DE69532878T2

DE69532878T2 - Verfahren zur Reinigung von viralem Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltend ein preS2-Peptid

Info

Publication number: DE69532878T2
Application number: DE69532878T
Authority: DE
Inventors: Soon-Jae Yuseong-gu Park; Young-Mee Seo-gu Lee; Kyung-Hee Yuseong-gu Yoon; Kook-Jin Yuseong-gu Lim; Young-Sun Seo-gu Kwon
Original assignee: LG Chemical Co Ltd
Current assignee: LG Corp
Priority date: 1994-12-10
Filing date: 1995-12-08
Publication date: 2005-06-09
Anticipated expiration: 2015-12-09
Also published as: EP0716094B1; RU2122430C1; CN1132211A; PL182103B1; US6362320B1; PL311735A1; EP0716094A1; AR002006A1; DK0716094T3; DE69532878D1; PE56396A1; CZ291024B6; BG100212A; CO4480040A1; CA2164672A1; BG63699B1; ATE264341T1; CA2164672C; UY24112A1; CN1057532C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung eines Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigens, das ein preS2-Peptid umfasst; und spezieller ein Verfahren zur Reinigung eines Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigens, das ein preS2-Peptid umfasst, aus einer rekombinanten Hefezelle, welches einen Schritt des Aufbrechens der Zelle, wobei ein Verlust des preS2-Peptids durch Verwendung eines chaotropen Salzes verhindert wird, gefolgt von Extraktion, Fällung, Adsorption auf Siliciumdioxid und Säulenchromatographie umfasst.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Hepatitis B ist eines der weltweiten Probleme der öffentlichen Gesundheit, und es wird gesagt, dass etwa 200 bis 300 Millionen der Weltbevölkerung das Hepatitis B-Virus („HBV") tragen. Die HBV-Infektion schreitet häufig zu Zirrhose und hepatozellulärem Karzinom fort, was zum möglichen Tod des Patienten führt.
Bisher ist kein Behandlungsmittel für Hepatitis B entwickelt worden, und deshalb ist die Bedeutung von Impfstoffen betont worden.
Blumberg et al. entdeckten 1955 das australische Antigen aus dem Blut von Hepatitis B-Patienten; und Krugman et al. berichteten 1971 über ein aktives Immunisierungsverfahren unter Verwendung eines wärmebehandelten humanen Serums, das HBV enthält, wodurch die Möglichkeit der Entwicklung von Hepatitis B-Impfstoffen geboten wurde. Danach sind Hepatitis B-Impfstoffe der ersten Generation, die durch Abtrennen und Reinigen von Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen (HBsAg) aus dem Blutplasma von Hepatitis B-Patienten hergestellt werden, in den Handel gekommen (M. R. Hilleman et al., Develop. Bio. Standard, 54, 3–12 (1983)).
Jedoch weisen die Impfstoffe, die aus dem Blutplasma abstammen, die Probleme auf, dass ihre Reinigungs- und Inaktivierungsverfahren mühsam sind und hohe Kosten erfordern; der Vorrat an menschlichem Blut beschränkt ist; und eine geimpfte Person mit den Pathogenen aus der Blutquelle infiziert werden kann.
Demgemäß sind, um die obigen Probleme zu lösen, gentechnologische Ansätze bei der Entwicklung von Hepatitis B-Impfstoffen ausprobiert worden.
Beispielsweise haben Valenzuela et al. ein Verfahren zur Produktion von HBsAg in Hefe entwickelt Nature, 293, 347–350 (1982)). Das rekombinante HbsAg (r-HBsAg) besteht hauptsächlich aus S-Protein (P25) mit 226 Aminosäuren, und wenn es gereinigt ist, bildet es Oberflächenantigen-Teilchen, welche nahezu mit denjenigen von HBsAg identisch sind, die aus Blutplasma abgetrennt werden.
K. H. Heermann et al. haben mitgeteilt, dass das Hepatitis B-Virushüllenprotein signifikante Mengen an L-Protein (preS1 + preS2 + S: p39) und M-Protein (preS2 + S: p31) sowie S-Protein enthält J. Virol., Nov., 396–402 (1984)). Es ist bekannt, dass das preS1-Peptid eine wichtige Rolle beim Angriff des Hepatitis B-Virus auf die Leber spielt, nachdem dieses den menschlichen Körper infiziert hat. Es hat sich in Tierexperimenten erwiesen, dass das preS2-Peptid, das aus 55 Aminosäuren besteht, zu der Antikörperbildung gegen das Oberflächenantigen beiträgt (D. R. Milich et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 8168–8172 (1985)).
Weiter ist bekannt, dass Antikörper, die gegen das preS2-Peptid gebildet werden, eine Verteidigungsaktivität gegen eine Virusinfektion zeigen (Y. Ito et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, 9174-9178 (1986)). Deshalb kann ein Impfstoff, der das preS2-Peptid enthält, für eine Person nützlich sein, die keine Antikörper gegen ein vorexistierendes Oberflächenantigen bilden kann. Die Entwicklung eines derartigen Impfstoffs ist auch für den Schutz gegen eine Infektion durch kürzlich entdeckte Hepatitis B-Virusvarianten wichtig.
Jedoch ist, da das preS-Peptid gegenüber Proteasen, die in einer Hefezelle anwesend sind, sehr empfindlich ist, die Herstellung eines Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigens, welches das preS-Peptid enthält, auf verschiedene Schwierigkeiten gestoßen. Um die Schwierigkeiten zu überwinden, haben Kobayashi et al. einen Impfstoff produziert, der durch genetische Modifikation der Protease-empfindlichen Region zwischen dem preS2- und S-Peptid hergestellt wird (J. Bacteriology, 8, 1–22 (1988)); und das U.S. Patent Nr. 4,742,158 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, der das preS-Peptid enthält, in welchem das Peptid durch Verwendung eines Protease-Inhibitors in dem Schritt des Aufbrechens der Zelle vor Protease geschützt wird. Jedoch ist die Auswirkung der genetischen Modifikation von Kobayashi et al. auf die Aktivität des preS2-Peptids nicht vollständig charakterisiert worden, und das letztgenannte Verfahren ist nicht brauchbar, da Protease-Inhibitoren zu teuer sind, um in einem Massenreinigungsverfahren verwendet zu werden. Weiter kann die Menge an preS2-Peptid nicht über eine gewisse Menge hinaus aufrechterhalten werden, unabhängig von der Menge der zugesetzten Protease-Inhibitoren, wenn die Reinigungszeit länger wird, wenn die Reinigungsskala oder -anforderung zunimmt.
Das europäische Patent Nr. 0 337 492 A1 stellt ein Verfahren zur Reinigung eines HBsAg aus der Kultur von Pichia sp. unter Verwendung von Kaliumthiocyanat bereit. Kaliumthiocyanat wird zur Erhöhung der Ausbeute an lipophilen Proteinen verwendet, und das ganze Verfahren zielt auf die Reinigung des HBsAg ab, das nur das S-Peptid enthält. Wenn das HBsAg weiter das preS2-Peptid umfasst, das aus 55 Aminosäuren vor dem S-Peptid besteht, welches aus 226 Aminosäuren besteht, weist es immunologische Eigenschaften auf, die denjenigen des Oberflächenantigens ähnlich sind, welches nur das S-Peptid umfasst, da die Antigenität und Immunogenität der S-Peptid-Einheit die gleichen sind. Jedoch sind die zwei Oberflächenantigene bezüglich ihrer physikochemischen Eigenschaften unvermeidbar verschieden. Insbesondere ist das preS2-Peptid ausreichend hydrophil, um auf der Oberfläche des Antigenteilchens exponiert zu werden, und demgemäß weist es einen wichtigen Einfluss auf das Reinigungsverfahren auf.
