WO2012155819A1

WO2012155819A1 - Hbv特异性抗体

Info

Publication number: WO2012155819A1
Application number: PCT/CN2012/075440
Authority: WO
Inventors: 傅阳心; 刘晓娟
Original assignee: 苏州丁孚靶点生物技术有限公司
Priority date: 2011-05-17
Filing date: 2012-05-14
Publication date: 2012-11-22
Also published as: CN102786592A

Abstract

本发明提供了抗HBV的特异性高亲和力抗体、其抗原结合片段及所述抗体的组合。本发明提供了编码所述抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子。本发明还提供了包含所述抗体、其抗原结合片段或所述抗体组合的药物和/或诊断组合物，以及所述抗体或其抗原结合片段用于预防、治疗和/或诊断乙型肝炎病毒感染的用途和方法。

Description

HBV特异性抗体技术领域

本发明属于病毒感染的预防和 /或治疗领域，特别是对由病毒感染引起的疾病，例如肝炎的预防和 /或治疗。此外，本发明还涉及病毒抗原的特异性高亲和力抗体的制备及其应用。背景技术

乙型肝炎病毒（HBV)是引起慢性人类感染的病毒。估计全球约有超过 4亿人口患有肝炎。 HBV具有抗原乙型肝炎表面抗原（ HBsAg )、 PreSl 和 PreS?^ 在中国，最近的研究表明，对于年龄为 1-59岁的中国人群而言， HBsAg、抗 HBsAg和抗乙型肝炎核心（ HBc ) 的加权出现率分别为 7. 1%、 50. 1%和 34. \ 考虑到 HBsAg测定的较低的灵敏度，出现了高比率的抗 HBc暗示着实际被感染的人数可能比最初的预计更高。在中国，最常见的 HBV亚型是 adr和 adw 。虽然最近在大多数国家均引进了针对 HBV普遍适用的疫苗，持续的 HBV感染仍然是全球性的普遍问题。还需要 10-20年才能观察到由疫苗带来的发病率和致死率的减少。目前的疫苗对于已被感染的患者没有明显的效果。此外，用于治疗的干扰素（ IFN )和拉米夫定（Lamivud ine )仅有有限的和暂时的效果并且将需要长时间的治疗 ^⁵。

从供体血清纯化得到的人抗体中含有针对 HBsAg的高滴度中和抗体，其通常在感染前或感染后不久被用于中和患者中的 HBV。然而，高花费、不精确的收集和制备阻止了其广泛的全球化应用，特别是在贫穷国家中的应用。

所有的 HBV表面抗原蛋白均能诱导产生 HBV的中和抗体。乙型肝炎免疫球蛋白（HBIg)已被用于乙型肝炎的预防。施用 HBIg能够保护新生儿使之不被感染了 HBV的母亲传染，还能够在被感染的接受者中使得新移植的肝脏不产生由 HBV引起的肝炎 ⁵。虽然 HBIg和 HBV的单克隆抗体均能够有效地中和 HBV，但是使用 HBIg有许多问题：例如供应不足，低的特异性活性，未知抗原的潜在污染等。此外，制备 HBIg 必然要和其他血制品的生产相竟争，而血液的供给是有限的。人们已经开发了抗 HBV的小鼠单克隆抗体。虽然小鼠单克隆抗体显示出对于抗原的高亲和力和高滴度，并且能够被大规模生产，但是它们很容易在患者中引起人抗小鼠的抗体应答。遗传工程和蛋白质表达技术方面的进展引起了单克隆抗体的进一步发展，所述单克隆抗体主要由人的氨基酸序列组成（例如鼠 /人嵌合的，或 "人源化" 的）或者完全由人的氨基酸序列组成（例如 "全人" 的单克隆抗体） ⁶。已开发了人源化的抗体，但是其还是会在某种程度上引起不需要的免疫和过敏反应，因而还是会限制它们的长期应用 ⁶。相比而言，全人抗体有着独特的优势。虽然已开发了针对美国和欧洲常见的 ayw亚型 HBsAg的全人单克隆抗体，还没有艮好地确定针对在中国常见的 HBV病毒株 (adr和 adw 亚型）的全人中和抗体。因此，亟需开发有效的针对 HBV的 adr和 /或 adw亚型的抗体。发明内容

为了开发出针对 adr和 /或 adw亚型的 HBsAg的高特异性抗体，发明人歸选了酵母表面展示单链抗体（ scFv )文库，从而歸选出了对 adr 和 adw亚型的 HBsAg是特异性的 scFv。此外，通过进一步的诱变，发明人歸选出了亲和力更高且表达更加稳定的特异性 scFv。

发明人克隆了所选择的高亲和性 scFv并将其与 hlgGlFc (人 IgGl 恒定区片段）融合以在哺乳动物细胞中以高产率生产 scFv-hlgGlFc 抗体。所述人 scFv-hlgGlFc抗体针对 adw和 /或 adr亚型的 HBsAg的高亲和力和高滴度比从普通供体收集的多克隆抗体效力更大（有高得多的滴度和亲和力）。此外，所述抗体还将解决数个与 HBIg相关的问题，例如供应短缺、贵的制备过程、未知材料（包括潜在抗原）的潜在污染等。

在具体的实施方式中，本发明涉及对于 HBV表面抗原（HBsAg)特异性地具有高亲和力的人抗体。特别地，所述抗体可以为全人抗体，当施用于人宿主时，与嵌合抗体或人源化抗体相比，所述全人抗体将具有较低的免疫原性。在一方面，本发明的抗体可以是通过遗传工程制备的，因此相比于 HBIg或人类血产品，其将避免含有潜在的人病原体。此外，本发明的抗体特别靶向中国常见的 HBV亚型（adw和 adr亚型）并且在具体的实施方式中，可以以互补的方式结合不同的表位。因此本发明涉及产生各种全人抗体或其组合，这将允许个性化的治疗，无论是作为单一的疗法还是通过利用各种抗体进行组合治疗都将有利于乙型肝炎病毒感染的治疗。

因此，大量生产本发明的抗体将为人类患者提供更便宜和更稳定的中和性抗体，并且伴有更高的亲和性、更低的毒性和 /或变态反应原性。所述抗体可以被广泛有效地应用，例如可用于针对新生儿和器官 (特别是肝脏）移植而中和病毒。被 HBV感染的患者有时候在其血清中具有高水平的 HBsAg , 这将导致免疫耐受性。本发明的高亲和性抗体将被用于减少病毒负荷和清除外周中的 HBV抗原。因此，本发明的高亲和性抗体还可用于与其他抗病毒物质联合使用，以破坏 T细胞耐受性并在宿主中产生强的免疫应答。

此外，由于单一的单克隆抗体处理可能不足以完全有效地控制病毒，并可能潜在地选择抗体耐受性病毒突变体。为了减少抗体耐受性克隆，可以联合使用多个抗体。发明人发现，本发明的抗体 scFvC-hlgGlFc将不会阻碍 HBsAg( adw亚型的）与酵母 -scFvD( 2D-115 ) 的结合，这表明 scFvC (wt)和 scFvD (2D-115)分别结合 HBsAg的不同位点（图 3 ) 。因此，抗 HBsAg的多种（例如 2种、 3种、 4种等）抗体的组合（以混合物的形式或者以汉特异性抗体的形式）将在很大程度上防止病况的复发。

为了进一步测试本发明的抗体是否可以预防病毒与肝细胞的结合，发明人测试并比较了分别通过本发明的抗体和 HBIg来中和 HBsAg 与 Chang肝细胞的结合。本发明的抗体阻碍了 HBsAg与 Chang肝细胞的结合，而量高得多的 HBIg却不能阻碍所述结合。

因此本发明提供了抗 HBV的特异性高亲和力抗体、其抗原结合片段及所述抗体的组合。本发明提供了编码所述抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子。本发明还提供了包含所述抗体、其抗原结合片段或所述抗体组合的药物和 /或诊断组合物，以及所述抗体或其抗原结合片段用于预防、治疗和 /或诊断乙型肝炎病毒感染的用途和方法。

在一个方面，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体特异性地结合 adw和 /或 adr亚型的 HBsAg并且具有下述特征中的至少一个：

(a)结合 adw和 /或 adr亚型的 HBsAg的 K_D值为 1 χ 1 (Γ⁹ Μ以下；

(b)阻碍 adw和 /或 adr亚型的 HBsAg与肝细胞的结合；

(c)与 adw和 /或 adr亚型的 HBsAg结合的亲和力高于人多克隆抗体 HBIg与相应的 adw和 /或 adr亚型的 HBsAg结合的亲和力。

在具体的实施方式中，本发明的所述抗体可以是单克隆抗体，例如全人单克隆抗体。

在具体的实施方式中，本发明的所述抗体结合 adw和 /或 adr亚型的 HBsAg的 K_D值可以为 6 X 1 (Γ⁹ M以下，例如 5 χ 10^_9 Μ以下、 4 χ 10^_9 Μ以下、 3 X 10"⁹ Μ以下。

在又一具体实施方式中，本发明的所述抗体具有下述特征中的至少一个：

(a)其重链可变区包含选自 SEQ ID NO: 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21、 23和 25中任一项所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID N0: 9、 11、 13、

15、 17、 19、 21、 23和 25 中任一项所示的氨基酸序列组成，或包含抗体 s cFvC的重链可变区序列，或者由抗体 scFvC的重链可变区序列组成，其中所述抗体 scFvC由 SEQ ID NO: 1所示的核酸序列编码；

(b)其轻链可变区包含 SEQ ID NO: 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24和 26中任一项所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID NO: 10、 12、 14、

