JPH0576370A - 高免疫能を有するｂ型肝炎ウイルス組換え表面抗原の取得方法、およびｂ型肝炎ウイルスワクチン組成物 - Google Patents
高免疫能を有するｂ型肝炎ウイルス組換え表面抗原の取得方法、およびｂ型肝炎ウイルスワクチン組成物Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原をコードする遺
伝子を含有しそして該遺伝子を発現させてなるピヒア
パストリス細胞から、該表面抗原を、非常に純粋で均質
な粒子状で高い免疫原性を有するＨＢｓＡｇとして高収
率で得る方法を提供することを目的とする。 【構成】 本発明の方法は、発現されたＢ型肝炎ウイ
ルス表面抗原を含有する上記ピヒア パストリス細胞を
特定の援衝液で溶菌し、不純物を沈殿で除去し、次いで
得られる粗抗原をケイソウ土をもちいる吸着脱着、更に
イミュノアフィニティークロマトグラフィーによる処
理、熱処理、陰イオン交換カラムでの洗剤による処理、
および高速液体クロマトグラフィーでの洗剤処理にかけ
て精製する多段式精製法である。
伝子を含有しそして該遺伝子を発現させてなるピヒア
パストリス細胞から、該表面抗原を、非常に純粋で均質
な粒子状で高い免疫原性を有するＨＢｓＡｇとして高収
率で得る方法を提供することを目的とする。 【構成】 本発明の方法は、発現されたＢ型肝炎ウイ
ルス表面抗原を含有する上記ピヒア パストリス細胞を
特定の援衝液で溶菌し、不純物を沈殿で除去し、次いで
得られる粗抗原をケイソウ土をもちいる吸着脱着、更に
イミュノアフィニティークロマトグラフィーによる処
理、熱処理、陰イオン交換カラムでの洗剤による処理、
および高速液体クロマトグラフィーでの洗剤処理にかけ
て精製する多段式精製法である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子工学および生物工
学の分野のものである。更に詳細には、高免疫能を有す
るＢ型肝炎ウイルス組換え表面抗原の取得方法、および
Ｂ型肝炎ウイルスワクチン組成物に関するものである。
Ｂ型肝炎ウイルスの感染は急性肝疾患のみならずこれが
進行した肝硬変、肝不全および肝細胞癌などの慢性疾患
を生じるため、その予防は世界規模での重大な健康上の
課題である。この感染病原体の主な保有者であるＢ型肝
炎ウイルスの慢性的なキャリアーは世界各地に約２億人
存在する。現状ではＢ型肝炎ウイルス感染に対する有効
な治療法がないため、その予防のみがその伝播および感
染率を減少させる手段である。
学の分野のものである。更に詳細には、高免疫能を有す
るＢ型肝炎ウイルス組換え表面抗原の取得方法、および
Ｂ型肝炎ウイルスワクチン組成物に関するものである。
Ｂ型肝炎ウイルスの感染は急性肝疾患のみならずこれが
進行した肝硬変、肝不全および肝細胞癌などの慢性疾患
を生じるため、その予防は世界規模での重大な健康上の
課題である。この感染病原体の主な保有者であるＢ型肝
炎ウイルスの慢性的なキャリアーは世界各地に約２億人
存在する。現状ではＢ型肝炎ウイルス感染に対する有効
な治療法がないため、その予防のみがその伝播および感
染率を減少させる手段である。
【０００２】
【従来の技術】Ｂ型肝炎ウイルスワクチンには、大別し
て血清由来のものと遺伝子工学技術により得られるもの
の２種がある。血清由来のワクチンは、該ウイルスの慢
性キャリアー由来の血清中のＢ型肝炎ウイルス表面抗原
（以下ＨＢｓＡｇと略す）を多様な物理的手法で精製し
不活化することにより得られる（Ａ．Ｊ．Ｚｕｃｋｅｒ
ｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａ
ｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９８５，２９０：４９２）。こ
れらのワクチンは長年にわたってその有効性と安全性が
実証されており（Ａ．Ｍ．Ｐｒｉｎｃｅ ｅｔ ａ
ｌ．，ＡｎｎｕａｌＣｌｉｎｉｃａ１ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ，１９８２，１４：２２５）、ヒト免疫不全ウイルス
または他の感染病原体の伝染の危険性も伴わない（Ｆ．
Ｄｅｉｎｈａｒｄｔ ｅｔ ａ１．，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏ１ｏｇｙ，１９８５，
１７：２０９）。しかし、これらのワクチンの広範な使
用は、ワクチン製造に用いるＢ型肝炎ウイルス表面抗原
を得るためのＢ型肝炎ウイルスのキャリアー血清の入
手、およびワクチンの精製、Ｂ型肝炎ウイルスの不活化
また血漿中に存在する他の感染病原体の除去という厳密
な操作や、ワクチンのバッチの通関手続きに必要な長期
にわたる安全性試験によって制限される。更に、血液伝
播による疾患を生じる感染病原体がワクチン作製におけ
る不活化処理から免れる恐れがあるため、一般に血液由
来産物を遺伝子工学技術により得られるものと置き換え
る傾向がある。
て血清由来のものと遺伝子工学技術により得られるもの
の２種がある。血清由来のワクチンは、該ウイルスの慢
性キャリアー由来の血清中のＢ型肝炎ウイルス表面抗原
（以下ＨＢｓＡｇと略す）を多様な物理的手法で精製し
不活化することにより得られる（Ａ．Ｊ．Ｚｕｃｋｅｒ
ｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａ
ｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９８５，２９０：４９２）。こ
れらのワクチンは長年にわたってその有効性と安全性が
実証されており（Ａ．Ｍ．Ｐｒｉｎｃｅ ｅｔ ａ
ｌ．，ＡｎｎｕａｌＣｌｉｎｉｃａ１ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ，１９８２，１４：２２５）、ヒト免疫不全ウイルス
または他の感染病原体の伝染の危険性も伴わない（Ｆ．
Ｄｅｉｎｈａｒｄｔ ｅｔ ａ１．，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏ１ｏｇｙ，１９８５，
１７：２０９）。しかし、これらのワクチンの広範な使
用は、ワクチン製造に用いるＢ型肝炎ウイルス表面抗原
を得るためのＢ型肝炎ウイルスのキャリアー血清の入
手、およびワクチンの精製、Ｂ型肝炎ウイルスの不活化
また血漿中に存在する他の感染病原体の除去という厳密
な操作や、ワクチンのバッチの通関手続きに必要な長期
にわたる安全性試験によって制限される。更に、血液伝
播による疾患を生じる感染病原体がワクチン作製におけ
る不活化処理から免れる恐れがあるため、一般に血液由
来産物を遺伝子工学技術により得られるものと置き換え
る傾向がある。
【０００３】ＨＢｓＡｇ遺伝子は、真核細胞や原核細胞
内でクローニングし発現される。原核生物である細菌の
場合は得られる発現レベルが低く、直径２２ｎｍの免疫
原粒子中へのＨＢｓＡｇの効率的な導入が起こらないた
め、ワクチン製造に必要な抗原供給源としては原核生物
は用いられていない（Ｐ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８０，２８０：８１５；
Ｃ．Ｊ．Ｂｕｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ，１９７９，２７９：４３）。ー方、真核生物細胞も
ＨＢｓＡｇの産生に使用されているが（Ｍ．Ｌ．Ｍｉｃ
ｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
１９８５，３：５６１；Ｇ．Ｍ．ＭａｃＮａｂ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａ１ｏｆ Ｃａｎ
ｃｅｒ，１９７６，３６：５０９）、この方法では複雑
で高価な装置、培地を要し又その方法体系も複雑で費用
がかかるため、製造規模を拡大するのは難しい。更に、
哺乳類動物細胞由来のワクチンについて言えばレトロウ
イルスの存在による発癌の危険性があるため、その安全
性が懸念される。従って得られるＨＢｓＡｇが天然に存
在するものと同様の特性を有するとはいえ、上述の方法
は噛乳類動物細胞由来のワクチンの大量生産には有用で
はない。
内でクローニングし発現される。原核生物である細菌の
場合は得られる発現レベルが低く、直径２２ｎｍの免疫
原粒子中へのＨＢｓＡｇの効率的な導入が起こらないた
め、ワクチン製造に必要な抗原供給源としては原核生物
は用いられていない（Ｐ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８０，２８０：８１５；
Ｃ．Ｊ．Ｂｕｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ，１９７９，２７９：４３）。ー方、真核生物細胞も
ＨＢｓＡｇの産生に使用されているが（Ｍ．Ｌ．Ｍｉｃ
ｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
１９８５，３：５６１；Ｇ．Ｍ．ＭａｃＮａｂ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａ１ｏｆ Ｃａｎ
ｃｅｒ，１９７６，３６：５０９）、この方法では複雑
で高価な装置、培地を要し又その方法体系も複雑で費用
がかかるため、製造規模を拡大するのは難しい。更に、
哺乳類動物細胞由来のワクチンについて言えばレトロウ
イルスの存在による発癌の危険性があるため、その安全
性が懸念される。従って得られるＨＢｓＡｇが天然に存
在するものと同様の特性を有するとはいえ、上述の方法
は噛乳類動物細胞由来のワクチンの大量生産には有用で
はない。
【０００４】遺伝子増幅されたワクチニアウイルスによ
り、感染病原体に有効な生ワクチンの製造に用いるＨＢ
ｓＡｇを単体で又は他の抗原と共に発現させる組換えウ
イルスを得ることができる（Ｃ．Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，１９８
６，６０：３３７；Ｅ．Ｐａｏｌｅｔｔｉ ｅｔａ
ｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔ
ｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
ＵＳＡ，１９８４，８１：１９３）。しかしこの方法で
は技術および処方の面において多くの問題があるため、
得られたワクチンをヒトに対して大規模に使用するには
至っていない。
り、感染病原体に有効な生ワクチンの製造に用いるＨＢ
ｓＡｇを単体で又は他の抗原と共に発現させる組換えウ
イルスを得ることができる（Ｃ．Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，１９８
６，６０：３３７；Ｅ．Ｐａｏｌｅｔｔｉ ｅｔａ
ｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔ
ｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
ＵＳＡ，１９８４，８１：１９３）。しかしこの方法で
は技術および処方の面において多くの問題があるため、
得られたワクチンをヒトに対して大規模に使用するには
至っていない。
【０００５】また、市販のＢ型肝炎ウイルス組換えワク
チンは、基本的には、遺伝子増幅された酵母のＨＢｓＡ
ｇの産生により製造されるものである。酵母のサッカロ
ミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、広範囲で使用される生物学的
に活性な異種の蛋白質産生に（Ｓ．Ｍ．Ｋｉｎｇｓｍａ
ｎ ｅｔ ａｌ，Ｔｉｃｔｅｃｈ，１９８７，５：５
３）、またＨＢｓＡｇの大量取得に（Ｗ．Ｊ．ＭｃＡｌ
ｅｅｒ ｅ１ ａ１．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８４，３０
７：１７８；Ｎ．Ｈａｒｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏ
ｓｔｇｒａｄｕａｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ，１９８７，６３ ｓｕｐｐｌ．２：６５；Ｇ．Ａ．
Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８８，２５：
１２３）広く用いられている。得られる抗原は細胞内に
産生され、種々の細胞破砕の方法により抽出され、多様
な物理化学的手法により精製される。これにより９７％
以上の純度で、動物およびヒトの血漿抗原が示すのと同
様な抗原作用を有する生成物が取得される（Ｐ．Ｈａｕ
ｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ Ｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９８７，６３ ｓｕ
ｐｐｌ．２：８３）。
チンは、基本的には、遺伝子増幅された酵母のＨＢｓＡ
ｇの産生により製造されるものである。酵母のサッカロ
ミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、広範囲で使用される生物学的
に活性な異種の蛋白質産生に（Ｓ．Ｍ．Ｋｉｎｇｓｍａ
ｎ ｅｔ ａｌ，Ｔｉｃｔｅｃｈ，１９８７，５：５
３）、またＨＢｓＡｇの大量取得に（Ｗ．Ｊ．ＭｃＡｌ
ｅｅｒ ｅ１ ａ１．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８４，３０
７：１７８；Ｎ．Ｈａｒｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏ
ｓｔｇｒａｄｕａｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ，１９８７，６３ ｓｕｐｐｌ．２：６５；Ｇ．Ａ．
Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８８，２５：
１２３）広く用いられている。得られる抗原は細胞内に
産生され、種々の細胞破砕の方法により抽出され、多様
な物理化学的手法により精製される。これにより９７％
以上の純度で、動物およびヒトの血漿抗原が示すのと同
様な抗原作用を有する生成物が取得される（Ｐ．Ｈａｕ
ｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ Ｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９８７，６３ ｓｕ
ｐｐｌ．２：８３）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】近年、Ｃ１化合物資化
性酵母であるピヒアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ）を宿主として用い、該菌におけるメタノー