Deshalb sind verschiedene Verfahren zur Reinigung des Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigens, welches das preS2-Peptid umfasst, entwickelt worden.
Das europäische Patent Nr. 0 130178 A1 beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von HBsAg, welches das preS2-Peptid umfasst, das durch Abtrennen des Oberflächenantigens unter Verwendung von zwei flüssigen Phasen charakterisiert ist, die hergestellt werden, indem man eine geeignete Menge an Dextran und Glycol zu einem Hefeextrakt gibt. Jedoch weist dieses Verfahren die Probleme auf, dass das abgetrennte Oberflächenantigen nicht ausreichend rein ist, es nicht für ein Reinigungsverfahren im großen Maßstab geeignet ist, da Dextran und Polyethylenglycol teuer sind; und es aufgrund der Tatsache, dass ein zusätzliches Verfahren für die Entfernugn eines verwendeten Tensids erforderlich ist, nicht wirtschaftlich ist.
Das U.S. Patent No. 4,742,158 lehrt ein Verfahren zur Reinigung von HBsAg, welches das preS2-Peptid umfasst, das umfasst: Herstellen eines Hefeextrakts in Anwesenheit von verschiedenen Protease-Inhibitoren und Reinigen des Oberflächenantigens daraus durch eine Reihe von Säulenchromatographie-Abtrennungsschritten unter Verwendung einer Affinitätssäule, die durch Anbringen eines humanen Serumalbumin-Polymers an eine Gelmatrix hergestellt wird, sowie einer hydrophoben Säule, die mit einem Tensid eluiert wird. Jedoch weist das Verfahren solche Mängel auf wie: die Protease-Inhibitoren, die in dem Verfahren verwendet werden, sind sehr teuer; die Affinitätssäule ist nicht für eine Massenreinigung geeignet; und ein spezielles Verfahren für die Entfernung eines Tensids, das in der hydrophoben Säulenchromatographie verwendet wird, ist erforderlich.
M. Kobayashi et al. haben ebenfalls ein Verfahren zur Reinigung von HBsAg mitgeteilt, welches das preS2-Peptid umfasst (J. of Biotechnology, 8, 1–22 (1988). Jedoch ist dieses Verfahren für eine Massenreinigung nicht geeignet, da es eine Immunoaffinitätssäule verwendet, welche eine niedrige Ausbeute zum Ergebnis hat.
Das koreanische Patent Nr. 065305 stellt ein Verfahren zur Reinigung von HBsAg bereit, welches eine pH-Fällung und Siliciumdioxid- und Anionenaustausch-Säulenchromatographie umfasst. Dieses Verfahren leidet an dem Nachteil, dass es schwierig ist, den Gehalt des preS2-Peptids bei einer geeigneten Menge aufrechtzuerhalten, da das preS2-Peptid während einer anfänglichen Stufe des Verfahrens von Proteasen verdaut wird.
Deshalb besteht immer noch ein Bedarf an einem effizienten Verfahren zur Reinigung von HBsAg, welches das preS2-Peptid enthält.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demgemäß ist es ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Reinigung eines Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigens, das preS2-Peptid umfasst, aus einer Hefezelle in einem ausreichend reinen Zustand bereitzustellen, dass es direkt einem Impfstoff einverleibt werden kann.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zur Reinigung eines Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigens, welches das preS2-Peptid umfasst und in einem rekombinanten Organismus exprimiert wird, gemäß Anspruch 1 bereitgestellt, wobei in einem ersten Schritt (a) die rekombinanten Organismuszellen unter Verwendung eines Puffers aufgebrochen werden, der ein chaotropes Salz enthält.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
Die obigen und andere Ziele und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der Erfindung offensichtlich, wenn sie in Verbindung mit der begleitenden Zeichnung genommen wird, in der:
1 das Ergebnis einer 15% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) zeigt, welche den preS2-Peptid-Gehalt in HBsAg verifiziert, wenn das Oberflächenantigen, welches das preS2-Peptid umfasst, in Anwesenheit von Natriumthiocyanat als chaotropem Salz gereinigt wird.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Reinigung eines Hepatitis B-Virus-Ober flächenantigens, welches das preS2-Peptid umfasst und in einem rekombinanten Organismus exprimiert wird, gemäß Anspruch 1 bereit, in dem in einem ersten Schritt (a) die Zellen des rekombinanten Organismus unter Verwendung eines Puffers aufgebrochen werden, der ein chaotropes Salz enthält, um den Verlust des preS2-Peptids zu minimieren. Die Verwendung eines Puffers, der ein chaotropes Salz enthält, für das Aufbrechen von Zellen fördert die Bildung von HBsAg-Teilchen und schützt das preS2-Peptid vor dem Proteaseangriff, welcher im Allgemeinen während einer anfänglichen Reinigungsstufe stattfindet, wodurch der preS2-Peptid-Gehalt bei einer konstanten Menge aufrecht erhalten wird, bis das Reinigungsverfahren beendet ist.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auf ein Verfahren zur Reinigung von HBsAg angewendet werden, welches von irgendeinem der geeigneten rekombinanten Organismen, bevorzugt einer rekombinanten Hefezelle, z. B. Saccharomyces cerevisiae, produziert wird.
Geeignete chaotrope Salze, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Natriumthiocyanat, Kaliumthiocyanat, Ammoniumthiocyanat, Guanidiniumhydrochlorid und Harnstoff; wobei Natriumthiocyanat bevorzugt ist.
Jedes herkömmliche Puffersystem, z. B. Phosphat-Puffer und Tris-Puffer, können für das Aufbrechen der Zelle in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden; und der pH desselben kann vorzugsweise auf einen Bereich von 6 bis 8 eingestellt werden. Die Konzentration des chaotropen Salzes in dem Puffer kann im Bereich von 1 bis 8 M, bevorzugt von 1 bis 3 M liegen.
Wenn die rekombinante Zelle unter Verwendung eines Puffers aufgebrochen wird, der ein wie oben beschriebenes chaotropes Salz enthält, schließt das verbleibende Reinigungsverfahren die Schritte ein:

(b1 ) Zugabe eines Tensids zu einem Zellhomogenisat der rekombinanten Zelle, um das Oberflächenantigen aus der Membran der Zelle zu extrahieren;
(b2) Erhöhen der Löslichkeit und Fördern der Teilchenbildung des Oberflächenantigens in dem Extrakt, der in Schritt (b1) erhalten wird, durch Alkalisierung des Extrakts;
(c) Fällung und Entfernung von Zelltrümmern, Lipiden und kontaminierenden Proteinen aus dem Extrakt, der in Schritt (b2) behandelt wurde, durch Ansäuern und
(d) anschließendes Zentrifugieren des Extrakts, um eine Lösung zu erhalten, die das Oberflächenantigen enthält;
(e) In-Kontakt-Bringen der in Schritt (d) erhaltenen Lösung mit Siliciumdioxid, um das Oberflächenantigen auf dem Siliciumdioxid zu adsorbieren, Auswaschen der kontaminierenden Proteine und Desorbieren des Oberflächenantigens von dem Siliciumdioxid unter Verwendung eines Puffers, um eine Fraktion von gereinigtem Oberflächenantigen zu erhalten;
(f) Durchführen einer hydrophoben Säulenchromatographie mit der in Schritt (e) erhaltenen Fraktion von gereinigtem Oberflächenantigen, um Fraktionen zu erhalten, die das Oberflächenantigen enthalten; und
(g) Reinigen der in Schritt (f) erhaltenen Fraktionen durch Größenausschluss-Gelfiltrations-Chromatographie, um das Oberflächenantigen in reiner Form zu erhalten.

