процесът е неикономичен благодарение на факта, че за отстраняване на използуваните вещества е необходима допълнителна процедура.
U. S. патент No 4,742,158 описва процес за филтриране на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген, който процес се състои от: приготвяне на клетъчен екстракт в присъствието на различни протеазазабавящи фактори и филтриране на повърхностния антиген посредством серия от стъпки за колонно хроматографично отделяне, използуващи сходна по свойства колона, приготвена чрез добавяне на човешки серум албуминов полимер към гел-образната матрица (междуклетъчно вещество), както и хидрофобна колона с активно вещество. Недостатъци на този процес се явяват: използуваните задържащи фактори са много скъпи; афинитетната колона не е подходяща за филтриране на големи количества; необходима е специална процедура за отстраняване на веществата, използувани в хидрофобната колонна хроматография.
Кобаяши също така представя процес за пречистване на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген, включващ preS2 пептид (J. of Biotechnology, 8,1-22 (1988)). Този процес не е подходящ за филтриране на големи количества, т. к. използува имуноафинитетна колона, което дава като резултат малко количество.
Корейски патент No 065305 представя процес за филтриране на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген, който включва
-4рН преципитация и смяна на силициев двуокис и анионни колонни хроматографии. Този процес притежава неудобството, че е трудно поддържането на съдържанието на preS2 пептида на подходящо ниво, т. е. preS2 пептидът се извлича от протеази по време на началния етап на процеса.
Все още съществува необходимост от ефективен процес за пречистване на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген, съдържащ preS2 пептид.
Задача на изобретението
Задача на изобретението е да представи процес за пречистване на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген, включващ preS2 пептид, от клетъчна закваска в достатъчно чисто състояние, за да бъде директно приложим във ваксина.
В съответствие с изобретението е представен процес за пречистване на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген, включващ preS2 пептид, изразен в рекомбиниран организъм, характеризиращ се с това, че клетките на последния се разрушават чрез използуване на буфер, съдържащ хаотропична сол.
Описание на чертежите
Едно примерно изпълнение на изобретението се представя посредством:
фиг. 1 показва резултата от 15% натриев додецил сулфат поликриламиден гел електрофорезис (SDS-PAGE), който променя съдържанието на preS2 пептида в хепатит Бе вирусния повърхностен антиген, когато повърхностният антиген, включващ preS2 пептид, се пречиства в присъствието на калиев тиоцианат в ролята на хаотропична сол.
Подробно описание на изобретението
Настоящото изобретение представлява процес за пречистване на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген, включващ preS2 пептид, изразен в рекомбиниран организъм, който се характеризира с това, че клетките на оргамизма се разрушават посредством използуване на буфер, съдържащ хаотропична сол, за минимизиране на загубите на preS2 пептид. Употребата на буфер, съдържащ хаотропична сол за разпадане на клетките, стимулира образуването на хепатит Бе вирусни повърхностни антигенови частици и защитава preS2 пептида от протеазна атака, която в общия случай се наблюдава по време на началния стадий на филтрирането, и по този начин поддържа съдържанието на preS2 пептида на постоянно ниво до приключване на процеса на пречистване.
Изобретението може да бъде приложено към процес за филтриране на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген, който се получава в който и да е подходящ рекомбиниран организъм, за предпочитане рекомбинирана клетъчна закваска Saccharomyces cerevisiae.
-5Подходящи хаотропични соли, които могат да бъдат използувани в настоящото изобретение, са натриев тиоцианат, калиев тиоцианат, амониев тиоцианат, гуанидиев хидрохлорид и CO(NH); за предпочитане е натриевият тиоцианат.
Всяка общоприета буферна система, напр. фосфатен буфер и Tris буфер, може да бъде използувана за разпадане на клетката в процеса, обект на изобретението; за предпочитане е pH да бъде в обхвата от 6 до 8. Концентрацията на хаотропична сол в буфера може да варира в диапазона от 1 до 8 М, за предпочитане от 1 до 3 М.
Когато рекомбинираната клетка се разпада посредством буфер с хаотропична сол, останалата част от процеса на пречистване може да се изпълни като се използува всяко съчетание от общоприетите стъпки за пречистване, независимо че за предпочитане са:
а/ прибавяне на вещества към клетъчната хомогенност на рекомбинираната клетка за извличане на повърхностен антиген от клетъчната мембрана;
б/ увеличаване на разтворимостта и стимулиране образуването на частици на повърхностния антиген в екстракта, получен при стъпка (а) посредством придаване електролитни свойства на екстракта;
в/ преципитация и отстраняване на клетъчните остатъци, липиди и замърсени протеини от екстракта, обработен през стъпка (б) чрез окисляване и центруфугиране за получаване на разтвор, съдържащ повърхностния антиген;
г/ свиване на получения през стъпка (в) разтвор със силициев двуокис с цел адсорбиране на повърхностния антиген от силиция, отмиване на замърсените протеини и десорбиране на повърхностния антиген от силициевия двуокис посредством буфер;
д/ подлагане на получения през стъпка (г) пречистен повърхностен антиген на хидрофобна колонна хроматография за получаване на фракции, съдържащи повърхностния антиген, и е/ пречистване на получените през стъпка (д) фракции чрез гел-филтрираща хроматография за получаване на повърхностен антиген в чист вид.
Подходящи вещества, които могат да се използуват през стъпка (а) за извличане на повърхностния антиген от клетъчната мембрана, включват: Tween 20, Tween 80, Triton Х-100 и натриева сол на жлъчната киселина, като за предпочитане е Tween 20. Веществото може да се използува в диапазона от 0.1 до 0.5% (тегло/обем), за предпочитане от 0.1 до 0.2% (тегло/обем), въз основа на количеството на хомогенните клетки.
За увеличаване на разтворимостта на повърхностния антиген в клетъчната хомогенност и подпомагане образуването на частиците му се препоръчва увеличаване на pH на повърхностния антигенов екстракт в обхват от 11.0 до 13.5 посредством използуване на
-6основа, за предпочитане натриев хидроокис и калиев хидроокис. Този процес на придаване на електролитни свойства се счита, че подпомага образуването на частиците на хепатит Бе вирусния повърхностен антиген чрез увеличаване на междумолекулната дисулфидна връзка и отделяне на замърсените протеини от повърхностния антиген посредством увеличената разтворимост. След това е препоръчително екстрактът да се остави при стайна температура в интервала от 0 до 30 С за време от 0.5 до 1 час. Тогава екстрактът се окислява, за да преципитират клетъчните отпадъци, липиди и замърсени протеини, при което pH на екстракта се намалява до обхват от 4.5 до 6.0. Киселините, които могат да бъдат използувани в този етап, включват всяка една от неорганичните или органични киселини, като за предпочитане е от 10 до 30% разтвор на оцетната киселина. Киселинната реакция може да бъде изпълнена при температурен интервал от 0 до 30 С за време от 0.5 до 2 часа, като за предпочитане е да се разбърква разтворът.
