JPH0576370A - 高免疫能を有するb型肝炎ウイルス組換え表面抗原の取得方法、およびb型肝炎ウイルスワクチン組成物 - Google Patents
高免疫能を有するb型肝炎ウイルス組換え表面抗原の取得方法、およびb型肝炎ウイルスワクチン組成物Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 B型肝炎ウイルス表面抗原をコードする遺
伝子を含有しそして該遺伝子を発現させてなるピヒア
パストリス細胞から、該表面抗原を、非常に純粋で均質
な粒子状で高い免疫原性を有するHBsAgとして高収
率で得る方法を提供することを目的とする。 【構成】 本発明の方法は、発現されたB型肝炎ウイ
ルス表面抗原を含有する上記ピヒア パストリス細胞を
特定の援衝液で溶菌し、不純物を沈殿で除去し、次いで
得られる粗抗原をケイソウ土をもちいる吸着脱着、更に
イミュノアフィニティークロマトグラフィーによる処
理、熱処理、陰イオン交換カラムでの洗剤による処理、
および高速液体クロマトグラフィーでの洗剤処理にかけ
て精製する多段式精製法である。
伝子を含有しそして該遺伝子を発現させてなるピヒア
パストリス細胞から、該表面抗原を、非常に純粋で均質
な粒子状で高い免疫原性を有するHBsAgとして高収
率で得る方法を提供することを目的とする。 【構成】 本発明の方法は、発現されたB型肝炎ウイ
ルス表面抗原を含有する上記ピヒア パストリス細胞を
特定の援衝液で溶菌し、不純物を沈殿で除去し、次いで
得られる粗抗原をケイソウ土をもちいる吸着脱着、更に
イミュノアフィニティークロマトグラフィーによる処
理、熱処理、陰イオン交換カラムでの洗剤による処理、
および高速液体クロマトグラフィーでの洗剤処理にかけ
て精製する多段式精製法である。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子工学および生物工
学の分野のものである。更に詳細には、高免疫能を有す
るB型肝炎ウイルス組換え表面抗原の取得方法、および
B型肝炎ウイルスワクチン組成物に関するものである。
B型肝炎ウイルスの感染は急性肝疾患のみならずこれが
進行した肝硬変、肝不全および肝細胞癌などの慢性疾患
を生じるため、その予防は世界規模での重大な健康上の
課題である。この感染病原体の主な保有者であるB型肝
炎ウイルスの慢性的なキャリアーは世界各地に約2億人
存在する。現状ではB型肝炎ウイルス感染に対する有効
な治療法がないため、その予防のみがその伝播および感
染率を減少させる手段である。
学の分野のものである。更に詳細には、高免疫能を有す
るB型肝炎ウイルス組換え表面抗原の取得方法、および
B型肝炎ウイルスワクチン組成物に関するものである。
B型肝炎ウイルスの感染は急性肝疾患のみならずこれが
進行した肝硬変、肝不全および肝細胞癌などの慢性疾患
を生じるため、その予防は世界規模での重大な健康上の
課題である。この感染病原体の主な保有者であるB型肝
炎ウイルスの慢性的なキャリアーは世界各地に約2億人
存在する。現状ではB型肝炎ウイルス感染に対する有効
な治療法がないため、その予防のみがその伝播および感
染率を減少させる手段である。
【0002】
【従来の技術】B型肝炎ウイルスワクチンには、大別し
て血清由来のものと遺伝子工学技術により得られるもの
の2種がある。血清由来のワクチンは、該ウイルスの慢
性キャリアー由来の血清中のB型肝炎ウイルス表面抗原
(以下HBsAgと略す)を多様な物理的手法で精製し
不活化することにより得られる(A.J.Zucker
man et al.,British Medica
l Journal,1985,290:492)。こ
れらのワクチンは長年にわたってその有効性と安全性が
実証されており(A.M.Prince et a
l.,AnnualClinica1 Researc
h,1982,14:225)、ヒト免疫不全ウイルス
または他の感染病原体の伝染の危険性も伴わない(F.
Deinhardt et a1.,Journal
of Medical Viro1ogy,1985,
17:209)。しかし、これらのワクチンの広範な使
用は、ワクチン製造に用いるB型肝炎ウイルス表面抗原
を得るためのB型肝炎ウイルスのキャリアー血清の入
手、およびワクチンの精製、B型肝炎ウイルスの不活化
また血漿中に存在する他の感染病原体の除去という厳密
な操作や、ワクチンのバッチの通関手続きに必要な長期
にわたる安全性試験によって制限される。更に、血液伝
播による疾患を生じる感染病原体がワクチン作製におけ
る不活化処理から免れる恐れがあるため、一般に血液由
来産物を遺伝子工学技術により得られるものと置き換え
る傾向がある。
て血清由来のものと遺伝子工学技術により得られるもの
の2種がある。血清由来のワクチンは、該ウイルスの慢
性キャリアー由来の血清中のB型肝炎ウイルス表面抗原
(以下HBsAgと略す)を多様な物理的手法で精製し
不活化することにより得られる(A.J.Zucker
man et al.,British Medica
l Journal,1985,290:492)。こ
れらのワクチンは長年にわたってその有効性と安全性が
実証されており(A.M.Prince et a
l.,AnnualClinica1 Researc
h,1982,14:225)、ヒト免疫不全ウイルス
または他の感染病原体の伝染の危険性も伴わない(F.
Deinhardt et a1.,Journal
of Medical Viro1ogy,1985,
17:209)。しかし、これらのワクチンの広範な使
用は、ワクチン製造に用いるB型肝炎ウイルス表面抗原
を得るためのB型肝炎ウイルスのキャリアー血清の入
手、およびワクチンの精製、B型肝炎ウイルスの不活化
また血漿中に存在する他の感染病原体の除去という厳密
な操作や、ワクチンのバッチの通関手続きに必要な長期
にわたる安全性試験によって制限される。更に、血液伝
播による疾患を生じる感染病原体がワクチン作製におけ
る不活化処理から免れる恐れがあるため、一般に血液由
来産物を遺伝子工学技術により得られるものと置き換え
る傾向がある。
【0003】HBsAg遺伝子は、真核細胞や原核細胞
内でクローニングし発現される。原核生物である細菌の
場合は得られる発現レベルが低く、直径22nmの免疫
原粒子中へのHBsAgの効率的な導入が起こらないた
め、ワクチン製造に必要な抗原供給源としては原核生物
は用いられていない(P.Valenzuela et
al.,Nature,1980,280:815;
C.J.Burrell et al.,Natur
e,1979,279:43)。ー方、真核生物細胞も
HBsAgの産生に使用されているが(M.L.Mic
hel et al.,Biotechnology,
1985,3:561;G.M.MacNab et
al.,British Journa1of Can
cer,1976,36:509)、この方法では複雑
で高価な装置、培地を要し又その方法体系も複雑で費用
がかかるため、製造規模を拡大するのは難しい。更に、
哺乳類動物細胞由来のワクチンについて言えばレトロウ
イルスの存在による発癌の危険性があるため、その安全
性が懸念される。従って得られるHBsAgが天然に存
在するものと同様の特性を有するとはいえ、上述の方法
は噛乳類動物細胞由来のワクチンの大量生産には有用で
はない。
内でクローニングし発現される。原核生物である細菌の
場合は得られる発現レベルが低く、直径22nmの免疫
原粒子中へのHBsAgの効率的な導入が起こらないた
め、ワクチン製造に必要な抗原供給源としては原核生物
は用いられていない(P.Valenzuela et
al.,Nature,1980,280:815;
C.J.Burrell et al.,Natur
e,1979,279:43)。ー方、真核生物細胞も
HBsAgの産生に使用されているが(M.L.Mic
hel et al.,Biotechnology,
1985,3:561;G.M.MacNab et
al.,British Journa1of Can
cer,1976,36:509)、この方法では複雑
で高価な装置、培地を要し又その方法体系も複雑で費用
がかかるため、製造規模を拡大するのは難しい。更に、
哺乳類動物細胞由来のワクチンについて言えばレトロウ
イルスの存在による発癌の危険性があるため、その安全
性が懸念される。従って得られるHBsAgが天然に存
在するものと同様の特性を有するとはいえ、上述の方法
は噛乳類動物細胞由来のワクチンの大量生産には有用で
はない。
【0004】遺伝子増幅されたワクチニアウイルスによ
り、感染病原体に有効な生ワクチンの製造に用いるHB
sAgを単体で又は他の抗原と共に発現させる組換えウ
イルスを得ることができる(C.Cheng et a
l.,Journal ofVirology,198
6,60:337;E.Paoletti eta
l.,Proceedings of the Nat
ionalAcademy of Sciences
USA,1984,81:193)。しかしこの方法で
は技術および処方の面において多くの問題があるため、
得られたワクチンをヒトに対して大規模に使用するには
至っていない。
り、感染病原体に有効な生ワクチンの製造に用いるHB
sAgを単体で又は他の抗原と共に発現させる組換えウ
イルスを得ることができる(C.Cheng et a
l.,Journal ofVirology,198
6,60:337;E.Paoletti eta
l.,Proceedings of the Nat
ionalAcademy of Sciences
USA,1984,81:193)。しかしこの方法で
は技術および処方の面において多くの問題があるため、
得られたワクチンをヒトに対して大規模に使用するには
至っていない。
【0005】また、市販のB型肝炎ウイルス組換えワク
チンは、基本的には、遺伝子増幅された酵母のHBsA
gの産生により製造されるものである。酵母のサッカロ
ミセス セレビシエ(Saccharomyces c
erevisiae)は、広範囲で使用される生物学的
に活性な異種の蛋白質産生に(S.M.Kingsma
n et al,Tictech,1987,5:5
3)、またHBsAgの大量取得に(W.J.McAl
eer e1 a1.,Nature,1984,30
7:178;N.Harford et al.,Po
stgraduate Medical Journa
l,1987,63 suppl.2:65;G.A.
Bitter et al.,Journal of
Medical Virology,1988,25:
123)広く用いられている。得られる抗原は細胞内に
産生され、種々の細胞破砕の方法により抽出され、多様
な物理化学的手法により精製される。これにより97%
以上の純度で、動物およびヒトの血漿抗原が示すのと同
様な抗原作用を有する生成物が取得される(P.Hau
ser et al.,Postgraduate M
edical Journal,1987,63 su
ppl.2:83)。
チンは、基本的には、遺伝子増幅された酵母のHBsA
gの産生により製造されるものである。酵母のサッカロ
ミセス セレビシエ(Saccharomyces c
erevisiae)は、広範囲で使用される生物学的
に活性な異種の蛋白質産生に(S.M.Kingsma
n et al,Tictech,1987,5:5
3)、またHBsAgの大量取得に(W.J.McAl
eer e1 a1.,Nature,1984,30
7:178;N.Harford et al.,Po
stgraduate Medical Journa
l,1987,63 suppl.2:65;G.A.
