DD284899A5

DD284899A5 - Verfahren zur herstellung eines plasmodium-impfstoffes

Info

Publication number: DD284899A5
Application number: DD88334294A
Authority: DD
Inventors: Teresa Cabezon; Wilde Michel De; Nigel Harford
Original assignee: ��@��`��k��
Priority date: 1987-01-30
Filing date: 1988-01-29
Publication date: 1990-11-28
Also published as: YU17488A; NZ223297A; CN1031395A; EP0278940A3; AU1093088A; NO880395D0; AP56A; PT86640B; AP8800078A0; NO880395L; JPS6463382A; OA08801A; KR880009130A; DD285612A5; FI880428A0; TNSN88004A1; MA21169A1; EP0278940A2; IL85216A0; DK43188D0

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen zur Prophylaxe von Plasmodium-Infektionen, wobei rekombinante Oberflaechenproteine bzw. Hybridpartikeln von Plasmodium, verwendet werden, die durch ein gentechnologisches Verfahren gewonnen werden, bei dem man ein Plasmodium-Gen, das fuer das entsprechende Oberflaechenprotein codiert, oder einen Teil des Gens in Ablesephase an das 3-Ende mindestens eines Teils der Pre S2-Region des HBV-Genoms ligiert, wobei dieser Teil so grosz ist, dasz er fuer ein immunogenes Protein codiert, dieses Fusions-DNA-Molekuel an eine Expressionskontrollsequenz eines Expressionsvektors funktionell ligiert, das erhaltene rekombinante DNA-Molekuel in einen eukaryontischen Wirtsorganismus einschleust, den erhaltenen transformierten Wirtsorganismus in einem Kulturmedium zuechtet und aus dem Zell-Lysat oder Kulturmedium das Protein bzw. das Hybridpartikel isoliert.{Plasmodium; Oberflaechenprotein-Gen; Oberflaechenprotein; Hybridpartikel; Expressionsvektor; DNA-Rekombinationstechnik; Nachweis von induzierten Antikoerpern; Prophylaxe; Impfstoff gegen Plasmodium-Infektionen}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der Medizin zur Prophylaxe von Plasmodium-Infektionendes Menschen.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

A. Malaria-Impfstoffe

In entwickelten Ländern benötigt man einen Malaria-Impfstoff für Menschen, die einem erhöhtem Infektionsrisiko ausgesetzt sind. Solche sind militärisches Personal und Reisende in Gebiete, in denen Malaria endemisch ist. In Ländern der Dritten Welt benötigt man einen billigen Malaria-Impfstoff zur Immunisierung sehr vieler Menschen.

Zahlreiche neuere Arbeiten schlagen vor, daß eine sensitiver Wirt eine ausreichende Immunität gegenüber dem Sporozoiten einer einzelnen Spezies von PI asm odium erlangen kann durch die Produktion eigener Antikörper gegen das circumsporozoide Protein (CS-Protein) des einzelnen Sporozoiten.

Die DNA von Sporozoiten-Proteinen von einigen Typen von Plasmodium sind kloniert und einige davon durch Anwendung rekombinanter DNA-Techniken exprimiert worden.

Aus der US-Patentschrift 4466917 ist ein als p-44 bezeichnetes Sporozoiten-Polypeptid bekannt. Ferner ist die Klonierung und Expression seiner DNA in E. coli bekannt.

Aus Sharma et al., Science, 228 (1985), 879-882, ist die Expression eines Teiles des CS-Proteins von Plasmodium knowlesi in Hefe bekannt. Der verwendete Expressionsvektor enthält die 5'-regulatorische Region des Hefe-Alkohol-Dehydrogenase I-Gens anstelle der 5' „upstream" Region des Plasmodium knowlesi CS-Gens.

Aus WO 84-02922-A ist die Klonierung eines DNA-Bereichs einer sich wiederholenden Protein-Untereinheit des CS-Proteins von P. knowlesi bekannt. Ferner ist die Expression dieses DNA-Fragments als Fusionsprotein mit ß-Lactose oder ß-Galactosidase in E. coli bekannt.

Aus WO 84-02917-A ist die Klonierung und Expression in E. coli einer codierenden Sequenz des CS-Proteins aus dem Blut-Stadium von P. falciparum bekannt.

Aus Dame et. al., Science, 225 (1984), 593, ist die Klonierung und Expression des CS-Proteins von P. falciparum in E. coli bekannt. Das Protein besitzt etwa 412 Aminosäuren und ein Molekulargewicht von etwa 44 000. Es besitzt 41 sich wiederholende Einheiten eines Tetrapeptids. Synthetische Peptide mit 7,11 oder 15 Aminosäureresten der sich wiederholenden Einheit binden an monoklonale Antikörper, die gegen das CS-Protein gerichtet sind.

Aus Ellis et al., Nature, 302 (1983), 536-538, ist die Expression eines Fusionsproteins in E. coli aus ß-Lactamase und P. knowlesi CS-Protein bekannt.

Aus Enea et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 81 (1984), 7520-7524, ist eine analoge sich wiederholende Struktur in dem CS-Protein von P. cynomolgi bekannt. Ferner ist die Klonierung und Expression der DNA des CS-Proteins in E. coli und seine codierende Sequenz bekannt.

Aus Ballou et al., Science, 228 (1985), 996-999, ist bekannt, daß synthetische Peptide der sich wiederholenden Struktur des CS-Proteins von Plasmodium falciparum, die mit Rinderserum Albumin (BSA) oder Thyroglobulin verbunden sind, in Mäusen und Kaninchen zu einer Antikörperantwort führen. Daraus wurde geschlossen, daß ein Impfstoff gegen das Sporozoitenstadium des Malaria-Parasiten entwickelt werden kann, indem synthetische Peptide der sich wiederholenden Struktur des CS-Proteins mit einem Carrier-Protein gebunden werden.

Aus Weber et al.. Molecular and Bacterial Parasitology, 15(1985), 305-316, ist bekannt, daß ein kloniertes Gen des CS-Proteins eines brasilianischen Stammes von P. falciparum als Sonde verwendet werden kann, um die Struktur von 17 anderen

P. falciparum-Stämmen durch Nucleinsäure-Hybridisierung zu analysieren. Daraus wurde geschlossen, daß das Gen des CS-Proteins hoch konserviert ist und daß die Entwicklung eines Malaria-Impfstoffes mit dem CS-Protein wahrscheinlich nicht durch Stammvariationen erschwert sein wird.

Aus Arnot et al., Science, 230 (1985), 815-818, ist die Klonierung des CS-Protein-Gens von P. vivax und seine codierende Sequenz bekannt. Daraus ergab sich, daß die codierende DNA-Sequenz des CS-Proteins von P. vivax homolog zu jener des CS-Gens von

P. knowlesi, nicht aber homolog zu jener von P. falciparum ist.

Aus Sharma et al., Science, 229 (1985), 779-782, ist die komplette Nucleotidsequenz der codierenden Region des CS-Gens aus dem Nuri-Stamm von P. knowlesi bekannt.

Aus Young et al., Science, 228 (1985), 958—962, ist die Expression des CS-Proteins von P. falciparum in E. coli und seine mögliche Anwendung in einem Malaria-Impfstoff für den Menschen bekannt.

Aus WO 84/02917 ist die künstliche Herstellung von Polynucleotid-Sequenzen, die im wesentlichen der gesamten oder nur einem Teil der mRNA oder der genomischen DNA von P. falciparum entsprechen, bekannt. Ferner ist das einer solchen Sequenz entsprechende Peptid und ein Verfahren zu seiner Herstellung bekannt, ebenso ein Mittel, um in einem Säugetier, das ein solches Peptid enthält, eine Immunantwort gegen P. falciparum Antigene zu stimulieren.

Aus Mazier et al., Science, 231 (1986), 156-159, ist bekannt, daß gebildete Antikörper nach der Immunisierung von Mäusen mit mehreren rekombinanten und synthetischen Peptiden des CS-Proteins von P. falciparum in einer menschlichen Leberzellkultur einen dreifachen Schutz vor dem Parasiten zeigen, nämlich einen Schutz vorder Anheftung des Sporozoiten an die Leberzell-Oberfläche, vor dem Eintritt und der nachfolgenden intracellulären Entwicklung des Sporozoiten.

B. Hepatitis B-Impfstoffe

Die Infektion mit Hepatitis B Virus (HBV) ist ein ernstes, weit verbreitetes Gesundheitsproblem. Die Infektion kann akut oder chronisch sein. In den Vereinigten Staaten wird die Zahl der akuten Hepatitisfälle auf mindestens 100000 pro Jahr mit einer Todesrate von 1 bis 2% geschätzt. Als chronische Übertrager von HBV werden unter gesunden Erwachsenen abhängig vom Alter und sozialer Schicht 0,1 bis 1 % eingestuft. In Südamerika gelten etwa 1 bis 3%, in der UdSSR und Südeuropa etwa 3 bis 6% und in Asien und Afrika mehr als 10% als chronische HBV-Überträger.

In entwickelten Ländern benötigt man einen Impfstoff für Menschen, die einem erhöhten Infektionsrisiko ausgesetzt sind. Solche sind Patienten und Personal in medizinischen Einrichtungen, wo man mit Blut in Kontakt kommt, militärisches Personal, Ehepartner von chronischen HBV-Überträgern, Reisende in HBV-endemische Gebiete, Neugeborene von chronischen HBV-Überträgern, Homosexuelle, Prostituierte und Drogenabhängige. In Ländern der Dritten Welt benötigt man einen billigen Impfstoff zur Immunisierung sehr vieler Menschen. Eine solche Immunisierung kann schließlich nicht nur die Zahl akuter Hepatitisfälle und chronischer HBV-Überträger verringern, sondern auch die Erkrankungsziffer und Sterblichkeitsrate bei chronischer aktiver Hepatitis und Leberzellkarzinom reduzieren.

Dane-Partikel, die man für Hepatitis B Virionen hält und die man aus infizierten Patienten isolieren kann, haben einen Durchmesser von etwa 42 nm. Jedes Partikel besteht aus einer Hülle, die das Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg) enthält, einem Capsid (HBcAg), einer endogenen Polymerase und einem DNA-Genom. Das Genom ist zirkulär und doppelsträngig mit einem Einzelstrangbereich von etwa 200 Basen. Der Einzelstrangbereich kann in vitro durch die endogene Polymerase zum Doppelstrang gemacht werden. Das DNA-Genom enthält etwa 3200 Basen.

Die Herstellung von H BV-I mpf stoff en stellte sich seit langem als schwierig heraus, da das Virus nur schwer in Gewebekultur vermehrbar ist und nur der Mensch als Wirt bekannt ist. Im Labor ist es jedoch möglich, auch Schimpansen mit dem Virus zu infizieren.

Aus Valenzuela et al., Nature 298 (1982), 347-350, ist die Expression von HBsAg in Hefe bekannt. Die codierende Sequenz von HBsAg, ein 835-Basenpaar großes Taq1-Hpa1-Fragment, wird unter die Kontrolle des Hefe-Alkohol-Dehydrogenase-I-Promotors gestellt. Dieser Arbeit gingen mehrere kurze Berichte über Forschungsaktivitäten auf diesem Gebiet voraus. Dazu gehört die Arbeit von Valenzuela et al., Arch. Biol. Med. Exp. (Chile), 14(1) (1981), 21-22, aus der die Expression eines DNA-Fragments in Hefe bekannt ist, das für ein Protein codiert, das ähnlich zu HBsAg ist. Dieses DNA-Fragment wird unter die Kontrolle des Hefe-Alkohol-Dehydrogenase I-Promotors gestellt. Ferner ist aus einer Arbeit in Scrip Nr.616, S. 14 (12. Aug. 1981) bekannt, daß ein Team von US-Wissenschaftlern, dem P. Valenzuela und W. J. Rutter angehören, die Herstellung des Hüllproteins von Hepatitis ßVirus in Hefe angekündigt haben. Aus Zuckerman, Nature, 295, (1982), 98-99, ist bekannt, daß W. J. Rutter über die Expression von glykosyliertem HBsAg in Hefezellen berichtet hat.

Antigene Komponenten von HBV, wie HBsAg, sind laut Berichten in Bakterien hergestellt worden, in die ein rekombininantes DNA-Molekül eingeschleust wurde, dasein Gen enthält, das für das Antigen codiert. Aus Burrell et al., Nature, 279, Nr. 5708 (1979), 43—47, ist die Expression von HBV-DNA-Sequenzen in E. coli, Stamm HB101, bekannt. Diese DNA-Sequenzen lagen kloniert in dem Plasmid pBR322 vor.

Aus der Europäischen Patentanmeldung Nr. 13282 ist die Herstellung eines rekombinanten Vektors bekannt, der für HBV-Antigene, wie HBsAg, codiert. Der Vektor wird aus der DNA von Dane-Partikeln und des Plasmids pBR322 hergestellt und eignet sich zur Transformation des E. coli Stammes HB101. Die Autoren geben an, daß als geeignete Wirte auch andere bakterielle Zellen, Hefe und Pilze, animalische und pflanzliche Zellen und andere Wirte zu verstehen sind, obwohl in dieser Anmeldung nur

E. coli als Wirtssystem verwendet wird.

Aus Charnay et al., Nature 286 (1980), 893—895, ist die Konstruktion eines Bacteriophagen bekannt, der ein Fusionsgen aus dem

ß-Galactosidase-Gen und dem Strukturgen HBsAg enthält. Der Bacteriophage führt zur Expression eines Fusionsproteins, das die antigenen Determinanten von HBsAg und ß-Galactosidase enthält.

Aus derGB-Patentanmeldung Nr.2034323 ist die Herstellung eines Phagen, der HBV-DNA enthält, bekannt. Der E. coli Stamm C600 wird durch diesen rekombinanten Phagen transformiert.

Aus der GB-Patentanmeldung Nr. 2 070621 ist ein Plasmid bekannt, das einen Teil des HBsAg-Gens, den Promoter und das Z-Gen des Lactose-Operons besitzt, und das in E. coli kloniert wurde.

Aus der Europäischen Patentanmeldung Nr.20251 sind rekombinante Vektoren aus dem Plasmid pBR322 und BamH I-Fragmenten von HBV-DNA bekannt, die zur Transformation von E. coli verwendet werden können. Andere Vektoren, die ein BamH I-Fragment von HBV-DNA und einen Teil des Tryptophan-Operons enthalten, wurden verwendet, um Expression in E. coli. Stamm HB101, zu erhalten.

Aus Edman et al., Nature 291, Nr. 5815 (1981), 503-506, ist die Konstruktion von Plasmiden bekannt, die zur Expression von HBcAg und einem Fusionsprotein aus ß-Lactamase-HBsAg in E. coli führen. Die Expression findet unter Kontrolle des regulatorischen Bereiches des Tryptophan-Operons statt.

Aus Pumpen et al., Gene, 30, (1984), 202-210, ist bekannt, daß geringe Mengen des HBsAg-Monomers und Fusionsproteine in E. coli synthetisiert werden. Die Expression wird durch Antikörper nachgewiesen, die mit dem denaturierten HBsAg-Monomer reagieren.

Andere Literaturzitate, in denen die Insertion von HBV-DNA in Bakterien offenbart wird, sind folgende: Charnay et al., Progr. Med. Virol., 27 (1981), 88-92; MacKay et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S. 78, Nr.7 (1981), 4510-4514; Fritsch et al., C. R. Acad. Sei., 287, Nr. 16 (1978), 1453; GB-Patentanmeldung 2034323 (Derwent Nr.46874C) und Paseket al., Nature, 282, Nr.6 (1979), 575. HBV-DNA wurde auch in Säugetierzellen kloniert, nämlich in Zellen des Menschen, der Maus und in Zellen eines menschlichen Lebertumors. Aus Dubois et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S., 77, Nr. 8 (1980), 4549-4553, ist beispielsweise die Transformation von Mauszellen mit einem Plasmid bekannt, das das HBV-Genom enthält. Die Expression von HBsAg wird offenbart; aus Hirschman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S., 77, Nr.9 (1980), 5507-5511, ist die Herstellung von HBV-ähnlichen Partikeln durch HeLa-Zellen bekannt, die mit HBV-DNA transformiert wurden.

Aus Funakoshi et al., Progr. Med. Virol., 27 (1981), 163-167, und Maupas et al., Progr. Med. Virol., 27 (1981), 185-201, sind Verfahren bekannt, um durch Verwendung von HBsAg aus menschlichem Blut HBV-Impfstoffe herzustellen. Der Impfstoff von Funakoshi et al. enthält 40 pg gereinigtes, formalinbehandeltes HBsAg, Phosphat, Natriumchlorid, 20 mg Mannit und als Adjuvans 0,1 % Aluminiumhydroxid. Aus der Arbeit von Maupas et al. ist bekannt, daß eine Dosis des Impfstoffes 1 ml war, der 2 bis 10 Mg gereinigtes, formalinbehandeltes HBsAg (bestimmt nach der Methode von Lowry) und 0,1 % Aluminiumhydroxid enthält. DasvonMaupusetal. verwendete Protokoll forderte drei Injektionen im Abstand von je einem Monat mit einer Auffrischimpfung nach einem Jahr; die Autoren schlagen zwei Injektionen von konzentriertem HBsAg im Abstand von drei Monaten vor. Ergänzende Literaturzitate zur Herstellung von HBV-Impfstoffen sind Maupas et al., Adamowicz et al. und Funakoshi et al. bzw. auf den Seiten 3, 37 und 57 von Hepatitis B Vaccine INSERM Symposium No. 18, herausgegeben durch Maupas und Guesry, 1981, Elsevier/North-Holland Biomedical Press.

Hefen sind als Wirtsorganismen zur Expression von bestimmten DNA-Sequenzen verwendet worden. Diese Sequenzen sind jedoch keine HBV-DNA-Sequenzen. Aus der GB-Patentanmeldung Nr.2068969 ist die Herstellung von Hühner-Ovalbumin in Hefe bekannt; aus einer Arbeit in Scrip Nr. 640, S. 11 (4. Nov. 1981) ist bekannt, daß ein Interferon-Typ in Hefe hergestellt wird. Aus dem Europäischen Patent 11 562 (Derwent Nr.38762C) sind hybride Hefeplasmide bekannt, die das uraj Hefe-Gen in dem 2μ Plasmid enthalten.

Das natürliche Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen (HBsAg) kann aus Plasma von infizierten Individuen als ein 22 nm großes Partikel isoliert werden. Dieses Partikel besteht aus den zwei Proteinen P24 und seinem glykosyliertem Derivat GP28. Beide Proteine besitzen 226 Aminosäuren und werden von dem Gen S des HBV-Genoms codiert. Eine für 163 Aminosäuren codierende DNA-Sequenz, die unmittelbar vor der codierenden Sequenz des S-Proteins auf dem HBV-Genom liegt, wird als Pre-S-codierende Sequenz bezeichnet. Ein für 55 Aminosäuren codierender DNA-Bereich der Pre S-codierenden Sequenz, der unmittelbar vor der codierenden Sequenz des S-Proteins liegt, wird als Pre S 2-codierende Sequenz bezeichnet. Der für die übrigen 108 Aminosäuren codierende DNA-Bereich der Pre S-codierenden Sequenz wird als Pre S1-codierende Sequenz bezeichnet. Die Pre S-codierende Sequenz oder irgendein kleiner Teil davon wird auch als die DNA-Sequenz bezeichnet, die für das HBsAg-Vorläuferprotein codiert.

