ES2264183T3 - Metodo para obtener antigeno de superficie del virus de la hepatitis b (hep b), recombinante, con capacidad inmunogenica superior y su uso en una preparacion de vacuna. - Google Patents
Metodo para obtener antigeno de superficie del virus de la hepatitis b (hep b), recombinante, con capacidad inmunogenica superior y su uso en una preparacion de vacuna.Info
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Abstract
UN PROCESO MULTI-ETAPA PARA RECUPERAR ANTIGENO DE SUPERFICIE DE HEPATITIS B DE CELULAS DE PICHIA PASTORIS QUE CONTIENEN UN GEN QUE CODIFICA EL CITADO ANTIGENO DE SUPERFICIE DE HEPATITIS B Y QUE LO HAN EXPRESADO. EL PROCESO CONDUCE A UN RENDIMIENTO ELEVADO DE HBSAG HOMOGENEO, MUY PURO, EN FORMA PARTICULADA CON UNA ELEVADA INMUNOGENICIDAD, ADECUADO PARA EL USO EN COMPOSICIONES VACUNALES PARA EL TRATAMIENTO DE SERES HUMANOS Y PARA EL USO EN METODOS DE DIAGNOSTICO.
Description
Método para obtener antígeno de superficie del
virus de la hepatitis B (HEP B), recombinante, con capacidad
inmunogénica superior y su uso en una preparación de vacuna.
La presente invención está en el campo de la
ingeniería genética y biotecnología y en particular en el de la
producción de vacunas contra el virus de la hepatitis B.
La infección con el virus de la hepatitis B es
un problema de salud importante a escala mundial, ya que no
solamente causa enfermedad aguda, sino que también evoluciona en
formas crónicas, cirrosis e insuficiencia de hígado, y carcinoma
hepatocelular. Se calcula que en el mundo hay aproximadamente 200
millones de portadores crónicos del virus, que constituyen el
principal reservorio de este agente infeccioso.
Hasta la presente no hay tratamiento eficaz
contra el virus, de modo que la prevención es el único camino para
reducir su diseminación y bajar la incidencia de la infección.
Hay dos estrategias principales para la
producción de vacunas contra el virus de la hepatitis B: aquellas
derivadas de plasma y aquellas obtenidas mediante técnicas de
ingeniería genética.
Las vacunas derivadas de plasma se basan en la
purificación de HBsAg a partir de plasma de portadores crónicos del
virus mediante varios métodos físicos y su inactivación (A. J.
Zuckerman et al., British Medical Journal, 1985, 290:
492). Estas vacunas han demostrado su eficacia y seguridad durante
años (A. M. Prince et al., Annual Clinical Research, 1982,
14, 225) y no se han asociado con el riesgo de transmisión
del virus de inmunodeficiencia adquirida u otros agentes
infecciosos (F. Deinhardt et al., Journal of Medical
Virology, 1985, 17: 209).
Sin embargo, el uso extensivo de esta vacuna se
ve afectado por la disponibilidad limitada de sueros de portadores
del virus para obtener HBsAg usado para la producción de la vacuna,
la necesidad para procedimientos estrictos para la purificación e
inactivación del virus de la hepatitis B y retirada de otros agentes
infecciosos que pueden estar presentes en el plasma al igual que
los ensayos de seguridad prolongada necesario para limpieza de
lotes de vacunas. Además existe el miedo particular que agentes
infecciosos que causan enfermedades de transmisión por vía
sanguínea puedan escapar del procedimiento de inactivación durante
la producción de la vacuna, a causa de que esto hay una tendencia
general a reemplazar productos derivados de la sangre con aquellos
obtenidos mediante técnicas de ingeniería
genética.
genética.
El gen del antígeno de superficie del virus de
la hepatitis B ha sido clonado y expresado en células procariotas y
eucariotas.
En bacterias, los niveles de expresión obtenidos
han sido bajos, y la incorporación eficaz del antígeno en
partículas inmunogénicas de 22 nm no tuvieron lugar, esto es porque
este sistema no fue usado como una fuente de antígeno para la
producción de vacunas (P. Valenzuela et al., Nature, 1980,
280: 815; C. J. Burrel et al., Nature, 1979,
279:43).
Las células eucariotas también se han usado en
la producción de HBsAg (M. L. Michel et al., Biotecnology,
1985, 3: 561; G. M. MacNab et al., British Journal of
Cancer, 1976, 36: 509). Sin embargo, la producción de
vacunas usando este método requiere un equipamiento, metodología y
medios de cultivo complejos y costosos, y plantea problemas en el
escalado de la producción. También hay miedos relacionados con la
seguridad de vacunas derivadas de líneas celulares de mamíferos que
son carcinógenas debido al riesgo de la presencia de retrovirus, y
eso aunque el antígeno obtenido tiene características similares al
antígeno natural, este método no se usa tampoco para producción en
masa de esta vacuna.
Los virus vaccinia manipulados genéticamente
hacen posible obtener virus recombinantes que expresan HBsAg solo o
en combinación con otros antígenos para la producción de vacunas
vivas contra agentes infecciosos (C. Cheng et al., Journal
or Virology, 1986, 60: 337; E. Paoletti et al.,
Proceedings of the Nacional Academy of Sciences USA, 1984,
81: 193). Las vacunas obtenidas por esta vía no han sido
aprobadas para uso a gran escala en seres humanos debido a
numerosas consideraciones técnicas y éticas.
Las vacunas recombinantes contra hepatitis B que
están comercialmente disponibles están basadas fundamentalmente en
la producción de HBsAg mediante levaduras manipuladas
genéticamente.
La levadura Saccharomyces cerevisiae se
ha usado ampliamente para la producción de proteínas heterólogas
activas biológicamente para amplio uso (S. M. Kingsman et
al., Tictech, 1987, 5: 53) y para obtener HBsAg en
grandes cantidades (W. J. McAleer et al., Nature, 1984,
307: 178; N. Harford et al., Postgraduate Medical
journal, 1987, 63 suppl. 2: 65; G. A. Bitter et
al., Journal of Medical Virology, 1988, 25: 123).
El antígeno obtenido se produce
intracelularmente y se extrae mediante diferentes métodos de
disrupción celular y se purifica mediante varios métodos
fisicoquímicos que han hecho posible conseguir niveles de pureza
mayores del 97% y con un producto que tiene un comportamiento
antigénico similar al del antígeno del plasma como se ha demostrado
en animales y seres humanos (P. Hauser et al., Postgraduate
Medical Journal, 1987, 63 suppl. 2: 83).