Bitter et al.,Journal of
Medical Virology,1988,25:
123)広く用いられている。得られる抗原は細胞内に
産生され、種々の細胞破砕の方法により抽出され、多様
な物理化学的手法により精製される。これにより97%
以上の純度で、動物およびヒトの血漿抗原が示すのと同
様な抗原作用を有する生成物が取得される(P.Hau
ser et al.,Postgraduate M
edical Journal,1987,63 su
ppl.2:83)。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】近年、C1化合物資化
性酵母であるピヒアパストリス(Pichia pas
toris)を宿主として用い、該菌におけるメタノー
ルの利用過程の第一酵素であるアルコールオキシダーゼ
Iをコードする遺伝子のプロモーターを用いることに基
く効率的な発現系が報告された。この発現系において、
プロモーターは厳密に調節され、菌細胞がグルコースの
存在下ではなくメタノールの存在下にあるときにアルコ
ールオキシダーゼIを30%までもの高いレベルで発現
できる(S.B.Ellis et al.,Mole
cular and Cellular Biolog
y,1985,5:1111;R.Couderc e
t al.,Agric.Biol.Chem.,19
80,44:2259)。
性酵母であるピヒアパストリス(Pichia pas
toris)を宿主として用い、該菌におけるメタノー
ルの利用過程の第一酵素であるアルコールオキシダーゼ
Iをコードする遺伝子のプロモーターを用いることに基
く効率的な発現系が報告された。この発現系において、
プロモーターは厳密に調節され、菌細胞がグルコースの
存在下ではなくメタノールの存在下にあるときにアルコ
ールオキシダーゼIを30%までもの高いレベルで発現
できる(S.B.Ellis et al.,Mole
cular and Cellular Biolog
y,1985,5:1111;R.Couderc e
t al.,Agric.Biol.Chem.,19
80,44:2259)。
【0007】ピヒア パストリスは、HBsAgを含む
多様な異種蛋白質類の発現にすでに用いられている
(J.M.Cregg et al.,Biotech
nology,1987,5:479)。この発現は、
該酵母の変異株の染色体に存在する発現カセット内で、
HBsAgをコードする遺伝子がクローニングされた遺
伝子構築体を用い、アルコールオキシダーゼIプロモー
ターの調節シグナルの下で行なわれる。これにより、メ
タノールの存在下で発現系が活性化されて、産生される
可溶性タンパク質の2〜3%がHBsAgであることを
可能にする。しかし、この抗原の精製については何の開
示も無い。サッカロミセス セレビシアエ発現系に対す
るピヒア パストリス発現系の重要な利点は、産生され
る抗原が非常に効率的に組込まれて直径22nmの粒子
となることにある。これは、サッカロミセス セレビシ
アエでは24キロダルトンの抗原のうちの少しの部分の
みが組み込まれて粒子となるのに対し、ピヒア パスト
リスでは産生した抗原の実質的に全部が粒子状となるか
らである(P.Valenzuela et al.,
Nature,1982,298:347;R.A.H
itzeman et al.,Nucleic Ac
ids Research,1983,11:274
5;A.Miyanohara et al.,Pro
ceedings of the National
Academy of Sciences USA,1
983,80:1)。
多様な異種蛋白質類の発現にすでに用いられている
(J.M.Cregg et al.,Biotech
nology,1987,5:479)。この発現は、
該酵母の変異株の染色体に存在する発現カセット内で、
HBsAgをコードする遺伝子がクローニングされた遺
伝子構築体を用い、アルコールオキシダーゼIプロモー
ターの調節シグナルの下で行なわれる。これにより、メ
タノールの存在下で発現系が活性化されて、産生される
可溶性タンパク質の2〜3%がHBsAgであることを
可能にする。しかし、この抗原の精製については何の開
示も無い。サッカロミセス セレビシアエ発現系に対す
るピヒア パストリス発現系の重要な利点は、産生され
る抗原が非常に効率的に組込まれて直径22nmの粒子
となることにある。これは、サッカロミセス セレビシ
アエでは24キロダルトンの抗原のうちの少しの部分の
みが組み込まれて粒子となるのに対し、ピヒア パスト
リスでは産生した抗原の実質的に全部が粒子状となるか
らである(P.Valenzuela et al.,
Nature,1982,298:347;R.A.H
itzeman et al.,Nucleic Ac
ids Research,1983,11:274
5;A.Miyanohara et al.,Pro
ceedings of the National
Academy of Sciences USA,1
983,80:1)。
【0008】しかしながら、組換えHBsAgを原料と
する市販されているワクチン製剤は、サッカロミセス
セレビシアエを抗原供給源としているのが現状である。
また、密度匂配遠心法を包含するところの酵母からのH
BsAgの最も一般的な精製法[スミス クライン(S
mith Kline)によるヨーロッパ特許願第N
o.278 940 A3号]は、工業規模で行うには
費用がかかる上に複雑である。
する市販されているワクチン製剤は、サッカロミセス
セレビシアエを抗原供給源としているのが現状である。
また、密度匂配遠心法を包含するところの酵母からのH
BsAgの最も一般的な精製法[スミス クライン(S
mith Kline)によるヨーロッパ特許願第N
o.278 940 A3号]は、工業規模で行うには
費用がかかる上に複雑である。
【0009】フィリップス・ペトロリアム(Phill
ips Petroleum)によるヨーロッパ特許願
第337 492号に、ピヒア パストリスの組換え株
からHBsAgを取得する方法が記載されている。この
発明の目的はワクチンに直接導入されるに十分の純度で
HBsAgを取得することにあるが、精製後の抗原粒子
の粒子化に関する特性のみならずHBsAgがワクチン
に含有された場合のその免疫能についてのいかなる記載
もない。
ips Petroleum)によるヨーロッパ特許願
第337 492号に、ピヒア パストリスの組換え株
からHBsAgを取得する方法が記載されている。この
発明の目的はワクチンに直接導入されるに十分の純度で
HBsAgを取得することにあるが、精製後の抗原粒子
の粒子化に関する特性のみならずHBsAgがワクチン
に含有された場合のその免疫能についてのいかなる記載
もない。
【0010】フィリップス・ペトロリアムの方法は、次
の工程で行われる:カオトロピック塩(Chaotro
pic salt)の存在下で酵母細胞を溶菌し、溶菌
細胞ペレットからHBsAgを含有する上清を分離し;
pH4.5〜5.5において上清から脂質および不純物
蛋白質を沈殿物として除去し;得られた上清を濃縮し次
いで透析濾過し;HBsAgを含有する残留分をシリカ
に接触させた後不純物蛋白質を尿素含有緩衝液(pH
9.5〜11.0)により洗浄除去してHBsAgを溶
出し;適切な画分を、不純物からHBsAg粒子を分離
するのに十分な排除限界分子量を有する材料によるゲル
濾過にかけ、そして;得られた適切な分画を陰イオン交
換樹脂に接触させ、次いで緩衝液(pH6〜9)により
樹脂からHBsAg粒子を溶出する。この方法ではカオ
トロピック緩衝液が溶菌および抽出に用いられる。カオ
トロピック緩衝液にはカオトロピック剤としてチオシア
ン酸塩カリウムが、プロテアーゼ阻害剤としてフェニル
メチルスルフォニルフルオライドが含有されており、後
者は非常に有毒であるため、精製工程において完全に除
去しなくてはならない。更に、フェニルメチルスルフォ
ニルフルオライドがプロテアーゼの阻害に有効であるに
しても、その阻害スペクトルは制限されたものである。
更に、この方法ではHBsAgを含有する上清を透析濾
過した後得られた画分をシリカに接触させる。シリカか
らHBsAg抗原を分離するために尿素含有緩衝液(p
H9.5〜11)を用いるが、尿素は高い変性能を有す
るためこれを用いると生成物の免疫原性が低下してしま
う。
の工程で行われる:カオトロピック塩(Chaotro
pic salt)の存在下で酵母細胞を溶菌し、溶菌
細胞ペレットからHBsAgを含有する上清を分離し;
pH4.5〜5.5において上清から脂質および不純物
蛋白質を沈殿物として除去し;得られた上清を濃縮し次
いで透析濾過し;HBsAgを含有する残留分をシリカ
に接触させた後不純物蛋白質を尿素含有緩衝液(pH
9.5〜11.0)により洗浄除去してHBsAgを溶
出し;適切な画分を、不純物からHBsAg粒子を分離
するのに十分な排除限界分子量を有する材料によるゲル
濾過にかけ、そして;得られた適切な分画を陰イオン交
換樹脂に接触させ、次いで緩衝液(pH6〜9)により
樹脂からHBsAg粒子を溶出する。この方法ではカオ
トロピック緩衝液が溶菌および抽出に用いられる。カオ
トロピック緩衝液にはカオトロピック剤としてチオシア
ン酸塩カリウムが、プロテアーゼ阻害剤としてフェニル
メチルスルフォニルフルオライドが含有されており、後
者は非常に有毒であるため、精製工程において完全に除
去しなくてはならない。更に、フェニルメチルスルフォ
ニルフルオライドがプロテアーゼの阻害に有効であるに
しても、その阻害スペクトルは制限されたものである。
更に、この方法ではHBsAgを含有する上清を透析濾
過した後得られた画分をシリカに接触させる。シリカか
らHBsAg抗原を分離するために尿素含有緩衝液(p
H9.5〜11)を用いるが、尿素は高い変性能を有す
るためこれを用いると生成物の免疫原性が低下してしま
う。
【0011】
【問題を解決するための手段】本発明はピヒア パスト
リス由来の組換えB型肝炎ウイルス表面抗原を、非常に
均質な粒子状で高い免疫原性を有する形で得ることを確
実にする新規な精製法を提供するものである。
リス由来の組換えB型肝炎ウイルス表面抗原を、非常に
均質な粒子状で高い免疫原性を有する形で得ることを確
実にする新規な精製法を提供するものである。
【0012】本発明によれば、B型肝炎ウイルス表面抗
原をコードする遺伝子を含有しそして該遺伝子を発現し
てなるピヒア パストリス細胞からB型肝炎ウイルス表
面抗原を取得する方法にして、(1)カオトロピック
剤、スクロースおよびエチレンジアミン四酢酸(EDT
A)を含む緩衝液の存在下で上記ピヒア パストリス細
胞を溶菌し、(2)不純物を酸性pH領域で沈殿させて
粗抗原を得、(3)該粗抗原を酸性下でケイソウ土塊に
吸着させ、次にアルカリ性下で脱着し、(4)脱着され
た粗抗原をB型肝炎ウイルス表面抗原に特異的なモノク
ローナル抗体を用いるイミュノアフィニティークロマト
グラフィー(immunoaffinity chro
matography)にかけ、(5)得られる溶出抗
原を30〜40℃の温度での熱処理にかけ、(6)陰イ
オン交換カラムで抗原を洗剤により洗浄し、そして
(7)得られる溶出抗原を洗剤の存在下で高速液体クロ
マトグラフィーにかける、ことを包含する方法が提供さ
れる。
原をコードする遺伝子を含有しそして該遺伝子を発現し
てなるピヒア パストリス細胞からB型肝炎ウイルス表
面抗原を取得する方法にして、(1)カオトロピック
剤、スクロースおよびエチレンジアミン四酢酸(EDT
A)を含む緩衝液の存在下で上記ピヒア パストリス細
胞を溶菌し、(2)不純物を酸性pH領域で沈殿させて
粗抗原を得、(3)該粗抗原を酸性下でケイソウ土塊に
吸着させ、次にアルカリ性下で脱着し、(4)脱着され
た粗抗原をB型肝炎ウイルス表面抗原に特異的なモノク
ローナル抗体を用いるイミュノアフィニティークロマト
グラフィー(immunoaffinity chro
matography)にかけ、(5)得られる溶出抗
原を30〜40℃の温度での熱処理にかけ、(6)陰イ
オン交換カラムで抗原を洗剤により洗浄し、そして
(7)得られる溶出抗原を洗剤の存在下で高速液体クロ
マトグラフィーにかける、ことを包含する方法が提供さ
れる。
【0013】本発明によれば、工程(1)でのピヒア
パストリス細胞の溶菌は、チオシアン酸カリウム、スク
ロース、エチレンジアミン四酢酸、トリス及び食塩を包
含してなる緩衝液の存在下で行われる。好ましくはピヒ
ア パストリス細胞の溶菌は1〜4Mチオシアン酸カリ
ウム、1〜15(w/v)%スクロース、2.5〜3.
5mMエチレンジアミン四酢酸、10〜30mMトリス
及び0.1〜1M食塩、更に好ましくは、291g/l
のチオシアン酸カリウム、100g/lのスクロース、
1.86g/lのエチレンジアミン四酢酸、12g/l
のトリス及び17.5g/lの食塩を包含してなる緩衝
液の存在下で行われる。
パストリス細胞の溶菌は、チオシアン酸カリウム、スク
ロース、エチレンジアミン四酢酸、トリス及び食塩を包
含してなる緩衝液の存在下で行われる。好ましくはピヒ
ア パストリス細胞の溶菌は1〜4Mチオシアン酸カリ
ウム、1〜15(w/v)%スクロース、2.5〜3.
