CN1108306A - 羧端带有前表面抗原1决定簇的重组乙肝疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明是用基因重组技术生产的新型乙肝疫苗， 将含有肝细胞结合位点的preS1(21－47)的抗原决 定簇的基因片段与乙肝病毒表面抗原主蛋白S基因 3′端融合，并将该融合基因插入痘苗表达载体，构建 重组痘苗病毒vSA－28。该重组病毒能稳定的表达 乙肝表面抗原和prsS1抗原的融合颗粒，具有良好的 双重免疫原性，分泌性和稳定性。作为新型乙肝亚单 位颗粒疫苗，用于乙肝的预防和治疗，也可用于制备 新型乙肝活疫苗。

Description

乙型肝炎是一种严重危害人类健康并广为流行的疾病，特别是在发展中国家。在我国，乙肝病毒携带者达1亿以上，由乙肝或乙肝有关的疾病导致死亡人数巨大，危害极大，普遍接种疫苗是控制乙肝的重要措施。

在乙型肝炎病毒（HBV）感染的某些患者血清中存在有42nm具有感染的病毒颗粒，是由病毒衣壳蛋白即表面抗原（HBsAg），核心抗原（HBcAg）和病毒核酸（DNA）组成。另外还有不具有感染性的20-22nm的球状和棒状颗粒，仅含乙肝表面抗原。它能诱导产生特异抗乙肝病毒抗体，使人体产生免疫力。由病人血清中分离HBsAg，制成的血源疫苗，由于来源困难，成本昂贵，安全性差，不够理想。

利用基因工程技术，在不同体系中：酵母，哺乳动物细胞，重组痘苗等表达乙肝表面抗原，用作基因工程疫苗，比之血源疫苗更为安全，经济，有效，但就其免疫原性的本质与血源疫苗几乎相同，因而仍有一些不足之处：如1）5-10%的人群免疫反应低下或无免疫应答。2）所需抗原量大。3）免疫持久性4-5年。因此研究高效经济的新型乙肝疫苗十分必要。

乙肝表面抗原有三种蛋白组分：主蛋白（S），中蛋白（M）和大蛋白（L），这三种蛋白由HBV中同一阅读框架的DNA编码，从不同的起始码ATG起始翻译，差别在于M蛋白比S蛋白在氨端多了55个氨基酸，即前表面抗原2（preS2）区，而L蛋白比M蛋白在氨端又多了119个氨基酸，即前表面抗原1（preS1）区。M和L蛋白主要存在于病毒颗粒的外壳中。

preS1区含有不同于S的抗原决定簇。preS1区具有T细胞和B细胞水平上的免疫原性，其中氨端第21-47氨基酸的肽段，能与肝细胞膜结合（Neurath A.R.等cell 1986：46.429-436）具有诱导产生中和抗体的能力，从而能阻断乙肝病毒与肝细胞的结合，以保护机体不受感染。另外L蛋白能激活对preS1特异的T细胞，克服对S蛋白和M蛋白的不反应性。但L蛋白不易从细胞中分泌出来，并且还抑制了S蛋白的分泌（Persing，P.H.等，Science，1986，234，1388）。氨端的肉豆蔻酸化和氨端的18个氨基酸顺序都是影响分泌的原因，同时L蛋白易被降解。因此要获得含L蛋白的疫苗有一定的困难。

用合成的preS1（21-47）多肽研究证实，该区域含有HBV与肝细胞结合所必需的位点，抗preS1（21-47）单抗MA18/7和F35.25能有效地抑制HBV与肝细胞的结合，具有中和病毒的能力（Petit M.A.等，Virology 1991，180.483-491）。免疫猩猩能使其抵制HBV的攻击（Neurath A.R.等，Vaccine，1989，7，234-236）。但是，用合成多肽作为疫苗，免疫原性低，距实际应用尚有很大距离。

近来，利用乙肝表面抗原作载体蛋白，成功地将外源基因片段，如：人单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSV-I）（Valenzuela，P.等，Bio-Technology，1985，3，323.），人免疫缺陷病毒（HIV）（Michel，M-L等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1988，85，7957.），脊髓灰质炎病毒（plio）（Delpeyroux，F.等，Science 1986，233，472）都插入preS2区，在酵母或哺乳动物细胞中获得表达。我们将促生长素抑制素基因（SS）融合在HBsAg主蛋白的羧端，也获得了成功（徐文忠等，生物化学与生物物理学报，1993，25，119-126）。因此，通过将preS1免疫决定簇与HBsAg主蛋白融合的办法，获得带preS1的新型乙肝疫苗不失为一条新的技术路线。

