DE69133525T2

DE69133525T2 - Verfahren zur Herstellung von recombinantem Hepatitis B Oberflächenantigen mit erhöhter Immunogen-Kapazität und Verwendung in einer Impfstoffzubereitung

Info

Publication number: DE69133525T2
Application number: DE69133525T
Authority: DE
Inventors: Verena L. González Plaza de la Revolucion Muzio; Eduardo Penton Arias; Giuvel Eden Fontirrochi Escobar; Marcelo Puentes Grandes Nazábal Gálvez; Marta de Jesus Lawton 10 de Octubre González Griego; Alejandro Marianao Beldarrain Iznaga; Guillermo Julio Cubanacan Playa Padron Gonzalez; Victoria Ramirez Albajes; Arnaldo Garcia Pena; Carlos Enrique Ruiz Cruz; Gladys Mabel Vibora 10 de Oct. Izquierdo Lopez; Luis Saturnino Herrera Martinez; Carlos Antonio Center Habana Duarte Cano; Lilia Luisa Playa Perez Suarez; Jose Garcia Suárez; Gustavo Alberto Vibora de la Riva de la Riva; Ramon Alexis Lisa Santiago Avila; Filiberto Rosendo Playa Ayon Zorrilla; Rolando Paez Meireles; Alberto Playa Agraz Fierro
Original assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Current assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Priority date: 1990-10-08
Filing date: 1991-10-07
Publication date: 2006-11-23
Also published as: JPH0576370A; GR3029582T3; EP0864649B1; EP0864649A2; CU22290A1; ATE175445T1; DK0864649T3; DE69133525T8; DE69133525D1; AU8557491A; DE69130724D1; EP0480525A2; JP3242640B2; ATE324451T1; DE69130724T2; EP0480525A3; ES2129025T3; DK0480525T3; EP0480525B1; ES2264183T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnik und der Biotechnologie und insbesondere das der Herstellung von Impfstoffen gegen den Hepatitisvirus B.
Die Infektion mit dem Hepatitisvirus B stellt weltweit ein bedeutendes Gesundheitsproblem dar, da sie nicht nur zu einer akuten Krankheit führt sondern sich auch zu chronischen Formen, Leberzirrhose und -insuffizienz und einem hepatozellulären Karzinom entwickeln kann. Es wird geschätzt, daß es weltweit etwa 200 Millionen chronische Träger dieses Virus gibt, die das grundsätzliche Reservoir dieses infektiösen Mittels bilden.
Gegenwärtig gibt es keine wirksame Behandlung für den Virus, so daß die Verhinderung den einzigen Weg darstellt, dessen Ausbreitung zu vermindern und die Infektionshäufigkeit zu verringern.
Es gibt zwei Hauptstrategien für die Herstellung von Impfstoffen gegen den Hepatitisvirus B: jene, die von Plasma abgeleitet sind, und jene, die durch gentechnische Verfahren erhalten werden.
Die vom Plasma abgeleiteten Impfstoffe basieren auf der Reinigung von HBsAg aus dem Plasma von chronischen Trägern des Virus durch verschiedene physikalische Verfahren und dessen Inaktivierung (A.J. Zuckerman et al., British Medical Journal, 1985, 290: 492). Diese Wirkstoffe zeigen seit Jahren ihre Wirksamkeit und Sicherheit (A.M. Prince et al., Annual Clinical Research, 1982, 14: 225) und sind nicht mit der Gefahr der Übertragung des Human-Immundefizienzvirus oder anderer infektiöser Mittel verbunden (F. Deinhardt et al., Journal of Medical Virology, 1985, 17: 209).
Die extensive Verwendung dieses Impfstoffs wird jedoch durch die begrenzte Verfügbarkeit von Seren von Trägern des Virus, um HBsAg zu erhalten, das für die Herstellung des Impfstoffs verwendet wird, die erforderlichen strengen Verfahren zum Reinigen und Inaktivieren des Hepatitisvirus B und zum Entfernen anderer infektiöser Mittel, die im Plasma vorhanden sein können, sowie auch durch die langen Sicherheitstests beeinträchtigt, die für die Reinheit der Impfstoffchargen erforderlich sind. Außerdem gibt es bestimmte Bedenken, daß bei der Herstellung des Impfstoffs infektiöse Mittel, die durch Blut übertragbare Krankheiten verursachen, aus dem Inaktivierungsprozeß entweichen können, als Folge davon besteht die allgemeine Tendenz, von Blut abgeleitete Produkte durch jene zu ersetzen, die durch gentechnische Verfahren erhalten wurden.
Das Gen in Form des Hepatitisvirus B-Oberflächenantigens ist geklont und in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen ausgeprägt worden.
In Bakterien waren die erhaltenen Expressionsmengen gering, und es fand keine wirksame Einführung des Antigens in immunogene Partikel mit 22 nm statt, deshalb wurde dieses System nicht als Antigenquelle für die Herstellung von Impfstoffen verwendet (P. Valenzuela et al., Nature, 1980, 280: 815; C.J. Burrell et al., Nature, 1979, 279: 43).
Eukaryotische Zellen wurden auch bei der Herstellung von HBsAg verwendet (M.L. Michel et al., Biotechnology, 1985, 3: 561; G.M. MacNab et al., British Journal of Cancer, 1976, 36: 509). Die Herstellung von Impfstoffen unter Anwendung dieses Verfahrens erfordert jedoch eine Ausrüstung, eine Methodologie und Kulturmedien, die komplex und teuer sind, und bringt Probleme bei der maßstablichen Vergrößerung der Produktion mit sich. Aufgrund der Gefahr eines vorhandenen Retrovirus bestehen auch Bedenken bezüglich der Sicherheit von Impfstoffen, die von tumorerzeugenden Mammaliazellinien abgeleitet sind, und obwohl das erhaltene Antigen Eigenschaften aufweist, die dem natürlichen Antigen ähnlich sind, wird dieses Verfahren somit ebenfalls nicht für die Massenproduktion dieses Impfstoffs verwendet.
Der genetisch manipulierte Vaccinavirus ermöglicht es, rekombinante Viren, die HBsAg ausprägen, allein oder in Kombination mit anderen Antigenen für die Produktion von lebenden Impfstoffen für infektiöse Mittel zu erhalten (C. Cheng et al., Journal of Virology, 1986, 60: 337; E. Paoletti et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1984, 81: 193). Die auf diese Weise erhaltenen Impfstoffe sind aufgrund zahlreicher technischer und ethischer Überlegungen nicht für die umfangreiche Verwendung beim Menschen zugelassen worden.
Die rekombinanten Impfstoffe für Hepatitis B, die kommerziell zur Verfügung stehen, basieren grundsätzlich auf der Produktion von HBsAg durch genetisch manipulierte Hefen.
Die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist in großem Umfang eingesetzt worden, um biologisch aktive heterologe Proteine für eine umfangreiche Verwendung zu produzieren (S.M. Kingsman et al., Tictech, 1987, 5: 53) und HBsAg in großen Mengen zu gewinnen (W.J. McAleer et al., Nature, 1984, 307: 178; N. Harford et al., Post-graduate Medical Journal, 1987, 63 Suppl. 2: 65; G.A. Bitter et al., Journal of Medical Virology, 1988, 25: 123).
Das erhaltene Antigen wird intrazellulär produziert und durch verschiedene Verfahren zum Aufbrechen der Zellen herausgelöst und durch verschiedene physikalisch-chemische Verfahren gereinigt, die es ermöglicht haben, Reinheitswerte von mehr als 97 % und ein Produkt zu erreichen, das ein antigenes Verhalten aufweist, das dem Plasmaantigen ähnlich ist, wie es bei Tieren und dem Menschen nachgewiesen worden ist (P. Hauser et al., Postgraduate Medical Journal, 1987, 63 Suppl. 2: 83).
Kürzlich wurde von einem effizienten Expressionssystem berichtet, das als Wirt die methylotrophe Hefe Pichia pastoris verwendet und das auf der Verwendung des Promotors des Gens für das Enzym Alkoholoxidase I basiert, das das erste Enzym darstellt, das am Verwertungsweg von Methanol durch diese Hefe beteiligt ist; dieser Promotor ist streng reguliert und ermöglicht es, große Mengen des Enzyms (bis zu 30 %) auszuprägen, wenn die Zellen in Gegenwart von Methanol wachsen, und nicht wenn sie in Gegenwart von Glucose wachsen (S.B. Ellis et al., Molecular and Cellular Biology, 1985, 5: 1111; R. Couderc et al., Agric. Biol. Chem., 1980, 44: 2259).