Beispielhafte Tenside, die im obigen Schritt (b1) zur Extraktion des Oberflächenantigens aus der Zellmembran verwendet werden können, umfassen: Tween^® 20, Tween^® 80, Triton X-100 und Natriumdesoxycholat, wobei Tween^® 20 bevorzugt ist. Das Tensid kann in einer Menge im Bereich von 0,1 bis 0,5% (Gew./Vol.), bevorzugt von 0,1 bis 0,2% (Gew./Vol.), bezogen auf die Menge des Zellhomogenisats, verwendet werden.
Um die Löslichkeit des Oberflächenantigens in dem Zellhomogenisat zu erhöhen und dessen Teilchenbildung zu fördern, wird es bevorzugt, den pH des Oberflächenantigen-Extrakts unter Verwendung einer Base, bevorzugt Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid, auf einen Bereich von 11,0 bis 13,5 zu erhöhen. Es wird angenommen, dass dieses Alkalisierungsverfahren die Teilchenbildung von HBsAg durch Erhöhen der intermolekularen Disulfid-Bindung und Dissoziieren der kontaminierenden Proteine aus HBsAg durch eine erhöhte Löslichkeit fördert. Danach lässt man den Extrakt bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 30°C über eine Zeitspanne im Bereich von 0,5 bis 1 Stunde stehen.
Dann wird der Extrakt angesäuert, um Zelltrümmer, Lipide und kontaminierende Proteine zu fällen, wobei der pH des Extrakts auf einen Bereich von 4,5 bis 6,0 erniedrigt wird. Repräsentative Säuren, die in diesem Schritt verwendet werden können, umfassen irgendeine anorganische oder organische Säure, wobei eine 10 bis 30%-ige Essigsäurelösung bevorzugt wird. Die Ansäuerungsreaktion kann bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 30°C über eine Zeitspanne im Bereich von 0,5 bis 2 Stunden vorzugsweise unter Rühren durchgeführt werden. Der angesäuerte Extrakt wird zentrifugiert, um die resultierenden Niederschläge zu entfernen und um einen Überstand zu erhalten, der das Oberflächenantigen enthält. Dieses Verfahren ist vorteilhaft, indem ein einfacher Zentrifugationsschritt die Zelltrümmer, Lipide und kontaminierenden Proteine gleichzeitig entfernt und die Ausbeute des Oberflächenantigens aufgrund des vorherigen Schritts des Lösens des Oberflächenantigens bei einem hohen pH-Bereich hoch ist.
Die Erhöhung und anschließende Erniedrigung des pH des Zellextrakts stabilisiert die teilchenbildende Eigenschaft des Oberflächenantigens und ist bei der Entfernung der Lipide und kontaminierenden Proteine sehr effizient.
Jedoch kann, wenn ein Thiocyanat als chaotropes Salz in dem Schritt des Aufbrechens der Zellen verwendet wird, beim Ansäuerungsschritt ein fauler Geruch entstehen. Das Thiocyanatsalz selbst ist eine farb-, geruch- und harmlose Verbindung, und ein Thiocyanation ist in Lösung ziemlich stabil. Deshalb wird angenommen, dass der Geruch, der im Ansäuerungsschritt erzeugt wird, aus Reaktionen von Thiocyanat mit einigen Substanzen im Zellextrakt herrührt. Dieser Geruch kann im Fall einer Reinigung im kleinen Maßstab für den Experimentator tolerierbar sein, aber bei einem Betrieb im großen Maßstab ist es vorzuziehen, das Thiocyanat vor dem Ansäuerungsschritt zu entfernen.
Beispielsweise kann das Thiocyanat bevorzugt durch Zugabe eines geeigneten Salzes zu dem Zellextrakt, um Thiocyanatsalz zusammen mit einigen der kontaminierenden Proteine beispielsweise unmittelbar nach dem obigen Schritt (b1); Entfernen der Niederschläge z. B. durch Zentrifugation; und Diafiltrieren des resultierenden Überstands entfernt werden. Das Oberflächenantigen fällt während dieses Verfahrens nicht aus. Weiter wird die Entfernung von Thiocyanat gleichzeitig mit der Entfernung von einem Teil der kontaminierenden Proteine durchgeführt, welches die anschließenden Reinigungsverfahren erleichtert.
Geeignete Salze, die in dem Deodorierungsverfahren verwendet werden können, umfassen Salze von mehrfach geladenen Anionen, z. B. Natriumsulfat und Ammoniumsulfat, in einer Konzentration im Bereich von 8 bis 15% (Gew./Vol.). Nach der Extraktion des Oberflächenantigens aus der Zellmembran wird Salz zugesetzt, und man lässt die Reaktion 0,5 bis 2 Stunden mit oder ohne Rühren bei Raumtemperatur vonstatten gehen. Die resultierenden Niederschläge können durch ein herkömmliches Verfahren, z. B. Zentrifugation, entfernt werden, um einen Überstand zu erhalten, der das Oberflächenantigen enthält. Der resultierende Überstand wird wiederholten Diafiltrationsverfahren unterzogen, um Thiocyanat und Sulfat zu entfernen. Der in diesem Schritt verwendete Puffer weist vorzugsweise einen pH im Bereich von 6 bis 8 auf. Wenn die Schritte der Salzbehandlung, Zentrifugation und Diafiltration beendet sind, wird der resultierende Überstand den Verfahren der Schritte (b2) und (c) unterzogen.
Der in Schritt (d) erhaltene Überstand, der das Oberflächenantigen enthält, wird unter Verwendung eines Säulen- oder Chargenverfahrens mit Siliciumdioxid behandelt, wobei das Chargenverfahren bevorzugt ist. Ein geeignetes Siliciumdioxid zur Verwendung in diesem Schritt ist mikrokristallines Siliciumdioxid mit einer Oberfläche im Bereich von 100 bis 500 m²/g; und bevorzugt kann Aerosil^® 380 (Degussa, Deutschland) verwendet werden. Der Überstand, der das Oberflächenantigen enthält, wird mit der Siliciumdioxid-Aufschlämmung bei einem pH im Bereich von 6 bis 8 und einer Temperatur im Bereich von 4 bis 30°C über eine Zeitspanne im Bereich von 2 bis 16 Stunden unter heftigem Rühren in Kontakt gebracht. Die Menge an getrocknetem Siliciumdioxid für die Adsorption des Oberflächenantigens beträgt bevorzugt etwa 5% (Gew./Gew.), bezogen auf das Gewicht des Zellkuchens. Der Oberflächenantigen-Siliciumdioxid-Komplex wird unter Verwendung eines herkömmlichen Verfahrens, z. B. Zentrifugation, aus der Lösung abgetrennt.