Recientemente se ha descrito un sistema eficaz
de expresión que usa como huésped la levadura metilotrópica
Pichia pastoris y que está basada en el uso del promotor del
gen del enzima Alcohol-oxidasa I, que es la primera
enzima implicada en la ruta de utilización del metanol por esta
levadura; dicho promotor está regulado estrictamente y hace posible
expresar niveles altos de la enzima (hasta 30%) cuando las células
crecen en la presencia de metanol y no cuando crecen en la
presencia de glucosa (S. B. Ellis et al., Molecular and
Cellular Biology, 1985, 5: 1111; R. Couderc et al.,
Agric. Biol. Chem., 1980, 44: 2259).
La levadura P. pastoris ya se ha usado
para la expresión de varias proteínas heterólogas, incluida HBsAg
(J. M. Cregg et al., Biotechnology, 1987, 5: 479), en
un constructo genético en la que el gen que codifica HBsAg está
clonado bajo las señales de regulación del promotor de la enzima
Alcohol-oxidasa I, en un casete de expresión que
está integrado en el cromosoma de una cepa mutante de esta levadura,
que hace posible, con activación del sistema en la presencia de
metanol, para 2-3% de la proteína soluble producida
para ser HBsAg. No se describe una purificación del antígeno, sin
embargo.
Una ventaja importante que ofrece el sistema
Pichia pastoris con respecto al S. cerevisiae es la
incorporación muy eficaz del antígeno en partículas de 22 nm, ya
que virtualmente todo el antígeno producido está en forma
particulada, a diferencia de lo que sucede en S. cerevisiae
en el que solamente una pequeña proporción del monómero de 24 kDa
está incorporado en las partículas de antígeno (P. Valenzuela et
al., Nature, 1982, 298: 347; R. A. Hitzeman et
al., Nucleic Acids Research, 1983, 11: 2745; A.
Miyanohara et al., Proceedings of the National Academy of
Sciences USA, 1983, 80: 1). No obstante, las preparaciones de
vacunas basadas en HBsAg recombinante disponibles actualmente en el
mercado continúa usando la levadura S. cerevisiae como su
fuente.
Por otro lado, los métodos de purificación
usados más comúnmente de antígeno de superficie de hepatitis B a
partir de levadura implica el uso de métodos de centrifugación en
gradiente de densidad (solicitud de patente europea de Smith Kline
No. 278 940 A3) que son costosos y complejos para llevar a cabo a
una escala industrial.
En la solicitud de patente europea de Phillips
Petroleum No. 337 492 se describe un procedimiento para recuperar
antígeno de superficie de hepatitis B a partir de cepa recombinante
de Pichia pastoris. Aunque el propósito es recuperar el
antígeno de superficie de hepatitis B en el estado de pureza
suficiente para ser incorporado directamente en una vacuna, no se
describen ni las características del antígeno en relación a su
particulación después de la purificación, ni su capacidad
inmunogénica cuando se incluye en una preparación de vacuna.
El procedimiento de Phillips Petroleum comprende
lisis de las células de la levadura en presencia de una sal
caotrópica y separar el líquido sobrenadante que contiene el
antígeno a partir de pellet de células lisadas; precipitar lípidos
y contaminar proteínas a partir del líquido sobrenadante a un pH
4,5-5,5 y retirar el residuo precipitado; someter
el líquido sobrenadante a tratamientos de concentración y
diafiltración; poner en contacto el retenido que contiene el
antígeno con sílice, lavar proteínas contaminantes de la sílice y
eluir el antígeno de superficie de hepatitis B con un tampón a pH
9,5-11,0 que contiene urea; someter la fracción
apropiada a filtración sobre gel con un material que tiene un
límite de exclusión de peso molecular adecuado para separar la
partícula de antígeno de superficie de hepatitis B de los
contaminantes; poner en contacto la fracción apropiada con una
resina de cambio aniónico y eluir la partícula de antígeno de
superficie de hepatitis B de la resina con un tampón que tiene un
pH de
6-9.
6-9.
En este procedimiento se usa un tampón
caotrópico para la etapa de lisis/extracción. Este tampón contiene
tiocianato potásico como agente caotrópico y fluoruro de
fenil-metil-sulfonilo como inhibidor
de proteasa. Este último compuesto es altamente venenoso, por lo
que es necesario eliminar todas sus trazas durante el procedimiento
de purificación. Además, a pesar de que esta sustancia es eficaz en
la inhibición de proteasa, su espectro de inhibición es
limitado.
Después, el líquido sobrenadante que contiene el
HBsAg se somete a diafiltración y esta fracción se pone en contacto
con sílice. Con el fin de llevar a cabo la separación del antígeno
de superficie de hepatitis B de la sílice, se emplea un tampón que
contiene urea con un pH en el intervalo de 9,5 a 11.Este compuesto
altamente desnaturalizante y su uso puede conducir a una pérdida de
inmunogenicidad del producto obtenido.
La presente invención proporciona un nuevo
antígeno de superficie recombinante de hepatitis B, una nueva
composición para vacuna para inmunizar contra el virus de Hepatitis
B, y un nuevo uso de una cepa particular de Pichia pastoris
y anticuerpo monoclonal anti-HBsAg, todos tal como
se definen en las reivindicaciones. La descripción describe un
procedimiento de purificación que garantiza obtener un antígeno
recombinante a partir de Pichia pastoris que se caracteriza
por un grado alto de particulación y homogeneidad, que le confiere
características inmunogénicas superiores.
Dicho procedimiento para recuperar antígeno de
superficie de hepatitis B a partir de células de Pichia
pastoris que contiene un gen codificante de dicho antígeno de
superficie de hepatitis B y que lo tiene expresado, comprende
células de crecimiento de cepa Pichia pastoris C226
[pTAO906], CBS450.90, que contiene un gen que codifica dicho
antígeno de superficie de hepatitis B bajo condiciones que resultan
en su expresión; lisar las células en presencia de un tampón que
comprende un agente caotrópico, sacarosa, y ácido
etilen-diamino-tetraacético
(EDTA);
(EDTA);
precipitar contaminantes a un pH ácido;
someter la preparación de antígeno a un
tratamiento de adsorción ácida y desorción alcalina sobre una matriz
de tierra de diatomeas;
someter la preparación del antígeno a
cromatografía de inmunoafinidad usando el anticuerpo monoclonal
específico del antígeno de superficie de hepatitis B CB HEP 1
producido por la línea celular hibridoma ECACC 90 112 606;
someter el antígeno eluído a un tratamiento con
calor a una temperatura de 30-40ºC;
lavar el antígeno en una columna de intercambio
aniónico con detergente; y someter el antígeno eluído a HPLC en
presencia de un detergente.
Se prefiere que la lisis de las células se lleve
a cabo en presencia de un tampón que comprende tiocianato potásico,
sacarosa, EDTA, Tris y NaCl. Más preferentemente, la lisis de las
células se lleva a cabo en presencia de un tampón que comprende
tiocianato potásico 1-4M, sacarosa
1-15% (p/v), EDTA 2,5-3,5 mM, Tris
10-30 mM y NaCl 0,1-1 M,
preferentemente y esencialmente que consiste en 291 g/l de
tiocianato potásico, 100 g/l de sacarosa, 1,86 g/l de EDTA, 12 g/l
de Tris y 17,5 g/l de NaCl.