5mMエチレンジアミン四酢酸、10〜30mMトリス
及び0.1〜1M食塩、更に好ましくは、291g/l
のチオシアン酸カリウム、100g/lのスクロース、
1.86g/lのエチレンジアミン四酢酸、12g/l
のトリス及び17.5g/lの食塩を包含してなる緩衝
液の存在下で行われる。
【0014】本発明によれば、工程(2)での酸性下で
不純物の沈殿はpH3〜4の条件下で行われる。所望な
ら工程(2)での酸性下で生成する不純物の沈殿を除去
した後得られる粗抗原をpH7〜8にて貯蔵することも
可能である。
不純物の沈殿はpH3〜4の条件下で行われる。所望な
ら工程(2)での酸性下で生成する不純物の沈殿を除去
した後得られる粗抗原をpH7〜8にて貯蔵することも
可能である。
【0015】好ましくは工程(2)での酸性下で生成す
る不純物の沈殿を除去した後得られる粗抗原を工程
(3)にてpH3〜5の酸性下でケイソウ土塊に吸着さ
せ、不純物をpH3〜5の溶出用緩衝液で洗浄除去し、
次いで該抗原をpH7.5〜9.0のアルカリ性下でケ
イソウ土塊から脱着する。所望ならケイソウ土塊から脱
着される粗抗原は通常行われる濃縮化や脱塩処理、例え
ば限外濾過による濃縮や透析濾過による脱塩を行うこと
ができる。
る不純物の沈殿を除去した後得られる粗抗原を工程
(3)にてpH3〜5の酸性下でケイソウ土塊に吸着さ
せ、不純物をpH3〜5の溶出用緩衝液で洗浄除去し、
次いで該抗原をpH7.5〜9.0のアルカリ性下でケ
イソウ土塊から脱着する。所望ならケイソウ土塊から脱
着される粗抗原は通常行われる濃縮化や脱塩処理、例え
ば限外濾過による濃縮や透析濾過による脱塩を行うこと
ができる。
【0016】本発明によれば工程(4)での粗抗原のイ
ミュノアフィニティークロマトグラフィーに用いるモノ
クローナル抗体が、B型肝炎ウイルス表面抗原粒子に高
い親和性を有することを基準にして選択されるモノクロ
ーナル抗体であることが望ましい。更に好ましくは、粗
抗原のイミュノアフィニティークロマトグラフィーに用
いられるモノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞EC
ACC90112606によって産生される抗HBsA
g CB−HEP1である。イミュノアフィニティーク
ロマトグラフィーカラムからの該抗原の溶離はカオト
ピック剤を含む緩衝液で行うのが好ましい。
ミュノアフィニティークロマトグラフィーに用いるモノ
クローナル抗体が、B型肝炎ウイルス表面抗原粒子に高
い親和性を有することを基準にして選択されるモノクロ
ーナル抗体であることが望ましい。更に好ましくは、粗
抗原のイミュノアフィニティークロマトグラフィーに用
いられるモノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞EC
ACC90112606によって産生される抗HBsA
g CB−HEP1である。イミュノアフィニティーク
ロマトグラフィーカラムからの該抗原の溶離はカオト
ピック剤を含む緩衝液で行うのが好ましい。
【0017】本発明によれば、工程(5)での溶出抗原
の30〜40℃の温度での熱処理を1〜6時間行うこと
が望ましい。加熱処理後該抗原を工程(6)において好
ましくはDEAEセルロースカラムでデオキシコール酸
ナトリウムやトリトン(Triton)X−100のよ
うな洗剤で洗浄する。使用される洗剤濃度は0.01〜
0.5重量%、好ましくは0.05〜0.1重量%であ
る。次いで該抗原を溶出する。
の30〜40℃の温度での熱処理を1〜6時間行うこと
が望ましい。加熱処理後該抗原を工程(6)において好
ましくはDEAEセルロースカラムでデオキシコール酸
ナトリウムやトリトン(Triton)X−100のよ
うな洗剤で洗浄する。使用される洗剤濃度は0.01〜
0.5重量%、好ましくは0.05〜0.1重量%であ
る。次いで該抗原を溶出する。
【0018】溶出抗原をその後好ましくは工程(7)に
おいてデオキシコール酸ナトリウムのような洗剤の存在
下で分画分子量20,000〜10,000,000の
高速液体クロマトグラフィーにかける。使用される洗剤
濃度は0.01〜0.5重量%、好ましくは約0.05
重量%である。
おいてデオキシコール酸ナトリウムのような洗剤の存在
下で分画分子量20,000〜10,000,000の
高速液体クロマトグラフィーにかける。使用される洗剤
濃度は0.01〜0.5重量%、好ましくは約0.05
重量%である。
【0019】本発明によればB型肝炎ウイルス表面抗原
は組換えピヒア パストリス株C226[pTAO90
6]、CBS450.90から回収されるのが望まし
い。本発明の他の態様によれば、組換えピヒア パスト
リス株C226[pTAO906]、CBS450.9
0;ハイブリドーマ細胞ECACC 9011260
6;ハイブリドーマ細胞ECACC 90 112 6
06により産生されるモノクローナル抗体抗HBsAg
CB−HEP1;上記プロセスで得られる組換えB型
肝炎ウイルス表面抗原;本発明に基づくプロセスにより
得られる組換えB型肝炎ウイルス表面抗原の予防免疫量
と、ワクチン組成物に使用するのに適した少くとも1種
の担体、稀釈剤またはアジュバントとを包含してなるB
型肝炎ウイルスに対する免疫用ワクチン組成物;そして
本発明に基づくプロセスにより得られる組換えB型肝炎
ウイルス表面抗原の予防免疫量と、ワクチン組成物に使
用するのに適した少くとも1種の担体、稀釈剤またはア
ジュバントとを包含してなるワクチン組成物を適切な回
数投与することからなるB型肝炎ウイルスに対する人間
または動物の予防接種方法が提供される。
は組換えピヒア パストリス株C226[pTAO90
6]、CBS450.90から回収されるのが望まし
い。本発明の他の態様によれば、組換えピヒア パスト
リス株C226[pTAO906]、CBS450.9
0;ハイブリドーマ細胞ECACC 9011260
6;ハイブリドーマ細胞ECACC 90 112 6
06により産生されるモノクローナル抗体抗HBsAg
CB−HEP1;上記プロセスで得られる組換えB型
肝炎ウイルス表面抗原;本発明に基づくプロセスにより
得られる組換えB型肝炎ウイルス表面抗原の予防免疫量
と、ワクチン組成物に使用するのに適した少くとも1種
の担体、稀釈剤またはアジュバントとを包含してなるB
型肝炎ウイルスに対する免疫用ワクチン組成物;そして
本発明に基づくプロセスにより得られる組換えB型肝炎
ウイルス表面抗原の予防免疫量と、ワクチン組成物に使
用するのに適した少くとも1種の担体、稀釈剤またはア
ジュバントとを包含してなるワクチン組成物を適切な回
数投与することからなるB型肝炎ウイルスに対する人間
または動物の予防接種方法が提供される。
【0020】本発明を更に詳細に説明する。本発明の方
法の第1ステップはEDTA、トリス、食塩、ショ糖及
びチオシアン酸カリウムを含む緩衝液で細胞を溶解させ
ることである。EDTAは広い阻害スペクトルを有する
プロテアーゼ阻害剤であり、基本的に生物適合物質であ
るため、この段階におけるその存在は重要である。スク
ロースは分子の半減期および立体配座を維持する。チオ
シアン酸カリウムは通常のカオトロピック剤であり、他
のもので代替可能である。
法の第1ステップはEDTA、トリス、食塩、ショ糖及
びチオシアン酸カリウムを含む緩衝液で細胞を溶解させ
ることである。EDTAは広い阻害スペクトルを有する
プロテアーゼ阻害剤であり、基本的に生物適合物質であ
るため、この段階におけるその存在は重要である。スク
ロースは分子の半減期および立体配座を維持する。チオ
シアン酸カリウムは通常のカオトロピック剤であり、他
のもので代替可能である。
【0021】細胞の破砕の後、破砕断片の分離はpH3
〜4の酸性領域において、不純物蛋白質類の酸性下での
沈殿と同時に行なう。この操作により精製工程のステッ
プ数を減少させることができ、同時に高い純度(抗原1
0%以上)の物質から出発して精製を始めることがで
き、回収率も向上する。更にこの操作により不純物とし
て共存する脂質、炭水化物やDNAが除去できる。遠心
分離の後、抗原を含む上清はpH7〜8にて貯蔵可能で
ある。精製を更に続けるために粗抗原のpHを3〜5に
再度低下させ、そして粗抗原をセライト(Celit
e)塊に接触させに抗原を吸着させる。セライト塊をト
リス塩酸、チオシアン酸カリウム、スクロースとEDT
Aを含むpH3〜5の緩衝液で洗浄し、炭水化物、脂質
やDNAのような共存不純物を除去する。抗原はセライ
ト塊からpH7.5〜9.0の緩衝液を用いてpHを変
化することにより回収される。このステップにおいて抗
原は温和な条件下で溶離されるため、変性や抗原として
の特異性を失うことなく40〜50%の純度で回収でき
る。
〜4の酸性領域において、不純物蛋白質類の酸性下での
沈殿と同時に行なう。この操作により精製工程のステッ
プ数を減少させることができ、同時に高い純度(抗原1
0%以上)の物質から出発して精製を始めることがで
き、回収率も向上する。更にこの操作により不純物とし
て共存する脂質、炭水化物やDNAが除去できる。遠心
分離の後、抗原を含む上清はpH7〜8にて貯蔵可能で
ある。精製を更に続けるために粗抗原のpHを3〜5に
再度低下させ、そして粗抗原をセライト(Celit
e)塊に接触させに抗原を吸着させる。セライト塊をト
リス塩酸、チオシアン酸カリウム、スクロースとEDT
Aを含むpH3〜5の緩衝液で洗浄し、炭水化物、脂質
やDNAのような共存不純物を除去する。抗原はセライ
ト塊からpH7.5〜9.0の緩衝液を用いてpHを変
化することにより回収される。このステップにおいて抗
原は温和な条件下で溶離されるため、変性や抗原として
の特異性を失うことなく40〜50%の純度で回収でき
る。
【0022】セライト塊から脱着された抗原を含む溶離
液を0.1μmのポアサイズの膜を用いる限外濾過によ
り30〜40倍位まで濃縮し、次いで得られた粗抗原は
3倍量の適切な緩衝液(トリス塩酸、EDTA、pH7
〜8)を用いて透析濾過し、そして抗原粒子の選別に特
別にスクリーニングされたモノクローナル抗体を用いる
イミュノアフィニティークロマトグラフィーにかける。
これらのモノクローナル抗体を用いると抗原活性を低下
させるような処理法をさけることができ、そしてチンパ
ンジーで実証されているように特定の免疫原性を有する
特異エピトープが識別される(Schelleken
s,H;De Reus,A;Peetermans,
J.H.and Van Eerd,P.A.C.M.
Postgraduated Medical Jou
rnal,1987,63,Supplement
(2),p.93−96)。上記のステップで得られる
HBsAgを含む画分をトリス塩酸、リン酸カリウム又
はリン酸ナトリウムを含むpH6〜7の適切な緩衝液に
て平衡化したアフィニティカラムに通す。この際流速は
25〜50cm/hである。カラム中の非吸着物質(不
純物質)は1Mの食塩を更に加えたカラムの平衡化に用
いた同緩衝液を用いて洗い出される。抗原は1〜3Mの
範囲でチオシアン酸カリウムを含むトリス塩酸又はリン
酸塩のような緩衝液を用いてカラムから回収される。こ
のステップから得られる抗原の純度は85%以上であ
る。
液を0.1μmのポアサイズの膜を用いる限外濾過によ
り30〜40倍位まで濃縮し、次いで得られた粗抗原は
3倍量の適切な緩衝液(トリス塩酸、EDTA、pH7
〜8)を用いて透析濾過し、そして抗原粒子の選別に特
別にスクリーニングされたモノクローナル抗体を用いる
イミュノアフィニティークロマトグラフィーにかける。
これらのモノクローナル抗体を用いると抗原活性を低下
させるような処理法をさけることができ、そしてチンパ
ンジーで実証されているように特定の免疫原性を有する
特異エピトープが識別される(Schelleken
s,H;De Reus,A;Peetermans,
J.H.and Van Eerd,P.A.C.M.