ルの利用過程の第一酵素であるアルコールオキシダーゼ
Ｉをコードする遺伝子のプロモーターを用いることに基
く効率的な発現系が報告された。この発現系において、
プロモーターは厳密に調節され、菌細胞がグルコースの
存在下ではなくメタノールの存在下にあるときにアルコ
ールオキシダーゼＩを３０％までもの高いレベルで発現
できる（Ｓ．Ｂ．Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，１９８５，５：１１１１；Ｒ．Ｃｏｕｄｅｒｃ ｅ
ｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９
８０，４４：２２５９）。
性酵母であるピヒアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ）を宿主として用い、該菌におけるメタノー
ルの利用過程の第一酵素であるアルコールオキシダーゼ
Ｉをコードする遺伝子のプロモーターを用いることに基
く効率的な発現系が報告された。この発現系において、
プロモーターは厳密に調節され、菌細胞がグルコースの
存在下ではなくメタノールの存在下にあるときにアルコ
ールオキシダーゼＩを３０％までもの高いレベルで発現
できる（Ｓ．Ｂ．Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，１９８５，５：１１１１；Ｒ．Ｃｏｕｄｅｒｃ ｅ
ｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９
８０，４４：２２５９）。
【０００７】ピヒア パストリスは、ＨＢｓＡｇを含む
多様な異種蛋白質類の発現にすでに用いられている
（Ｊ．Ｍ．Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，１９８７，５：４７９）。この発現は、
該酵母の変異株の染色体に存在する発現カセット内で、
ＨＢｓＡｇをコードする遺伝子がクローニングされた遺
伝子構築体を用い、アルコールオキシダーゼＩプロモー
ターの調節シグナルの下で行なわれる。これにより、メ
タノールの存在下で発現系が活性化されて、産生される
可溶性タンパク質の２〜３％がＨＢｓＡｇであることを
可能にする。しかし、この抗原の精製については何の開
示も無い。サッカロミセス セレビシアエ発現系に対す
るピヒア パストリス発現系の重要な利点は、産生され
る抗原が非常に効率的に組込まれて直径２２ｎｍの粒子
となることにある。これは、サッカロミセス セレビシ
アエでは２４キロダルトンの抗原のうちの少しの部分の
みが組み込まれて粒子となるのに対し、ピヒア パスト
リスでは産生した抗原の実質的に全部が粒子状となるか
らである（Ｐ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ，１９８２，２９８：３４７；Ｒ．Ａ．Ｈ
ｉｔｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８３，１１：２７４
５；Ａ．Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，１
９８３，８０：１）。
多様な異種蛋白質類の発現にすでに用いられている
（Ｊ．Ｍ．Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，１９８７，５：４７９）。この発現は、
該酵母の変異株の染色体に存在する発現カセット内で、
ＨＢｓＡｇをコードする遺伝子がクローニングされた遺
伝子構築体を用い、アルコールオキシダーゼＩプロモー
ターの調節シグナルの下で行なわれる。これにより、メ
タノールの存在下で発現系が活性化されて、産生される
可溶性タンパク質の２〜３％がＨＢｓＡｇであることを
可能にする。しかし、この抗原の精製については何の開
示も無い。サッカロミセス セレビシアエ発現系に対す
るピヒア パストリス発現系の重要な利点は、産生され
る抗原が非常に効率的に組込まれて直径２２ｎｍの粒子
となることにある。これは、サッカロミセス セレビシ
アエでは２４キロダルトンの抗原のうちの少しの部分の
みが組み込まれて粒子となるのに対し、ピヒア パスト
リスでは産生した抗原の実質的に全部が粒子状となるか
らである（Ｐ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ，１９８２，２９８：３４７；Ｒ．Ａ．Ｈ
ｉｔｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８３，１１：２７４
５；Ａ．Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，１
９８３，８０：１）。
【０００８】しかしながら、組換えＨＢｓＡｇを原料と
する市販されているワクチン製剤は、サッカロミセス
セレビシアエを抗原供給源としているのが現状である。
また、密度匂配遠心法を包含するところの酵母からのＨ
ＢｓＡｇの最も一般的な精製法［スミス クライン（Ｓ
ｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ）によるヨーロッパ特許願第Ｎ
ｏ．２７８ ９４０ Ａ３号］は、工業規模で行うには
費用がかかる上に複雑である。
する市販されているワクチン製剤は、サッカロミセス
セレビシアエを抗原供給源としているのが現状である。
また、密度匂配遠心法を包含するところの酵母からのＨ
ＢｓＡｇの最も一般的な精製法［スミス クライン（Ｓ
ｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ）によるヨーロッパ特許願第Ｎ
ｏ．２７８ ９４０ Ａ３号］は、工業規模で行うには
費用がかかる上に複雑である。
【０００９】フィリップス・ペトロリアム（Ｐｈｉｌｌ
ｉｐｓ Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ）によるヨーロッパ特許願
第３３７ ４９２号に、ピヒア パストリスの組換え株
からＨＢｓＡｇを取得する方法が記載されている。この
発明の目的はワクチンに直接導入されるに十分の純度で
ＨＢｓＡｇを取得することにあるが、精製後の抗原粒子
の粒子化に関する特性のみならずＨＢｓＡｇがワクチン
に含有された場合のその免疫能についてのいかなる記載
もない。
ｉｐｓ Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ）によるヨーロッパ特許願
第３３７ ４９２号に、ピヒア パストリスの組換え株
からＨＢｓＡｇを取得する方法が記載されている。この
発明の目的はワクチンに直接導入されるに十分の純度で
ＨＢｓＡｇを取得することにあるが、精製後の抗原粒子
の粒子化に関する特性のみならずＨＢｓＡｇがワクチン
に含有された場合のその免疫能についてのいかなる記載
もない。
【００１０】フィリップス・ペトロリアムの方法は、次
の工程で行われる：カオトロピック塩（Ｃｈａｏｔｒｏ
ｐｉｃ ｓａｌｔ）の存在下で酵母細胞を溶菌し、溶菌
細胞ペレットからＨＢｓＡｇを含有する上清を分離し；
ｐＨ４．５〜５．５において上清から脂質および不純物
蛋白質を沈殿物として除去し；得られた上清を濃縮し次
いで透析濾過し；ＨＢｓＡｇを含有する残留分をシリカ
に接触させた後不純物蛋白質を尿素含有緩衝液（ｐＨ
９．５〜１１．０）により洗浄除去してＨＢｓＡｇを溶
出し；適切な画分を、不純物からＨＢｓＡｇ粒子を分離
するのに十分な排除限界分子量を有する材料によるゲル
濾過にかけ、そして；得られた適切な分画を陰イオン交
換樹脂に接触させ、次いで緩衝液（ｐＨ６〜９）により
樹脂からＨＢｓＡｇ粒子を溶出する。この方法ではカオ
トロピック緩衝液が溶菌および抽出に用いられる。カオ
トロピック緩衝液にはカオトロピック剤としてチオシア
ン酸塩カリウムが、プロテアーゼ阻害剤としてフェニル
メチルスルフォニルフルオライドが含有されており、後
者は非常に有毒であるため、精製工程において完全に除
去しなくてはならない。更に、フェニルメチルスルフォ
ニルフルオライドがプロテアーゼの阻害に有効であるに
しても、その阻害スペクトルは制限されたものである。
更に、この方法ではＨＢｓＡｇを含有する上清を透析濾
過した後得られた画分をシリカに接触させる。シリカか
らＨＢｓＡｇ抗原を分離するために尿素含有緩衝液（ｐ
Ｈ９．５〜１１）を用いるが、尿素は高い変性能を有す
るためこれを用いると生成物の免疫原性が低下してしま
う。
の工程で行われる：カオトロピック塩（Ｃｈａｏｔｒｏ
ｐｉｃ ｓａｌｔ）の存在下で酵母細胞を溶菌し、溶菌
細胞ペレットからＨＢｓＡｇを含有する上清を分離し；
ｐＨ４．５〜５．５において上清から脂質および不純物
蛋白質を沈殿物として除去し；得られた上清を濃縮し次
いで透析濾過し；ＨＢｓＡｇを含有する残留分をシリカ
に接触させた後不純物蛋白質を尿素含有緩衝液（ｐＨ
９．５〜１１．０）により洗浄除去してＨＢｓＡｇを溶
出し；適切な画分を、不純物からＨＢｓＡｇ粒子を分離
するのに十分な排除限界分子量を有する材料によるゲル
濾過にかけ、そして；得られた適切な分画を陰イオン交
換樹脂に接触させ、次いで緩衝液（ｐＨ６〜９）により
樹脂からＨＢｓＡｇ粒子を溶出する。この方法ではカオ
トロピック緩衝液が溶菌および抽出に用いられる。カオ
トロピック緩衝液にはカオトロピック剤としてチオシア
ン酸塩カリウムが、プロテアーゼ阻害剤としてフェニル
メチルスルフォニルフルオライドが含有されており、後
者は非常に有毒であるため、精製工程において完全に除
去しなくてはならない。更に、フェニルメチルスルフォ
ニルフルオライドがプロテアーゼの阻害に有効であるに
しても、その阻害スペクトルは制限されたものである。
更に、この方法ではＨＢｓＡｇを含有する上清を透析濾
過した後得られた画分をシリカに接触させる。シリカか
らＨＢｓＡｇ抗原を分離するために尿素含有緩衝液（ｐ
Ｈ９．５〜１１）を用いるが、尿素は高い変性能を有す
るためこれを用いると生成物の免疫原性が低下してしま
う。
【００１１】
【問題を解決するための手段】本発明はピヒア パスト
リス由来の組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原を、非常に
均質な粒子状で高い免疫原性を有する形で得ることを確
実にする新規な精製法を提供するものである。
リス由来の組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原を、非常に
均質な粒子状で高い免疫原性を有する形で得ることを確
実にする新規な精製法を提供するものである。
【００１２】本発明によれば、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗
原をコードする遺伝子を含有しそして該遺伝子を発現し
てなるピヒア パストリス細胞からＢ型肝炎ウイルス表
面抗原を取得する方法にして、（１）カオトロピック
剤、スクロースおよびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）を含む緩衝液の存在下で上記ピヒア パストリス細
胞を溶菌し、（２）不純物を酸性ｐＨ領域で沈殿させて
粗抗原を得、（３）該粗抗原を酸性下でケイソウ土塊に
吸着させ、次にアルカリ性下で脱着し、（４）脱着され
た粗抗原をＢ型肝炎ウイルス表面抗原に特異的なモノク
ローナル抗体を用いるイミュノアフィニティークロマト
グラフィー（ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏ
ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけ、（５）得られる溶出抗
原を３０〜４０℃の温度での熱処理にかけ、（６）陰イ
オン交換カラムで抗原を洗剤により洗浄し、そして
（７）得られる溶出抗原を洗剤の存在下で高速液体クロ
マトグラフィーにかける、ことを包含する方法が提供さ
れる。
原をコードする遺伝子を含有しそして該遺伝子を発現し
てなるピヒア パストリス細胞からＢ型肝炎ウイルス表
面抗原を取得する方法にして、（１）カオトロピック
剤、スクロースおよびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）を含む緩衝液の存在下で上記ピヒア パストリス細
胞を溶菌し、（２）不純物を酸性ｐＨ領域で沈殿させて
粗抗原を得、（３）該粗抗原を酸性下でケイソウ土塊に
吸着させ、次にアルカリ性下で脱着し、（４）脱着され
た粗抗原をＢ型肝炎ウイルス表面抗原に特異的なモノク
ローナル抗体を用いるイミュノアフィニティークロマト
グラフィー（ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏ
ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけ、（５）得られる溶出抗
原を３０〜４０℃の温度での熱処理にかけ、（６）陰イ
オン交換カラムで抗原を洗剤により洗浄し、そして
（７）得られる溶出抗原を洗剤の存在下で高速液体クロ
マトグラフィーにかける、ことを包含する方法が提供さ
れる。
【００１３】本発明によれば、工程（１）でのピヒア
パストリス細胞の溶菌は、チオシアン酸カリウム、スク
ロース、エチレンジアミン四酢酸、トリス及び食塩を包
含してなる緩衝液の存在下で行われる。好ましくはピヒ
ア パストリス細胞の溶菌は１〜４Ｍチオシアン酸カリ
ウム、１〜１５（ｗ／ｖ）％スクロース、２．５〜３．
５ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１０〜３０ｍＭトリス
及び０．１〜１Ｍ食塩、更に好ましくは、２９１ｇ／ｌ
のチオシアン酸カリウム、１００ｇ／ｌのスクロース、
１．８６ｇ／ｌのエチレンジアミン四酢酸、１２ｇ／ｌ
のトリス及び１７．５ｇ／ｌの食塩を包含してなる緩衝
液の存在下で行われる。
パストリス細胞の溶菌は、チオシアン酸カリウム、スク
ロース、エチレンジアミン四酢酸、トリス及び食塩を包
含してなる緩衝液の存在下で行われる。好ましくはピヒ
ア パストリス細胞の溶菌は１〜４Ｍチオシアン酸カリ
ウム、１〜１５（ｗ／ｖ）％スクロース、２．５〜３．
５ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１０〜３０ｍＭトリス
及び０．１〜１Ｍ食塩、更に好ましくは、２９１ｇ／ｌ
のチオシアン酸カリウム、１００ｇ／ｌのスクロース、
１．８６ｇ／ｌのエチレンジアミン四酢酸、１２ｇ／ｌ
のトリス及び１７．５ｇ／ｌの食塩を包含してなる緩衝
液の存在下で行われる。
【００１４】本発明によれば、工程（２）での酸性下で
不純物の沈殿はｐＨ３〜４の条件下で行われる。所望な
ら工程（２）での酸性下で生成する不純物の沈殿を除去
した後得られる粗抗原をｐＨ７〜８にて貯蔵することも
可能である。
不純物の沈殿はｐＨ３〜４の条件下で行われる。所望な
ら工程（２）での酸性下で生成する不純物の沈殿を除去