Die Pre S-codierende Sequenz von einigen HBV-Subtypen (z.B. ayw) umfaßt 163 Codons, während sie bei anderen HBV-Subtypen (z.B. adw₂) 174 Codons besitzt. In jedem Fall besitzt die Pre S2-Region 55 Codons und liegt unmittelbar vor der codierenden Sequenz des S-Proteins.

In der Pre S2-codierenden Sequenz liegt dieBindungs-oder Rezeptorstelle für Polyalbumin, die auf der Oberfläche von Dane-Partikeln und auf der Oberfläche von einigen HBsAg-Partikeln gefunden wird, welche aus dem Serum von HBV-infizierten Patienten isoliert werden. Obwohl die Pre S2-Region unmittelbar vor der codierenden Region des S-Proteins auf dem HBV-Genom liegt, ist die Pre S 2-Region nicht an der Zusammensetzung von HBsAg-Partikeln beteiligt; vgl. z. B. Persing et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82 (1985), 3440-3444.

Aus Valenzuela et al., Nature, 298 (1982), 347-350, sind HBsAg-ähnliche Partikel bekannt, die nach Aufschluß von Hefezellen gefunden wurden, welche mit einem Vektor transformiert wurden, der die codierende Sequenz des Proteins enthält. Daraus wurde geschlossen, daß HBsAg-Partikel in Hefe synthetisiert werden.

Aus Harford et al., Developments in Biological Standardization, 54 (1983), 125-139, sind HBsAg-ähnliche Partikel bekannt, die nach Aufschluß von transformierten Hefezellen gefunden wurden. Diese Zellen wurden mit einem Vektor transformiert, der eine DNA-Sequenz enthält, die für 18 Aminosäuren der Ornithin-Carbamoyltransferase codiert. Dieser Sequenz folgten unmittelbar атЗ'-Endeein DNA-Bereich der Pre S2-codierenden Sequenz, der für 42 N-terminale Aminosäuren codiert und anschließend der codierende Bereich des S-Proteins.

Aus Laub et al., J. Virology, 48(1) (1983), 271-280, ist die Konstruktion eines Simian Virus 40 Vektors bekannt, in dem die frühe Region durch einen großen Teil des HBV-Genoms, der die Pre S-S proteincodierende Sequenz enthält, ersetzt ist. Diese HBV-DNA wurde in SV40 transformierten CV-1 Zellen (COS-Zellen) exprimiert.

Aus Stibbe et al., J. Virology, 46(2) (1983), 626-628, ist bekannt, daß GP33 und GP36 in geringen Mengen vorliegende HBsAg Glykoproteine durch die Pre S2-S proteincodierende Sequenz codiert werden. Aus Stibbe et al., Dev. Biol. Stand., 54 (1983), 33-34, ist bekannt, daß HBsAg-Partikel, die große Mengen von GP33 und GP36 enthalten, keine höheren Antikörpertiter gegen das Anti S-Protein enthalten, als jene HBsAg-Partikel, die fast frei von GP33 und GP36 sind.

Aus Heerman et al., J. Virol., 52(2) (1984), 396-402, ist bekannt, daß die codierende Sequenz des Proteins S und die Pre S-codierende Sequenz, die für 389 Aminosäuren codieren, für das Poly peptid P 39 codieren. Dieses Poly peptid wird zusammen mit der glykolysierten Form GP42 und den anderen HBV-Oberflächenantigen-assoziierten Polypeptiden P24, GP27, GP33 und GP36 in HBV-Partikeln und viralen Antigenfilamenten gefunden.

Aus Neurath et al., Science, 224 (1984), 392-394, ist bekannt, daß Polypeptide mit 26 aminoterminalen Aminosäuren der Pre S2-codierenden Sequenz immunogen sind. Es wird darauf hingewiesen, daß Antikörper gegen diese Polypeptide für diagnostische Tests verwendet werden können.

Aus Michel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81 (1984), 7708-7712, ist die Expression von HBsAg, das Rezeptoren für das menschliche Serum Polyalbumin trägt, in chinesischen Hamster-Ovarienzellen (CHO) bekannt. Diese Zellen wurden mit einem Plasmid transfiziert, das die Pre S2-S proteincodierende Sequenz enthält.

Aus Persing et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82 (1985), 3440-3444, ist bekannt, daß Maus L-Zellen, die mit einer Pre S2-S-proteincodierenden Sequenz transformiert wurden, drei HBsAg-verwandte Polypeptide (24, 27 und35kd) exprimieren. Diese Polypeptide können zu komplexen immunreaktiven HBsAg-Partikeln mit einem Durchmesser von 22 nm ausgebildet werden, die polymerisiertes menschliches Serumalbumin (HSA) binden; Maus L-Zellen dagegen, die mit einer Pre S2-S-codierenden Sequenz, die am З'-Endeder Pre S2-Region eine Leserahmenmutation besitzt, transformiert wurden, können nur noch 24 und 27 kd große Polypeptide exprimieren, die zu immunreaktiven HBsAg-Partikeln mit einem Durchmesser von 22 nm ausgebildet werden können und nicht mehr HSA binden können. Persing et al. folgern daraus, daß die Pre S2-S-proteincodierende Sequenz für ein 35 kd großes Poly peptid codiert unddaßdas Pre S2-Protein für die HSA-Bindungsaktivität von HBsAg verantwortlich ist, nicht aber für die Zusammensetzung und Sekretion von HBsAg-Partikeln benötigt wird; es wird ferner geschlossen, daß das in großen Mengen vorliegende 24kd große Polypeptid von HBsAg nicht in erster Linie durch Spaltung von größeren Vorläuferproteinen (nämlich den 27 oder 35kd großen Peptiden) erhalten wird.

Aus Milich et al., Science, 228(1985), 1195-1199, ist bekannt, daß Impfstoffe, die HBV-Partikel mit Pre S2 und HBsAg enthalten, in bestimmten Mäusen eine Unempfindlichkeit verhindern können, die auftritt, wenn der Impfstoff nur HBsAg enthält; die verwendeten HBV-Partikel mit Pre S 2 und HBsAg wurden aus chinesischen Hamster-Ovarienzellen (CHO) erhalten, die mit einem Plasmid transfiziert worden waren, das die Pre S2-S proteincodierende Sequenz enthielt. Es ist ferner bekannt, daß die 26 Aminosäuren am Aminoterminus des 33kd großen Polypeptids, das durch die Pre S2-S proteincodierende Sequenz codiert wird, eine dominante Antikörperbindungsstelle in der PreS2-Region repräsentieren.

In Michel et al., „Vaccines 86", Brown et al., Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1986), 359-363, ist die Herstellung von Hepatitis B-Oberflächenantigenpartikel, die das Expressionsprodukt der Pre S2-Region enthalten, beschrieben.

Aus Neurath et al., Nature, 315 (1985), 154-156, ist bekannt, daß die Pre S-Region Proteine der HBV-Hülle codiert, die Domänen besitzen, die spezifisch durch Leberzellen erkannt werden; die Pre S2-S proteincodierende Sequenz für ein Protein codiert, das in HBV-Partikeln vorhanden ist; synthetische Peptide, die dem Gen entsprechen, das für Pre S-Proteine codiert, immunogen sind.

Neurath et al. schließen daraus, daß HBV-Impfstoffe Pre S-Determinanten enthalten sollten.

Aus Valenzuela et al., Biotechnology, 3 (1985), 317-320, ist die Expression der gesamten PreS2-S proteincodierenden Sequenz in Hefe bekannt; es ist ferner bekannt, daß diese Hefezellenein Partikel mit HBsAg und Pre S synthetisieren, das im Elektronenmikroskop und in den Sedimentationseigenschaften sehr ähnlich jenen Partikeln ist, die nur HBsAg enthalten, und daß die PreS2-Region nicht die Fähigkeit beeinträchtigt, Partikel auszubilden, die den 22 nm großen HBsAg-Partikeln sehr ähnlich sind. Aus Valenzuela et al. ist ferner die Hypothese bekannt, daß HBV in die Leber gelangt, indem der HBV-Polyalbumin-Rezeptor durch Polyalbumin an Leberzellen gebunden wird und somit das Virus aufgenommen wird, und daß der Polyalbumin-Rezeptor von HBV durch die Pre S2-Region codiert wird. Valenzuela schließt daraus, daß ein Impfstoff, der Pre S2 enthält, zur Bildung von Antikörpern führt, die nicht nur HBV über einen normalen Mechanismus inaktivieren, sondern auch die Aufnahme des Virus durch Leberzellen stören könnten.

Die Europäische Patentanmeldung Nr. 171 008-A beansprucht die Herstellung von nicht-glykosyliertem Hepatitis B Virus-Oberflächenantigen P31 Protein in Hefe.

Die Europäische Patentanmeldung Nr. 174 444-A 2 beansprucht ein Verfahren zur Herstellu ng in Hefe von HBsAg-Partikel,diedas P31 Protein enthalten.

Die folgende Tabelle I vergleicht die bekannten Aminosäuresequenzen der Pre S2-Region mit der HBV Pre S2-Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung:

Tabelle I

Vergleich der Aminosäuresequenz der Pre S2-Region von verschiedenen HBV-Serotypen

-55

Pre S2 codierende

-30

Region

-10 0

Literatur

L

T

K

L

T

D

Aspartat

L

He

I

V TT P

I

AP

Gegenstand

HBV

zitat

L

T

Threonin

L

Leu

L

V TT P

I

AP

Pre S 2 co

Sub-

Aminosäure-Abkürzungen

S

Serin

Tyr

Y

VLTT PL

I

AL

dierende

typ

MQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSSSARTGDPVTN

T

Asp

E

Glutaminsäure

Phe

F

V TTT P

I

AL

Region

-50 -40

-20

T

Th r

P

Prolin

His

H

IFS

1

T

Ser

G

Glycin

Lys

K

Isoleucin

I S

2

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T

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A

Alanin

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3

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C

Cystein

Trp

W

Tyrosin

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V

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Q

Phenylalanin

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M

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Asn

N

Histidin

6

adw

Cys

Lysin

7

adw

VaI

Arginin

8

adw

Met

Tryptophan

adw

Glutamin

adr

H

Asparagin

adr

ayw

adyw

Zitierte Literatur

1. Valenzuela et al.. In Animal Virus Genetics (Field. Jaenisch and Fox eds), 57-70, Acadamic Press. New York (1980).

2. Chow et al.. Fourth Annual Congress for Recombinant DNA Research, San Diego, USA, 1984.

3. FujisawaetaL.Nucl. Acids Res., 11 (19831,4601-4610.

4. Lo et al., Biochem Biophys. Res. Com., 2, (1986), 382-388.

5. Fujisawa et al., a. a. O.

6. Onoetal., Nucl. Acid Res., 11 (1983), 1747-1757.

7. Galibert et al.. Nature, 281 (1979), 646-650.

8. Pasek et al., Nature, 282 (1979), 575-579.

C. Polyvalente Impfstoffe

Aus Valenzuela et al., Biotechnology, 3 (1985), 323-327, ist bekannt, daß der HBsAg Polyalbuminrezeptor, der durch die Pre S2 codierende Sequenz codiert wird, zur Herstellung von polyvalenten Impfstoffen verwendet werden kann. Aus Valenzuela et al. ist ferner bekannt, daß durch Expression der hybriden HSV-1 gD-Pre S2-S proteincodierenden Sequenz in Hefe die Herstellung eines hybriden HBsAg-Herpes simplex 1-Virus G Iy ко protein D (HSV-1 g D) Partikels ermöglicht wird.

Aus Valenzuela, „Hepatitis B su bun it vaccines using recombinant DNA Techniques", 15. Mai 1985, Bio-Expo-5-Meeting, Boston Massachussetts, ist bekannt, daß bei einem Hybrid, wie dem vorstehend beschriebenen HBsAg-HSV-1 gD-Partikel, die immunologische Dominanz von HBsAg gegenüber dem fremden immunogenen Polypeptid, dasauf derOberflächedes Partikels präsentiert wird, gefährdet wird.

Aus der Europäischen Patentanmeldung 0175 261 ist ein neues hybrides Polypeptid bekannt, das zumindest einen großen Teil des Hepatitis B Oberflächen-Antigens fusioniert mit einem oder mehreren Oligopeptiden enthält. Das hybride Polypeptid ist in der Lage, in einem zellulären Wirt ein Partikel zu bilden, das zumindest ein Epitop von zumindest einem Oligopeptid präsentiert.

Proteine können posttranslationale Modifikationen erfahren und einige von diesen können die Konformation und Funktion des Proteins grundlegend beeinflussen. Oligosaccharid-Ketten an dem aus Menschen stammenden Pre SI-Pre S2-S und Pre S 2-S-Proteins (Heermanetal., J. Virol., 52 [1984], 396-402; Stibbe and Gerlich, Virology, 123 [1982], 436-442; Stibbe and Gerlich,

J. Virol., 46 [1983], 626-628, und vermutlich die Myristinsäure an dem Pre S 1- Pre S2-S-Protein (Persing et al. ,Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Molecular Biology of Hepatitis B viruses, 28.-31. Aug. 1986, Cold Spring Harbor Laboratory) könnten die Partikelbildung, die Konformation der Proteine in den Partikeln und die Antigenität und Immunogenität dieser Partikel beeinflussen.

Hefe (Saccharomyces cere visiae) besitzt die nötigen Enzyme, um Proteine zu glykosylieren (Ballou „The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Metabolism and Gene Expression"; Strathern, Jones and Broach Ed., Cold Spring Harbor Laboratory [1982], 335-360) und Fettsäuren zu acylieren (Towler and Glasler, Proc. Natl. Acad. Sei., 83 [1986], 2812-2816), ähnlich wie dies höhere eukaryontische Zellen vermögen.

Virale Oberflächenglykoproteine, die in Hefe exprimiert wurden, liegen glykosyliert vor. Aus Jabbar et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 82 (1985), 2019-2023, ist bekannt, daß die Expression des Hämagglutinin-Gens von Influenza in Hefen zu einem glykosylierten

Hämagglutinin-Protein führte. Aus Wen and Schlesinger, Proc. Natl. Acad. Sei., 83 (1986), 3639-3643, ist bekannt, daß die Expression von Glycoproteinen des Sindbis und vesiculären Stomatitits Virus in Hefe zu glykosylierten Virai-Proteinen führte. Aus Fujisawa et al. (Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Molecular Biology of Hepatitis B viruses, 28.-31. Aug. 1986, Cold Spring Harbor Laboratory, S.62) ist bekannt, daß die Expression des Pre S2-S Gens in Hefe zur Synthese von zwei glykosylierten Formen des PreS2-S Proteins führte. Aus Kniskern et al. (Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Modern Approaches to New Vaccines, Including Prevention of AIDS, 9.-14. Sept. 1986, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 89) ist bekannt, daß die Expression des Pre S1- Pre S 2-S Gens in Hefe zur Synthese von zwei Pre S1 - Pre S 2-S Proteinen mit einer Größe von 45 kd bzw. 39 kd führte. Aus Persing et al. (Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Molecular Biology of Hepatitis B viruses, 28.-31. Aug. 1986, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 19) ist bekannt, daß die Zugabe von ³H-markierter Myristinsäure zu COS7-Zellen, die Pre S1- Pre S2-S, Pre S2-S und S-Proteine exprimieren, zu radioaktiv markierten Pre S1- Pre S 2-S-Protein führte.

Fusionsproteine, die in Hefe exprimiert und in ein Partikel verpackt werden, werden nach dem allgemeinen Schema gereinigt: Aerosile Adsorption und Desorption (1) -» Calciumchlorid-Präzipitation (2) —> Phenylagarose oder Phenylboronatagarose-Adsorption und Desorption (3) —* Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugation oder DEAE-Ionenaustauschchromatographie. Schritt 1 ist aus der EP-A 0 204680 und Schritt 3 aus der EP-A 0199698, soweit es Phenylagarose betrifft, bekannt. Die spezifische Kombination von Schritt 1 und Schritt 3 ermöglicht es, kontaminierendes Material stark abzutrennen (Eliminierung von 90% Protein, Kohlenhydraten und 50% Lipide). Diese neue Kombination ermöglicht ein gutes Funktionieren der nächsten chromatographischen Schritte.

Im Falle von Fusionsproteinen, die glykosyliert sind, wird Phenylboronat (PBA) als Affinitätsadsorbens verwendet. Bei pH 9 bildet die Boronatgruppe kovalente Komplexe mit möglichen cis-Diolgruppen an den glykosylierten Seitenketten aus. PBA-GeIe sind gegebenenfalls zur Reinigung von löslichen Glykoproteinen nicht aber zur Reinigung von Partikeln, die Glykoproteine in der Lipid-Doppelschicht eingebettet haben, verwendet worden (vgl. Cook et al., Analyticyl Biochemistry, 149 [1985], 349-535; Middle et al.. Biochemical Journal, 209 [1983], 771-779; Cook et al., Biochemicaet Biophysica Acta, 828 [1985], 205-212; Maestasaneet al., Journal of Chromatography, 189 [1980], 225-231). Da das Partikel viele Liganden-Bindungsstellen enthält, müssen PBA-GeIe mit einer sehr niedrigen PB-Ligandendichte verwendet werden, z.B. PBA-GeIe mit einem Boronatgehalt von <10цд/тІ Gel, vorzugsweise 5 цд Boronat pro ml Gel. Die Verwendung von Phenylboronatgelen mit sehr niedrigem Boranatgehalt erlaubt die Affinitätschromatographie von Partikeln, die Glykoproteine eingebettet enthalten.

Ziel der Erfindung

Mit der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Plasmodium-Impfstoffes zur Verfügung gestellt, der gegen Malaria wirksam ist, kostengünstig hergestellt werden kann und zur Immunisierung vieler Menschen einsetzbar ist.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung eines billigen Malaria-Impfstoffes bereitzustellen. Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Malaria-Impfstoffes, bei dem ein rekombinantes DNA-Molekül verwendet wird, das eine funktionell codierende DNA-Sequenz enthält, die in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer Hepatitis B Virus (HBV) Preo S 2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist. Der Ausdruck „codierende Sequenz" oder „codierende Region", wie hier gebraucht, schließt auch ein beliebiges funktionelles Derivat davon ein. Mit dem Ausdruck „funktionelles Derivat" ist eine codierende Sequenz mit Aminosäure-Modifikationen gemeint, die, wo es angebracht ist, die Partikelbildung nicht stört und/oder die Immunogenität, wenn dies gewünscht ist, beibehält. Ein solches funktionelles Derivat kann durch die übliche ortsspezifische Mutagenese, wie durch Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193-1201, beschrieben, hergestellt werden. Im allgemeinen enthält ein solches DNA-Molekül eine regulatorische Region, die vorzugsweise von dem Hefe arg³-Gen stammt.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem ein rekombinanter Vektor verwendet wird, der ein rekombinantes DNA-Molekül enthält, das mit einer regulatorischen Region funktionell verbunden ist. Das DNA-Molekül enthält eine funktionell codierende DNA-Sequenz, die in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist. Mit dem Ausdruck „regulatorische Region", wie hier verwendet, ist eine DNA-Sequenz gemeint, die eine Promoter-Region und andere notwendige Sequenzen für die Transkription und Translation einer codierenden Sequenz enthält. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem eine eukaryontische Wirtszelle verwendet wird, die durch einen rekombinanten Vektor transformiert wird, welcher ein DNA-Molekül enthält, das mit einer regulatorischen Region funktionell verbunden ist. Das DNA-Molekül enthält eine funktionell, codierende DNA-Sequenz, die in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem eine solche transformierte Wirtszelle hergestellt wird. Dazu gehört auch die Transformation einer eukaryontischen Wirtszelle mit solch einem rekombinanten Vektor.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem ein ein hybrides HBsAg enthaltendes Partikel hergestellt wird, das ein Peptid enthält oder präsentiert, das durch eine funktionell codierende DNA-Sequenz codiert wird. Das Verfahren umfaßt die Kultivierung einer durch einen rekombinanten Vektor transformierten eukaryontischen Wirtszelle in einem geeigneten Kulturmedium und die Isolierung des Partikels aus einem Lysat oder Extrakt dieser Wirtszelle. Der verwendete Vektor enthält ein mit einer regulatorischen Region funktionell verbundenes DNA-Molekül, in dem die funktioneile codierende DNA-Sequenz in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem ein Impfstoff hergestellt wird, der ein Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen (HBsAg) enthaltendes hybrides immunogenes Partikel enthält, das ein Peptid enthält oder präsentiert, das durch eine funktionelle codierende DNA-Sequenz codiert wird.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an solchen hybriden Partikeln enthält.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, der Mizellen enthält, die ein solches hybrides Partikel und Polysorbat enthalten und einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an solchen Mizellen enthält.