También se prefiere que la precipitación ácida
de los contaminantes se lleve a cabo a un pH de
3-4.
Si se desea, la preparación del antígeno
obtenido después de retirada del precipitado formado en la etapa de
precipitación ácida puede almacenarse a un pH de
7-8.
Preferentemente, la preparación del antígeno
obtenido después del precipitado formado en la etapa de
precipitación ácida está en contacto con una matriz de tierra de
diatomeas a un pH de 3-5 para adsorber el antígeno y
los contaminantes se eluyen con un tampón de elución que tiene un
pH de 3-5, seguido de desorción del antígeno a un
pH de 7,5-9,0.
Si se desea, la preparación del antígeno
desorbido a partir de tierra de diatomeas puede someterse a
concentración convencional y tratamientos de desalinización, es
decir concentrado mediante ultrafiltración y eliminación de las
sales mediante diafiltración.
El anticuerpo monoclonal usado en el tratamiento
por cromatografía de inmunoafinidad de la preparación del antígeno
es un anticuerpo monoclonal elegido por una alta afinidad a
partículas de antígeno de superficie de hepatitis B antigénico. El
anticuerpo monoclonal usado en el tratamiento por cromatografía de
inmunoafinidad de la preparación del antígeno es anti HBsAg
CB-HEP1 producido por línea celular hibridoma ECACC
90 112 606.
Preferentemente, el antígeno se eluye a partir
de columna de cromatografía de inmunoafinidad con un tampón que
contiene un agente caotrópico.
Se prefiere que el tratamiento con calor del
antígeno eluído a 30-40ºC se lleve a cabo durante
1-6 horas.
Después de tratamiento con calor, el antígeno se
lava preferentemente en una columna de celulosa DEAE con un
detergente tal como deoxicolato de sodio y Triton
X-100. El detergente se usa en una concentración de
0,01-0,5% en peso, preferentemente
0,05-0,1% en peso. Luego el antígeno se eluye.
El antígeno eluído se somete luego
preferentemente a HPLC con límite entre 20 000 y 10 000 000 en
presencia de un detergente tal como deoxicolato de sodio. El
detergente se usa en una concentración de 0,01-0,05%
en peso, preferentemente aproximadamente 0,05% en peso.
El antígeno de superficie de hepatitis B se
recupera a partir de la cepa Pichia pastoris recombinante
C226 [pTAO9
06], CBS450.90.
06], CBS450.90.
La invención se explicará ahora en más
detalle.
La primera etapa del procedimiento es lisar las
células con un tampón que contiene EDTA, Tris, NaCl, sacarosa y
tiocianato de potasio. En esta etapa es importante la presencia de
EDTA que es un inhibidor de proteasa con un amplio espectro de
inhibición y también es totalmente biocompatible. La sacarosa
mantiene el estado conformacional de la molécula al igual que su
vida media. El tiocianato de potasio es un agente caotrópico
convencional: se pueden usar otros en su lugar.
Después de la ruptura de las células, la
separación de deshechos se lleva a cabo simultáneamente con una
precipitación ácida de proteínas contaminantes, usando un intervalo
de pH de 3 a 4. Esta operación permite reducir el número de etapas
durante el procedimiento de purificación y al mismo tiempo empezar
el procedimiento con un material de alta pureza (más de 10% de
antígeno) y con una buena recuperación. Además, esta etapa asegura
la eliminación de los lípidos contaminantes, carbohidratos y ADN.
Después de centrifugación, el líquido sobrenadante que contiene el
antígeno puede almacenarse a un pH entre 7 y 8. Con el fin de llevar
a cabo la posterior purificación, el pH de la preparación se baja
de nuevo a un pH entre 3 y 5 y luego se permite poner en contacto a
la preparación con una matriz de Celite donde se adsorbe el
antígeno. La matriz se lava con una solución tampón que tiene un pH
entre 3 y 5 (Tris-HCl, tiocianato de potasio,
sacarosa y EDTA) para retirar contaminantes tales como
carbohidratos, lípidos y ADN. El antígeno se recupera a partir de la
matriz mediante un cambio de pH, usando un tampón con pH entre 7,5
y 9,0. Esta etapa asegura que el antígeno se recupera con una pureza
entre 40 y 50%, sin riesgos de desnaturalización o pérdida de
particularidad del antígeno debido a las condiciones suaves
empleadas durante su elución.
El eluyente que contiene el antígeno desorbido
de la Celite se concentra entre 30 y 40 veces mediante
ultrafiltración usando una membrana de 0,1 \mum y después la
preparación se somete a diafiltración con 3 volúmenes de un tampón
adecuado (Tris.HCl, EDTA, pH entre 7 y 8) y luego se somete a una
posterior etapa de purificación mediante cromatografía por
inmunoafinidad, usando anticuerpos monoclonales especialmente
cribados para la selección de partículas antigénicas. Estos
anticuerpos monoclonales se usan para evitar tratamientos
estresantes y posiblemente reconocer epitopos específicos que
tienen propiedades inmunogénicas particulares como se ha demostrado
en chimpancés (Schellekens, H.; De Reus, A.; Peetermans, J.H. y Van
Eerd, P.A.C.M. Postgraduated Medical Journal, 1987, 63, Supplement
(2), p. 93-96). La fracción que contiene el HBsAg
obtenido a partir de la etapa previa se aplica en la columna de
afinidad equilibrada en un tampón adecuado tal como
Tris-HCl, fosfato de potasio o de sodio con pH
entre 6 y 7 usando un flujo entre 25 y 50 cm/h. Las fracciones no
adsorbidas en la columna (sustancias contaminantes) se lavan usando
el tampón de equilibrado con una adición de NaCl 1M. El antígeno se
recupera de la columna usando un tampón tal como
Tris-HCl o fosfato que contiene tiocianato de
potasio en un intervalo entre 1 y 3M. El material obtenido a partir
de esta etapa tiene una pureza de más de 85%.
Otro aspecto novedoso de este método es que el
eluyente que contiene el antígeno obtenido en la etapa previa se
somete luego a un tratamiento con calor a 30 a 40ºC, preferentemente
37ºC, durante un período de tiempo de 1 a 6 horas. Esta etapa
permite una alta recuperación de partículas homogéneas de 22 nm, que
muestran una alta inmunogenicidad. Especialmente, este hecho se
muestra en la etapa siguiente que consiste en intercambio iónico en
celulosa DEAE, en cuya etapa estas partículas eluyen en un pico
ancho con NaCl 175 mM, cuya fracción es diferente de las fracciones
restantes que contienen formas particuladas del antígeno con
actividad antigénica más
baja.
baja.