Die Hefe P. pastoris ist bereits für die Expression verschiedener heterologer Proteine, einschließlich HBsAg (J.M. Cregg et al., Biotechnology, 1987, 5: 479) in einem genetischen Konstrukt, bei dem das Gen, das HBsAg codiert, unter den regelnden Signalen des Promotors des Enzyms Alkoholoxidase 1 geklont worden ist, in einer Expressionskassette verwendet worden, die in das Chromosom eines Mutantenstamms dieser Hefe integriert worden ist, wodurch es möglich wird, daß bei der Aktivierung des Systems in Gegenwart von Methanol 2 bis 3 % des erzeugten löslichen Proteins HBsAg sind. Es wird jedoch keine Reinigung des Antigens offenbart.
Ein wichtiger Vorteil, den das System Pichia pastoris gegenüber dem von S. cerevisiae zeigt, ist die sehr wirksame Einführung des Antigens in Partikel mit 22 nm, da praktisch das gesamte erzeugte Antigen in Partikelform vorliegt, das steht im Gegensatz zu dem, was in S. cerevisiae passiert, bei dem nur ein geringer Anteil des Monomers mit 24 kDa in die Antigenpartikel eingeführt wird (P. Valenzuela et al., Nature, 1982, 298: 347; R.A. Hitzeman et al., Nucleic Acids Research, 1983, 11: 2745; M. Miyanohara et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1983, 80: 1). Die auf rekombinantem HBsAg basierenden Impfstoffpräparate, die gegenwärtig auf dem Markt verfügbar sind, verwenden jedoch als Quelle weiterhin die Hefe S. cerevisiae.
Andererseits beinhalteten die am häufigsten verwendeten Reinigungsverfahren für das Hepatitis B-Oberflächenantigen von Hefe die Anwendung von Dichtegradienten-Zentrifugierverfahren (europäische Patentanmeldung Nr. 278 940 A3 von Smith Kline), deren Durchführung in industriellem Umfang teuer und komplex ist.
In der europäischen Patentanmeldung Nr. 337 492 von Phillips Petroleum wird ein Verfahren zur Gewinnung des Hepatitis B-Oberflächenantigens aus einem rekombinanten Stamm von Pichia pastoris beschrieben. Obwohl der Zweck darin besteht, das Hepatitis B-Oberflächenantigen in einem ausreichenden Reinheitszustand zu gewinnen, so daß es direkt in einem Impfstoff aufgenommen werden kann, werden weder die Eigenschaften des Antigens bezüglich seiner Partikelform nach der Reinigung noch dessen immunogene Kapazität beschrieben, wenn es in einem Impfstoffpräparat enthalten ist.
Das Verfahren von Phillips Petroleum umfaßt das Auflösen der Hefezellen in Gegenwart eines chaotropen Salzes und das Abtrennen des Überstands, der das Antigen enthält, vom aufgelösten Zellpellet, das Fällen der Lipide und verunreinigender Proteine aus dem Überstand bei pH = 4,5 bis 5,5 und das Entfernen des gefällten Rückstandes, das Unterziehen des Überstandes Konzentrierungs- und Diafiltrationsbehandlungen, den Kontakt des zurückgehaltenen Materials, das das Antigen enthält, mit Silicamaterial, das Waschen der verunreinigten Proteine aus dem Silicamaterial und das Eluieren des Hepatitis B-Oberflächenantigens mit einem Puffer mit pH = 9,5 bis 11,0, der Harnstoff enthält, das Unterziehen der geeigneten Fraktion einer Gelfiltration mit einem Material, das einen Grenzwert für den Ausschluß nach dem Molekulargewicht aufweist, der geeignet ist, um das Partikel des Hepatitis B-Oberflächenantigens von Verunreinigungen zu trennen, dem Kontakt der geeigneten Fraktion mit einem Anionenaustauschharz und das Eluieren des Partikels des Hepatitis B-Oberflächenantigens aus dem Harz mit einem Puffer mit pH = 6 bis 9.
Bei diesem Verfahren wird ein chaotroper Puffer für den Auflösungs/Extraktions-Schritt verwendet. Dieser Puffer enthält Kaliumthiocyanat als chaotropes Mittel und Phenylmethylsulfonylfluorid als Proteaseinhibitor. Die letztgenannte Verbindung ist stark giftig, so daß es erforderlich ist, beim Reinigungsprozeß alle Spuren davon zu beseitigen. Obwohl diese Substanz bei der Hemmung von Protease wirksam ist, ist deren Hemmungsspektrum zudem begrenzt.
Danach wird der HBsAg enthaltende Überstand diafiltriert, und diese Fraktion wird mit Silicamaterial in Kontakt gebracht. Um die Trennung des Hepatitis B-Oberflächenantigens vom Silicamaterial vorzunehmen, wird ein harnstoffhaltiger Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 9,5 bis 11 verwendet. Diese Verbindung ist stark denaturierend und deren Verwendung kann zum Verlust der Immunogenität des erhaltenen Produktes führen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues rekombinantes Hepatitis B-Oberflächenantigen, eine neue Impfstoffzusammensetzung für die Immunisierung gegenüber dem Hepatitisvirus B und eine neue Verwendung eines bestimmten Stammes von Pichia pastoris und einen monoklonalen Antikörper für HBsAg bereit, die jeweils wie in den Ansprüchen definiert sind. Die Beschreibung offenbart ein Verfahren zum Reinigen, wobei garantiert wird, daß ein rekombinantes Antigen aus Pichia pastoris erhalten wird, das durch ein hohes Ausmaß der Partikelbildung und Homogenität gekennzeichnet ist, durch das hervorragende immunogene Eigenschaften verliehen werden.
Das Verfahren zur Gewinnung des Hepatitis B-Oberflächenantigens aus Zellen von Pichia pastoris, die ein Gen enthalten, das dieses Hepatitis B-Oberflächenantigen codiert, und die es ausgeprägt haben, umfaßt: das Züchten von Zellen des Stammes Pichia pastoris C226 [pTAO906], CBS450.90, die ein Gen enthalten, das dieses Hepatitis B-Oberflächengen codieren kann, bei Bedingungen, die zu dessen Expression führen;
das Auflösen der Zellen in Gegenwart eines Puffers, der ein chaotropes Mittel, Sacccharose und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) umfaßt;
das Fällen von Verunreinigungen bei einem sauren pH-Wert;
das Unterziehen des Antigenpräparats einer sauren Adsorptions- und alkalischen Desorptionsbehandlung über einer Kieselerdematrix;
das Unterziehen des Antigenpräparats der Immunoaffinitätschromatographie unter Verwendung des für das Hepatitis B-Oberflächenantigen spezifischen monoklonalen Antikörpers CB HEP1, der von der Hybridomzellinie ECACC 90 112 606 produziert worden ist;
das Unterziehen des eluierten Antigens einer Wärmebehandlung bei einer Temperatur von 30 bis 40°C;
das Waschen des Antigens in einer Anionenaustauschsäule mit einem Detergens; und
das Unterziehen des eluierten Antigens der HPLC in Gegenwart eines Detergens.
Es ist bevorzugt, daß das Auflösen der Zellen in Gegenwart eines Puffers erfolgt, der Kaliumthiocyanat, Saccharose, EDTA, Tris und NaCl umfaßt. Besonders bevorzugt erfolgt das Auflösen der Zellen in Gegenwart eines Puffers, der 1 bis 4 m Kaliumthiocyanat, 1 bis 15 % (Gew./Vol.) Saccharose, 2,5 bis 3,5 mM EDTA, 10 bis 30 mM Tris und 0,1 bis 1 m NaCl umfaßt, wobei er im wesentlichen aus 291 g/l Kaliumthiocyanat, 100 g/l Saccharose, 1,86 g/l EDTA, 12 g/l Tris und 17,5 g/l NaCl besteht.
Es ist auch bevorzugt, daß das Fällen der Verunreinigungen mit Säure bei einem pH-Wert von 3 bis 4 erfolgt.
Falls erwünscht, kann das Antigenpräparat, das nach dem Entfernen des beim Fällungsschritt mit einer Säure gebildeten Niederschlags erhalten worden ist, bei einem pH-Wert von 7 bis 8 aufbewahrt werden.