した後得られる粗抗原をｐＨ７〜８にて貯蔵することも
可能である。
【００１５】好ましくは工程（２）での酸性下で生成す
る不純物の沈殿を除去した後得られる粗抗原を工程
（３）にてｐＨ３〜５の酸性下でケイソウ土塊に吸着さ
せ、不純物をｐＨ３〜５の溶出用緩衝液で洗浄除去し、
次いで該抗原をｐＨ７．５〜９．０のアルカリ性下でケ
イソウ土塊から脱着する。所望ならケイソウ土塊から脱
着される粗抗原は通常行われる濃縮化や脱塩処理、例え
ば限外濾過による濃縮や透析濾過による脱塩を行うこと
ができる。
る不純物の沈殿を除去した後得られる粗抗原を工程
（３）にてｐＨ３〜５の酸性下でケイソウ土塊に吸着さ
せ、不純物をｐＨ３〜５の溶出用緩衝液で洗浄除去し、
次いで該抗原をｐＨ７．５〜９．０のアルカリ性下でケ
イソウ土塊から脱着する。所望ならケイソウ土塊から脱
着される粗抗原は通常行われる濃縮化や脱塩処理、例え
ば限外濾過による濃縮や透析濾過による脱塩を行うこと
ができる。
【００１６】本発明によれば工程（４）での粗抗原のイ
ミュノアフィニティークロマトグラフィーに用いるモノ
クローナル抗体が、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原粒子に高
い親和性を有することを基準にして選択されるモノクロ
ーナル抗体であることが望ましい。更に好ましくは、粗
抗原のイミュノアフィニティークロマトグラフィーに用
いられるモノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞ＥＣ
ＡＣＣ９０１１２６０６によって産生される抗ＨＢｓＡ
ｇ ＣＢ−ＨＥＰ１である。イミュノアフィニティーク
ロマトグラフィーカラムからの該抗原の溶離はカオト
ピック剤を含む緩衝液で行うのが好ましい。
ミュノアフィニティークロマトグラフィーに用いるモノ
クローナル抗体が、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原粒子に高
い親和性を有することを基準にして選択されるモノクロ
ーナル抗体であることが望ましい。更に好ましくは、粗
抗原のイミュノアフィニティークロマトグラフィーに用
いられるモノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞ＥＣ
ＡＣＣ９０１１２６０６によって産生される抗ＨＢｓＡ
ｇ ＣＢ−ＨＥＰ１である。イミュノアフィニティーク
ロマトグラフィーカラムからの該抗原の溶離はカオト
ピック剤を含む緩衝液で行うのが好ましい。
【００１７】本発明によれば、工程（５）での溶出抗原
の３０〜４０℃の温度での熱処理を１〜６時間行うこと
が望ましい。加熱処理後該抗原を工程（６）において好
ましくはＤＥＡＥセルロースカラムでデオキシコール酸
ナトリウムやトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００のよ
うな洗剤で洗浄する。使用される洗剤濃度は０．０１〜
０．５重量％、好ましくは０．０５〜０．１重量％であ
る。次いで該抗原を溶出する。
の３０〜４０℃の温度での熱処理を１〜６時間行うこと
が望ましい。加熱処理後該抗原を工程（６）において好
ましくはＤＥＡＥセルロースカラムでデオキシコール酸
ナトリウムやトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００のよ
うな洗剤で洗浄する。使用される洗剤濃度は０．０１〜
０．５重量％、好ましくは０．０５〜０．１重量％であ
る。次いで該抗原を溶出する。
【００１８】溶出抗原をその後好ましくは工程（７）に
おいてデオキシコール酸ナトリウムのような洗剤の存在
下で分画分子量２０，０００〜１０，０００，０００の
高速液体クロマトグラフィーにかける。使用される洗剤
濃度は０．０１〜０．５重量％、好ましくは約０．０５
重量％である。
おいてデオキシコール酸ナトリウムのような洗剤の存在
下で分画分子量２０，０００〜１０，０００，０００の
高速液体クロマトグラフィーにかける。使用される洗剤
濃度は０．０１〜０．５重量％、好ましくは約０．０５
重量％である。
【００１９】本発明によればＢ型肝炎ウイルス表面抗原
は組換えピヒア パストリス株Ｃ２２６［ｐＴＡＯ９０
６］、ＣＢＳ４５０．９０から回収されるのが望まし
い。本発明の他の態様によれば、組換えピヒア パスト
リス株Ｃ２２６［ｐＴＡＯ９０６］、ＣＢＳ４５０．９
０；ハイブリドーマ細胞ＥＣＡＣＣ ９０１１２６０
６；ハイブリドーマ細胞ＥＣＡＣＣ ９０ １１２ ６
０６により産生されるモノクローナル抗体抗ＨＢｓＡｇ
ＣＢ−ＨＥＰ１；上記プロセスで得られる組換えＢ型
肝炎ウイルス表面抗原；本発明に基づくプロセスにより
得られる組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原の予防免疫量
と、ワクチン組成物に使用するのに適した少くとも１種
の担体、稀釈剤またはアジュバントとを包含してなるＢ
型肝炎ウイルスに対する免疫用ワクチン組成物；そして
本発明に基づくプロセスにより得られる組換えＢ型肝炎
ウイルス表面抗原の予防免疫量と、ワクチン組成物に使
用するのに適した少くとも１種の担体、稀釈剤またはア
ジュバントとを包含してなるワクチン組成物を適切な回
数投与することからなるＢ型肝炎ウイルスに対する人間
または動物の予防接種方法が提供される。
は組換えピヒア パストリス株Ｃ２２６［ｐＴＡＯ９０
６］、ＣＢＳ４５０．９０から回収されるのが望まし
い。本発明の他の態様によれば、組換えピヒア パスト
リス株Ｃ２２６［ｐＴＡＯ９０６］、ＣＢＳ４５０．９
０；ハイブリドーマ細胞ＥＣＡＣＣ ９０１１２６０
６；ハイブリドーマ細胞ＥＣＡＣＣ ９０ １１２ ６
０６により産生されるモノクローナル抗体抗ＨＢｓＡｇ
ＣＢ−ＨＥＰ１；上記プロセスで得られる組換えＢ型
肝炎ウイルス表面抗原；本発明に基づくプロセスにより
得られる組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原の予防免疫量
と、ワクチン組成物に使用するのに適した少くとも１種
の担体、稀釈剤またはアジュバントとを包含してなるＢ
型肝炎ウイルスに対する免疫用ワクチン組成物；そして
本発明に基づくプロセスにより得られる組換えＢ型肝炎
ウイルス表面抗原の予防免疫量と、ワクチン組成物に使
用するのに適した少くとも１種の担体、稀釈剤またはア
ジュバントとを包含してなるワクチン組成物を適切な回
数投与することからなるＢ型肝炎ウイルスに対する人間
または動物の予防接種方法が提供される。
【００２０】本発明を更に詳細に説明する。本発明の方
法の第１ステップはＥＤＴＡ、トリス、食塩、ショ糖及
びチオシアン酸カリウムを含む緩衝液で細胞を溶解させ
ることである。ＥＤＴＡは広い阻害スペクトルを有する
プロテアーゼ阻害剤であり、基本的に生物適合物質であ
るため、この段階におけるその存在は重要である。スク
ロースは分子の半減期および立体配座を維持する。チオ
シアン酸カリウムは通常のカオトロピック剤であり、他
のもので代替可能である。
法の第１ステップはＥＤＴＡ、トリス、食塩、ショ糖及
びチオシアン酸カリウムを含む緩衝液で細胞を溶解させ
ることである。ＥＤＴＡは広い阻害スペクトルを有する
プロテアーゼ阻害剤であり、基本的に生物適合物質であ
るため、この段階におけるその存在は重要である。スク
ロースは分子の半減期および立体配座を維持する。チオ
シアン酸カリウムは通常のカオトロピック剤であり、他
のもので代替可能である。
【００２１】細胞の破砕の後、破砕断片の分離はｐＨ３
〜４の酸性領域において、不純物蛋白質類の酸性下での
沈殿と同時に行なう。この操作により精製工程のステッ
プ数を減少させることができ、同時に高い純度（抗原１
０％以上）の物質から出発して精製を始めることがで
き、回収率も向上する。更にこの操作により不純物とし
て共存する脂質、炭水化物やＤＮＡが除去できる。遠心
分離の後、抗原を含む上清はｐＨ７〜８にて貯蔵可能で
ある。精製を更に続けるために粗抗原のｐＨを３〜５に
再度低下させ、そして粗抗原をセライト（Ｃｅｌｉｔ
ｅ）塊に接触させに抗原を吸着させる。セライト塊をト
リス塩酸、チオシアン酸カリウム、スクロースとＥＤＴ
Ａを含むｐＨ３〜５の緩衝液で洗浄し、炭水化物、脂質
やＤＮＡのような共存不純物を除去する。抗原はセライ
ト塊からｐＨ７．５〜９．０の緩衝液を用いてｐＨを変
化することにより回収される。このステップにおいて抗
原は温和な条件下で溶離されるため、変性や抗原として
の特異性を失うことなく４０〜５０％の純度で回収でき
る。
〜４の酸性領域において、不純物蛋白質類の酸性下での
沈殿と同時に行なう。この操作により精製工程のステッ
プ数を減少させることができ、同時に高い純度（抗原１
０％以上）の物質から出発して精製を始めることがで
き、回収率も向上する。更にこの操作により不純物とし
て共存する脂質、炭水化物やＤＮＡが除去できる。遠心
分離の後、抗原を含む上清はｐＨ７〜８にて貯蔵可能で
ある。精製を更に続けるために粗抗原のｐＨを３〜５に
再度低下させ、そして粗抗原をセライト（Ｃｅｌｉｔ
ｅ）塊に接触させに抗原を吸着させる。セライト塊をト
リス塩酸、チオシアン酸カリウム、スクロースとＥＤＴ
Ａを含むｐＨ３〜５の緩衝液で洗浄し、炭水化物、脂質
やＤＮＡのような共存不純物を除去する。抗原はセライ
ト塊からｐＨ７．５〜９．０の緩衝液を用いてｐＨを変
化することにより回収される。このステップにおいて抗
原は温和な条件下で溶離されるため、変性や抗原として
の特異性を失うことなく４０〜５０％の純度で回収でき
る。
【００２２】セライト塊から脱着された抗原を含む溶離
液を０．１μｍのポアサイズの膜を用いる限外濾過によ
り３０〜４０倍位まで濃縮し、次いで得られた粗抗原は
３倍量の適切な緩衝液（トリス塩酸、ＥＤＴＡ、ｐＨ７
〜８）を用いて透析濾過し、そして抗原粒子の選別に特
別にスクリーニングされたモノクローナル抗体を用いる
イミュノアフィニティークロマトグラフィーにかける。
これらのモノクローナル抗体を用いると抗原活性を低下
させるような処理法をさけることができ、そしてチンパ
ンジーで実証されているように特定の免疫原性を有する
特異エピトープが識別される（Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎ
ｓ，Ｈ；Ｄｅ Ｒｅｕｓ，Ａ；Ｐｅｅｔｅｒｍａｎｓ，
Ｊ．Ｈ．ａｎｄ Ｖａｎ Ｅｅｒｄ，Ｐ．Ａ．Ｃ．Ｍ．
Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕ
ｒｎａｌ，１９８７，６３，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ
（２），ｐ．９３−９６）。上記のステップで得られる
ＨＢｓＡｇを含む画分をトリス塩酸、リン酸カリウム又
はリン酸ナトリウムを含むｐＨ６〜７の適切な緩衝液に
て平衡化したアフィニティカラムに通す。この際流速は
２５〜５０ｃｍ／ｈである。カラム中の非吸着物質（不
純物質）は１Ｍの食塩を更に加えたカラムの平衡化に用
いた同緩衝液を用いて洗い出される。抗原は１〜３Ｍの
範囲でチオシアン酸カリウムを含むトリス塩酸又はリン
酸塩のような緩衝液を用いてカラムから回収される。こ
のステップから得られる抗原の純度は８５％以上であ
る。
液を０．１μｍのポアサイズの膜を用いる限外濾過によ
り３０〜４０倍位まで濃縮し、次いで得られた粗抗原は
３倍量の適切な緩衝液（トリス塩酸、ＥＤＴＡ、ｐＨ７
〜８）を用いて透析濾過し、そして抗原粒子の選別に特
別にスクリーニングされたモノクローナル抗体を用いる
イミュノアフィニティークロマトグラフィーにかける。
これらのモノクローナル抗体を用いると抗原活性を低下
させるような処理法をさけることができ、そしてチンパ
ンジーで実証されているように特定の免疫原性を有する
特異エピトープが識別される（Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎ
ｓ，Ｈ；Ｄｅ Ｒｅｕｓ，Ａ；Ｐｅｅｔｅｒｍａｎｓ，
Ｊ．Ｈ．ａｎｄ Ｖａｎ Ｅｅｒｄ，Ｐ．Ａ．Ｃ．Ｍ．
Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕ
ｒｎａｌ，１９８７，６３，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ
（２），ｐ．９３−９６）。上記のステップで得られる
ＨＢｓＡｇを含む画分をトリス塩酸、リン酸カリウム又
はリン酸ナトリウムを含むｐＨ６〜７の適切な緩衝液に
て平衡化したアフィニティカラムに通す。この際流速は
２５〜５０ｃｍ／ｈである。カラム中の非吸着物質（不
純物質）は１Ｍの食塩を更に加えたカラムの平衡化に用
いた同緩衝液を用いて洗い出される。抗原は１〜３Ｍの
範囲でチオシアン酸カリウムを含むトリス塩酸又はリン
酸塩のような緩衝液を用いてカラムから回収される。こ
のステップから得られる抗原の純度は８５％以上であ
る。
【００２３】本発明方法の更に新規なステップは、前の
ステップで得られた抗原を含む溶出液を次いで３０〜４
０℃好ましくは３７℃にて１〜６時間加熱処理すること
である。このステップにより２２ｎｍの均質な粒子を高
収率で回収でき、この粒子は高い免疫原性を示す。特に
この事実はＤＥＡＥセルロースでのイオン交換を行う次
のステップで明らかとなる。即ちこのステップでこれら
の粒子は１７５ｍＭ食塩にて明確なピークとして溶出さ
れ、この画分は低い抗原性を有する粒子状物質を含む残
留画分と異なるものである。
ステップで得られた抗原を含む溶出液を次いで３０〜４
０℃好ましくは３７℃にて１〜６時間加熱処理すること
である。このステップにより２２ｎｍの均質な粒子を高
収率で回収でき、この粒子は高い免疫原性を示す。特に
この事実はＤＥＡＥセルロースでのイオン交換を行う次
のステップで明らかとなる。即ちこのステップでこれら
の粒子は１７５ｍＭ食塩にて明確なピークとして溶出さ
れ、この画分は低い抗原性を有する粒子状物質を含む残
留画分と異なるものである。
【００２４】抗原を含む溶出画分を次いで適切なｐＨ７
〜７．５の緩衝液（トリス塩酸又はリン酸塩緩衝液）を
用いゲル濾過クロマトグラフィーにより脱塩する。次い
でこの物質をＤＥＡＥセルロースのようなイオン交換カ
ラムに流し、この樹脂を、１０〜５０ｍＭの範囲の異な
った濃度の食塩と、０．０１〜０．５重量％好ましくは
０．０５〜０．１％の範囲内の異なった濃度のデオキシ
コール酸ナトリウムやトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１
００のような洗剤を含む洗浄液で洗う。これらの洗浄に
より共存するＤＮＡやエンドトキシンの除去が確実に行
なえる。抗原を１５０〜２００ｍＭの食塩とチオシアン
酸カリウムを含む溶液を用いカラムから回収する。この
抗原液にはＤＮＡが全く含まれず、純度は９５％以上で
ある。
〜７．５の緩衝液（トリス塩酸又はリン酸塩緩衝液）を
用いゲル濾過クロマトグラフィーにより脱塩する。次い