R.E.Streeck等人曾报道，将preS1氨端氨基酸顺序1-42，在乙肝表面抗原第223位，外加5个氨基酸的接头与之融合，在SV40启动子控制下，获得了暂时表达。虽然他们也发现在细胞内和培液中都有S和preS1的表达，能形成颗粒，但尚未构建稳定的表达株和对表达产物的免疫原性进行研究（Machein L，等，Arch.Virol，1992，4，133-136）。另外，他们使用的片段（1-42）中N端的20个氨基酸，可能会影响表达产物的分泌。

本发明的目的在于提供一个阻断乙肝病毒感染的新型乙肝重组疫苗，即一个含有乙肝表面抗原S基因与preS1肝细胞结合位点的抗原决定簇基因融合的重组痘苗病毒（Vaccinia Virus），能稳定地表达并分泌乙肝表面抗原与preS1的融合颗粒。颗粒同时具有乙肝HBsAg和preS1的双重抗原性，具良好的免疫性，免疫动物能迅速产生高滴度的双重抗体，这就具备了发展成高效、速效的新型乙肝疫苗的可能。本发明所提供的重组痘苗病毒能大量分泌产生HBsAg和preS1的融合颗粒。经分离纯化，可制成更为安全高效的新型乙肝基因工程颗粒疫苗。该重组痘苗病毒也可用于制备成新型乙肝活疫苗。

我们利用PCR技术，人工合成了preS1基因中对应氨基酸第21-47的核苷酸顺序，去除了可能影响S抗原分泌的氨端20个氨基酸。在乙肝表面抗原基因羧端，在对应氨基酸第223位与合成的preS1核苷酸片段相融合。获得了含有乙肝表面抗原S基因与preS1（21-47）的融合基因。并构建了含有该融合基因的重组痘苗病毒，成功地表达了带HBsAg和preS1双重抗原的颗粒。实验证明，我们的设计方案既不影响乙肝表面抗原颗粒的形成和白细胞的分泌，也不影响HBsAg的免疫原性，却同时带有preS1的免疫原性。免疫动物能高水平地产生抗HBsAg和抗preS1的抗体。

本发明提供将HBsAg主蛋白羧端与preS1抗原决定簇融合，以及组建一个能稳定表达分泌HBsAg主蛋白和preS1蛋白融合颗粒的重组痘苗病毒的方法，包括：

1.含肝细胞结合位点的preS1抗原决定簇（21-47）的PCR法合成和克隆（pWR/PS1）。

2.乙肝表面抗原基因（S）羧端与合成的preS1（21-47）基因融合的克隆构建（pUC/PSA-28）。

3.含融合基因的重组痘苗表达质粒的构建（pGJPSA-28）。

4.含乙肝S基因与preS1（21-47）基因的重组痘苗病毒的构建和筛选（vSA-28）。

5.重组痘苗病毒的增殖和带preS1的乙肝表面抗原的表达。

本发明的示意图说明如下：

图1.含肝细胞结合位点的preS1抗原决定簇（21-47）基因的PCR合成和克隆示意图。

图中符号说明：St：StuⅠ（限制酶）;X：XbaⅠ;Pv：PvuⅡ;E：EcoRⅠ;S：SacⅠ;Sm：SmaⅠ;B：BamHⅠ;Sa：Sa1Ⅰ;Ps：PstⅠ;H：HindⅢ。