Окисленият екстракт се центруфугира за отстраняване на явилите се като резултат от преципитацията вещества и за получаване на повърхността на течност, съдържаща повърхностния антиген. Като преимущество на тази процедура се явява фактът, че в един етап на обикновено центруфугиране се отстраняват клетъчните отпадъци, липиди и замърсени протеини и съдържанието на повърхностен антиген е високо благодарение на първоначалния етап на разтваряне на повърхностния антиген в областта на наситено състояние на pH.
Увеличаването и след това намаляването на pH на клетъчния екстракт стабилизира свойството за образуване на частици на повърхностния антиген и е ефикасно при отстраняването на липидите и замърсените протеини.
Когато се използува тиоцианат като хаотропична сол в етапа на клетъчно разпадане, в етапа на окисляване може да се отдели неприятна миризма. Самата тиоцианатова сол е безцветно,без мирис и безвредно съединение, а тиоцианатовият йон е напълно стабилен в разтвор. Нещо повече, миризмата, получена по време на окислителния процес, се счита, че произхожда от реакциите на тиоцианата с някои вещества в клетъчния екстракт. Тази миризма може да бъде поносима за оператора в случаите на малко по обем пречистване, но при поголеми количества е препоръчително да се отстрани тиоцианатът преди етапа на окисляване.
Например тиоцианатът може да бъде отстранен чрез прибавяне на подходяща сол към клетъчния екстракт с цел преципитиране на тиоцианатната сол заедно с някои от замърсените протеини веднага след получаването им, т. е. стъпка (а),отстраняване на преципитиралите вещества, т. е. центруфугиране, и филтриране на получената течност. Повърхностният антиген не се втвърдява по време на тази процедура. Отстраняването на тиоцианата се осъществява успоредно с отстраняването на част от замърсените протеини, което улеснява последващите процеси на пречистване.
-7Предпочитаните соди, които могат да се използуват в процедурата за обезмирисяване на тиоцианата, включват соли на заредени аниони, например натриев сулфат и амониев сулфат, в концентрация от 8 до 15% (тегло/обем). След извличане на повърхностния антиген от клетъчната мембрана се прибавя солта като реакцията може да протече при стайна температура за 0.5 до 2 часа със или без разбъркване. Получените преципитирали вещества се отстраняват по някой от общоприетите методи, например центруфугиране, за получаване на течност, съдържаща повърхностния антиген.
Получената течност се подлага на повторно филтриране за отстраняване на тиоцианата и сулфата. Използуваният през този етап буфер е препоръчително да има pH в интервала от 6 до 8. При завършване на процедурите по обработка със сол, центруфугиране и филтриране получената течност се подлага на процесите, описани в стъпки (б) и (в).
Течността, получена през стъпка (в), в която се съдържа повърхностният антиген, се обработва със силиций, използувайки колонен или сериен метод като последният е за предпочитане.
Подходящ вид силиций за приложение през този етап е микрокристалинният силиций с площ от 100 до 500 кв. м/г като за предпочитане е Aerosil 380 (Дегуса, Германия). Течността, съдържаща повърхностния антиген, осъществява контакт със силиция при pH в интервала от 6 до 8 и температурен интервал от 4 до 30 С за време от 2 до 16 часа при усърдно разбъркване. Количеството на сухия силициев двуокис за адсорбцията на повърхностния антиген е препоръчително да бъде около 5% (тегло/тегло) въз основа на теглото на клетъчната маса. Повърхностният антиген - силициев комплекс, се отделя от разтвора по един от общоприетите методи, например центруфугиране. След това комплексът се се измива три пъти с буфер с pH в интервала от 6 до 8, за предпочитане - натриев фосфатен, натриев хлориден буфер, за отстраняване на утаените замърсени протеини от силиция.
Повърхностният антиген може да бъде отделен от силициевия двуокис чрез свързване на комплекса с подходящ буфер за около два часа. Буфер с pH в интервала от 8.8 до 11.0, за предпочитане натриев карбонатен-натриев бикарбонатен буфер, е подходящ за използуване през тази стъпка. Буферът може да съдържа урея с концентрация от1 до 8 М и активно вещество - за предпочитане натриева сол на жлъчната киселина, с концентрация от 0.1 до 0.3 wt%. Тогава силицият се отстранява от разтвора по някой от общоприетите методи, например центруфугиране, за получаване на течност, съдържаща повърхностния антиген. Когато натриевата сол на жлъчната киселина се използува по време на десорбцията, се налага отстраняването му чрез повторно филтриране.
Получената по горепосочения начин течност, съдържаща повърхностния антиген, може в последствие да се пречисти с
-8хидрофобна колонна хроматография, в която хидрофобният клей е препоръчително да бъде агаров гел с пенилова утайка.
Преди контакта между течността и хидрофобния клей, последният се еквалибрира с буфер с pH в диапазона от 8.8 до 11.0, който може да бъде същият буфер, използуван в предишната стъпка. Препоръчително е буферът да съдържа урея с концентрация от 1 до 4М за отстраняване в максимална степен на замърсените протеини, които са по-малко хидрофобни в сравнение с повърхностния антиген. Тогава течността, съдържаща повърхностния антиген, се прекарва през колоната , за да влезе в контакт със запълващия материал. Колоната се измива основно с еквалибрирания буфер, съдържащ 10-40 wt% етилен гликол.
Хидрофобната колонна хроматография представлява ефикасен процес на пречистване, в който повечето от оставащите замърсени вещества в течността след силициевата адсорбция могат да бъдат отстранени. В частност повишаващите температурата материали, трудно отстраними по някой от общоприетите методи, могат да бъдат отстранени през тази стъпка. Уреята и етилен гликолът, които остават във фракциите, съдържащи повърхностния антиген, могат да бъдат отстранени например чрез диализа или повторно филтриране, при които за предпочитане се използува буфер с pH в интервала от 6 до 8.
Фракциите, съдържащи повърхностния антиген, получен от хидрофобната колонна хроматография, в последствие се пречистват посредством клей изключваща гел филтрираща хроматография до степен, в която пречистеният антиген може да бъде използуван при приготвянето на ваксина.