Danach wird der Komplex gewaschen, z. B. dreimal mit einem Puffer mit einem pH im Bereich von 6 bis 8, bevorzugt einem Natriumphosphat-Natriumchlorid-Puffer, um die rückständigen kontaminierenden Proteine aus dem Siliciumdioxid zu entfernen. Das Oberflächenantigen kann aus dem Siliciumdioxid desorbiert werden, indem man den Komplex etwa 2 Stunden lang mit einem geeigneten Puffer in Kontakt bringt. Ein Puffer mit einem pH im Bereich von 8,8 bis 11,0, bevorzugt ein Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Puffer, kann in diesem Schritt geeignet verwendet werden. Der Puffer kann weiter Harnstoff in einer Konzentration im Bereich von 1 bis 8 M und ein Tensid, bevorzugt Natriumdesoxycholat, in einer Konzentration im Bereich von 0,1 bis 0,3 Gew.-% enthalten. Dann wird das Siliciumdioxid unter Verwendung eines herkömmlichen Verfahrens, z. B. Zentrifugation, aus der Lösung entfernt, um einen Überstand zu erhalten, der das Oberflächenantigen enthält. Wenn jedoch Natriumdesoxycholat in dem Desorptionsschritt verwendet wird, ist es erforderlich, es über eine wiederholte Diafiltration zu entfernen.
Der oben erhaltene Überstand, der das Oberflächenantigen enthält, wird weiter durch hydrophobe Säulenchromatographie gereinigt, wobei das hydrophobe Harz vorzugsweise ein Agarosegel mit Phenylresten ist. Bevor der Überstand mit dem hydrophoben Harz in Kontakt tritt, wird das Füllmaterial, d. h. hydrophobe Harz, mit einem Puffer mit einem pH im Bereich von 8,8 bis 11,0, bei dem es sich um den gleichen Puffer wie denjenigen handeln kann, der im vorigen Schritt verwendet wurde, äquilibriert.
Der Puffer kann bevorzugt Harnstoff in einer Konzentration im Bereich von 1 bis 4 M enthalten, um die kontaminierenden Proteine, die weniger hydrophob sind als das Oberflächenantigen, maximal zu entfernen.
Dann wird der Überstand, der das Oberflächenantigen enthält, durch die Säule geleitet, um mit dem Füllmaterial darin in Kontakt zu treten. Die Säule wird gründlich mit dem Gleichgewichtspuffer gewaschen, der 10–40 Gew.-% Ethylenglycol enthält, um die relativ schwach adsorbierten kontaminierenden Proteine von dem Füllmaterial zu entfernen. Dann wird das Oberflächenantigen, das an das hydrophobe Harz gebunden ist, mit dem Gleichgewichtspuffer, der 60 bis 80 Gew.-% Ethylenglycol enthält, eluiert.
Diese hydrophobe Säulenchromatographie stellt einen sehr effizienten Reinigungsschritt dar, in dem das meiste der verbleibenden Kontaminanten in dem Überstand nach dem Sililciumdioxid-Adsorptionsschritt entfernt werden kann. Insbesondere können pyrogene Materialien, die durch ein herkömmliches Verfahren schwer zu entfernen sind, über diesen Schritt entfernt werden. Harnstoff und Ethylenglycol, die in den Fraktionen verbleiben, welche das Oberflächenantigen enthalten, können z. B. durch Dialyse oder durch wiederholte Diafiltration entfernt werden, bei der vorzugsweise ein Puffer mit einem pH im Bereich von 6 bis 8 verwendet wird.
Die aus der hydrophoben Säulenchromatographie erhaltenen Fraktionen, die das Oberflächenantigen enthalten, werden weiter durch Größenausschluss-Gelfiltrations-Chromatographie in einem solchen Ausmaß gereinigt, dass das gereinigte Antigen bei der Herstellung eines Impfstoffs verwendet werden kann.
Die beispielhaften polaren Matrizes, die als Säulenfüllmaterial verwendet werden können, umfassen z. B. Agarosegel, Dextrangel und Polyacrylamidgel mit einem Molekulargewicht-Rückhaltewert von mindestens 1 000 000, bevorzugt von 5 000 bis 500 000. Die Größenausschluss-Gelfiltrations-Chromatographie wird durchgeführt, indem man die Fraktionen, die das Oberflächenantigen enthalten, durch eine Säule leitet, die mit Tris- oder Phosphat-Puffer mit einem pH im Bereich von 6 bis 8 äquilibriert ist, der Natriumchlorid in einer Konzentration im Bereich von 0,1 bis 0,2 M enthält; und das Oberflächenantigen mit dem gleichen Puffer eluiert.
Die Fraktionen, die das Oberflächenantigen enthalten, werden vereinigt, und die Reinheit des Oberflächenantigens und des darin enthaltenen preS2-Peptids werden mit SDS-PAGE bestimmt. Wie durch verschiedene Experimente in den folgenden Beispielen verifiziert, ist das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung gereinigte Oberflächenantigen so rein und ist der Gehalt an preS2-Peptid desselben so hoch, dass das gereinigte Antigen direkt bei der Herstellung des Impfstoffs verwendet werden kann.
Die folgenden Beispiele und das Vergleichsbeispiel sollen die Erfindung weiter erläutern, ohne ihren Bereich zu beschränken.
Weiter sind die Prozentsätze, die nachstehend für Feststoff-Feststoff-, Flüssigkeits-Flüssigkeits- und Feststoff-Flüssigkeits-Mischungen angegeben sind, auf der Basis von Gew./Gew., Vol/Vol. bzw. Gew./Vol., falls nicht speziell anders angegeben.
Beispiel 1
(Schritt 1) Aufbrechen von Hefezellen
Rekombinanter Saccharomyces cerevisiae KCTC 0098BP, der ein Hepatitis B-Oberflächenantigen exprimieren kann, welches das preS2-Peptid umfasst, wurde in 30 l YEPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2 Hefepepton, 1,6% Glucose) bei 27°C kultiviert. 70 g des so erhaltenen Hefezellkuchens wurden mit 140 ml eines Puffers 1 (50 mM Tris, pH 7,2, 1 M Natriumthiocyanat, 0,15 M Natriumchlorid, 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) gemischt, und die Mischung wurde in den Behälter einer Perlenprallmühle (Biospec Products, OKLA, U.S.A.) gegeben, welche 210 ml Glasperlen mit einem Durchmesser von 0,5 mm enthielt.
Der Behälter wurde in Eiswasser eingetaucht, und die Perlenprallmühle wurde dreimal jeweils 5 Minuten in einem 15-minütigen Zeitabstand betrieben. Das resultierende Zellhomogenisat wurde von den Glasperlen abgetrennt, die Glasperlen wurden mit 210 ml Puffer 1 gewaschen, und die Waschlösung wurde mit dem Zellhomogenisat vereinigt.
(Schritt 2) Extraktion und Lösung des Oberflächenantigens
Zu dem in (Schritt 1) erhaltenen Zellhomogenisat wurde 0,1% (Gew./Vol.) Tween 20 gegeben, und die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Die Lösung wurde durch die Zugabe von 5 N Natriumhydroxid auf pH 11,5 eingestellt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende Lösung wurde durch die Zugabe von 20%-iger Essigsäure auf pH 5,2 eingestellt, 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann 30 Minuten stehen gelassen.
Die Lösung wurde bei 8°C zentrifugiert, um die Zelltrümmer zusammen mit den Niederschlägen zu entfernen.