Postgraduated Medical Jou
rnal,1987,63,Supplement
(2),p.93−96)。上記のステップで得られる
HBsAgを含む画分をトリス塩酸、リン酸カリウム又
はリン酸ナトリウムを含むpH6〜7の適切な緩衝液に
て平衡化したアフィニティカラムに通す。この際流速は
25〜50cm/hである。カラム中の非吸着物質(不
純物質)は1Mの食塩を更に加えたカラムの平衡化に用
いた同緩衝液を用いて洗い出される。抗原は1〜3Mの
範囲でチオシアン酸カリウムを含むトリス塩酸又はリン
酸塩のような緩衝液を用いてカラムから回収される。こ
のステップから得られる抗原の純度は85%以上であ
る。
【0023】本発明方法の更に新規なステップは、前の
ステップで得られた抗原を含む溶出液を次いで30〜4
0℃好ましくは37℃にて1〜6時間加熱処理すること
である。このステップにより22nmの均質な粒子を高
収率で回収でき、この粒子は高い免疫原性を示す。特に
この事実はDEAEセルロースでのイオン交換を行う次
のステップで明らかとなる。即ちこのステップでこれら
の粒子は175mM食塩にて明確なピークとして溶出さ
れ、この画分は低い抗原性を有する粒子状物質を含む残
留画分と異なるものである。
ステップで得られた抗原を含む溶出液を次いで30〜4
0℃好ましくは37℃にて1〜6時間加熱処理すること
である。このステップにより22nmの均質な粒子を高
収率で回収でき、この粒子は高い免疫原性を示す。特に
この事実はDEAEセルロースでのイオン交換を行う次
のステップで明らかとなる。即ちこのステップでこれら
の粒子は175mM食塩にて明確なピークとして溶出さ
れ、この画分は低い抗原性を有する粒子状物質を含む残
留画分と異なるものである。
【0024】抗原を含む溶出画分を次いで適切なpH7
〜7.5の緩衝液(トリス塩酸又はリン酸塩緩衝液)を
用いゲル濾過クロマトグラフィーにより脱塩する。次い
でこの物質をDEAEセルロースのようなイオン交換カ
ラムに流し、この樹脂を、10〜50mMの範囲の異な
った濃度の食塩と、0.01〜0.5重量%好ましくは
0.05〜0.1%の範囲内の異なった濃度のデオキシ
コール酸ナトリウムやトリトン(Triton)X−1
00のような洗剤を含む洗浄液で洗う。これらの洗浄に
より共存するDNAやエンドトキシンの除去が確実に行
なえる。抗原を150〜200mMの食塩とチオシアン
酸カリウムを含む溶液を用いカラムから回収する。この
抗原液にはDNAが全く含まれず、純度は95%以上で
ある。
〜7.5の緩衝液(トリス塩酸又はリン酸塩緩衝液)を
用いゲル濾過クロマトグラフィーにより脱塩する。次い
でこの物質をDEAEセルロースのようなイオン交換カ
ラムに流し、この樹脂を、10〜50mMの範囲の異な
った濃度の食塩と、0.01〜0.5重量%好ましくは
0.05〜0.1%の範囲内の異なった濃度のデオキシ
コール酸ナトリウムやトリトン(Triton)X−1
00のような洗剤を含む洗浄液で洗う。これらの洗浄に
より共存するDNAやエンドトキシンの除去が確実に行
なえる。抗原を150〜200mMの食塩とチオシアン
酸カリウムを含む溶液を用いカラムから回収する。この
抗原液にはDNAが全く含まれず、純度は95%以上で
ある。
【0025】溶出抗原を分画分子量100,000ダル
トンの膜を用いて蛋白質濃度が1〜3mg/mlの範囲
になるまで限外濾過にて濃縮を行なう。デオキシコール
酸ナトリウムのような洗剤を粗抗原に0.05%の濃度
になるように加え、そして濃縮液を分画分子量20,0
00〜10,000,000ダルトンの高分離能ゲル濾
過クロマトグラフィー(PW 5000又はPW 60
00)にかける。カラムを0.05%デオキシコール酸
ナトリウムを含む緩衝液で平衡化する。工程中洗剤の存
在により抗原中のエンドトキシン含量は抗原1μg当り
0.4ng以下に低下し、所望でない粒子状画分の選別
が可能となる。
トンの膜を用いて蛋白質濃度が1〜3mg/mlの範囲
になるまで限外濾過にて濃縮を行なう。デオキシコール
酸ナトリウムのような洗剤を粗抗原に0.05%の濃度
になるように加え、そして濃縮液を分画分子量20,0
00〜10,000,000ダルトンの高分離能ゲル濾
過クロマトグラフィー(PW 5000又はPW 60
00)にかける。カラムを0.05%デオキシコール酸
ナトリウムを含む緩衝液で平衡化する。工程中洗剤の存
在により抗原中のエンドトキシン含量は抗原1μg当り
0.4ng以下に低下し、所望でない粒子状画分の選別
が可能となる。
【0026】得られた抗原を再度適切な緩衝液を用いて
ゲル濾過クロマトグラフィーにより脱塩し、次いでワク
チン組成物として用いるために水酸化アルミニウムゲル
をアジュバントとして添加する。ここに開示した方法に
基づき得られるワクチン組成物の卓越した免疫原性は厳
密な二重盲検法に従って行なわれる制御された前臨床試
験の結果から証明される。本発明の方法により、人体用
として入手可能な同質の免疫原性を有する優れた品質の
ワクチン製剤を得ることができる。
ゲル濾過クロマトグラフィーにより脱塩し、次いでワク
チン組成物として用いるために水酸化アルミニウムゲル
をアジュバントとして添加する。ここに開示した方法に
基づき得られるワクチン組成物の卓越した免疫原性は厳
密な二重盲検法に従って行なわれる制御された前臨床試
験の結果から証明される。本発明の方法により、人体用
として入手可能な同質の免疫原性を有する優れた品質の
ワクチン製剤を得ることができる。
【0027】以下、本発明について実施例を挙げて説明
する。但し、本発明は以下の実施例にのみ限定されるも
のではない。
する。但し、本発明は以下の実施例にのみ限定されるも
のではない。
実施例1 B型肝炎ウイルス表面抗原遺伝子を得るため、該ウイル
スDNAをプラスミドpBR322のEcoRI部位に
クローニングした。ウイルスゲノムは、同ウイルスの無
症候性キャリアの血清から単離精製したデーン粒子(D
ane particles)より報文(P.Vale
nzuela et al., Nature, 19
79, 280:815)と同様の方法によって取得し
た。得られたプラスミド(pHBSIと称する)を制限
酵素EcoRIとHpalで消化し、得られた断片をT
aqIで消化し、この部位にEcoRIリンカー(5’
GGAATTCC 3’)を連結して、pBR322の
EcoRI部位にサブロクーニングした。得られたプラ
スミドをpHB32と称し、このプラスミドをEcoR
Iで消化し、S1ヌクレアーゼで処理することによりH
BsAg遺伝子を含む断片を得た。この断片を、あらか
じめNcoIで開環しS1ヌクレアーゼとアルカリホス
ファターゼで処理しておいたpBS5(図1参照)にサ
ブクローニングした。得られたプラスミドをpPCSA
3(図2参照)と称し、ここから、目的の遺伝子を挾む
5’末端(25bp)と3’末端(125bp)の該ウ
イルスのノンコーディング領域を標準反応条件に従いP
CR法で除去した(R. K. Saiki et
al., Science, 1985 230:1
350)。下記の配列を有す2つの合成オリゴヌクレオ
チド: 5’ 領域: 5’ GCCATGGAGAACATC
ACAT3’ (配列番号:1) 3’ 領域: 3’ GACCCATATGTAAAT
TTGCAGCTGG5’ (配列番号:2) を用いて、目的の遺伝子の5’末端と3’末端にNco
I切断部位とSalI切断部位をそれぞれ設けた。これ
により、目的の遺伝子の取扱が容易になり、また、増幅
された断片の上記の制限酵素による消化によってノンコ
ーディング領域を除去できるようになった。得られた正
確なHBsAg遺伝子を含む678bpの断片をプラス
ミドpBS5にサブクローニングした。こうして得られ
たプラスミド[pPCB6と称する(図3参照)]にお
いては、上記の遺伝子がサッカロミセス セレビシエの
酵素グリセルアルデヒド3−ホスフエートデヒドロゲナ
ーゼ(GAP)遺伝子の転写制御シグナルの支配下にあ
る。ピヒア パストリスの遺伝子ライブラリー由来のプ
ラスミドpCAO10(図4参照)から、酵素AOX1
遺伝子のプロモーターとノンコーデング5’領域を含む
1.1kbの断片を抽出した。この断片をプラスミドP
BR322にサブクローニングして得たプラスミドpP
AO23(図5参照)を用いてPCRを行ない、酵素A
OX1の構造遺伝子からこの蛋白質の最初の6個のアミ
ノ酸をコードするコドンに対応する18bpの塩基配列
を除去した。用いた2つの合成オリゴヌクレオチドは次
のものである。 5’ 領域 :5’GTATCACGAGGCCCT
3’ (配列番号:3) 3’ 領域 :3’TTGATTAATAAGCTTT
GGTACCGC5’ (配列番号:4) 3’領域のオリゴヌクレオチドによって、酵素AOX1
の構造遺伝子の18bpの配列を除去してHBsAg遺
伝子への正確な結合を達成するための、酵素AOX1遺
伝子のプロモーターの3’領域にNcoI部位を設ける
ことができる。また、5’領域のオリゴヌクレオチドに
よってPBR322のEcoRI部位が維持できる。増
幅された1115bpの断片はプラスミドpUC19に
サブクローニングされ、これにより、ピヒア パストリ
スの酵素AOX1遺伝子の完全なプロモーターを含むプ
ラスミドpMAO107が得られた(図6参照)。HB
sAgの正確な遺伝子を酵素AOX1の完全なプローモ
ーターの支配下にサブクローニングすることにより最終
統合ベクターを得た(図7参照)。得られたクローン
(pHAO112と称する)はAOX1プロモーターの
制御シグナル及びサッカロミセス セレビシエのGAP
遺伝子の終止シグナルの支配下にある上記遺伝子を含ん
でおり、さらに、酵母との相同的組換えに必要なピヒア
パストリスの染色体DNAの領域も有している。この
プラスミドをS1ヌクレアーゼで部分消化処理してHB
sAg遺伝子の3’末端と酵素グリセルアルデヒド3−
ホスフェートデヒドロゲナーゼのターミネーターとの間
に位置するSalI部位を破壊した。得られたクローン
をpSAO503(図8参照)と称し、この中に、酵素
AOX1の構造遺伝子の断片及びそれと隣りあうノンコ
ーディング3’領域を含むプラスミドpCAO10由来
の2.4kbの断片をサブクローニングした。得られた
プラスミドをpVAO721と称し(図8参照),これ
にサッカロミセスセレビシエのhis3遺伝子を含む
1.8kbの断片をプラスミドpPMC(図9参照)か
らクローニングした。得られたクローンをpTAO90
6と称し(図10参照)、最終統合プラスミドとしてピ
ヒア パストリスMP36株(欧州特許公開EP−A
0 438200号)の形質転換に用いた。形質転換体
のうち遺伝子統合の明確なパターンを示すものを用いて
遺伝子発現による抗原生産レベルの評価を行った。抗原
生産用に選択した株をC226と称した。ピヒア パス
トリスC226[pTAO906]は、1990年10
月22日、オランダ国バーン市所在のセントラルビュー
ローフォルスキメルカルチャース〔Centraalb
urear voor Schimmelcultur
es(CBS)〕にブタペスト条約に基づき寄託され、
寄託番号CBS450.90を与えられた。た。
スDNAをプラスミドpBR322のEcoRI部位に
クローニングした。ウイルスゲノムは、同ウイルスの無
症候性キャリアの血清から単離精製したデーン粒子(D
ane particles)より報文(P.Vale
nzuela et al., Nature, 19
79, 280:815)と同様の方法によって取得し
た。得られたプラスミド(pHBSIと称する)を制限
酵素EcoRIとHpalで消化し、得られた断片をT
aqIで消化し、この部位にEcoRIリンカー(5’
GGAATTCC 3’)を連結して、pBR322の
EcoRI部位にサブロクーニングした。得られたプラ
スミドをpHB32と称し、このプラスミドをEcoR
Iで消化し、S1ヌクレアーゼで処理することによりH
BsAg遺伝子を含む断片を得た。この断片を、あらか
じめNcoIで開環しS1ヌクレアーゼとアルカリホス
ファターゼで処理しておいたpBS5(図1参照)にサ
ブクローニングした。得られたプラスミドをpPCSA
3(図2参照)と称し、ここから、目的の遺伝子を挾む
5’末端(25bp)と3’末端(125bp)の該ウ
イルスのノンコーディング領域を標準反応条件に従いP
CR法で除去した(R. K. Saiki et
al., Science, 1985 230:1
350)。下記の配列を有す2つの合成オリゴヌクレオ
チド: 5’ 領域: 5’ GCCATGGAGAACATC
ACAT3’ (配列番号:1) 3’ 領域: 3’ GACCCATATGTAAAT
TTGCAGCTGG5’ (配列番号:2) を用いて、目的の遺伝子の5’末端と3’末端にNco
I切断部位とSalI切断部位をそれぞれ設けた。これ
により、目的の遺伝子の取扱が容易になり、また、増幅
された断片の上記の制限酵素による消化によってノンコ
ーディング領域を除去できるようになった。得られた正
確なHBsAg遺伝子を含む678bpの断片をプラス
ミドpBS5にサブクローニングした。こうして得られ
たプラスミド[pPCB6と称する(図3参照)]にお
いては、上記の遺伝子がサッカロミセス セレビシエの
酵素グリセルアルデヒド3−ホスフエートデヒドロゲナ
ーゼ(GAP)遺伝子の転写制御シグナルの支配下にあ
る。ピヒア パストリスの遺伝子ライブラリー由来のプ
ラスミドpCAO10(図4参照)から、酵素AOX1
遺伝子のプロモーターとノンコーデング5’領域を含む
1.1kbの断片を抽出した。この断片をプラスミドP
BR322にサブクローニングして得たプラスミドpP
AO23(図5参照)を用いてPCRを行ない、酵素A
OX1の構造遺伝子からこの蛋白質の最初の6個のアミ
ノ酸をコードするコドンに対応する18bpの塩基配列
を除去した。用いた2つの合成オリゴヌクレオチドは次
のものである。 5’ 領域 :5’GTATCACGAGGCCCT
3’ (配列番号:3) 3’ 領域 :3’TTGATTAATAAGCTTT
GGTACCGC5’ (配列番号:4) 3’領域のオリゴヌクレオチドによって、酵素AOX1