Mit dem Ausdruck „funktioneile codierende DNA-Sequenz" ist eine codierende DNA-Sequenz gemeint, die nach Fusion in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV PreS2-S-proteincodierenden Sequenz an der Zusammensetzung des HBsAg Partikels nicht beteiligt ist und auch nicht dabei stört.

Bevorzugte funktioneile codierende DNA-Sequenzen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf immunogene codierende Sequenzen, wie die codierende Sequenz des CS-Proteins von Plasmodium, oder ein beliebiges immunogenes Derivat davon. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem eine HBV Pre S1 proteincodierende Region verwendet wird, die für die folgende Aminosäuresequenz codiert:

-163 ATG Met	GGG GIy	ACG Thr	AAT Asn	CTT Leu	TCT Ser	GTT VaI	CCC Pro	AAC Asn	CCT Pro	CTG Leu
GGA GIy	TTC Phe	TTT Phe	CCC Pro	GAT Asp	CAT His	CAG GIn	TTG Leu	GAC Asp	CCT Pro
GCA AIa	TTC Phe	GGA GIy	GCC AIa	AAC Asn	TCA Ser	AAC Asn	AAT Asn	CCA Pro	GAT Asp
TGG Trp CCA Pro	GAC Asp GCA AIa	TTC Phe GCC AIa	AAC Asn AAC Asn	CCC Pro CAG GIn	АТС lie GTA VaI	AAG Lys GGA GIy	GAC Asp GTG VaI	CAC His GGA GIy	TGG Trp GCA AIa
TTC Phe	GGG GIy	CCA Pro	GGG GIy	CTC Leu	ACC Thr	CCT Pro	CCA Pro	CAC His	GGC GIy
GGT GIy	ATT He	TTG Leu	GGG GIy	TGG Trp	AGC Ser	CCT Pro	CAG GIn	GCT Ala	CAG GIn
GGC GIy	ATA Me	TTG Leu	ACC Thr	ACA Thr	GTG VaI	TCA Ser	ACA Thr	ATT He	CCT Pro
CCT Pro	CCT Pro	GCC AIa	TCC Ser	ACC Thr	AAT Asn	CGG Arg	CAG GIn	TCA Ser	GGA GIy
AGG	CAG	CCT	ACT	CCC	ATC	TCT	CCA	CCT	СТА
Arg	GIn	Pro	Thr	Pro	He	Ser	Pro	Pro	Leu
AGA Arg	GAC Asp	AGT Ser	CAT His	CCT Pro	CAG GIn	GCC AIa

oder bei dem eine HBV Pre S2 proteincodierende Region oder eine HBV Pre S2-S proteincodierende Region verwendet wird, in der der Pre S 2-Anteil für die folgende Aminosäuresequenz codiert:

-55 -50

Met-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-GIn-Asp-

-40 -30

Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Ser-

-20 Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile-Ser-

-10 Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn;

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem ein rekombinanter DNA-Vektor verwendet wird, in dem eine solche Pre S1-, Pre S 2- oder Pre S 2-S proteincodierende Region mit einer regulatorischen Region funktionell verbunden ist; eine transformierte Wirtszelle, die einen solchen Vektor enthält; und ein Verfahren zur Herstellung einer solchen transformierten Zelle, das die Transformation einer Wirtszelle mit einem solchen Vektor umfaßt.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem ein rekombinanter DNA-Vektor verwendet wird, in dem eine Pre S1-funktionelle DNA codierende Sequenz- Pre S2-S proteincodierende Sequenz oder ein immunogenes Derivat davon mit einer regulatorischen Region funktionell verbunden ist; eine Hefe-Wirtszelle, die mit solch einem Vektor transformiert wird; ein Verfahren zur Herstellung eines solchen transformierten Wirtes, das die Transformation einer Hefe-Wirtszelle mit solch einem Vektor umfaßt; ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das durch die Pre S1-funktionelle DNA-codierende Sequenz-Pre S2-S proteincodierende Sequenz codiert ist, oder eines immunogenen Derivats davon; das Protein, das durch solch eine Methode hergestellt wird; einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an einem solchen Protein enthält; ein Partikel, das ein Polypeptid enthält, welches durch die Pre S1-funktionelle DNA-codierende Sequenz- Pre S2-S proteincodierende Sequenz codiert wird, oder ein immunogenes Derivat davon; ein Verfahren zu seiner Herstellung, einen

Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an solchen Partikeln enthält, eine Mizelle, die ein solches Partikel und Polysorbat enthält und einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge an solchen Mizellen enthält. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem eine Pre S1-PreS2 proteincodierende Sequenz oder PreS1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz verwendet wird, von denen der Pre S1- Pre S 2-Bereich die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

PRE-Sl	REGION	ACG	AAT	CTT	TCT	GTT	CCC	AAC	CCT	CTG
-163		Thr	Asn	Leu	Ser	VaI	Pro	Asn	Pro	Leu
ATG	GGG	TTT	CCC	GAT	CAT	CAG	TTG	GAC	CCT
Met	GIy	Phe	Pro	Asp	His	GIn	Leu	Asp	Pro
GGA	TTC	GGA	GCC	AAC	TCA	AAC	AAT	CCA	GAT
GIy	Phe	GIy	AIa	Asn	Ser	Asn	Asn	Pro	Asp
GCA	TTC	TTC	AAC	CCC	АТС	AAG	GAC	CAC	TGG
AIa	Phe	Phe	Asn	Pro	lie	Lys	Asp	His	Trp
TGG	GAC	GCC	AAC	CAG	GTA	GGA	GTG	GGA	GCA
Trp	Asp	AIa	Asn	GIn	VaI	GIy	VaI	GIy	Ala
CCA	GCA	CCA	GGG	CTC	ACC	CCT	CCA	CAC	GGC
Pro	AIa	Pro	GIy	Leu	Thr	Pro	Pro	His	GIy
TTC	GGG	TTG	GGG	TGG	AGC	CCT	CAG	GCT	CAG
Phe	GIy	Leu	GIy	Trp	Ser	Pro	GIn	Ala	Gin
GGT	ATT	TTG	ACC	ACA	GTG	TCA	ACA	ATT	CCT
GIy	He	Leu	Thr	Thr	VaI	Ser	Thr	lie	Pro
GGC	ATA	GCC	TCC	ACC	AAT	CGG	CAG	TCA	GGA
GIy	Me	AIa	Ser	Thr	Asn	Arg	GIn	Ser	GIy
CCT	CCT	CCT	ACT	CCC	ATC	TCT	CCA	CCT	СТА
Pro	Pro	Pro	Thr	Pro	Me	Ser	Pro	Pro	Leu
AGG	CAG	AGT	CAT	CCT	CAG	GCC
Arg	GIn	Ser	His	Pro	GIn	AIa
AGA	GAC
Arg	Asp
PRE-S2	REGION	TGG	AAT	TCC	ACT	GCC	TTC	CAC	CAA
-55		Trp	Asn	Ser	Thr	AIa	Phe	His	Gin
ATG	CAG	CAG	GAT	CCC	AGA	GTC	AGG	GGT	CTG
Met	GIn	GIn	Asp	Pro	Arg	VaI	Arg	GIy	Leu
GCT	CTG	CCT	GCT	GGT	GGC	TCC	AGT	TCA	GGA
AIa	Leu	Pro	Ala	GIy	GIy	Ser	Ser	Ser	GIy
TAT	TTT	AAC	CCT	GCT	CCG	AAT	ATT	GCC	TCT
Tyr	Phe	As η	Pro	AIa	Pro	Asn	He	Ala	Ser
ACA	GTA	TCG	TCA	AGC	TCC	GCG	AGG	ACT	GGG
Th r	VaI	Ser	Ser	Ser	Ser	AIa	Arg	Thr	GIy
CAC	ATA	GTG	ACG	AAC
His	Ne	VaI	Thr	Asn
GAC	CCT
Asp	Pro

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem ein rekombinanter Vektor verwendet wird, in dem eine solche neue Pre S1- Pre S2 oder PreS1- PreS2-S proteincodierende Sequenz mit einer Expressionskontrollsequenz funktionell verbunden ist; eine Wirtszelle, die mit solch einem Vektor transformiert ist; und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen transformierten Wirtes, das die Transformation einer Wirtszelle mit einem solchen Vektor umfaßt.

Folgende Aminosäure-Abkürzungen werden verwendet:

Asp Aspartat He Isoleucin

Thr Threonin Leu Leucin

Ser Serin Tyr Tyrosin

GIu Glutaminsäure Phe Phenylalanin

Pro Prolin His Histidin

GIy Glycin Lys Lysin

AIa Alanin Arg Arginin

Cys Cystein Trp Tryptophan

VaI Valin GIn Glutamin

Met Methionin Asn Asparagin

Kurze Beschreibung der Figuren:

Fig. 1: ist eine Restriktionskarte von pRIT10601.

Fig. 2: ist eine Restriktionskarte von pRIT10616.

Fig. 3: ist eine Restriktionskarte von pMC200.

Fig. 4: ist die Nuleotid-Sequenz eines Bereiches des 3300 Basenpaar großen Hefe Hindlll-Fragments, das in pMC200 integriert

ist und das die Restriktionsstellen Hindi, BgIII und EcoRI besitzt.

Fig. 5: zeigt die Herstellung von pRIT10671 undpRIT10673.

Fig. 6: zeigt die Herstellung von pRIT10749.

Fig.7: zeigt die Herstellung von pRIT10761 und pRIT10764.

Fig. 8: zeigt die Herstellung von pRIT10167 (Beispiel 1),pRIT10158 und pRiti 0162 (Beispiel 3); pRIT10158, pRITI 0677 und

pRIT10909 (Beispiel 4); pRITI0911 (Beispiel 5); pRITI0679, pRITI0903, pRITI 0914 (Beispiel 6); pRITI 2211, pRITI 2209 und pRITI 2230 (Beispiel 7); und pRITI 2288 und pRITI 2322 (Beispiel 8).

Fig. 9: zeigt eine Restriktionskarte von pRIT10172.

Fig. 10: zeigt eine Restriktionskarte von pRIT12290.

Fig. 11: zeigt eine Restriktionskarte von pRITI 2322, die die DNA-Bereiche zeigt, die von pRITI 2230 und pRITI 2288 stammen.

Fig. 12: zeigt die Herstellung von pRITI 2571; pRITI 2573; pRITI 2572 und pRITI 2574.

Fig. 13: ist eine Restriktionskarte von pRITI 2309.

Fig. 14: zeigt die Herstellung von pRITI 2314 und pRITI 2544.

Fig. 15: zeigt die Herstellung von pRITI 2658.

Fig. 16: ist eine Restriktionskarte von pRITI 2662.

Fig. 17: zeigtdieHerstellung vonpRIT12660.

Fig. 18: zeigt die Herstellung von pRITI 2845 (a, b, c, d, e, f).

Fig. 1A: zeigtdieHerstellung von pRIT12662.

Fig. 2A: zeigt eine schematische Restriktionskarte des KlonsA MPfI und eine Strategie zu seiner Sequenzierung.

Fig. ЗА: zeigt die Nucleotid-Sequenz des CS-Protein-Gens von P. falciparum.

Fig. 4A: zeigt die in pRIT12792 enthaltene Pre S1- Pre S2 DNA-codierende Sequenz.

Fig. 5B: zeigt die Konstruktion von pRITX.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung Expression von HBsAg in Hefe

Mit dem Ausdruck „regulatorische Region", wie hier verwendet, ist eine DNA-Sequenz gemeint, die notwendige oder wünschenswerte Sequenzen für die Transkription und Translation einer codierenden Sequenz enthält. Solche regulatorischen Regionen werden in der Regel angrenzend an das 5'-Ende der codierenden Sequenz, die exprimiert werden soll, gesetzt. Vorzugsweise wird eine weitere Region der Hefe DNA, die ein Terminationssignal für die Transkription enthält, unmittelbar an das З'-Ende der codierenden Region, die exprimiert werden soll, gesetzt, um die Termination der Transkription zu bewirken. Mit dem Ausdruck „HBsAG ", wie hier gebraucht, ist ein Antigen gemeint, das Protein umfaßt, die durch die S-proteincodierende Sequenz des HBV-Genoms codiert werden. Ein solches HBsAg ist strukturell ähnlich zu natürlichem HBsAg oder hat im wesentlichen die gleichen antigenen Determinanten wie das natürliche HBsAg, die durch die S-proteincodierende Sequenz codiert werden. Ein solches HBsAg kann eine Immunantwort stimulieren, die spezifisch erkennt und mit natürlichem HBsAg reagiert. Ein solches HBsAG wird auch spezifisch durch Anti-HBsAg-Antikörper erkannt.

Die HBsAg codierende Sequenz kann aus der DNA von Dane-Partikeln aus dem Serum von infizierten Menschen isoliert werden, indem der Einzelstrangbereich der DNA mit einer DNA-Polymerase, vorzugsweise der endogenen Polymerase, zum Doppelstrang gemacht wird und dieser anschließend mit einer Restriktionsendonuclease geschnitten wird. Die Wahl der Endonuclease hängt teilweise von den einzelnen Dane-Partikeln ab. Beispielsweise kann die HBsAg-codierende Sequenz der HBV DNA bestimmter Dane-Partikel des adw Serotyps durch ein einzelnes BamHI-Fragment isoliert werden; die HBsAgcodierende Sequenz der HBV DNA bestimmter Dane-Partikel des ayw Serotyps kann durch ein Hhal-Fragment isoliert werden. HBV DNA von Dane-Partikel des gleichen Serotyps können auch unterschiedliche Restriktionsmuster aufweisen.

Die Spaltung von DNA

Die Herstellung von DNA-Fragmenten, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, die Ligierung von solchen Fragmenten zu rekombinanten DNA-Molekülen und die Insertion solcher rekombinanter DNA-Moleküle in Mikroorganismen wird in an sich bekannter Weise durchgeführt; vgl. die vorstehenden oder nachfolgenden Literaturzitate. Bedingungen werden gewählt, um die Denaturierung der DNA und der Enzyme zu verhindern. Beispielsweise wird der pH-Wert auf einen Bereich von 7 bis 11 eingestellt und die Temperatur unter 60⁰C gehalten. Vorzugsweise wird die Restriktion der DNA bei einer Temperatur von 30°C bis 40°C und die Ligierung bei 0°C bis 10⁰C durchgeführt. Verwendete Restriktionsenzyme und Ligasen sind handelsüblich und werden nach Vorschrift verwendet. Die T4 DNA-Ligase ist die bevorzugte Ligase. Die verschiedenen Fragmente und die endgültigen Konstruktionen können in üblicherweise miteinander verbunden werden. In

vielen Fällen wurden Gene isoliert, durch Restriktionsenzyme kartiert und auch sequenziert. Zu diesem Zweck kann man die interessierende Sequenz, wie die HBsAg-Sequenz, durch Restriktion des Gens selektionieren und, wenn nötig, weiter manipulieren, wie durch Ba 131 Verdauung, in vitro Μ utagenese, Primer-vermittelte Reparatur oder ähnliches, um ei η Fragment gewünschter Größe herzustellen, das die gewünschte Sequenz enthält und geeignete Enden besitzt. Linker und Anschlußfragmente können benutzt werden, um Sequenzen miteinanderzu verbinden und auch verloren gegangene Sequenzen zu ersetzen, wenn innerhalb der interessierenden Region eine Restriktionsstelle verwendet wurde. Die verschiedenen Fragmente, die isoliert werden, können durch Elektrophorese gereinigt werden, elektroeluiert, mit anderen Sequenzen ligiert, kloniert, wieder isoliert und weiter manipuliert werden.

Die Verwendung von regulatorischen Regionen zur Kontrolle der Transkription des interessierenden Struktur-Gens, wie der HBsAg-Sequenz, erlaubt es, nachdem die Wirtszellen zu einer hohen Dichte gewachsen sind, während dessen das Strukturgen gar nicht oder nur wenig exprimiert wurde, durch Änderung derumgebenden Bedingungen z.B. des Nährstoffes, der Temperatur usw., die Expression des Strukturgens zu induzieren.

Beispielsweise kann man mit der GAL4 regulatorischen Region die Hefezellen in einem Vollmedium mit einer Kombination aus Glycerin und Milchsäure zu einer hohen Dichte, nämlich der mittleren oder späten log-Phase, wachsen lassen und dann die Kohlenstoffquelle ändern und Galactose anbieten. Mit der PHO5 regulatorischen Region kann man die Zellen in einem Medium mit einer hohen Phosphatkonzentration von etwa 7mM KH₂PO₄ wachsen lassen, sie dann ernten und in einem Medium, das phosphatfrei ist, resuspendieren, um eine Derepression und Expression zu bewirken. Bei Temperatursensitivität könnte man die Zellen bei 25°C bis 37⁰C wachsen lassen und dann die Temperatur passend um 5°C bis 20⁰C ändern. Die Wirtszellen weisen dann das mit der regulatorischen Region verbundene Regulationssystem auf.