Най-удачните полярни матрици, които могат да бъдат използувани като колонен запълващ материал включват агаров гел, декстринов гел и полиакриламиден гел с молекулно тегло с най-малка прагова стойност 1,000,000, за предпочитане - от 5,000 до 500,000. Клей изключващата гел филтрираща хроматография се осъществява чрез преминаване на фракциите, съдържащи повърхностния антиген, през колона, еквалибрирана с Tris или фосфатен буфер с pH в интервала от 6 до 8, която съдържа натриев хлорид с концентрация от 0.1 до 0.2 М и промиване на повърхностния антиген със същия буфер.
Фракциите, съдържащи повърхностния антиген, са комбинирани и чистотата на повърхностния антиген и съдържащия се в него preS2 пептид са определени със SDS-PAGE.
Проверен в различни експерименти в следващите примери, повърхностният антиген, пречистен съгласно процеса, обект на настоящото изобретение, е така пречистен и съдържанието на preS2 пептида в него е достатъчно наситено, че пречистеният антиген може директно да се използува при приготвяне на ваксина.
Следващите примери служат за допълнително илюстриране на настоящото изобретение без ограничение на обхвата. Нещо повече, процентите, представени в тях за твърдо вещество в твърда смес, течност в течност и твърдо вещество в течност, са на основата на тегло/тегло, обем/обем и тегло/обем съответно, ако не е указано друго.
-9Пример 1 (Стъпка 1) Разпадане на клетката
Рекомбинираният Saccharomyces cerevisiae VCTC 0098ВР, който е в състояние да изяви хепатит Бе повърхностен антиген, включващ preS2 пептид, е култивиран при 27 С в 301 от YEPD среда (1% екстракт, 2% пептон, 1.6% глюкоза). 70 g от клетъчното вещество, получено по този начин, са смесени с 140 ml буфер 1 (50 тМ Tris, pH 7.2, 1 М натриев тиоцианат, 0.15 М натриев хлорид, 10 тМ етилен диамин, тетра оцетна киселина (EDTA) и 1 тМ фенил метил сулфонил флурид (PMSF)), а сместа е в контейнер с уред за разбиване (Биоспек Продъктс, Окла, САЩ), съдържащ 210 ml стъклени зърна с диаметър 0.5 тт.
Контейнерът е потопен в ледена вода и уредът за разбиване се задействува три пъти на 15 минутни интервали, всеки от които е с времетраене 5 минути. Получената клетъчна хомогенност е отделена от стъклените зърна, последните са измити с 210 ml от буфер 1 и полученият разтвор се смесва с клетъчната хомогенност.
(Стъпка 2) Извличане и разпадане на повърхностния антиген
Към клетъчната хомогенност, получена през стъпка 1, са прибавени 0.1% (тегло/обем) от Tween 20 и сместа се разбърква при стайна температура за 2 часа.
Разтворът е приспособен към pH 11.5 чрез прибавяне на 5 N натриев хидроокис и е разбъркван за 1 час при стайна температура. Полученият разтвор е приспособен към pH 5.2 чрез добавяне на 20% оцетна киселина; разбъркван е при стайна температура за 30 минути, след което е оставен да престои в продължение на 30 минути. Разтворът е центруфугиран при 8°С за отстраняване на клетъчните остатъци заедно с преципитиралите вещества.
Течността, съдържаща повърхностния антиген, е приспособена към pH 7.2 чрез прибавяне на 5 N натриев хидроокис. В този момент количеството на течността е 300 ml.
(Стъпка 3) Адсорбция и десорбция чрез използуване на силициев двуокис
Сухият силициев двуокис е смесен с вода за получаване на 5% разтвор (сухо тегло/обем разтвор), 70 ml от който е добавен към течността, получена през стъпка 2, като сместа се разбърква за 2 часа при стайна температура. Полученият разтвор се центруфугира при 5,500 оборота в минута за 10 минути за отстраняване на течността, а преципитиралият силициев двуокис, адсорбирал повърхностния антиген, се промива два пъти с фосфатен буфер (pH 7.2), съдържащ 0.15 М натриев хлорид.
- 10Промитият силициев двуокис се прибавя към 70 ml от 50 тМ карбонатен буфер (pH 9.5), съдържащ 1 М урея, като сместа се разбърква при стайна температура за 1 час до отделяне на повърхностния антиген от силициевия двуокис. В този момент буферът показва pH 9.2. Разтворът се центруфугира (Бекман Jal4 ротор) при 12,000 об/минута за 30 минути с цел получаване на течност, съдържаща повърхностния антиген.
Количеството хепатит Бе вирусен повърхностен антиген в течността е около 6.5 mg при измерване с Auzyme апаратура (Абот, САЩ).
Пример за сравнение
Процедурите, посочени в пример 1, се повтарят с изключение на това, че натриевият тиоцианат не е включен в буфер 1 за получаване на пречистен разтвор на повърхностен антиген. Като резултат количеството на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген в течността е около 7.1 mg при измерване с Auzyme апаратура.
Разтворите на повърхностния антиген, получени в Примера и Примера за сравнение, са подложени на действието на 15% натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел електрофереза (SDS-PAGE), последвана от сребристо оцветяване. Резултатът е посочен на фиг. 1, където линии 1 и 2 представят разтвори на повърхностния антиген, получени в Пример 1 и Примера за сравнение съответно. Тук А изразява цяла протеинова връзка; В и С изобразяват протеиновите фрагменти, получени от протеазната атака.
Както е показано на фиг. 1, повърхностният антиген, включващ високо съдържание на preS2 пептид, може да бъде пречистен от клетъчна среда в съответствие с процеса, обект на настоящото изобретение.
Пример 2 (Стъпка 1) Разпадане на клетъчната среда
Рекомбиниран Saccharomyas cerevisiae КСТС 0098ВР, който е в състояние да изрази хепатит Бе повърхностен антиген, включващ preS2 пептид, се култивира при 27вС в 300 1YEPD среда. 3 kg клетъчно вещество, получено по този начин, се смесва с 6 1 буфер 1 и получената смес преминава два пъти през Диномил (Гленмилс, Япония), съдържащ 3 1 стъклени зърна с диаметър 0.5 тт, при 10°С и скорост на потока 650 ml/min за разрушаване на клетъчната среда.
Получената клетъчна хомогенност се отделя от стъклените зърна. Те се измиват с 91 от буфер 1; отмитият разтвор се смесва с клетъчната хомогенност. Количеството хепатит Бе вирусен
- 11 повърхностен антиген в течността е около 754 mg при измерване с Auzyme апаратура.