Der Überstand, der das Oberflächenantigen enthielt, wurde durch Zugabe von 5 N Natriumhydroxid auf pH 7,2 eingestellt. An diesem Punkt betrug das Volumen des Überstands etwa 300 ml.
(Schritt 3) Adsorption und Desorption unter Verwendung von Siliciumdioxid
Getrocknetes Siliciumdioxid wurde mit Wasser gemischt, um eine 5%-ige Aufschlämmung (Trockengewicht/Aufschlämmungsvolumen) herzustellen; 70 ml derselben wurden zu dem in (Schritt 2) erhaltenen Überstand gegeben, und die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende Lösung wurde 10 Minuten lang bei 5500 U/min zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen, und das ausgefallene Siliciumdioxid, an dem das Oberflächenantigen adsorbiert war, wurde zweimal mit Phosphat-Puffer (pH 7,2) gewaschen, der 0,15 M Natriumchlorid enthielt.
Das gewaschene Siliciumdioxid wurde zu 70 ml 50 mM Carbonatpuffer (pH 9,5) gegeben, der 1 M Harnstoff enthielt, und die Mischung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, um das Oberflächenantigen vom Siliciumdioxid zu desorbieren. An diesem Punkt zeigte der Puffer pH 9,2. Die Lösung wurde 30 Minuten lang bei 12 000 U/min zentrifugiert (Beckman JA14-Rotor), um den Überstand zu erhalten, der das Oberflächenantigen enthielt.
Die Menge des Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigens im Überstand betrug etwa 6,5 mg, wie es mit dem Auzyme-Kit (Abbott, U.S.A.) gemessen wurde.
Vergleichsbeispiel
Die gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 wurden wiederholt, außer dass kein Natriumthiocyanat in den Puffer 1 eingeschlossen wurde, um die gereinigte Oberflächenantigen-Lösung zu erhalten. Als Ergebnis betrug die Menge des Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigens in dem Überstand etwa 7,1 mg, als sie mit dem Auzyme-Kit gemessen wurde.
Die im Beispiel und Vergleichsbeispiel erhaltenen Oberflächenantigen-Lösungen wurden einer 15% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) unterzogen, gefolgt von Silberfärbung. Das Ergebnis ist in 1 gezeigt, in der die Bahnen 1 und 2 die Oberflächenantigen-Lösungen darstellen, die in Beispiel 1 bzw. dem Vergleichsbeispiel erhalten wurden. Hier zeigt A die intakte Proteinbande an; und B und C die Proteinfragmente, die aus dem Proteaseangriff resultierten.
Wie in 1 gezeigt, kann das Oberflächenantigen, das einen hohen preS2-Peptid-Gehalt umfasst, aus Hefezellen in hoher Ausbeute gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gereinigt werden.
Beispiel 2
(Schritt 1) Aufbrechen von Hefezellen
Rekombinanter Saccharomyces cerevisiae KCTC 0098BP, der ein Hepatitis B-Oberflächenantigen exprimieren kann, welches das preS2-Peptid umfasst, wurde in 300 l YEPD-Medium bei 27°C kultiviert. 3 kg des so erhaltenen Hefezellkuchens wurden mit 6 l Puffer 1 gemischt, und die Mischung wurde zweimal durch Dynomill (Glenmills, Japan), die 3 l Glasperlen mit einem Durchmesser von 0,5 mm enthielt, bei 10°C bei einem Durchsatz von 650 ml/min geleitet, um die Hefezellen aufzubrechen.
Das resultierende Zellhomogenisat wurde von den Glasperlen abgetrennt, die Glasperlen wurden mit 9 l Puffer 1 gewaschen, und die Waschlösung wurde mit dem Zellhomogenisat vereinigt. Die Menge des HBsAg im Überstand betrug etwa 754 mg, als sie mit dem Auzyme-Kit gemessen wurde.
(Schritt 2) Extraktion und Lösung des Oberflächenantigens
Zu dem in (Schritt 1) erhaltenen Zellhomogenisat wurde 0,1% (Gew./Vol.) Tween 20 gegeben, und die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Die Lösung wurde durch die Zugabe von 5 N Natriumhydroxid auf pH 11,5 eingestellt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende Lösung wurde durch die Zugabe von 20%-iger Essigsäure auf pH 5,2 eingestellt, 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann 30 Minuten stehen gelassen.
Die Lösung wurde bei 8°C zentrifugiert, um die Zelltrümmer zusammen mit den Niederschlägen zu entfernen.
Der Überstand, der das Oberflächenantigen enthielt, wurde durch die Zugabe von 5 N Natriumhydroxid auf pH 7,2 eingestellt. Als Ergebnis betrug das Volumen des Überstands schließlich etwa 12 l, und die Menge des HBsAg in dem Überstand betrug etwa 1250 mg, als sie mit dem Auzyme-Kit gemessen wurde.
Die Ausbeute des Oberflächen-Antigens betrug 165,8%, bezogen auf die in (Schritt 1) bestimmte Menge des Oberflächenantigens. Diese unerwartet hohe Ausbeute beruht hauptsächlich auf den vereinigten Wirkungen des Tensids und des Alkalis, welche die Antigenität erhöhen und die Löslichkeit des Oberflächenantigens fördern.
(Schritt 3) Adsorption und Desorption unter Verwendung von Siliciumdioxid
Der in (Schritt 2) erhaltene Überstand wurde mit dem zweifachen Volumen an 0,15 M Natriumchlorid verdünnt und dann auf Siliciumdioxid (Aerosil 380) gemäß dem folgenden Verfahren adsorbiert. Getrocknetes Siliciumdioxid wurde mit Wasser gemischt, um eine 10%-ige Aufschlämmung (Trockengewicht/Aufschlämmungsvolumen) herzustellen; 1,5 l derselben wurden zu dem in (Schritt 2) erhaltenen Überstand gegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei 4°C gerührt.
Die resultierende Lösung wurde 10 Minuten lang bei 5 500 U/min zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen, und das ausgefallene Siliciumdioxid, an dem das Oberflächenantigen adsorbiert war, wurde zweimal mit Phosphat-Puffer (pH 7,2) gewaschen, der 0,15 M Natriumchlorid enthielt.
Das gewaschene Siliciumdioxid wurde zu 3 l 50 mM Carbonatpuffer (pH 9,5) gegeben, der 1 M Harnstoff enthielt, und die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, um das Oberflächenantigen vom Siliciumdioxid zu desorbieren. An diesem Punkt zeigte der Puffer pH 9,2. Die Lösung wurde 30 Minuten lang bei 8700 U/min zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten, der das Oberflächenantigen enthielt.
Die Menge des HBsAg in dem Überstand betrug etwa 895 mg, als sie mit dem Auzyme-Kit gemessen wurde (Ausbeute: 118,7%).
(Schritt 4) Hydrophobe Säulenchromatographie
Zu dem in (Schritt 3) erhaltenen Überstand, der das Oberflächenantigen enthielt, wurde Harnstoff auf eine Endkonzentration von 4 M gegeben, und die resultierende Lösung wurde durch eine Phenylagarose-Säule geleitet, die mit 50 mM Carbonat-Puffer (pH 9,2) äquilibriert war, der 4 M Harnstoff enthielt. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen, der 20% Ethylenglycol enthielt. Dann wurde der gleiche Puffer, der 60% Ethylenglycol enthielt, zu der Säule gegeben, um das Oberflächenantigen zu eluieren.