Die Fusion der HBsAg-Sequenz mit der regulatorischen Region kann durch Verwendung eines Zwischenvektors erreicht werden. Alternativ kann die HBsAg-Sequenz aber auch direkt in einen Vektor integriert werden, der die regulatorische Region enthält. Ein Vektor ist eine DNA, die das DNA-Fragment der Erfindung tragen und beibehalten kann, beispielsweise ein Phage oder ein Plasmid. Techniken zur Klonierung von DNA-Fragmenten in Phagen sind beispielsweise aus Charnay et al., Nature, Bd. 286 (1980), 893-895, und der GB-Patentanmeldung2034323 bekannt. Die HBsAg-Sequenz wird so mit der regulatorischen Region verbunden, daß nach Expression der HBsAg-Sequenz ein HBsAg entsteht, das frei von fremden Aminosäureresten ist. In einer Ausführungsform der Erfindung wurde die HBsAg-codierende Sequenz zusammen mit 42 Codons der für das HBsAg Vorläufer (PreS-S) Protein codierenden DNA in Ablesephase mit dem 18.Codon der für das Hefe OCT-Protein codierenden Sequenz ligiert, die unter der Kontrolle des arg³ Promoters steht. Dieses Konstrukt ergibt ein hybrides Partikel, das ein HBsAg-Protein enthält, das neben den 226 Aminosäuren des S-Proteins zusätzlich 60N-terminale Aminosäuren besitzt. Ein Beispiel für eine regulatorische Region stammt von dem Hefe arg³-Gen, das für die Ornithin-Carbamoyl-Transferase (OCT) codiert. Die arg³ regulatorische Region ist verantwortlich für spezifische und allgemeine Kontrollmechanismen. Aus Crabeel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd.78 (1981), 6026, ist die Klonierung dieser regulatorischen Region in dem Plasmid pYeura³arg³ in E.coli bekannt. Bevorzugte Wirte sind Stämme von S.cerivisiae, in denen die Argininbiosynthese derepremiert ist, beispielsweise der Stamm 1c1697d. Die Verwendung solcher Stämme führt durch den arg³-Promoter zu einer erhöhten Expression im Vergleich zu dem Stamm DC5. Andere nützliche regulatorische Regionen stammen von Hefe-Genen, deren Produkte an der Glykolyse beteiligt sind, beispielsweise von Genen, die für Enolase, Aldolase, Phosphoglyceratkinase und Glyerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase codieren; von dem Hefe-Alkohol-Dehydrogenase-Gen; und im allgemeinen von Genen, die am katabolischen Stoffwechsel beteiligt sind, wie das Arginase-Gen.

Ein bevorzugter Vektor zur Klonierung des fusionierten DNA-Fragments in Hefe ist das Plasmid YEp 13, das in E.coli und S.cerevisiae repliziert und stabil ist und daher als Shuttle-Vektor bezeichnet wird. Mehrere andere Hefe-Vektoren sind bekannt und erhältlich. Die HBsAg-Sequenz und die regulatorische Region können in einem Hefe-Vektor nacheinander oder gleichzeitig inseriert werden. Die Transformation von Hefen mit Plasmid-Vektoren, die hefespezifische autonom replizierende Sequenzen enthalten, führt normalerweise dazu, daß das DNA-Molekül der Erfindung wie ein Plasmid extrachromosomal repliziert wird. Solche Repiikons sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Transformation mit Plasmid-Vektoren, die keine funktionellen Hefe-Replikons enthalten, führt zur Integration des DNA-Moleküls in das Hefe-Genom.

Impfstoffe für den Menschen zum Schutz vor HBV-Infektion, die HBsAg enthalten, das gemäß der Erfindung in Hefe produziert wurde und einen geeigneten Carrier besitzen, können nach bekannten Methoden hergestellt werden. Die Verwendung eines Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat, ist wünschenwert. Das so produzierte HBsAg kann auch mit anderen immunogenen Substanzen kombiniert werden, um Kombinations-Impfstoffe herzustellen. Der HBV-Impfstoff oder der Kombinations-Impfstoff kann beispielsweise subcutan, intravenös oder intramuskulär verabreicht weden.

Expression eines DNA-Moleküls, das eine funktionell DNA-Sequenz enthält, die in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist

Diese Erfindung betrifft auch ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine funktioneile DNA-Sequenz enthält, die in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist. Die Bezeichnung „codierende Sequenz" oder „codierende Region", wie hier verwendet, umfaßt auch ein beliebiges funktionelles Derivat davon. Mit dem Ausdruck „funktionelles Derivat" ist eine codierende Sequenz mit Aminosäuremodifikationen gemeint, die die Partikelbildung nicht stört und/oder die Immunogenität beibehält. Solche funktionellen Derivate können durch die übliche ortsspezifische Mutagenese hergestellt werden. Aus Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193-1201, sind ortspezifische Mutagenese-Techniken bekannt. Eine solche Fusion kann am N-Terminus der Pre S2-Region oder an irgendeinem Punkt innerhalb der Pre S 2-Region stattfinden. Es gibt vier Arten von Fusionen, nämlich am 5'-Terminus der gesamten Pre S 2-Region, an irgendeinem Punkt innerhalb der Pre S2-Region, so daß die Pre S2-DNA die funktionell DNA-Sequenz an beiden Seiten flankiert, an dem 5'-terminalen Ende einer verkürzten Pre S2-Region oder am 5'-Terminus der S-proteincodierenden Region, so daß die Fusion keine Pre S2-DNA enthält. Verschiedene Pre S 2-S proteincodierenden Sequenzen sind bekannt und können nach bekannten Methoden hergestellt und isoliert werden (vgl. die oben zitierte Literatur). In einer Ausführungsform der Erfindung wurde die ARG 3 regulatorische Region zusammen mit 18 Codons der für das Hefe-OCT-Protein codierenden DNA in Ablesephase mit einer verkürzten Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert, die dann 42 Codons der Pre S2-S proteincodierenden Sequenz zusammen mit der kommpletten S-proteincodierenden Sequenz enthält. Bevorzugte funktioneile DNA-Sequenzen sind Sequenzen, die das circumsporozoide (CS)Protein von Plasmodium oder ein beliebiges immunogenes Derivat davon codieren. Mit dem Ausdruck „immunogenes Derivat" ist eine Sequenz gemeint, die ein Derivat oder eine

modifizierte Version einer natürlich vorkommenden Sequenz ist, und die die schützende immunogene Aktivität der natürlichen Sequenz beibehält oder verstärkt. Solche immunogenen Derivate können nach üblichen Methoden hergestellt werden. Der Ausdruck „Pre S2-, Pre S1- oder die gesamte Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz", wie hier verwendet, umfaßt ein beliebiges immunogenes Derivat davon.

Mit dem Ausdruck „circumsporozoides (CS) Protein des Plasmodiums" ist das immunologisch dominante Oberflächenantigen des Sporozoiten von Plasmodium oder ein beliebiges immunogenes Derivat davon gemeint. Nützliche circumsporozoide (CS) Proteine umfassen insbesondere jene, die von Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale und P. malariaestammen. P. falciparum, P. vivax, P. ovale und P. malariae infizieren den Menschen.

Aus Dame et al., Science, 225 (1984), 593-599, ist die CS-proteincodierende Sequenz von Plasmodium falciparum bekannt. Aus Arnot et al., Science, 230 (1985), 815-818, ist die CS-proteincodierende Sequenz von P. vivax bekannt. Aus Sharma et al., Science, 229 (1985), 779-782, ist die CS-proteincodierende Sequenz von P. knowlesi bekannt. Aus Enea et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81 (1984), 7520-7524, ist die CS-proteincodierende Sequenz von P. cynomolgi bekannt. Die CS-proteincodierenden Sequenzen anderer Spezies von Plasmodium sind bekannt (vgl. die vorstehend zitierte Literatur) und/oder können nach üblichen Methoden erhalten werden.

Die Ausdrücke „CSP" oder „CS-Protein" umfassen das natürliche, normal große circumsporozoide Protein von Plasmodium und auch ein beliebiges immunogenes Derivat davon. Mit dem Ausdruck „immunogenes Derivat" des circumsporozoiden Proteins von Plasmodium ist (a) ein beliebiges Derivat des circumsporozoiden Proteins von Plasmodium, das die schützende immunogene Aktivität beibehält, gemeint oder (b) ein beliebiges Protein, das von einer modifizierten codierenden Sequenz des circumsporozoiden Proteins von Plasmodium abstammt, das eine schützende immunogene Aktivität behält. Solche immunogenen Derivate können nach üblichen Methoden hergestellt werden. Aus Ballou et al., Science, 228 61985), 996-999, sind einige immunogene synthetische Derivate der CS-proteincodierenden Sequenz von P. falciparum bekannt; vgl. auch Mazier et al., Science, 231 (1986), 156-159.

Die CS-codierende Sequenz von verschiedenen Plasmodium-Arten ist bekannt und kann nach bekannten Methoden hergestellt oder isoliert werden (vgl. beispielsweise WO84-02922-A [P. knowlesi CS-Protein] und Dame et al., Science, 225 [1984], 593 [P. falciparum CS-Protein]). Ein DNA-Molekül, in dem die CS-codierende Sequenz oder eine beliebige funktioneile DNA-Sequenz in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HBV Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist, kann nach bekannten Methoden hergestellt werden, wie durch Ligierung der CS-codierenden Sequenz oder einer anderen beliebigen funktioneilen DNA-Sequenz in Ablesephase mit einem beliebigen Codon der für 55 Aminosäure codierenden Pre S2-codierenden Region aus einer Pre S2-S proteincodierenden Sequenz.

Vorzugsweise verbleibt nach Ligierung mit der CS-codierenden Sequenz oder einer anderen funktionellen DNA-Sequenz ein genügend großer Teil der Pre S2-codierenden Sequenz, um das CS-Protein oder ein beliebiges anderes funktionelles Protein auf der HBsAg-Partikel-Oberfläche optimal zu präsentieren. Ein genügend großer Teil der Pre S2-Region sollte nämlich verbleiben, so daß das durch die Pre S2-Region codierte Poly peptid als Brücke zwischen dem durch die funktionell DNA-Sequenz codierten Produkt und der HBsAg-Partikel-Oberflache fungieren kann. Beispielsweise ist ausMilich et al., Science, 228 (1985), 1195-1199, bekannt, daß die 26 aminoterminalen Aminosäuren der Pre S2-codierenden Sequenz eine dominante Antikörperbindungsstelle auf der Pre S2-Region darstellen. Wenn es gewünscht ist, ein hybrides Partikel herzustellen, das die Epitope der PreS2 und CS bzw. einer anderen funktionellen DNA-Sequenz enthält oder präsentiert, sollte man vorzugsweise die CS-codierende Sequenz oder eine andere beliebige funktioneile DNA-Sequenz an einem Punkt innerhalb der Pre S2-codierenden Region inserieren, der die Herstellung eines hybriden Partikels erlaubt, das die Epitope der Pre S2 und CS bzw. einer anderen funktionellen DNA-Sequenz enthält oder präsentiert.

Der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete rekombinante Vektor enthält das rekombinante DNA-Molekül (nämlich eine funktioneile DNA-Sequenz, die in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-Region aus einer HV Pre S2-S-proteincodierenden Sequenz fusioniert ist), funktionell verbunden mit einer regulatorischen Region. Ein solcher Vektor kann zusätzlich auch ein funktionelles Hefe-Replikon besitzen. Mit dem Ausdruck „Replikon" ist jene kleinste DNA-Region gemeint, die zur extrachromosomalen Stabilität eines solchen rekombinanten Vektors in einem Hefe-Wirtsorganismus beiträgt. Solche Replikons sind bekannt. Mit dem Ausdruck „regulatorische Region" ist eine beliebige DNA-Region gemeint, die die Transkription und Translation der zu exprimierenden DNA-Sequenz reguliert. Solche regulatorische Regionen sind ebenfalls bekannt. Solch ein Vektor kann nach üblichen Methoden hergestellt werden, wie durch die Inserierung des DNA-Moleküls der Erfindung in Ablesephase in einen Vektor, der bereits ein Replikon einer regulatorischen Region enthält. Die Inserierung erfolgt in solcher Weise, daß das DNA-Molekül mit solch einer regulatorischen Region funktionell verbunden ist. Das DNA-Molekül wird vorzugsweise in einen Vektor ligiert, der zur Expression in der Hefegattung Saccharomyces befähigt ist.

Die Erfindung betrifft auch eine durch einen solchen rekombinanten Vektor transformierte Hefe-Wirtszelle und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen transformierten Wirtes, das die Transformierung einer Hefe-Wirtszelle mit dem rekombinanten Vektor umfaßt. Eine solche Transformation wird in an sich bekannter Weise durchgeführt. Geeignete Hefezellen sind jene der Gattung Saccharomyces, wobei die Zellen der Art Saccharomyces cerevisiae und Saccharomyces carlsbergensis besonders geeignet sind.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines hybriden HBsAg-Protein enthaltenden Partikels, das das Produkt der funktionellen DNA-Sequenz enthält oder präsentiert. Ein solches Verfahren umfaßt die Kultivierung der transformierten Hefe-Wirtszellen in einem geeigneten Kulturmedium und die Isolierung des Partikels aus einem Zell-Lysat oder Extrakt dieser Wirtszellen. Mit dem Ausdruck „präsentiert oder enthält" ist gemeint, daß das durch die funktioneile DNA-Sequenz codierte Protein in dem hybriden HBsAg-Protein enthaltenden Partikel so enthalten ist, daß es eine Immunantwort stimulieren kann. Gewünschtenfalls wird die Präsentation des durch die funktionell DNA-Sequenz codierten Proteins nicht die immunogene Aktivität der HBsAg-Epitope stören, wodurch ein bivalenter Impfstoff erhalten wird. Besonders bevorzugt wird das durch die funktionell DNA-Sequenz codierte Protein auf einem HBsAg-Partikel in solcher Weise präsentiert, daß entweder die maximale Anzahl von Epitopen des durch die funktionale DNA-Sequenz codierten Proteins oder die maximale Anzahl von Epitopen des durch die funktionale DNA-Sequenz codierten Proteins und des HBsAg-Proteins wie angemessen exponiert wird. Mit dem Ausdruck „geeignetes Kulturmedium" ist ein Medium gemeint, das das Wachstum des transformierten Wirts ermöglicht und es einem solchen Wirt ermöglicht, das Produkt des hybriden DNA-Fragments, das in dem zur Transformation verwendeten Vektors enthalten ist, in wiederholbarer Menge zu exprimieren. Dieses hybride DNA-Fragment ist ein Fusionsprodukt aus der funktionellen DNA-Sequenz und der Pre S2-S proteincodierenden Sequenz. Einem Fachmann ist es bekannt, daß das geeignete Kulturmedium abhängig von der verwendeten Wirtszelle ist. Die Isolierung des hybriden Partikels der Erfindung aus einem

Zell-Lysat oder Extrakt einer solchen Wirtszelle kann durch übliche Protein-Isolierungstechniken durchgeführt werden. Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, der die hybriden Partikel dieser Erfindung enthält. Ein solcher Impfstoff wird eine zum Immunschutz notwendige Menge an hybriden Partikel der Erfindung enthalten und ist nach üblichen Methoden herstellbar. Mit dem Ausdruck „Immunschutz" ist gemeint, daß die hybriden Partikel dieser Erfindung in ausreichender Menge verabreicht werden, so daß eine ausreichende Antikörperantwort gegen das Agens erzielt wird, die zum Schutz beiträgt und keine ernsten Nebenwirkungen hat. Vorzugsweise enthält der Impfstoff der Erfindung die Mizellen der Erfindung, nämlich Mizellen, die das Partikel der Erfindung und Polysorbat enthalten. Die bevorzugte Menge an Polysorbat in solch einer Mizelle ist 5 ЬіэБОцд Polysorbat pro ЮОцд Protein. Die Mizelle kann nach dem Verfahren hergestellt werden, das in der EP-A 0199698 beschrieben ist. In dem Impfstoff der Erfindung kann eine wäßrige Lösung der hybriden Partikel der Erfindung vorzugsweise mit einem physiologischen pH direkt verwendet werden. Alternativ kann das Partikel mit einem beliebigen der bekannten Adjuvantien aufgenommen werden. Solche Adjuvantien umfassen unter anderem Aluminiumhydroxid.

Aus New Trends and Developments in Vaccines, herausgegeben durch Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978, ist die Herstellung von Impfstoffen generell bekannt.

Die Menge des hybriden Partikels der Erfindung ist in jeder Impfstoffdosis auf eine Menge beschränkt, die in typischen Impfstoffen eine zum Immunschutz notwendige Antwort induziert, ohne bedenkliche Nebeneffekte zu haben. Eine solche Menge hängt davon ab, welches spezifische Immunogen verwendet wird und ob ein Adjuvans beigegeben ist. Im allgemeinen wird erwartet, daß jede Dosis 1 bis ЮООрд Protein, vorzugsweise 1 bis 200 цд Protein, enthält. Eine optimale Menge für einen speziellen Impfstoff kann durch Standarduntersuchungen ermittelt werden, zu denen die Beobachtung der Antikörpertiter und anderer Reaktionen im Patienten gehört. Nach einer ersten Impfung erhalten die Patienten vorzugsweise nach vier Wochen eine weitere Impfstoffverabreichung, der alle sechs Monate eine weitere folgt, solange ein Infektionsrisiko besteht. Die Immunantwort auf das hybride Partikel der Erfindung kann durch die Verwendung eines Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid, erhöht werden.

Zur Veranschaulichung des hybriden Partikels der Erfindung wurde eine 64 Codon enthaltende DNA-Sequenz, die für das sich wiederholende Epitop des circumsporozoiden (CS) Protein von Plasmodium falciparum codiert und eine acht Codons enthaltende CS-codierende Sequenz (vgl. Dame et al., Science, 225 [1984], 593-599) jeweils in Ablesephase mit einem Teil der Pre S2-codierenden Sequenz, die in einem Hefeexpressionsvektor vorliegt, fusioniert. Dieser Hefeexpressionsvektor enthält darüber hinaus ein Replikon und eine geeignete regulatorische Region. Beide Expressionsvektoren, nämlich der eine mit der 64 Codons enthaltenden CS-Sequenz und der andere mit der acht Codons enthaltenden Sequenz, wurden jeweils in Hefe-Wirtszellen eingeführt und die Extrakte von solchen transformierten Zellen hinsichtlich der Anwesenheit von HBsAg- und CS-Epitopen auf dem gleichen Molekül untersucht.

Die Ergebnisse wurden durch Immunblot-Analyse erhalten, wobei ein Gemisch von fünf monoklonalen Antikörpern gegen CS und einem monoklonalen Antikörper gegen HBsAg aus Hefe verwendet wurden. Die Ergebnisse zeigten eine 37 kd großes Hybridprotein aus dem Lysat von Hefen, die mit einem Vektor transformiert wurden, der die 64 Codons enthaltende CS-codierende Sequenz in Ablesephase fusioniert mit der Pre S2-S proteincodierenden Sequenz enthält. Die Ergebnisse zeigten ein 30 kd großes hybrides Protein aus Lysaten von Hefe, die mit einem Vektor transformiert wurden, der die acht Codons enthaltende CS-codierende Sequenz in Ablesephase fusioniert mit der Pre S2-S proteincodierenden Sequenz enthält. Der Zusammenbau dieser Proteine in HBsAg ähnliche Partikelstrukturen wurde durch die Analyse von Cäsiumchlorid und Sucrosegradienten, Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Elektronenmikroskopie gezeigt. Die Präsentation der CS-Epitope auf der Außenseite von solchen Partikeln wurde in ELISA-Tests durch die Zugänglichkeit der CS-Epitope für CS-spezifische Antikörper gezeigt. Die Präsentation von HBsAg-Epitopen auf der Außenseite von solchen Partikeln wurde durch Radioimmuntest (AUSRIA II, Abbott) oder ELISA-Test (Enzygnost-HBsAg, Behringwerke) gezeigt.