でこの物質をＤＥＡＥセルロースのようなイオン交換カ
ラムに流し、この樹脂を、１０〜５０ｍＭの範囲の異な
った濃度の食塩と、０．０１〜０．５重量％好ましくは
０．０５〜０．１％の範囲内の異なった濃度のデオキシ
コール酸ナトリウムやトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１
００のような洗剤を含む洗浄液で洗う。これらの洗浄に
より共存するＤＮＡやエンドトキシンの除去が確実に行
なえる。抗原を１５０〜２００ｍＭの食塩とチオシアン
酸カリウムを含む溶液を用いカラムから回収する。この
抗原液にはＤＮＡが全く含まれず、純度は９５％以上で
ある。
【００２５】溶出抗原を分画分子量１００，０００ダル
トンの膜を用いて蛋白質濃度が１〜３ｍｇ／ｍｌの範囲
になるまで限外濾過にて濃縮を行なう。デオキシコール
酸ナトリウムのような洗剤を粗抗原に０．０５％の濃度
になるように加え、そして濃縮液を分画分子量２０，０
００〜１０，０００，０００ダルトンの高分離能ゲル濾
過クロマトグラフィー（ＰＷ ５０００又はＰＷ ６０
００）にかける。カラムを０．０５％デオキシコール酸
ナトリウムを含む緩衝液で平衡化する。工程中洗剤の存
在により抗原中のエンドトキシン含量は抗原１μｇ当り
０．４ｎｇ以下に低下し、所望でない粒子状画分の選別
が可能となる。
トンの膜を用いて蛋白質濃度が１〜３ｍｇ／ｍｌの範囲
になるまで限外濾過にて濃縮を行なう。デオキシコール
酸ナトリウムのような洗剤を粗抗原に０．０５％の濃度
になるように加え、そして濃縮液を分画分子量２０，０
００〜１０，０００，０００ダルトンの高分離能ゲル濾
過クロマトグラフィー（ＰＷ ５０００又はＰＷ ６０
００）にかける。カラムを０．０５％デオキシコール酸
ナトリウムを含む緩衝液で平衡化する。工程中洗剤の存
在により抗原中のエンドトキシン含量は抗原１μｇ当り
０．４ｎｇ以下に低下し、所望でない粒子状画分の選別
が可能となる。
【００２６】得られた抗原を再度適切な緩衝液を用いて
ゲル濾過クロマトグラフィーにより脱塩し、次いでワク
チン組成物として用いるために水酸化アルミニウムゲル
をアジュバントとして添加する。ここに開示した方法に
基づき得られるワクチン組成物の卓越した免疫原性は厳
密な二重盲検法に従って行なわれる制御された前臨床試
験の結果から証明される。本発明の方法により、人体用
として入手可能な同質の免疫原性を有する優れた品質の
ワクチン製剤を得ることができる。
ゲル濾過クロマトグラフィーにより脱塩し、次いでワク
チン組成物として用いるために水酸化アルミニウムゲル
をアジュバントとして添加する。ここに開示した方法に
基づき得られるワクチン組成物の卓越した免疫原性は厳
密な二重盲検法に従って行なわれる制御された前臨床試
験の結果から証明される。本発明の方法により、人体用
として入手可能な同質の免疫原性を有する優れた品質の
ワクチン製剤を得ることができる。
【００２７】以下、本発明について実施例を挙げて説明
する。但し、本発明は以下の実施例にのみ限定されるも
のではない。
する。但し、本発明は以下の実施例にのみ限定されるも
のではない。
実施例１ Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原遺伝子を得るため、該ウイル
スＤＮＡをプラスミドｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に
クローニングした。ウイルスゲノムは、同ウイルスの無
症候性キャリアの血清から単離精製したデーン粒子（Ｄ
ａｎｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）より報文（Ｐ．Ｖａｌｅ
ｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９
７９， ２８０：８１５）と同様の方法によって取得し
た。得られたプラスミド（ｐＨＢＳＩと称する）を制限
酵素ＥｃｏＲＩとＨｐａｌで消化し、得られた断片をＴ
ａｑＩで消化し、この部位にＥｃｏＲＩリンカー（５’
ＧＧＡＡＴＴＣＣ ３’）を連結して、ｐＢＲ３２２の
ＥｃｏＲＩ部位にサブロクーニングした。得られたプラ
スミドをｐＨＢ３２と称し、このプラスミドをＥｃｏＲ
Ｉで消化し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理することによりＨ
ＢｓＡｇ遺伝子を含む断片を得た。この断片を、あらか
じめＮｃｏＩで開環しＳ１ヌクレアーゼとアルカリホス
ファターゼで処理しておいたｐＢＳ５（図１参照）にサ
ブクローニングした。得られたプラスミドをｐＰＣＳＡ
３（図２参照）と称し、ここから、目的の遺伝子を挾む
５’末端（２５ｂｐ）と３’末端（１２５ｂｐ）の該ウ
イルスのノンコーディング領域を標準反応条件に従いＰ
ＣＲ法で除去した（Ｒ． Ｋ． Ｓａｉｋｉ ｅｔ
ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８５ ２３０：１
３５０）。下記の配列を有す２つの合成オリゴヌクレオ
チド： ５’ 領域： ５’ ＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＣＡＴＣ
ＡＣＡＴ３’ （配列番号：１） ３’ 領域： ３’ ＧＡＣＣＣＡＴＡＴＧＴＡＡＡＴ
ＴＴＧＣＡＧＣＴＧＧ５’ （配列番号：２） を用いて、目的の遺伝子の５’末端と３’末端にＮｃｏ
Ｉ切断部位とＳａｌＩ切断部位をそれぞれ設けた。これ
により、目的の遺伝子の取扱が容易になり、また、増幅
された断片の上記の制限酵素による消化によってノンコ
ーディング領域を除去できるようになった。得られた正
確なＨＢｓＡｇ遺伝子を含む６７８ｂｐの断片をプラス
ミドｐＢＳ５にサブクローニングした。こうして得られ
たプラスミド［ｐＰＣＢ６と称する（図３参照）］にお
いては、上記の遺伝子がサッカロミセス セレビシエの
酵素グリセルアルデヒド３−ホスフエートデヒドロゲナ
ーゼ（ＧＡＰ）遺伝子の転写制御シグナルの支配下にあ
る。ピヒア パストリスの遺伝子ライブラリー由来のプ
ラスミドｐＣＡＯ１０（図４参照）から、酵素ＡＯＸ１
遺伝子のプロモーターとノンコーデング５’領域を含む
１．１ｋｂの断片を抽出した。この断片をプラスミドＰ
ＢＲ３２２にサブクローニングして得たプラスミドｐＰ
ＡＯ２３（図５参照）を用いてＰＣＲを行ない、酵素Ａ
ＯＸ１の構造遺伝子からこの蛋白質の最初の６個のアミ
ノ酸をコードするコドンに対応する１８ｂｐの塩基配列
を除去した。用いた２つの合成オリゴヌクレオチドは次
のものである。 ５’ 領域 ：５’ＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴ
３’ （配列番号：３） ３’ 領域 ：３’ＴＴＧＡＴＴＡＡＴＡＡＧＣＴＴＴ
ＧＧＴＡＣＣＧＣ５’ （配列番号：４） ３’領域のオリゴヌクレオチドによって、酵素ＡＯＸ１
の構造遺伝子の１８ｂｐの配列を除去してＨＢｓＡｇ遺
伝子への正確な結合を達成するための、酵素ＡＯＸ１遺
伝子のプロモーターの３’領域にＮｃｏＩ部位を設ける
ことができる。また、５’領域のオリゴヌクレオチドに
よってＰＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位が維持できる。増
幅された１１１５ｂｐの断片はプラスミドｐＵＣ１９に
サブクローニングされ、これにより、ピヒア パストリ
スの酵素ＡＯＸ１遺伝子の完全なプロモーターを含むプ
ラスミドｐＭＡＯ１０７が得られた（図６参照）。ＨＢ
ｓＡｇの正確な遺伝子を酵素ＡＯＸ１の完全なプローモ
ーターの支配下にサブクローニングすることにより最終
統合ベクターを得た（図７参照）。得られたクローン
（ｐＨＡＯ１１２と称する）はＡＯＸ１プロモーターの
制御シグナル及びサッカロミセス セレビシエのＧＡＰ
遺伝子の終止シグナルの支配下にある上記遺伝子を含ん
でおり、さらに、酵母との相同的組換えに必要なピヒア
パストリスの染色体ＤＮＡの領域も有している。この
プラスミドをＳ１ヌクレアーゼで部分消化処理してＨＢ
ｓＡｇ遺伝子の３’末端と酵素グリセルアルデヒド３−
ホスフェートデヒドロゲナーゼのターミネーターとの間
に位置するＳａｌＩ部位を破壊した。得られたクローン
をｐＳＡＯ５０３（図８参照）と称し、この中に、酵素
ＡＯＸ１の構造遺伝子の断片及びそれと隣りあうノンコ
ーディング３’領域を含むプラスミドｐＣＡＯ１０由来
の２．４ｋｂの断片をサブクローニングした。得られた
プラスミドをｐＶＡＯ７２１と称し（図８参照），これ
にサッカロミセスセレビシエのｈｉｓ３遺伝子を含む
１．８ｋｂの断片をプラスミドｐＰＭＣ（図９参照）か
らクローニングした。得られたクローンをｐＴＡＯ９０
６と称し（図１０参照）、最終統合プラスミドとしてピ
ヒア パストリスＭＰ３６株（欧州特許公開ＥＰ−Ａ
０ ４３８２００号）の形質転換に用いた。形質転換体
のうち遺伝子統合の明確なパターンを示すものを用いて
遺伝子発現による抗原生産レベルの評価を行った。抗原
生産用に選択した株をＣ２２６と称した。ピヒア パス
トリスＣ２２６［ｐＴＡＯ９０６］は、１９９０年１０
月２２日、オランダ国バーン市所在のセントラルビュー
ローフォルスキメルカルチャース〔Ｃｅｎｔｒａａｌｂ
ｕｒｅａｒ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒ
ｅｓ（ＣＢＳ）〕にブタペスト条約に基づき寄託され、
寄託番号ＣＢＳ４５０．９０を与えられた。た。
スＤＮＡをプラスミドｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に
クローニングした。ウイルスゲノムは、同ウイルスの無
症候性キャリアの血清から単離精製したデーン粒子（Ｄ
ａｎｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）より報文（Ｐ．Ｖａｌｅ
ｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９
７９， ２８０：８１５）と同様の方法によって取得し
た。得られたプラスミド（ｐＨＢＳＩと称する）を制限
酵素ＥｃｏＲＩとＨｐａｌで消化し、得られた断片をＴ
ａｑＩで消化し、この部位にＥｃｏＲＩリンカー（５’
ＧＧＡＡＴＴＣＣ ３’）を連結して、ｐＢＲ３２２の
ＥｃｏＲＩ部位にサブロクーニングした。得られたプラ
スミドをｐＨＢ３２と称し、このプラスミドをＥｃｏＲ
Ｉで消化し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理することによりＨ
ＢｓＡｇ遺伝子を含む断片を得た。この断片を、あらか
じめＮｃｏＩで開環しＳ１ヌクレアーゼとアルカリホス
ファターゼで処理しておいたｐＢＳ５（図１参照）にサ
ブクローニングした。得られたプラスミドをｐＰＣＳＡ
３（図２参照）と称し、ここから、目的の遺伝子を挾む
５’末端（２５ｂｐ）と３’末端（１２５ｂｐ）の該ウ
イルスのノンコーディング領域を標準反応条件に従いＰ
ＣＲ法で除去した（Ｒ． Ｋ． Ｓａｉｋｉ ｅｔ
ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８５ ２３０：１
３５０）。下記の配列を有す２つの合成オリゴヌクレオ
チド： ５’ 領域： ５’ ＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＣＡＴＣ
ＡＣＡＴ３’ （配列番号：１） ３’ 領域： ３’ ＧＡＣＣＣＡＴＡＴＧＴＡＡＡＴ
ＴＴＧＣＡＧＣＴＧＧ５’ （配列番号：２） を用いて、目的の遺伝子の５’末端と３’末端にＮｃｏ
Ｉ切断部位とＳａｌＩ切断部位をそれぞれ設けた。これ
により、目的の遺伝子の取扱が容易になり、また、増幅
された断片の上記の制限酵素による消化によってノンコ
ーディング領域を除去できるようになった。得られた正
確なＨＢｓＡｇ遺伝子を含む６７８ｂｐの断片をプラス
ミドｐＢＳ５にサブクローニングした。こうして得られ
たプラスミド［ｐＰＣＢ６と称する（図３参照）］にお
いては、上記の遺伝子がサッカロミセス セレビシエの
酵素グリセルアルデヒド３−ホスフエートデヒドロゲナ
ーゼ（ＧＡＰ）遺伝子の転写制御シグナルの支配下にあ
る。ピヒア パストリスの遺伝子ライブラリー由来のプ
ラスミドｐＣＡＯ１０（図４参照）から、酵素ＡＯＸ１
遺伝子のプロモーターとノンコーデング５’領域を含む
１．１ｋｂの断片を抽出した。この断片をプラスミドＰ
ＢＲ３２２にサブクローニングして得たプラスミドｐＰ
ＡＯ２３（図５参照）を用いてＰＣＲを行ない、酵素Ａ
ＯＸ１の構造遺伝子からこの蛋白質の最初の６個のアミ
ノ酸をコードするコドンに対応する１８ｂｐの塩基配列
を除去した。用いた２つの合成オリゴヌクレオチドは次
のものである。 ５’ 領域 ：５’ＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴ
３’ （配列番号：３） ３’ 領域 ：３’ＴＴＧＡＴＴＡＡＴＡＡＧＣＴＴＴ
ＧＧＴＡＣＣＧＣ５’ （配列番号：４） ３’領域のオリゴヌクレオチドによって、酵素ＡＯＸ１
の構造遺伝子の１８ｂｐの配列を除去してＨＢｓＡｇ遺
伝子への正確な結合を達成するための、酵素ＡＯＸ１遺
伝子のプロモーターの３’領域にＮｃｏＩ部位を設ける
ことができる。また、５’領域のオリゴヌクレオチドに
よってＰＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位が維持できる。増
幅された１１１５ｂｐの断片はプラスミドｐＵＣ１９に
サブクローニングされ、これにより、ピヒア パストリ
スの酵素ＡＯＸ１遺伝子の完全なプロモーターを含むプ
ラスミドｐＭＡＯ１０７が得られた（図６参照）。ＨＢ
ｓＡｇの正確な遺伝子を酵素ＡＯＸ１の完全なプローモ
ーターの支配下にサブクローニングすることにより最終
統合ベクターを得た（図７参照）。得られたクローン
（ｐＨＡＯ１１２と称する）はＡＯＸ１プロモーターの
制御シグナル及びサッカロミセス セレビシエのＧＡＰ
遺伝子の終止シグナルの支配下にある上記遺伝子を含ん
でおり、さらに、酵母との相同的組換えに必要なピヒア
パストリスの染色体ＤＮＡの領域も有している。この
プラスミドをＳ１ヌクレアーゼで部分消化処理してＨＢ
ｓＡｇ遺伝子の３’末端と酵素グリセルアルデヒド３−
ホスフェートデヒドロゲナーゼのターミネーターとの間
に位置するＳａｌＩ部位を破壊した。得られたクローン
をｐＳＡＯ５０３（図８参照）と称し、この中に、酵素
ＡＯＸ１の構造遺伝子の断片及びそれと隣りあうノンコ
ーディング３’領域を含むプラスミドｐＣＡＯ１０由来
の２．４ｋｂの断片をサブクローニングした。得られた
プラスミドをｐＶＡＯ７２１と称し（図８参照），これ
にサッカロミセスセレビシエのｈｉｓ３遺伝子を含む
１．８ｋｂの断片をプラスミドｐＰＭＣ（図９参照）か
らクローニングした。得られたクローンをｐＴＡＯ９０
６と称し（図１０参照）、最終統合プラスミドとしてピ