16、 18、 20、 22、 24和 26 中任一项所示的氨基酸序列组成，或包含抗体 s cFvC的轻链可变区序列，或者由抗体 scFvC的轻链可变区序列组成，其中所述抗体 scFvC由 SEQ ID NO: 1所示的核酸序列编码；

(c)其重链可变区中的 CDR1 : 包含选自 SEQ ID N0: 3、 27、 33、 39、 45、 51、 57、 63、 69和 75中任一项所示的氨基酸序列；和 /或其重链可变区中的 CDR2包含选自 SEQ ID NO: 4、 28、 34、 40、 46、 52、 58、 64、 70和 76中任一项所示的氨基酸序列；和 /或其重链可变区中的 CDR3 包含选自 SEQ ID NO: 5、 29、 35、 41、 47、 53、 59、 65、 71和 77 中任一项所示的氨基酸序列；或所述 CDR1 - 3分别由上述氨基酸序列中的任一项组成；或者重链可变区中的 CDR1 - 3分别包含抗体 scFvC的重链可变区 CDR1-3 , 或者分别由抗体 scFvC的重链可变区 CDR1-3组成，其中所述抗体 s cFvC由 SEQ ID NO: 1所示的核酸序列编码；

(d)其轻链可变区中的 CDR1包含 SEQ ID NO: 6、 30、 36、 42、 48、 54、 60、 66、 72和 78中任一项所示的氨基酸序列；和 /或其轻链可变区中的 CDR2 包含 SEQ ID NO: 7、 31、 37、 43、 49、 55、 61、 67、 73 和 79中任一项所示的氨基酸序列；和 /或其轻链可变区中的 CDR3包含 SEQ ID NO: 8、 32、 38、 44、 50、 56、 62、 68、 74和 80中任一项所示的氨基酸序列；或所述 CDR1 - 3分别由上述氨基酸序列中的任一项组成；或者轻链可变区中的 CDR1 - 3分别包含抗体 scFvC的轻链可变区 CDR1-3 ,或者分别由抗体 scFvC的轻链可变区 CDR1-3组成，其中所述抗体 scFvC由 SEQ ID NO: 1所示的核酸序列编码；

(e)其可变区序列包含 SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 2中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列，或者由 SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 2中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明的所述抗体的重链可变区 CDR1-3 可以分别包含 SEQ ID NO: 3-5中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 3-5中所示的氨基酸序列组成。

此外，本发明所述抗体的轻链可变区 CDR1-3可以分别包含 SEQ ID NO: 6-8中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 6-8中所示的氨基酸序列组成；和 /或其重链可变区 CDR1-3可以分别包含 SEQ ID NO: 3-5 中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 3-5中所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明所述抗体的重链可变区可以包含 SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明所述抗体的轻链可变区可以包含 SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列或者由 SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列组成；和 /或其重链可变区可以包含 SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明的所述抗体的重链可变区 CDR1-3 可以分别包含 SEQ ID NO: 27-29 中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 27-29中所示的氨基酸序列组成。

此外，本发明所述抗体的轻链可变区 CDR1-3可以分别包含 SEQ ID NO: 30 - 32中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 30 - 32中所示的氨基酸序列组成；和 /或其重链可变区 CDR1-3可以分别包含 SEQ ID NO: 27 - 29中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 27 - 29中所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明所述抗体的重链可变区可以包含 SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明所述抗体的轻链可变区可以包含 SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列或者由 SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列组成；和 /或其重链可变区可以包含 SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明的所述抗体的重链可变区 CDR1-3 可以分别包含 SEQ ID NO: 33-35 中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 33-35中所示的氨基酸序列组成。

此外，本发明所述抗体的轻链可变区 CDR1-3可以分别包含 SEQ ID NO: 36 - 38中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 36 - 38中所示的氨基酸序列组成；和 /或其重链可变区 CDR1-3可以分别包含 SEQ ID NO: 33 - 35中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 33 - 35中所示的氨基酸序列组成。在具体的实施方式中，本发明所述抗体的重链可变区可以包含

SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明所述抗体的轻链可变区可以包含 SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列或者由 SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列组成；和 /或其重链可变区可以包含 SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明的所述抗体的重链可变区 CDR1-3 可以分别包含 SEQ ID NO: 39-41 中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 39-41中所示的氨基酸序列组成。

此外，本发明所述抗体的轻链可变区 CDR1-3可以分别包含 SEQ ID NO: 42 - 44中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 42 - 44中所示的氨基酸序列组成；和 /或其重链可变区 CDR1-3可以分别包含 SEQ ID NO: 39 - 41中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 39 - 41中所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明所述抗体的重链可变区可以包含 SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明所述抗体的轻链可变区可以包含 SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列或者由 SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列组成；和 /或其重链可变区可以包含 SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明的所述抗体的重链可变区 CDR1-3 可以分别包含 SEQ ID NO: 45-47 中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 45-47中所示的氨基酸序列组成。

此外，本发明所述抗体的轻链可变区 CDR1-3可以分别包含 SEQ ID NO: 48 - 50中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 48 - 50中所示的氨基酸序列组成；和 /或其重链可变区 CDR1-3可以分别包含 SEQ ID NO: 45 - 47中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 45 - 47中所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明所述抗体的重链可变区可以包含

SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明所述抗体的轻链可变区可以包含 SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列或者由 SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列组成；和 /或其重链可变区可以包含 SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明的所述抗体的重链可变区 CDR1-3 可以分别包含 SEQ ID NO: 51 - 53中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 51 - 53中所示的氨基酸序列组成。

此外，本发明所述抗体的轻链可变区 CDR1-3可以分别包含 SEQ ID NO: 54 - 56中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 54 - 56中所示的氨基酸序列组成；和 /或其重链可变区 CDR1-3可以分别包含 SEQ ID NO: 51 - 53中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 51 - 53中所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明所述抗体的重链可变区可以包含 SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明所述抗体的轻链可变区可以包含 SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列或者由 SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列组成；和 /或其重链可变区可以包含 SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明的所述抗体的重链可变区 CDR1-3 可以分别包含 SEQ ID NO: 57-59 中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 57-59中所示的氨基酸序列组成。

此外，本发明所述抗体的轻链可变区 CDR1-3可以分别包含 SEQ ID NO: 60 - 62中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 60 - 62中所示的氨基酸序列组成；和 /或其重链可变区 CDR1-3可以分别包含 SEQ ID NO: 57 - 59中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 57 - 59中所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明所述抗体的重链可变区可以包含 SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明所述抗体的轻链可变区可以包含 SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列或者由 SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列组成；和 /或其重链可变区可以包含 SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明的所述抗体的重链可变区 CDR1-3 可以分别包含 SEQ ID NO: 63-65 中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 63-65中所示的氨基酸序列组成。

此外，本发明所述抗体的轻链可变区 CDR1-3可以分别包含 SEQ ID NO: 66 - 68中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 66 - 68中所示的氨基酸序列组成；和 /或其重链可变区 CDR1-3可以分别包含 SEQ ID NO: 63 - 65中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 63 - 65中所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明所述抗体的重链可变区可以包含 SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明所述抗体的轻链可变区可以包含 SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列或者由 SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列组成；和 /或其重链可变区可以包含 SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明的所述抗体的重链可变区 CDR1-3 可以分别包含 SEQ ID NO: 69-71 中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 69-71中所示的氨基酸序列组成。

此外，本发明所述抗体的轻链可变区 CDR1-3可以分别包含 SEQ ID NO: 72 - 74中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 72 - 74中所示的氨基酸序列组成；和 /或其重链可变区 CDR1-3可以分别包含 SEQ ID NO: 69 - 71中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 69 - 71中所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明所述抗体的重链可变区可以包含 SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明所述抗体的轻链可变区可以包含 SEQ ID NO: 26所示的氨基酸序列或者由 SEQ ID NO: 26所示的氨基酸序列组成；和 /或其重链可变区可以包含 SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，本发明的所述抗体的重链可变区 CDR1-3 可以分别包含 SEQ ID NO: 75-77 中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 75-77中所示的氨基酸序列组成。

此外，本发明所述抗体的轻链可变区 CDR1-3可以分别包含 SEQ ID NO: 78 - 80中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 78 - 80中所示的氨基酸序列组成；和 /或其重链可变区 CDR1-3可以分别包含 SEQ ID NO: 75 - 77中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 75 - 77中所示的氨基酸序列组成。在另外的实施方式中，本发明所述抗体的可变区序列可以包含 SEQ ID NO: 2中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列，或者由 SEQ ID NO: 2中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列组成，例如抗体 scFvD (2D-115)或抗体 scFvD-hIgGlFc₀

在一个具体实施方式中，本发明所述抗体的重链可变区 CDR1-3 可以分别包含抗体 scFvC的重链可变区 CDR1-3 ,或者分别由抗体 scFvC 的重链可变区 CDR1-3组成，其中所述抗体 scFvC由 SEQ ID NO: 1所示的核酸序列编码。

在另外的实施方式中，本发明所述抗体的轻链可变区 CDR1-3可以分别包含抗体 scFvC的轻链可变区 CDR1-3 ,或者分别由抗体 scFvC的轻链可变区 CDR1-3组成，其中所述抗体 scFvC由 SEQ ID NO: 1所示的核酸序列编码；和 /或其重链可变区 CDR1-3 可以分别包含所述抗体 scFvC的重链可变区 CDR1-3, 或者分别由所述抗体 scFvC的重链可变区 CDR1-3组成。

在一个具体实施方式中，本发明所述抗体的重链可变区包含抗体 scFvC的重链可变区序列，或者由抗体 scFvC的重链可变区序列组成，其中所述抗体 scFvC由 SEQ ID NO: 1所示的核酸序列编码。