Neue Pre S2 und Pre S2-S proteincodierende Sequenzen

Die neuen HBV Pre S2 und Pre S2-S proteincodierenden Sequenzen der Erfindung stammen von dem HBV adw Subtyp und wurden aus dem Plasm id pRIT10616 isoliert. Der Ausdruck „codierende Sequenz" oder „codierende Region", wie hier verwendet, umfaßt auch ein beliebiges funktionelles Derivat davon. Mit dem Ausdruck „funktionelles Derivat" ist eine codierende Sequenz mit Aminosäuremodifikationen gemeint, die wenn dienlich die Partikelbildung nicht stören und/oder die Immunogenität beibehalten, wenn es gewünscht ist. Solche funktionellen Derivate können durch ortsspezifische Mutagenese, wie z. B. von Botsteinetal., Science, 229(198S), 1193-1201, beschrieben, erhalten werden. Solche Pre S2 und Pre S2-S proteincodierenden Sequenzen können durch übliche rekombinante DNA-Verfahren aus dem Plasmid pRIT10616 erhalten werden. Dieses Plasmid wurde (in E. coli K12 Stamm C600) gemäß des Budapester Vertrages bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 2. Juni 1982 unter ATCC 38131 hinterlegt. Die Pre S2-Region einer solchen neuen proteincodierenden Sequenz enthält die folgenden Aminosäuren:

-55 -50

Met-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp-

-40 -30

Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-

-20 Ser-Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile-

-10 Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn.

Eine solche Region kann auch durch synthetische Oligonucleotide in üblicher Weise hergestellt werden. Ein bevorzugtes funktionelles Derivat der Pre S2-S-codierenden Sequenz der Erfindung ist eines, in dem die Aminosäure-Alanin (GCT) an der Position-45 durch die ortsspezifische Mutagenese durch die Aminosäure Threonin (ACT) ausgetauscht wurde. Ein solches funktionelles Derivat wird in Saccharomyces cerevisiae zweimal stärker exprimiert als die unmodifizierte codierende Sequenz der Erfindung.

Neue Pre S1 proteincodierende Sequenz

Die neue HBV Pre S1 proteincodierende Sequenz stammt von einem HBV adwSubtyp und kann aus dem Plasmid pRIT10616 isoliert werden. Die Bezeichnung „codierende Sequenz" oder „codierende Region", wie hier verwendet, umfaßt auch ein beliebiges funktionelles Derivat davon. Mit dem Ausdruck „funktionelles Derivat" ist eine codierende Sequenz mit Aminosäuremodifikationen gemeint, die, wenn gewünscht, die Partikelbildung nicht stört und/oder die Immunogenität beibehält. Solche „funktioneile Derivate" können durch übliche ortsspezifische Mutagenese, wie aus Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193-1201, bekannt, hergestellt werden. Eine solche Pre S1 proteincodierende Sequenz kann durch übliche rekombinante DNA-Techniken aus dem Plasmid pRIT10616 erhalten werden. Dieses Plasmid wurde (in E.coli K12 Stamm C600) gemäß dem Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 2. Juni 1982 unter ATCC 38131 hinterlegt. Die Pre Sei-Region codiert für die folgende Aminosäuresequenz:

-163	GGG	ACG	AAT	CTT	TCT	GTT	CCC	AAC	CCT	CTG
ATG	GIy	Thr	Asn	Leu	Ser	VaI	Pro	Asn	Pro	Leu
Met	TTC	TTT	CCC	GAT	CAT	CAG	TTG	GAC	CCT
GGA	Phe	Phe	Pro	Asp	His	GIn	Leu	Asp	Pro
GIy	TTC	GGA	GCC	AAC	TCA	AAC	AAT	CCA	GAT
GCA	Phe	GIy	AIa	Asn	Ser	Asn	Asn	Pro	Asp
AIa	GAC	TTC	AAC	CCC	АТС	AAG	GAC	CAC	TGG
TGG	Asp	Phe	Asn	Pro	lie	Lys	Asp	His	Trp
Trp	GCA	GCC	AAC	CAG	GTA	GGA	GTG	GGA	GCA
CCA	AIa	AIa	Asn	GIn	VaI	GIy	VaI	GIy	AIa
Pro	GGG	CCA	GGG	CTC	ACC	CCT	CCA	CAC	GGC
TTC	GIy	Pro	GIy	Leu	Thr	Pro	Pro	His	GIy
Phe	ATT	TTG	. GGG	TGG	AGC	CCT	CAG	GCT	CAG
GGT	He	Leu	GIy	Trp	Ser	Pro	GIn	Ala	GIn
GIy	ATA	TTG	ACC	ACA	GTG	TCA	ACA	ATT	CCT
GGC	He	Leu	Thr	Thr	VaI	Ser	Thr	He	Pro
GIy	CCT	GCC	TCC	ACC	AAT	CGG	CAG	TCA	GGA
CCT	Pro	AIa	Ser	Thr	Asn	Arg	GIn	Ser	GIy
Pro	CAG	CCT	ACT	CCC	ATC	TCT	CCA	CCT	СТА
AGG	GIn	Pro	Thr	Pro	He	Ser	Pro	Pro	Leu
Arg	GAC	AGT	CAT	CCT	CAG	GCC
AGA	Asp	Ser	His	Pro	GIn	AIa
Arg

Eine solche Region kann auch durch die übliche Synthese von Oligonucleotiden erhalten werden.

Neue PreS1-PreS2-S proteincodierende Sequenz

Die Erfindung betrifft auch eine HBV Pre S1- Pre S2-S proteincodierende Sequenz, von der der Pre S1- Pre S2-Teil die folgende Aminosäuresequenz enthält:

PRE-S1	-REGION	ACG	AAT	CTT	TCT	GTT	CCC	AAC	CCT	CTG
-163		Thr	Asn	Leu	Ser	VaI	Pro	Asn	Pro	Leu
ATG	GGG	TTT	CCC	GAT	CAT	CAG	TTG	GAC	CCT
Met	GIy	.Phe	Pro	Asp	His	GIn	Leu	Asp	Pro
GGA	TTC	GGA	GCC	AAC	TCA	AAC	AAT	CCA	GAT
GIy	Phe	GIy	AIa	Asn	Ser	Asn	Asn	Pro	Asp
GCA	TTC	TTC	AAC	CCC	АТС	AAG	GAC	CAC	TGG
AIa	Phe	Phe	Asn	Pro	Не	Lys	Asp	His	Trp
TGG	GAC	GCC	AAC	CAG	GTA	GGA	GTG	GGA	GCA
Trp	Asp	AIa	Asn	GIn	VaI	GIy	VaI	GIy	Ala
CCA	GCA	CCA	GGG	CTC	ACC	CCT	CCA	CAC	GGC
Pro	AIa	Pro	GIy	Leu	Thr	Pro	Pro	His	GIy
TTC	GGG	TTG	GGG	TGG	AGC	CCT	CAG	GCT	CAG
Phe	GIy	Leu	GIy	Trp	Ser	Pro	GIn	Ala	Gin
GGT	ATT	TTG	ACC	ACA	GTG	TCA	ACA	ATT	CCT
GIy	He	Leu	Thr	Thr	VaI	Ser	Thr	lie	Pro
GGC	ATA
GIy	He

CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA

Pro	Pro	AIa	Ser	Thr	Asn	Arg	GIn	Ser	GIy
AGG	CAG	CCT	ACT	CCC	ATC	TCT	CCA	CCT	СТА
Arg	Gin	Pro	Thr	Pro	He	Ser	Pro	Pro	Leu
AGA	GAC	AGT	CAT	CCT	CAG	GCC
Arg	Asp	Ser	His	Pro	GIn	AIa
PRE-S 2-	REGION
-55
ATG	CAG	TGG	AAT	TCC	ACT	GCC	TTC	CAC	CAA
Met	Gin	Trp	Asn	Ser	Thr	AIa	Phe	His	GIn
GCT	CTG	CAG	GAT	CCC	AGA	GTC	AGG	GGT	CTG
AIa	Leu	GIn	Asp	Pro	Arg	VaI	Arg	GIy	Leu
TAT	TTT	CCT	GCT	GGT	GGC	TCC	AGT	TCA	GGA
Tyr	Phe	Pro	Ala	GIy	GIy	Ser	Ser	Ser	GIy
ACA	GTA	AAC	CCT	GCT	CCG	AAT	ATT	GCC	TCT
Th r	VaI	As η	Pro	AIa	Pro	Asn	He	AIa	Ser
CAC	ATA	TCG	TCA	AGC	TCC	GCG	AGG	ACT	GGG
His	Ne	Ser	Ser	Ser	Ser	AIa	Arg	Thr	GIy
GAC	CCT	GTG	ACG	AAC
Asp	Pro	VaI	Thr	Asn

Die neue HBV Pre S1 - Pre S 2-S proteincodierende Sequenz dieser Erfindung stammt von einem HBV adw Subtyp und wurde aus dem Plasm id pRIT 10616 isoliert. Dieses Plasmid ist wie oben angegeben bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter ATCC 38131 hinterlegt. Der Ausdruck „codierende Sequenz" oder „codierende Region", wie hier verwendet, umfaßt auch ein beliebiges funktionelles Derivat davon. Mit dem Ausdruck „funktionelles Derivat" ist eine codierende Sequenz mit Aminosäuremodifikation gemeint, die, wenn es gewünscht ist, die Partikelbildung nicht stört und/oder die Immunogenität beibehält. Solche funktioneilen Derivate können durch die übliche ortsspezifische Mutagenese, wie beispielsweise von Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193-1201, bekannt, hergestellt werden.

Expression des PreS1-PreS2-S-Proteinsin Hefe

Die Erfindung betrifft auch einen rekombinanten DNA-Vektor, in dem die gesamte Pre S1- Pre S 2-S proteincodierende Sequenz an eine Expressions-Kontrollsequenz funktionell gebunden ist. Ein solcher Vektor kann zusätzlich ein Replikon enthalten, das von dem Wirt, in dem es verwendet wird, abhängig ist. Vorzugsweise wird die Pre S1 - Pre S 2-S proteincodierende Sequenz verwendet.

Mit dem Ausdruck „Replikon" ist jene kleinste DNA-Region gemeint, die einen solchen rekombinanten Vektor in einem Hefe-Wirtsorganismus extrachromosomal stabil hält. Solche Replikons sind bekannt. Mit dem Ausdruck „regulatorische Region" ist eine beliebige DNA-Sequenz gemeint, die eine Promotor-Region und andere Sequenzen enthält, die wichtig für die Regulierung der Transkription einer codierenden Sequenz sind. Solche regulatorischen Regionen sind bekannt. Ein solcher Vektor kann in an sich bekannterWeise hergestellt werden, wie durch Inserierung einer Pre S1- Pre S2-S proteincodierenden Sequenz in Ablesephase in einen Vektor, der bereits ein Replikon und eine regulatorische Region enthält. Die Inserierung erfolgt in solcher Weise, daß das DNA-Molekül an die regulatorische Region funktionell gebunden ist. Das DNA-Molekül wird vorzugsweise in einen Vektor Iigiert, der in Hefen der Gattung Saccharomyces exprimiert wird. Vorzugsweise ist die in dem Vektor enthaltene Pre S1-PreS2-S proteincodierende Sequenz die Pre S 1- Pre S 2-S proteincodierende Sequenz. Solche Vektoren sind nützlich für die Insertion von funktionellen DNA-Sequenzen, um die resultierende Pre S1-funktioneile DNA-Sequenz Pre S 2-S proteincodierende Sequenz zu exprimieren. Deshalb betrifft diese Erfindung ein recombinantes DNA-Molekül, in dem eine funktioneile DNA-Sequenz in Ablesephase mit der Pre S1-Region aus der Pre S1- Pre S2-S proteioncodierenden Sequenz fusioniert ist und einen ein solches rekombinantes DNA-Molekül enthaltenden Vektor. Die Fusion kann so erfolgen, daß die funktionell DNA-Sequenz entweder eine Insertion in der Pre S1-Region bildet, oder einen Teil der Pre S2-Region ersetzt; vgl. unten, Beispiel 21A. Mit dem Ausdruck „funktionelle DNA-Sequenz" ist eine DNA-Sequenz gemeint, die, wenn sie in Ablesephase mit der Pre S1-Region aus der Pre SI- Pre S2-S proteincodierenden Sequenz fusioniert ist, nicht an der Zusammensetzung des HBsAG-Partikels beteiligt ist noch die Partikelbildung stört. Bevorzugte funktionelle DNA-Sequenzen umfassen die das circumsporozoide (CS) Protein von Plasmodium oder ein beliebiges immunogenes Derivat davon codierende Sequenz.

Die Erfindung betrifft auch eine Hefe-Wirtszelle, die mit einem solchen rekombinanten Vektor transformiert ist und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen transformierten Wirts. Eine solche Transformation wird in an sich bekannter Weise ausgeführt. Bevorzugte Hefezellen gehören der Gattung Saccharomyces und besonders bevorzugte Zellen der Art Saccharomyces cerevisiae an.

Die Erfindung betrifftauch ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das durch eine Pre S1-funktionelle DNA-Sequenz- Pre S2-proteincodierende Sequenz codiert ist. Ein solches Verfahren umfaßt die Kultivierung der transformierten Wirtszellen in geeigneten Kulturmedien und die Isolierung des Proteins aus dem Kulturüberstand oder aus einem Zell-Lysat oder Extrakt solcher Wirtszellen. Die Art der Isolierung hängt von der Fähigkeit der Wirtszelle ab, solche Proteine zu sekretieren. Mit dem Ausdruck „geeignete Kulturmedien" sind Medien gemeint, in denen der transformierte Wirt wachsen und das Produkt einer Pre S1-funktionellen DNA-Sequenz- Pre S2-S-proteincodierenden Sequenz in wiederholbarer Menge exprimieren kann. Die Isolierung des Pre S1-funktionelle DNA-Sequenz- Pre S2-S-Proteins aus einem Zell-Lysat oder dem Kulturüberstand eines solchen Wirtes wird nach üblichen Methoden durchgeführt. Das Protein, das nach dem Verfahren dieser Erfindung isoliert wird, kann glykosyliert sein, sofern die Wirtszelle die Fähigkeit zur Glykosylierung besitzt. Wenn ein nicht glykosyliertes Protein gewünscht ist, sollte das Protein dieser Erfindung durch Verwendung einer Wirtszelle, die nicht zur Glykosylierung befähigt ist, hergestellt werden. Alternativ könnte die proteincodierende Sequenz durch die übliche ortsspezifische Mutagenese, wie beispielsweise aus Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193—1201, bekannt, verändert werden, bevor das Verfahren der Erfindung durchgeführt wird.

Die Erfindung betrifftauch einen Impfstoff, der eine zum Immunschutz notwendige Menge des Pre S1-funktioneile DNA-Sequenz- PreS2-S-Proteins enthält, die beide nach dem Verfahren der Erfindung hergestellt wurden. Ein solcher Impfstoff kann in an sich bekannter Weise hergestellt werden.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines hybriden Partikels, das ein Protein enthält, das durch eine Pre S1-funktionelle DNA-Sequenz- Pre S2-S-proteincodierende Sequenz codiert ist. Eine solche Methode umfaßt die Kultivierung dertransformierten Hefe-Wirtszellen in geeigneten Kulturmedien und die Isolierung des Partikels aus dem Kulturüberstand oder aus einem Zell-Lysat oder Extrakt solcher Wirtszellen. Die Art der Isolierung hängt von der Fähigkeit der Zellen ab, solche Partikel zu selektieren. Mit dem Ausdruck „geeignete Kulturmedien" sind Medien gemeint, in denen der transformierte Wirt wachsen und die PreS1-funktionelle DNA-Sequenz- Pre S2-S-proteincodierende Sequenz in Partikelform und in wiederholbarer Menge exprimieren kann. Einem Fachmann ist es bekannt, daß die geeigneten Kulturmedien von der verwendeten Wirtszelle abhängen. Die Isolierung des Partikels aus einem Kulturlysat oder dem Kulturüberstand solcher Wirtszellen wird nach üblichen Methoden ausgeführt.

Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, der die Partikel der Erfindung enthält. Ein solcher Impfstoff enthält eine zum Immunschutz notwendige Menge der Partikel und wird in an sich bekannter Weise hergestellt. Der Impfstoff enthält vorzugsweise die Mizelle der Erfindung, nämlich eine IVIizelle, die das Partikel der Erfindung und Polysorbat enthält. Die bevorzugte Menge von Polysorbat in einer solchen Mizelle ist 5 bis 10pg Polysorbat pro lOOpg Protein. Die Mizelle kann nach dem in der EP-A 0199698 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Für den Impfstoff der Erfindung kann eine wäßrige Lösung des Pre S1-funktionelle DNA-Sequenz- Pre S2-S-Proteins oder des Partikels, die vorzugsweise einen physiologischen pH-Wert besitzt, direkt verwendet werden. Alternativ kann dem Proteinpartikel ein beliebiges Adjuvans beigemengt werden. Solche Adjuvantien umfassen unter anderem Aluminiumhydroxid.

Aus New Trends and Developments in Vaccines, herausgegeben durch Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978, ist die Herstellung von Impfstoffen bekannt. Aus der US-Patentschrift 4235877 ist die Einkapselung in Liposomen bekannt. Aus den US-Patentschriften 4372945 und4474757 ist die Zusammensetzung von Proteinen zu Makromolekülen bekannt.

Das Pre S 1-funktionelle DNA-Sequenz- Pre S2-S-Protein oder das Partikel liegt in jeder Impfdosis in einer Menge vor, die in typischen Impfstoffen einer zum Immunschutz notwendigen Antwort ohne bedeutende Nebenwirkungen führt. Eine solche Menge ist abhängig von dem verwendeten spezifischen immunogenen Stoff und auch davon, ob der Impfstoff ein Adjuvans enthält. Generell wird erwartet, daß jede Impfdosis 1 bis 1 ОООцд Protein, vorzugsweise 1 bis 200pg, enthält. Eine optimale Menge für einen speziellen Impfstoff kann durch Standarduntersuchungen ermittelt werden, die die Beobachtung von Antikörpertiter und anderen Reaktionen in Patienten umfassen. Nach einer ersten Impfung wird dem Patienten vorzugsweise nach vier Wochen eine weitere Impfdosis verabreicht, der alle sechs Monate eine weitere folgt, solange ein Infektionsrisiko besteht.

Die Immunantwort gegen das Pre S 1-funktionelle DNA-Sequenz-Pre S2-S-Protein oder das Partikel wird durch die Verwendung eines Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid, verstärkt.

Ausführungsbeispiele

- Alle Prozentangaben sind Gewichtsprozente und alle Temperaturen werden in ⁰C angegeben.

- Die Enzyme, die für die DNA-Manipulation verwendet werden, wurden von Bethesda Research Laboratories, New England Biolabs, und/oder Boehringer, bezogen und entsprechend der Vorschrift des Herstellers angewendet.

- Hefe-Wachstumsmedien: Selektivmedium: YNB (Hefestickstoffbase ohne Aminosäure (Difco Labs) 0,675% (w/v) mit 2% (w/v) Glucose).

- YEPD Medium: 1 % (w/v) Hefeextrakt, 2% (w/v) Pepton und 2% (w/v) Glucose.

- Methoden zur Herstellung von rekombinanten DNA-Molekülen sind aus „Molecular Cloning", T.Maniatis et al., Cold Spring Harbor Lab. (1982) bekannt.

- PMSF: Phenylmethylsulphonylfluorid.

Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:

PBS: phosphatgepufferte Kochsalzlösung (pro Liter): (pH 7,4)

8,OgNaCI

0,2g KCI

1,15g Na₂HPO₄

0,2g KH₂PO₄

0,IgCaCl₂

0,1g MgCI₂-6H₂O

BSA: Rinderserumalbumin (A₄₃₇₈, Sigma)

X-gal: S-BrorrM-chloroindoyl-ß-D-galactopyranosid, erhältlich bei Sigma Chemical Co., St.Louis, Missouri.