Die eluierten Fraktionen, die das Oberflächenantigen enthielten, wurden vereinigt und mit einem Amicon-Diafiltrationssystem (Amicon, U.S.A.) mit einem molekularen Rückhalte-Wert von 100000 filtriert, um Harnstoff und Ethylenglycol in dem Eluat zu entfernen, und das resultierende Filtrat wurde unter Verwendung desselben Systems konzentriert.
Die Menge des HBsAg in dem Filtrat betrug etwas 546 mg, als sie mit dem Auzyme-Kit gemessen wurde (Ausbeute: 72,4%).
(Schritt 5) Gelfiltrations-Chromatographie
8 l Sepharose CL-4B (Pharmacia, U.S.A.) wurden in eine Säule gefüllt und mit einem Phosphat-Puffer (pH 7,2) äquilibriert, der 0,15 M Natriumchlorid enthielt. Das Konzentrat, das das Oberflächenantigen enthielt und in (Schritt 4) erhalten wurde, wurde durch die Säule geleitet und mit dem gleichen Puffer eluiert, um Fraktionen zu erhalten, die das Oberflächenantigen enthielten.
Die Menge des HBsAg (umfasst sowohl das intakte als auch Fragmente desselben aufgrund von Proteaseangriff) in den vereinigten Fraktionen betrug etwa 540 mg, als sie mit dem Auzyme-Kit gemessen wurde (Ausbeute: 71,6%), und die Reinheit des Oberflächenantigens betrug etwa 98,2%. Mittels SDS-PAGE wurde gemessen, dass der Gehalt des preS2-Peptids in dem Gesamt-Oberflächenantigen etwa 75% betrug. Die so erhaltene gereinigte Oberflächenantigen-Lösung wurde durch ein 0,2 μm-Filter (Corning, U.S.A.) filtriert, und das Filtrat wurde bei 4°C aufbewahrt.
Beispiel 3
(Schritt 1) Aufbrechen von Hefezellen
Rekombinanter Saccharomyces cerevisiae KCTC 0098BP wurde in 300 l YEPD-Medium bei 27°C kultiviert. 4 kg des so erhaltenen Hefezellkuchens wurden mit 8 l Puffer 1 gemischt, und die Mischung wurde bei 10°C zweimal durch Dynomill (Glenmills, Japan), die 3 l Glasperlen mit einem Durchmesser von 0,5 mm enthielt, mit einem Durchsatz von 650 ml/min geleitet, um die Hefezellen aufzubrechen.
Das resultierende Zellhomogenisat wurde von den Glasperlen abgetrennt, die Glasperlen wurden mit 12 l Puffer 1 gewaschen, und die Waschlösung wurde mit dem Zellhomogenisat vereinigt.
(Schritt 2) Extraktion und Lösung des Oberflächenantigens
Zu dem in (Schritt 1) erhaltenen Zellhomogenisat wurde 0,1% (Gew./Vol.) Tween 20 gegeben, und die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Zu der Lösung wurde eine gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung auf eine Endkonzentration von 10 gegeben, und die Mischung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende Lösung wurde bei 8°C zentrifugiert, um die Zelltrümmer zusammen mit den Niederschlägen zu entfernen.
Der Überstand wurde mit einem Amicon-Diafiltrationssystem (Amicon, U.S.A.) mit einem molekularen Rückhalte-Wert von 100000 unter Verwendung von 20 mM Tris-Puffer (pH 7,5) filtriert, um Thiocyanat und Natriumsulfat in demselben zu entfernen, und dann unter Verwendung desselben Systems auf ein Endvolumen von 6 l konzentriert.
Das Konzentrat wurde die durch die Zugabe von 5 N Natriumhydroxid auf pH 11,5 eingestellt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende Lösung wurde durch allmähliche Zugabe von 20%-iger Essigsäure auf pH 5,2 eingestellt, 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann 30 Minuten stehen gelassen. Die Lösung wurde bei 8°C zentrifugiert, um die Zelltrümmer zusammen mit den Niederschlägen zu entfernen.
Der Überstand wurde durch Zugabe von 5 N Natriumhydroxid auf pH 7,2 eingestellt, und die Menge des HBsAg in demselben betrug etwa 1400 mg, als sie mit dem Auzyme-Kit gemessen wurde.
(Schritt 3) Adsorption und Desorption unter Verwendung von Siliciumdioxid
Der in (Schritt 2) erhaltene Überstand wurde auf Siliciumdioxid (Aerosil 380) gemäß dem folgenden Verfahren adsorbiert. Getrocknetes Siliciumdioxid wurde mit Wasser gemischt, um eine 10%-ige Aufschlämmung (Trockengewicht/Aufschlämmungsvolumen) herzustellen; 2 l derselben wurden zu dem in (Schritt 2) erhaltenen Überstand gegeben, und die Mischung wurde bei 4°C über Nacht gerührt.
Die resultierende Lösung wurde 10 Minuten lang bei 5500 U/min zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen, und das ausgefallene Siliciumdioxid, an dem das Oberflächenantigen adsorbiert war, wurde zweimal mit Phosphat-Puffer (pH 7,2) gewaschen, der 0,15 M Natriumchlorid enthielt.
Das gewaschene Siliciumdioxid wurde zu 4 l 50 mM Carbonat-Puffer (pH 9,5) gegeben, der 1 M Harnstoff enthielt, und die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, um das Oberflächenantigen vom Siliciumdioxid zu desorbieren. An diesem Punkt zeigte der Puffer pH 9,2. Die Lösung wurde bei 8 700 U/min zentrifugiert, um den Überstand zu erhalten, der das Oberflächenantigen enthielt.
Die Menge des HBsAg in dem Überstand betrug etwa 840 mg, als sie mit dem Auzyme-Kit gemessen wurde.
(Schritt 4) Hydrophobe Säulenchromatographie
Zu dem in (Schritt 3) erhaltenen Überstand, der das Oberflächenantigen enthielt, wurde Harnstoff auf eine Endkonzentration von 4 M gegeben, und die resultierende Lösung wurde durch eine Phenylagarose-Säule geleitet, die mit 50 mM Carbonat-Puffer (pH 9,2) äquilibriert war, der 4 M Harnstoff enthielt. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen, der 20% Ethylenglycol enthielt. Dann wurde der gleiche Puffer, der 60% Ethylenglycol enthielt, zu der Säule gegeben, um das Oberflächenantigen zu eluieren.
Die eluierten Fraktionen, die das Oberflächenantigen enthielten, wurden vereinigt und mit einem Amicon-Diafiltrationssystem (Amicon, U.S.A.) mit einem molekularen Rückhalte-Wert von 100 000 filtriert, um Harnstoff und Ethylenglycol in dem Eluat zu entfernen, und das resultierende Filtrat wurde unter Verwendung desselben Systems konzentriert.
Die Menge des HBsAg in dem Filtrat betrug etwa 527 mg, als sie mit dem Auzyme-Kit gemessen wurde.
(Schritt 5) Gelfiltrations-Chromatographie
8 l Sepharose CL-4B (Pharmacia, U.S.A.) wurden in eine Säule gefüllt und mit einem Phosphat-Puffer (pH 7,2) äquilibriert, der 0,15 M Natriumchlorid enthielt. Das das Oberflächenantigen enthaltende Konzentrat, das in (Schritt 4) erhalten wurde, wurde durch die Säule geleitet und mit dem gleichen Puffer eluiert, um Fraktionen zu erhalten, die Oberflächenantigen enthielten.