(Стъпка 2) Извличане и разпадане на повърхностния антиген
Към клетъчната хомогенност, получена през стъпка 1, се прибавя 0.1% (тегло/обем) от Tween 20 като сместа се разбърква за 2 часа на стайна температура.
Разтворът се приспособява към pH 11.5 чрез прибавяне на 5 N натриев хидроокис и се разбърква за 1 час при стайна температура. Полученият разтвор се приспособява към pH 5.2 чрез добавяне на 20% оцетна киселина; разбърква се за 30 минути при стайна температура, след което се оставя да престои за 30 минути.
Разтворът се центруфугира при 8 С за отстраняване на клетъчните остатъци заедно с преципитиралите вещества.
Течността, съдържаща повърхностния антиген, се приспособява към pH 7.2 чрез добавяне на 5 N натриев хидроокис. Като резултат обемът на течността е около 12 1, а количеството на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген в нея е около 1,250 mg, измерени с Auzyme апаратура.
Количеството повърхностен антиген е 165.8% на основата на количеството повърхностен антиген, определено през стъпка 1. Този неочаквано висок резултат се дължи главно на общите действия на течността и електролита, които увеличават антигенността и улесняват разтворимостта на повърхностния антиген.
(Стъпка 3) Адсорбция и десорбция при наличието на силициев двуокис
Течността, получена при стъпка 2, се размива двукратно с 0.15 М натриев хлорид и след това се адсорбира от силициевия двуокис в съответствие със следната процедура: сухият силициев двуокис се смесва с вода за получаване на 10% полу-течен разтвор (сухо тегло/обем на разтвора), 1.5 1 от който се прибавя към течността, получена при стъпка 2; сместа се разбърква за една нощ при температура 4°С.
Полученият разтвор се центруфугира при 5,500 об./мин. в продължение на 10 минути за отстраняване на течността като преципитиралият силициев двуокис, адсорбирал повърхностния антиген, се промива два пъти с фосфатен буфер (pH 7.2), съдържащ 0.15 М натриев хлорид.
Промитият силициев двуокис се прибавя към 3 1 от 50 тМ карбонатен буфер (pH 9.5), съдържащ 1 М урея, като сместа се разбърква за 2 часа при стайна температура с цел десорбиране на повърхностния антиген от силициевия двуокис. В този момент буферът показва pH 9.2. Разтворът се центруфугира при 8,700 об./мин. за време 30 минути с цел получаване на течността, съдържаща повърхностния антиген.
- 12 Количеството хепатит Бе вирусен повърхностен антиген е около 895 mg, измерени с Auzyme апаратура (съдържание: 118.7%).
(Стъпка 4) Хидрофобна колонна хроматография
Към течността, получена през стъпка 3 и съдържаща повърхностния антиген, се прибавя урея за получаване на крайна концентрация 4 М. Полученият разтвор се прекарва през пенил агарова колона, еквалибрирана с 50 тМ карбонатен буфер (пН 9.2), съдържащ 4 М урея. Колоната се измива със същия буфер, съдържащ 20% етилен гликол; след това същият буфер, съдържащ 60% етилен гликол, се прибавя към колоната с цел получаване на повърхностния антиген.
Фракциите, съдържащи повърхностния антиген, се комбинират и филтрират с Амикон диафилтрираща система (Амикон, САЩ) с молекулярна прагова стойност 100,000 за отстраняване на уреята и етилен гликола; полученият филтрат се концентрира посредством същата система.
Количеството на хепатит Бе вирусния повърхностен антиген във филтрата е около 546 mg, измерени с Auzyme апаратура (съдържание: 72.4%).
(Стъпка 5) Гел филтрираща хроматография
1 от Сефароза CL-4B (Фармация, САЩ) се пълнят в колона и се еквалибрират с фосфатен буфер (pH 7.2), съдържащ 0.15 М натриев хлорид. Концентратът, съдържащ повърхностния антиген, получен през стъпка 4, се прекарва през колоната и се промива със същия буфер за получаване на фракции, съдържащи повърхностния антиген.
Количеството хепатит Бе вирусен повърхностен антиген (вкл. и фрагментите, дължащи се на протеазната атака) в обединените фракции е около 540 mg, измерени с Auzyme апаратура (съдържание: 71.6%); чистотата на повърхностния антиген е измерена около 75% посредством SDS-PAGE. Пречистеният разтвор, съдържащ повърхностния антиген, получен по този начин, се филтрира през 0.2]Ч филтър (Корнинг, САЩ) и филтратът се съхранява при температура 4° С.
Пример 3 (Стъпка 1) Разпадане на клетъчната проба
Рекомбиниранирана Saccharomvces cerevisiae КСТС 0098ВР е култивирана при 27 С в 300 1YEPD среда. 4 kg клетъчна проба, получена по този начин, се размесва с 8 1 от буфер 1 и сместа се прекарва два пъти през диномил (Гленмил, Япония), съдържащ 3 1 стъклени зърна с диаметър 0.5 мм при 10’С и скорост на потока 650 ml/min за разпадане на клетъчната проба.
- 13Получената клетъчна хомогенност се отделя от стъклените зърна, последните се измиват с 12 1 от буфер 1 като полученият разтвор се смесва с клетъчната хомогенност.
(Стъпка 2) Извличане и разтваряне на повърхностния антиген
Към клетъчната хомогенност, получена през стъпка 1, се добавя 0.1% (тегло/обем) Tween 20 като сместта се разбърква при стайна температура в продължение на 2 часа.
Към разтвора се прибавя наситен разтвор на амониев сулфат до достигане на концентрация 10% като сместа се разбърква при стайна температура в продължение на 1 час. Полученият разтвор се центруфугира при температура 8°С с цел отстраняване на клетъчните остатъци заедно с преципитиралите вещества.
Получените на повърхността на разтвора вещества се филтрират със система за диафилтриране Амикон (Амикон, САЩ) с прагова молекулярна стойност от 100,000 като се използува 20 тМ Tris буфер (pH 7.5) за отстраняване на тиоционата и натриевия сулфат в тях, след което използувайки същата система, се достига до крайна стойност на концентрацията от 6 1.
Концентратът се приспособява към pH 11.5 чрез прибавяне на 5 N натриев хидрроокис и се разбърква при стайна температура в продължение на 1 час. Полученият разтвор се приспособява към pH 5.2 чрез прибавяне постепенно на 20% оцетна киселина и се разбърква в продължение на 30 минути при стайна температура, след което се остава да престои 30 минути. Разтворът се центруфугира при 8°С за отстраняване на клетъчните остатъци заедно с преципитиралите вещества.