の構造遺伝子の18bpの配列を除去してHBsAg遺
伝子への正確な結合を達成するための、酵素AOX1遺
伝子のプロモーターの3’領域にNcoI部位を設ける
ことができる。また、5’領域のオリゴヌクレオチドに
よってPBR322のEcoRI部位が維持できる。増
幅された1115bpの断片はプラスミドpUC19に
サブクローニングされ、これにより、ピヒア パストリ
スの酵素AOX1遺伝子の完全なプロモーターを含むプ
ラスミドpMAO107が得られた(図6参照)。HB
sAgの正確な遺伝子を酵素AOX1の完全なプローモ
ーターの支配下にサブクローニングすることにより最終
統合ベクターを得た(図7参照)。得られたクローン
(pHAO112と称する)はAOX1プロモーターの
制御シグナル及びサッカロミセス セレビシエのGAP
遺伝子の終止シグナルの支配下にある上記遺伝子を含ん
でおり、さらに、酵母との相同的組換えに必要なピヒア
パストリスの染色体DNAの領域も有している。この
プラスミドをS1ヌクレアーゼで部分消化処理してHB
sAg遺伝子の3’末端と酵素グリセルアルデヒド3−
ホスフェートデヒドロゲナーゼのターミネーターとの間
に位置するSalI部位を破壊した。得られたクローン
をpSAO503(図8参照)と称し、この中に、酵素
AOX1の構造遺伝子の断片及びそれと隣りあうノンコ
ーディング3’領域を含むプラスミドpCAO10由来
の2.4kbの断片をサブクローニングした。得られた
プラスミドをpVAO721と称し(図8参照),これ
にサッカロミセスセレビシエのhis3遺伝子を含む
1.8kbの断片をプラスミドpPMC(図9参照)か
らクローニングした。得られたクローンをpTAO90
6と称し(図10参照)、最終統合プラスミドとしてピ
ヒア パストリスMP36株(欧州特許公開EP−A
0 438200号)の形質転換に用いた。形質転換体
のうち遺伝子統合の明確なパターンを示すものを用いて
遺伝子発現による抗原生産レベルの評価を行った。抗原
生産用に選択した株をC226と称した。ピヒア パス
トリスC226[pTAO906]は、1990年10
月22日、オランダ国バーン市所在のセントラルビュー
ローフォルスキメルカルチャース〔Centraalb
urear voor Schimmelcultur
es(CBS)〕にブタペスト条約に基づき寄託され、
寄託番号CBS450.90を与えられた。た。
【0028】実施例2 HBsAgを合成するため、形質転換体C226の前接
種段階の培養を以下の組成の生理食塩水培地で行なう: K2HPO4− 5g/l MgSO4− 4.6g/l NH4SO4− 22g/l CaCl2− 0.5g/l グリセロール − 20ml/l ビタミン類 200×− 10ml/l 微量元素 200×− 5ml/l 培養は30℃、pH4.5、通気及び撹拌条件下で、酸
素分圧が飽和値の30%を超えるようにして行なう。培
養時間は10から12時間とする。接種段階では生理食
塩水倍地を以下の組成の富栄養培地にとり換える。 酵母抽出物 1% ペプトン 2% グリセロール 2% 微量元素 200×− 10ml/l ビタミン類 200×− 5ml/l 培養は前記条件で10から12時間かけて、細胞濃度が
10から12g/l(乾燥基準)に達するまで行ない、
さらに、培養物を上記と同様の富栄養培地に接種して上
記と同様の温度とpH条件で培養を行なう。培養は8か
ら10時間けて細胞濃度が10から12g/l(乾燥基
準)に達するまで行なう。遺伝子発現による抗原の産生
を誘導するために、この時点からメタノールを連続的に
添加しはじめる。90から100時間の培養で産生した
抗原は総蛋白質のおよそ3%に達する。メタノールの添
加量は培地中の細胞濃度の増加に従って間隔を置いて増
加させる。この後、以下の組成を有する富栄養培地によ
って培養物を増し始める: 酵母抽出物 3% ペプトン 6% この増加は180から200時間続く培養の最後まで維
持され、比成長率は5倍になり、発現レベルが上昇す
る。この方法によって得られるもう一つの結果は、この
ようにして生産された蛋白質は80%以上可溶な状態に
維持されることであり、この要素は以後の精製段階の効
率向上と抗原の粒子状化の向上を促す。培養の最終段階
においては60から80g/l(乾燥基準)のバイオマ
ス濃度が得られ、抗原産生レベルは総蛋白質の2から5
%に達する。培養終了後、細胞を連続的システムにおい
て遠心で回収し、同じ遠心装置を用いて滅菌水で洗浄後
クリーム状で4%で保存する。
種段階の培養を以下の組成の生理食塩水培地で行なう: K2HPO4− 5g/l MgSO4− 4.6g/l NH4SO4− 22g/l CaCl2− 0.5g/l グリセロール − 20ml/l ビタミン類 200×− 10ml/l 微量元素 200×− 5ml/l 培養は30℃、pH4.5、通気及び撹拌条件下で、酸
素分圧が飽和値の30%を超えるようにして行なう。培
養時間は10から12時間とする。接種段階では生理食
塩水倍地を以下の組成の富栄養培地にとり換える。 酵母抽出物 1% ペプトン 2% グリセロール 2% 微量元素 200×− 10ml/l ビタミン類 200×− 5ml/l 培養は前記条件で10から12時間かけて、細胞濃度が
10から12g/l(乾燥基準)に達するまで行ない、
さらに、培養物を上記と同様の富栄養培地に接種して上
記と同様の温度とpH条件で培養を行なう。培養は8か
ら10時間けて細胞濃度が10から12g/l(乾燥基
準)に達するまで行なう。遺伝子発現による抗原の産生
を誘導するために、この時点からメタノールを連続的に
添加しはじめる。90から100時間の培養で産生した
抗原は総蛋白質のおよそ3%に達する。メタノールの添
加量は培地中の細胞濃度の増加に従って間隔を置いて増
加させる。この後、以下の組成を有する富栄養培地によ
って培養物を増し始める: 酵母抽出物 3% ペプトン 6% この増加は180から200時間続く培養の最後まで維
持され、比成長率は5倍になり、発現レベルが上昇す
る。この方法によって得られるもう一つの結果は、この
ようにして生産された蛋白質は80%以上可溶な状態に
維持されることであり、この要素は以後の精製段階の効
率向上と抗原の粒子状化の向上を促す。培養の最終段階
においては60から80g/l(乾燥基準)のバイオマ
ス濃度が得られ、抗原産生レベルは総蛋白質の2から5
%に達する。培養終了後、細胞を連続的システムにおい
て遠心で回収し、同じ遠心装置を用いて滅菌水で洗浄後
クリーム状で4%で保存する。
【0029】実施例3 カラムクロマトグラフィー用に適したHBsAg粗抗原
を得る目的で、抗原をコードする遺伝子で形質転換され
た酵母培養物を遠心分離して得られるバイオマスを機械
的に破砕して得られる粗抽出物を次の精製工程にかけ
る。洗浄したクリーム状の細胞濃縮物を蒸留水にて10
0g/lに調整し破砕用緩衝液として次の化合物を加え
る: トリス 12.1g/l ショ糖 100g/l 食塩 17.5g/l EDTA 1.86g/l チオシアン酸カリウム 291g/l pHを1NHClにて7.5〜8.0に調整し、この溶
液を5分間ホモジナイズし、そしてベットミルで細胞を
機械的に破壊する。細胞破砕物をHBsAgの安定性に
基づく極限のpH条件下にて清澄化操作を行い、その条
件下で数多くの宿主酵母由来の他の不純物蛋白質を沈殿
させる。一方抗原は溶液中に残留する。酸性pHでの他
の不純物蛋白質の沈殿化による破砕抽出物の清澄化は次
の方法で実行した。破砕細胞ホモジネートを攪拌しなが
ら、0〜4℃まで冷却し、pHを記録していく。そして
発泡をさけつつ4℃にて1NHCl溶液をpHが2.5
〜3になるのに十分な量を急速に加える。更に5分撹拌
を続けた後混合物を4℃に冷却し連続式の遠心分離機に
かける。遠心時間は45分間で、被検液の抽出容器及び
回収容器は冷却状態にしておく。遠心後直ちに上清を一
定に撹拌しpHを記録しながらpH7.5〜8.5にも
どす。清澄化した上清のpHを再び4.0に下げ、1k
gのセライト塊(High flow Super c
ell,Fluka)当りおよそ抗原0.35gを加え
て約1時間ホモジナイズする。抗原をセライト塊に吸着
させ、遠心、濾過又は傾斜法によりセライト塊と非吸着
物質を分け、非吸着分を廃棄する。次いでベッドに固定
された抗原を2〜3回次の組成の緩衝液で洗浄する: チオシアン酸カリウム 48.5g/l ショ糖 100g/l トリス 2.42g/l EDTA 1.86g/l pHは1NHClにて4.0に調整した。連続して洗浄
した後、セライト塊からの抗原の脱着を次の組成の溶出
用緩衝液を用いて行った。 トリス 2.42g/l EDTA 1.12g/l ショ糖 100g/l pHは1NNaOHにて9.0〜9.5に調整した。溶
出により得られる粗抗原を約55のファクターで初期容
量を濃縮するため、0.1μmのポアサイズのカートリ
ッジを有するAMICON型の濃縮機(中空繊維)に導
入する。この全操作は4℃で行った。得られたHBsA
gを完全に精製するために、数段階のクロマトグラフィ
ーを以下に述べるように実行した。濃縮セライト溶出物
の約2lを20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)で
膨潤、平衡化したセファデックス(Sephadex)
G−25のゲル濾過カラムで脱塩した。この過程は28
0nmにおける吸光度及び伝導率により制御される。C
NBrで活性化した約2lのセファロース(Sepha
rose)CL−4Bとそれに結合した約10gのモノ
クローナル抗体CB−HEP1(実施例4に従ってセン
トロ デインヘニエリア ヘネティカイ ビオテクノロ
ヒアで入手される)とからなるイミュノアフィニテイ吸
着剤を調製し、その特性により高免疫能を持つ抗原の選
別が可能となる。上記の吸着剤を充填したイミュノアフ
ィニテイカラムを20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.
0)で平衡化し、そのカラムにベッド1ml当りおよそ
0.1mgのHBsAgの比で抗原を含む多量の脱塩さ
れたセライト溶出液濃縮液を流した。流速は室温にて5
0cm/hとした。洗浄は平衡化に使用したのと同じも
ので行い、進行状況は280nmの吸収グラフを記録す
ることで行った。溶出液をその吸収がクロマトグラフの
ベースラインに一致するまで集め、それから20mMト
リス塩酸、1N食塩を含むpH8.0の緩衝液をその吸
収がベースラインに再び一致するまで流し、非特異的吸
着物を除去した。抗原は20mMトリス塩酸、3Mチオ
シアン酸カリウム、1M食塩を含むpH8.0の緩衝液
で溶出し、カラムを長時間使用しない場合はカラムを直
ちに4℃の0.01%チメロサール(thimeros
al)を含む過剰の平衡化用緩衝液で洗浄した。
を得る目的で、抗原をコードする遺伝子で形質転換され
た酵母培養物を遠心分離して得られるバイオマスを機械
的に破砕して得られる粗抽出物を次の精製工程にかけ
る。洗浄したクリーム状の細胞濃縮物を蒸留水にて10
0g/lに調整し破砕用緩衝液として次の化合物を加え
る: トリス 12.1g/l ショ糖 100g/l 食塩 17.5g/l EDTA 1.86g/l チオシアン酸カリウム 291g/l pHを1NHClにて7.5〜8.0に調整し、この溶
液を5分間ホモジナイズし、そしてベットミルで細胞を
機械的に破壊する。細胞破砕物をHBsAgの安定性に
基づく極限のpH条件下にて清澄化操作を行い、その条
件下で数多くの宿主酵母由来の他の不純物蛋白質を沈殿
させる。一方抗原は溶液中に残留する。酸性pHでの他
の不純物蛋白質の沈殿化による破砕抽出物の清澄化は次
の方法で実行した。破砕細胞ホモジネートを攪拌しなが
ら、0〜4℃まで冷却し、pHを記録していく。そして
発泡をさけつつ4℃にて1NHCl溶液をpHが2.5
〜3になるのに十分な量を急速に加える。更に5分撹拌
を続けた後混合物を4℃に冷却し連続式の遠心分離機に
かける。遠心時間は45分間で、被検液の抽出容器及び
回収容器は冷却状態にしておく。遠心後直ちに上清を一
定に撹拌しpHを記録しながらpH7.5〜8.5にも
どす。清澄化した上清のpHを再び4.0に下げ、1k
gのセライト塊(High flow Super c
ell,Fluka)当りおよそ抗原0.35gを加え
て約1時間ホモジナイズする。抗原をセライト塊に吸着
させ、遠心、濾過又は傾斜法によりセライト塊と非吸着
物質を分け、非吸着分を廃棄する。次いでベッドに固定
された抗原を2〜3回次の組成の緩衝液で洗浄する: チオシアン酸カリウム 48.5g/l ショ糖 100g/l トリス 2.42g/l EDTA 1.86g/l pHは1NHClにて4.0に調整した。連続して洗浄
した後、セライト塊からの抗原の脱着を次の組成の溶出
用緩衝液を用いて行った。 トリス 2.42g/l EDTA 1.12g/l ショ糖 100g/l pHは1NNaOHにて9.0〜9.5に調整した。溶
出により得られる粗抗原を約55のファクターで初期容
量を濃縮するため、0.1μmのポアサイズのカートリ
ッジを有するAMICON型の濃縮機(中空繊維)に導
入する。この全操作は4℃で行った。得られたHBsA
gを完全に精製するために、数段階のクロマトグラフィ
ーを以下に述べるように実行した。濃縮セライト溶出物
の約2lを20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)で
膨潤、平衡化したセファデックス(Sephadex)
G−25のゲル濾過カラムで脱塩した。この過程は28
0nmにおける吸光度及び伝導率により制御される。C
NBrで活性化した約2lのセファロース(Sepha
rose)CL−4Bとそれに結合した約10gのモノ
クローナル抗体CB−HEP1(実施例4に従ってセン
トロ デインヘニエリア ヘネティカイ ビオテクノロ
ヒアで入手される)とからなるイミュノアフィニテイ吸
着剤を調製し、その特性により高免疫能を持つ抗原の選
別が可能となる。上記の吸着剤を充填したイミュノアフ
ィニテイカラムを20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.