Vorzugsweise wird das Antigenpräparat, das nach dem Entfernen des beim Fällungsschritt mit einer Säure gebildeten Niederschlags erhalten wird, bei einem pH-Wert von 3 bis 5 mit einer Kieselerdematrix in Kontakt gebracht, um das Antigen zu adsorbieren, und die Verunreinigungen werden mit einem Elutionspuffer mit einem pH-Wert von 3 bis 5 eluiert, darauf folgt die Desorption des Antigens bei pH = 7,5 bis 9,0.
Falls erwünscht, kann das aus der Kieselerde desorbierte Antigenpräparat herkömmlichen Konzentrierungs- und Entsalzungsbehandlungen unterzogen werden, zum Beispiel durch Ultrafiltration konzentriert und durch Diafiltration entsalzt werden.
Der bei der Immunoaffinitätschromatographiebehandlung des Antigenpräparats verwendete monoklonale Antikörper ist ein monoklonaler Antikörper der wegen der hohen Affinität gegenüber den antigenen Partikeln des Hepatitis B-Oberflächenantigens ausgewählt worden ist. Der bei der Immunoaffinitätschromatographiebehandlung des Antigenpräparats verwendete monoklonale Antikörper ist Anti-HBsAg CB-HEP1, der von der Hybridomzellinie ECACC 90 112 606 produziert wird.
Das Antigen wird vorzugsweise mit einem Puffer, der ein chaotropes Mittel enthält, aus der Säule für die Immunoaffinitätschromatographie eluiert.
Es ist bevorzugt, daß die Wärmebehandlung des eluierten Antigens 1 bis 6 Stunden bei 30 bis 40°C erfolgt.
Nach der Wärmebehandlung wird das Antigen gewaschen, vorzugsweise in einer DEAE-Cellulose-Säule mit einem Detergens, wie Natriumdesoxicolat und Triton X-100. Das Detergens wird mit einer Konzentration von 0,01 bis 0,5 Gew.-%, vorzugsweise 0,05 bis 0,1 Gew.-% eluiert. Dann wird das Antigen eluiert.
Das eluierte Antigen wird dann vorzugsweise der HPLC mit einem Trennfaktor zwischen 20.000 und 10.000.000 in Gegenwart eines Detergens, wie Natriumdesoxicolat, unterzogen. Das Detergens wird mit einer Konzentration von 0,01 bis 0,5 Gew.-%, vorzugsweise etwa 0,05 Gew.-% verwendet.
Das Hepatitis B-Oberflächenantigen wird aus dem rekombinanten Stamm von Pichia pastoris C226 [pTAO906], CBS450.90 gewonnen.
Die Erfindung wird nunmehr ausführlicher erläutert.
Der erste Schritt des Verfahrens besteht im Auflösen der Zellen mit einem Puffer, der EDTA, Tris, NaCl, Saccharose und Kaliumthiocyanat enthält. Bei diesem Schritt ist das Vorhandensein von EDTA wichtig, das ein Proteaseinhibitor mit einem weiten Hemmungsspektrum darstellt und auch biologisch vollkommen kompatibel ist. Die Saccharose behält den Konformationszustand des Moleküls sowie auch dessen Halbwertszeit bei. Kaliumthiocyanat ist ein herkömmliches chaotropes Mittel, statt dessen können auch andere verwendet werden.
Nach dem Aufbrechen der Zellen wird die Abtrennung der Bruchstücke gleichzeitig mit dem Fällen der verunreinigenden Proteine mit einer Säure durchgeführt, wobei ein pH-Bereich von 3 bis 4 angewendet wird. Dieses Verfahren ermöglicht es, die Anzahl der Schritte beim Reinigungsverfahren zu verringern und gleichzeitig das Verfahren mit einem Material mit hoher Reinheit (mehr als 10 % des Antigens) und bei einer guten Wiedergewinnung zu beginnen. Dieser Schritt sichert ferner die Beseitigung von verunreinigenden Lipiden, Kohlehydraten und DNA. Nach dem Zentrifugieren kann der Überstand, der das Antigen enthält, bei einem pH-Wert von 7 bis 8 aufbewahrt werden. Um die anschließende Reinigung durchzuführen, wird der pH-Wert des Präparats wieder auf pH = 3 bis 5 verringert, und danach kann das Präparat mit einer Celite-Matrix in Kontakt gebracht werden, auf der das Antigen adsorbiert wird. Die Matrix wird mit einer gepufferten Lösung mit einem pH-Wert von 3 bis 5 (Tris-HCl, Kaliumthiocyanat, Saccharose und EDTA) gewaschen, um Verunreinigungen, wie Kohlehydrate, Lipide und DNA, zu entfernen. Das Antigen wird aus der Matrix gewonnen, indem der pH-Wert geändert wird, wobei ein Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 bis 9,0 verwendet wird. Dieser Schritt sichert, daß das Antigen mit einer Reinheit von 40 bis 50 % ohne Gefahren der Denaturierung oder des Verlusts der Partikelform des Antigens gewonnen wird, da bei dessen Elution milde Bedingungen angewendet werden.
Das Elutionsmittel, das das Antigen enthält, das aus dem Celite desorbiert worden ist, wird durch Ultrafiltration auf das 30- bis 40-Fache konzentriert, wobei eine Membran mit 0,1 μm verwendet wird, und später wird das Präparat mit 3 Volumina eines angemessenen Puffers (Tris-HCl, EDTA, pH-Wert 7 bis 8) diafiltriert und dann einem weiteren Reinigungsschritt durch Immunoaffinitätschromatographie unterzogen, wobei monoklonale Antikörper verwendet werden, die besonders auf die Auswahl von antigenen Partikeln geprüft worden sind. Diese monoklonalen Antikörper werden verwendet, um belastende Behandlungen zu vermeiden und möglicherweise bestimmte Epitope zu erkennen, die bestimmte immunogene Eigenschaften aufweisen, wie es bei Schimpansen nachgewiesen worden ist (Schellekens, H; De Reus, A; Peetermans, J.H. und Van Eerd, P.A.C.M. Postgraduated Medical Journal, 1987, 63, Supplement (2), S. 93-96). Die Fraktion, die HBsAg enthält, das vom vorhergehenden Schritt erhalten worden ist, wird auf die Affinitätssäule aufgebracht, die in einem angemessenen Puffer, wie Tris-HCl, Kalium- oder Natriumphosphat, mit einem pH-Wert von 6 bis 7 ausgeglichen worden ist, wobei eine Strömung von 25 bis 50 cm/h verwendet wird. Die nicht adsorbierten Fraktionen in der Säule (verunreinigende Substanzen)-werden gewaschen, wobei der Ausgleichspuffer mit einem Zusatz von 1 m NaCl verwendet wird. Das Antigen wird aus der Säule gewonnen, wobei ein Puffer, wie Tris-HCl oder Phosphat, das Kaliumthiocyanat im Bereich von 1 bis 3 m enthält, verwendet wird. Das von diesem Schritt erhaltene Material hat eine Reinheit von mehr als 85 %.
Ein weiterer neuer Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, daß das Elutionsmittel, das das Antigen enthält, das im vorhergehenden Schritt erhalten worden ist, dann während eines Zeitraums von 1 bis 6 Stunden einer Wärmebehandlung bei 30 bis 40°C, vorzugsweise 37°C, unterzogen wird. Dieser Schritt ermöglicht eine sehr gute Gewinnung von homogenen Partikeln mit 22 nm, die eine sehr gute Immunogenität zeigen. Diese Tatsache wird besonders im nächsten Schritt deutlich, der aus dem Ionenaustausch in DEAE-Cellulose besteht, wobei diese Partikel bei diesem Schritt mit 175 mM NaCl mit einem deutlichen Peak eluieren, wobei sich diese Fraktion von den restlichen Fraktionen unterscheidet, die Partikelformen des Antigens mit einer niedrigeren Antigenaktivität enthalten.
Die das Antigen enthaltende eluierte Fraktion wird dann durch Gelfiltrationschromatographie mit einem angemessenen Puffer (Tris-HCl oder Phosphat-Puffer) in einem pH-Bereich von 7 bis 7,5 entsalzt. Dann wird dieses Material auf eine Ionenaustauschsäule, wie DEAE-Cellulose, aufgebracht, und das Harz wird mit unterschiedlichen Konzentrationen von NaCl im Bereich von 10 bis 50 mM und Detergenzien, wie Natriumdesoxicolat und Triton X-100, bis zu Konzentrationen im Bereich von 0,05 bis 0,1 % gewaschen. Diese Wäschen sichern die Beseitigung der verunreinigenden DNA und von Endotoxinen. Das Antigen wird aus der Säule gewonnen, indem eine 150 bis 200 mM NaCl-Lösung und Kaliumthiocyanat verwendet werden. Dieses Präparat ist vollkommen frei von DNA und hat einen Reinheitswert von mehr als 95 %.