Получените на повърхността на разтвора вещества се приспособяват към pH 7.2 с добавяне на 5 N натриев хидроокис, при което се установява, че количеството на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген е около 1,400 mg при измерване с Auzyme апаратура.
(Стъпка 3) Адсорбция и десорбция при използуване на силициев двуокис
Веществата по повърхността на разтвора, получени през стъпка 2, се адсорбират от силициев двуокис (Аерозил 380) в съответствие със следната процедура: сухият силициев двуокис се смесва с вода до получаване на 10% полу-течен разтвор (сухо тегло/обем), 2 1 от който се добавят към получените вещества през стъпка 2 като новополучената смес се разбърква при 4°С за една нощ.
Полученият разтвор се центруфугира при 5,500 оборота в минута в продължение на 10 минути за отстраняване на получените на повърхността му вещества, а преципитиралият силициев двуокис, адсорбирал повърхностния антиген, се измива два пъти с фосфатен буфер (pH 7.2), съдържащ 0.15 М натриев хлорид.
Измитият силициев двуокис се прибавя към 4 л от 50 мМ карбонатен буфер (pH 9.5), съдържащ 1 М урея като сместта се разбърква при стайна температура в продължение на 2 часа с цел десорбция на повърхностния антиген от силициевия двуокис. В този момент буферът показва pH 9.2. Разтворът се центруфугира при 8,700 оборота в минута за получаване на веществата по повърхността му, съдържащи повърхностния антиген.
Количеството на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген в получените на повърхността на разтвора вещества е около 840 mg при измерване с апаратура Auzyme.
(Стъпка 4) Хидрофобна колонна хроматография
Към веществата, получени през стъпка 3, съдържащи повърхностния антиген, се добавя урея до получаване на крайна концентрация 4 М. Полученият разтвор се прекарва през пенил агарова колона, която е еквалибрирана с 50 тМ карбонатен буфер, съдържащ 4 М урея. Колоната се измива със същия буфер, съдържащ 20% етилен гликол. След това същият буфер, съдържащ 60% етилен гликол, се прибавя към колоната за отделяне на повърхностния антиген.
Отделените фракции, съдържащи повърхностния антиген, се комбинират и филтрират с помощта на диафилтрираща система Амикон (Амикон, САЩ) с прагова молекулярна стойност 100,000 за отстраняване на уреята и етилен гликола. Полученият филтрат се концентрира с помощта на същата система.
Количеството на хепатит Бе вирусния повърхностен антиген е около 527 мг при измерване с апаратура Auzyme.
(Стъпка 5) Филтрираща хроматография £ Sepharose CL-4B (Фармация, САЩ) се пълнят в колона и се еквалибрират с фосфатен буфер (pH 7.2), съдържащ 0.15 М натриев хлорид. Концентратът, съдържащ повърхностния антиген, получен през стъпка 4, се прекарва през колоната като се използува същият буфер за получаване на фракциите, съдържащи повърхностния антиген.
Количеството на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген в комбинираните фракции е около 480 mg при измерване с апаратура Auzyme; чистотата на повърхностния антиген е около 98.9%. Съдържанието на preS2 пептид в цялото количество повърхностен антиген е измерено около 75% чрез SDS-PAGE. Пречистеният разтвор с повърхностен антиген, получен по този начин, се филтрира през 0.2 /ч филтър (Корнинг, САЩ) като филтратът се съхранява при температура 4°С.
- 15 Пример 4
Имунологичните свойства на S и preS2 nenmugume в повърхностния антиген, получен в примери 2 и 3 (разглеждани от тук нататък като повърхностен антиген 2 и повърхностен антиген 3) са потвърдени в съответствие със следните опити с морски свинчета:
ml (200yjg/ml) от повърхностен антиген 2 или 3 се смесва с 18 ml фосфатен буфер (pH 7.2), съдържащ 0.15 М натриев хлорид, като се филтрира през 0.2^ шприц филтър (Суперфос Биосектор, Дания). Гореизложената процедура е изпълнена в стерилна среда.
Всяко от морските свинчета, тежащи около 350 г всяко, е инжектирано подкожно с 1 ml повърхностен антиген 2 или 3 двукратно през интервал от 15 дни. След 30 дни от първото инжектиране са взети кръвни проби от всяко от морските свинчета, от които проби е извлечен серум. Когато серумът е анализиран с Ausab апаратура (Абот, САЩ), степента на образуване на антитела срещу S nenmugume на повърхностен антиген 2 или 3 са 100%, GMT на повърхностни антигени 2 и 3 са 33.38 и 29.77 мШ/ml съответно.
Степента на формиране на антитела срещу preS2 пептида е определена в съответствие със следната процедура: 50 1 (1 mg/ml) preS2 nenmug с N-крайни 26 аминокиселини, синтезирани с пептиден синтезатор (Приложни Биосистеми, САЩ), прилагащ автоматизирана твърдо-фазна пептидна синтеза, и 20 1 (10 mg/ml) поли L-лизин се прибавят към 200 1 от 50 тМ оцетен буфер (pH 4.5). Към сместа се прибавят 10 1 от 1% EDC (1-етил-3-(3-диметил-аминопропил)кародиимид) и получената смес влиза в реакция при температура 37 С за 1 час. Получената смес се размива с 20 ml от 10 тМ карбонатен буфер (pH 9.6) и се прибавя към проба от 96-пробна ELISA пластина в количество 200 jw 1/проба. Пробата престоява в инкубационен период от 20 часа при стайна температура с цел адсорбиране на пептида в повърхността на посявката, след което се измива три пъти с дестилирана вода.
PBS, съдържащ 0.5% казеин, се прибавя към посявките в количество 250^1/посявка; пробата престоява в инкубационен период при стайна температура за повече от 2 часа, така че да се избегнат каквито и да е неспецифични реакции в последствие. Към всяка от посявките се извършват проверки за положителен и отрицателен резултат и се прибавят 200/ч1 от серума от всяко от морските свинчета, периодично размиван по десет пъти с PBS (експериментална група). Пробата престоява в инкубационен период от 4 часа при стайна температура, след което се промива пет пъти с TTBS буфер (0.9% натриев хлорид, 0.05% Tween 20, 10 тМ Tris, pH 7.5). Разтвор, включващ porcine анти - антитела в морските свинчета, белязани с хрянова пероксидаза (HRP), размита с 4000 единици обем PBS, съдържащ 0.5% казеин, се прибавя към към пробите в количество 200р1/проба.