图2A.乙肝S基因3′端与preS1（21-47）的融合和克隆示意图。

图中符号说明：■  S基因，□  PreS1;Sp：Spel;Pf：pflmⅠ;Ac：AccⅠ;余者同图1。

图2B.乙肝S基因3′端与preS1（21-47）融合在痘苗表达载体上的克隆示意图。

图3.重组痘苗病毒vSA-28的Southern杂交鉴定ECL显影照片。

1.天坛株，2.pGJPSA-28，3.vSA-28。

图4.重组痘苗病毒vSA-28表达产物具S抗原和preS1双重抗原性。

图4A.培养液和细胞裂解液中³⁵S甲硫氨酸标记的乙肝表面抗原与抗HBsAg免疫沉淀，经蛋白电泳的放射性自显影图。

图4B.培养液和细胞裂解液中³⁵S甲硫氨酸标记的乙肝preS1抗原与抗preS1单抗MA18/7免疫沉淀，经蛋白电泳的放射自显影图。

图中：Mock对照;S带HBsAg的重组痘苗vTH-2;SA-28重组痘苗vSA-28。

M.为标准分子量    m.为培养液    C.为细胞裂解液

箭头表示糖苷化和非糖苷化的S和SA-28蛋白

图5.重组痘苗病毒vSA-28表达产物的分泌性测定。在不同细胞（CV-1，Vero，CEC）中分泌性水平的比较。

培养液;■细胞裂介液。

图6.重组痘苗病毒vSA-28表达产物颗粒性鉴定。

图6A.vTH-2（上）和vSA-28（下）融合颗粒的CsCl密度超离心测定。

图6B.vSA-28融合颗粒的电子显微镜观察照片（×12000）。

图7.重组痘苗病毒vSA-28表达产物的免疫原性测定。

本发明的内容具体描述如下：

1.preS1（21-47）基因片段的PCR合成及克隆;

我们选定乙肝病毒adr亚型含有肝细胞结合位点的preS1抗原决定簇，氨基酸序号第21-47位，以含preS1基因的克隆作模板，用PCR法合成了与preS1（21-47）相对应的核苷酸序列。为便于克隆，在此片段的5′端和3′端分别引入一个StuⅠ和XbaⅠ酶切点。PCR产物经上述酶双酶解后，克隆入PWR13质粒得PWR13质粒得PWR/PS1，在通过顺序测定验证后备用（见图1）。

2.乙肝表面抗原基因（adr型）羧端与合成的preS1（21-47）基因融合克隆

在含有preS1（21-47）的克隆上，将XbaⅠ切点打开，再补平重连，在preS1（21-47）片段3′端造成一个终止码TAG。为了在preS1（21-47）片段5′端与乙肝表面抗原基因融合后，仍保持阅读框架正确，在preS1片段5′端，装上10个寡核苷长的SmaⅠ接头，而在S基因3′端，对应第223氨基酸处，即AccⅠ酶切点，经同样酶切开补平，造成平头与preS1（21-47）氨端SmaⅠ接头连接，完成乙肝表面抗原基因与preS1（21-47）的基因融合。含preS1与HBsAg223位融合基因的重组质粒为PUC/SA-28（见图2A）。我们将重组质粒转入大肠杆菌中保存，此菌种为Escherichia coli TG-1/PGJPSA-28存放标记CCTCC  NO：M93074。

3.融合基因在重组痘苗表达质粒上的构建

为实现设计的融合基因与痘苗病毒的重组，首先必须将融合基因插入痘苗表达质粒。我们选择已成功用于多种外源基因表达的痘苗通用表达质粒pGJP-5（吴雪等，生物化学与生物物理学报1987，19（5）395）。该质粒带有痘苗启动子p7.5和痘苗TK基因顺序，其间带有几个克隆位点，若在中间插入外源基因，即可造成TK基因的失活，而可用作重组病毒的选择标记。另外还带有氨苄青霉素（AP^r）耐药标记，可作为大肠杆菌中组建克隆时的重组子选择标记。将用BamHI切下的融合基因插在pGJP-5质粒的BamHI位点上，得重组质粒pGJPSA-28（见图2B）。

4.含S与preS1（21-47）基因融合与低毒痘苗病毒天坛株的重组及痘苗病毒的筛选。

我们选用已知的低毒痘苗病毒株，天坛株（Vaccinia Virus Tian Tan），由中华人民共和国卫生部北京生物制品所获得。其特点是，由此产生的重组痘苗病毒用作活疫苗时，其毒性低，这已为长期的临床实践所证明。

将重组痘苗表达质粒pGJPSA-28从菌种CCTCC NO：93074中取出，按下述实施例的具体叙述制备方法获得的质粒DNA和天坛痘苗病毒引入CV-1细胞，由于表达质粒上的TK基因与痘苗TK基因具有同源顺序和彼此的亲和力，因而有可能同源交换，而发生体内重组，也即将表达质粒上失活的TK基因所包含的痘苗启动子p7.5和相连的乙肝表面抗原S与preS1（21-47）的融合基因重组到痘苗病毒基因组中去，再通过对TK^-的多次选择，即可得纯化的重组痘苗病毒vSA-28（见图2B）。