L-BROTH (pro Liter):

lOgTrypton

5 g NaCI

5g Hefeextrakt

1 ml 0,1 M MgSO₄

Nach Autoklavierung Zugabe von 5ml einer sterilen Thiaminlösung (1 mg/ml). Für feste Medien Zugabe von 15g Agar pro Liter.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Konstruktion des Plasmids pRIT10167

Das Ausgangsmaterial war das Plasmid ρ 6y, das in pBR322 ein 2,1 kb großes Hind Ill-Fragment der Hefe-DNA enthält, das für das TDH3-Gen codiert. pBR322 ist aus Bolivar et al., Gene, 2 (1977), 95-113, bekannt. Das рбу-Plasmid wurde konstruiert und charakterisiert von Musti et al., Gene, 25 (1983), 133, und von Dr.M.Rosenberg des National Institute of Health erhalten. Das Hind Ill-Fragment wurde in ein pBR322-Derivat ohne EcoRI-Stelle umkloniert, und es entstand das Plasmid PRIT10164 (ein nicht wesentlicher Schritt). Die folgenden Manipulationen wurden ausgeführt, um eine BamHI-Stelle an dem G-Rest des ATG-Codons derTDH3-codierenden Sequenz einzuführen und ein Hindlll-BamHI DNA-Fragment mitTDH3-Promotoraktivität zu erhalten, in dem die TDH 3-Sequenzen intakt und nicht durch die Manipulation verändert sind. Die wie oben beschrieben hergestellte DNA von pRIT 10164 wurde durch zweimalige Cäsiumchlorid-Äthidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation, wie im wesentlichen aus Kahn et al. (Methods in Enzymology, 68, 268,1979) bekannt, gereinigt. 150pg der pRIT 10164 DNA wurden vollständig mit 75 Einheiten der Endonuclease Xba I verdaut, mit Phenol und Äther extrahiert, mit Äthanol präzipitiert und die DNA in 0,01 M Tromethamin-HCI-Pufferzu einer Konzentration von 1 цд pro μΙ aufgenommen. Proben von 20pg dieser Xbal-gespaltenen DNA wurden mit der Nuclease BaI 31 verdaut, um die 61 Basenpaare der DNA zwischen dem ATG-Codon und derXbal-Stellezu entfernen. Verdauungen mit BaI31 wurden bei 30⁰C für 1 bis 3 Minuten in einem Puffer mit pH 3,1, der 60OmM NaCI, 12mM CaCI₂,12mM MgCI₂,1 mM EDTA, 2OmM Tromethamin-HCI enthält, durchgeführt, wobei eine Einheit der Bal31-Nuclease pro 20цд DNA in einem Reaktionsvolumen von 200μΙ verwendet wurde.

Die Enzymreaktionen wurden gestoppt durch Zugabe von Äthylenbis(oxyäthylennitrilo)-tetraessigsäure(EGTA) bis zu einer Endkonzentration von 2OmM. Die Proben wurden mit gleichen Volumina Phenol und Äther extrahiert und mit Äthanol präzipitiert. Jede DNA-Probe wurde in 20 μ110 mM Tromethamin-HCI-Puffer pH 7,5 resuspendiert. Das Ausmaß der BaI 31-Verdauung wurde gemessen, indem etwa 2,5 μg einer jeden DNA-Probe mit der Endonuclease Hpa I verdaut wurden und indem die Größe der Hpal-Xbal-Fragmentemitdem 335 Basenpaar großen Hpal-Xbal-Fragment von pRIT 10164 verglichen wurde. Nach 2 Minuten Verdauung mit BaI 31 waren etwa 41 bis 88 Nucleotide von dem Xbal-Hpal-Fragment von pRIT10164 entfernt.

Dieses Ergebnis zeigt an, daß eine ähnliche Anzahl von Basenpaaren von der anderen Xba I-Stelle zu dem ATG-Codon hin entfernt worden sind. 5μg der nach der 2minütigen Bal31-Verdauung erhaltenen DNA wurden mit der Endonuclease BamHI gespalten, mit Phenol extrahiert und durch Äthanolpräzipitation gesammelt. Diese DNA wurde mit 5 Einheiten der T 4-Polymerase in Gegenwart von Desoxynucleotid-triphosphaten behandelt, um Einzelstrangbereiche an den BamHI- und Bal31-Stellen aufzufüllen. Die DNA wurde mit Phenol extrahiert und durch Äthanolpräzipitation gesammelt. 2,3 μg dieser DNA wurden mit 5 Einheiten T4 DNA-Ligase behandelt. Die Hälfte des Ligationsansatzes wurde verwendet, um kompetente Zellen des E.coli Stammes K12 MM 294, die nach dem Verfahren von Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 69 (1972), 2110, hergestellt wurden, zu transformieren. 1 ml der transformierten E.coli-Population wurde in 350ml L-Broth mit 200μg/ml Ampicillin verdünnt und die gesamte Plasmid-DNA aus der resultierenden Kultur gereinigt.

80pg dieser Plasmid-DNA, die eine Population von Plasmidmolekülen mit Bal31 induzierten Deletionen von etwa 40 bis 80 Basenpaaren enthält, wurde nacheinander mit 75 Einheiten der Endonuclease Hind III und 96 Einheiten der Endonuclease BamHI verdaut, um DNA-Fragmente freizusetzen, in denen eine BamHI-Stelle nach den oben beschriebenen Behandlungen eingeführt wurde. Dies ist der Fall, wo die Bal31 Verdauung an einem G-Rest gestoppt hat. Diese geschnittene DNA wurde auf einem präparativen 1%igen Agarose-Gel aufgetrennt. Die gewünschten Hind IIl-BamHI-Fragmente mit einer Größe von 1 000 bis 1100 Basenpaaren wurden in zwei Stückchen aus dem Gel ausgeschnitten, wobei das eine eine DNA mit etwa 1070 Basenpaaren und das andere Gelstückchen eine DNA mit etwa 1 030 Basenpaaren enthielt. Die DNA wurde aus den Agarose-Gel-Stückchen durch mehrmaliges Einfrieren und Auftauen und einer anschließenden Zentrifugation, bei der die Agarose sedimentiert wurde, erhalten. Der flüssige Überstand wurde durch einen Mi IM pore GV Mi I lex Filter gedrückt und die DNA durch zweimalige Äthanolpräzipitationen gesammelt und schließlich in 20μΙ einer 0,01 M Tromethamin-HCI-Puffers mit pH 7,5 resuspendiert. Die Analyse der Agarosegelelektrophorese und der Vergleich mit einer Hind III, Xba l-verdauten pRIT1064 DNA und mit den Fragmenten einer Hind III EcoRI-gespaltenen \Phagen-DNA zeigten, daß zwei getrennte Hind Ill-Fragmentpopulationen erhalten wurden. Die eine Fragmentpopulation entsprach einer Größe von etwa 1 070 Basenpaaren und die andere einer Größe von etwa 1 030 Basenpaaren im Vergleich mit dem 1120 Basenpaar großen Hind Ill-Xbal-Ausgangsfragment aus pRIT10164. Etwa 100ng der 1 030 Basenpaare großen Hindill BamHI-Fragmentpopulation wurde mit 200ng des Plasmids pUC9 ligiert, das mit Hind III und BamHI gespalten und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war (vgl. US-PS 4264731). Die Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetente Zellen des E.coli Stammes JM 103 zu transformieren und auf Ampicillin-Resistenz zu selektionieren. Die Transformation des E.coli Stammes JM 103 wurde nach dem von Cohen et al., a.a.O., beschriebenen Verfahren durchgeführt.

Der Vektor puC9 und der E.coli Stamm JM 103 sind aus Vieira and Messing, Gene, 19 (1982), 259, bekannt und wurden von J.Messing (Universität von Minnesota) erhalten. Der puC9-Vektor ist erhältlich von Amersham (Buckinghamshire, United Kingdom) und Pharmacia (Uppsala, Schweden). Der E.coli Stamm JM 103 ist erhältlich von J.Messing (Universität von Minnesota). Ein anderer E.coli Stamm mit den Eigenschaften des E.coli Stammes JM103, nämlich der Stamm JM 101, ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter ATTC 33876 hinterlegt und kann als Wirt ebenfalls verwendet werden. Etwa 400 ampicillinresistente Kolonien wurden pro ml erhalten und 98 Kolonien davon auf einem Medium, das X-gal enthielt, getestet. 95 davon waren weiß und zeigten die erfolgreiche Insertion eines fremden DNA-Fragments zwischen den Hindlll- und BamHI-Stellen des Vektors an.

Plasmide einzelner transformierter Kolonien wurden nach Amplifikation der Plasmide durch Zugabe von Spectinomcycin (150μ/ιτιΙ) in das Kulturmedium im Labormaßstab präpariert (Birnboim and DoIy, Nucl. Acid Res., 7 [1979], 1513). Die rekombinanten Plasmide wurden auf einem 7,5%igen Polyacrylamid-Gel nach einer Doppelverdauung mit Ava Il und BamHI analysiert und mit dem 450 Basenpaare großen Ava Il-Xba I-Fragment, das den Promotor und die N-terminale codierende Region von pRIT 10164 enthält, und mit den Hpa Il-Fragmenten der pBR322 DNA verglichen. In 35 von 36 Plasmiden wurde ein Ava II-BamHI-Fragment gefunden, das Deletionen von 20 bis 90 Basenpaaren im Vergleich mit pRIT10164 besitzt. Drei Plasmide, die Deletionen von etwa 80 Basenpaaren (pRIT10166), 50 Basenpaaren (pRIT10167-Fig.8) und 45 Basenpaaren (pRIT10165) enthalten, wurden für weitere Tests ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurde durch CsCI-Äthidium-Bromid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt und 25pg jeweils mit EcoRI verdaut. Die EcoRI-Enden wurden mitY³²-P-ATP in einer

Kinasereaktion markiert und die Nucleotidsequenz der Hind lll-EcoRI-Fragmente eines jedes Plasmids nach Maxam und Gilbert (Methods in Enzymology, 65 [1980], 499), bestimmt. Die Markierung und Sequenzierung von der EcoRI-Stelle aus im pUC9-Vektoranteil eines jeden rekombinanten Plasmids ist ein passendes Mittel, um die Sequenz an der angrenzenden BamHI-Stelle zu bestimmen, die das Ende der Deletion in dem TDH3 DNA-Fragment angibt. Diese Sequenzierungsanalyse zeigte, daß in dem Plasmid pRIT10166 die BamHI-Stelle an einem G-Rest in der 5'-nichttranslatierten Region 25 Basenpaare upstream des ATG-Codons wiederentstanden ist; in pRIT 10165 ist die BamHI-Stelle an der zweiten Base des dritten Codonsund in pRIT 10167 an dem G des ATG-Codons lokalisiert.

Das Hind HI-BamHI-Fragment der TDH3 DNA in pRIT10167 enthält alle notwendigen Sequenzen in unveränderter Form für die TDHS-Promotoraktivität.

Beispiel 2

Konstruktion des Vektors pRIT10172

Das 1050 Basenpaare große Hind HI-BamHI TDH 3 DNA-Fragment aus pRIT 10167, hergestellt gemäß Beispiel 1, wurde in den aus Broach et al., Gene 8 (1979), 121, bekannten Shuttle-Vektor YEp 13 umkloniert. Das Hind IU-BamHI TDH 3 DNA-Fragment wurde zwischen die Hind Ill-Stelle der zwei Mikron DNA des Vektors und der BamHI-Stelle ligiert und es entstand das rekombinante Plasmid pRIT12159. Die DNA von pRIT 12159 wurde mit Xbal und BamHI gespalten und das erhaltene 1 650 Basenpaare große Fragment anstelle eines ähnlichen Xba l-BamHI-Fragmentes, das den arg³-Promotor enthält, in das Plasmid pRIT 10774 ligiert. Das Plasmid pRIT 10774 ist aus Cabezon et al., (Proc. Natl. Acad. Sei., USA 81 [1986], 6594-6598), bekannt. Dieses Plasmid, in dem die BamHI und Xhol-Stellen des Vektoranteils durch In-vitro-Manipulation deletiert sind, enthält das YEp 13-Replikon, ein 1470 Basenpaare großes Hindlll-BamHI-Fragment, das die arg³-Promotorregion besitzt, und ein 1150 Basenpaare großes BamHI-Hind Ill-Fragment, das die arg³-Transkriptions-Terminationsregion besitzt. Die Substitution des arg³-Promotorinserts von pRIT10774 durch dasTDH3-Promotorinsert ergibt das Plasmid pRIT10172. Dieses Plasmid besitzt daher neben dem Signal für die Transkriptions-Termination auf dem 1150 Basenpaare großen BamHI-Hind III arg³-DNA-Fragment eine einzelne BamHI-Stelle, die an dem ATG desTDH3-Promotorinserts liegt.

Fremde DNA kann daher in diese Stelle kloniert werden. Ferner können die zwei DNA-Inserts, die über Hind Ill-Stellen miteinander verbunden sind, als eine Expressionseinheit auf einem 2200 Basenpaare großen Hind HI-Fragment entnommen werden und in andere Vektoren inseriert werden. Fig. 9 zeigt eine Restriktionskarte von pRIT10172.

Beispiel 3

Herstellung des Plasmids pRIT12290

Ein 1050 Basenpaare großes Hind IH-EcoRI-Fragment von pRIT10167 (Fig. 8), hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, das das Hind IH-BamH ITDH3-Promotorfragment und den BamH I-Sma 1-EcoR I-Teil des pUC9-Polylinkers besitzt, wurde zwischen die Hind IN- und EcoRI-Stellen eines pBR322-Derivates ligiert. Es entstand das rekombinante Plasmid pRIT12176. Das verwendete pBR322-Derivat besitzt eine Deletion der BamH I-Stelle, nachdem diese Stelle durch die T4 DNA-Polymerase aufgefüllt worden war.

Die Plasmid-DNA von pRIT10158 (Fig.8), hergestellt gemäß Beispiel 4 (b), wurde mit EcoRI gespalten und mit T4 DNA-Polymerase behandelt, um den EcoRI Einzelstrangbereich aufzufüllen. Diese Präparation wurde ferner mit der Endonuclease CIaI verdaut. Eine weitere Probe der pRIT10158 DNA wurde mit den Endonucleasen CIaI und Haelll verdaut und ein 1150 Basenpaar großes CIa I-Hae Ill-Fragment, dasdieTranskriptions-Terminationsregion des arg³-Gens besitzt, durch preparative Agarose-Gelektrophorese und Elektroelution erhalten. Dieses Fragment wurde mit EcoR I gespaltener, T4 DNA-Polymerase behandelter und CIaI nachgespaltener pRIT10158DNA ligiert. Der Ligationsansatz wurde verwendet, um kompetente Zellen des E.coli Stammes MM 294, die nach Cohen et al., a. a.O., hergestellt wurden, zu transformieren und dann auf Ampicillin-Resistenzzu selektionieren. Von den transformierten Kolonien wurde ein Plasmid isoliert, das als pRIT10162 identifiziert wurde, in dem das CIa I-Hae III arg³Transkriptions-Terminationsfragment in pRIT 10158 zwischen die CIaI und die aufgefüllte EcoRI-Stelle inseriert wurde, und in dem die EcoRI-Stelle wieder hergestellt wurde. Fig.8 zeigt die Herstellung von pRIT10162. Die Plasmid-DNA pRIT 10162 wurde mit EcoR I und Pst I gespalten, mit ebenfalls EcoRI und Pst I gespaltener DNA von pRIT 12176 gemischt und ligiert. Die Ligasemischung wurde verwendet, um Zellen des E.coli K12 Stammes MM294 nach dem Verfahren von Cohen et al., a.a.O., zu transformieren und auf Ampicillin-Resistenzzu selektionieren. Ein Plasmid, pRIT12208, wurde aus einer transformierten Kolonie erhalten, in dem das 4630 Basenpaare große EcoR I-Pstl-Fragment von pRIT12176mit dem 1 930 Basenpaare großen EcoRI-Pstl-Fragment von pRIT10162 ligiert worden war, und in dem die arg³-Transkriptions-Terminationsregion an der TDH 3-Promotorregion angelagert ist. Die arg³ und TDH3-DNA-Regionen können durch Spaltung mit Hindill in einem 2 200 Basenpaare großen Fragment aus pRIT 12208 erhalten werden. Zum Erhalt der anderen Orientierung dieses Fragments hinsichtlich der Vektorsequenzen wurde das 2 200 Basenpaare große Hind Ill-Fragment von pRIT 12208 in der Hind Ill-Stelle eines pBR 322-Derivates umkloniert. In diesem Plasmid-Derivat waren die EcoR I- und BamH I-Stellen in Auffüllreaktionen durch die T4 DNA-Polymerase nacheinander deletiert worden. Das resultierende rekombinante Plasmid, in dem das 2 200 Basenpaare große Hind 111-Fragment hinsichtlich der Vektorsequenz in anderer Orientierung vorliegt, im Vergleich zu pRIT 12208, wird als pRIT 12290 identifiziert. Fig. 10 zeigt eine Restriktionskarte von pRIT 12290. In den Plasmiden pRIT 12208 und pRIT 12290 liegen zwischen den TDH3-Promotor und arg³-Transkriptions-Terminationsfragmenten die einzig vorhandenen BamH I, Sma I und Eco I-Restriktionsstellen, die sich gut zur Klonierung von DNA-Fragmenten, die codierende Sequenzen enthalten, eignen. Die Promotor- und Transkriptions-Terminationsregionen können zusammen in einem 2200 Basenpaare großen Hind Ill-Fragment als eine Expressionseinheit erhalten werden und in andere Vektoren transferiert werden. Die BamH I-Stelle ist besonders gut geeignet, da sie am ATG-Codon desTDH 3-Gens liegt und somit für die Fusion anderer Gene mit dem TDH3-Promotor verwendet werden kann, um diese in Hefe wie nachfolgend veranschaulicht zu exprimieren. Solche fusionierten Sequenzen können aus pRIT 12208 oder pRIT 12290 durch Spaltung mit der Endonuclease Hind III oder anderer Endonucleasen an den flankierenden Restriktionsstellen als eine Expressionseinheit erhalten und in Hefe-Shuttle-Vektoren inseriert werden.