- 16Получените проби остават в инкубационен период 1 час при 37 С и се промиват 5 пъти с TTBS буфер.
След това 200 1 от субстратния разтвор за хрян пероксидазата, подготвен чрез разтваряне на 200y&g тетраметил бензидин (ТМВ) в 20уЙ1 DMSO, прибавяне на 10 ml от 0.1 М оцетен буфер (pH 5.1) и 20 ml от 30% хидроген прекис към него и получавайки 20 ml разтвор чрез добавяне на дестилирана вода, се добавят към всяка от пробите, които реагират до смяна на цвета. Към получения разтвор се добавят 50 ml IN сярна киселина за всяка от пробите с цел спиране промяната на цвета. О. D. на всяка от пробите се определя при дължина на вълната 450 пт с Microplate четящо устройство (Динатех MR5000, САЩ).
Когато О. D. на експерименталната група е по- висок от праговата стойност (два пъти стойността на О. D. при отрицателна контролна проба) се установява образуването на антитела срещу preS2 пептида, при което се отчита броят на морските свинчета с положителна реакция на създаване на антитела.
Като резултат, и двата повърхностни антигена - 2 и 3, показват 100% степен на създаване на антитела.
Пример 5
С цел определяне имунологичните свойства на S и preS2 пептиди в повърхностни антигени 2 и 3 се провежда следният експеримент с мишки: 1 м (200ywg/ml) от повърхностен антиген 2 или 3 се смесва с 18 ml фосфатен буфер (pH 7.2), съдържащ 0.15 М натриев хлорид, като сместа се филтрира през 0.2/ищприц филтър. Филтратът се смесва с 1 ml от 3% алхидро гел (Суперфор Биосектор, Дания).
Полученият разтвор, съдържащ 10^g/ml повърхностен антиген 2 или 3, се размива с разтвор на алхидро гел (получен при размиване на алхидро гел) до получаване на крайна концентрация 0.15% с фосфатен буфер (pH 7.2), съдържащ 0.15 М натриев хлорид, за получаване на 4 проби със съответно 0.01, 0.03, 0.09 и 0.27 ng/ml повърхностен антиген. Банките, съхраняващи пробите, се разклащат за предотвратяване преципитацията на алхидро гела. Гореизложената процедура се изпълнява в стерилна среда.
Осемдесет мишки на възраст 5 седмици са разделени в осем групи, всяка състояща се от по 10 мишки, като всяка от тях се инжектира с 1 ml от всеки от размитите разтвори на повърхностен антиген 2 или 3. След 28 дни от инжектирането са взети кръвни проби от всяка мишка за получаване на серум. Антителата срещу S пептида се определят с Ausab апаратура (Абот, САЩ). Степените на образуване на антитела срещу S пептида в повърхностен антиген 2 или 3 са показани в табл. 1.
- 17 Концентрация на повърх. антиген
Степен на образуване на антитела срещу повърхностен антиген (%) Повърхностен Повърхностен
| антиген 2 | антиген 3 | |
| 0.01 | 10 | 10 |
| 0.03 | 20 | 40 |
| 0.09 | 80 | 60 |
| 0.27 | 90 | 100 |
Антителата срещу preS2 nenmuga са определени в съответствие с метода по Пример 4, а степените на образуване на антитела срещу preS2 nenmuga в повърхностен антиген 2 илиЗ са дадени в табл. 2:
Концентрация на повърхн. антиген (ng/ml)
Степени на образуване на антитела срещу повърхн. антиген (%)
Повърхностен Повърхностен антиген 2 антиген 3
| 0.01 | 10 | 10 |
| 0.03 | 20 | 40 |
| 0.09 | 80 | 60 |
| 0.27 | 90 | 100 |
Ефективните дози 50(Εϋ5θ) S и preS2 пептиди са изчислени no probit метода (Фини, Пробит анализи, 1971), използувайки степените на формиране на антитела, получени по-горе. Като резултат ED5Q на S и preS2 пептидите в повърхностен антиген 2 са 0.0580 и 0.0577 ng/ml съответно, а тези на S и preS2 пептидите в повърхностен антиген 3 са 0.0455 и 0.0469 ng/ml съответно. Тъй като съдържанието на preS2 пептид в повърхностен антиген 2 или 3 е 75%, стойността на Εϋβθ на preS2 nenmuga се счита по-ниска от получената по-горе.
Както е показано в изложените примери, хепатит Бе вирусен повърхностен антиген с високо съдържание на preS2 пептид и с високи имунологични свойства на S и preS2 пептиди може да бъде получен от рекомбинирана клетъчна среда в съответствие с настоящото изобретение.
Т. к. изобретението е описано от гледна точка на гореизложените особености, трябва да се отбележи, че различни модификации и промени по отношение на него могат да бъдат направени, но те също попадат в обхвата на изобретението така, както е описано в претенциите.
- 4g(1/1)
FIG. 1
-19Претенции:
Claims (17)
1. Процес за пречистване на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген, включващ preS2 пептид от клетки на рекомбиниран организъм, характеризиращ се с това, че включва етап на разпадане на клетките посредством използуване на буфер, съдържащ хаотропична сол,за получаване на клетъчна хомогенност.
2. Процес за пречистване на хепатит Бе вирусен повърхностен антиген, включващ preS2 пептид, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че хаотропичната сол се избира от групата, както следва: натриев тиоцианат, калиев тиоцианат, гуанидиев хлорид и urea.
3. Процесът, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че концентрацията на хаотропичната сол в буфера е в диапазона от 1 до 8 М.
4. Процесът, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че включва следните стъпки:
а/ Прибавяне на вещества към клетъчната хомогенност за извличане на повърхностния антиген от клетъчната мембрана на клетките;
б/Увеличаване на разтворимостта и стимулиране образуването на повърхностния антиген в екстракта, получен през стъпка (а), посредством електролитните свойства на екстракта;
в/ Преципитиране на клетъчните остатъци, липидите и замърсените протеини от обработения през стъпка (б) екстракт посредством окисляване и последващо центруфугиране за получаване на разтвор, съдържащ повърхностния антиген;
г/ взаимодействие на разтвора, получен през стъпка (в) със силициевия двуокис с цел адсорбиране на повърхностния антиген от последната, отмиване на замърсените протеини и дисорбция на повърхностния антиген от силициевия двуокис посредством буфера за получаване на фракцията пречистен повърхностен антиген;
д/ подлагане на фракцията пречистен повърхностен антиген, получена през стъпка (г), на хидрофобна колонна хроматография за получаване на фракциите, съдържащи повърхностния антиген,и е/ пречистване на фракциите, получени през стъпка (д) посредством клей изключващата гел филтрираща хроматография за получаване на повърхностния антиген в чист вид.