5.重组痘苗病毒的增殖和带有preS1乙肝表面抗原的表达。

经过筛选的重组痘苗病毒vSA-28，并通过Southern杂交和产物的分析验证后，感染Vero，CV-1或者CEC细胞，即可进行病毒的增殖，以大量获得重组痘苗病毒。重组痘苗病毒感染细胞后能表达并分泌具有S和preS1双重免疫原性的融合的乙肝表面抗原颗粒，可用于生产高效和新型基因工程乙肝疫苗。vSA-28也可用作活疫苗使用。

本发明的内容在以下实施例的具体叙述：

材料和方法：

a.基因重组所用限制酶，连接酶，Klenow聚合酶，SmaI接头，皆为Boehringer产品;

细胞培养基，DMEM/HG高葡萄糖培液，胎牛血清（FCS），无甲硫氨酸培液（RPM1-1640，Met-Free），无甲硫氨酸胎牛血清（Met-Free，FCS）皆为GIBCO产品;

5-溴脱氧尿苷（BUdR）为FLUKA产品;

³⁵S-标记甲硫氨酸（L-³⁵S-Met）为Amersham产品;

PCR用试剂盒和Tag  DNA聚合酶为Biolabs产品;

b.所用胸腺嘧啶核苷激酶（TK）基因缺陷型细胞Human Tk^-143细胞，在含25μg/ml BUdR和5%胎牛血清的DMEM培养基中培养。痘苗病毒天坛株（Vaccinia Virus Tian Tan）由卫生部北京生物制品所提供。原代鸡胚细胞（CEC），用10日令鸡胚制备在10%小牛血清的DMEM中培养。CV-1细胞由德国马普生化所提供，Vero细胞由上海医科大学闻玉梅教授提供。

c.细胞的转染。CV-1细胞，经痘苗病毒天坛株感染两小时后，用磷酸钙共沉淀的DNA（含10μg质粒和10μg鱼精DNA）转染，37℃培养5小时后，吸去转染液，加入新鲜培液，继续培养48小时后收获细胞。

d.质粒DNA的制备。用碱变性法，经Sepharose 2B纯化。

e.质粒的重组和细菌转化。参照Sambrook，J.等人“分子克隆”书上的方法进行，所用受体菌为TG-1或JM105。

f.重组痘苗病毒的筛选和病毒DNA抽提。痘苗病毒DNA制备参见文献（Espostto，J.等，J.Virol.Meth 1980，2，175）方法进行。TK^-重组病毒按照Weir等的方法（Weir，J.P.等，Proc.Natl.Acd.Sci.USA1982，79，1210），在BUdR存在下，选择空斑并进行分析鉴定。

g.HBsAg和preS1的测定。HBsAg的测定用AUSRIA药盒（Abbott公司产品）或北京生物制品所乙肝表面抗原放免检测药盒。preS1抗原的测定，采用Organon Teknika公司检测药盒，或由本所张祖传组提供的ELISA检测试剂进行。分泌至培养液中的抗原，可直接用培液测定或细胞内的抗原经PBS悬浮后，用干冰冻融四次，离心后的上清液为冻融细胞液样品，也可用细胞的裂解液样品进行测定（参见方法Ⅰ项）。所用抗preS1单抗（MA18/7）由联邦德国W.H.Gerlich博士所赠。

h.表达产物的蛋白电泳分析。采用SDS聚丙烯酰胺电泳参照Laemmli法进行（Laemmli，U.K.等  Nature，1970，227.680）。

i.表达产物的³⁵S-甲硫氨酸标记及免疫沉淀。取磷酸钙沉淀法转染后20小时的细胞，去培液，用无甲硫氨酸培液洗涤后，在无甲硫氨酸FCS和无甲硫氨酸培液中，培养1小时，再经无甲硫氨酸培液洗涤后，加入50-80uci³⁵S-标记的甲硫氨酸培养3小时，然后换成DMEM/HG培液过夜。收集标记的细胞，经预冷的PBS洗涤二次后悬于0.8mlHypotonic缓冲液，再加入0.2ml 5×lysis缓冲液，振摇，离心后上清-20℃保存备用为细胞裂解液。