此外，在另外的实施方式中，本发明所述抗体的轻链可变区可以包含抗体 _{s c}FvC的轻链可变区序列，或者由抗体 scFvC的轻链可变区序列组成，其中所述抗体 scFvC由 SEQ ID NO: 1所示的核酸序列编码；和 /或其重链可变区包含所述抗体 scFvC的重链可变区序列，或者由所述抗体 scFvC的重链可变区序列组成。

在具体的实施方式中，本发明所述抗体的可变区序列可以包含 SEQ ID NO: 1中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列，或者由 SEQ ID NO: 1中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列组成，例如抗体 scFvC (wt) 或抗体 scFvC-hIgGlFc₀

在特别的实施方式中，本发明所述的抗体为单克隆抗体，例如全人单克隆抗体。在具体的实施方式中，本发明所述的抗体包含恒定区，所述恒定区可以是例如 hIgGlFc。

在另外的方面，本发明还涉及下列抗体或其抗原结合片段，其与上文中所述的本发明的抗体竟争结合 adw或 adr亚型的 HBsAg。

在又一个方面，本发明涉及组合物（例如抗体组合物），其包含至少两种不同的抗体或抗原结合片段，所述至少两种不同的抗体或抗原结合片段结合不完全相同的目标抗原表位或者以彼此不互相竟争的方式结合目标抗原，并且彼此独立地选自上文中所述的本发明的抗体；相结合的方式存在，例如以抗体混合物或者多特异性抗体（例如汉特异性抗体）的形式存在。

在一个具体的实施方式中，所述组合物含有：

(a)第一种抗体，其可变区序列包含 SEQ ID NO: 1中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列，或者由 SEQ ID NO: 1中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列组成，例如抗体 scFvC (wt)或抗体 scFvC-hlgGlFc; 和 (b)第二种抗体，其可变区序列包含 SEQ ID NO: 2中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列，或者由 SEQ ID NO: 2中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列组成，例如抗体 scFvD (2D-115) 或抗体 scFvD - hIgGlFc。

在具体的实施方式中，所述组合物包含抗体 scFvC-hlgGlFc和抗体 scFvD - hIgGlFc。

在另外的方面，本发明涉及分离的核酸分子，其编码前述的任一本发明的抗体或抗原结合片段。

此外，本发明还涉及核酸载体，其包含所述本发明的分离的核酸分子。

本发明也涉及宿主细胞，其包含上述本发明的核酸载体。

在另外的方面，本发明涉及药物和 /或诊断组合物，其包含本发明所述的抗体或抗原结合片段、本发明所述的组合物或本发明所述的分离的核酸分子，以及任选地药学上可接受的载体。

在具体的实施方式中，所述药物和 /或诊断组合物可以进一步包含其他有效治疗成分，例如其他抗病毒成分（例如拉夫米定、干扰素等）、细胞毒素、放射性同位素等。

在具体的实施方式中，本发明的药物和 /或诊断组合物还可以进一步包含用于诊断的标记物，所述标记物可以是例如放射性同位素（例如碘 125 ) 、酶、酶的底物、发光物质（例如异鲁米诺和吖啶酯）、荧光物质（例如荧光素和罗丹明）、生物素或有色物质（例如乳胶颗粒和胶体金）等。

在另外的方面，本发明还涉及任一本发明所述的抗体、任一本发明所述的组合物或任一本发明所述的分离的核酸分子用于制备药物的用途，所述药物用于预防和 /或治疗由乙型肝炎病毒引起的感染，例如所述乙型肝炎病毒包含 adw或 adr亚型的 HBsAg。在具体的实施方式中，所述药物用于阻碍 adw和 /或 adr亚型的 HBsAg与肝细胞的结合。

在又一个方面，本发明涉及任一本发明所述的抗体、任一本发明所述的组合物或任一本发明所述的分离的核酸分子用于制备诊断剂的用途，所述诊断剂用于诊断乙型肝炎病毒感染，例如所述乙型肝炎病毒包含 adw或 adr亚型的 HBsAg。

在另外的方面，本发明涉及一种预防和 /或治疗乙型肝炎病毒感染的方法，所述方法包括下列步骤：向有需要的受试者施用预防和 /或治疗有效量的本发明所述的抗体、本发明所述的组合物、本发明所述的分离的核酸分子或本发明所述的药物组合物。

在另外的方面，本发明涉及诊断乙型肝炎病毒感染的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)使待测样品与本发明所述的抗体、本发明所述的组合物、或本发明所述的诊断组合物相接触；

(b)检测所述抗体、组合物、或诊断组合物是否与 HBs Ag发生反应，以判断样品中是否存在 HBsAg。

特别地，所述 HBsAg可以为 adw或 adr亚型的 HBsAg。

此外，本发明也涉及上述各种具体实施方式的任意组合。附图说明

图 1.经过酵母表面展示系统筛选后，抗 HBsAg抗体的增加的表达和亲和力。从非免疫人 s cFv文库中筛选并分离出抗 HBsAg的人 s cFvD ( D-WT)。然后，进行了连续数轮的随机诱变和流式细胞术筛选以增加所得到的 s cFv的亲和力和表达稳定性。如图 1所示，所述 s cFv在酵母表面上的表达增加 4. 7倍并且在两轮诱变后，其对 HBsAg的亲和力增加了超过 32倍。其中， D-WT是一个酵母克隆，其表面展示分离自非免疫人 s cFv文库的、抗 HBsAg的人 scFvD (wt)。克隆 1D-66是在进行第一轮易错聚合酶链式反应之后，通过大量的分选和亚克隆而得到的表达特定 scFvD (lD-66)分子的酵母细胞克隆。克隆 2D-115是在进行第二轮易错聚合酶链式反应之后，通过大量的分选和亚克隆而得到的表达特定 scFvD (2D-115)分子的酵母细胞克隆，其中克隆 1D-66与克隆 2D-115均是基于前述所筛选出的 scFvD (wt)，通过易错 PCR而得到的酵母细胞克隆。

图 2.在酵母筛选之后，在体外实验中本发明的抗体增强的中和 HBV的能力。

图 3. scFvC (wt)和 scFvD (2D-115)结合 HBsAg的不同位点。

图 4.通过 scFvD-hlgGlFc来中和 HBsAg与 Chang肝细胞的结合。

HBsAg (adw或 adr亚型的）结合 Chang肝细胞，但是 scFvD-hlgGlFc会阻碍 HBsAg与 Chang肝细胞的结合。

图 5. scFvC-hlgGlFc会阻碍 HBsAg与 Chang肝细胞的结合。

图 6. scFvC-hlgGlFc与 HBsAg (血液)的结合效力和亲和力（图 6A ) 以及 scFvC-hlgGlFc与 HBsAg (adr)和 HBsAg (adw)的结合具有更高的亲和力（图 6B ) 。具体实施方式

抗体或其抗原结合片段

在本申请中，术语 "特异性结合" 是指两分子间的非随机结合反应，例如抗体或其抗原结合片段将不显示任何显著的与来自除了其特异性结合配偶体之外的其他分子的结合。

本发明所述的抗体意指任何能够特异性地结合 adw或 adr亚型的 HBsAg 的抗体，包括天然的、或者部分或全部合成产生的多肽或多肽片段。本发明所述的抗体还涵盖了包含抗体的抗原结合片段的任何多肽或蛋白质。包含抗原结合片段的抗体片段是诸如 Fab、 scFv、 Fv、 dAb、 Fd、双特异性抗体分子、或多特异性抗体分子等。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以是鼠源或人源或兔源或羊源或其它动物来源，或者可以是基因工程抗体，如人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体或单链抗体等。在一个具体的实施方式中，本发明所述的抗体是单克隆抗体，例如全人单克隆抗体。

本领域技术人员明了，可以采取单克隆抗体和其他抗体并使用重组 DNA技术来产生保留原始抗体的特异性的其他抗体或嵌合分子。例如，可以将编码免疫球蛋白可变区的 DNA与恒定区连接，或将抗体的互补性决定区（CDRs ) 引入不同免疫球蛋白的恒定区加框架区内。参见，例如 EP-A-184187 , GB 2188638A或 EP-A-239400等。另外，也可以对酵母细胞、杂交瘤或产生抗体的其他细胞实施基因突变或其他改变，其可以改变或不可以改变所产生的抗体的结合特异性。

因为可以以多种方式对抗体进行修饰，所以术语 "抗体" 应当被理解为涵盖任何特异性结合成员或物质，所述特异性结合成员或物质包含相应的抗原结合位点。因此，术语 "抗体" 也涵盖了抗体片段和衍生物，包括包含抗原结合片段的任何多肽，无论是天然的还是完全或部分合成的。因此，也包括了嵌合分子，其包含与另一种多肽融合的抗体的抗原结合片段或等价物。嵌合抗体的克隆和表达在 EP-A-0120694和 EP-A-0125023等文献中均有所描述。

因此，本发明所述抗体或者抗原结合片段也同样包含特定抗体或抗原结合片段的变体。所述变体保持了亲本抗体（或其抗原结合片段）的功能（例如，通过保守置换所述亲本中的氨基酸而产生）。特别地，所述变体与其亲本抗体或抗原结合片段是 "同源" 的，这意味着它们之间具有序列同一性或序列相似性。