Die Menge des Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigens in den vereinigten Fraktionen betrug etwa 480 mg, als sie mit dem Auzyme-Kit gemessen wurde, und die Reinheit des Oberflächenantigens betrug etwa 98,9%. Mittels SDS-PAGE wurde gemessen, dass der preS2-Peptid-Gehalt in dem Gesamt-Oberflächenantigen etwa 75% betrug. Die so erhaltene gereinigte Oberflächenantigen-Lösung wurde durch ein 0,2 μm-Filter (Corning, U.S.A.) filtriert, und das Filtrat wurde bei 4°C aufbewahrt.
Beispiel 4
Die Immunogenitäten des S- und preS2-Peptids in den Oberflächenantigenen, die in den Beispielen 2 und 3 erhalten wurden (nachstehend als "Oberflächenantigen 2" und "Oberflächenantigen 3" bezeichnet) wurden gemäß den folgenden Experimenten unter Verwendung von Meerschweinchen bestätigt.
1 ml (200 μg/ml) Oberflächenantigen 2 oder 3 wurde mit 18 m l Phosphat-Puffer (pH 7,2) gemischt, der 0,15 M Natriumchlorid enthielt, und die Mischung wurde durch ein 0,2 μm Spritzen-Filter filtriert. Das Filtrat wurde mit 1 ml 3% Alhydrogel (Superfos Biosector, Dänemark) gemischt. Das obige Verfahren wurde in sterilem Zustand auf einem sauberen Labortisch durchgeführt.
Jedem von 11 Meerschweinchen, die jeweils etwa 350 g wogen, wurde subkutan 1 ml der oben hergestellten Oberflächenantigen 2- oder 3-Zusammensetzung zweimal in einem Abstand von 15 Tagen injiziert. Nach 30 Tagen ab der ersten Injektion wurden jedem Meerschweinchen Blutproben entnommen, und die Seren wurden daraus abgetrennt. Als die Seren mit dem Ausab^®-Kit (Abbott, U.S.A.) analysiert wurden, betrugen die Raten der Antikörperbildung gegen S-Peptide von Oberflächenantigen 2 or 3 100%, die GMTs von Oberflächenantigen 2 und 3 betrugen 33,38 bzw. 29,77 mlE/ml.
Die Rate der Antikörperbildung gegen das preS2-Peptid wurde gemäß dem folgenden Verfahren bestimmt. 50 μl (1 mg/ml) des preS2-Peptids mit 26 N-terminalen Aminosäuren, die mit einem Peptid-Synthetisierer (Applied Biosystems, U.S.A.) unter Verwendung einer automatisierten Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert wurden, und 20 μl (10 mg/ml) Poly-L-lysin wurden zu 200 μl 50 mM Acetat-Puffer (pH 4,5) gegeben. Zu der Mischung wurden 10 μl 1%-iges EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid) gegeben, und die resultierende Mischung wurde 1 Stunde bei 37°C umgesetzt. Die resultierende Mischung wurde mit 20 ml 10 mM Carbonat-Puffer (pH 9,6) verdünnt und in die Vertiefungen einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen in einer Menge von 200 μl/Vertiefung gegeben. Die Platte wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, um die Peptid-Adsorption an der Vertiefungsoberfläche zu ermöglichen, und dann dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen.
PBS, die 0,5% Casein enthielt, wurde in einer Menge von 250 μl/Vertiefung in die Vertiefungen gegeben, und die Platten wurden mehr als 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, um alle nicht-spezifischen Reaktionen, die später stattfinden könnten, zu verhindern. In jede der Vertiefungen wurden positive und negative Kontrollen und 200 μl von jedem der Meerschweinchen-Seren gegeben, die seriell zehnfach mit PBS verdünnt waren (experimentelle Gruppe). Die Platte wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und dann fünfmal mit TTBS-Puffer (0,9% Natriumchlorid, 0,05% Tween 20, 10 mM Tris, pH 7,5) gewaschen. Eine Lösung, die Schweine-Anti-Meerschweinchen-Antikörper enthielt, der mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) markiert war und mit dem 4000-fachen Volumen PBS, das 0,5 Casein enthielt, verdünnt war, wurde in einer Menge von 200 μl/Vertiefung in die Vertiefungen gegeben. Die resultierende Mischung wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert und fünfmal mit TTBS-Puffer gewaschen.
Danach wurden 200 μl Substratlösung für Meerrettich-Peroxidase, die hergestellt wurde, indem man 200 μg Tetramethylbenzidin (TMB) in 20 μl DMSO löste, 10 ml 0,1 M Acetat-Puffer (pH 5,1) und 20 μl 30%-iges Wasserstoffperoxid dazu gab und durch Zugabe von destilliertem Wasser das Volumen der Lösung auf 20 ml einstellte, in jede Vertiefung gegeben und umgesetzt, bis sich die Farbe entwickelte. Zu der resultierenden Mischung wurden 50 μl 1 N Schwefelsäure pro jede Vertiefung gegeben, um die Farbentwicklung anzuhalten, und die O. D. jeder Vertiefung wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm mit einem Mikroplatten-Ablesegerät (Dynatech MR5000, U.S.A.) bestimmt.
Wenn die O. D. der experimentellen Gruppe höher war als der Grenzwert (zweimal der O. D.-Wert der negativen Kontrolle), wurde festgelegt, dass die Antikörperbildung gegen das preS2-Peptid stattgefunden hat, und die Zahl der Meerschweinchen, die eine positive Antikörperreaktion zeigten, wurde gezählt.
Als Ergebnis zeigten sowohl das Oberflächenantigen 2 als auch 3 eine Antikörper-Bildungsrate von 100%.
Beispiel 5
Um die Immunogenität des S- und preS2-Peptids in den Oberflächenantigenen 2 und 3 zu bestimmen, wurden die folgenden Experimente unter Verwendung von Mäusen durchgeführt. 1 ml (200 μg/ml) Oberflächenantigen 2 oder 3 wurde mit 18 ml Phosphat-Puffer (pH 7,2) gemischt, der 0,15 M Natriumchlorid enthielt, und die Mischung wurde durch ein 0,2 μm-Spritzen-Filter filtriert. Das Filtrat wurde mit 1 ml 3% Alhydrogel (Superfos Biosector, Denmark) gemischt.
Die resultierende Lösung, die 10 μg/ml des Oberflächenantigens 2 oder 3 enthielt, wurde mit einem Alhydrogel-Verdünnungsmittel (das durch Verdünnung von Alhydrogel hergestellt wurde) mit Phosphat-Puffer (pH 7,2), der 0,15 M Natriumchlorid enthielt, auf eine Endkonzentration von 0,15% verdünnt, um 4 Proben herzustellen, die 0,01, 0,03, 0,09 bzw. 0,27 ng/ml des Oberflächenantigens aufwiesen. Die Behälter, welche die Proben enthielten, wurden ausreichend geschüttelt, um die Fällung des Alhydrogels zu verhindern. Das obige Verfahren wurde in sterilem Zustand auf einem sauberen Labortisch durchgeführt.