La fracción eluída que contiene el antígeno se
desaliniza luego mediante cromatografía de filtración sobre gel con
un tampón adecuado (Tris-HCl o tampón fosfato) en un
intervalo de pH de 7 a 7,5. Subsecuentemente, este material se
aplica sobre una columna de intercambio iónico similar a celulosa
DEAD y la resina se lava con diferentes concentraciones de NaCl en
un intervalo entre 10 y 50 mM y detergentes tal como deoxilato de
sodio y Triton X-100 a concentraciones en un
intervalo entre 0,05 y 0,1%. Estos lavados aseguran la eliminación
del ADN contaminante y endotoxinas. El antígeno se recupera a partir
de la columna usando una solución de NaCl entre 150 y 200 nM y
tiocianato de potasio. Esta preparación está completamente libre de
ADN y tiene un nivel de pureza por encima del 95%.
El antígeno eluído se concentra usando un
sistema de ultrafiltración con membranas con límite de 100 000
daltons hasta una concentración de proteína en un intervalo entre 1
y 3 mg/ml. Se añade un detergente tal como deoxicolato de sodio en
una concentración de 0,05% a la preparación y luego el concentrado
se somete a una cromatografía de filtración sobre gel de alta
resolución con un intervalo de trabajo de 10 000 000 y 20 000
daltons (PM 5000 o PM 6000). La columna se equilibra con un tampón
que contiene 0,05% de deoxicolato de sodio. La presencia de
detergente durante la operación decrece el nivel de endotoxina de la
preparación antigénica hasta menos de 0,4 ng/mg de antígeno y
permite la separación de fracciones no particuladas
adecuadamente.
El antígeno obtenido se desalinizar de nuevo en
una columna de filtración sobre gel en un tampón adecuado con el
fin de ser adyuvado en gel de hidróxido de aluminio con el fin de
usarse en una preparación para vacuna.
La verificación de las características de
inmunogenicidad superiores de la preparación para vacuna obtenida
mediante uso de los métodos indicados, se basa en los resultados de
ensayos preclínicos controlados llevados a cabo de acuerdo con un
estricto protocolo de doble ciego.
Mediante el método descrito en este texto es
posible obtener un producto de calidad superior que un inmunogen
sobre otros de la misma clase disponibles comercialmente para uso en
seres humanos.
Ejemplo
1
Para obtener el gen del antígeno de superficie
del virus de hepatitis B, se clonó el ADN viral en el sitio EcoRI
de pBR322. El genoma viral se obtuvo a partir de partículas Dane
aisladas y purificadas a partir de suero de un vehículo
asintomático del virus mediante un método similar al descrito (P.
Valenzuela et al., Nature, 1979, 280: 815). El
plásmido resultante, denominado pHBS1, se digirió con las enzimas
EcoRI y HpaI para obtener un fragmento que sucesivamente se digirió
con la enzima TaqI, y en este sitio se unió un conector EcoRI (5'
GGAATTCC 3') y se subclonó en el sitio EcoRI de pBR322. El plásmido
resultante se denominó pHBS2, del que se obtuvo el fragmento que
contenía el gen HBsAg mediante digestión con EcoRI y tratamiento con
nucleasa S_{1}.
Este fragmento se subclonó en el vector pBS5
(Fig.1) previamente se linealizó con NcoI y se trató con nucleasa
S_{1} y fosfatasa alcalina. El plásmido resultante se denominó
pPCAS3 (Fig.2), en el que las regiones virales no codificantes en
las terminaciones 5' (25 bp) y 3' (125 bp) que flanquean dicho gen
se eliminaron mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR por
sus siglas en inglés) de acuerdo con las condiciones de reacción
estándar (R. K. Saiki et al., Science, 1985, 230:
1350).
Usando dos oligonucleótidos sintéticos, cuyas
secuencias son:
| región 5': 5' GCCATGGAGAACATCACAT 3' | (SEQ ID Nº: 1) |
| región 3': 3' GACCCATATGTAAATTTGCAGCTGG 5' | (SEQ ID Nº: 2), |
Los sitios con restricciones NcoI y SaII se
crearon en las terminaciones 5' y 3' del gen respectivamente, que
permitió la fácil manipulación posterior y la eliminación de las
regiones no codificantes en la digestión del fragmento amplificado
con las enzimas mencionadas anteriormente. El fragmento de 678 bp
obtenido, que contiene el gen HBsAg exacto, se subclonó en el
plásmido pBS5. El plásmido resultante, denominado pPCB6 (Fig.3),
contenía dicho gen bajo señales de regulación de transcripción del
gen para la enzima
gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa
(GAP) de S. cerevisiae.
A partir del plásmido pCAO10, obtenido a partir
de una librería de ADN de Pichia pastoris (Fig.4) se extrajo
el fragmento 1.1 kb que contenía el promotor del gen del enzima
AOX1, al igual que una región 5' no codificante, que fue subclonada
en plásmido PBR322, siendo el plásmido resultante pPAO23 (Fig. 5)
sobre el que se llevó a cabo la técnica de reacción en cadena de
polimerasa con el propósito de eliminar 18 bp del gen estructural
para el enzima AOX1, que corresponde a los codones que codifican los
primeros 6 aminoácidos de esta proteína que están presentes en este
constructo.
Los oligonucleótidos usados fueron:
| región 5': 5' GTATCACGAGGCCCT 3' | (SEQ ID NO:3) |
| región 3': 3' TTGATTAATAAGCTTTGGTACCGC 5' | (SEQ ID NO:4) |
Los oligonucleótidos de la región 3' permiten la
creación de un sitio NcoI en la terminación 3' del promotor del gen
para la enzima AOX1 con el fin de eliminar la secuencia de 18 bp del
gen estructural para esta enzima y conseguir una unión exacta al
gen HBsAg. El oligonucleótido de la región 5' permite retención del
sitio EcoRI de
PBR322.
PBR322.
El fragmento amplificado de 1115 bp fue
subclonado en el plásmido pUC19, dando como resultado el plásmido
denominado pMAO107 (Fig.6) que contiene el promotor perfecto del gen
para la enzima AOX1 de P. pastoris.
El vector de integración final se obtuvo
mediante subclonación del gen exacto para HBsAg bajo el promotor
perfecto de la enzima AOX1 (Fig.7). El clon resultante, denominado
pHAO112, contiene el gen para HBsAg bajo la señal de la regulación
del promotor AOX1 y la señal de terminación del gen GAP de S.
cerevisiae, en el que hay también una región de ADN cromosomal
de P. pastoris necesario para recombinación homóloga con la
levadura. Mediante digestión parcial y tratamiento con nucleasa S1
de este plásmido, el sitio SaII se destruyó, estando localizado
entre la terminación 3' y el gen HBsAg y el terminador de la enzima
gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa.