ヒア パストリスＭＰ３６株（欧州特許公開ＥＰ−Ａ
０ ４３８２００号）の形質転換に用いた。形質転換体
のうち遺伝子統合の明確なパターンを示すものを用いて
遺伝子発現による抗原生産レベルの評価を行った。抗原
生産用に選択した株をＣ２２６と称した。ピヒア パス
トリスＣ２２６［ｐＴＡＯ９０６］は、１９９０年１０
月２２日、オランダ国バーン市所在のセントラルビュー
ローフォルスキメルカルチャース〔Ｃｅｎｔｒａａｌｂ
ｕｒｅａｒ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒ
ｅｓ（ＣＢＳ）〕にブタペスト条約に基づき寄託され、
寄託番号ＣＢＳ４５０．９０を与えられた。た。
【００２８】実施例２ ＨＢｓＡｇを合成するため、形質転換体Ｃ２２６の前接
種段階の培養を以下の組成の生理食塩水培地で行なう： Ｋ２ＨＰＯ４− ５ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４− ４．６ｇ／ｌ ＮＨ４ＳＯ４− ２２ｇ／ｌ ＣａＣｌ２− ０．５ｇ／ｌ グリセロール − ２０ｍｌ／ｌ ビタミン類 ２００×− １０ｍｌ／ｌ 微量元素 ２００×− ５ｍｌ／ｌ 培養は３０℃、ｐＨ４．５、通気及び撹拌条件下で、酸
素分圧が飽和値の３０％を超えるようにして行なう。培
養時間は１０から１２時間とする。接種段階では生理食
塩水倍地を以下の組成の富栄養培地にとり換える。 酵母抽出物 １％ ペプトン ２％ グリセロール ２％ 微量元素 ２００×− １０ｍｌ／ｌ ビタミン類 ２００×− ５ｍｌ／ｌ 培養は前記条件で１０から１２時間かけて、細胞濃度が
１０から１２ｇ／ｌ（乾燥基準）に達するまで行ない、
さらに、培養物を上記と同様の富栄養培地に接種して上
記と同様の温度とｐＨ条件で培養を行なう。培養は８か
ら１０時間けて細胞濃度が１０から１２ｇ／ｌ（乾燥基
準）に達するまで行なう。遺伝子発現による抗原の産生
を誘導するために、この時点からメタノールを連続的に
添加しはじめる。９０から１００時間の培養で産生した
抗原は総蛋白質のおよそ３％に達する。メタノールの添
加量は培地中の細胞濃度の増加に従って間隔を置いて増
加させる。この後、以下の組成を有する富栄養培地によ
って培養物を増し始める： 酵母抽出物 ３％ ペプトン ６％ この増加は１８０から２００時間続く培養の最後まで維
持され、比成長率は５倍になり、発現レベルが上昇す
る。この方法によって得られるもう一つの結果は、この
ようにして生産された蛋白質は８０％以上可溶な状態に
維持されることであり、この要素は以後の精製段階の効
率向上と抗原の粒子状化の向上を促す。培養の最終段階
においては６０から８０ｇ／ｌ（乾燥基準）のバイオマ
ス濃度が得られ、抗原産生レベルは総蛋白質の２から５
％に達する。培養終了後、細胞を連続的システムにおい
て遠心で回収し、同じ遠心装置を用いて滅菌水で洗浄後
クリーム状で４％で保存する。
種段階の培養を以下の組成の生理食塩水培地で行なう： Ｋ２ＨＰＯ４− ５ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４− ４．６ｇ／ｌ ＮＨ４ＳＯ４− ２２ｇ／ｌ ＣａＣｌ２− ０．５ｇ／ｌ グリセロール − ２０ｍｌ／ｌ ビタミン類 ２００×− １０ｍｌ／ｌ 微量元素 ２００×− ５ｍｌ／ｌ 培養は３０℃、ｐＨ４．５、通気及び撹拌条件下で、酸
素分圧が飽和値の３０％を超えるようにして行なう。培
養時間は１０から１２時間とする。接種段階では生理食
塩水倍地を以下の組成の富栄養培地にとり換える。 酵母抽出物 １％ ペプトン ２％ グリセロール ２％ 微量元素 ２００×− １０ｍｌ／ｌ ビタミン類 ２００×− ５ｍｌ／ｌ 培養は前記条件で１０から１２時間かけて、細胞濃度が
１０から１２ｇ／ｌ（乾燥基準）に達するまで行ない、
さらに、培養物を上記と同様の富栄養培地に接種して上
記と同様の温度とｐＨ条件で培養を行なう。培養は８か
ら１０時間けて細胞濃度が１０から１２ｇ／ｌ（乾燥基
準）に達するまで行なう。遺伝子発現による抗原の産生
を誘導するために、この時点からメタノールを連続的に
添加しはじめる。９０から１００時間の培養で産生した
抗原は総蛋白質のおよそ３％に達する。メタノールの添
加量は培地中の細胞濃度の増加に従って間隔を置いて増
加させる。この後、以下の組成を有する富栄養培地によ
って培養物を増し始める： 酵母抽出物 ３％ ペプトン ６％ この増加は１８０から２００時間続く培養の最後まで維
持され、比成長率は５倍になり、発現レベルが上昇す
る。この方法によって得られるもう一つの結果は、この
ようにして生産された蛋白質は８０％以上可溶な状態に
維持されることであり、この要素は以後の精製段階の効
率向上と抗原の粒子状化の向上を促す。培養の最終段階
においては６０から８０ｇ／ｌ（乾燥基準）のバイオマ
ス濃度が得られ、抗原産生レベルは総蛋白質の２から５
％に達する。培養終了後、細胞を連続的システムにおい
て遠心で回収し、同じ遠心装置を用いて滅菌水で洗浄後
クリーム状で４％で保存する。
【００２９】実施例３ カラムクロマトグラフィー用に適したＨＢｓＡｇ粗抗原
を得る目的で、抗原をコードする遺伝子で形質転換され
た酵母培養物を遠心分離して得られるバイオマスを機械
的に破砕して得られる粗抽出物を次の精製工程にかけ
る。洗浄したクリーム状の細胞濃縮物を蒸留水にて１０
０ｇ／ｌに調整し破砕用緩衝液として次の化合物を加え
る： トリス １２．１ｇ／ｌ ショ糖 １００ｇ／ｌ 食塩 １７．５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ １．８６ｇ／ｌ チオシアン酸カリウム ２９１ｇ／ｌ ｐＨを１ＮＨＣｌにて７．５〜８．０に調整し、この溶
液を５分間ホモジナイズし、そしてベットミルで細胞を
機械的に破壊する。細胞破砕物をＨＢｓＡｇの安定性に
基づく極限のｐＨ条件下にて清澄化操作を行い、その条
件下で数多くの宿主酵母由来の他の不純物蛋白質を沈殿
させる。一方抗原は溶液中に残留する。酸性ｐＨでの他
の不純物蛋白質の沈殿化による破砕抽出物の清澄化は次
の方法で実行した。破砕細胞ホモジネートを攪拌しなが
ら、０〜４℃まで冷却し、ｐＨを記録していく。そして
発泡をさけつつ４℃にて１ＮＨＣｌ溶液をｐＨが２．５
〜３になるのに十分な量を急速に加える。更に５分撹拌
を続けた後混合物を４℃に冷却し連続式の遠心分離機に
かける。遠心時間は４５分間で、被検液の抽出容器及び
回収容器は冷却状態にしておく。遠心後直ちに上清を一
定に撹拌しｐＨを記録しながらｐＨ７．５〜８．５にも
どす。清澄化した上清のｐＨを再び４．０に下げ、１ｋ
ｇのセライト塊（Ｈｉｇｈ ｆｌｏｗ Ｓｕｐｅｒ ｃ
ｅｌｌ，Ｆｌｕｋａ）当りおよそ抗原０．３５ｇを加え
て約１時間ホモジナイズする。抗原をセライト塊に吸着
させ、遠心、濾過又は傾斜法によりセライト塊と非吸着
物質を分け、非吸着分を廃棄する。次いでベッドに固定
された抗原を２〜３回次の組成の緩衝液で洗浄する： チオシアン酸カリウム ４８．５ｇ／ｌ ショ糖 １００ｇ／ｌ トリス ２．４２ｇ／ｌ ＥＤＴＡ １．８６ｇ／ｌ ｐＨは１ＮＨＣｌにて４．０に調整した。連続して洗浄
した後、セライト塊からの抗原の脱着を次の組成の溶出
用緩衝液を用いて行った。 トリス ２．４２ｇ／ｌ ＥＤＴＡ １．１２ｇ／ｌ ショ糖 １００ｇ／ｌ ｐＨは１ＮＮａＯＨにて９．０〜９．５に調整した。溶
出により得られる粗抗原を約５５のファクターで初期容
量を濃縮するため、０．１μｍのポアサイズのカートリ
ッジを有するＡＭＩＣＯＮ型の濃縮機（中空繊維）に導
入する。この全操作は４℃で行った。得られたＨＢｓＡ
ｇを完全に精製するために、数段階のクロマトグラフィ
ーを以下に述べるように実行した。濃縮セライト溶出物
の約２ｌを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で
膨潤、平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）
Ｇ−２５のゲル濾過カラムで脱塩した。この過程は２８
０ｎｍにおける吸光度及び伝導率により制御される。Ｃ
ＮＢｒで活性化した約２ｌのセファロース（Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ）ＣＬ−４Ｂとそれに結合した約１０ｇのモノ
クローナル抗体ＣＢ−ＨＥＰ１（実施例４に従ってセン
トロ デインヘニエリア ヘネティカイ ビオテクノロ
ヒアで入手される）とからなるイミュノアフィニテイ吸
着剤を調製し、その特性により高免疫能を持つ抗原の選
別が可能となる。上記の吸着剤を充填したイミュノアフ
ィニテイカラムを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で平衡化し、そのカラムにベッド１ｍｌ当りおよそ
０．１ｍｇのＨＢｓＡｇの比で抗原を含む多量の脱塩さ
れたセライト溶出液濃縮液を流した。流速は室温にて５
０ｃｍ／ｈとした。洗浄は平衡化に使用したのと同じも
ので行い、進行状況は２８０ｎｍの吸収グラフを記録す
ることで行った。溶出液をその吸収がクロマトグラフの
ベースラインに一致するまで集め、それから２０ｍＭト
リス塩酸、１Ｎ食塩を含むｐＨ８．０の緩衝液をその吸
収がベースラインに再び一致するまで流し、非特異的吸
着物を除去した。抗原は２０ｍＭトリス塩酸、３Ｍチオ
シアン酸カリウム、１Ｍ食塩を含むｐＨ８．０の緩衝液
で溶出し、カラムを長時間使用しない場合はカラムを直
ちに４℃の０．０１％チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｏｓ
ａｌ）を含む過剰の平衡化用緩衝液で洗浄した。
を得る目的で、抗原をコードする遺伝子で形質転換され
た酵母培養物を遠心分離して得られるバイオマスを機械
的に破砕して得られる粗抽出物を次の精製工程にかけ
る。洗浄したクリーム状の細胞濃縮物を蒸留水にて１０
０ｇ／ｌに調整し破砕用緩衝液として次の化合物を加え
る： トリス １２．１ｇ／ｌ ショ糖 １００ｇ／ｌ 食塩 １７．５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ １．８６ｇ／ｌ チオシアン酸カリウム ２９１ｇ／ｌ ｐＨを１ＮＨＣｌにて７．５〜８．０に調整し、この溶
液を５分間ホモジナイズし、そしてベットミルで細胞を
機械的に破壊する。細胞破砕物をＨＢｓＡｇの安定性に
基づく極限のｐＨ条件下にて清澄化操作を行い、その条
件下で数多くの宿主酵母由来の他の不純物蛋白質を沈殿
させる。一方抗原は溶液中に残留する。酸性ｐＨでの他
の不純物蛋白質の沈殿化による破砕抽出物の清澄化は次
の方法で実行した。破砕細胞ホモジネートを攪拌しなが
ら、０〜４℃まで冷却し、ｐＨを記録していく。そして
発泡をさけつつ４℃にて１ＮＨＣｌ溶液をｐＨが２．５
〜３になるのに十分な量を急速に加える。更に５分撹拌
を続けた後混合物を４℃に冷却し連続式の遠心分離機に
かける。遠心時間は４５分間で、被検液の抽出容器及び
回収容器は冷却状態にしておく。遠心後直ちに上清を一
定に撹拌しｐＨを記録しながらｐＨ７．５〜８．５にも
どす。清澄化した上清のｐＨを再び４．０に下げ、１ｋ
ｇのセライト塊（Ｈｉｇｈ ｆｌｏｗ Ｓｕｐｅｒ ｃ
ｅｌｌ，Ｆｌｕｋａ）当りおよそ抗原０．３５ｇを加え
て約１時間ホモジナイズする。抗原をセライト塊に吸着
させ、遠心、濾過又は傾斜法によりセライト塊と非吸着
物質を分け、非吸着分を廃棄する。次いでベッドに固定
された抗原を２〜３回次の組成の緩衝液で洗浄する： チオシアン酸カリウム ４８．５ｇ／ｌ ショ糖 １００ｇ／ｌ トリス ２．４２ｇ／ｌ ＥＤＴＡ １．８６ｇ／ｌ ｐＨは１ＮＨＣｌにて４．０に調整した。連続して洗浄
した後、セライト塊からの抗原の脱着を次の組成の溶出
用緩衝液を用いて行った。 トリス ２．４２ｇ／ｌ ＥＤＴＡ １．１２ｇ／ｌ ショ糖 １００ｇ／ｌ ｐＨは１ＮＮａＯＨにて９．０〜９．５に調整した。溶
出により得られる粗抗原を約５５のファクターで初期容
量を濃縮するため、０．１μｍのポアサイズのカートリ
ッジを有するＡＭＩＣＯＮ型の濃縮機（中空繊維）に導
入する。この全操作は４℃で行った。得られたＨＢｓＡ
ｇを完全に精製するために、数段階のクロマトグラフィ
ーを以下に述べるように実行した。濃縮セライト溶出物
の約２ｌを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で
膨潤、平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）
Ｇ−２５のゲル濾過カラムで脱塩した。この過程は２８
０ｎｍにおける吸光度及び伝導率により制御される。Ｃ
ＮＢｒで活性化した約２ｌのセファロース（Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ）ＣＬ−４Ｂとそれに結合した約１０ｇのモノ
クローナル抗体ＣＢ−ＨＥＰ１（実施例４に従ってセン
トロ デインヘニエリア ヘネティカイ ビオテクノロ
ヒアで入手される）とからなるイミュノアフィニテイ吸
着剤を調製し、その特性により高免疫能を持つ抗原の選
別が可能となる。上記の吸着剤を充填したイミュノアフ
ィニテイカラムを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で平衡化し、そのカラムにベッド１ｍｌ当りおよそ
０．１ｍｇのＨＢｓＡｇの比で抗原を含む多量の脱塩さ
れたセライト溶出液濃縮液を流した。流速は室温にて５
０ｃｍ／ｈとした。洗浄は平衡化に使用したのと同じも
ので行い、進行状況は２８０ｎｍの吸収グラフを記録す
ることで行った。溶出液をその吸収がクロマトグラフの
ベースラインに一致するまで集め、それから２０ｍＭト
リス塩酸、１Ｎ食塩を含むｐＨ８．０の緩衝液をその吸
収がベースラインに再び一致するまで流し、非特異的吸
着物を除去した。抗原は２０ｍＭトリス塩酸、３Ｍチオ
シアン酸カリウム、１Ｍ食塩を含むｐＨ８．０の緩衝液
で溶出し、カラムを長時間使用しない場合はカラムを直
ちに４℃の０．０１％チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｏｓ
ａｌ）を含む過剰の平衡化用緩衝液で洗浄した。
【００３０】アフィニティカラムから溶離したＨＢｓＡ
ｇを３７℃の水浴中にて２時間加熱する。後に抗原を２
０ｍＭトリス塩酸、３ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ８．０
の緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−２５カラムに
流し脱塩した。２０ｍＭトリス塩酸、３ｍＭ ＥＤＴＡ
を含むｐＨ８．０の緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロ
ース（Ｗｈａｔｍａｎ，ＤＥ−５２）を含むカラムに約
３１の脱塩したイミュノアフィニティカラムからの粗抗
原を流し、クロマト精製を４℃にて行った。次いで２０