标记的细胞裂解液或细胞培液，分别加入S抗体或抗preS1抗体，混匀，0℃30分钟后，离心弃上清。沉淀用RIPA缓冲液洗三次，悬于上样缓冲液，100℃4分钟，离心收集上清，进行电泳分析。电泳胶抽干后，压片自显影。

j.ECL非放射性标记检测试剂和标记操作方法，详细参见Amersham公司提供的操作步骤。

下面分步描述实施的具体步骤：

实施例1，含肝细胞结合位点的preS1（21-47）抗原决定簇基因的合成和克隆。

我们选定含肝细胞结合位点的preS1抗原决定簇，氨基酸序号第21-47位。用含有preS1的重组质粒DNA作为模板（pUC/LS-1），采用PCR法扩增了含有第21-47位的preS1的DNA片段，所用5’端引物为：

5'CTTTCTGTTCCC AGGCCTCTGGG 3'

              StuI

共长23个核苷酸，其中划线部分为设计引入的一个StuⅠ酶切点顺序。3’端引物为：5' CTGGCCAGTGAT CTCTAGAGGGTTGAAG 3'

                               XbaI

共长29个核苷酸，其中划线部分为设计引入的一个XbaⅠ切点顺序。PCR反应体系参见Biolabs方法。PCR扩增的片段用StuI和XbaI双酶解后，插入到质粒pWR13的StuI和XbaI位置上，得含preS1（21-47）的重组克隆pWR/PS1，preS1（21-47）经DNA顺序测定验证（见图1）。

实施例2，preS1（21-47）与S基因融合克隆pUC/SA-28的组建。

为实现preS1（21-47）片段与S抗原羧端的融合，我们首先将含preS1（21-47）基因片段的质粒（pWR/PS1），用XbaI酶解，再用大片段聚合酶将其补平后连接，造成一个终止码TAG，同时也使XbaI切点丢失。另外为保持由S基因到preS1（21-47）片段阅读框架正确无误，我们在preS1（21-47）上StuI酶切点处经StuI酶解后，加上10个核苷酸SmaI接头得pUC/10preS1（21-47）TAG。

选定S基因对应氨基酸序号第223处AccI切点为preS1（21-47）片段的融合点。将带有S基因的重组质粒pWR/HBS-4△SalI，先将AccI酶切打开，再经大片段酶补齐。再将3’端补平的S基因用SacI酶切下，插在pUC/10 preS1（21-47）TAG的SacI和SmaI双酶解的位点上，产生pUC/SA-28，经顺序测定，验证S基因与preS1（21-47）融合处框架正确，并在preS1（21-47）羧端含有终止码后，再构建含融合基因的重组痘苗表达质粒（见图2A）。

实施例3，含S基因与preS1（21-47）基因融合的重组痘苗表达质粒pGJPSA-28的构建。

重组质粒pUC/SA-28，经BamHI酶解后完整地分出含有S基因与preS1（21-47）融合的DNA片段，直接插入经BamHI酶切的重组痘苗表达质粒pGJP-5，得重组质粒pGJPSA-28，经BamHI回切，得长约0.78Kb的融合基因。这样该重组质粒的上游依次为TK基因，痘苗启动子p7.5，ATGS（1-223）+Val，Trp，Gly+preS1（21-47）+Ser，Ser+TAG，质粒多用酶切点，TK基因。重组质粒pGJPSA-28还有AP^r耐药标记，可在大肠杆菌中转化（如TG-1），选择和扩增，以制备重组质粒DNA（见图2B）。含重组质粒pGJPSA-28的大肠杆菌Escherichia coli TG-1/pGJPSA-28保存于编号为CCTCC NO：93074。

实施例4，含有S和preS1（21-47）基因融合的重组痘苗病毒的筛选和vSA-28的鉴定。

重组的痘苗是通过重组痘苗表达质粒pGJPSA-28和天坛株病毒在CV-1细胞体内发生重组而产生。再通过感染TK^-143细胞，在BUdR存在下，选择重组痘苗空斑。由于表达质粒TK基因中插有p7.5启动子和融合基因，TK已失去活性，即TK^-，在发生体内重组后，重组痘苗病毒也是TK^-的，也即BUdR存在下，只有重组的TK^-才能存活下来，经过两次空斑纯化，并经HBsAg和preS1抗原表达的测定为阳性后，选择得到重组的痘苗病毒vSA-28。