0)で平衡化し、そのカラムにベッド1ml当りおよそ
0.1mgのHBsAgの比で抗原を含む多量の脱塩さ
れたセライト溶出液濃縮液を流した。流速は室温にて5
0cm/hとした。洗浄は平衡化に使用したのと同じも
ので行い、進行状況は280nmの吸収グラフを記録す
ることで行った。溶出液をその吸収がクロマトグラフの
ベースラインに一致するまで集め、それから20mMト
リス塩酸、1N食塩を含むpH8.0の緩衝液をその吸
収がベースラインに再び一致するまで流し、非特異的吸
着物を除去した。抗原は20mMトリス塩酸、3Mチオ
シアン酸カリウム、1M食塩を含むpH8.0の緩衝液
で溶出し、カラムを長時間使用しない場合はカラムを直
ちに4℃の0.01%チメロサール(thimeros
al)を含む過剰の平衡化用緩衝液で洗浄した。
【0030】アフィニティカラムから溶離したHBsA
gを37℃の水浴中にて2時間加熱する。後に抗原を2
0mMトリス塩酸、3mM EDTAを含むpH8.0
の緩衝液で平衡化したセファデックスG−25カラムに
流し脱塩した。20mMトリス塩酸、3mM EDTA
を含むpH8.0の緩衝液で平衡化したDEAEセルロ
ース(Whatman,DE−52)を含むカラムに約
31の脱塩したイミュノアフィニティカラムからの粗抗
原を流し、クロマト精製を4℃にて行った。次いで20
mMトリス塩酸、3mM EDTA、50mM食塩と
0.05%のデオキシコール酸ナトリウムを含む平衡化
緩衝液で洗浄した。工程は280nmの吸収グラフを記
録して制御した。溶出液は吸収値がベースラインに一致
するまで集めた。HBsAgは20mMトリス塩酸、3
mM EDTA、150mM食塩を含むpH8.0の緩
衝液を用いてカラムから溶離し、吸収値がベースライン
に一致するまで溶出液を集めた。以前のステップで述ベ
た如く、イオン交換カラムから得られるフラクションを
分画分子量100,000ダルトンのカートリッジを用
いるアミコン中空繊維システム(DC−2)で約25倍
まで濃縮した。次いでデオキシコール酸ナトリウムを
0.05g/100mlになるように濃縮液に加えた。
混合液を4℃にて1時間インキュベートし、次いでこの
フラクションを20mMトリス塩酸、3mMEDTA、
0.05%デオキシコール酸ナトリウムを含むpH8.
0の緩衝液で平衡化させたPWG6000カラムに流
す。同じ分子のモノマー又は二量体を含まない高度に粒
子状化した抗原を含む一つのピークが得られた。このフ
ラクションを回収し、pH7.0のPBS緩衝液にて平
衡化したセファデックスG−25カラムにて脱塩した。
この精製HBsAgの最終的な粗抗原を0.2μmのポ
アサイズの膜で無菌濾過し更に水酸化アルミニウムをア
ジュバントとして添加した。上に述べたように抗原は注
射可能な状態までに精製する必要があり、非経口投与用
組成物に要求される全ての厳格な基準に合致すべく考慮
され、そして相当する品質管理が行われる必要がある
(組換えDNA技術で作製されたB型肝炎ワクチンに対
する必要条件、世界保健機関による生物学的粗抗原N
o.45に対する必要条件、テクニカルリポートシリー
ズ、No.786、1989)。次に示す表に本発明の
目的であるHBsAgの精製工程で得られた結果がまと
められている。
gを37℃の水浴中にて2時間加熱する。後に抗原を2
0mMトリス塩酸、3mM EDTAを含むpH8.0
の緩衝液で平衡化したセファデックスG−25カラムに
流し脱塩した。20mMトリス塩酸、3mM EDTA
を含むpH8.0の緩衝液で平衡化したDEAEセルロ
ース(Whatman,DE−52)を含むカラムに約
31の脱塩したイミュノアフィニティカラムからの粗抗
原を流し、クロマト精製を4℃にて行った。次いで20
mMトリス塩酸、3mM EDTA、50mM食塩と
0.05%のデオキシコール酸ナトリウムを含む平衡化
緩衝液で洗浄した。工程は280nmの吸収グラフを記
録して制御した。溶出液は吸収値がベースラインに一致
するまで集めた。HBsAgは20mMトリス塩酸、3
mM EDTA、150mM食塩を含むpH8.0の緩
衝液を用いてカラムから溶離し、吸収値がベースライン
に一致するまで溶出液を集めた。以前のステップで述ベ
た如く、イオン交換カラムから得られるフラクションを
分画分子量100,000ダルトンのカートリッジを用
いるアミコン中空繊維システム(DC−2)で約25倍
まで濃縮した。次いでデオキシコール酸ナトリウムを
0.05g/100mlになるように濃縮液に加えた。
混合液を4℃にて1時間インキュベートし、次いでこの
フラクションを20mMトリス塩酸、3mMEDTA、
0.05%デオキシコール酸ナトリウムを含むpH8.
0の緩衝液で平衡化させたPWG6000カラムに流
す。同じ分子のモノマー又は二量体を含まない高度に粒
子状化した抗原を含む一つのピークが得られた。このフ
ラクションを回収し、pH7.0のPBS緩衝液にて平
衡化したセファデックスG−25カラムにて脱塩した。
この精製HBsAgの最終的な粗抗原を0.2μmのポ
アサイズの膜で無菌濾過し更に水酸化アルミニウムをア
ジュバントとして添加した。上に述べたように抗原は注
射可能な状態までに精製する必要があり、非経口投与用
組成物に要求される全ての厳格な基準に合致すべく考慮
され、そして相当する品質管理が行われる必要がある
(組換えDNA技術で作製されたB型肝炎ワクチンに対
する必要条件、世界保健機関による生物学的粗抗原N
o.45に対する必要条件、テクニカルリポートシリー
ズ、No.786、1989)。次に示す表に本発明の
目的であるHBsAgの精製工程で得られた結果がまと
められている。
【0031】実施例4 HBsAgに特異的なモノクローナル抗体(MAb)を
得るために、8週齢のBalb/c雄マウスを、ヒト血
漿から得た天然B型肝炎ウイルス表面抗原で免疫化した
(S.Krugman et al.,J.Am.Me
d.Assoc.,1971,217:41)。コーラ
ー(Kholer)(The Technic of
Hybridoma Production,Immu
nological Methods,1981,Vo
l.I,Academic Press,285−29
8)によって記載された基本原理に従って、ハイブリッ
ドの融合、培養、及び追跡を行った。50%ポリエチレ
ングリコール1500(BDH)を用いて10:1の比
率で脾臓細胞とミエローマ株SP2/0/Ag14とを
ハイフリダイズし、該細胞を1ml培地当リ100,0
00細胞、及び1ウェル当り100μlを、プレート上
の96ウェル(Costar)に接種した。用いた選択
的培養培地はRPMI1640(Gibco)であり、
この調製に際しては1g/1 NaHCO3、3μg/
1 HEPES、2mM L−グルタミン、1mMピル
ビン酸ナトリウム、0.05mM 2−メルカプトエタ
ノール、10%新生仔牛の血清、40μg/mlゲンタ
マイシン、及び3%ヒト内皮細胞培養上清(HECS)
を追加し(Astaldi et al.,Metho
ds of Enzymology,1983,Vo
l.XCΠ、ed.J.Langone,Academ
ic Press,39−46)、この調製物にヒポキ
サンチンを上限0.03mMまで、チミジンを3μMま
で、及びアミノプテリンを0.4μmまで加えた。培養
して3週目から、間接エリザ法を用いて上清液につい
て、HBsAgに特異な抗体を調べた。陽性反応を示し
たウェルのうち高反応値が反復分析試験で得られた理由
によりNo.48を選択し、稀釈度を制限して数回にわ
たリクローニング及び再クローニングを行った。最終ク
ローンとして以下の免疫化学上の特徴を有するモノクロ
ーナル抗体を分泌するところの48/1/5/4を選択
した。 ・該モノクローナル抗体は特異な方法で天然のHBsA
g及び酵母中で産生する組換えHBsAg(HBsAg
r)の両者を認識する。このことはエリザ法によって両
分子について証明されている。 ・該モノクローナル抗体は固体相(エリザ法)及び溶液
中のHBsAgrを認識する。溶液中のHBsAgrを
用いた先行インキュベーションにより、モノクローナル
抗体と固体相中のHBsAgrとの結合を阻害すること
が可能である。 ・コーティングとして幾つかの分子を用いたエリザ法に
よるアッセイでは交差反応はみられない。モノクローナ
ル抗体は又、ウェスタンブロット法により、HBsAg
rを産生する酵母を調製するためのHBsAgに対応す
るバンドを特異的に認識する。これによりこのモノクロ
ーナル抗体はHBsAgに非常に特異なものであり、認
識したエピトープは連続的なタイプであることが確認で
きる。 ・該モノクローナル抗体は国際基準と同様な方法でサブ
タイプay及びadを認識し、これにより、該抗体は総
てのウイルスのサブタイプに共通な決定子に対して作用
する、ということは明らかである。 ・本クローンに特異な特徴とは、本クローンがサブクラ
ス ガンマ2bとクラスMの2種類のH鎖を合成すると
いう事実である。このクローンによる形質転換細胞はゲ
ル濾過クロマトグラフィ(Sephacry1 S−3
00)により分離可能なクラスIgG 2bと五量体I
gM分子の両抗体を分泌する。このことは二重放射線状
免疫放散(O.Ouchterlony et a
l.,1973,Handbook of Exper
imental Immunology,vol・1:
19.1)及びポリアクリルアミドゲル電気泳動(N.
K.Laemmli,Nature,1970,22
7:680)によって立証されている。両抗体はHBs
Agに特異的であり、このことはマウスIgGとIgM
〔Sigma社(米国)製〕に特異な複合体を用い、エ
リザ法によって実証されている。 ・塗布されたPVCプレートの実験の結果は、モノクロ
ーナル抗体がHBsAgを効率的に捕捉することが可能
であるということを示している。高モル濃度のチオシア
ン酸ナトリウムを含有する溶液を用いることにより、H
BsAgを高率で連続的に抽出することができる。 ブタペスト条約に従ってこのハイブリドーマ細胞株を1
990年11月26日付で英国、サリスベリー市所在の
ヨーロピアン コレクション オブ アニマルセル カ
ルチャーズに寄託し、寄託番号ECACC 90 11
2 606を得た。
得るために、8週齢のBalb/c雄マウスを、ヒト血
漿から得た天然B型肝炎ウイルス表面抗原で免疫化した
(S.Krugman et al.,J.Am.Me
d.Assoc.,1971,217:41)。コーラ
ー(Kholer)(The Technic of
Hybridoma Production,Immu
nological Methods,1981,Vo
l.I,Academic Press,285−29
8)によって記載された基本原理に従って、ハイブリッ
ドの融合、培養、及び追跡を行った。50%ポリエチレ
ングリコール1500(BDH)を用いて10:1の比
率で脾臓細胞とミエローマ株SP2/0/Ag14とを
ハイフリダイズし、該細胞を1ml培地当リ100,0
00細胞、及び1ウェル当り100μlを、プレート上
の96ウェル(Costar)に接種した。用いた選択
的培養培地はRPMI1640(Gibco)であり、
この調製に際しては1g/1 NaHCO3、3μg/
1 HEPES、2mM L−グルタミン、1mMピル
ビン酸ナトリウム、0.05mM 2−メルカプトエタ
ノール、10%新生仔牛の血清、40μg/mlゲンタ
マイシン、及び3%ヒト内皮細胞培養上清(HECS)
を追加し(Astaldi et al.,Metho
ds of Enzymology,1983,Vo
l.XCΠ、ed.J.Langone,Academ
ic Press,39−46)、この調製物にヒポキ
サンチンを上限0.03mMまで、チミジンを3μMま
で、及びアミノプテリンを0.4μmまで加えた。培養
して3週目から、間接エリザ法を用いて上清液につい
て、HBsAgに特異な抗体を調べた。陽性反応を示し
たウェルのうち高反応値が反復分析試験で得られた理由
によりNo.48を選択し、稀釈度を制限して数回にわ
たリクローニング及び再クローニングを行った。最終ク
ローンとして以下の免疫化学上の特徴を有するモノクロ
ーナル抗体を分泌するところの48/1/5/4を選択
した。 ・該モノクローナル抗体は特異な方法で天然のHBsA
g及び酵母中で産生する組換えHBsAg(HBsAg
r)の両者を認識する。このことはエリザ法によって両
分子について証明されている。 ・該モノクローナル抗体は固体相(エリザ法)及び溶液
中のHBsAgrを認識する。溶液中のHBsAgrを
用いた先行インキュベーションにより、モノクローナル
抗体と固体相中のHBsAgrとの結合を阻害すること
が可能である。 ・コーティングとして幾つかの分子を用いたエリザ法に
よるアッセイでは交差反応はみられない。モノクローナ
ル抗体は又、ウェスタンブロット法により、HBsAg
rを産生する酵母を調製するためのHBsAgに対応す
るバンドを特異的に認識する。これによりこのモノクロ
ーナル抗体はHBsAgに非常に特異なものであり、認
識したエピトープは連続的なタイプであることが確認で
きる。 ・該モノクローナル抗体は国際基準と同様な方法でサブ
タイプay及びadを認識し、これにより、該抗体は総
てのウイルスのサブタイプに共通な決定子に対して作用
する、ということは明らかである。 ・本クローンに特異な特徴とは、本クローンがサブクラ
ス ガンマ2bとクラスMの2種類のH鎖を合成すると
いう事実である。このクローンによる形質転換細胞はゲ
ル濾過クロマトグラフィ(Sephacry1 S−3
00)により分離可能なクラスIgG 2bと五量体I
gM分子の両抗体を分泌する。このことは二重放射線状
免疫放散(O.Ouchterlony et a
l.,1973,Handbook of Exper
imental Immunology,vol・1:
19.1)及びポリアクリルアミドゲル電気泳動(N.