Das eluierte Antigen wird mit einem Ultrafiltrationssystem mit Membranen mit einem Trennfaktor von 10.000 Dalton bis zu einer Proteinkonzentration im Bereich von 1 bis 3 mg/ml konzentriert. Ein Detergens, wie Natriumdesoxicolat, wird dem Präparat mit einer Konzentration von 0,05 % zugesetzt, und das Konzentrat wurde dann einer hochauflösenden Gelfiltrationschromatographie mit einem Arbeitsbereich von 10.000.000 bis 20.000 Dalton (PW 5.000 oder PW 6.000) unterzogen. Die Säule wurde mit einem Puffer ausgeglichen, der 0,05 % Natriumdesoxicolat enthielt. Das Vorhandensein des Detergens während des Verfahrens verringert den Endotoxinwert des Antigenpräparats auf weniger als 0,4 ng/μg des Antigens und ermöglicht die Abtrennung von Fraktionen, die keine geeignete Partikelbildung erfahren haben.
Das erhaltene Antigen wird wiederum in einer Gelfiltrationssäule in einem angemessenen Puffer entsalzt, so daß es zu einem Zusatzstoff in einem Aluminiumhydroxidgel werden kann, um es bei der Herstellung eines Impfstoffs zu verwenden.
Die Bestätigung der hervorragenden Immunogenitätseigenschaften des Impfstoffpräparats, das durch Anwendung der angegebenen Verfahren erhalten wurde, basiert auf den Ergebnissen von kontrollierten vorklinischen Tests, die entsprechend eines strengen Doppelblindprotokolls durchgeführt wurden.
Nach dem hier beschriebenen Verfahren kann ein Produkt mit hervorragender Qualität als ein Immunogen im Verhältnis zu anderen der gleichen handelsüblichen Art für die Verwendung beim Menschen erhalten werden.
PRAKTISCHE BEISPIELE:
BEISPIEL 1:
Um das Gen in Form des Heptatitisvirus B-Oberflächenantigens zu erhalten, wurde die Virus-DNA am EcoRI-Ort von pBR322 geklont. Das Virus-Genom wurde aus Dane-Partikeln erhalten, die vom Serum eines asymptomatischen Trägers des Virus nach einem Verfahren abgetrennt und gereinigt wurden, das dem berichteten ähnlich ist (P. Valenzuela et al., Nature, 1979, 280: 815). Das entstehende Plasmid, als pHBS1 bezeichnet, wurde mit den Enzymen EcoRI und HpAl aufgeschlossen, wodurch ein Fragment erhalten wurde, das wiederum mit dem Enzym TaqI aufgeschlossen wurde, und in diesem Ort wurde ein EcoRI-Linker (5' GGAATTCC 3') ligiert und in den EcoRI-Ort von pBR322 subkloniert. Das entstandene Plasmid wurde als pHBS2 bezeichnet, von dem das Fragment, das das HBsAg-Gen enthält, durch Aufschließen mit EcoRI und Behandlung mit S₁-Nuclease erhalten wurde.
Dieses Fragment wurde in den Vektor pBS5 subkloniert (1), der vorher mit NcoI linearisiert und mit S₁-Nuclease und alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Das entstandene Plasmid wurde als pPCAS3 bezeichnet (2), bei dem die nicht-kodierenden Virusbereiche an den Enden 5' (25 bp) und 3' (125 bp), die dieses Gen flankieren, durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nach üblichen Reaktionsbedingungen eliminiert wurden (R.K. Saiki et al., Science, 1985, 230: 1350).
Durch Verwendung von zwei synthetischen Oligonucleotiden, deren Sequenzen lauten:
5'-Region: 5' GCCATGGAGAACATCACAT 3' (Sequ.-ID-Nr.: 1)
3'-Region: 3' GACCCATATGTAAATTTGCAGCTGG 5' (Sequ.-ID-Nr.: 2)
wurden an den Enden 5' bzw. 3' des Gens NcoI- und Sall-Restriktionsorte geschaffen, die dessen anschließende leichte Manipulation und die Beseitigung der nicht-codierenden Regionen beim Aufschließen des amplifizierten Fragmentes mit den vorstehend genannten Enzymen ermöglichten. Das erhaltene Fragment mit 678 bp, das das exakte HBsAg-Gen enthält, wurde im Plasmid pBS5 subkloniert. Das entstandene Plasmid, als pPCB6 bezeichnet (3), enthält dieses Gen unter den Transkriptionskontrollsignalen des Gens für das Enzym Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAP) von S. cerevisiae.
Aus dem Plasmid pCAO10, das aus einer DNA-Bank von Pichia pastoris (4) erhalten worden war, wurde das 1,1 kb Fragment extrahiert, das den Promotor des Gens für das Enzym AOX1 sowie auch eine nicht-codierende 5'-Region enthielt, die im Plasmid PBR322 subkloniert worden war, wobei das entstandene Plasmid pPAO23 (5) war, bei dem das Polymerase-Kettenreaktionsverfahren angewendet wurde, um 18 bp aus dem Strukturgen für das Enzym AOX1 zu beseitigen, das den Codonen entspricht, die die ersten 6 Aminosäuren dieses Proteins codieren, die in diesem Konstrukt vorlagen.
Die verwendeten Oligonucleotide waren:
5'-Region: 5' GTATCACGAGGCCCT 3' (Sequ.-ID-Nr.: 3)
3'-Region: 3' TTGATTAATAAGCTTTGGTACCGC 5' (Sequ.-ID-Nr.: 4)
Das Oligonucleotid der 3'-Region erlaubt die Schaffung eines NcoI-Ortes am 3'-Ende des Promotors des Gens für das Enzym AOX1, um die Sequenz mit 18 bp des Strukturgens für dieses Enzym zu beseitigen und eine exakte Bindung am HBsAg-Gen zu erreichen. Das Oligonucleotid der 5'-Region ermöglicht den Erhalt des EcoRI-Ortes von PBR322.
Das amplifizierte Fragment mit 1.115 bp wurde im Plasmid pUC19 subkloniert, was zu dem Plasmid führte, das als pMAO107 bezeichnet wird (6), das den perfekten Promotor des Gens für das Enzym AOX1 von P. pastoris enthält.
Der abschließende Integrationsvektor wurde durch Subklonieren des exakten Gens für HBsAg unter dem perfekten Promotor des Enzyms AOX1 erhalten (7). Der resultierende Klon, der als pHAO112 bezeichnet wird, enthält das Gen für HBsAg unter dem Regulationssignal des AOX1-Promotors und das Terminationssignal des GAP-Gens von S. cerevisiae, worin auch eine Region der Chromosomen-DNA von P. pastoris vorliegt, die für eine homologe Rekombination mit der Hefe erforderlich ist. Durch partielles Aufschließen und S1-Nuclease-Behandlung dieses Plasmids wurde der Sall-Ort zerstört, der sich zwischen dem 3'-Ende des HBsAg-Gens und dem Terminator des Enzyms Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase befand. Der entstandene Klon wurde als pSAO503 bezeichnet (8) und in ihm wurde das 2,4 kb Fragment subkloniert, das ein Fragment des Strukturgens für das Enzym AOX1 sowie auch die nicht-codierende 3'-Region enthält, die es flankiert, die aus dem Plasmid pCAO10 erhalten worden war. Das entstandene Plasmid wurde als pVAO721 bezeichnet (8), in das das 1,8 kb Fragment, das das his3-Gen von S. cerevisisae enthält, vom Plasmid pPMS (9) kloniert wurde.
Der erhaltene Klon pTAO906 (10) ergab das abschließende Integrationsplasmid, das für die Transformation des Stamms P. pastoris MP36 (EP-A 0 438 200) verwendet wurde. Die Individuen, die deutliche Integrationsmuster zeigten, dienten der Auswertung der Werte für die Antigenexpression. Der für die Produktion des Antigens ausgewählte Stamm wurde als C226 bezeichnet.
Von Pichia pastoris C226 [pTAO906] wurde am 22. Oktober 1990 eine Hinterlegung gemäß dem Budapester Vertrag beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS) in Baarn, Niederlande, vorgenommen, Hinterlegungsnummer CBS 450.90.
BEISPIEL 2:
Um die Synthese von HBsAg zu erreichen, wird der transformierte Stamm C226 im Preinokulumstadium in einem Salzmedium gezüchtet, dessen Zusammensetzung lautet:

K₂HPO₄ – 5 g/l

MgSO₄ – 4,6 g/l

NH₄SO₄ – 22 g/l

CaCl₂ – 0,5 g/l

Glycerol – 20 ml/l

Vitamine 200 x – 10 ml/l

Spurenelemente 200 x – 5 ml/l
Die Züchtung erfolgt bei einer Temperatur von 30°C und pH = 4,5 bei solchen Belüftungs- und Bewegungsbedingungen, daß ein Partialdruck von Sauerstoff von mehr als 30 % des Sättigungswertes garantiert ist. Die Kultur wird 10 bis 12 Stunden gezüchtet.
Im Inokulumzustand gibt es eine Änderung des Salzmediums durch ein reiches Medium mit folgender Zusammensetzung:

Hefeextrakt 1 %

Pepton 2 %

Glycerol 2 %

Spurenelemente 200 x – 10 ml/l

Vitamine 200 x – 5 ml/l
Die Kultur wird 10 bis 12 Stunden unter diesen Bedingungen gehalten, bis eine Zellkonzentration von 10 bis 12 g/l erreicht ist (auf der Basis des Trockenmaterials), um die Fermentation zu beimpfen, die im gleichen reichen Medium und unter identischen Bedingungen von Temperatur und pH-Wert durchgeführt wird. Die Kultur wird 8 bis 10 Stunden gehalten, bis eine Zellkonzentration von 10 bis 12 g/l erreicht ist (auf der Basis des Trockenmaterials).
Ab diesem Moment beginnt eine kontinuierliche Zugabe von Methanol, um die Expression des Antigens einzuleiten, die bei einer 90- bis 100-stündigen Kultur etwa 3 % des gesamten Proteins erreicht. Diese Zugabe erfolgt mit einer Zunahme in Intervallen entsprechend der Zunahme der Zellkonzentration im Medium. Am Ende dieses Zeitraums beginnt eine Verstärkung der Kultur mit einem reichen Medium mit folgende Zusammensetzung:

Hefeextrakt 3 %

Pepton 6 %
Diese Verstärkung wird bis zum Ende der Züchtung beibehalten, die 180 bis 200 Stunden dauert, wobei die spezifische Wachstumsrate auf das Fünffache erhöht wurde und die Expressionsmengen zunahmen. Ein Ergebnis dieses Verfahrens bestand auch darin, daß das auf diese Weise ausgeprägte Protein mit mehr als 80 % in löslicher Form beibehalten wurde, und dieser Faktor bestimmt die höhere Wirksamkeit in den nachfolgenden Reinigungsstufen sowie auch eine bessere Partikelbildung des Antigens.
In der letzten Stufe der Fermentierung wird eine Biomassekonzentration von 60 bis 80 g/l (auf der Basis des Trockenmaterials) erhalten, und die Werte der Antigenexpression erreichen 2 bis 5 % des gesamten Proteins.
Nach Abschluß der Fermentierung werden die Zellen durch Zentrifugieren in einem kontinuierlichen System aufgefangen und nach dem Waschen mit sterilem Wasser unter Verwendung des gleichen Zentrifugiersystems bei 4°C als Creme aufbewahrt.
BEISPIEL 3:
Um ein HBsAg-Präparat zu erhalten, das für die Behandlung durch Säulenchromatographie geeignet ist, wurde der unbehandelte Extrakt, der durch mechanisches Aufbrechen der Biomasse erhalten worden war, die durch Zentrifugieren der Kultur der Hefe gewonnen worden war, die mit dem das Antigen codierenden Gen transformiert worden war, folgendem Reinigungsverfahren unterzogen.
Die Zellkonzentration der gewaschenen Creme wurde mit destilliertem Wasser bei 100 g/l eingestellt, und um einen Puffer für das Aufbrechen zu erhalten, wurden folgende Substanzen zugesetzt:

Trishydroxymethylaminomethan – 12,1 g/l

Saccharose – 100 g/l

NaCl – 17,5 g/l

EDTA – 1,86 g/l

KSCN – 291 g/l
Der pH-Wert wurde mit 1 n HCl bei 7,5 bis 8,0 eingestellt.
Diese Lösung wurde 5 Minuten homogenisiert, und die Zellen wurden mit einer Bettmühle (bed mill) mechanisch aufgebrochen.
Die aufgebrochenen Zellen wurden einem Klärungsverfahren auf der Basis der Stabilität des HBsAg bei extremen pH-Bedingungen unterzogen, bei denen zahlreiche verunreinigende Proteine der Wirtshefe gefällt wurden, wohingegen das Antigen in Lösung blieb.
Die Klärung des Extraktes vom Aufbrechen durch Fällen der Verunreinigungen bei einem sauren pH-Wert wurde nach folgendem Verfahren durchgeführt:
Das Homogenat der aufgebrochenen Zellen wurde bei kontinuierlichem Rühren und Erfassen des pH-Wertes auf eine Temperatur von 0 bis 4°C abgekühlt und unter Vermeidung der Schaumbildung schnell in einer ausreichenden Menge mit einer Lösung von 1 n HCl mit 4°C gemischt, um den pH-Wert bis zu einem Bereich von 2,5 bis 3 zu verringern. Nachdem weitere 5 Minuten gerührt worden war, wurde das Gemisch in einer auf 4°C abgekühlten, kontinuierlichen Zentrifuge zentrifugiert, bei einer Haltezeit von 45 Minuten, wobei die Aufnahmegefäße, aus denen das Material herausgelöst und aufgefangen wurde, kühl gehalten wurden. Der Überstand wurde unmittelbar nach dem Zentrifugieren bei konstantem Rühren und Erfassung des pH-Wertes wieder auf einen pH-Wert von 7,5 bis 8,5 gebracht.
Der pH-Wert des geklärten Überstands wurde erneut auf 4,0 verringert, und es wurde etwa 1 Stunde mit einer Celite-Matrix (High Flow Supercell, Fluka) bei einem ungefähren Anteil von 0,35 g des Antigens pro kg der Matrix homogenisiert. Das Antigen wurde auf der Matrix adsorbiert, und durch Zentrifugieren, Filtrieren oder Dekantieren wurde letztere vom nicht-adsorbierten Material getrennt, das weggegossen wurde. Dann erfolgten zwei oder drei Wäschen des am Bett fixierten Antigens mit einer Pufferlösung mit der folgenden Zusammensetzung:

KSCN – 48,5 g/l

Saccharose – 100 g/l

Tris – 2,42 g/l

EDTA – 1,86 g/l
Der pH-Wert wurde mit 1 n HCl bei 4,0 eingestellt.
Nach den aufeinanderfolgenden Wäschen erfolgte die Desorption des Antigens von der Matrix, wobei ein Elutionspuffer verwendet wurde, dessen Zusammensetzung wie folgt war:

Tris – 2,42 g/l

EDTA – 1,12 g/l

Saccharose – 100 g/l
Der pH-Wert wurde mit 1 n NaOH bei 9,0 bis 9,5 eingestellt.
Das durch die Elution erhaltene Material wurde in einen Eindickapparat vom AMICON-Typ (Hohlfaser) mit einer Patrone mit einer Porengröße von 0,1 um eingeführt, um dessen ursprüngliches Volumen um einen Faktor von etwa 55 zu konzentrieren. Das gesamte Verfahren erfolgte bei 4°C.
Um die Reinigung des erhaltenen HBsAg zu vervollständigen, wurden einige Chromatographieschritte durchgeführt, wie es nachstehend angegeben ist:
Etwa 2 l der konzentrierten Celite-Eluate wurden durch eine Gelfiltrationssäule des Mediums Sephadex G-25 entsalzt, expandiert und in 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH = 8,0, ausgeglichen. Der Verlauf wurde durch die Absorption bei 280 nm und durch die Leitfähigkeit kontrolliert.
Es wurde eine Immunoaffinitätsmatrix hergestellt, die etwa 2 l Sepharose CL-4B, die mit CNBr aktiviert war, und etwa 10 g des daran gebundenen monoklonalen Antikörpers CB-HEP1 (beim CIGB gemäß Beispiel 4 erhalten) mit speziellen Eigenschaften enthielt, die die Auswahl von Antigenpopulationen mit hoher Immunogenität ermöglichen. Die mit der vorstehend genannten Matrix gepackte Immunoaffinitätssäule wurde in 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH = 8,0, ausgeglichen und es wurde eine Menge des Konzentrats des entsalzten Celite-Eluats, das das Antigen enthielt, für ein ungefähres Verhältnis von 1,0 mg HBsAg pro ml Bett injiziert. Die Strömungsrate bei Umgebungstemperatur betrug etwa 50 cm/h. Das Waschen wurde mit einem Ausgleichspuffer durchgeführt, und der Verlauf wurde durch die Absorption bei 280 nm mit einer graphischen Aufzeichnung kontrolliert. Der Abfluß wurde aufgefangen, bis die Grundlinie im Chromatogramm erreicht war, dann wurde ein Puffer hindurchgeleitet, der 20 mM Tris-HCl, 1 n NaCl, pH = 8,0, enthielt, um die nichtspezifische Adsorption zu beseitigen, bis der Grundwert erneut erreicht war.
Das Antigen wurde mit einem Puffer eluiert, der 20 mM Tris-HCl, 3 m KSCN, 1 m NaCl, pH = 8,0, enthielt, und die Säule wurde bei 4°C in Gegenwart von 0,01 Thimerosal sofort mit einem Überschuß des Ausgleichspuffers gewaschen, falls die Säule lange Zeit unbenutzt bleibt.
Das aus der Affinitätssäule eluierte HBsAg wurde innerhalb von 2 Stunden in einem Wasserbad einer Wärmebehandlung bei 37°C unterzogen. Später wurde das Antigen in einer Säule Sephadex G-25 entsalzt, die mit 20 mM Tris-HCl, 3 mM EDTA, pH = 8,0, ausgeglichen worden war.
In eine Säule, die DEAE-Cellulose (Whatman DE-52) enthielt, die in dem Puffer 20 mM Tris-HCl, 3 mM EDTA, pH = 8,0 ausgeglichen worden war, wurden etwa 3 l des entsalzten Materials aus der Immunoaffinitätssäule injiziert, und das Verfahren erfolgte bei 4°C. Dann wurden nachfolgende Wäschen mit dem Gleichgewichtspuffer durchgeführt, der 20 mM Tris-HCl, 3 mM EDTA, 50 mM NaCl und 0,05 % Na-desoxycolat enthielt. Das Verfahren wurde anhand der Absorption bei 280 nm mit einer graphischen Aufzeichnung kontrolliert. Der Abfluß wurde aufgefangen, bis die Grundlinie im Chromatogramm erreicht war. Das HBsAg wurde unter Verwendung eines Puffers aus der Säule gewonnen, der 20 mM Tris-HCl, 3 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH = 8,0, enthielt, wobei der Abfluß aufgefangen wurde, bis der Grundwert wieder erreicht war.
Die Fraktion, die aus der Ionenaustauschsäule erhalten worden war, wie es im vorangegangenen Schritt beschrieben ist, wurde in einem Amicon-Hohlfasersystem (DC-2) etwa 25-fach konzentriert, wobei eine Patrone mit einem Trennfaktor von 10.000 Dalton verwendet wurde. Dann wurde dem Konzentrat 0,05 g/100 ml Nadesoxycolat zugesetzt. Es wurde 1 h bei 4°C inkubiert, und später wurde diese Fraktion auf die Säule PWG 6,000 aufgebracht, die in 20 mM Tris-HCl, 3 mM EDTA und 0,05 % Na-desoxycolat, pH = 8,0, ausgeglichen worden war. Es wurde ein Hauptpeak erhalten, der das sehr stark partikelförmige Antigen enthielt, das frei von Monomeren oder Dimeren des gleichen Moleküls war. Diese Fraktion wurde auf einer Säule G-25 aufgefangen und entsalzt, die in PBS, pH = 7,0, ausgeglichen worden war. Dieses abschließende Präparat des gereinigten HBsAg wurde für die weitere Verwendung als Zusatzstoff in Aluminiumhydroxid steril filtriert, wobei eine Membran mit 0,2 μm verwendet wurde.
Da das vorstehend genannte gereinigte Antigen als injizierbares Präparat entwickelt werden muß, wurden alle strikten Maßnahmen vorgenommen, um den Forderungen zu entsprechen, die für Präparate für die parenterale Verabreichung festgelegt sind, und es wurden die entsprechenden Qualitätskontrollen durchgeführt (Anforderungen für Impfstoffe für Hepatitis B, die durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt wurden, Anforderungen für biologische Substanzen Nr. 45, Weltgesundheitsorganisation, Reihe Technischer Berichte Nr. 786, 1989).
In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse zusammengefaßt, die während des Reinigungsverfahrens von HBsAg erhalten wurden, das Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist.
BEISPIEL 4
Um einen für HBsAg spezifischen monoklonalen Antikörper (MAb) zu erhalten, wurden 8 Wochen alte männliche Balb/c-Mäuse mit dem natürlichen Hepatitisvirus B-Oberflächenantigen immunisiert, das aus Human-Plasma erhalten worden war (S. Krugman et al., J. Am. Med. Assoc., 1971, 217: 41). Die Fusion, die Züchtung und Verfolgung der Hybride erfolgte nach Grundprinzipien, die bei Kholer beschrieben sind (The Technic of Hybridoma Production, Immunological Methods, 1981, Bd. I, Academic Press, 285-298). Die Milzzellen wurden mit der Myelomlinie SP2/0/Ag14 in einem Verhältnis von 10:1 hybridisiert, wobei 50 % Polyethylenglycol 1.500 (BDH) verwendet wurde, und auf Platten mit 96 Vertiefungen (Costar) mit einer Konzentration von 100.000 Zellen pro ml Medium und 100 μl pro Vertiefung geimpft. Das verwendete selektive Kulturmedium war RPMI 1640 (Gibco), das mit 1 g/l NaHCO₃, 3 μg/l HEPES, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 0,05 mM 2-Mercaptoethanol, 10 % Serum eines neugeborenen Kalbes, 40 μg/ml Gentamicin und 3 % eines Kulturüberstandes von Human- Endothelzellen (HECS) ergänzt werden kann (Astaldi et al., Methods of Enzymology, 1983, Bd. XCII, Herausg. J. Langone, Academic Press, 39-46), dem bis zu 0,03 mM Hypoxanthin, bis zu 3 μM Thymidin und bis zu 0,4 μM Aminopterin zugesetzt wurden.
Ab der dritten Züchtungswoche wurden die Überstände auf für HBsAg spezifische Antikörper untersucht, wobei ein indirekter ELISA angewendet wurde. Von den positiven Vertiefungen wurde die Nummer 48 wegen der bei wiederholten Assays erhaltenen hohen Werte ausgewählt und geklont und einige Male erneut geklont, indem die Verdünnungen eingeschränkt wurden. Als letzter Klon wurde 48/1/5/4 ausgewählt, der einen MAb mit folgenden immunochemischen Eigenschaften ausschied:

– Er erkennt sowohl natürliches HBsAg als auch in Hefen produziertes rekombinantes HBsAg (HBsAgr) spezifisch. Das wurde bei beiden Molekülen beim ELISA nachgewiesen.
– Er erkennt HBsAgr sowohl in der festen Phase (ELISA) als auch in Lösung. Es ist möglich, daß Binden des MAb an das Antigen in der festen Phase durch vorheriges Inkubieren damit in Lösung zu hemmen.
– Beim ELISA beim Prüfen mit verschiedenen Molekülen als Beschichtung wurden keine Querreaktionen beobachtet. Er erkennt im Western-Blot auch die Bande spezifisch, die dem HBsAg eines Präparats von Hefe entspricht, die HBsAgr produziert. Dadurch können wir bestätigen, daß dieser MAb gegenüber HBsAg sehr spezifisch ist und daß das erkannte Epitop vom kontinuierlichen Typ ist.
– Er erkennt in einer internationalen Standards äquivalenten Weise die Subtypen ay und ad, was darauf hinweist, daß er gegen die Determinante gerichtet ist, die allen Subtypen dieses Virus gemein ist.
– Eine spezielle Eigenschaft dieses Klons ist die Tatsache, daß er zwei Arten von schweren Ketten synthetisiert: eine der Unterklassen Gamma 2b und die andere der Klasse M. Die Zellen scheiden beide Antikörper der Klasse IgG 2b als auch pentamere IgM-Moleküle aus, die durch Gelfiltrationschromatographie (Sephacryl S-300) abgetrennt werden können. Das wurde durch doppelte Zirkularimmunodiffusion (0. Ouchterlony et al., 1973, Handbook of Experimental Immunology, Bd. 1: 19.1) und Polyacrylamid-Gelelektrophorese (N.K. Laemmli, Nature, 1970, 227: 680) nachgewiesen. Beide Antikörper sind gegenüber HBsAg spezifisch, was durch ELISA bei Konjugaten nachgewiesen wurde, die für IgG und IgM der Maus sind (Sigma) spezifisch.
– Versuche bei beschichteten PVC-Platten zeigten, daß der MAb HBsAg wirksam einfangen kann. Ein hoher Prozentsatz davon kann anschließend eluiert werden, wobei Kaliumthiocyanatlösungen mit einer hohen Molarität verwendet werden.

Bei der European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, Großbritannien wurde am 26. November 1990 eine Hybridomzelline gemäß dem Budapester Vertrag unter der Hinterlegungsnummer ECACC 90 112 606 hinterlegt.
Für die Herstellung dieses monoklonalen Antikörpers werden reine Präparate davon aus dem Bauchwasser erhalten, das nach dem Beimpfen von 3 Millionen Hybridzellen in den Peritonealraum von Balb/c-Mäusen extrahiert worden war, denen 10 Tage vorher auf dem gleichen Weg Mineralöl injiziert worden war. Das durch wiederholtes Punktieren aufgefangene Bauchwasser wird mit 500 G zentrifugiert, mit Chloroform 1:1 von Lipiden befreit und mit mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) dialysiert.
Für die Reinigung werden eine zweistündige Fällung mit 50 %-igem NH₂SO₄ bei 4°C, das 30-minütige Zentrifugieren mit 4.000 U/min, zwei weitere Wäschen des Niederschlags mit der gleichen Konzentration von NH₂SO₄ und das Entsalzen in Sephadex G-25 (Pharmacia) angewendet. Die entsalzte Probe wird durch Affinitätschromatographie in Protein A-Sepharose CL4B (Pharmacia) fraktioniert, wobei den vom Hersteller vorgeschlagenen Instruktionen gefolgt wird.
Die gereinigten Antikörper werden an Matrices von Sepharose CL4B gebunden, die nach dem vom Hersteller vorgeschlagenen Verfahren mit Cyanbromid aktiviert wurde. Pro ml Gel werden 5 mg MAb verwendet.
BEISPIEL 5
Um ein Impfstoffpräparat mit hoher Homogenität und hohem Grad der Partikelbildung aus dem reinen rekombinanten Antigen zu erhalten, wurde letzteres mit einer sterilen Aluminiumhydroxidlösung gemischt.
Nach dieser Formel wurden verschiedene Chargen hergestellt, um die erforderlichen Tests für die Kennzeichnung dieses Produktes durchzuführen. Dann wurden die erhaltenen Ergebnisse bei der Auswertung von drei aufeinanderfolgenden Chargen dieses Präparats detailliert.

(*) Spezifische Proteinwerte von mehr als 1.000 μg/ml beruhen auf der Unterschätzung des immunogenen Proteins durch Follin.