Beispiel 4

Konstruktion der Plasmide pRIT10677, pRIT10909 und pRIT10158

a) pRIT10677

Ein 1372 Basenpaare großes BamH I-Fragment von klonierter HBV-DNA wurde aus pRIT 10616 (Harfprd et al., Dev. Biol. Standard,

54[1983], 125-130), ausgeschnitten und mit BamH I gespaltener pBR327 DNA gemischt und ligiert. Dieses BamHI-Fragment enthält einen Teil der HBsAG-Vorläuferregion, die HBsAG-codierende Sequenz und З'-nichtcodierende Sequenzen. Aus der Ligationsmischung wurde das Plasmid pRIT10677 ausgewählt, das das HBV BamHI-Fragment in der Orientierung enthält, daß die Xbal-Stelle der HBV DNA benachbart zur Sall-Stelle der pBR327-Vektor-DNA ist. Fig.8 zeigt die Herstellung von pRIT 10677. b) pRIT10909

Das 3300 Basenpaare große Hind Ill-Fragment des aus Crabeel M. et al., EMBO J., 2(1983), 205-212, bekannten Plasmides pMC200 (ohne Beschränkung erhältlich bei American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter ATCC 39131) wurde in ein pBR 322-Derivat umkloniert, in dem die EcoR I-Stelle in einer Auffüllreaktion durch die T4 DNA-Polymerase deletiert wurde. Ein resultierendes rekombinantes Plasmid, pRIT10158, (Fig. 8), wurde ausgewählt, in dem die З'-Region des arg³-Gens des Hind Ill-Fragments benachbart zu der CIa I-Stelle des modifizierten pBR322-Vektors liegt. Aus pRIT10158 wurde ein 1150 Basenpaare großes CIa I-Haelll-Fragment erhalten, das die Transkriptions-Terminationsregion des arg³-Gens enthält. Dieses 1150 Basenpaare große Fragment wurde mit der CIaI-und Hpa I gespaltenen DNA des Plasmids pRIT 10677 (wie vorstehend in Teil a) beschrieben) ligiert, um die arg³-Terminations-Region an der Hpa I-Stelle, die downstream von der HBsAG-codierenden Region liegt, einzuführen. Das resultierende Plasmid ist pRIT 10909. Fig. 8 zeigt die Herstellung von pRIT 10909. Fig. 3 zeigt eine Restriktionskarte von pMC200.

Beispiel 5

Konstruktion der Plasmide pRIT10911 und pRIT10912

Die BamHI-Stelle in pRIT10167 (Beispiel 1) und die natürlich vorkommende BamHI-Stelle in der Vorläuferregion des HBsAG-Gens eines in pRIT10616 (Harford et al., Dev. Biol. Standard, 54[1983], 125-130), klonierten HBV-Virus des adw-Serotyps, liegen im gleichen Leserahmen vor. Dies ermöglicht die Fusion mit dem TDH3-Promotorfragment, so daß eine fusionierte DNA-Sequenz entsteht, die ein ATG-Condon, 42 Codons der HBsAG-Precursor-Sequenz und dieser folgend 226 Codons der HBsAG-codierenden Sequenz besitzt. Das Ausgangsmaterial für das in dieser Fusion verwendete HBV DNA-Fragment war das Plasmid pRIT 10909 (vgl. vorstehend, Beispiel 4, Teil b)). Dieses Plasmid enthält ein 935 Basenpaare großes BamH I-Hpal-Insert, das einen Teil der codierenden Region der HBsAG-Vorläuferregion, die vollständige HBsAG-codierende Sequenz und 128 Basenpaare der З'-nichttranslatierten DNA enthält, und an das downstream von seiner Hpa I-Stelle ein 1150 Basenpaare großes Haelll-Clalll-DNA-Fragment auspRIT10158, das die arg³-Transkriptions-Terminationsregion enthält, ligiert worden war. pRIT10158 ist vorstehend in Beispiel 4 Teil b) beschrieben. Das 2085 Basenpaare große Ecol-BamHI-Fragment wurde aus pRIT 10909 ausgeschnitten und zwischen die EcoR I-und BamH I-Stellen von pRIT10167, das wie vorstehend in Beispiel a) beschrieben, hergestellt wurde, ligiert. Es entstand das Plasmid pRIT 10911. Das 3135 pb große Hind Ill-Fragment von pRIT10911, das Hefe-DNA-Transkriptionssignale und die HBsAG-codierende Sequenz enthält, wurde in den Shuttle-Vektor YEp 13 inseriert. Es entstand das Plasmid pRIT10912. Fig. 8 zeigt die Herstellung von pRIT10911.

Beispiel 6

Konstruktion der Plasmide pRIT10903 und pRIT10914

Das Ziel der nachfolgend beschriebenen Konstruktionen war, überschüssige Nucleotide am 5'-Ende eines DNA-Fragmentes, das zumindest für den N-terminalen Bereich des reifen HBsAG codiert, zu entfernen, so daß eine aus 6bp bestehende Restriktionsstelle an der ersten Base des zweiten Codons geschaffen wird. Das resultierende Fragment kann dann mit Promotorfragmenten fusioniert werden, die eine aus 6 Basenpaare bestehende Restriktionsstelle an dem Initiationscodon besitzen, wobei Mungo Bohnen-Nuclease oder S 1-Nuclease verwendet werden, um Einzelstrangbereiche zu entfernen und für die Ligierung stumpfe Enden zu schaffen, wie dies Rosenberg et al., Methods in Enzymology, 101C, 123(1983), beschrieben hat. Ein 1225 bp großes FnuDII-Fragmentvon HBV DNA aus pRIT10616 (vgl. Harford et al. [1983], Devel. Biol. Standard, 54,125-130), das das HBsAG-Gen enthält, wurde isoliert, mit synthetischen Octomer EcoRI-Linkern versehen und in die EcoR I-Stelle des Vektors pACYC184 ligiert. Es entstand das Plasmid pRIT 10679 (Fig.8). Der Vektor pACYC184 wurde von S.Cohen erhalten und ist aus Chang A. CY. und Cohen S. (1978), J. Bacteriol., 134,1141-1156, bekannt. pACYCI 84 ist auch von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter ATCC 37033 erhältlich. Von diesem EcoRI (FnuDII)-Fragment wurde ein 125bp großes EcoR I-Xba I-Fragment erhalten, das die C-terminale Region der HBsAG-Vorläufer-DNA, das HBsAG ATG-Codon und 90 bp der HBsAG-codierenden Sequenz enthält. Dieses 125bp große ExoR I-Xba I-Fragment wurde zwischen die EcoR I-und Xba I-Stellen von pRIT10158 (vgl. Beispiel 4b) eingeführt. Das resultierende Plasmid pRIT 10903 enthält daher eine einzige EcoR I-Stelle an der Verbiundung zwischen arg³-DNA und HBV-DNA und eine einzige Xho I-Stelle in der arg³-Promotorregion. Fig. 8 zeigt die Herstellung von pRIT 10903.

150pg der pRIT 10903 Plasmid-DNA, die durch CsCI-Äthidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt wurde, wurden mit 80 Einheiten der EcoRI-Endonuclease gespalten, mit Phenol extrahiert, mit Äthanol präzipitiert undiniOmM Tromethamin-HCI-Puffer (pH 7,5) zu einer Konzentration von 1 цд pro μΙ aufgenommen. Die DNA wurde in drei Proben von jeweils 50цд aufgeteilt und bei 30⁰C 50,75 und 90 Sekunden mit der Nuclease Ba 131 inkubiert. Jede Reaktionsmischung enthielt den gleichen in Beispiel 1 beschriebenen Reaktionspuffer, 50цд EcoRI-verdaute pRIT10903-DNA und 2,5 Einheiten der Nuclease Ba131 in einem Endvolumen von 500μΙ. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von EGTA bis zu einer Endkonzentration von 2OmM gestoppt. Die Reaktionsmischungen wurden auf Eis gestellt, mit einem gleichen Volumen Phenol extrahiert und mit Äthanol präzipitiert. Die Ba 131-behandelten DNA-proben wurden jeweils in 50 μΙ 1OmM Tromethamin-HCI-Puffer aufgenommen. 2,5 μg der DNA wurden mit der Endonuclease BstE Il verdaut und auf einem 7,5%igen Polyacrylamid-Gel mit dem EcoR l-BstE Il-Verdau von pRIT 10903, derein 285 bp großes Fragment freisetzt, verglichen. Die Behandlung mit der Nuclease Ba 131 75 Sekunden bei 30°C reduziert die Größe dieses EcoR l-BstE Il-Fragments um 10 bis 60 bp. Es entsteht eine Serie von einzelnen DNA-Fragmenten, bei denen schätzungsweise 10, 30,45 und 60bp entfernt sind. Die Entfernung von 29 bp, ausgehend von der ursprünglichen FnuDII-Stelle, würde zur Entfernung der gesamten HBsAG-Vorläufer-DNA und des HBsAG ATG-Codons führen. 5μgderpRIT10903DNA, die 75 Sekunden mit Ba 131 behandelt worden war, wurden mit 8 Einheitender Nuclease Xho I verdaut, mit Phenol extrahiert und mit Äthanol präzipitiert. Diese DNA wurde dann mit 5 Einheiten der T 4 DNA-Polymerase in Gegenwart von Desoxynucleotidtriphosphaten inkubiert, um Einzelstrangbereiche an den Xho I- und Ba 131-Enden aufzufüllen mit Phenol behandelt und mitÄthanol präzipitiert. Die DNA wurde dann mit 5 Einheiten derT4 DNA-Ligase 16 Stunden bei 16°C inkubiert. Die Ligationsmischung wurde schließlich verwendet, um kompetente Zellen des E.coli K12 Stammes MM 294 zu transformieren und diese dann auf Ampicillin-Resistenz zu selektionieren, wie aus dem vorstehend angegebenen Verfahren von Cohen et al.

bekannt ist. Etwa 2000 ampicillinresistente Kolonien pro ml wurden nach dem Ausplattieren erhalten. Aus 47 einzelnen Kolonien wurden Plasmide im Labormaßstab (vgl. Birnboim et al., a.a.O.) präpariert, von denen 23 eine Xhol-Stelle besitzen. Dies deutet daraufhin, daß die Auffüllreaktion an der ursprünglichen Xhol-Stelle und die Ligierung an ein З'-Ende, das mit einem G-Rest endet, erfolgreich verlaufen ist. Diese 23 Plasmide wurden weiter mit XhoI und Xba I verdaut, um die Größe des kleinen Restriktionsfragmentes im Vergleich mit den ursprünglichen EcoRI-Xbal-Fragmenten aus pRIT10903zu vergleichen. Mehrere Plasmide wurden identifiziert, die schätzungsweise Deletionen von 25 bis40bp besitzen. Ein Plasmid, pRIT10914, dessen Xho I-Xbal-Fragment schätzungsweise eine Größe von 95 bis 100bp besitzt, wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt. Fig. 8 zeigt die Herstellung von pRIT 10914. DNA dieses Plasmides wurde durch CsCI-Äthidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt und 25цд einer solchen DNA wurden mit 140 Einheiten der Xbal-Endonuclease gespalten.

Die Xba I-Enden wurden mit γ-³²Ρ-ΑΤΡ markiert und die markierte DNA mit 15 Einheiten der Hind Ill-Endonuclease gespalten. Das kleine 765bp Hindlll-Xbal-Fragment wurde durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Elektroelution isoliert und nachfolgend durch Äthanol präzipitiert. Die Nucleotid-Sequenz an und im Bereich der Xhol-Stelle wurde bestimmt, indem dieses Fragment von dem markierten Xba I-Ende aus nach Maxam und Gilbert sequenziert wurde. Die Sequenzdaten zeigten, daß die Xho I-Stelle an der ersten Base des zweiten Codons der HBsAg-codierenden Sequenz liegt.

Xhol

CTCGAGAAC

HBsAG Nucleotide

Nach Entfernung von Einzelstrangbereichen ist dieses Fragment daher zur Fusion mit der BamH !-Verlängerung desTDH3-Promotor-Fragmentes von pRIT10167 (Beispiel 1) geeignet.

Beispiel 7

Konstruktion der Plasmide pRIT12211, pRIT 12209, pRIT 12230 und pRIT 12265 Das Plasmid pRIT10911, hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde als Ausgangsmaterial für weitere Manipulationen verwendet. Um gewünschte Restriktionsstellen einzuführen, wurde das Plasmid mit den Endonucleasen BamH I und Xba I gespalten und das ausgeschnittene Fragment durch ein 2275bp großes BamH I-Xbal-Fragment aus pRIT10158 (Beispiel 4) ersetzt. Diese Manipulation führt zu dem Plasmid pRIT12211, in dem das Hind lll-BamH ITDH 3 Promotor-Fragment neben einem BamH I-Xba I-Fragment liegt, das eine Xho I-Stelle enthält. Ferner enthält dieses Plasmid ein Xba I-Hind Ill-Fragment, in dem die C-terminale Region der HBsAG-codierenden Sequenz und 128bp der3'-nichtcodierenden Sequenz mit der 1150bparg³-Transkriptions-Terminationsregion fusioniert ist. Fig. 8 zeigt die Herstellung von pRIT 12211. Das Plasmid pRIT 12211 wurde mit den Endonucleasen Xhol und XbaI gespalten. Hierdurch wurde ein 1600bp großes Fragment entfernt, das durch ein 94bp großes Xhol-Xba I-Fragment der modifizierten HBsAG DNA aus pRIT10914, hergestellt gemäß Beispiel 5, ersetzt wurde. Dieses 94bp große Fragment wurde nach der Doppelverdauung der pRIT 10914 DNA mit Xhol und Xba I durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese und anschließende Elektroelution aus dem entsprechenden Gelstückchen gereinigt und durch Äthanol präzipitiert. Das durch die Insertion des 94bp großen Fragments entstandene Plasmid pRIT12209 (vgl. Fig.8) wurde durch CsCI-Äthidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. 50 pg dieser DNA wurden mit 90 Einheiten der BamHI-Endonucleaseund 60 Einheiten der Xho I-Endonuclease verdaut, um die 990 bp große unwesentliche DNA zwischen dem TDH 3 Promotor und der HBsAG-codierenden Region zu entfernen. Die DNA wurde dann mit Phenol extrahiert und anschließend mit Äthanol präzipitiert. 16pg dieser DNA wurden 30 Minuten bei 30⁰C mit 20 Einheiten der Mungo Bohnen-Nuclease (PL Biochemicals) in einem Volumen von 125 μΙ inkubiert. Der verwendete Inkubationspuffer enthielt 3OmM Natriumacetat (pH 4,6), 25OmM Natriumchlorid, 1 mM Zinkchlorid und 5% Glycerin. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Natriumdodecylsulfat bis zu einer Endkonzentration von 0,2% gestoppt und die DNA mit einem gleichen Volumen an Phenol extrahiert und anschließend mit Äthanol präzipitiert. Eine Teilmenge von 0,5 цд dieser mit Mungo Bohnen-Nuclease behandelten Probe wurde mit 2 Einheiten derT4DNA-Ligase 16 Stunden bei 16°C inkubiert und dann mit 2 Einheiten der BamHI-Endonuclease gespalten, um jegliche Vektormoleküle zu zerstören, die bisher unbehandelt geblieben sind. Diese Mischung wurde verwendet, um kompetente Zellen des E.coli K12 Stammes MM294 zu transformieren und anschließend auf Ampicillinresistenz gemäß Cohen et al., a.a.O., zu selektionieren. Etwa 2000 ampicillinresistente Kolonien pro ml Transformationsmischung wurden erhalten. Von 24 amplifizierten Kolonien wurden die Plasmide im Labormaßstab (gemäß dem Verfahren von Birnboim et al., а. а. О.) präpariert. 16 der 24 Plasmide ergaben nach Verdauung mit der Endonuclease Hind III zwei DNA-Fragmente mit einer Größe von 2700bp (pUC9-Vektor) und 3 000 bp. Das 3000 bp große Fragment besitzt die für ein DNA-Fragment erwartete Größe, in dem die HBsAG-codierende Sequenz und die arg³-Terminationsregion an das TDH3 Promotor-Fragment ligiert ist.

Vier Plasmid-Kandidaten wurden für die weitere Untersuchung hergenommen. Die DNA eines jeden Plasmides wurde mit der Endonuclease Xba I gespalten, in einer Kinase-Reaktion mit γ-³²Ρ-ΑΤΡ markiert, mit der Endonuclease Hind Hl gespalten und durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgetrennt. Das 1190bp große markierte Hindlll-Xbal-Fragment wurde durch Elektroelution isoliert und durch Äthanol präzipitiert. Die Sequenz eines jeden isolierten Fragments wurde nach Maxam und Gilbert, a.a.O., bestimmt. Zwei Plasmide wurden gefunden, die die korrekte Sequenz ATGGAGAACfür eine perfekte Fusion zwischen der TDH 3 Promotor-Region und dem HBsAG-Gen besitzen. Eines dieser Plasmide, pRIT 12230, wurde für weitere Manipulationen verwendet. Fig.8 zeigt die Herstellung von pRIT 12230. Die DNA dieses Plasmids (pRIT 12230) wurde mit der Endonuclease Hind III gespalten und das ЗОООЬр große Fragment, in dem die HBsAg-codierende Sequenz fusioniert mit dem TDH 3 Promotor vorliegt, in den Shuttle-Vektor XEp 13 ligiert. Das resultierende Plasmid, pRIT12265, wurde nach dem von Ito et al., J. Bact. 153(1983), 163, beschriebenen Verfahren in den Hefestamm DC5 (MATa, leu2-3, Ieu2-112, his3, can1 -11) (erhalten von J. Broach State University of N.Y., Stony Brook) eingeschleust. Dieser Hefestamm ist auch ohne Beschränkung von der American Type Culture Collection unter ATCC 20630 erhältlich.

Beispiel 8

Konstruktion der Plasmide pRIT12288 und pRIT12322

Das Plasmid pRIT 12230 (Beispiel 7) enthält З'-downstream vom Stop-Codon des HBsAg-Strukturgens 128 bp, die nicht für HBV codieren.

Zur Entfernung dieser 128 bp wurden 25 μg von pRIT 12230, hergestellt gemäß Beispiel 7, mit Acc I und EcoR I verdaut. pRIT 12230 enthält eine einzige Accl-Stelle, die in der codierenden Sequenz des S-Gens 7 Nucleotide vor dem TAA Stop-Codon liegt. Die

verdaute DNA wurde auf einem 1%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und das größere 4200 bp große Vektor-Fragment aus dem Gel durch Elektroelution erhalten und durch Äthanol präzipitiert.

Künstliche 12mer und 14mer Einzelstrang-DNA-Linker-Moleküle mit den folgenden Sequenzen wurden für die Insertion zwischen der Acc I- und EcoRI-Stelle von pRIT 12230 hergestellt:

5' ATACATTTAACGS' 12 mer

3' TGTAAATTGCTTAA 5' 14 mer

Dies stellt die korrekten C-terminalen HBsAg-Codons und das TAA-Stop-Codon wieder her und liefert für den Zusatz von Transkriptions-Terminationsfragmenten eine EcoRI-Stelle, die sonst nirgenwoin dem TDH3 Promotor oder den HBsAg-codierenden Sequenzen vorliegt.

10OpMoI der synthetischen 12 mer und 10OpMoI der synthetischen 14mer Einzelstränge werden in einem Endvolumen von 10 bis 20 μΙ zusammengemischt, 15 Minuten bei 7O⁰C erhitzt und dann innerhalb von 3 Stunden langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, um das Aneinanderlagern beider Stränge entlang ihrer komplementären Sequenzen zu erreichen. Zu dieser „annealing"-Mischung werden 0,15pMol (400ng) des 4200bp langen Accl-EcoRI-Fragments von pRIT 12230,10fach konzentrierter Ligationspuffer und 2 Einheiten der T4 DNA-Ligase gegeben.