El clon resultante se denominó pSAO503 (Fig. 8), y en él se
subclonó el fragmento 2,4 kb que contenía un fragmento del gen
estructural para la enzima AOX1 al igual que la región no
codificante 3' que lo flanqueaba, que se obtuvo a partir del
plásmido pCAO10. El plásmido resultante se denominó pVAO721 (Fig.8),
en el que se clonó el fragmento 1,8 kb que contiene el gen his3 de
S. cerevisiae, a partir del plásmido pPMC
(Fig. 9).
(Fig. 9).
El clon obtenido, pTA0906 (Fig. 10), dio el
plásmido de integración final que se usó para transformación de
cepa P. pastoris MP36 (EP-A 0 438 200). Los
individuos que mostraron claros patrones de integración se usaron
para evaluación de los niveles de expresión de antígeno. La cepa
seleccionada para producción del antígeno se denominó C226.
Un depósito de acuerdo con el tratado de
Budapest preparado con Pichia pastoris C226 [pTAO906] el 22
de Octubre de 1990 con el Central Bureau voor Schimmelcultures
(CBS) en Baarn, Países Bajos, depósito número CBS 450.90.
\newpage
Ejemplo
2
Para obtener la síntesis de HBsAg, la cepa
transformada C226 se cultivó en el estadio de preinoculación en un
medio salino, cuya composición era:
| K_{2}HPO_{4} - | 5 g/l |
| MgSO_{4} - | 4,6 g/l |
| NH4SO_{4}- | 22 g/l |
| CaCl_{2} - | 0.5 g/l |
| Glicerol - | 20 ml/l |
| Vitaminas 200 x - | 10 ml/l |
| Trazas de elementos 200 x - | 5 ml/l |
El crecimiento tuvo lugar a una temperatura de
30ºC y pH 4,5 bajo condiciones de aeración y agitación tal que
garantizaba una presión parcial de oxígeno mayor del 30% del valor
de saturación. El cultivo creció entre 10 y 12 horas.
En el estadio de inoculación hubo un cambio en
el medio salino por un medio rico de la siguiente composición:
| Extracto de levadura | 1% |
| Peptona | 2% |
| Glicerol | 2% |
| Trazas de elementos 200x - | 10 ml/l |
| Vitaminas 200x - | 5 ml/l |
El cultivo se mantuvo durante
10-12 horas bajo estas condiciones hasta que se
alcanzó una concentración celular de 10-12 g/l (en
base a una materia seca) con el fin de inocular la fermentación que
se llevó a cabo en el mismo medio rico y bajo idénticas condiciones
de temperatura y pH. El cultivo se mantuvo durante
8-10 horas hasta que se alcanzó una concentración
celular de 10-12 g/l (en base a un materia
seca).
A partir de este momento empieza una adición
continua de metanol con el fin de inducir expresión del antígeno
que alcanza aproximadamente 3% del total de proteína al
90-100 horas de cultivación. Esta adición se lleva
a cabo con incremento a intervalos de acuerdo con el incremento de
concentración celular en el medio. Al final de este período empieza
un incremento de cultivo con un medio rico que tiene la siguiente
composición:
| Extracto de levadura | 3% |
| Peptona | 6% |
Este incremento se mantiene hasta el final del
cultivo, que termina a 180-200 horas, incrementando
la relación de crecimiento específico cinco veces, y alcanzando los
niveles de expresión. Un resultado de este método fue también que
la proteína expresada de esta manera se mantiene en forma soluble
sobre 80%, y este factor determina mayor eficacia en las etapas
posteriores de purificación al igual que mejora la particulación del
antígeno.
En la etapa final de fermentación, se obtiene
una concentración de biomasa de 60 a 80 g/l (en base a materia
seca) y los niveles de expresión de antígeno alcanzan entre 2 y 5%
de la proteína total.
Cuando se completa la fermentación, las células
se colectan por centrifugación en un sistema continuo y se
almacenan a 4ºC como una crema después de lavar con agua estéril
usando el mismo sistema de centrifugación.
Ejemplo
3
Con el fin de obtener una preparación de HBsAg
adecuada para procesamiento por columna cromatográfica, el extracto
bruto obtenido mediante disrupción mecánica de la biomasa obtenida
mediante centrifugación del cultivo de la levadura transformada con
el gen que codifica el antígeno, se sometió al siguiente método de
purificación.
La concentración celular de la crema lavada se
ajustó a 100 g/l con agua destilada y con el fin de obtener un
tampón de ruptura se añadieron las siguientes sustancias:
| Trishidroximetilaminometano | 12,1 g/l |
| Sacarosa | 100 g/l |
| NaCl | 17,5 g/l |
| EDTA | 1,86 g/l |
| KSCN | 2,91 g/l |
El pH se ajustó entre 7,5 y 8,0 con HCl 1N.
Esta solución se homogeneizó durante 5 minutos y
se sometió a ruptura mecánica de las células en una trituradora.
Las células desintegradas se sometieron a un
procedimiento de clarificación basado en la estabilidad de HBsAg
bajo condiciones extremas de pH, bajo las cuales numerosas proteínas
contaminantes de la levadura huésped precipitaron, mientras el
antígeno permaneció en la solución.
La clarificación del extracto de ruptura
mediante precipitación de contaminantes a pH ácido se llevó a cabo
mediante el siguiente método:
El homogenato de células desintegradas se enfrió
a una temperatura entre 0 y 4ºC, bajo agitación continua y
registrando el pH, y se mezcló rápidamente, evitando la formación de
espuma, con una solución de HCl 1N a 4ºC, en una cantidad
suficiente para bajar el pH hasta un intervalo entre 2,5 y 3.
Después de agitación durante cinco minutos más, la mezcla se
centrifugó en una centrífuga en continuo enfriada a 4ºC, con un
tiempo de permanencia de 45 minutos, manteniendo fríos los
receptáculos de los que se extrajo y se colectó el material. El
líquido sobrenadante se almacenó a un pH entre 7,5 y 8,5
inmediatamente después de centrifugar, bajo agitación constante y
registro de pH.
El pH del líquido sobrenadante se bajó de nuevo
hasta 4,0 y se homogeneizó durante una hora aproximadamente con una
matriz de Celite (High Flor Supercell, Fluka), en una proporción
aproximada de 0,35 g del antígeno por kg de la matriz. El antígeno
se adsorbió sobre la matriz y mediante centrifugación, filtración o
decantación, el último se separó a partir del material no adsorbido
que se descartó. Luego se llevaron a cabo 2 ó 3 lavados del
antígeno fijado sobre el lecho con una solución tampón que tenía la
siguiente composición:
| KSCN | 48,5 g/l |
| Sacarosa | 100 g/l |
| Tris | 2,42 g/l |
| EDTA | 1,86 g/l |
El pH se ajustó a 4,0 con HCl 1N.