如果两个多肽分子（例如本发明中的抗体或其抗原结合片段，或者其变体）中的氨基酸残基序列分别在如下描述进行比对获取最大对应性时是相同的，则这两种多肽称为是 "同一的" 。在两个或多个多肽序列的情况下，术语 "同一的" 或 "百分比一致性" 指在比较窗口比较和比对获取最大对应性时，为相同的或具有指定百分比的氨基酸残基的两个或多个序列或子序列，所述的最大对应性是用一种下列的序列比较算法或者通过手动比对和目测来测量。当序列一致性百分比用于指蛋白质或肽时，应该认识到，不同一的残基位置通常因为保守性氨基酸置换而不同，其中氨基酸残基置换成了具有相似化学性质（例如，电荷或疏水性）的其它氨基酸残基并因而没有改变该分子的功能性质。如果序列因保守置换而不同，则可以上调百分比序列一致性来校正取代的保守性性质。用于进行这种调整的方法是本领域那些技术人员熟知的。通常，这涉及将保守置换打分为部分错配而不是完全错配，从而增加了百分比序列一致性。因此，例如，如果同一的氨基酸的打分为 1，而非保守置换的打分为 0，则保守置换的打分在 0和 1 之间。保守置换的打分可才艮据（例如） Meyers & Miller 的算法

(Computer Applic. Biol. Sci. 4: 11-17 (1988) ) ，例如才艮据在程 Jf PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif. , USA)中实现的该算法来计算。

在两个多肽的情形中，短语 "相似的" 指利用其中一种下列的序列比较算法或者通过手动比对和目测测量，在比较窗口比对获取最大对应性时，具有至少 60%，优选 80%，最优选 90-95%的氨基酸残基一致性的序列或子序列。该定义也指测试序列的互补序列，所述的互补序列在所述测试序列与参考序列具有基本一致性时具有基本的序列互补性或子序列互补性。

对于序列比较，通常将一个序列用作测试序列与其比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入电脑中，指定子序列坐标，并且如果需要，指定序列算法程序参数。通常使用程序参数的默认值，但可以指定参数的备选值。然后基于程序参数，序列比较算法计算出测试序列相对参考序列的百分比序列一致性。

如本申请所使用的， "比较窗口" 包括对连续位置的片段，通常为 20-600，通常约 50至约 200，更常见约 100至约 150个连续位置的指代，在所述的连续位置中在两个序列经最佳比对后，一个序列可以与相同数量的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列的比对方法是本领域所熟知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过以下方法进行： Smith & Waterman ( Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981) ) 的局部同源性算法、 Needleman & Wunsch ( J. Mol. Biol. 48: 443 (1970) ) 的同源性比对算法、 Pearson & Lipman ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988) ) 的相似性搜索方法、这些算法的计算机实 i¾(GAP、BESTFIT、FASTA以及 Wiscons in Genet ics软件包中的 TFASTA

( Genetics Computer Groups 575 Science Dr. , Madison, Wis. ) ) 或手动比对和目测。本领域技术人员将理解，上述关于多肽变体的描述也同样适用于编码所述多肽或其变体的多核苷酸序列。

"经保守修饰的变体" 适用于氨基酸和核酸序列两者。对于特殊的核酸序列，经保守修饰的变体指编码相同的或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或者如果核酸不编码氨基酸序列，则指基本上同一的序列。由于遗传密码子的简并性，大量的功能相同的核酸编码任意给定的蛋白质。例如，密码子 GCA、 GCC、 GCG和 GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在每个丙氨酸由一个密码子确定的位置处，可将该密码子改变成任意描述的相应密码子而不会改变编码的多肽。这种核酸变异是 "沉默变异" ，其为经保守修饰的变异的一种。这里的编码多肽的每种核酸序列也描述了该核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到，可以修饰核酸中的每个密码子（除了 AUG , 其通常为甲石克氨酸的唯一密码子）来产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异在每种描述的序列中是隐含的。

"基本同一的序列" ，是指其中序列的改变没有影响分子的期望功能的序列。

对于氨基酸序列，技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单独的取代、删减或添加（其改变、添加或删减了编码序列中的单个氨基酸或小比例的氨基酸）在该改变导致氨基酸由化学相似的氨基酸置换时是 "经保守修饰的变异" 。提供功能相似的氨基酸的保守置换表是本领域所熟知的。

下面的 6组每组包含为相互保守置换的氨基酸：

1)丙氨酸（A)、丝氨酸（S)、苏氨酸（T) ;

2)天冬氨酸（ D ) 、谷氨酸（ E ) ；

3) 天冬酰胺（N)、谷氨酰胺（Q) ;

4) 精氨酸 00、赖氨酸（K) ;

5) 异亮氨酸（1)、亮氨酸（L)、甲硫氨酸 (M)、缬氨酸（V) ; 和

6) 苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、色氨酸（W)。（参见，例如 Cre ighton, Prote ins (1984) ) 。两个核酸序列或多肽基本上同一的指示是由第一核酸编码的多肽可与产生对抗由第二核酸编码的多肽的抗体发生免疫杂交反应。因而，例如，如果两个肽仅因保守置换而不同，则所述的一个多肽通常与另一个多肽基本一致。两个核酸序列基本同一的另一指示是两个分子或它们的互补序列在如下描述的严格条件下互相杂交。可利用本领域已知的多种技术分离人和人源化的抗体。例如，人杂交瘤可以如

Kontermann 等人 ( Kontermann R 和 Dubel Stefan; Antibody Engineering , Spr inger-Ver lag New York , LLC； 2001， ISBN： 3540413545 ) 所述进行制备。噬菌体展示这一用于产生特异性结合成员的技术已在许多出版物例如 Kontermann等人（同上）和 W092/01047 中进行了详细描述。转基因小鼠（其中小鼠抗体基因是失活的并用人抗体基因功能性地替代，同时保持小鼠免疫系统的其他组分完整）可以用于分离针对人抗原的人抗体（Mendez等人， 1997 ) 。单克隆或多克隆的人抗体，还可在其他转基因动物例如山羊、牛、綿羊、兔等中制备。

可以通过基因表达制备合成的抗体，所述基因借助于合成的并在合适的表达载体内装配的寡核苷酸而产生，例如如 Knappik等人（同上）或 Krebs等人， Journal of Immunological Methods 1M 200167-84 所描述的。

已显示，抗体的片段（例如抗原结合片段）也可以具有结合抗原的能力。所述抗原结合片段可以是，例如（ i) 由 VL、 CL、 VH和 CHI 结构域组成的 Fab片段；（ ii ) 由 VH和 CHI结构域组成的 Fd片段；

( iii ) 由单一抗体的 VL和 VH结构域组成的 Fv片段；（ iv) 由 VH 结构域组成的 dAb片段（ Ward, E. S.等人， Nature 341， 544-546( 1989 )， McCafferty等人（ 1990 ) ^"re， 348， 552-554 )； (v)分离的 CDR 区；（vi) F(ab')2片段，其是包括两个连接的 Fab片段的二价片段；

(vii )单链 Fv分子（scFv) ，其中 VH结构域和 VL结构域通过肽连接体连接，所述肽连接体允许这两个结构域联合以形成抗原结合位点

(Bird等人， Science, 242， 423-426， 1988; Huston等人， Proc. Natl. Acad. Sci USA 85， 5879-5883; 1998 ) ； ( viii ) 双特异性单链 Fv 二聚体（PCT/US92/09665 )；和（ ix) "双抗体" ，其是通过基因融合构建的多价或多特异性片段（WO 3804; F. Holliger等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448， 1993 ) 。 Fv、 scFv 或双抗体分子可以通过引入连接 VH和 VL结构域的二石克桥来稳定（Y. Reiter 等人， Nature Biotech, 14, 1239-1245， 1996 ) 。还可制备包括与 CH3结构 i或连接的 scFv的小抗体（minibodies ) ( S. Hu等人， Cancer Res.， 56， 3055-3061, 1996 ) 。抗原结合位点

本发明所述的抗体或其抗原结合片段与相应的抗原或其部分互补。在抗体分子中，抗原结合位点可以称为抗体-抗原结合位点，并包括特异地结合并与靶抗原全部或部分互补的抗体的一部分。当抗原很大时，抗体可以只结合抗原的特定部分，这个部分称为表位。抗原结合片段

抗原结合片段是本发明所述抗体的一部分，其包括抗原结合位点并结合靶抗原。在某些实施方式中，抗原结合片段可以由一个或多个抗体可变结构域（例如，由轻链可变区组成的 Fd抗体片段）或其抗原结合片段构成。在某些实施方式中，抗原结合片段包括抗体轻链可变区（VL) 和抗体重链可变区（VH) 。核细胞系统（例如， CH0或 NS0 ( ECACC 85110503 ) 细胞）糖基化的，或这它们也可以是（例如，如果通过在原核细胞中表达而产生）未糖基化的。还可以有意地改变糖基化，例如通过抑制岩藻糖基化，以便增加所得抗体的 ADCC活性。

抗体的可变区的结构和位置可以通过参考 Kabat, E.A.等人 ( Sequences of Proteins of Immunological Interest. 第四版. US Department of Health and Human Services. 1987 ) 及本领域的其他资料来确定，所述资料现在在因特网 ( ht tp: // immuno. bme. nwu. edu 或使用任何搜索引擎查找 "Kabat" ) 上可获得。 CDRs根据 Kabat等人的定义进行确定。

本发明的抗体或其抗原结合片段可以进一步包括抗体恒定区或其部分。例如， VL结构域可以以其 C-末端附着至抗体轻链恒定区。类似地，基于 VH结构域的抗体或其抗原结合片段可以以其 C-末端附着至免疫球蛋白重链的所有或部分（例如 CH1结构域），所述免疫球蛋白重链源自任何抗体同种型，例如 IgG、 IgA、 IgE和 IgM，以及同种型亚类中的任何一种，例如 IgGl和 IgG4。