对重组痘苗病毒vSA-28在DNA水平上进行了Southern blot鉴定。

制备vSA-28 DNA，以天坛株痘苗病毒DNA和融合基因的表达质粒pGJPSA-28  DNA为对照，都经BamHI酶解电泳后，再转移至硝酸纤维素膜上，用S基因为探针进行杂交，结果由图3所示。已知重组表达质粒pGJPSA-28，BamHI酶解片段包含有完整的S和preS1融合基因长约0.78Kb，而重组痘苗vSA-28 DNA，BamHI酶解的片段中能与S基因杂交的也是0.78Kb的片段，天坛株对照则呈阴性，这表明，融合基因已正确的插在重组痘苗病毒DNA中。

实施例5，重组痘苗病毒vSA-28表达产物具有S和preS1双重抗原性的鉴定。

我们用³⁵S-甲硫氨酸标记vSA-28感染20小时后的CV-1细胞，追踪20小时后收集1ml细胞裂解液和3ml培液，取100μl细胞裂解液和300μl培液，用免抗S血清沉淀后电泳，用vTH-2（仅含S主蛋白的重组痘苗病毒）感染的CV-1细胞和未经感染的CV-1细胞作对照。由图4A可见，在vTH-2中有特异的24KD沉淀带和糖苷化的27KD带，而在vSA-28中也有能和S抗体特异沉淀的27KD和糖苷化的29KD条带，同样在培液中也有能被S抗体结合的条带，但被糖苷化的比细胞内的略大，这可能是在分泌过程中，糖苷化的程度增加的原故。

另外，表达产物用抗preS1（29-36）单抗MA18/7，进行免疫沉淀后电泳，结果见图4B，由于vTH-2只表达S抗原，因而不能与单抗MA18/7特异结合而沉淀。而在vSA-28表达产物中无论在培液和细胞内，用preS1（29-36）单抗MA18/7都有特异的条带24KD和29KD出现，结果与图4A中用S抗血清结合沉淀的条带大小一致。这表明vSA-28的表达产物既能被抗S抗体所识别又能被抗preS1抗血清所识别，即vSA-28的表达产物SA-28蛋白，同时具有S抗原和preS1抗原的双重抗原性。

实施例6，vSA-28表达产物SA-28蛋白的分泌性。

由脉冲标记追踪--免疫沉淀的实验结果看出，在培液中可检测到SA-28蛋白存在，这表明产物具有分泌性。

我们进一步测定了SA-28蛋白在不同细胞CV-1，Vero和CEC中的分泌情况。在感染Vero和CEC细胞后96小时取样，分别测定培液和细胞裂解液中的S抗原量为指标的SA-28量，结果见图5。与vTH-2相似，vSA-28在CV-1中分泌表达较差，在Vero细胞和CEC细胞表达和分泌水平较高，尤以Vero细胞最好，SA-28与vTH-2相比表达S抗原的水平和分泌性非常相似。在培养液和细胞裂解液中检测到的抗原量接近相当，这表明大约有占总共S抗原的一半是分泌到培液中的。

用ELISA方法检测preS1的结果与S抗原的结果是一致的（数据未列）。

实施例7，重组痘苗病毒vSA-28表达的SA-28蛋白颗粒性的分析。

我们用vTH-2和vSA-28分别感染Vero细胞，96小时后培液中表达的S抗原和融合的SA-28的S抗原经氯化铯密度梯度离心后进行了测定。在vTH-2和vSA-28培液中，可找到密度分别为1.20g/ml和1.23g/ml的S抗原放免测定阳性峰（见图6B），在除去氯化铯，再经浓缩和负染后，在电镜下可见直径约为25（μm）的SA-28颗粒（见图6A）。融合蛋白的颗粒与S抗原颗粒在密度和大小上没有十分明显的区别。

实施例8，vSA-28表达的SA-28的免疫原性分析

我们将vSA-28感染CV-1细胞48小时的培液，离心去痘苗后，经过疏水介质JL-QT6S-C4（A）柱层析和Sepharose 4B柱纯化，收集S抗原活性峰，得到部分纯化的SA-28蛋白。免疫Balb/C小鼠，取1.9μg SA-28蛋白以氢氧化铝为佐剂，经同样方法纯化的HBsAg3.2μg为对照，每组小鼠6-7只腹腔注射，21天后同样量加强，在第21天和第49天，即加强后的第28天，采血测定抗S抗体和抗preS1抗体含量，结果见图7。SA-28免疫Balb/C小鼠有良好的免疫原性，无论是在一次免疫或两次免疫以后，SA-28样品与用标准疫苗相比，产生抗S抗体几乎处在同一水平上。