Después de los sucesivos lavados, se llevó a
cabo la deserción del antígeno de la matriz, usando un tampón de
elución, siendo la composición del mismo la siguiente:
| Tris | 2,42 g/l |
| EDTA | 1,12 g/l |
| Sacarosa | 100 g/l |
El pH se ajustó entre 9,0 y 9,5 con NaOH 1N.
El material obtenido mediante la elución se
introdujo en un concentrador de tipo AMICON
(Hollow-Fiber) con un cartucho que tenía un tamaño
de poro de 0,1 mm con el fin de concentrar su volumen inicial por un
factor de aproximadamente 55. La operación total se llevó a cabo a
4ºC.
Con el fin de completar la purificación del
HBsAg obtenido se llevaron a cabo algunas etapas cromatográficas
que se describen a continuación:
Se desalinizaron aproximadamente 2 litros de los
líquidos eluídos concentrados de la celita mediante columna de
filtración sobre gel de medio Sephadex G-25, se
expandió y se equilibró en tampón Tris-HCl 20 mM, pH
8,0. El progreso se controló mediante la absorbancia a 280 nm y
mediante conductividad.
Se preparó una matriz de inmunoafinidad que
contenía aproximadamente 2 litros de Sepharose CL-4B
activada con CNBr y aproximadamente 10 g del anticuerpo monoclonal
CB-HEP1 (obtenido en el CIGB de acuerdo con el
ejemplo 4) unido, con características especiales que permiten la
selección de las poblaciones de antígeno que tienen inmunogenicidad
alta. La columna de inmunoafinidad empaquetada con la matriz
anterior se equilibró con tampón Tris-HCl 20 mM, pH
8,0, y se inyectó con una cantidad de concentrado del eluído de la
celite desalinizada que contenía el antígeno para una relación
aproximada de 0,1 mg de HBsAg por ml de lecho. El caudal fue
aproximadamente de 50 cm/h a temperatura ambiente. Los lavados se
llevaron a cabo con un tampón de equilibrado y el progreso se
controló mediante la absorbancia a 280 nm con registro gráfico. El
efluyente se colectó hasta que alcanzó la línea base en el
cromatograma, luego el tampón que contenía Tris-HCl
20 mM, NaCl 1N, pH 8,0 se pasó para eliminar adsorción no
específica hasta que se obtuvo el nivel base de nuevo.
El antígeno se eluyó con un tampón que contenía
Tris-HCl 20 mM, KSCN 3M, NaCl 1M, pH 8,0 y la
columna se lavó inmediatamente con un exceso de tampón de
equilibrado en presencia de 0,01% de timerosal a 4ºC, en el caso de
que la columna se mantenga sin usar durante largo tiempo.
El HBsAg eluído a partir de la columna de
afinidad se sometió a un tratamiento con calor a 37ºC durante 2
horas en un baño de agua. Posteriormente el antígeno se desalinizó
en una columna de Sephadex G-25 equilibrada con
Tris-HCl 20 mM, EDTA 3 mM, pH 8,0.
En una columna que contenía celulosa DEAE
(Whatman DE-52) equilibrada en
Tris-HCl 20 mM, EDTA 3 mM, tampón a pH 8,0, se
inyectaron aproximadamente 3 litros de material desalinizado a
partir de columna de inmunoafinidad y el procedimiento se llevó a
cabo a 4ºC. Luego, se llevaron a cabo lavados posteriores con el
tampón de equilibrado que contenía Tris-HCl 20 mM,
EDTA 3 mM, NaCl 50 mM y 0,05% de Na-Deoxicolato. El
procedimiento se controló mediante absorbancia a 280 nm con
registro gráfico. El efluyente se colectó hasta que se alcanzó la
línea base en el cromatograma. El HBsAg se recuperó de la columna
usando un tampón que contenía Tris-HCl 20 mM, EDTA
3 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0, colectando el efluyente hasta que se
alcanzó de nuevo la línea base.
La fracción que se obtuvo a partir de la columna
de intercambio iónico tal como se ha descrito en la etapa previa,
se concentró en un Sistema Amicon Hollow Fiber
(DC-2), usando un cartucho de límite de 100 000
daltons aproximadamente 25 veces. Luego, se añadieron 0,05 g/100 ml
de Na-Deoxicolato al concentrado. La incubación se
llevó a cabo durante 1 horas a 4ºC y luego esta fracción se aplicó
sobre una columna PWG 6000, se equilibró en
Tris-HCl 20 mM, EDTA 3 mM, y
Na-Deoxicolato al 0,05%, pH 8,0. Se obtuvo un pico
principal que contenía el antígeno altamente particulado, libre de
monómeros o dímeros de la misma molécula. Esta fracción se recogió
y se desalinizó sobre una columna G-25 equilibrada
en PBS, pH 7,0. Esta preparación final de HBsAg purificado se
filtró estérilmente usando una membrana de 0,2 \mum para un
posterior tratamiento adyuvante en hidróxido de aluminio.
Como al antígeno purificado tal como se ha
referido anteriormente debe desarrollarse como una preparación
inyectable, se tomaron todas las medidas estrictas para cumplir con
los requerimientos que caen sobre preparaciones para administración
parenteral y se llevaron a cabo los controles de calidad
correspondientes (Requirements for Hepatitis B vaccines made by
recombinant DNA techniques, Requirements for Biological Substances
No. 45, World Health Organization, Technical Report Series, No.
786, 1989).
En la siguiente tabla se resumen los resultados
durante el procedimiento de purificación de HBsAg, objeto de la
presente invención.