在另外的方面，本发明还涉及能够在竟争性测试中与上述的本发明的抗体或其抗原结合片段竟争结合 HBsAg (例如 adw或 adr 亚型的 HBsAg)的抗体或其抗原结合片段。所述竟争性测试可以是例如使用 ELISA 和 /或通过将特异性的报告分子标记至一种抗体或其抗原结合从而使得能够鉴定结合相同表位或重叠表位的抗体或其抗原结合片段。抗体之间的交叉竟争可以容易地通过进行反转测定法来测定，例如通过颠倒标记的和未标记的抗体以鉴定在两个方向上阻断结合的抗体对。

例如，可以使用 ELISA来测定竟争，其中 HBsAg被固定至平板，并且将第一种经标记的抗体（参照抗体）连同一种或多种其他未标记的抗体一起加入平板中。通过由经标记的抗体发出的信号减少而观察到与经标记的抗体进行竟争的未标记的抗体的存在。抗体组合物

本发明所述的包含前述本发明抗体的组合物包含至少两种不同的抗体或抗原结合片段，所述至少两种不同的抗体或抗原结合片段结合不完全相同的目标抗原表位或者以彼此不互相竟争的方式结合目标抗原，并且彼此独立地选自上文中所述的本发明的抗体；其中所述至少存在，例如以抗体混合物或者多特异性抗体（例如汉特异性抗体）的形式存在。此外，包含在所述组合物中的抗体可以以各种形式存在，例如糖基化的或未糖基化的。

当使用双特异性抗体时，其是常规的双特异性抗体并可以以各种方式进行制备 ( Ho l l iger , P. 和 Winter G. Curren t Opinion Bio techno 1. 4， 446-449 ( 1993 ) ) ，例如采用化学方法或由杂种杂交瘤制备，或者可以是上文提及的汉特异性抗体片段中的任何一种。汉特异性抗体的例子包括利用 BiTE™技术所产生的抗体，其中可以使用具有不同特异性的两种抗体的结合结构域，并将它们经由柔性短肽直接连接。这将两种抗体组合在短的单个多肽链上。只使用可变结构域可以构建不含 Fc 区的双抗体和 scFv，这有效地减少了抗独特型反应的影响。

双特异性双抗体，与双特异性完整抗体不同，也可以是特别有用的，因为它们可以容易地在大肠杆菌、 coin 中构建并表达。使用本申请中所述的酵母展示系统可以从文库中容易地选择出具有合适的结合特异性的双抗体（以及许多其他多肽，例如抗体片段）。如果双抗体的一个臂保持恒定，例如，具有针对 HBsAg的特异性，那么就可以制备文库，其中另一个臂是可变的，并且可以选择出具有合适的特异性的抗体。可以通过 knobs-into-ho l es改造来制备双特异性完整抗体（C. E. B. Ridgeway等人， Protein Eng. , 9， 616-621， 1996 ) 。

酸分子。核酸可以包括 DNA和 /或 R 。在一个优选方面，本发明提供了这样的核酸，其编码如上定义的本发明的 CDR或 CDRs组，或抗体抗原 -结合位点，或重链 /轻链可变区，或抗体分子，例如 scFv。

本发明还提供了质粒、核酸载体、转录或表达盒形式的构建体，其包括至少一个上述分离的核酸分子。

本发明还提供了重组宿主细胞，其包含一种或多种如上的构建体 (例如核酸载体）。编码所提供的任何 CDR或 CDRs组或重链 /轻链可变区或抗原结合位点或抗体分子例如 scFv 的核酸可以方便地通过在适当条件下培养包含所述核酸的重组宿主细胞而被表达。在通过表达而产生后，可以使用任何合适的技术分离和 /或纯化本发明的抗体或其抗原结合片段，随后在适当时进行使用。

根据本发明的核酸可以包括 D 和 R ，或可以是完全或部分合成的。当提及本文列出的核苷酸序列时，涵盖了具有指定序列的 DM 分子，并涵盖了具有其中 U代替 T的指定序列的 RNA分子，除非本申请中另有说明。

用于在各种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是众所周知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌、酵母和转基因植物和动物。本领域可用的用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢（CH0) 细胞、 HeLa 细胞、幼仓鼠腎细胞、 NS0小鼠黑素瘤细胞、 YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人胚腎细胞、人胚视网膜细胞以及许多其他细胞。在一个具体的实施方式中，所述宿主细胞是酵母细胞。

可以选择或构建合适的载体，其包含合适的调节序列，包括启动子序列、终止子序列、多腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因以及其他合适序列。适当地，载体可以是质粒，病毒例如噬菌体或噬菌粒、或腺病毒、 AAV、慢病毒等。关于进一步的细节，参见例如 Molecular Cloning: A Laboratory Manual ,第三版， Sambrook和 Russel 1， 2001， Cold Spring Harbor Laboratory Press。用于操作核酸的许多已知技术和规程，例如核酸构建体的制备、诱变、测序、将 D 导入细胞和基因表达，以及發白质分析在 Current Protocols in Molecular Biology, 第二版， Ausubel等人（编者）， John Wi ley & Sons， 1986; Short Protocol s in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel等人 (编者）， John Wiley & Sons, 第四版， 1999中详细描述。

因此，本发明的一个方面提供了包含本文所公开的核酸的宿主细胞。此类宿主细胞可以处于体外或者可以是培养的。此类宿主细胞也可以处于体内。所述宿主细胞的体内存在可以允许本发明的抗体作为 "胞内抗体" 或细胞内抗体进行胞内表达。胞内抗体可以用于基因治疗（Mara s co WA ( 1997 ) Gene Therapy, 4 ( 1 ) ： 11 ) 。药物和 /或诊断组合物

本发明的抗体或其抗原结合片段、组合物或分离的核酸分子将通常以药物和 /或诊断组合物的形式被施用，其可以包含除所述抗体或其抗原结合片段、组合物或分离的核酸分子以外的至少一种组分。

因此，除上述活性成分以外，居本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、载体、緩冲质、稳定剂或本领域技术人员公知的其他材料。此类材料应当是非毒性的并且不应干扰活性成分的功效。此类材料可以包括，例如任何一种和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂以及生理学相容的物质等。药学上可接受的载体可以是例如水、盐水、磷酸盐緩冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及其组合。在许多情况下，所述药物和 /或诊断组合物中可以包括等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨糖醇，或氯化钠将是优选的。药学上可接受的物质的还可以是湿润剂或少量辅助物质例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或緩冲质，其增强抗体的保存期或效用。载体或其他材料的精确性质将取决于施用途径，所述施用途径可以是口月良、局部、通过吸入或通过注射，例如静脉内。在一个优选实施方案中，所述药物和 /或诊断组合物通过静脉内输注或注射进行施用。在另一优选实施方案中，所述药物和 /或诊断组合物通过肌内或皮下注射进行施用。

用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶嚢、粉剂或液体形式，例如含有惰性稀释剂或可同化的可食用载体。片剂可以包含固体载体例如明胶或佐剂。液体药物组合物一般包含液体载体例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖类溶液或者二醇例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。特异性结合成员（需要时，以及其他成分）还可包封在硬或软壳明胶胶嚢内，压缩成片剂，或直接掺入受试者饮食中。对于口服治疗施用，活性成分可以与赋形剂相掺合，并以可吸收的片剂、颊含片剂、锭剂、胶嚢、酏剂、悬浮液、糖浆剂、糯米纸嚢剂等的形式进行使用。为了通过除肠胃外施用以外的其他方式施用本发明的化合物，可能必需用防止其对于静脉内注射，或在痛苦部位注射，活性成分将是肠胃外可接受的水溶液的形式，其是无热原的并且具有合适的 pK、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员将能够容易地例如使用等渗媒介物例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸盐林格注射液来制备合适的溶液。需要时，可以包括防腐剂、稳定剂、緩冲质、抗氧化剂和 /或其他添加剂。

本发明的药物和 /或诊断组合物可以单独地或与其他治疗相组合地同时或顺次施用，这取决于被治疗的病状。

本发明的抗体或其抗原结合片段、组合物或分离的核酸分子可以以液体、半固体或固体形式进行配制，例如液体溶液（例如，可注射的和可输注的溶液）、分散系或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选的形式取决于所希望的施用形式、治疗应用、所述分子的物理化学特性和递送途径。制剂可以包含赋形剂、或赋形剂的组合，例如：糖、氨基酸和表面活性剂。液体制剂可以包含广泛范围的抗体浓度和 ρΗ。固体制剂可以通过例如冻干、喷雾干燥、或经超临界流体技术进行干燥来生产。

通常，药物和 /或诊断组合物在制造和贮存条件下必须是无菌的和稳定的。所述药物和 /或诊断组合物可以配制为溶液、微乳液、分散系、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。无菌可注射溶液可以通过下列方式制备：在需要时将在合适溶剂中的所需量的本发明的抗体或其抗原结合片段、组合物或分离的核酸分子与上文所列的一种成分或成分组合相掺合，随后过滤灭菌。一般地，分散系通过将活性化合物整合入无菌媒介物中进行制备，所述无菌媒介物包含基础分散介质和来自上文列举的那些中的所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这种干燥方式从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外所需成分的粉末。溶液的合适流动性可以通过下列方式来维持：例如，通过使用包衣例如卵磷脂，在分散系的情况下通过维持所需颗粒大小，和通过使用表面活性剂。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶可以导致可注射组合物的吸收延长。

在某些实施方案中，本发明所述的抗体或其抗原结合片段、组合物、分离的核酸分子或药物和 /或诊断组合物可以用保护活性成分不被快速释放的载体进行制备，例如受控释放制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶嚢化的递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚肝类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法是被授予专利权的，或者一般是本领域技术人员已知的。参见，例如 Sus ta ined and Con trolled Release Drug Deli very Sys tems ( J. R. Rob inson , ed. ， Marce l Dekker , Inc. , New York , 1978 ) 。