ｍＭトリス塩酸、３ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ食塩と
０．０５％のデオキシコール酸ナトリウムを含む平衡化
緩衝液で洗浄した。工程は２８０ｎｍの吸収グラフを記
録して制御した。溶出液は吸収値がベースラインに一致
するまで集めた。ＨＢｓＡｇは２０ｍＭトリス塩酸、３
ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ食塩を含むｐＨ８．０の緩
衝液を用いてカラムから溶離し、吸収値がベースライン
に一致するまで溶出液を集めた。以前のステップで述ベ
た如く、イオン交換カラムから得られるフラクションを
分画分子量１００，０００ダルトンのカートリッジを用
いるアミコン中空繊維システム（ＤＣ−２）で約２５倍
まで濃縮した。次いでデオキシコール酸ナトリウムを
０．０５ｇ／１００ｍｌになるように濃縮液に加えた。
混合液を４℃にて１時間インキュベートし、次いでこの
フラクションを２０ｍＭトリス塩酸、３ｍＭＥＤＴＡ、
０．０５％デオキシコール酸ナトリウムを含むｐＨ８．
０の緩衝液で平衡化させたＰＷＧ６０００カラムに流
す。同じ分子のモノマー又は二量体を含まない高度に粒
子状化した抗原を含む一つのピークが得られた。このフ
ラクションを回収し、ｐＨ７．０のＰＢＳ緩衝液にて平
衡化したセファデックスＧ−２５カラムにて脱塩した。
この精製ＨＢｓＡｇの最終的な粗抗原を０．２μｍのポ
アサイズの膜で無菌濾過し更に水酸化アルミニウムをア
ジュバントとして添加した。上に述べたように抗原は注
射可能な状態までに精製する必要があり、非経口投与用
組成物に要求される全ての厳格な基準に合致すべく考慮
され、そして相当する品質管理が行われる必要がある
（組換えＤＮＡ技術で作製されたＢ型肝炎ワクチンに対
する必要条件、世界保健機関による生物学的粗抗原Ｎ
ｏ．４５に対する必要条件、テクニカルリポートシリー
ズ、Ｎｏ．７８６、１９８９）。次に示す表に本発明の
目的であるＨＢｓＡｇの精製工程で得られた結果がまと
められている。
ｇを３７℃の水浴中にて２時間加熱する。後に抗原を２
０ｍＭトリス塩酸、３ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ８．０
の緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−２５カラムに
流し脱塩した。２０ｍＭトリス塩酸、３ｍＭ ＥＤＴＡ
を含むｐＨ８．０の緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロ
ース（Ｗｈａｔｍａｎ，ＤＥ−５２）を含むカラムに約
３１の脱塩したイミュノアフィニティカラムからの粗抗
原を流し、クロマト精製を４℃にて行った。次いで２０
ｍＭトリス塩酸、３ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ食塩と
０．０５％のデオキシコール酸ナトリウムを含む平衡化
緩衝液で洗浄した。工程は２８０ｎｍの吸収グラフを記
録して制御した。溶出液は吸収値がベースラインに一致
するまで集めた。ＨＢｓＡｇは２０ｍＭトリス塩酸、３
ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ食塩を含むｐＨ８．０の緩
衝液を用いてカラムから溶離し、吸収値がベースライン
に一致するまで溶出液を集めた。以前のステップで述ベ
た如く、イオン交換カラムから得られるフラクションを
分画分子量１００，０００ダルトンのカートリッジを用
いるアミコン中空繊維システム（ＤＣ−２）で約２５倍
まで濃縮した。次いでデオキシコール酸ナトリウムを
０．０５ｇ／１００ｍｌになるように濃縮液に加えた。
混合液を４℃にて１時間インキュベートし、次いでこの
フラクションを２０ｍＭトリス塩酸、３ｍＭＥＤＴＡ、
０．０５％デオキシコール酸ナトリウムを含むｐＨ８．
０の緩衝液で平衡化させたＰＷＧ６０００カラムに流
す。同じ分子のモノマー又は二量体を含まない高度に粒
子状化した抗原を含む一つのピークが得られた。このフ
ラクションを回収し、ｐＨ７．０のＰＢＳ緩衝液にて平
衡化したセファデックスＧ−２５カラムにて脱塩した。
この精製ＨＢｓＡｇの最終的な粗抗原を０．２μｍのポ
アサイズの膜で無菌濾過し更に水酸化アルミニウムをア
ジュバントとして添加した。上に述べたように抗原は注
射可能な状態までに精製する必要があり、非経口投与用
組成物に要求される全ての厳格な基準に合致すべく考慮
され、そして相当する品質管理が行われる必要がある
（組換えＤＮＡ技術で作製されたＢ型肝炎ワクチンに対
する必要条件、世界保健機関による生物学的粗抗原Ｎ
ｏ．４５に対する必要条件、テクニカルリポートシリー
ズ、Ｎｏ．７８６、１９８９）。次に示す表に本発明の
目的であるＨＢｓＡｇの精製工程で得られた結果がまと
められている。
【００３１】実施例４ ＨＢｓＡｇに特異的なモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を
得るために、８週齢のＢａｌｂ／ｃ雄マウスを、ヒト血
漿から得た天然Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原で免疫化した
（Ｓ．Ｋｒｕｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅ
ｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９７１，２１７：４１）。コーラ
ー（Ｋｈｏｌｅｒ）（Ｔｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｃ ｏｆ
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８１，Ｖｏ
ｌ．Ｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２８５−２９
８）によって記載された基本原理に従って、ハイブリッ
ドの融合、培養、及び追跡を行った。５０％ポリエチレ
ングリコール１５００（ＢＤＨ）を用いて１０：１の比
率で脾臓細胞とミエローマ株ＳＰ２／０／Ａｇ１４とを
ハイフリダイズし、該細胞を１ｍｌ培地当リ１００，０
００細胞、及び１ウェル当り１００μｌを、プレート上
の９６ウェル（Ｃｏｓｔａｒ）に接種した。用いた選択
的培養培地はＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）であり、
この調製に際しては１ｇ／１ ＮａＨＣＯ３、３μｇ／
１ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピル
ビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール、１０％新生仔牛の血清、４０μｇ／ｍｌゲンタ
マイシン、及び３％ヒト内皮細胞培養上清（ＨＥＣＳ）
を追加し（Ａｓｔａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８３，Ｖｏ
ｌ．ＸＣΠ、ｅｄ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ，Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ，３９−４６）、この調製物にヒポキ
サンチンを上限０．０３ｍＭまで、チミジンを３μＭま
で、及びアミノプテリンを０．４μｍまで加えた。培養
して３週目から、間接エリザ法を用いて上清液につい
て、ＨＢｓＡｇに特異な抗体を調べた。陽性反応を示し
たウェルのうち高反応値が反復分析試験で得られた理由
によりＮｏ．４８を選択し、稀釈度を制限して数回にわ
たリクローニング及び再クローニングを行った。最終ク
ローンとして以下の免疫化学上の特徴を有するモノクロ
ーナル抗体を分泌するところの４８／１／５／４を選択
した。 ・該モノクローナル抗体は特異な方法で天然のＨＢｓＡ
ｇ及び酵母中で産生する組換えＨＢｓＡｇ（ＨＢｓＡｇ
ｒ）の両者を認識する。このことはエリザ法によって両
分子について証明されている。 ・該モノクローナル抗体は固体相（エリザ法）及び溶液
中のＨＢｓＡｇｒを認識する。溶液中のＨＢｓＡｇｒを
用いた先行インキュベーションにより、モノクローナル
抗体と固体相中のＨＢｓＡｇｒとの結合を阻害すること
が可能である。 ・コーティングとして幾つかの分子を用いたエリザ法に
よるアッセイでは交差反応はみられない。モノクローナ
ル抗体は又、ウェスタンブロット法により、ＨＢｓＡｇ
ｒを産生する酵母を調製するためのＨＢｓＡｇに対応す
るバンドを特異的に認識する。これによりこのモノクロ
ーナル抗体はＨＢｓＡｇに非常に特異なものであり、認
識したエピトープは連続的なタイプであることが確認で
きる。 ・該モノクローナル抗体は国際基準と同様な方法でサブ
タイプａｙ及びａｄを認識し、これにより、該抗体は総
てのウイルスのサブタイプに共通な決定子に対して作用
する、ということは明らかである。 ・本クローンに特異な特徴とは、本クローンがサブクラ
ス ガンマ２ｂとクラスＭの２種類のＨ鎖を合成すると
いう事実である。このクローンによる形質転換細胞はゲ
ル濾過クロマトグラフィ（Ｓｅｐｈａｃｒｙ１ Ｓ−３
００）により分離可能なクラスＩｇＧ ２ｂと五量体Ｉ
ｇＭ分子の両抗体を分泌する。このことは二重放射線状
免疫放散（Ｏ．Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ ｅｔ ａ
ｌ．，１９７３，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ・１：
１９．１）及びポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎ．
Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，１９７０，２２
７：６８０）によって立証されている。両抗体はＨＢｓ
Ａｇに特異的であり、このことはマウスＩｇＧとＩｇＭ
〔Ｓｉｇｍａ社（米国）製〕に特異な複合体を用い、エ
リザ法によって実証されている。 ・塗布されたＰＶＣプレートの実験の結果は、モノクロ
ーナル抗体がＨＢｓＡｇを効率的に捕捉することが可能
であるということを示している。高モル濃度のチオシア
ン酸ナトリウムを含有する溶液を用いることにより、Ｈ
ＢｓＡｇを高率で連続的に抽出することができる。 ブタペスト条約に従ってこのハイブリドーマ細胞株を１
９９０年１１月２６日付で英国、サリスベリー市所在の
ヨーロピアン コレクション オブ アニマルセル カ
ルチャーズに寄託し、寄託番号ＥＣＡＣＣ ９０ １１
２ ６０６を得た。
得るために、８週齢のＢａｌｂ／ｃ雄マウスを、ヒト血
漿から得た天然Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原で免疫化した
（Ｓ．Ｋｒｕｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅ
ｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９７１，２１７：４１）。コーラ
ー（Ｋｈｏｌｅｒ）（Ｔｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｃ ｏｆ
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８１，Ｖｏ
ｌ．Ｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２８５−２９
８）によって記載された基本原理に従って、ハイブリッ
ドの融合、培養、及び追跡を行った。５０％ポリエチレ
ングリコール１５００（ＢＤＨ）を用いて１０：１の比
率で脾臓細胞とミエローマ株ＳＰ２／０／Ａｇ１４とを
ハイフリダイズし、該細胞を１ｍｌ培地当リ１００，０
００細胞、及び１ウェル当り１００μｌを、プレート上
の９６ウェル（Ｃｏｓｔａｒ）に接種した。用いた選択
的培養培地はＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）であり、
この調製に際しては１ｇ／１ ＮａＨＣＯ３、３μｇ／
１ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピル
ビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール、１０％新生仔牛の血清、４０μｇ／ｍｌゲンタ
マイシン、及び３％ヒト内皮細胞培養上清（ＨＥＣＳ）
を追加し（Ａｓｔａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８３，Ｖｏ
ｌ．ＸＣΠ、ｅｄ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ，Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ，３９−４６）、この調製物にヒポキ
サンチンを上限０．０３ｍＭまで、チミジンを３μＭま
で、及びアミノプテリンを０．４μｍまで加えた。培養
して３週目から、間接エリザ法を用いて上清液につい
て、ＨＢｓＡｇに特異な抗体を調べた。陽性反応を示し
たウェルのうち高反応値が反復分析試験で得られた理由
によりＮｏ．４８を選択し、稀釈度を制限して数回にわ
たリクローニング及び再クローニングを行った。最終ク
ローンとして以下の免疫化学上の特徴を有するモノクロ
ーナル抗体を分泌するところの４８／１／５／４を選択
した。 ・該モノクローナル抗体は特異な方法で天然のＨＢｓＡ
ｇ及び酵母中で産生する組換えＨＢｓＡｇ（ＨＢｓＡｇ
ｒ）の両者を認識する。このことはエリザ法によって両
分子について証明されている。 ・該モノクローナル抗体は固体相（エリザ法）及び溶液
中のＨＢｓＡｇｒを認識する。溶液中のＨＢｓＡｇｒを
用いた先行インキュベーションにより、モノクローナル
抗体と固体相中のＨＢｓＡｇｒとの結合を阻害すること
が可能である。 ・コーティングとして幾つかの分子を用いたエリザ法に
よるアッセイでは交差反応はみられない。モノクローナ
ル抗体は又、ウェスタンブロット法により、ＨＢｓＡｇ
ｒを産生する酵母を調製するためのＨＢｓＡｇに対応す
るバンドを特異的に認識する。これによりこのモノクロ
ーナル抗体はＨＢｓＡｇに非常に特異なものであり、認
識したエピトープは連続的なタイプであることが確認で
きる。 ・該モノクローナル抗体は国際基準と同様な方法でサブ
タイプａｙ及びａｄを認識し、これにより、該抗体は総
てのウイルスのサブタイプに共通な決定子に対して作用
する、ということは明らかである。 ・本クローンに特異な特徴とは、本クローンがサブクラ
ス ガンマ２ｂとクラスＭの２種類のＨ鎖を合成すると
いう事実である。このクローンによる形質転換細胞はゲ
ル濾過クロマトグラフィ（Ｓｅｐｈａｃｒｙ１ Ｓ−３