80 fünf Wochen alte Mäuse wurden in 8 Gruppen aufgeteilt, die jeweils aus 10 Mäusen bestanden, und jeder Maus wurde peritoneal 1 ml jeder der oben hergestellten verdünnten Lösungen des Oberflächenantigens 2 oder 3 injiziert. Nach 28 Tagen ab der Injektion wurden jeder Maus Blutproben entnommen, und die Seren wurden daraus abgetrennt. Die Antikörper gegen S-Peptid wurden mit dem Ausab-Kit (Abbott, U.S.A.) bestimmt, und die obigen Antikörper-Bildungsraten gegen S-Peptide im Oberflächenantigen 2 oder 3 sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1
Die Antikörper gegen das preS2-Peptid wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 4 bestimmt, und die obigen Antikörper-Bildungsraten gegen die preS2-Peptide im Oberflächenantigen 2 oder 3 sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2
Die wirksame Dosis 50 (ED₅₀) des S- und preS2-Peptids wurde durch das Probit-Verfahren (Finney, D. J., Probit Analysis, 1971) unter Verwendung der oben erhaltenen Antikörper-Bildungsraten berechnet. Als Ergebnis betrug die ED₅₀ des S- und preS2-Peptids im Oberflächenantigen 2 0,0580 bzw. 0,0577 ng/ml, und diejenige des S- und preS2-Peptids im Oberflächenantigen 3 betrugen 0,0455 bzw. 0,0469 ng/ml. Da jedoch der Gehalt an preS2-Peptid im Oberflächenantigen 2 oder 3 75% beträgt, wird angenommen, dass die ED₅₀ des preS2-Peptids niedriger ist als der oben erhaltene berechnete Wert.
Wie in den obigen Beispielen gezeigt, kann ein Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen mit einem hohen preS2-Peptid-Gehalt und dem hoch immunogenen S- und preS2-Peptid darin aus rekombinanten Hefezellen gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden.
Während die Erfindung mit Bezug auf die obigen speziellen Ausführungsformen beschrieben wurde, sollte anerkannt werden, dass vom Fachmann verschiedene Abwandlungen und Änderungen bei der Erfindung vorgenommen werden können, die ebenfalls in den Bereich der Erfindung fallen, wie er durch die beigefügten Ansprüche definiert ist.

Claims

Verfahren zur Reinigung von Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen, das ein preS2-Peptid enthält, aus Zellen eines rekombinanten Organismus, welches umfasst: (a) Aufbrechen der Zellen in einem Puffer, der ein chaotropes Salz oder ein Denaturierungsmittel enthält, um ein Zell-Homogenisat zu erhalten; (b) Zugabe eines Tensids zu dem in Schritt (a) erhaltenen Zell-Homogenisat und Alkalisieren des Homogenisats auf einen pH von 11,0 bis 13,5, um die Löslichmachung des Oberflächenantigens zu erhöhen, wodurch man ein alkalisiertes Homogenisat erhält; (c) Ansäuern des in Schritt (b) erhaltenen alkalisierten Homogenisats auf einen pH von 4,5 bis 6,0, um Zelltrümmer, Lipide und einige kontaminierende Proteine zu fällen, wodurch man ein angesäuertes Homogenisat erhält; (d) Zentrifugieren des in Schritt (c) erhaltenen angesäuerten Homogenisats, um eine Überstandslösung zu erhalten, die das Oberflächenantigen und verbleibende kontaminierende Proteine enthält; (e) Behandeln der in Schritt (d) erhaltenen Lösung mit Siliciumdioxid, um das Oberflächenantigen auf dem Siliciumdioxid zu adsorbieren, Entfernen der verbleibenden kontaminierenden Proteine durch Waschen und Desorbieren des Oberflächenantigens von dem Siliciumdioxid unter Verwendung eines Puffers, wodurch man eine Fraktion von gereinigtem Oberflächenantigen erhält; (f) Durchführen einer hydrophoben Säulenchromatographie mit der in Schritt (e) erhaltenen Fraktion von gereinigtem Oberflächenantigen, wodurch man Fraktionen erhält, die weiter gereinigtes Oberflächenantigen enthalten; und (g) Reinigung der in Schritt (f) erhaltenen Fraktionen durch Größenausschluss-Gelfiltrationschromatographie, wodurch man das Oberflächenantigen in reiner Form erhält.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem das chaotrope Salz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Natriumthiocyanat, Kaliumthiocyanat, Ammoniumthiocyanat, Guanidiniumchlorid und Harnstoff besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Konzentration des chaotropen Salzes in dem Puffer im Bereich von 1 bis 8 M liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, welches weiter die Schritte umfasst: Zugabe von Natriumsulfat oder Ammoniumsulfat zu dem in Schritt (b) oder (c) erhaltenen Zellextrakt bis zu einer Konzentration im Bereich von 8 bis 15% (Gew./Vol.); Entfernen von Zelltrümmern und Kontaminanten; und Durchführen einer Diafiltration des Überstands vor Schritt (d).
Verfahren nach Anspruch 1, in dem das in Schritt (a) verwendete Tensid Tween^® 20, Tween^® 80, Triton X-100 oder Natriumdesoxycholat ist.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Konzentration des in Schritt (a) verwendeten Tensids im Bereich von 0,1 bis 0,5% (Gew./Vol.) auf der Grundlage des Volumens des Zell-Homogenisats liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem der in Schritt (a) erhaltene Zellextrakt im Schritt (b) auf einen pH im Bereich von 11,0 bis 13,5 eingestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem der pH des Zellextrakts im Schritt (c) auf einen Bereich von 4,5 bis 6,0 eingestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem das in Schritt (d) verwendete Siliciumdioxid eine Oberfläche im Bereich von 100 bis 500 m²/g aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem das Oberflächenantigen in Schritt (d) von dem Siliciumdioxid unter Verwendung eines Puffers desorbiert wird, der einen pH im Bereich von 8,8 bis 11,0 aufweist und Harnstoff in einer Konzentration im Bereich von 1 bis 8 M und ein Tensid in einer Konzentration im Bereich von 0,1 bis 0,3 Gew.-% enthält.
Verfahren nach Anspruch 10, in dem das Tensid Natriumdesoxycholat ist.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem das hydrophobe Harz in Schritt (a) ein Agarosegel mit Phenylgruppen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die hydrophobe Säulenchromatographie in Schritt (e) durchgeführt wird, indem man die Fraktion, die das Oberflächenantigen enthält, durch eine Säule leitet, die mit einem Äquilibrierungspuffer äquilibriert ist, der einen pH im Bereich von 8,8 bis 11,0 aufweist und Harnstoff in einer Konzentration im Bereich von 1 bis 4 M enthält; die Säule mit dem Äquilibrierungspuffer, der 10–40 Gew.-% Ethylenglycol enthält, wäscht; und das Oberflächenantigen mit dem Äquilibrierungspuffer, der 60–80 Gew.-% Ethylenglycol enthält, eluiert.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Größenausschlusschromatographie in Schritt (f) unter Verwendung eines Dextrangels oder eines Polyacrylamidgels mit einem Molekulargewicht-Begrenzungswert von mindestens 1.000.000 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Größenausschlusschromatographie in Schritt (f) durchgeführt wird, indem man die Fraktion, die das Oberflächenantigen enthält, durch eine Säule leitet, die mit einem Tris- oder Phosphatpuffer äquilibriert ist, der einen pH im Bereich von 6 bis 8 aufweist und Natriumchlorid in einer Konzentration im Bereich von 0,1 bis 0,2 M enthält; und das Oberflächenantigen mit dem gleichen Puffer eluiert.