本发明的所述药物组合物还可以进一步包含其他有效治疗成分，例如其他抗病毒成分、细胞毒素、放射性同位素等。所述其它抗病毒试剂还可以包括例如利巴韦林、金刚烷、羧基脲、 IL-2、 IL-12、五羧链胞酸、拉夫米定、干扰素等。

另外，本发明的所述诊断组合物可以进一步包含用于诊断的标记物，所述标记物可以是例如放射性同位素（例如碘 125 ) 、酶、酶的底物、发光物质（例如异鲁米诺和吖啶酯）、荧光物质（例如荧光素和罗丹明）、生物素或有色物质（例如乳胶颗粒和胶体金）等。

在具体的实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、组合物或分离的核酸分子可以用可检测的或功能性的标记进行标记。可检测的标记包括放射性标记，例如 ¹³¹1 或 "TC，其可以使用抗体成像领域中已知的常规化学附着至本发明的抗体。标记还包括酶标记例如辣才艮过氧化物酶。标记进一步包括化学部分，例如生物素，其可以经由与特异性同族可检测部分例如经标记的抗生物素蛋白结合而进行检测。乙型肝炎病毒感染的诊断、预防和 /或治疗方法

本发明提供了本发明所述的抗体或其抗原结合片段、组合物、分离的核酸分子或药物和 /或诊断组合物结合 HBsAg的方法。所述结合可以在体内发生，例如在给患者施用所述抗体或其抗原结合片段、组合物、分离的核酸分子或药物和 /或诊断组合物后，或者也可以在体外发生，例如在 ELISA、蛋白质印迹法、免疫细胞化学、免疫沉淀、亲和层析、或基于细胞的测定法中，或者在基于离体的治疗方法（例如，其中将细胞或体液离体与根据本发明的抗体或其抗原结合片段、组合物、分离的核酸分子或药物和 /或诊断组合物接触并随后施用给患者的方法）中。

可以定量测定与 HBsAg结合的本发明的抗体或其抗原结合片段的量。定量结果可以与测试样品中的抗原量相关，这可能具有诊断意义。

样品中抗体的反应性可以通过任何合适的方法进行测定，例如放射免疫测定法（RIA )。将放射性标记的抗原与未标记的抗原（测试样品）混合并允许其结合抗体。将结合的抗原与未结合的抗原在物理上分离，并且测定与抗体结合的放射性抗原的量。测试样品中的抗原越多，与抗体结合的放射性抗原就越少。竟争结合测定法还可与非放射性抗原一起使用，使用与报告分子连接的抗原或类似物。报告分子可以是具有光谱学上分开的吸收或发射特征的荧光染料、磷光体或激光染料。合适的荧光染料包括荧光素、罗丹明、藻红蛋白或德克萨斯红。合适的生色染料包括二氨基联苯胺。

其他报告物包括大分子胶粒或颗粒材料例如胶乳珠，它们是有色、磁性或顺磁性的，以及可以直接或间接引起可被肉眼观察、被在电子学上检测或记录的可检测信号的生物学或化学活性剂。这些分子可以是例如催化反应的酶，所述反应产生或改变颜色或者引起电特性的改变。它们可以是可分子激发的（mo lecular ly exc i table ) ，从而使得能态之间的电子跃迁导致特征性的光谱吸收或发射。它们可以包括与生物传感器结合使用的化学实体。可以采用生物素 /抗生物素蛋白或生物素 /链霉抗生物素蛋白和碱性磷酸酶检测系统。通过单个抗体 -报告物缀合物产生的信号可以用于衍生在样品（正常和测试）中相关抗体结合的可定量的绝对或相对数据。

本发明的抗体或其抗原结合片段、组合物、分离的核酸分子或药物和 /或诊断组合物可以通过注射（例如皮下、静脉内、腔内（例如肿瘤切除术后）、损伤内、腹膜内或肌内），通过吸入，或局部（例如眼内、鼻内、直肠、伤口内、皮肤上）或口服施用。施用途径可以通过产品的物理化学特征，通过针对具体疾病的特别考虑，通过剂量或给药间隔，或者通过对于优化功效或最小化副作用的要求来确定。

根据本发明，所提供的药物组合物可以施用给有此需要的个体。施用优选以 "预防和 /或治疗有效量" ，例如能够有效防止病毒感染和 /或减少、消除病毒感染的量，其可显示为至少改善特定疾病或病症的至少一种症状。所施用的实际量，以及施用率和持续时间，将取决于被治疗的疾病的性质和严重程度。治疗处方，例如关于剂量等的决定，可以基于临床前和临床研究来确定，所述研究的设计完全在本领域技术人员的水平范围内。

精确剂量将取决于许多因素，包括所述抗体是用于诊断还是用于治疗，待治疗区域的大小和位置，抗体的精确性质（例如，完整抗体、片段或双抗体），以及附着至所述抗体的任何可检测标记或其他分子的性质。一般的抗体剂量对于全身应用来说将是 100 μ _§ - 1 mg，并且对于局部应用来说将是 1 μ _§ - 1 mg。这是对于成人患者的单一治疗的剂量，对于儿童和婴儿它可以按比例调整，并且还可以对于其他抗体形式按分子量和活性而成比例地调整。根据医师的判断，治疗可以按每天一次、每周二次、每周一次、每月一次或其他时间间隔重复。在本发明的优选实施方案中，治疗是周期性的，并且施用之间的时期是约 2周或更多，例如约 3周或更多，约 4周或更多，或约一月一次。下面将结合具体的实施例进一步阐述本发明的内容。除非特别说明，实施例中所用到的方法、试剂、材料、容器、步骤等均是本领域技术人员所使用的常规方法。本领域技术人员将会理解，实施例的内容仅用于解释发明的内容而将不会在任何方面限制本发明所将涵盖的保护范围。实施例 1 筛选抗 adr和 adw亚型 HBsAg的特异性 scFv

I.高亲和力特异性 scFv的筛选

使用了非免疫人 scFv文库（关于此文库的具体信息参见 Na ture Protoco l s Vo l. 1 No. 2: 755-768, 2006 ) ，通过酵母展示方法进行了抗 adr和 adw亚型 HBsAg的 scFv的筛选。经过上述筛选之后，发明人分离并克隆了对于 adr和 adw亚型的 HBsAg具有高亲和力的特异性单链抗体 scFvC (Wt) ( SEQ ID NO: 1 ) 和 scFvD (Wt)。

I I.经突变的高亲和力 scFv的进一步筛选

由于选自人 scFv 酵母文库的人单克隆抗体通常具有较低的表达水平，因此，其难以以有效的方式被制备并用于大规模的临床应用。为了克服这个问题，可以进一步突变上述所筛选出的、特异于 adr和 adw亚型的 HBsAg的人 scFv (即 scFvC和 scFvD ) 。以 scFvD为例，发明人在上述所筛选的 scFvD (wt)的基础上，利用酵母展示系统，通过数轮易错聚合酶链式反应（error-prone PCR)对所述 scFvD进行了诱变（具体的诱变过程是按照 Na ture Protoco l s Vo l. 1 No. 2: 755-768, 2006 中所描述的过程进行的），并随后通过流式细胞术歸选得到了具有更强的亲和力和更好的表达稳定性的单链抗体 scFvD (lD- 66)和 scFvD (2D-115) (SEQ ID NO: 2)。其中，如图 1所示，经过两轮突变和筛选之后所得到的突变体 scFvD (2D-115)在酵母细胞表面的表达增加了 4. 7倍，并且其对 HBsAg ( adw和 adr亚型）的亲和力增加了 32倍。实施例 2 所筛选出的 scFvD (wt) 、 scFvD (lD-66) 以及 scFvD (2D-115)能够中和 HBsAg与肝细胞的结合

为了检测所得到的高亲和力、特异性抗体是否能够中和 HBsAg与肝细胞的结合，发明人检测了所得到的单链抗体特异性中和 HBsAg的能力。首先，发明人用 100 μ ΐ 5 μ g/ml 的 HBsAg-bio (adw) (上海 PrimeGene 生物技术公司， #671-02;在实验室按照标准方法对购得的 HBsAg(adw)进行了生物素化，稀释到 5 μ g/ml ) 分别预孵育表达 scFvA (A-WT) , scFvD(wt)、 scFvD (1D-66)以及 scFvD (2D-115)的酵母细胞（ 5χ10^δ和 1.5χ10⁷个细胞），其中以无结合特异性的单链抗体 scFvA(A-WT)作为阴性对照。所述预孵育在室温下进行 5分钟。以 7000 rpm将所述酵母细胞离心 3分钟，取上清并与 5xl0⁴ Chang肝细胞在冰上孵育 30分钟。用 PBS (含 NaN₃)清洗细胞两次，并用抗生蛋白链菌素 -藻红蛋白（Strep-PE)在冰上染色 20分钟。然后再用 PBS (含 NaN₃) 清洗细胞两次，并用流式细胞仪（BD Caliber)进行分析。使用 HBsAg-bio(adr) (上海 PrimeGene生物技术公司， #671-01;在实验室按照标准方法对购得的 HBsAg(adr)进行了生物素化，稀释到 5 μ g/ml ) 进行了相同的实验，并得到了类似的实验结果。

结果显示，所获得的高亲和力抗体 scFvD(wt)、 scFvD(lD-66)以及 scFvD(2D-115)均能够在体外中和测试中，在 3分钟内耗尽 HBsAg (图 2) ，表明所得到的抗体能够特异性地中和 HBsAg (adr和 adw) 。实施例 3 单克隆抗体 scFvD-hlgGlFc以及 scFvC-hlgG!Fc能够完全阻碍 HBsAg与 Chang肝细胞的结合