5. Процесът, съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че съдържа стъпките, както следва: прибавяне на сол към клетъчния екстракт, получен през стъпка (а) или (б); отстраняване на клетъчните остатъци и твърди вещества; подлагане на течността на диафилрация преди стъпка (в).
6. Процесът, съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че веществата, използувани през стъпка (а) са Tween 20, Tween 80, Тритон Х-100 или натриева сол на жлъчната киселина.
7. Процесът, съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че концентрацията на веществото, използувано през стъпка (а) е в диапазона от 0.1 до 0.5% (w/v) въз основа обема на клетъчната хомогенност.
8. Процесът, съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че клетъчният екстракт, получен през стъпка (а) се приспособява към pH в диапазона от 11.0 до 13.5 през стъпка (б).
9. Процесът, съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че pH на клетъчния екстракт е в диапазона от 4.5 до 6.0 през стъпка (в).
10. Процесът, съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че силициевият двуокис, използуван при стъпка (г), е с площ от 100 до 500 кв. m/g.
11. Процесът, съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че повърхностният антиген се отделя от силициевия двуокис през стъпка (г) като се използува буфера с диапазон на pH от 8.8 до 11.0 и при съдържание на урея с концентрация в границите от 1 до 8 М и вещество за отделяне с концентрация от 0.1 до 0.3 wt%.
12. Процесът, съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че използуваното вещество за отделяне е натриева сол на жлъчната киселина.
13. Процесът, съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че хидрофобният клей, използуван през стъпка (д) е агаров гел, съдържащ пенилови групи.
14. Процесът, съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че хидрофобната колонна хроматография през стъпка (д) се осъществява чрез преминаване на фракцията, съдържаща повърхностния антиген, през колона, еквилибрирана с буфер с pH в диапазона от 8.8 до 11.0 и съдържа урея с концентрация в границите от 1 до 4 М като колоната се промива с еквалибриран буфер, съдържащ 10-40 wt% етилен гликол, а на повърхностният антиген се въздействува с еквалибрирания буфер, съдържащ 60-80 wt% етилен гликол.
15. Процесът, съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че клей изключващата хроматография през стъпка (е) се осъществява в присъствието на декстранов гел или полиакриламиден гел с молекулярно тегло с прагова стойност най-малко 1,000,000.
16. Процесът, съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че клей изключващата хроматография през стъпка (е) се осъществява чрез преминаване на фракцията, съдържаща повърхностния антиген през еквилибрирана колона с Tris или фосфатен буфер, който има pH в диапазона от 6 до 8 и съдържа натриев хлорид с концентрация в границите от 0.1 до 0.2 М, и въздействува на повърхностния антиген със същия буфер.
17. Ваксина срещу хепатит Бе вирус, съдържаща повърхносния антиген, пречистен в съответствие с метода съгласно претенция 1.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR19940033594 | 1994-12-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG100212A true BG100212A (bg) | 1996-12-31 |
| BG63699B1 BG63699B1 (bg) | 2002-09-30 |
Family
ID=19400952
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG100212A BG63699B1 (bg) | 1994-12-10 | 1995-12-08 | Метод за пречистване на повърхностен антиген на вируса на хепатит в, съдържащ пептида pres2 |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6362320B1 (bg) |
| EP (1) | EP0716094B1 (bg) |
| KR (1) | KR960023066A (bg) |
| CN (1) | CN1057532C (bg) |
| AR (1) | AR002006A1 (bg) |
| AT (1) | ATE264341T1 (bg) |
| BG (1) | BG63699B1 (bg) |
| BR (1) | BR9505739A (bg) |
| CA (1) | CA2164672C (bg) |
| CO (1) | CO4480040A1 (bg) |
| CZ (1) | CZ291024B6 (bg) |
| DE (1) | DE69532878T2 (bg) |
| DK (1) | DK0716094T3 (bg) |
| ES (1) | ES2217272T3 (bg) |
| JO (1) | JO1885B1 (bg) |
| PE (1) | PE56396A1 (bg) |
| PL (1) | PL182103B1 (bg) |
| PT (1) | PT716094E (bg) |
| RO (1) | RO113308B1 (bg) |
| RU (1) | RU2122430C1 (bg) |
| TR (1) | TR199501557A2 (bg) |
| UY (1) | UY24112A1 (bg) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA79735C2 (uk) * | 2000-08-10 | 2007-07-25 | Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. | Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах |
| KR100405174B1 (ko) * | 2001-02-02 | 2003-11-12 | 씨제이 주식회사 | 재조합 β형 간염바이러스 표면항원의 정제방법 |
| US20090017443A1 (en) * | 2004-05-19 | 2009-01-15 | Advanced Life Science Institute, Inc. | Method for Detection of Hepatitus B Virus |
| GB0522765D0 (en) * | 2005-11-08 | 2005-12-14 | Chiron Srl | Combination vaccine manufacture |
| KR100948127B1 (ko) * | 2007-06-27 | 2010-03-18 | 주식회사 중앙백신연구소 | 복합호흡기 질환 돼지의 조직유제를 함유하는 백신 조성물 |
| PL2812091T3 (pl) | 2012-09-17 | 2021-07-19 | W.R. Grace & Co. - Conn. | Podłoża chromatograficzne i urządzenia |
| FR2997222B1 (fr) * | 2012-10-19 | 2015-01-16 | Alstom Technology Ltd | Dispositif d'etablissement et/ou de coupure de courant a contacts permanents a usure reduite |
| PL3137209T3 (pl) | 2014-05-02 | 2023-01-02 | W.R. Grace & Co. - Conn. | Funkcjonalizowany materiał nośnikowy i sposoby wytwarzania oraz stosowania funkcjonalizowanego materiału nośnikowego |
| JP2018517559A (ja) | 2015-06-05 | 2018-07-05 | ダブリュー・アール・グレース・アンド・カンパニー−コーンＷ Ｒ Ｇｒａｃｅ ＆ Ｃｏ−Ｃｏｎｎ | 吸着性バイオプロセス清澄化剤並びにその製造及び使用方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5340926A (en) * | 1983-03-25 | 1994-08-23 | Celltech, Limited | Process for the recovery of recombinantly produced protein from insoluble aggregate |