| Etapa | Vol (1) | HBsAg (mg) | Proteínas | Actividad | Rendimiento |
| (Determi. | totales | específica (mg | global | ||
| mediante ELISA) | HbsAg det. | ||||
| ELISA/g de prot.) | |||||
| Células | 168 | 26600 | 880 | 30,2- | |
| desintegradas | |||||
| Precipitación | 176 | 14520 | 114 | 127,3 | 54% |
| ácida | |||||
| Adsorción sobre | 34,5 | 4640 | 7,1 | 653,5 | 17% |
| celita y concentración | |||||
| Inmunoafinidad y | 9,5 | 3120 | 3,2 | 975 | 11% |
| tratamiento térmico | |||||
| Intercambio | 2,5 | 1936 | 1,86 | 1040 | 7,2% |
| iónico | |||||
| Filtración sobre | 0,54 | 1500 | 1,42 | 1056 | 5,6% |
| gel HPLC |
Ejemplo
4
Con el fin de obtener un anticuerpo monoclonal
(MAb) específico para HBsAg, se inmunizaron ratones machos de 8
semanas Balc/c con antígeno de superficie de virus de hepatitis B
natural obtenido a partir de plasma humano (S. Krugman et
al., J. Am. Med. Assoc., 1971, 217: 41). La fusión,
cultivo y seguimiento de los híbridos se llevó a cabo de acuerdo
con los principios básicos descritos por Kholer (The Technic of
Hybridoma Production, Immunological Methods, 1981, Vol. 1, Academia
Press, 285-298). Las células de bazo se hibridaron
con línea mieloma SP2/0/Ag14 en una relación de 10:1 usando
polietilenglicol 1500 al 50% (BDH), y se sembraron sobre placas con
96 pocillos (Costar), a una concentración de 100 000 células por ml
de medio y 100 \mul por pocillo. El medio de cultivo selectivo
usado fue RPMI 1640 (Gibco), que se puede implementar con
NaHCO_{3} 1 g/l, HEPES 3 \mug/l, L-glutamina 2
mM, piruvato de sodio 1 mM, 2-mercaptoetanol 0,05
mM, suero de ternero recién nacido al 10%, gentamicina 40 \mug/ml
y 3% de líquido sobrenadante de cultivo de células endoteliales
humanas (HECS), (Astadi et al., Methods of Enzymology, 1983,
Vol. XCII, ed. J. Langone, Academia Press, 39-46),
al que se añadió hipoxantina hasta 0,03 mM, timidina hasta 3 mM y
aminopterina hasta 0,4 \muM.
A partir de la tercera semana de cultivo, los
líquidos sobrenadantes se investigaron para anticuerpos específicos
de HBsAg, usando un ELISA indirecto. Entre los pocillos positivos,
se eligió el No. 48 por sus altos valores obtenidos en ensayos
repetidos, y se clonó y reclonó varias veces mediante dilución
limitante. Como último clon se eligió 48/1/5/4, que segregó un MAb
que tenía las siguientes características inmunoquímicas:
- reconoce de una manera específica ambos HBsAg
natural y HBsAg recombinante producidos en levaduras (HBsAgr). Esto
se demostró en ELISA con ambas moléculas.
- reconoce HBsAg en ambas fases sólida (ELISA) y
en solución. Es posible inhibir la unión del MAb al antígeno en
fase sólida mediante incubación previa con él en solución.
- no se observaron reacciones cruzadas en ELISA
al ensayar con varias moléculas como revestimiento. Se reconoce
específicamente también en un equipo Western blot la banda que
corresponde a HBsAg de una preparación de levadura que produce
HBsAgr. Esto nos permite afirmar que este MAb es altamente
específico a HBsAgr y que el epitopo reconocido es un tipo
continuo.
- reconoce de manera equivalente los estándares
internacionales de subtipos ay y ad, que indican que se dirige
contra el determinante común de todos los subtipos del virus.
- una característica especial de este clon es el
hecho de que sintetiza dos tipos de cadenas pesadas: una de
subclase gamma 2b y el otro de clase M. Las células segregan ambos
anticuerpos de clase IgG 2b y moléculas pentaméricas IgM que pueden
separarse mediante cromatografía de filtración sobre gel (Sephacryl
S-300). Esto fue demostrado mediante inmunodifusión
radial doble (O. Ouchterlony et al., 1973, Handbook of
Experimental Immunology, vol. 1:19.1) y electroforesis sobre gel de
poliacrilamida (N. K. Laemmli, Nature, 1970, 227: 680).
Ambos anticuerpos son específicos de HBsAg, que fue demostrado
mediante ELISA con conjugados específicos para ratón IgG e IgM
(Sigma).
- experimentos sobre placas revestidas de PVC
indican que el MAb es capaz de atrapar HBsAg eficazmente. Un alto
porcentaje de él puede ser eluído subsecuentemente, usando
soluciones con una alta molaridad de tiocianato de potasio.
Se preparó un depósito de acuerdo con el tratado
de Budapest de esta línea celular de hibridoma el 26 de Noviembre
de 1990 con el Colección Europea de Cultivos celulares animales,
Salisbury, Reino Unido, número de depósito ECACC 90 112 606.
Para la producción de este anticuerpo
monoclonal, sus preparaciones puras se obtuvieron a partir de
fluidos ascites extraídos después de inoculación de 3 millones de
células híbridas en la cavidad peritoneal de ratón Balb/c
preinyectado 10 días antes con aceite mineral mediante la misma
ruta. Los ascites colectados mediante punción repetida se
centrifugaron a 500 g, se retiraron los lípidos con cloroformo 1:1,
y se dializaron con salino tamponado con fosfato (PBS).
Para purificación se usó una precipitación con
NH_{2}SO_{4} al 50%, durante 2 horas a 4ºC, se centrifugó a
4000 r.p.m. durante 30 minutos, dos lavados adicionales del
precipitado con la misma concentración de NH_{2}SO_{4} y se
desalinizó en Sephadex G-25 (Pharmacia). El
espécimen desalinizado se fraccionó mediante cromatografía de
afinidad en proteína A Sepharose CL4B (Pharmacia), siguiendo las
instrucciones sugeridas por el fabricante.
Los anticuerpos purificados se unieron a
matrices de Sepharose CL4B activada con bromuro de cianógeno de
acuerdo con el método propuesto por el fabricante. Por ml de gel,
se usaron 5 mg de MAb.
Ejemplo
5
Con el fin de obtener una preparación de vacuna
a partir del antígeno recombinante puro, con alta homogeneidad y
grado de particulación, el último se mezcló con una solución de
hidróxido de aluminio estéril.
Siguiendo esta fórmula, se prepararon varios
lotes para llevar a cabo los ensayos necesarios para caracterización
de este producto. Luego los resultados obtenidos se detallaron en
la evaluación de los tres lotes consecutivos de esta
preparación.
Ejemplo
6
Para estudiar las características de
inmunogenicidad del antígeno de superficie del virus de la hepatitis
B obtenido mediante la ruta de ADN recombinante en levaduras tal
como se ha descrito en los ejemplos anteriores, se llevó a cabo un
protocolo para ensayos preclínicos sobre grupos de voluntarios,
después de demostrar que la preparación cumple con los
requerimientos de las regulaciones para uso en seres humanos para
administración parenteral (Requirements for Hepatitis B vaccines
made by recombinant DNA techniques, Requirements for Biological
Substances No. 45, World Health Organization, Technical Report
Series, No. 786, 1989). Estos estudios fueron conducidos por un
Comité de Evaluación creado para este propósito por el Ministerio de
Salud Pública de Cuba, que emitió un informe de resultados que se
da en forma resumida a continuación:
El Comité de Evaluación para la vacuna
recombinante cubana contra hepatitis B del Ministerio de Salud
Pública de Cuba redactó un informe final completo de un estudio en
fase II prototipo para evaluación de la inmunogenicidad de la
vacuna cubana de origen ADN recombinante del antígeno de superficie
del virus de hepatitis B (rec-HBsAg) en
levadura.