为了进一步测试本发明的抗体是否可以预防病毒与肝细胞的结合，根据参考文献 7中描述的方法，发明人利用上述筛选出的 scFvC (wt) 和 scFvD(2D-115) 分别构建了单克隆抗体 scFvC-hlgGlFc 和 scFvD-hlgGlFc。然后，发明人检测了所述 scFvC-hlgGlFc 和 scFvD-hlgGlFc中和 HBsAg与 Chang肝细胞结合的能力。

为了检测 scFvD-hlgGlFc中和 HBsAg与 Chang肝细胞结合的能力，首先收获 Chang 肝细胞（ 5.3xl0⁵/ml ) 置于容器中。然后稀释 HBsAg-bio(adw) (上海 PrimeGene 生物科技公司， #671-02)至 5 μ g/ml。在反应管中加入 25 μ 1所述经稀释的 HBsAg-bio (adw) /5ml管，随后分别在各管中加入不同量的各抗体，在室温孵育 30分钟，之后向所述反应管中各加入 5xl0⁴Chang肝细胞并在室温下孵育 30分钟，用 PBS(NaN₃)清洗细胞，然后用抗生蛋白链菌素-藻红蛋白（Strep-PE)在冰上染色 20分钟，再用 PBS (NaN₃) 清洗细胞两次，并用流式细胞仪 (BD Caliber)进行分析。其中，纯化的 hlgGl被用作阴性对照，而人抗 HBsAg抗体（人 HBIg，来自中国、沭阳）被用作阳性对照。结果显示， HBsAg与 Chang肝细胞的结合可以被 11.2 μ g的 scFvD-hlgGFc完全阻碍，但是即使是 312 μ ₈的 HBIg也完全不能阻碍所述结合（图 4 ) 。

此外，发明人检测了 scFvC-hlgGlFc中和 HBsAg与 Chang肝细胞结合的能力。首先，使用 0.25 μ ₈5 g/ml的 HBsAg-bio(adw) (上海 PrimeGene 生物技术公司， #671-02;在实验室按照标准方法对购得的 HBsAg (adw)进行了生物素化，稀释到 5 μ g/ml ) 或 0.25 μ g 5 μ g/ml 的 HBsAg-bio(adr) (上海 PrimeGene生物技术公司， #671-01;在实验室按照标准方法对购得的 HBsAg (adr)进行了生物素化，稀释到 5 μ g/ml ) 分别与 Ι μ ξ /ml的 scFvC-hlgGlFc ( 8 μ 1、 80μ 1或 800 μ 1 ) 在反应管中共同孵育，伴随摇动在室温下孵育 1小时。随后向各反应管中加入 5xl0⁴Chang肝细胞并在冰上孵育 30分钟。用 PBS (NaN₃)清洗细胞，然后用抗生蛋白链菌素 -藻红蛋白（Strep-PE)在冰上染色 20 分钟，再用 PBS (NaN₃)清洗细胞两次，并用流式细胞仪（BD Caliber) 进行分析。实验结果显示， scFvC-hlgGlFc也能够完全阻碍 HBsAg与 Chang肝细胞的结合（图 5并且见表 1 ) 。表 1

scFvC- hlgGlFc, 80 μ 1 /

4 10 μ 1 46. 5 36

HBsAg-bio (adw)

scFvC- hlgGlFc, 800 μ 1 1

5 10 μ 1 24. 2 69

HBsAg-bio (adw) 实施例 4 单克隆抗体 scFvC-hlgGlFc能够高效地结合血液来源的 HBsAg

为了检测 scFvC-hlgGlFc与 HBsAg (血液来源）的结合效力和亲和力，发明人进行了下述实验：将 2 g/ml 的 HBsAg (血液来源，中国患者）包被在 ELISA板上，所述 HBsAg是从患者血液样品集合中纯化得到的（上海 Yeming生物有限公司），然后以 1% FBS/PBS/NaN₃封闭平板，以不同的滴定浓度向所述平板的各孔中分别加入 scFvC-hlgGlFc或人多克隆抗 HBsAg抗体（人 HBIg，来自中国、沭阳）。其中，所用的二抗是以碱性磷酸酶（AP)标记的山羊抗人抗体。在所有的实验中，均为在室温下孵育 1小时。实验结果显示，本发明的抗体能够结合 HBsAg , 而且结合的亲和力为人多克隆抗体 HBIg的 18526. 4 倍（图 6A及表 2)。此外，测得 scFvC-hlgGlFc与 HBsAg的亲和力为 Kd=538 pM。表 2

实施例 5 单克隆抗体 scFvC-hlgGlFc能够高效地结合 adr和 adw 亚型的 HBsAg

为了检测 scFvC-hlgGlFc与 adr和 adw亚型的 HBsAg的结合效力和亲和力，发明人进行了下述实验：将 10 μ g的 HBsAg (adr或 adw)包被在 ELISA平板上，以 2% FBS/PBS/¾N₃封闭所述平板。加入不同量的 hlgGl作为标准。然后加入一系列滴定浓度的人多克隆抗 HBsAg抗体（人 HBIg，来自中国、沭阳）或 scFvC-hlgGlFc, 在室温孵育 1小时。其中，所用的二抗是以碱性碑酸酶（AP)标记的山羊抗人抗体。实验结果显示，本发明的抗体能够高效地结合 adr和 adw亚型的 HBsAg , 而且结合的亲和力远高于人多克隆抗体 HBIg (图 6B)。此外，与实施例 4的结果比较后可知，本发明的抗体对于 adr和 adw亚型的 HBsAg的亲和力高于其对于血液来源的 HBsAg的亲和力。实施例 6 抗体 scFVc和 scFvD结合 HBsAg上的不同表位

由于单一的单克隆抗体处理可能不足以完全有效地控制病毒，并可能潜在地选择抗体耐受性病毒突变体。为了减少抗体耐受性克隆，联合使用多个抗体可能会更有效地预防 /治疗病毒感染。因此，为了检测所筛选出的高亲和力抗体 s cFvC和 s cF vD是否结合 HBs Ag上的不同表位，发明人进行了竟争测试。简要地，实验过程如下：为了测试 scFvC 和 scFvD在 HBsAg (adr或 adw亚型）上的结合位点，首先用 Ι Ο μ Ι以 1： 10000的比例于封闭緩冲液中稀释的前述 HBs Ag-b i o (adw)，分别与 5 μ 1 (10ng) 、 25 μ 1 (l OOng) 和 125 μ 1 (l OOOng) 的所述 scFvC-hlgGlFc (1. 8 μ g/ml)在室温共同孵育 30分钟，然后将其加入至 5xl 0⁵酵母 -scFvD (2D-115)细胞中，于室温共同孵育 30分钟。清洗细胞三次，然后加入 10 μ 1的抗生蛋白链菌素 -别藻蓝蛋白（ s trep-apc ) ( 1: 500 , 在封闭緩冲液中稀释）并在冰上孵育 10分钟，清洗细胞两次，随后利用流式细胞术进行分析。类似地，发明人用 10 μ 1以 1: 10000 的比例于封闭緩冲液中稀释的前述 HBsAg-bio (adr)，分别与 5 μ 1 (10ng)、 25 μ 1 (100ng)和 125 μ 1 (l OOOng)的所述 scFvC-hlgGlFc (1. 8 μ g/ml)在室温共同孵育 30 分钟，然后将其加入至 5xl 0⁵酵母 -scFvC (wt)细胞中，于室温共同孵育 30分钟。清洗细胞三次，然后加入 Ι Ο μ Ι 的 s trep-apc ( 1: 500，在封闭緩冲液中稀释）并在冰上孵育 10分钟，清洗细胞两次，随后利用流式细胞术进行分析发明人发现， scFvC-hlgGlFc不会阻碍 HBsAg与 scFvD的结合，而作为阳性对照， scFvC-hlgGlFc完全阻碍了 HBsAg与 scFvC的结合 (图 3)。这表明 scFvC和 scFvD分别结合 HBsAg的不同位点。因此，组合使用本发明的抗 HBsAg高特异性抗体（以混合物的形式或者以双特异性抗体的形式）将在很大程度上防止病况的复发。参考文献：

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4. Norder H, Courouce AM, Coursaget P, Echevarr ia JM, Lee SD， Mushahwar IK，等人， Genetic diversity of hepat i t is B virus strains derived worldwide: genotypes, subgenotypes, and HBsAg subtypes。 Intervirology, 2004; 47 (6) : 289-309。

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7. Powers, D.B.等人， Express ion of single-chain Fv-Fc fusions in Pichia pas tor is. J. Immunol. Methods 251 (2001) 123-135。

Claims

1、抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体特异性地结合 adw和 / 或 adr亚型的 HBsAg并且具有下述特征中的至少一个：

(a)结合 adw和 /或 adr亚型的 HBsAg的 K_D值为 1 χ 1 (Γ⁹ Μ以下；

(b)阻碍 adw和 /或 adr亚型的 HBsAg与肝细胞的结合；

(c)与 adw和 /或 adr亚型的 HBsAg结合的亲和力高于人多克隆抗体 HBIg与相应的 adw和 /或 adr亚型的 HBsAg结合的亲和力；

其中所述抗体可以是单克隆抗体，例如全人单克隆抗体。

2、权利要求 1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体结合 adw和 /或 adr亚型的 HBsAg的 K_D值为 6 χ 10"⁹ Μ以下，例如 5 χ 10"⁹ Μ 以下、 4 χ 10^_9 Μ以下、 3 χ 10^_9 Μ以下。