| US4649192A (en) * | 1985-05-30 | 1987-03-10 | Smith Kline-Rit | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate |
| DE3883596T2 (de) * | 1987-03-09 | 1994-02-17 | Merck & Co Inc | Reinigung von rekombiniertem Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen. |
| EP0310178A1 (en) * | 1987-09-30 | 1989-04-05 | Merck & Co. Inc. | Recovery of pres2+S antigen |
| EP0314240A3 (en) * | 1987-10-26 | 1990-03-28 | Merck & Co. Inc. | Process for purifying recombinant hepatitis antigens |
| US5004688A (en) * | 1988-04-15 | 1991-04-02 | Phillips Petroleum Company | Purification of hepatitis proteins |
| US5030720A (en) * | 1988-09-01 | 1991-07-09 | Merck & Co., Inc. | Pres2+S hepatitis B vaccine derived from plasma |
| EP0384058A1 (en) * | 1989-02-09 | 1990-08-29 | Development Center For Biotechnology | Isolation of hepatitis B surface antigen from transformed yeast cells |
| CU22290A1 (es) * | 1990-10-08 | 1995-01-31 | Cigb | Procedimiento para la obtencion de antigeno de superficie del virus de la hepatitis b de superior capacidad inmunoganica y su uso en un preparado vacunal |
-
1995
- 1995-11-29 KR KR1019950044795A patent/KR960023066A/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-12-07 CA CA002164672A patent/CA2164672C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-07 JO JO19951885A patent/JO1885B1/en active
- 1995-12-07 CO CO95057860A patent/CO4480040A1/es unknown
- 1995-12-07 PE PE1995286655A patent/PE56396A1/es not_active Application Discontinuation
- 1995-12-08 PL PL95311735A patent/PL182103B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-12-08 BG BG100212A patent/BG63699B1/bg unknown
- 1995-12-08 RO RO95-02141A patent/RO113308B1/ro unknown
- 1995-12-08 DE DE69532878T patent/DE69532878T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-08 CZ CZ19953247A patent/CZ291024B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-12-08 EP EP95119383A patent/EP0716094B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-08 DK DK95119383T patent/DK0716094T3/da active
- 1995-12-08 AT AT95119383T patent/ATE264341T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-12-08 ES ES95119383T patent/ES2217272T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-08 PT PT95119383T patent/PT716094E/pt unknown
- 1995-12-08 RU RU95120587A patent/RU2122430C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-12-11 AR ARP950100498A patent/AR002006A1/es active IP Right Grant
- 1995-12-11 UY UY24112A patent/UY24112A1/es not_active IP Right Cessation
- 1995-12-11 TR TR95/01557A patent/TR199501557A2/xx unknown
- 1995-12-11 BR BR9505739A patent/BR9505739A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-12-11 CN CN95120408A patent/CN1057532C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-11-02 US US09/432,300 patent/US6362320B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2217272T3 (es) | 2004-11-01 |
| CA2164672A1 (en) | 1996-06-11 |
| EP0716094A1 (en) | 1996-06-12 |
| CO4480040A1 (es) | 1997-07-09 |
| UY24112A1 (es) | 1996-05-10 |
| TR199501557A2 (tr) | 1997-03-21 |
| PL311735A1 (en) | 1996-06-24 |
| PT716094E (pt) | 2004-08-31 |
| ATE264341T1 (de) | 2004-04-15 |
| JO1885B1 (en) | 1997-12-15 |
| AR002006A1 (es) | 1998-01-07 |
| DE69532878D1 (de) | 2004-05-19 |
| CZ324795A3 (en) | 1996-06-12 |
| DE69532878T2 (de) | 2005-06-09 |
| BG63699B1 (bg) | 2002-09-30 |
| KR960023066A (ko) | 1996-07-18 |
| CZ291024B6 (cs) | 2002-12-11 |
| RO113308B1 (ro) | 1998-06-30 |
| BR9505739A (pt) | 1997-12-23 |
| PE56396A1 (es) | 1996-12-14 |
| EP0716094B1 (en) | 2004-04-14 |
| CN1057532C (zh) | 2000-10-18 |
| CA2164672C (en) | 2004-06-22 |
| CN1132211A (zh) | 1996-10-02 |
| PL182103B1 (pl) | 2001-11-30 |
| US6362320B1 (en) | 2002-03-26 |
| DK0716094T3 (da) | 2004-07-26 |
| KR0177254B1 (bg) | 1999-04-01 |
| RU2122430C1 (ru) | 1998-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5151023A (en) | Hepatitis a,b-combined adjuvanted vaccine | |
| JP5559847B2 (ja) | ワクチンに使用するためのｈｂｖ抗原の精製 | |
| CA1066191A (en) | Hepatitis b vaccine | |
| BG100212A (bg) | Метод за пречистване на повърхностен антиген на вируса на хепатит в, съдържащ пептида pres2 | |
| KR910008643B1 (ko) | B형 간염 비루스 표면항원(HBs 항원)의 정제 방법 | |
| US4565697A (en) | Process for producing a hepatitis B infection preventing vaccine | |
| US6991929B1 (en) | Hepatitis A vaccines | |
| US4118478A (en) | Vaccine manufacture for active immunization containing hepatitis B surface antigen and associated antigen | |
| WO1981000050A1 (en) | Process for producing hepatitis b vaccine | |
| EP0315242A2 (en) | Process for purifying recombinant hepatitis antigens | |
| EP0294071A2 (en) | Hepatitis B vaccines made with pre-formed aluminum hydroxide gels, and processes thereof | |
| EP0005864B1 (en) | Antigenic composition useful as a vaccine or vaccine intermediate, and process for preparing same | |
| KR100194247B1 (ko) | 재조합 b형 간염 표면 항원의 정제방법 | |
| KR0159716B1 (ko) | B형 간염 표면 항원의 정제방법 | |
| JPS61103895A (ja) | ＨＢｓＡｇの精製方法 | |
| SU728720A3 (ru) | Способ получени вакцины против гепатита в | |
| KR930012107B1 (ko) | 한국형 c형 간염 바이러스의 특이 항원인 khcv 403 단백질의 정제방법 | |
| HU186864B (en) | Process for preparing pure hepatitis b superficial antigen from human plasma | |
| JPS60258127A (ja) | Ｂ型肝炎ワクチンの製造方法 | |
| JPH03503847A (ja) | Ｂ型肝炎ワクチンの製造及び精製方法 | |
| CN87106697A (zh) | 制备乙型肝炎复合疫苗的方法 | |
| JPS63230639A (ja) | 新規なｂ型肝炎ウイルス表面抗原粒子とその製法 | |
| JPH0762033B2 (ja) | Ｂ型肝炎ワクチン |