Este informe que se resume en este texto es un
experimento doble ciego controlado diseñado para comparar el
comportamiento de la vacuna rec-HBsAg cubana con una
vacuna comercialmente disponible establecida del mismo tipo que
está aprobada y registrada en casi cien países (Smith &
Kline).
De un total de 123 personas que firmaron un
documento como un registro de su consentimiento para participación
voluntaria en el estudio, 35 fueron excluidos por diferentes razones
y se eligieron 88 personas clínicamente sanas libres de marcadores
de virus (HBsAg, HBeAg, anti-HBsAg,
anti-HBcAg), con valores normales de transaminasas
(ALT). La muestra consistía principalmente en adultos jóvenes de
ambos sexos, de edad entre 20 y 34, uniformemente distribuidos en
tres grupos de 31, 30 y 27 personas, que fueron inoculados con 3
dosis (1 ml de antígeno adsorbido sobre hidróxido de aluminio) de
20 mg de la vacuna cubana (CV20), 10 mg de la vacuna cubana (CV10),
y 20 mg de la vacuna comercial (SK20), respectivamente, en los días
0, 30 y 60.
Se tomaron muestras de sangre en los mismos días
antes de la vacunación y en los días 15, 75 y 90 intra o
post-vacunación. 45% del total del grupo de personas
fueron inoculadas subcutáneamente y el resto intramuscularmente
(músculo deltoide), sin diferencias significativas entre los grupos
relativo a la edad, sexo o métodos de
administración.
administración.
En el día 90 después de completar el programa
total de vacunación, en 29 de aquellos vacunados y evaluados de los
31 que recibieron CV20, 100% mostraron título a anticuerpo mayor que
el nivel protector mínimo acordado (MPL) de 10 IU/litro, con un
título de media geométrica (GMT) de 239,9 IU/litro.
En 26 de estos vacunados y evaluados de los 30
que recibieron CV10, 100% mostraron título a anticuerpo mayor que
el MPL con un GMT de 218,4 IU/litro, mientras que de las 26 personas
vacunadas y evaluadas de los 27 que recibieron SK20, 23 (88,5%)
tenían anticuerpos con un GMT de 43,9 IU/litro, pero solamente 21
(80,8%) excedieron el MPL.
Al comparar los resultados del día 90 con los
del día 75 (15 días después de la tercera dosis), ambas vacunas
cubanas CV20 y CV10 mantuvieron una relación mínima de
seroconversión (100%) e incrementaron hasta 100% el número de los
vacunados con títulos mayores del MPL, mientras con SK20 el número
de aquellos que respondieron decrecieron del 96,3% a 88,5%, pero el
número de personas con títulos mayores del MPL incrementó de 70,4%
a 80,8%. Estos datos son todavía significativamente peores (p) para
SK20 que para ambas preparaciones
cubanas.
cubanas.
Se puede concluir, consecuentemente, que del
total de 81 personas vacunadas y evaluadas que completaron el
programa de vacunación (92% de aquellos que recibieron la primea
dosis), la seroconversión se produjo en 78 (96,3%), del total 55
(100%) recibieron una u otra vacuna cubana (todos con títulos
mayores del MPL) y 23 (88,5%) recibieron la vacuna comercial, 21
(80,8%) de ellos con títulos mayores del MPL. Basado en estos
resultados que están significativamente a favor de la vacuna
cubana, se decidió extender este estudio a un grupo mayor de
personas elegidas de la manera descrita anteriormente y agrupado en
instituciones diferentes del servicio de salud
nacional.
nacional.
Los resultados de esta segunda fase se dan en
forma resumida en las gráficas 1 y 2. En estas gráficas se pueden
ver los niveles de respuesta para ambas preparaciones (vacuna cubana
v. SK) usando métodos de inmunización intramuscular (IM) y
subcutánea (SC).
Las siguientes abreviaturas se usan en los
dibujos:
| B | BamHI |
| N | NcoI |
| S | SalI |
| E_{I} | EcoRI |
| E_{v} | EcoRV |
| BglI | BglI |
| C | Clal |
| CIP | fosfatasa de intestino de ternero |
| Klenow | Fragmento grande de polimerasa I de ADN |
SEQ. ID NO:1
| TIPO DE SECUENCIA: nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: 19 nucleótidos |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCATGGAGA ACATCACAT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ. ID NO:2
| TIPO DE SECUENCIA: nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: 25 nucleótidos |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTCGACGTT TAAATGTATA CCCAG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ. ID NO:3
| TIPO DE SECUENCIA: nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: 15 nucleótidos |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTATCACCAG GCCCT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ. ID NO:4
| TIPO DE SECUENCIA: nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: 24 nucleótidos |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCCATGGTT TCGAATAATT AGTT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (4)
1. Antígeno de superficie de
hepatitis B recombinante, que se puede obtener mediante un
procedimiento que comprende
- -
- crecer células de cepa Pichia pastoris C226 [pTAO906], CBS450.90, que contiene un gen que codifica dicho antígeno de superficie de hepatitis B bajo condiciones que dan como resultado su expresión;
- -
- lisar las células en presencia de un tampón que comprende un agente caotrópico, sacarosa y ácido etilendiamino-tetraacético (EDTA);
- -
- precipitar contaminantes a un pH ácido;
- -
- someter la preparación de antígeno a un tratamiento de adsorción ácida y deserción alcalina sobre una matriz de tierras de diatomeas;
- -
- someter la preparación de antígeno a cromatografía de inmunoafinidad usando el anticuerpo monoclonal específico del antígeno de superficie de hepatitis B, CB-HEP1 producido por línea celular hibridoma ECACC 90 112 606;
- -
- someter el antígeno eluído a un tratamiento con calor a una temperatura de 30 a 40ºC;
- -
- lavar el antígeno en una columna de intercambio aniónico con detergente; y
- -
- someter el antígeno eluído a HPLC en presencia de un detergente.
2. Composición para vacuna para
inmunizar contra Virus de Hepatitis B, que comprende un antígeno de
superficie de Hepatitis B tal como se reivindica en la
reivindicación 1, en un cantidad eficaz para vacunación, y al menos
un vehículo, diluyente o adyuvante apropiado para uso en composición
para vacuna.
3. Uso de cepa Pichia
pastoris C226 [pTAO906], CBS450.90, en un método tal como se ha
definido en la reivindicación 1.
4. Uso de un anticuerpo monoclonal
anti-HBsAG CB-HEP1, producido por
línea celular hibridoma ECACC 90 112 606, en un método tal como se
ha definido en la reivindicación 1.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CU90155A CU22290A1 (es) | 1990-10-08 | 1990-10-08 | Procedimiento para la obtencion de antigeno de superficie del virus de la hepatitis b de superior capacidad inmunoganica y su uso en un preparado vacunal |
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