００）により分離可能なクラスＩｇＧ ２ｂと五量体Ｉ
ｇＭ分子の両抗体を分泌する。このことは二重放射線状
免疫放散（Ｏ．Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ ｅｔ ａ
ｌ．，１９７３，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ・１：
１９．１）及びポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎ．
Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，１９７０，２２
７：６８０）によって立証されている。両抗体はＨＢｓ
Ａｇに特異的であり、このことはマウスＩｇＧとＩｇＭ
〔Ｓｉｇｍａ社（米国）製〕に特異な複合体を用い、エ
リザ法によって実証されている。 ・塗布されたＰＶＣプレートの実験の結果は、モノクロ
ーナル抗体がＨＢｓＡｇを効率的に捕捉することが可能
であるということを示している。高モル濃度のチオシア
ン酸ナトリウムを含有する溶液を用いることにより、Ｈ
ＢｓＡｇを高率で連続的に抽出することができる。 ブタペスト条約に従ってこのハイブリドーマ細胞株を１
９９０年１１月２６日付で英国、サリスベリー市所在の
ヨーロピアン コレクション オブ アニマルセル カ
ルチャーズに寄託し、寄託番号ＥＣＡＣＣ ９０ １１
２ ６０６を得た。
【００３２】このモノクローナル抗体を産生するため
に、前もって１０日前に同様の方法でミネラルオイルを
注入してあるＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔に３００万のハ
イブリッド細胞を接種した後、該抗体の純調製物を抽出
した腹水から得た。繰返し穿刺して回収した腹水を５０
０ｇで遠心分離にかけ、１：１のクロロホルムで脱脂
し、食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で透析した。精製の
目的で４℃にて２時間５０％ＮＨ２ＳＯ４を用いて抗体
を沈殿させ、４０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離にか
け、同じ濃度のＮＨ２ＳＯ４で沈殿物を更に２回洗浄
し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５〔Ｐｈａｒｍａｃｉａ
社（スウェーデン）製〕中で脱塩した。脱塩試料をアフ
ィニティクロマトグラフィにより蛋白質Ａセファロース
ＣＬ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）中にて分画した。
これらの機器の製造者による指示は以下の通りである。
臭化シアンにより活性化したセファロースＣＬ４Ｂの吸
着剤に精製抗体を結合させる。１ｍｌのゲル当り５ｍｇ
のモノクローナル抗体を用いる。
に、前もって１０日前に同様の方法でミネラルオイルを
注入してあるＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔に３００万のハ
イブリッド細胞を接種した後、該抗体の純調製物を抽出
した腹水から得た。繰返し穿刺して回収した腹水を５０
０ｇで遠心分離にかけ、１：１のクロロホルムで脱脂
し、食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で透析した。精製の
目的で４℃にて２時間５０％ＮＨ２ＳＯ４を用いて抗体
を沈殿させ、４０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離にか
け、同じ濃度のＮＨ２ＳＯ４で沈殿物を更に２回洗浄
し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５〔Ｐｈａｒｍａｃｉａ
社（スウェーデン）製〕中で脱塩した。脱塩試料をアフ
ィニティクロマトグラフィにより蛋白質Ａセファロース
ＣＬ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）中にて分画した。
これらの機器の製造者による指示は以下の通りである。
臭化シアンにより活性化したセファロースＣＬ４Ｂの吸
着剤に精製抗体を結合させる。１ｍｌのゲル当り５ｍｇ
のモノクローナル抗体を用いる。
【００３３】実施例５ 精製された組換え抗原から高均一性と高粒子度を有する
ワクチン組成物を得るために、該組換え抗原を無菌水酸
化アルミニウム溶液と混合した。この製法に従って該産
生物の特徴を調べるのに必要な試験を行う目的で、数個
のバッチを調製した。これらの調製物の３つの連続した
バッチの評価において得られた結果を詳述する。
ワクチン組成物を得るために、該組換え抗原を無菌水酸
化アルミニウム溶液と混合した。この製法に従って該産
生物の特徴を調べるのに必要な試験を行う目的で、数個
のバッチを調製した。これらの調製物の３つの連続した
バッチの評価において得られた結果を詳述する。
【００３４】実施例６ 上記実施例記載のように、酵母菌由来組換ＤＮＡによっ
て得られたＨＢｓＡｇの免疫原性を調査するために、こ
の製剤が非経口投与を人間に行うための規程の必要条件
（組換ＤＮＡ技術によって作製されたＢ型肝炎ワクチン
の必要条件、世界健康機関による生物学的粗抗原Ｎｏ．
４５に対する必要条件、テクニカルポートシリーズ、Ｎ
ｏ．７８６，１９８９）を満たしている事を明示した上
で、前臨床試験として有志のグループに接種した。実験
記録を作成したキューバの厚生省がこの目的の為に発足
させた評価委員会によってこの調査は行われ、この委員
会は概略では下記のような結果レポートを発行してい
る：キューバ厚生省発足のＢ型肝炎に対するキューバ組
換えワクチン評価委員会は、酵母におけるＨＢｓＡｇの
組換えＤＮＡ（ｒｅｃ−ＨＢｓＡｇ）由来のキューバワ
クチンの接種原性の評価のためのプロトタイプ フェー
ズΠの完全な最終レポートを作成している。レポートの
内容を要約すると、約１００ヶ国で承認され登録されて
いる同一タイプの市販されているワクチン〔スミス ク
ライン（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｋｌｉｎｅ）〕とキューバｒ
ｅｃ−ＨＢｓＡｇワクチンの効果を比較するたに、典型
的な二重盲検試験が行われている。この調査に任意で参
加したという同意の記録として書類に署名をした総勢１
２３人のうち、３５人が様々の理由で除外され、アミノ
基転移酵素の正常な価（ＡＬＴ）を示し、ウイルスのマ
ーカー（ＨＢｓＡｇ， ＨＢｅＡｇ， 抗ＨＢｓＡｇ及
び抗ＨＢｃＡｇ）を含まない、臨床検査で健康体とされ
た８８人が選ばれた。年齢２０〜３４才の成年男女の試
料採取者を一様にに３１人、３０人、及び２７人からな
る３グループに分け、３回の接種（水酸化アルミニウム
に吸着された抗原 １ｍｌ）、つまり、あるグループは
２０μｇのキューバワクチン（ＣＶ２０）を、又あるグ
ループは１０μｇキューバワクチン（ＣＶ１０）を、又
残リのグループは２０μｇの市販ワクチン（スミス ク
ライン）を各々０日、３０日後及び６０日後の３回の接
種を行った。同じ日の接種前に血液サンプルを採取し、
接種途中１５目目、及び接種完了後の、接種後７５日
目、９０日目にも血液サンプルを採取した。グループ全
員の４５％に皮下接種を行い、残りは筋肉内接種（三角
筋）を行ったが、年齢、性別及び接種方法はそれ程違わ
ないようにした。ワクチン接種の全スケジュールを完了
した９０日後、ＣＶ２０ｗｏを接種した３１人のうち２
９人が免疫された。検査を受けた全員が、認知された最
少感染防御接種レベル（ＭＰＬ）の１０ＩＵ／ｌよりも
大きな抗体力価を示した。相乗平均力価（ＧＭＴ）は２
３９．９ＩＵ／ｌであった。ＣＶ１０を接種した３０人
のうち２６人が免疫され、検査された。全員が上記ＭＰ
Ｌ値より大きな抗体力価を示し、上記ＧＭＴ値が２１
８．４ＩＵ／ｌであった。一方ＳＫ２０を接種した２７
人のうち２６人が免疫され、検査された。このうち２３
人（８８．５％）がＧＭＴ値４３．９ＩＵ／ｌという抗
体力価を示したが、ＭＰＬ値を越えたのは２１人のみ
（８０．８％）であった。接種後９０日後の結果と７５
日目（３回目の投与の１５日後）を比較してみると、キ
ューバワクチンＣＶ２０とＣＶ１０の両方は血清変換の
最大率（１００％）を保持しており上記ＭＰＬ値より大
きな力価で免疫された人は１００％迄増加してた。一方
ＳＫ２０で免疫された人は９６．３％から８８．５％に
減っているが、上記ＭＰＬ値より大きな力価で免疫され
た人は７４．４％から８８．８％に増加している。これ
らのデータは二つのキューバワクチン組成物よりも、Ｓ
Ｋ２０がかなり劣る事を示している。従って、８１人の
ワクチン接種を受け検査され、ワクチン接種の全てのス
ケジュールを完了した人々（最初に接種された人のうち
９２％）のうち、７８人（９６．３％）に血清変換が認
められた。この７８人のうち、どちらかのキューバワク
チンを接種した５５人が全てＭＰＬ値よりも大きな抗体
力価を示し、一方、市販のワクチン（スミス クライ
ン）を接種した２３人（８８．５％）の中の２１人（８
０．８％）がＭＰＬ値よりも大きな抗体力価を示した。
従って、キューバワクチンに有利なこれらの結果に基づ
いて、この調査を上記したような方法で選定し、異なる
機関で集められた多数のグループに迄広げることを決定
した。このフェーズΠ臨床試験から得た結果を図１１、
図１２に要約して記載してある。これらの図により、皮
下接種及び筋内接種による接種処置を行うと、両ワクチ
ン組成物（キューバワクチン及びスミス クラインワク
チン）への応答レベルがわかる。
て得られたＨＢｓＡｇの免疫原性を調査するために、こ
の製剤が非経口投与を人間に行うための規程の必要条件
（組換ＤＮＡ技術によって作製されたＢ型肝炎ワクチン
の必要条件、世界健康機関による生物学的粗抗原Ｎｏ．
４５に対する必要条件、テクニカルポートシリーズ、Ｎ
ｏ．７８６，１９８９）を満たしている事を明示した上
で、前臨床試験として有志のグループに接種した。実験
記録を作成したキューバの厚生省がこの目的の為に発足
させた評価委員会によってこの調査は行われ、この委員
会は概略では下記のような結果レポートを発行してい
る：キューバ厚生省発足のＢ型肝炎に対するキューバ組
換えワクチン評価委員会は、酵母におけるＨＢｓＡｇの
組換えＤＮＡ（ｒｅｃ−ＨＢｓＡｇ）由来のキューバワ
クチンの接種原性の評価のためのプロトタイプ フェー
ズΠの完全な最終レポートを作成している。レポートの
内容を要約すると、約１００ヶ国で承認され登録されて
いる同一タイプの市販されているワクチン〔スミス ク
ライン（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｋｌｉｎｅ）〕とキューバｒ
ｅｃ−ＨＢｓＡｇワクチンの効果を比較するたに、典型
的な二重盲検試験が行われている。この調査に任意で参
加したという同意の記録として書類に署名をした総勢１
２３人のうち、３５人が様々の理由で除外され、アミノ
基転移酵素の正常な価（ＡＬＴ）を示し、ウイルスのマ
ーカー（ＨＢｓＡｇ， ＨＢｅＡｇ， 抗ＨＢｓＡｇ及
び抗ＨＢｃＡｇ）を含まない、臨床検査で健康体とされ
た８８人が選ばれた。年齢２０〜３４才の成年男女の試
料採取者を一様にに３１人、３０人、及び２７人からな
る３グループに分け、３回の接種（水酸化アルミニウム
に吸着された抗原 １ｍｌ）、つまり、あるグループは
２０μｇのキューバワクチン（ＣＶ２０）を、又あるグ
ループは１０μｇキューバワクチン（ＣＶ１０）を、又
残リのグループは２０μｇの市販ワクチン（スミス ク
ライン）を各々０日、３０日後及び６０日後の３回の接
種を行った。同じ日の接種前に血液サンプルを採取し、
接種途中１５目目、及び接種完了後の、接種後７５日
目、９０日目にも血液サンプルを採取した。グループ全
員の４５％に皮下接種を行い、残りは筋肉内接種（三角
筋）を行ったが、年齢、性別及び接種方法はそれ程違わ
ないようにした。ワクチン接種の全スケジュールを完了
した９０日後、ＣＶ２０ｗｏを接種した３１人のうち２
９人が免疫された。検査を受けた全員が、認知された最
少感染防御接種レベル（ＭＰＬ）の１０ＩＵ／ｌよりも
大きな抗体力価を示した。相乗平均力価（ＧＭＴ）は２
３９．９ＩＵ／ｌであった。ＣＶ１０を接種した３０人
のうち２６人が免疫され、検査された。全員が上記ＭＰ
Ｌ値より大きな抗体力価を示し、上記ＧＭＴ値が２１
８．４ＩＵ／ｌであった。一方ＳＫ２０を接種した２７
人のうち２６人が免疫され、検査された。このうち２３
人（８８．５％）がＧＭＴ値４３．９ＩＵ／ｌという抗
体力価を示したが、ＭＰＬ値を越えたのは２１人のみ
（８０．８％）であった。接種後９０日後の結果と７５
日目（３回目の投与の１５日後）を比較してみると、キ
ューバワクチンＣＶ２０とＣＶ１０の両方は血清変換の
最大率（１００％）を保持しており上記ＭＰＬ値より大
きな力価で免疫された人は１００％迄増加してた。一方
ＳＫ２０で免疫された人は９６．３％から８８．５％に
減っているが、上記ＭＰＬ値より大きな力価で免疫され
た人は７４．４％から８８．８％に増加している。これ
らのデータは二つのキューバワクチン組成物よりも、Ｓ
Ｋ２０がかなり劣る事を示している。従って、８１人の
ワクチン接種を受け検査され、ワクチン接種の全てのス
ケジュールを完了した人々（最初に接種された人のうち
９２％）のうち、７８人（９６．３％）に血清変換が認
められた。この７８人のうち、どちらかのキューバワク
チンを接種した５５人が全てＭＰＬ値よりも大きな抗体
力価を示し、一方、市販のワクチン（スミス クライ
ン）を接種した２３人（８８．５％）の中の２１人（８
０．８％）がＭＰＬ値よりも大きな抗体力価を示した。
従って、キューバワクチンに有利なこれらの結果に基づ
いて、この調査を上記したような方法で選定し、異なる
機関で集められた多数のグループに迄広げることを決定
した。このフェーズΠ臨床試験から得た結果を図１１、
図１２に要約して記載してある。これらの図により、皮
下接種及び筋内接種による接種処置を行うと、両ワクチ
ン組成物（キューバワクチン及びスミス クラインワク
チン）への応答レベルがわかる。
【００３５】
【発明の効果】本発明の方法により、非常に純粋で均質
な粒子状で高い免疫原性を有するＢ型肝炎ウイルス組換
え表面抗原を高収率で取得することができる。又、該抗
原を有効成分とするＢ型肝炎ウイルスワクチン組成物
は、哺乳動物、特に人間に対して有効である。
な粒子状で高い免疫原性を有するＢ型肝炎ウイルス組換
え表面抗原を高収率で取得することができる。又、該抗
原を有効成分とするＢ型肝炎ウイルスワクチン組成物
は、哺乳動物、特に人間に対して有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、サッカロミセス セレビシエの酵素Ｇ
ＡＰ遺伝子の転写制御シグナルを含む、ＮｃｏＩで開環
しＳ１ヌクレアーゼとアルカリ ホスファターゼ処理し