3、权利要求 1或 2所述的抗体或其抗原结合片段，或者它们的变体，其中所述抗体具有下述特征中的至少一个：

(a) 其重链可变区包含选自 SEQ ID NO: 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21、 23和 25中任一项所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID N0: 9、 11、 13、

(b) 其轻链可变区包含 SEQ ID NO: 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24和 26中任一项所示的氨基酸序列，或由 SEQ ID NO: 10、 12、 14、

(c) 其重链可变区中的 CDR1 : 包含选自 SEQ ID NO: 3、 27、 33、 39、 45、 51、 57、 63、 69和 75中任一项所示的氨基酸序列；和 /或其重链可变区中的 CDR2包含选自 SEQ ID NO: 4、 28、 34、 40、 46、 52、 58、 64、 70和 76中任一项所示的氨基酸序列；和 /或其重链可变区中的 CDR3 包含选自 SEQ ID NO: 5、 29、 35、 41、 47、 53、 59、 65、 71 和 77中任一项所示的氨基酸序列；或所述 CDR1 - 3分别由上述氨基酸序列中的任一项组成；或者重链可变区中的 CDR1 - 3 分别包含抗体 s cFvC 的重链可变区 CDR1-3 , 或者分别由抗体 s cFvC 的重链可变区 CDR1-3组成，其中所述抗体 s cFvC由 SEQ ID NO: 1所示的核酸序列编码；

(d)其其轻链可变区中的 CDR1 包含 SEQ ID NO: 6、 30、 36、 42、 48、 54、 60、 66、 72和 78中任一项所示的氨基酸序列；和 /或其轻链可变区中的 CDR2包含 SEQ ID NO: 7、 31、 37、 43、 49、 55、 61、 67、 73和 79 中任一项所示的氨基酸序列；和 /或其轻链可变区中的 CDR3 包含 SEQ ID NO: 8、 32、 38、 44、 50、 56、 62、 68、 74和 80 中任一项所示的氨基酸序列；或所述 CDR1 - 3分别由上述氨基酸序列中的任一项组成；或者轻链可变区中的 CDR1 - 3分别包含抗体 scFvC的轻链可变区 CDR1-3 , 或者分别由抗体 s cFvC的轻链可变区 CDR1-3组成，其中所述抗体 s cFvC由 SEQ ID NO: 1所示的核酸序列编码；

4、权利要求 3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的重链可变区 CDR1-3分别包含 SEQ ID NO: 3-5中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 3-5中所示的氨基酸序列组成；或者其中所述抗体的重链可变区 CDR1-3分别包含 SEQ ID NO: 27-29中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 27-29中所示的氨基酸序列组成；或者其中所述抗体的重链可变区 CDR1-3分别包含 SEQ ID NO: 33-35中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 33-35中所示的氨基酸序列组成；或者其中所述抗体的重链可变区 CDR1-3分别包含 SEQ ID NO: 39-41中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 39-41中所示的氨基酸序列组成；或者其中所述抗体的重链可变区 CDR1-3 分别包含 SEQ ID NO: 45-47 中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 45-47中所示的氨基酸序列组成；或者其中所述抗体的重链可变区 CDR1-3 分别包含 SEQ ID NO: 51-53中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 51-53中所示的氨基酸序列组成；或者其中所述抗体的重链可变区 CDR1-3 分别包含 SEQ ID NO: 57-59 中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 57-59 中所示的氨基酸序列组成；或者其中所述抗体的重链可变区 CDR1-3 分别包含 SEQ ID NO: 63-65 中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 63-65中所示的氨基酸序列组成；或者其中所述抗体的重链可变区 CDR1-3分别包含 SEQ ID NO: 69-71中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 69-71 中所示的氨基酸序列组成；或者其中所述抗体的重链可变区 CDR1-3分别包含 SEQ ID NO: 75-77中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 75-77中所示的氨基酸序列组成。

5、权利要求 3或 4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的轻链可变区 CDR1-3分别包含 SEQ ID NO: 6-8中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 6-8中所示的氨基酸序列组成；或者其中所述抗体的轻链可变区 CDR1-3分别包含 SEQ ID NO: 30-32中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 30-32中所示的氨基酸序列组成；或者其中所述抗体的轻链可变区 CDR1-3分别包含 SEQ ID NO: 36-38中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 36-38中所示的氨基酸序列组成；或者其中所述抗体的轻链可变区 CDR1-3分别包含 SEQ ID NO: 42-44中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 42-44中所示的氨基酸序列组成；或者其中所述抗体的轻链可变区 CDR1-3分别包含 SEQ ID NO: 48-50 中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 48-50中所示的氨基酸序列组成；或者其中所述抗体的轻链可变区 CDR1-3 分别包含 SEQ ID NO: 54-56中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 54-56中所示的氨基酸序列组成；或者其中所述抗体的轻链可变区 CDR1-3 分别包含 SEQ ID NO: 60-62 中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 60-62 中所示的氨基酸序列组成；或者其中所述抗体的轻链可变区 CDR1-3 分别包含 SEQ ID NO: 66-68 中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 66-68中所示的氨基酸序列组成；或者其中所述抗体的轻链可变区 CDR1-3分别包含 SEQ ID NO: 72-74中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 72-74 中所示的氨基酸序列组成；或者其中所述抗体的轻链可变区 CDR1-3分别包含 SEQ ID NO: 78-80中所示的氨基酸序列或者分别由 SEQ ID NO: 78-80中所示的氨基酸序列组成。

6、权利要求 3 - 5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的重链可变区包含选自下组的氨基酸序列或者由选自下组的氨基酸序列组成： SEQ ID N0: 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21、 23和 25。

7、权利要求 3 - 6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的氨基酸序列或者由选自下组的氨基酸序列组成： SEQ ID NO: 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24 和 26。

8、权利要求 7所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的可变区序列包含 SEQ ID NO: 2中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列，或者由 SEQ ID NO: 2中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列组成。

9、权利要求 3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的重链可变区 CDR1-3分别包含抗体 scFvC的重链可变区 CDR1-3 , 或者分别由抗体 scFvC的重链可变区 CDR1-3组成，其中所述抗体 s cFvC由 SEQ ID NO: 1所示的核酸序列编码。

10、权利要求 3或 9所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的轻链可变区 CDR1-3分别包含抗体 scFvC的轻链可变区 CDR1-3 , 或者分别由抗体 s cFvC 的轻链可变区 CDR1-3 组成，其中所述抗体 s cFvC由 SEQ ID NO: 1所示的核酸序列编码。

11、权利要求 3、 9或 10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的重链可变区包含抗体 scFvC的重链可变区序列，或者由抗体 scFvC的重链可变区序列组成，其中所述抗体 scFvC由 SEQ ID NO: 1所示的核酸序列编码。

12、权利要求 3、 9 - 11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的轻链可变区包含抗体 scFvC的轻链可变区序列，或者由抗体 scFvC的轻链可变区序列组成，其中所述抗体 scFvC由 SEQ ID NO: 1所示的核酸序列编码。

13、权利要求 12所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的可变区序列包含 SEQ ID NO: 1中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列，或者由 SEQ ID NO: 1中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列组成。

14、权利要求 1 - 13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为单克隆抗体，例如全人单克隆抗体；特别地，所述抗体包含恒定区，所述恒定区可以是例如 hIgGlFc。

15、抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与权利要求 1 - 14中任一项所述的抗体竟争结合 adw或 adr亚型的 HBsAg。

16、组合物，其包含至少两种不同的抗体或抗原结合片段，所述或者以彼此不互相竟争的方式结合目标抗原，并且彼此独立地选自权利要求 1 - 14中任一项所述的抗体或抗原结合片段；其中所述至少两在，例如以抗体混合物或者多特异性抗体（例如汉特异性抗体）的形式存在。

17、权利要求 16所述的组合物，其含有：

(a)第一种抗体，其可变区序列包含 SEQ ID NO: 1中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列，或者由 SEQ ID NO: 1中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列组成；和

(b)第二种抗体，其可变区序列包含 SEQ ID NO: 2中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列，或者由 SEQ ID NO: 2中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列组成。

18、分离的核酸分子，其编码权利要求 1 - 15中任一项所述的抗体或抗原结合片段。

19、核酸载体，其包含权利要求 18中所述的分离的核酸分子。

20、宿主细胞，其包含权利要求 19中所述的核酸载体。

21、药物和 /或诊断组合物，其包含权利要求 1 - 15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求 16或 1 7所述的组合物或权利要求 18所述的分离的核酸分子；以及任选地药学上可接受的载体。

22、权利要求 21所述的药物和 /或诊断组合物，其进一步包含其他有效治疗成分，例如其他抗病毒成分（例如拉夫米定、干扰素等）、细胞毒素、放射性同位素等；和 /或进一步包含标记物，所述标记物可以是例如放射性同位素（例如碘 125 )、酶、酶的底物、发光物质（例如异鲁米诺和吖啶酯）、荧光物质（例如荧光素和罗丹明）、生物素或有色物质（例如乳胶颗粒和胶体金）等。

23、权利要求 1 - 15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求 16或 17所述的组合物或权利要求 18所述的分离的核酸分子用于制备药物的用途，所述药物用于预防和 /或治疗由乙型肝炎病毒引起的感染，例如所述乙型肝炎病毒包含 adw或 adr亚型的 HBsAg;例如，所述药物用于阻碍 adw和 /或 adr亚型的 HBsAg与肝细胞的结合。

24、权利要求 1 - 15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求 16或 17所述的组合物或权利要求 18所述的分离的核酸分子用于制备诊断剂的用途，所述诊断剂用于诊断乙型肝炎病毒感染，例如所述乙型肝炎病毒包含 adw或 adr亚型的 HBsAg。