在一次免疫以后，即有较高水平的抗preS1抗体产生，这提示抗preS1抗体可能早于抗S抗体的产生。而在两次免疫后有更大幅度的提高，显示了SA-28也具有良好的preS1免疫原性。

我们的结果表明，与合成的多肽相比，我们发明的优点在于vSA-28表达的SA-28蛋白的颗粒性为SA-28良好的免疫原性，提供了基础。而SA-28颗粒良好的分泌性，为制备新型乙肝基因工程亚单位疫苗的分离纯化提供了有利条件。

已知抗preS1（21-47）抗体具有中和病毒的能力而具保护作用。因而SA-28抗原，发展成新型乙肝疫苗有可能具有以下优越性：

1.除产生抗S抗体外，还能产生抗preS1抗体。能在中和病毒和阻断病毒与肝细胞结合两个环节上起作用。因此能得到更彻底的保护。

2.能较早的高水平的产生抗preS1抗体，提供更早的保护作用。

3.临床上约有10%的人群对S抗原不能产生应答反应，应用SA-28产生抗preS1抗体阻断病毒粒子与肝细胞的结合，也有可能诱导产生抗S抗体从而达到保护作用。

4.慢性乙肝患者是在于T细胞水平上对S抗原无反应，但在体内preS1抗原在T细胞水平上的免疫反应要大大高于S抗原。因而有可能在高剂量的SA-28作用下使T细胞反应帮助产生preS1抗体和抗S抗体，以中和并清除病毒颗粒，达到治疗的目的。

Claims (4)

1、一种用基因重组技术完成的重组痘苗，即用于乙肝的预防和乙肝治疗的疫苗，其特征在于：

a.选定乙肝病毒adr亚型含有肝细胞结合位点的preS1/抗原决定簇，利用PCR技术，人工合成了preS1基因中对应氨基酸第21-47的核苷酸顺序，去除了可能影响S抗原分泌的氨端20个氨基酸，为了便于克隆，在此片段的5′端和3′端分别引入一个StrI和XbaI酶切点，PCR产物经上述双酸解后，克隆入PWR13质粒得PWR/PS1；

b.在乙肝表面抗原基因羧端对应的第223位与合成的preS1核苷酸片段相融合，获得了含有乙肝表面抗原S基因与preS1(21-47)的融合基因；

c.含preS1(21-47)与HBsAs223位融合基因的重组质粒为PUC/SA-28；

d.重组痘苗病毒使用的重组表达质粒pGJP-5和带有融合基因的重组表达质粒pGJPSA-28；

e.将该重组表达质粒pGJPSA-28转入大肠杆菌，存放标记为CCTCCNO∶M93074；

f.重组痘苗病毒所用表达质粒含有痘苗表达启动子P7.5和乙肝表面抗原基因3′端与带肝细胞结合位点的preS1抗原决定簇基因融合插在TK序列中，重组痘苗有TK^-特征；

g.重组痘苗病毒带有乙肝表面抗原基因与有肝细胞结合位点的preS1抗原决定簇融合基因，能稳定地产生具有分泌性的颗粒形式表达的融合蛋白SA-28，具有乙肝表面抗原和乙肝preS1抗原的双重抗原性质，能使动物产生高滴度的抗S抗体和抗preS1抗体等特点，因此可发展为新型的亚单位乙肝疫苗以及新型的活疫苗，能用于乙肝的预防和治疗。

2、根据权利要求1中所述的含有乙肝表面抗原S基因与preS1（21-47）的融合基因，其特征在于包括所用在乙肝表面抗原羧端第223位处（及其它位点）与其它任何抗原决定簇及外源基因的融合;

3、根据权利要求1中所述的重组痘苗病毒出发株其特征在于为低毒株，天坛株和广9株;

4、根据权利要求1中所述的基因融合，其特征在于在重组痘苗表达体系外的任何表达系统，包括哺乳动物体系、酵母体系、大肠杆菌体系、昆虫病毒体系等，包括表达株和表达产物。

Images