K.Laemmli,Nature,1970,22
7:680)によって立証されている。両抗体はHBs
Agに特異的であり、このことはマウスIgGとIgM
〔Sigma社(米国)製〕に特異な複合体を用い、エ
リザ法によって実証されている。 ・塗布されたPVCプレートの実験の結果は、モノクロ
ーナル抗体がHBsAgを効率的に捕捉することが可能
であるということを示している。高モル濃度のチオシア
ン酸ナトリウムを含有する溶液を用いることにより、H
BsAgを高率で連続的に抽出することができる。 ブタペスト条約に従ってこのハイブリドーマ細胞株を1
990年11月26日付で英国、サリスベリー市所在の
ヨーロピアン コレクション オブ アニマルセル カ
ルチャーズに寄託し、寄託番号ECACC 90 11
2 606を得た。
【0032】このモノクローナル抗体を産生するため
に、前もって10日前に同様の方法でミネラルオイルを
注入してあるBalb/cマウスの腹腔に300万のハ
イブリッド細胞を接種した後、該抗体の純調製物を抽出
した腹水から得た。繰返し穿刺して回収した腹水を50
0gで遠心分離にかけ、1:1のクロロホルムで脱脂
し、食塩加リン酸緩衝液(PBS)で透析した。精製の
目的で4℃にて2時間50%NH2SO4を用いて抗体
を沈殿させ、4000rpmにて30分間遠心分離にか
け、同じ濃度のNH2SO4で沈殿物を更に2回洗浄
し、Sephadex G−25〔Pharmacia
社(スウェーデン)製〕中で脱塩した。脱塩試料をアフ
ィニティクロマトグラフィにより蛋白質Aセファロース
CL4B(Pharmacia社製)中にて分画した。
これらの機器の製造者による指示は以下の通りである。
臭化シアンにより活性化したセファロースCL4Bの吸
着剤に精製抗体を結合させる。1mlのゲル当り5mg
のモノクローナル抗体を用いる。
に、前もって10日前に同様の方法でミネラルオイルを
注入してあるBalb/cマウスの腹腔に300万のハ
イブリッド細胞を接種した後、該抗体の純調製物を抽出
した腹水から得た。繰返し穿刺して回収した腹水を50
0gで遠心分離にかけ、1:1のクロロホルムで脱脂
し、食塩加リン酸緩衝液(PBS)で透析した。精製の
目的で4℃にて2時間50%NH2SO4を用いて抗体
を沈殿させ、4000rpmにて30分間遠心分離にか
け、同じ濃度のNH2SO4で沈殿物を更に2回洗浄
し、Sephadex G−25〔Pharmacia
社(スウェーデン)製〕中で脱塩した。脱塩試料をアフ
ィニティクロマトグラフィにより蛋白質Aセファロース
CL4B(Pharmacia社製)中にて分画した。
これらの機器の製造者による指示は以下の通りである。
臭化シアンにより活性化したセファロースCL4Bの吸
着剤に精製抗体を結合させる。1mlのゲル当り5mg
のモノクローナル抗体を用いる。
【0033】実施例5 精製された組換え抗原から高均一性と高粒子度を有する
ワクチン組成物を得るために、該組換え抗原を無菌水酸
化アルミニウム溶液と混合した。この製法に従って該産
生物の特徴を調べるのに必要な試験を行う目的で、数個
のバッチを調製した。これらの調製物の3つの連続した
バッチの評価において得られた結果を詳述する。
ワクチン組成物を得るために、該組換え抗原を無菌水酸
化アルミニウム溶液と混合した。この製法に従って該産
生物の特徴を調べるのに必要な試験を行う目的で、数個
のバッチを調製した。これらの調製物の3つの連続した
バッチの評価において得られた結果を詳述する。
【0034】実施例6 上記実施例記載のように、酵母菌由来組換DNAによっ
て得られたHBsAgの免疫原性を調査するために、こ
の製剤が非経口投与を人間に行うための規程の必要条件
(組換DNA技術によって作製されたB型肝炎ワクチン
の必要条件、世界健康機関による生物学的粗抗原No.
45に対する必要条件、テクニカルポートシリーズ、N
o.786,1989)を満たしている事を明示した上
で、前臨床試験として有志のグループに接種した。実験
記録を作成したキューバの厚生省がこの目的の為に発足
させた評価委員会によってこの調査は行われ、この委員
会は概略では下記のような結果レポートを発行してい
る:キューバ厚生省発足のB型肝炎に対するキューバ組
換えワクチン評価委員会は、酵母におけるHBsAgの
組換えDNA(rec−HBsAg)由来のキューバワ
クチンの接種原性の評価のためのプロトタイプ フェー
ズΠの完全な最終レポートを作成している。レポートの
内容を要約すると、約100ヶ国で承認され登録されて
いる同一タイプの市販されているワクチン〔スミス ク
ライン(Smith & Kline)〕とキューバr
ec−HBsAgワクチンの効果を比較するたに、典型
的な二重盲検試験が行われている。この調査に任意で参
加したという同意の記録として書類に署名をした総勢1
23人のうち、35人が様々の理由で除外され、アミノ
基転移酵素の正常な価(ALT)を示し、ウイルスのマ
ーカー(HBsAg, HBeAg, 抗HBsAg及
び抗HBcAg)を含まない、臨床検査で健康体とされ
た88人が選ばれた。年齢20〜34才の成年男女の試
料採取者を一様にに31人、30人、及び27人からな
る3グループに分け、3回の接種(水酸化アルミニウム
に吸着された抗原 1ml)、つまり、あるグループは
20μgのキューバワクチン(CV20)を、又あるグ
ループは10μgキューバワクチン(CV10)を、又
残リのグループは20μgの市販ワクチン(スミス ク
ライン)を各々0日、30日後及び60日後の3回の接
種を行った。同じ日の接種前に血液サンプルを採取し、
接種途中15目目、及び接種完了後の、接種後75日
目、90日目にも血液サンプルを採取した。グループ全
員の45%に皮下接種を行い、残りは筋肉内接種(三角
筋)を行ったが、年齢、性別及び接種方法はそれ程違わ
ないようにした。ワクチン接種の全スケジュールを完了
した90日後、CV20woを接種した31人のうち2
9人が免疫された。検査を受けた全員が、認知された最
少感染防御接種レベル(MPL)の10IU/lよりも
大きな抗体力価を示した。相乗平均力価(GMT)は2
39.9IU/lであった。CV10を接種した30人
のうち26人が免疫され、検査された。全員が上記MP
L値より大きな抗体力価を示し、上記GMT値が21
8.4IU/lであった。一方SK20を接種した27
人のうち26人が免疫され、検査された。このうち23
人(88.5%)がGMT値43.9IU/lという抗
体力価を示したが、MPL値を越えたのは21人のみ
(80.8%)であった。接種後90日後の結果と75
日目(3回目の投与の15日後)を比較してみると、キ
ューバワクチンCV20とCV10の両方は血清変換の
最大率(100%)を保持しており上記MPL値より大
きな力価で免疫された人は100%迄増加してた。一方
SK20で免疫された人は96.3%から88.5%に
減っているが、上記MPL値より大きな力価で免疫され
た人は74.4%から88.8%に増加している。これ
らのデータは二つのキューバワクチン組成物よりも、S
K20がかなり劣る事を示している。従って、81人の
ワクチン接種を受け検査され、ワクチン接種の全てのス
ケジュールを完了した人々(最初に接種された人のうち
92%)のうち、78人(96.3%)に血清変換が認
められた。この78人のうち、どちらかのキューバワク
チンを接種した55人が全てMPL値よりも大きな抗体
力価を示し、一方、市販のワクチン(スミス クライ
ン)を接種した23人(88.5%)の中の21人(8
0.8%)がMPL値よりも大きな抗体力価を示した。
従って、キューバワクチンに有利なこれらの結果に基づ
いて、この調査を上記したような方法で選定し、異なる
機関で集められた多数のグループに迄広げることを決定
した。このフェーズΠ臨床試験から得た結果を図11、
図12に要約して記載してある。これらの図により、皮
下接種及び筋内接種による接種処置を行うと、両ワクチ
ン組成物(キューバワクチン及びスミス クラインワク
チン)への応答レベルがわかる。
て得られたHBsAgの免疫原性を調査するために、こ
の製剤が非経口投与を人間に行うための規程の必要条件
(組換DNA技術によって作製されたB型肝炎ワクチン
の必要条件、世界健康機関による生物学的粗抗原No.
45に対する必要条件、テクニカルポートシリーズ、N
o.786,1989)を満たしている事を明示した上
で、前臨床試験として有志のグループに接種した。実験
記録を作成したキューバの厚生省がこの目的の為に発足
させた評価委員会によってこの調査は行われ、この委員
会は概略では下記のような結果レポートを発行してい
る:キューバ厚生省発足のB型肝炎に対するキューバ組
換えワクチン評価委員会は、酵母におけるHBsAgの
組換えDNA(rec−HBsAg)由来のキューバワ
クチンの接種原性の評価のためのプロトタイプ フェー
ズΠの完全な最終レポートを作成している。レポートの
内容を要約すると、約100ヶ国で承認され登録されて
いる同一タイプの市販されているワクチン〔スミス ク
ライン(Smith & Kline)〕とキューバr
ec−HBsAgワクチンの効果を比較するたに、典型
的な二重盲検試験が行われている。この調査に任意で参
加したという同意の記録として書類に署名をした総勢1
23人のうち、35人が様々の理由で除外され、アミノ
基転移酵素の正常な価(ALT)を示し、ウイルスのマ
ーカー(HBsAg, HBeAg, 抗HBsAg及
び抗HBcAg)を含まない、臨床検査で健康体とされ
た88人が選ばれた。年齢20〜34才の成年男女の試
料採取者を一様にに31人、30人、及び27人からな
る3グループに分け、3回の接種(水酸化アルミニウム
に吸着された抗原 1ml)、つまり、あるグループは
20μgのキューバワクチン(CV20)を、又あるグ
ループは10μgキューバワクチン(CV10)を、又
残リのグループは20μgの市販ワクチン(スミス ク
ライン)を各々0日、30日後及び60日後の3回の接
種を行った。同じ日の接種前に血液サンプルを採取し、
接種途中15目目、及び接種完了後の、接種後75日
目、90日目にも血液サンプルを採取した。グループ全
員の45%に皮下接種を行い、残りは筋肉内接種(三角
筋)を行ったが、年齢、性別及び接種方法はそれ程違わ
ないようにした。ワクチン接種の全スケジュールを完了
した90日後、CV20woを接種した31人のうち2
9人が免疫された。検査を受けた全員が、認知された最
少感染防御接種レベル(MPL)の10IU/lよりも
大きな抗体力価を示した。相乗平均力価(GMT)は2
39.9IU/lであった。CV10を接種した30人
のうち26人が免疫され、検査された。全員が上記MP
L値より大きな抗体力価を示し、上記GMT値が21
8.4IU/lであった。一方SK20を接種した27
人のうち26人が免疫され、検査された。このうち23
人(88.5%)がGMT値43.9IU/lという抗
体力価を示したが、MPL値を越えたのは21人のみ
(80.8%)であった。接種後90日後の結果と75
日目(3回目の投与の15日後)を比較してみると、キ
ューバワクチンCV20とCV10の両方は血清変換の
最大率(100%)を保持しており上記MPL値より大
きな力価で免疫された人は100%迄増加してた。一方
SK20で免疫された人は96.3%から88.5%に
減っているが、上記MPL値より大きな力価で免疫され
た人は74.4%から88.8%に増加している。これ
らのデータは二つのキューバワクチン組成物よりも、S
K20がかなり劣る事を示している。従って、81人の
ワクチン接種を受け検査され、ワクチン接種の全てのス
ケジュールを完了した人々(最初に接種された人のうち
92%)のうち、78人(96.3%)に血清変換が認
められた。この78人のうち、どちらかのキューバワク
チンを接種した55人が全てMPL値よりも大きな抗体
力価を示し、一方、市販のワクチン(スミス クライ
ン)を接種した23人(88.5%)の中の21人(8
0.8%)がMPL値よりも大きな抗体力価を示した。
従って、キューバワクチンに有利なこれらの結果に基づ
いて、この調査を上記したような方法で選定し、異なる
機関で集められた多数のグループに迄広げることを決定
した。このフェーズΠ臨床試験から得た結果を図11、
図12に要約して記載してある。これらの図により、皮
下接種及び筋内接種による接種処置を行うと、両ワクチ
ン組成物(キューバワクチン及びスミス クラインワク
チン)への応答レベルがわかる。
【0035】
【発明の効果】本発明の方法により、非常に純粋で均質
な粒子状で高い免疫原性を有するB型肝炎ウイルス組換
え表面抗原を高収率で取得することができる。又、該抗
原を有効成分とするB型肝炎ウイルスワクチン組成物
は、哺乳動物、特に人間に対して有効である。
な粒子状で高い免疫原性を有するB型肝炎ウイルス組換
え表面抗原を高収率で取得することができる。又、該抗
原を有効成分とするB型肝炎ウイルスワクチン組成物
は、哺乳動物、特に人間に対して有効である。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、サッカロミセス セレビシエの酵素G
AP遺伝子の転写制御シグナルを含む、NcoIで開環
しS1ヌクレアーゼとアルカリ ホスファターゼ処理し
たHBsAg遺伝子サブクローニング用プラスミドpB
S5を示す。略号B、NおよびSは、それぞれBamH
I、NcolおよびSalIの切断部位を示す。
AP遺伝子の転写制御シグナルを含む、NcoIで開環
しS1ヌクレアーゼとアルカリ ホスファターゼ処理し
たHBsAg遺伝子サブクローニング用プラスミドpB
S5を示す。略号B、NおよびSは、それぞれBamH