たＨＢｓＡｇ遺伝子サブクローニング用プラスミドｐＢ
Ｓ５を示す。略号Ｂ、ＮおよびＳは、それぞれＢａｍＨ
Ｉ、ＮｃｏｌおよびＳａｌＩの切断部位を示す。
ＡＰ遺伝子の転写制御シグナルを含む、ＮｃｏＩで開環
しＳ１ヌクレアーゼとアルカリ ホスファターゼ処理し
たＨＢｓＡｇ遺伝子サブクローニング用プラスミドｐＢ
Ｓ５を示す。略号Ｂ、ＮおよびＳは、それぞれＢａｍＨ
Ｉ、ＮｃｏｌおよびＳａｌＩの切断部位を示す。
【図２】図２は、ＨＢｓＡｇ遺伝子をｐＢＳ５に組み込
んだＨＢｓＡｇ遺伝子サブクローニング用プラスミドｐ
ＰＣＡ３を示す。
んだＨＢｓＡｇ遺伝子サブクローニング用プラスミドｐ
ＰＣＡ３を示す。
【図３】図３は、ｐＰＣＡ３においてＨＢｓＡｇ遺伝子
の５’末端と３’末端のノンコーディング領域を除去し
たＨＢｓＡｇ遺伝子サブクローニング用プラスミドｐＰ
ＣＢ６を示す。
の５’末端と３’末端のノンコーディング領域を除去し
たＨＢｓＡｇ遺伝子サブクローニング用プラスミドｐＰ
ＣＢ６を示す。
【図４】図４は、ピヒア パストリス染色体の遺伝子ラ
イブラリーから得られるプラスミドｐＣＡＯ１０を示
す。略号Ｅ１、ＥＶおよびＢｇＩＩは、それぞれＥｃｏ
ＲＩ、ＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩの切断部位を示す。
イブラリーから得られるプラスミドｐＣＡＯ１０を示
す。略号Ｅ１、ＥＶおよびＢｇＩＩは、それぞれＥｃｏ
ＲＩ、ＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩの切断部位を示す。
【図５】図５は、酵素ＡＯＸ１遺伝子のプロモーターと
５’末端のノンコーデイング領域を含む断片をプラスミ
ドｐＢＲ３２２にサブクローニングして得られるプラス
ミドｐＰＡＯ２３を示す。略号ＣはＣｌａＩの切断部位
を示す。
５’末端のノンコーデイング領域を含む断片をプラスミ
ドｐＢＲ３２２にサブクローニングして得られるプラス
ミドｐＰＡＯ２３を示す。略号ＣはＣｌａＩの切断部位
を示す。
【図６】図６はｐＰＡＯ２３に含まれる酵素ＡＯＸ１遺
伝子の５’末端と３’末端に合成オリゴヌクレオチドを
結合して得られるプラスミドｐＭＡＯ１０７を示す。
伝子の５’末端と３’末端に合成オリゴヌクレオチドを
結合して得られるプラスミドｐＭＡＯ１０７を示す。
【図７】図７は、酵素ＡＯＸ１のプロモーターの支配下
でＨＢｓＡｇ遺伝子をサブクローニングして得られるプ
ラスミドｐＨＡＯ１１２の構築の順序を示す。
でＨＢｓＡｇ遺伝子をサブクローニングして得られるプ
ラスミドｐＨＡＯ１１２の構築の順序を示す。
【図８】図８は、ｐＨＡＯ１１２にＡＯＸ１の３’末端
ノンコーディング領域をサブクローニングして得られる
プラスミドｐＶＡＯ７２１の構築の順序を示す。略号Ｃ
ＩＰは子牛腸内ホスファターゼを示す。
ノンコーディング領域をサブクローニングして得られる
プラスミドｐＶＡＯ７２１の構築の順序を示す。略号Ｃ
ＩＰは子牛腸内ホスファターゼを示す。
【図９】図９は、サッカロミセス セレビシエのｈｉｓ
３遺伝子を含むプラスミドｐＰＭＣを示す。
３遺伝子を含むプラスミドｐＰＭＣを示す。
【図１０】図１０は、ｐＶＡＯ７２１にサッカロミセス
セレビシエのｈｉｓ３遺伝子を含む断片をクローニン
グして得られるＨＢｓＡｇ遺伝子発現用プラスミドｐＴ
ＡＯ９０６を示す。
セレビシエのｈｉｓ３遺伝子を含む断片をクローニン
グして得られるＨＢｓＡｇ遺伝子発現用プラスミドｐＴ
ＡＯ９０６を示す。
【図１１】図１１は、二つの機関の各グループについ
て、キューバワクチン２０μｇと１０μｇ、およびスミ
ス クラインワクチン２０μｇをそれぞれ接種して９０
日目に測定した免疫原性の比較のグラフを示す。
て、キューバワクチン２０μｇと１０μｇ、およびスミ
ス クラインワクチン２０μｇをそれぞれ接種して９０
日目に測定した免疫原性の比較のグラフを示す。
【図１２】図１２は、五つの機関の各グループについ
て、キューバワクチン２０μｇと１０μｇ、およびスミ
ス クラインワクチン２０μｇを接種して９０日目に測
定した免疫原性の比較のグラフを示す。
て、キューバワクチン２０μｇと１０μｇ、およびスミ
ス クラインワクチン２０μｇを接種して９０日目に測
定した免疫原性の比較のグラフを示す。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｓ 8413−4Ｃ (72)発明者 エデユアルド ペントン アリアズ キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、 エントレ 33 イ 35、カツレ30、 3303 (72)発明者 マニユエル パロウ ガルシア キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、プラザ デ ラ レボルシオン、ベダ ド、アプト ６ エントレ パセオ イ アー、カツレ ５タ、435 (72)発明者 ギウベル フオンテイロツシイ エスコバ ール キユーバ国、カマギユーエイ、 エデン、 エントレ １ラ イ ２ダ カツレ サル ジエント オリベラ、86、 (72)発明者 マルセロ ナザバール ガルベス キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、マリアナーオ、 エントレ ヘレラ イ ポラール、アベ 51、31 (72)発明者 マルタ デ ヘサス ゴンザレス グリエ ゴ キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、プラザデ ラ レボルシオン、ベダ ド、エントレ ４ イ ６、カツレ 17、 557 (72)発明者 アレジヤンドロ ベルダレイン イズナガ キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、 マリアナーオ、サンタ フエリシ ア、エントレ 49 イ 51、アプト５、カ ツレ76、4902 (72)発明者 グイレルモ ジユリオ パドロン ゴンザ レス キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、 キユーバナカン、エント レ アベ 31 イ 33、カツレ 184、 3112 (72)発明者 ヴイクトリア ラミレス アルヴエイジ キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、プラザデ ラ レボルシオン、ベダ ド、エントレ ４ イ ６、カツレ ア ー、85 (72)発明者 アルナルド ガルシア ペーニヤ キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、キユーバナカン、エントレ 31 イ 33、カツレ 184、3112 (72)発明者 カルロス エンリツク ルイーズ クルス キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、マリアナーオ、 エントレ 104 イ 106、アベ 39、10410 (72)発明者 グラデイス マベール イズケルド ロペ ス キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、10 デ オクテユーブレ、ビボラ、エ ントレ ゲルトルデイス イ ホセフイー ナ、カツレ ゲラベツト、160 (72)発明者 ルイース サトウルニノ ヘレーラ マル テイネス キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、 カツレ 96 エントレ、 ３アー イ ３アー アー (72)発明者 カルロス アントニオ デユアルト カノ キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、セントル ハバナ、エントレ キユー ベイ サン イグナシオ、アプト 19、カ ツレエンペドラド、211 (72)発明者 リリア ルイーザ ペレス スアレス キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、ブラーヤ、キユーバナカン、エントレ 31 イ 33、カツレ 184 3112 (72)発明者 ホセ ガルシア カバレロ キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、サン ミゲル デル パドロン、エン トレ １ラ イ サン アントニオ カロ リーナ、 ラケル、20905 (72)発明者 グスタボ アルベルト デ ラ リバ デ ラ リバ キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、ビボラ、エントレ デストランペス イ ゴイキユリア、アプト シー、コヌ コ、82 (72)発明者 アレクシス エス ムサツチーノ ラサ キユーバ国、シウダツド デ ラ ハバ ナ、マリエール、エントレ 71 イ 73、 カツレ 128、7117
Claims (21)
- 【請求項１】 Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原をコードする
遺伝子を含有しそして該遺伝子を発現してなるピヒア
パストリス細胞からＢ型肝炎ウイルス表面抗原を取得す
る方法にして、 （１）カオトロピック剤、スクロースおよびエチレンジ
アミン四酢酸を含む緩衝液の存在下で上記ピヒア パス
トリス細胞を溶菌し、 （２）不純物を酸性ｐＨ領域で沈殿させて粗抗原を得、 （３）該粗抗原を酸性下でケイソウ土塊に吸着させ、次
にアルカリ性下で脱着し、 （４）脱着された粗抗原をＢ型肝炎ウイルス表面抗原に
特異的なモノクローナル抗体を用いるイミュノアフィニ
ティークロマトグラフィーにかけ、 （５）得られる溶出抗原を３０〜４０℃の温度での熱処
理にかけ、 （６）陰イオン交換カラムで抗原を洗剤により洗浄し、
そして （７）得られる溶出抗原を洗剤の存在下で高速液体クロ
マトグラフィーにかける、ことを包含する方法。 - 【請求項２】 工程（１）での上記ピヒア パストリス
細胞の溶菌を、チオシアン酸カリウム、スクロース、エ
チレンジアミン四酢酸、トリスおよび食塩からなる緩衝
液の存在下で行なう請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 工程（１）での上記ピヒア パストリス
細胞の溶菌を、１〜４Ｍチオシアン酸カリウム、１〜１
５％（ｗ／ｖ）スクロース、２．５〜３．５ｍＭエチレ
ンジアミン四酢酸、１０〜３０ｍＭトリスおよび０．１
〜１Ｍ食塩よりなる緩衝液の存在下で行なう請求項２に
記載の方法。 - 【請求項４】 工程（２）での酸性下で不純物の沈殿を
ｐＨ３〜４の条件下で行なう請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 工程（２）で形成される沈殿物を除去し
て得られる粗抗原をｐＨ７〜８の条件下で保存する請求
項１に記載の方法。 - 【請求項６】 工程（２）で形成される沈殿物を除去し
て得られる粗抗原を、工程（３）においてｐＨ３〜５の
条件下でケイソウ土塊と接触させて抗原を吸着させ、そ
してｐＨ３〜５の溶出緩衝液で不純物を溶出させ、次い
でｐＨ７．５〜 ９．０で抗原を脱着する請求項１に記
載の方法。 - 【請求項７】 工程（３）においてケイソウ土から脱着
された粗抗原を限外濾過によって濃縮し、そして透析濾
過によって脱塩する請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 工程（４）において粗抗原のイミュノア
フィニティークロマトグラフィー処理に用いられるモノ
クローナル抗体が、抗原性Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原粒
子に対する高い親和性で選ばれるモノクローナル抗体で
ある請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 工程（４）において粗抗原のイミュノア
フィニティークロマトグラフィー処理に用いられるモノ
クローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞ＥＣＡＣＣ ９
０ １１２ ６０６によって産生される抗ＨＢｓＡｇ
ＣＢ−ＨＥＰ１である請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 工程（４）において、イミュノアフィ
ニティークロマトグラフィーカラムから抗原をカオトロ
ピック剤を含有する緩衝液で溶出する請求項１に記載の
方法。 - 【請求項１１】 工程（５）において、３０〜４０℃で
の溶出抗原の熱処理を１〜６時間行なう請求項１に記載
の方法。 - 【請求項１２】 工程（６）において、ＤＥＡＥセルロ
ースカラムで抗原をデオキシコール酸ナトリウムおよび
トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００より選ばれる洗剤
によって洗浄する請求項１に記載の方法。 - 【請求項１３】 工程（６）において、陰イオンカラム
で抗原を０．０１〜０．５重量％の濃度の洗剤により洗
浄する請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１４】 工程（７）において、溶出抗原を、デ
オキシコール酸ナトリウムのような洗剤の存在下で、分
画分子量が２０，０００〜１０，０００，０００の間に
ある高速液体クロマトグラフィーにかける請求項１に記
載の方法。 - 【請求項１５】 工程（７）において、０．０１〜０．
５重量％の濃度の洗剤の存在下で抗原を高速クロマトグ
ラフィーにかける請求項１に記載の方法。 - 【請求項１６】 Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を、組換え
ピヒア パストリス株Ｃ２２６〔ｐＴＡＯ９０６〕、Ｃ
ＢＳ４５０．９０から回収する請求項１に記載の方法。 - 【請求項１７】 組換えピヒア パストリス株Ｃ２２６
〔ｐＴＡＯ９０６〕、ＣＢＳ４５０．９０。 - 【請求項１８】 ハイブリドーマ細胞ＥＣＡＣＣ ９０
１１２ ６０６。 - 【請求項１９】 ハイブリドーマ細胞ＥＣＡＣＣ ９０
１１２ ６０６により産生される抗ＨＢｓＡｇ ＣＢ
−ＨＥＰ１モノクローナル抗体。 - 【請求項２０】 請求項１〜１６のいずれかの方法によ
り得ることのできる組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原。 - 【請求項２１】 請求項１〜１６のいずれかの方法によ
り得ることのできる組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原の
予防免疫量と、ワクチン組成物に使用するのに適した少
くとも１種の担体、稀釈剤またはアジュバントを包含し
てなるＢ型肝炎ウイルスワクチン組成物。
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