BEISPIEL 6
Um die Immunogenitätseigenschaften des Hepatitisvirus B-Oberflächenantigens zu untersuchen, das über den Weg der rekombinanten DNA in Hefen erhalten worden ist, wie es in den vorstehenden Beispielen beschrieben ist, wurde ein Protokoll für vorklinische Tests bei Gruppen von Freiwilligen durchgeführt, nachdem nachgewiesen worden ist, daß das Präparat die Anforderungen der Vorschriften für die Verwendung beim Menschen durch parenterale Verabreichung erfüllt (Anforderungen an Hepatitis B-Impfstoffe, die durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt wurden, Anforderungen an biologische Substanzen Nr. 45, Weltgesundheitsorganisation, Reihe Technische Berichte Nr. 768, 1989). Diese Untersuchungen wurden von einem Auswertungskomitee durchgeführt, das vom Kubanischen Gesundheitsministerium für diesen Zweck eingerichtet worden war, das einen Bericht der Ergebnisse herausgegeben hat, der nachfolgend zusammenfassend aufgeführt ist.
Das Komitee für die Auswertung des kubanischen rekombinaten Impfstoffs gegen Hepatitis B vom Kubanischen Gesundheitsministerium hat einen vollständigen abschließenden Bericht einer Prototypstudie der Phase II für die Auswertung der Immunogenität des kubanischen Impfstoffs, der von rekombinanter DNA vom Hepatitisvirus B-Oberflächenantigen (rec-HBsAg) in Hefe stammt, erstellt.
Dieser Bericht, der hier zusammengefaßt ist, ist ein typischer kontrollierter Doppelblindversuch, der so gestaltet ist, daß das Verhalten des kubanischen rec-HBsAg-Impfstoffs mit einem anerkannten handelsüblichen Impfstoff des gleichen Typs verglichen wird, der in nahezu 100 Ländern zugelassen und registriert ist (Smith & Kline).
Von insgesamt 123 Personen, die ein Dokument als Erfassung ihrer Zustimmung zur freiwilligen Teilnahme an der Untersuchung unterzeichnet hatten, wurden 35 aus unterschiedlichen Gründen ausgeschlossen, und es wurden 88 klinisch gesunde Personen ohne Marker des Virus (HBsAg, HBeAg, anti-HBsAg, anti-HBcAg) mit normalen Werten der Transaminasen (ALT) ausgewählt. Die Probe bestand hauptsächlich aus jungen Erwachsenen beiderlei Geschlechts im Alter von 20 bis 34, die gleichmäßig auf drei Gruppen mit 31, 30 und 27 Personen aufgeteilt wurden, denen an den Tagen 0, 30 und 60 drei Dosen (1 ml Antigen, auf Aluminiumhydroxid adsorbiert) von 20 μg des kubanischen Impfstoffs (CV20), 10 μg des kubanischen Impfstoffs (CV10) bzw. 20 μg des handelsüblichen Impfstoffs (SK20) geimpft wurden.
Vor der Impfung und an den Tagen 15, 75 und 90 innerhalb oder nach der Impfung wurden an den gleichen Tagen Blutproben entnommen. 45 % der gesamten Personengruppe wurden subkutan geimpft und der Rest intramuskulär (Deltamuskel), ohne signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen, die das Alter, das Geschlecht oder die Verabreichungsverfahren betreffen.
Am Tag 90 nach Abschluß des gesamten Verlaufs der Impfung zeigten 29 der geimpften und eingeschätzten von den 31, die CV20 erhalten hatten, 100 % Antikörpertiter, die höher als der vereinbarte Mindestschutzwert (MPL) von 10 IE/I waren – bei einem geometrischen Durchschnittstiter (GMT) von 239,9 IE/I.
Bei 26 der geimpften und eingeschätzten von den 30, die CV10 erhalten hatten, zeigten 100 % Antikörpertiter, die höher als der MPL waren, bei einem GMT von 218,4 IE/I, wohingegen von 26 Personen von den 27, die geimpft und eingeschätzt worden waren und die SK20 erhalten hatten, 23 (88,5 %), Antikörper mit einem GMT von 43,9 IE/I hatten, jedoch nur 21 (80,8 %) überschritten den MPL.
Beim Vergleich der Ergebnisse am Tag 90 mit denen am Tag 75 (15 Tage nach der dritten Dosis) behielten beide kubanischen Impfstoffe CV20 und CV10 eine maximale Rate der Serokonversion (100 %) bei, und die Anzahl derer stieg auf 100 %, die mit Titern geimpft worden waren, die höher als der MPL war, wohingegen bei SK20 die Anzahl derer, die reagiert hatten, von 96,3 % auf 88,5 % abnahm, die Anzahl der Personen mit Titern, die oberhalb des MPL waren, stieg jedoch von 70,4 % auf 80,8 %. Diese Werte sind für SK20 noch deutlich schlechter (p) als für beide kubanischen Präparate.
Daraus kann die Schlußfolgerung gezogen werden, daß von den insgesamt 81 geimpften und eingeschätzten Personen, die den Verlauf der Impfung beendet hatten (92 % von denen, die die erste Dosis erhalten hatten) bei 78 (96,3 %) eine Serokonversion hervorgerufen wurde, von denen 55 (100 %) den einen oder den anderen kubanischen Impfstoff erhalten hatten (alle mit Titern, die höher als der MPL waren) und 23 (88,5 %) den handelsüblichen Impfstoff erhalten hatten, 21 (80,8 %) davon mit Titern, die höher als der MPL waren. Auf der Basis dieser Ergebnisse, die einen deutlichen Vorteil für den kubanischen Impfstoff darstellen, wurde entschieden, diese Untersuchung auf eine größere Gruppe von Personen auszuweiten, die in der oben beschriebenen Art und Weise ausgewählt und in unterschiedlichen Instituten des Nationalen Gesundheitsdienstes in Gruppen eingeteilt worden waren.
Die Ergebnisse dieser zweiten Phase sind in den Graphiken 1 und 2 zusammenfassend angegeben. In diesen Graphiken sind die Werte der Reaktion auf beide Präparate (kubanischer Impfstoff gegenüber SK) ersichtlich, wobei die Verfahren der intramuskulären (IM) und der subkutanen (SC) Immunisierung angewendet wurden.
ZEICHNUNGEN:
In den Zeichnungen werden die folgenden Abkürzungen verwendet:

B: BamHI
N: NcoI
S: SalI
E_I: EcoRI
E_V: EcoRV
BglI: BglII
C: ClaI
CIP: Intestinphosphatase vom Kalb
Klenow: DNA-Polymerase I großes Fragment

SEQUENZAUFSTELLUNG

Sequ.-ID-Nr.: 1
Sequenztyp: Nucleotid
Sequenzlänge: 19 Nucleotide
GCCATGGAGA ACATCACAT
Sequ.-ID-Nr.: 2
Sequenztyp: Nucleotid
Sequenzlänge: 25 Nucleotide
GGTCGACGTT TAAATGTATA CCCAG
Sequ.-ID-Nr.: 3
Sequenztyp: Nucleotid
Sequenzlänge: 15 Nucleotide
GTATCACGAG GCCCT
Sequ.-ID-Nr.: 4
Sequenztyp: Nucleotid
Sequenzlänge: 24 Nucleotide
CGCCATGGTT TCGAATAATT AGTT

Claims

Rekombinantes Hepatitis B-Oberflächenantigen, das erhalten werden kann nach einem Verfahren, umfassend: Züchten von Zellen des Stammes Pichia pastoris C226 (pTAO906], CBS450.90, die ein Gen enthalten, das dieses Hepatitis B-Oberflächengen codieren kann, bei Bedingungen, die zu dessen Expression führen; Auflösen der Zellen in Gegenwart eines Puffers, der ein chaotropes Mittel, Sacccharose und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) umfaßt; Fällen von Verunreinigungen bei einem sauren pH-Wert; Unterziehen des Antigenpräparats einer sauren Adsorptions- und alkalischen Desorptionsbehandlung über einer Kieseleerdematrix; Unterziehen des Antigenpräparats der Immunoaffinitätschromatographie unter Verwendung des für das Hepatitis B-Oberflächenantigen spezifischen monoklonalen Antikörpers CB-HEP1, der von der Hybridomzellinie ECACC 90 112 606 produziert worden ist; Unterziehen des eluierten Antigens einer Wärmebehandlung bei einer Temperatur von 30 bis 40°C; Waschen des Antigens in einer Ionenaustauschsäule mit einem Detergens; und Unterziehen des eluierten Antigens der HPLC in Gegenwart eines Detergens.
Impfstoffzusammensetzung für die Immunisierung gegenüber dem Hepatitis B-Virus, umfassend ein rekombinantes Hepatitis B-Oberflächenantigen nach Anspruch 1 in einer für das Impfen wirksamen Menge und mindestens einen Träger, ein Verdünnungsmittel oder ein Adjuvans, die für die Verwendung in einer Impfstoffzusammensetzung geeignet sind.
Verwendung des Stammes Pichia pastoris C226 [pTAO906], CBS450.90 bei einem Verfahren, wie es in Anspruch 1 angegeben ist.
Verwendung des monoklonalen Antikörpers Anti-HbsAg CB-HEP1, der von der Hybridomzellinie ECACC 90 112 606 produziert worden ist, bei einem Verfahren, wie es in Anspruch 1 angegeben ist.