I、NcolおよびSalIの切断部位を示す。
【図2】図2は、HBsAg遺伝子をpBS5に組み込
んだHBsAg遺伝子サブクローニング用プラスミドp
PCA3を示す。
んだHBsAg遺伝子サブクローニング用プラスミドp
PCA3を示す。
【図3】図3は、pPCA3においてHBsAg遺伝子
の5’末端と3’末端のノンコーディング領域を除去し
たHBsAg遺伝子サブクローニング用プラスミドpP
CB6を示す。
の5’末端と3’末端のノンコーディング領域を除去し
たHBsAg遺伝子サブクローニング用プラスミドpP
CB6を示す。
【図4】図4は、ピヒア パストリス染色体の遺伝子ラ
イブラリーから得られるプラスミドpCAO10を示
す。略号E1、EVおよびBgIIは、それぞれEco
RI、EcoRVおよびBglIIの切断部位を示す。
イブラリーから得られるプラスミドpCAO10を示
す。略号E1、EVおよびBgIIは、それぞれEco
RI、EcoRVおよびBglIIの切断部位を示す。
【図5】図5は、酵素AOX1遺伝子のプロモーターと
5’末端のノンコーデイング領域を含む断片をプラスミ
ドpBR322にサブクローニングして得られるプラス
ミドpPAO23を示す。略号CはClaIの切断部位
を示す。
5’末端のノンコーデイング領域を含む断片をプラスミ
ドpBR322にサブクローニングして得られるプラス
ミドpPAO23を示す。略号CはClaIの切断部位
を示す。
【図6】図6はpPAO23に含まれる酵素AOX1遺
伝子の5’末端と3’末端に合成オリゴヌクレオチドを
結合して得られるプラスミドpMAO107を示す。
伝子の5’末端と3’末端に合成オリゴヌクレオチドを
結合して得られるプラスミドpMAO107を示す。
【図7】図7は、酵素AOX1のプロモーターの支配下
でHBsAg遺伝子をサブクローニングして得られるプ
ラスミドpHAO112の構築の順序を示す。
でHBsAg遺伝子をサブクローニングして得られるプ
ラスミドpHAO112の構築の順序を示す。
【図8】図8は、pHAO112にAOX1の3’末端
ノンコーディング領域をサブクローニングして得られる
プラスミドpVAO721の構築の順序を示す。略号C
IPは子牛腸内ホスファターゼを示す。
ノンコーディング領域をサブクローニングして得られる
プラスミドpVAO721の構築の順序を示す。略号C
IPは子牛腸内ホスファターゼを示す。
【図9】図9は、サッカロミセス セレビシエのhis
3遺伝子を含むプラスミドpPMCを示す。
3遺伝子を含むプラスミドpPMCを示す。
【図10】図10は、pVAO721にサッカロミセス
セレビシエのhis3遺伝子を含む断片をクローニン
グして得られるHBsAg遺伝子発現用プラスミドpT
AO906を示す。
セレビシエのhis3遺伝子を含む断片をクローニン
グして得られるHBsAg遺伝子発現用プラスミドpT
AO906を示す。
【図11】図11は、二つの機関の各グループについ
て、キューバワクチン20μgと10μg、およびスミ
ス クラインワクチン20μgをそれぞれ接種して90
日目に測定した免疫原性の比較のグラフを示す。
て、キューバワクチン20μgと10μg、およびスミ
ス クラインワクチン20μgをそれぞれ接種して90
日目に測定した免疫原性の比較のグラフを示す。
【図12】図12は、五つの機関の各グループについ
て、キューバワクチン20μgと10μg、およびスミ
ス クラインワクチン20μgを接種して90日目に測
定した免疫原性の比較のグラフを示す。
て、キューバワクチン20μgと10μg、およびスミ
ス クラインワクチン20μgを接種して90日目に測
定した免疫原性の比較のグラフを示す。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 // A61K 39/395 S 8413−4C (72)発明者 エデユアルド ペントン アリアズ キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、 エントレ 33 イ 35、カツレ30、 3303 (72)発明者 マニユエル パロウ ガルシア キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、プラザ デ ラ レボルシオン、ベダ ド、アプト 6 エントレ パセオ イ アー、カツレ 5タ、435 (72)発明者 ギウベル フオンテイロツシイ エスコバ ール キユーバ国、カマギユーエイ、 エデン、 エントレ 1ラ イ 2ダ カツレ サル ジエント オリベラ、86、 (72)発明者 マルセロ ナザバール ガルベス キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、マリアナーオ、 エントレ ヘレラ イ ポラール、アベ 51、31 (72)発明者 マルタ デ ヘサス ゴンザレス グリエ ゴ キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、プラザデ ラ レボルシオン、ベダ ド、エントレ 4 イ 6、カツレ 17、 557 (72)発明者 アレジヤンドロ ベルダレイン イズナガ キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、 マリアナーオ、サンタ フエリシ ア、エントレ 49 イ 51、アプト5、カ ツレ76、4902 (72)発明者 グイレルモ ジユリオ パドロン ゴンザ レス キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、 キユーバナカン、エント レ アベ 31 イ 33、カツレ 184、 3112 (72)発明者 ヴイクトリア ラミレス アルヴエイジ キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、プラザデ ラ レボルシオン、ベダ ド、エントレ 4 イ 6、カツレ ア ー、85 (72)発明者 アルナルド ガルシア ペーニヤ キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、キユーバナカン、エントレ 31 イ 33、カツレ 184、3112 (72)発明者 カルロス エンリツク ルイーズ クルス キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、マリアナーオ、 エントレ 104 イ 106、アベ 39、10410 (72)発明者 グラデイス マベール イズケルド ロペ ス キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、10 デ オクテユーブレ、ビボラ、エ ントレ ゲルトルデイス イ ホセフイー ナ、カツレ ゲラベツト、160 (72)発明者 ルイース サトウルニノ ヘレーラ マル テイネス キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、 カツレ 96 エントレ、 3アー イ 3アー アー (72)発明者 カルロス アントニオ デユアルト カノ キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、セントル ハバナ、エントレ キユー ベイ サン イグナシオ、アプト 19、カ ツレエンペドラド、211 (72)発明者 リリア ルイーザ ペレス スアレス キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、ブラーヤ、キユーバナカン、エントレ 31 イ 33、カツレ 184 3112 (72)発明者 ホセ ガルシア カバレロ キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、サン ミゲル デル パドロン、エン トレ 1ラ イ サン アントニオ カロ リーナ、 ラケル、20905 (72)発明者 グスタボ アルベルト デ ラ リバ デ ラ リバ キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、ビボラ、エントレ デストランペス イ ゴイキユリア、アプト シー、コヌ コ、82 (72)発明者 アレクシス エス ムサツチーノ ラサ キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、マリエール、エントレ 71 イ 73、 カツレ 128、7117
Claims (21)
- 【請求項1】 B型肝炎ウイルス表面抗原をコードする
遺伝子を含有しそして該遺伝子を発現してなるピヒア
パストリス細胞からB型肝炎ウイルス表面抗原を取得す
る方法にして、 (1)カオトロピック剤、スクロースおよびエチレンジ
アミン四酢酸を含む緩衝液の存在下で上記ピヒア パス
トリス細胞を溶菌し、 (2)不純物を酸性pH領域で沈殿させて粗抗原を得、 (3)該粗抗原を酸性下でケイソウ土塊に吸着させ、次
にアルカリ性下で脱着し、 (4)脱着された粗抗原をB型肝炎ウイルス表面抗原に
特異的なモノクローナル抗体を用いるイミュノアフィニ
ティークロマトグラフィーにかけ、 (5)得られる溶出抗原を30〜40℃の温度での熱処
理にかけ、 (6)陰イオン交換カラムで抗原を洗剤により洗浄し、
そして (7)得られる溶出抗原を洗剤の存在下で高速液体クロ
マトグラフィーにかける、ことを包含する方法。 - 【請求項2】 工程(1)での上記ピヒア パストリス
細胞の溶菌を、チオシアン酸カリウム、スクロース、エ
チレンジアミン四酢酸、トリスおよび食塩からなる緩衝
液の存在下で行なう請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 工程(1)での上記ピヒア パストリス
細胞の溶菌を、1〜4Mチオシアン酸カリウム、1〜1
5%(w/v)スクロース、2.5〜3.5mMエチレ
ンジアミン四酢酸、10〜30mMトリスおよび0.1
〜1M食塩よりなる緩衝液の存在下で行なう請求項2に
記載の方法。 - 【請求項4】 工程(2)での酸性下で不純物の沈殿を
pH3〜4の条件下で行なう請求項1に記載の方法。 - 【請求項5】 工程(2)で形成される沈殿物を除去し
て得られる粗抗原をpH7〜8の条件下で保存する請求
項1に記載の方法。 - 【請求項6】 工程(2)で形成される沈殿物を除去し
て得られる粗抗原を、工程(3)においてpH3〜5の
条件下でケイソウ土塊と接触させて抗原を吸着させ、そ
してpH3〜5の溶出緩衝液で不純物を溶出させ、次い
でpH7.5〜 9.0で抗原を脱着する請求項1に記
載の方法。 - 【請求項7】 工程(3)においてケイソウ土から脱着
された粗抗原を限外濾過によって濃縮し、そして透析濾
過によって脱塩する請求項1に記載の方法。 - 【請求項8】 工程(4)において粗抗原のイミュノア
フィニティークロマトグラフィー処理に用いられるモノ
クローナル抗体が、抗原性B型肝炎ウイルス表面抗原粒
子に対する高い親和性で選ばれるモノクローナル抗体で
ある請求項1に記載の方法。 - 【請求項9】 工程(4)において粗抗原のイミュノア
フィニティークロマトグラフィー処理に用いられるモノ
クローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞ECACC 9
0 112 606によって産生される抗HBsAg
CB−HEP1である請求項1に記載の方法。 - 【請求項10】 工程(4)において、イミュノアフィ
ニティークロマトグラフィーカラムから抗原をカオトロ
ピック剤を含有する緩衝液で溶出する請求項1に記載の
方法。 - 【請求項11】 工程(5)において、30〜40℃で
の溶出抗原の熱処理を1〜6時間行なう請求項1に記載
の方法。 - 【請求項12】 工程(6)において、DEAEセルロ
ースカラムで抗原をデオキシコール酸ナトリウムおよび
トリトン(Triton)X−100より選ばれる洗剤
によって洗浄する請求項1に記載の方法。 - 【請求項13】 工程(6)において、陰イオンカラム
で抗原を0.01〜0.5重量%の濃度の洗剤により洗
浄する請求項13に記載の方法。 - 【請求項14】 工程(7)において、溶出抗原を、デ
オキシコール酸ナトリウムのような洗剤の存在下で、分
画分子量が20,000〜10,000,000の間に
ある高速液体クロマトグラフィーにかける請求項1に記
載の方法。 - 【請求項15】 工程(7)において、0.01〜0.
5重量%の濃度の洗剤の存在下で抗原を高速クロマトグ
ラフィーにかける請求項1に記載の方法。 - 【請求項16】 B型肝炎ウイルス表面抗原を、組換え
ピヒア パストリス株C226〔pTAO906〕、C
BS450.90から回収する請求項1に記載の方法。 - 【請求項17】 組換えピヒア パストリス株C226
〔pTAO906〕、CBS450.90。 - 【請求項18】 ハイブリドーマ細胞ECACC 90
112 606。 - 【請求項19】 ハイブリドーマ細胞ECACC 90
112 606により産生される抗HBsAg CB
−HEP1モノクローナル抗体。 - 【請求項20】 請求項1〜16のいずれかの方法によ
り得ることのできる組換えB型肝炎ウイルス表面抗原。 - 【請求項21】 請求項1〜16のいずれかの方法によ
り得ることのできる組換えB型肝炎ウイルス表面抗原の
予防免疫量と、ワクチン組成物に使用するのに適した少
くとも1種の担体、稀釈剤またはアジュバントを包含し
てなるB型肝炎ウイルスワクチン組成物。
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