Diese Mischung wird 4 Stunden bei 16°C inkubiert, sodann werden weitere 2 Einheiten der T4 TNA-Ligase zugesetzt. Hierauf wird die Mischung über Nacht auf Eis gestellt. Die ligierte Mischung wird verwendet, um kompetente Zellen des Stammes MM 294 zu transformieren und dann auf Ampicillin-Resistenz gemäß Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 69 (1972), 2110, zu selektionieren. Plasmide werden von 12 oder mehr Einzelkolonien im Labormaßstab gemäß dem Verfahren von Birnboim und DoIy, Nucl. Acids Res., 7 (1979), 1513, präpariert und durch Restriktions-Endonucleasen analysiert. Plasmide mit der Insertion des Linkers zwischen der Acc I und EcoRI-Stelle zeigen nach Verdauung mit Acc I oder EcoR I eine einzelne 4 200 bp große DNA-Bande. Die Richtigkeit der Linkerinsertion in einem solchen Plasmidkann durch die DNA-Sequenzierung ausgehend von der EcoRI-Stelle oder der Acc I-Stelle nach dem chemischen Modifikationsverfahren von Maxam und Gilbert (Methods in Enzymolygy, 65 [1980], 499), nachgewiesen werden.

Um einTranskriptions-Terminationsfragmentzu beschaffen, wurde ein Plasmid mit dem Accl-EcoRI-Linker-lnsert, erhalten wie vorstehend beschrieben, mit der Endonuclease EcoR I gespalten und mit alkalischer Phosphatase behandelt (US-Patent 4264732). Das 2650 bp große Hind Ill-Fragment von pRIT 10162, hergestellt gemäß Beispiel 3, wurde in die Hind HI-Stelle des Vektors pBR327 umkloniert. Es entstand das Plasmid pRIT12288. pBR327 ist aus Soberon et al., Gene, 9 (1980), 287-305, bekannt und kann wie in Beispiel 10, Teil (b) beschrieben, aus dem Plasmid pRIT 12309, das bei American Type Culture Collection unter ATCC67187 erhältlich ist, hergestellt werden. Fig.8 zeigt die Konstruktion von pRIT12288. Das Hind Ill-Fragment ist in pRIT12288 so orientiert, daß die arg³-Transkriptions-Terminationsregion neben den EcoRI- und Clal-Restriktionsstellen auf der pBR327-Hälfte liegt. Von pRIT 12288 wird ein 1180 bp großes EcoR I-Fragment erhalten, das die arg³-Transkriptions-Terminationsregion enthält. Dieses Fragment wird an das beschriebene EcoR l-gespaltene und mit alkalischer Phosphatase behandelte pRIT12230-Derivat ligiert. Plasmide, die aus der Ligationsmischung hervorgehen, werden hinsichtlich der Insertion und der Orientierung des 1180bp großes EcoRI-Fragments untersucht. Die Orientierung des Inserts kann durch Spaltung mit der Endonuclease Hind III bestimmt werden, die Fragmente einer Größe von 2880 und 2720 bp freisetzt, sofern das Insert die gewünschte Orientierung hat.

Ein Plasmid, pRIT 12322, wurde konstruiert, in dem der Accl-EcoRI-Linder die 128bp lange unerwünschte HBV-DNA ersetzt und indemdas1180bplange EcoR I-Fragment von pRIT 12288 in der richtigen Orientierung vorliegt, nämlich downstream der HBsAg-codierenden Sequenz. Ein 2900bp großes Hind Ill-Fragment kann aus pRIT 12322 ausgeschnitten werden, das die HBsAg-Expressionseinheit enthält, zu der derTDH3-Promotor, die HBsAg-codierende Sequenz und die arg³-Transkriptions-Terminationsregion gehört. Fig. 8 zeigt die Konstruktion von pRIT 12322; vgl. auch Fig. 11, die eine Restriktionskarte von pRIT 12232 zeigt und angibt, welche Teile davon von pRIT 12288 und pRIT 12230 stammen.

Beispiele

Konstruktion des Plasmids pRIT12329

Wie in Beispiel 8 beschrieben, enthält pRIT 12322 ein 2900bp großes Hind HI-Fragment, das alle notwendigen Signalsequenzen für die Expression von HBsAg unter der Kontrolle des TDH 3-Promotors enthält. Diese Expressionseinheit wurde in einen Hefe-Shuttle-Vektor ligiert.

Die DNA des Shuttle-Vektors YEp 13 wurde mit der Endonuclease Hindill gespalten, mit alkalischer Phosphatase behandelt und als Empfänger für das Hind 11 I-Fragment aus pRIT 12322, hergestellt gemäß Beispiele, verwendet. Ein Plasmid, pRIT 12329, wurde isoliert, das neben dem YEp 13-Replikon auch das 2900bp große Hind Ill-Fragment mit der Expressionseinheit, wie in Beispiel 8 beschrieben, enthält.

Beispiel 10

Konstruktion von Plasmid-Vektoren zur Expression von hybriden antigenen HBsAg-Cs in Hefe A. Konstruktion der Plasmide pRIT12573 und pRIT12574

Das Plasmid WR201 wurde vom Walter Reed Army Institute of Research erhalten und ergibt sich aus der Insertion eines 2,3kb großen EcoR I-Fragmentes aus AmPFI (Dame et al., Science, 225 [1984], 593-599), das die vollständige DNA-Sequenz des Circumsporozoiden (CS)-Proteins von Plasmodium falciparum enthält, in den Vektor pUC8. Die Fig. 2A zeigt die schematische Restriktionskarte und eine Strategie zur Sequenzierung des Klons AmPF 1. Die Positionen von Restriktionsstellen, die in der Figur aufgezeigt sind, wurden aus der Sequenz bestimmt und durch Restriktionsspaltung nachgewiesen: A, Avail; Ac, Acc I; B, Bstnl; D, Dral; Dd, Ddel; F, Fokl; N, Ndel; R, Rsal; S, Stul; T, Tthlll; Tq, Taql; X, Xhoil. Die Pfeile geben den Startpunkt, die Richtung und den Umfang der bestimmten Sequenzen an. Die Cs-proteincodierende Sequenz wird durch eine dicke Linie angezeigt. Die Fig. ЗА zeigt die Nucleotid-Sequenz des CS-Protein-Gens von P. falciparum. Die Nucleotid-Sequenz des CS-Protein-Gens in AmPFI ist gezeigt. Vektor pUC8 ist aus Vieira et al., Gene, 19 (1982), 259, bekannt. pUC8 ist bei Amersham und Pharmacia erhältlich. Ein 1 215bp großes Stu I-Rsa I-Fragment des Plasmids WR 201, das die CS-proteincodierende Sequenz ohne die ersten

52bp (Fig. 12) enthält, wurde durch Elektroelution aus einem 7,5%igen Polyacrylamidgel gereinigt. Dieses Fragment wurde mit Sau ЗА geschnitten, um kleinere Fragmente zu bilden. Diese umfassen unter anderem ein 192 bp großes Sau3A-Fragment, das für 16 sich wiederholende Tetrapeptide des CS-Proteins codiert, und drei identische 24 bp große Sau ЗА-Fragmente, die für zwei sich wiederholende Tetrapeptide des CS-Proteins codieren.

Das Plasmid pRIT 10911 (hergestellt gemäß Beispiel 5) ist ein риСЭ-Derivat, dasein 3136 bp großes Hind Ill-Fragment einer Expressionseinheit enthält, in der ein 1 050 bp großes Hind lll-BamH l-Hefeglycerinaldehyd-S-phosphat-Dehydrogenase (TDH3)-Promotor-Fragment (welches das ATG liefert) an der BamHI-Stelle mit einem 935 bp großen BamHI-Hpa I-Fragment der HBV-DNA fusioniert ist. Dieses HBV-DNA-Fragment codiert für die 42 terminalen Aminosäuren der Pre S2-Region, die 226Aminosäuren des S-Gens (Serotyp adw) und besitzt ^SbpderS'-nichtcodierenden DNA. Das S-Gen wird durch ein 1150bp großes Hefe-DNA-Fragment flankiert, das das arg³-Transkriptions-Terminationssignal enthält. pUC 9 ist aus Vieira et al., Gene, 19 (1982), 259-268, bekannt. Die BamHI-Stelle von pRIT10911, die an dem ATG-Initiatonscodon liegt, ist in Ablesephase mit den Sau3A-Stellen des repetitiven Epitops von CS von Plasmodium falciparum. Die DNA des Plasmids pRIT 10911 wurde mit der Endonuclease BamH I gespalten, mit alkalischer Phosphatase behandelt, mit Phenol extrahiert und durch Äthanol präzipitiert. 0,2 цд dieser DNA wurden mit 0,2 pg des durch Sau ЗА gespaltenen Stul-Rsal CS-Genfragments, hergestellt wie oben beschrieben, gemischt und mit T4 DNA-Ligase behandelt. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetente Zellen des E.coli Stammes K12 MM294, hergestellt gemäß Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 69 (1972), 2110, zu tranformieren. 32 Plasmide von transformierten Einzelkolonien wurden nach Amplifikation der Plasmide durch Zugabe von Spectinomycin (300цд/тІ) zum Kulturmedium im Labormaßstab (Birnboim et al.. Nucleic Acids Research, 7 [1979], 1513), präpariert. Die rekombinanten Plasmide wurden nach der Verdauung mit BamH I und Xba I auf einem 7,5%igen Polyacrylamidgel analysiert und mit dem 219bp großen BamH I-Xba I-Fragment von pRIT 10911 (Plasmid, das die Sequenz für die ersten 42 Aminosäuren der Pre S2-Vorläuferregion und die beginnende Sequenz der HBsAg-Region enthält) und mit den Haelll-Fragmenten der Фх 174 DNA verglichen.

Unter den 32 Plasmiden zeigte ein Plasmid ein 411 bp großes BamH I-Xba I-Fragment, das der Insertion eines 192 bp großen Sau 3A-Fragments in richtiger Orientierung entsprach. Dieses Plasmid wurde mit pRIT12572 bezeichnet. Ein anderes Plasmid zeigte ein 243 bp großes BamH I-Xba I-Fragment, das der Insertion eines 24 bp großen Sau 3 Α-Fragments in richtiger Orientierung entsprach. Dieses Plasmid wurde mit pRIT 12571 bezeichnet. Fig. 12 zeigt die Herstellung von pRIT 12571 und pRIT 12572. Die Hind Ill-Fragmente von pRIT 12572 und pRIT 12571, die den TDH 3-Promotor, die codierende Sequenz des hybriden CS-HBsAg und die arg³-Terminationsregion enthalten, wurden in YEp 13 umkloniert. Es entstanden die Plasmide pRIT 12574 und pRIT 12573 (Fig. 12). YEp 13 ist aus Broach et al., Gene, 8 (1979), 121-133, bekannt. Fig. 12 zeigt die Herstellung von pRIT12573 und pRIT12574. Lithiumacetatbehandelte Hefezellen (Ito et al., J. Bacteriol. 153 [1983], 163-168), des Stammes Saccharomyces cerevisiae DC-5 (a, leu2-3, Ieu2-112, his³, can 1-11) und Saccharomyces cerevisiae 10S44C (pep4-3, leu2-3, Ieu2-112) wurden durch die Plasmide pRITiO912, pRIT 12574 und pRIT 12573 transformiert und auf Leucin-Unabhängigkeit selektioniert. Die Hefestämme DC 5 und 10S44C wurden von M.Crabeel vom Ceria Institut, Anderlecht, Belgien (vgl. auch Cabezon.T. et al., Proc. Natl. Acad., Sei., USA, 81 [1984], 6594-6598), erhalten. Der Hefestamm DC 5 wurde in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, gemäß Budapester Vertrag am 2. Juni 1982 unter ATCC 20630 hinterlegt. Der Hefestamm 10S44C wurde in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, gemäß Budapester Vertrag am 18. August 1986 unter ATCC 20819 hinterlegt. Das erwartete hybride Protein von pRIT 12573 soll 277 Aminosäuren enthalten, während das erwartete hybride Protein von pRIT 12574 333 Aminosäuren enthalten soll.

Es ist auch möglich, die CS-Epitoprepion in dem Vektor der Erfindung zu erweitern. Beispielsweise können in die BamH I-Stelle der Plasmide pRIT 12572 und pRIT12571 zusätzlich Sau 3A-Fragmente der CS-Protein-DNA, z.B. 192 bp große oder 24 bp große Sau3A-Fragmente, wie folgt ligiert werden:

Die Plasmid-DNA von pRIT 12572 oder pRIT 12571 wird mit der Endonuclease BamH I gespalten und mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das 1 215bp große Stul-Rsa I-Fragment des Plasmids WR 201, erhalten wie oben beschrieben, wird mit der Endonuclease Sau3A gespalten, um die 192bp großen und 24bp großen Fragmente freizusetzen, die die Tetrapeptidwiederholungen aufweisen. Diese Fragmente werden mit BamH I gespaltenen und mit alkalischer Phosphatase behandelten Vektoren pRIT 12572 oder pRIT 12571 gemischt und mitT4 DNA-Ligase behandelt. Die Ligationsmischungen werden zur Transformation von Zellen des E.coli-Stammes K12 verwendet. Die Zellen werden auf Ampicillin-Resistenz selektioniert. Plasmide von transformierten Kolonien werden hinsichtlich der Größe der BamH I-Xba I-Fragmente durch Endonuclease-Verdauung ausgesucht und mit ähnlich verdauter DNA von pRIT 12572 oder pRIT 12571, besonders mit den 411 bp großen und 243bp großen BamH I-Xba I-Fragmenten von pRIT 12572 und pRIT 12571 verglichen, die die Fusion aus den sich wiederholenden CS-Sequenzen und dem Teil der Pre S2-S-codierenden Sequenz tragen. Eine Zunahme der Größe dieser Fragmente um 192 bp oder 24 bp weist auf die Insertion eines sich wiederholenden Tetrapeptid-Fragmentes an der BamH I-Stelle von pRIT 12572 und pRIT 12571 hin. Die Anwesenheit einer BamHI-Stelle in solchen Plasmiden weist auf die Insertion der 192bp großen oder 24 bp großen Sau 3 Α-Fragmente in der für die Fusion am ATG-Codon korrekten Orientierung hin. Dieses vorstehend beschriebene Verfahren kann wiederholt werden, wenn es wünschenswert ist, weitere 192 bp große oder 24bp große Sau 3A-Fragmente einzuführen, die für die sich wiederholenden CS-Tetrapeptide codieren, wodurch die CS-Tetrapeptidregion auf dem hybriden Partikel erweitert werden kann. Wie bereits dargelegt, können die Hind Ill-Fragmente, die die Expressionseinheiten enthalten, aus solchen Derivaten von pRIT12572 oder pRIT12571 nach üblichen Methoden ausgeschnitten und in YEp13 oder andere geeignete Hefe-Klonierungsvektoren inseriert und in Hefezellen eingeführt werden. B. Konstruktion von pRIT12309, pRlT12314 und dem Expressions-Shuttle-Vektor pRlT12544, der die komplette 2 Mikron Hefe-DNA enthält

Das Plasmid pRIT12309 umfaßt die komplette 6318bp große 2 Mikron Hefe-DNA-Sequenz, die in die EcoRI-Stelle des Plasmid-Vektors pBR327 kloniert ist. Die 6318 bp große 2 Mikron Hefe-DNA-Sequenz wurde aus dem Plasmid pCV 19 erhalten, das von J. Broach, Princeton University, überlassen wurde. Das Plasmid pRIT12309 wurde in dem E.coli-Stamm K12 MM924 gemäß Budapester Vertrag in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter ATCC 67187 hinterlegt. Fig. 13 zeigt eine Restriktionskarte von pRIT 12309. Die Insertion der 2 Mikron DNA-Sequenz in eine der zwei EcoR I-Steilen von pBR327 unterbricht die 2 Mikron A codierende Region und führt dazu, daß das resultierende hybride Molekül pRIT12309 keine Α-Gen- bzw. FLP-Funktion aufweist. Eine Beschreibung der 2 Mikron-Struktur und Funktion ist aus Broach J., „The Molecular Biology of the yeast Saccharomyces: Life cycle and Inheritance", 445-470, Strathern J.N., Jones E.W. und Broach J. R. (Herausg.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1981), bekannt.

pBR327 ist aus Soberon et al., Gene, 9 (1980), 287-305, bekannt und wurde von F. Bolivar (Department of Molecular Biology, National University of Mexico, Mexico 20DF) erhalten. Einem Fachmann ist es bekannt, daß das Plasmid pBR327 aus dem Plasmid pRIT 12309 erhalten werden kann. Die pRIT 12309 Plasmid-DNA wird aus dem E.coli-Stamm, der in der American Type Culture Collection unter ATCC 67187 hinterlegt ist, durch eine der zahlreichen üblichen Verfahren isoliert, mit EcoRI gespalten und wieder ligiert. Die Ligationsmischung wird verwendet, um kompetente E.coli K12-Zellen zu transformieren und auf Ampicillin- oder Tetracyclin-Resistenzzu selektionieren. Eine beträchtliche Anzahl der transformierten Kolonien wird Plasmide enthalten, in denen nur die pBR327-Häfte von pRIT 12309 vorhanden ist, ohne eines der 2 Mikron DNA-Fragmente. Das 2850bp große CIaI-SaI I-Fragment, das dieTDH3-arg³-Expressionseinheit und flankierende pBR322-Sequenzen aus pRIT12290 (beschrieben in Beispiel 3) enthält, wurde in den Vektor pRIT 12309 zwischen der CIa I- und SaI I-Stelle umkloniert. Das resultierende Plasmid pRIT 12314 wurde mit der Endonuclease Sal I gespalten und mit dem 2 218 bp großen SaI I-Xho I-Fragment aus YEp 13, das das Hefe LEU 2-Gen enthält, ligiert. Fig. 14 zeigt die Herstellung von pRIT 12314. YEp 13 ist von der American Type Culture Collection unter ATCC37115 erhältlich. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetente Zellen des Stammes JA221, die nach Cohen et al., a.a.O., präpariert wurden, zu transformieren und auf Leucin-Unabhängigkeit und Ampicillin-Resistenz zu selektionieren.

Der Stamm JA221 ist von der American Type Culture Collection unter ATCC33875 erhältlich.

Ein Plasmid, pRIT 12544, in dem das 2218 bp große SaI I-Xho ILEU 2-Genfragment in die SaI I-Stelle von pRIT12314 inseriert wurde, wurde aus einem Klon dieser Transformation erhalten. Die Orientierung dieser Insertion ist so, daß die wieder entstandene SaI I-Stelle auf jener Seite liegt, die der TDH3-arg³-Expressionseinheit am nächsten ist. Das Plasmid pRIT 12544 ist ein E.coli Hefe-Shuttle-Vektor mit einer einzigen BamHI- und Smal-Stelle, die zwischen den TDH3-Promotor und arg³-Transkriptions-Terminationsregionen liegen. Diese Restriktionsstellen eignen sich zur Insertion von DNA-Sequenzen, die unter der Kontrolle des TDH3-Promotors stehen sollen. Fig. 14 zeigt die Herstellung von pRIT 12544. C. Konstruktion des Plasmids pRIT12658

Das 3328 bp große Hind Ill-Fragment von pRIT 12574, ein YEp13-Derivat, hergestellt gemäß Beispiel 10, Teil A, wurde in ein pBR322-Derivat mit delitierter Ba mH I-Stelle, die in einer Auf füll reaktion durch dieT4 DNA-Polymerase zerstört wurde, umkloniert. Es entstand das Plasmid pRIT12608. Dieses Plasmid enthält eine einzige BamH I-Stelle, die an dem ATG-Initiations-Codon der CS-HBsAG-codierenden Sequenz liegt (Fig. 15). Das 2250 bp große BamH I-Sal I-Fragment von pRIT 12608, das die CS-HBsAg-codierende Sequenz, die arg³-Transkriptions-Terminationsregion und flankierende pBR322-Sequenzen besitzt, wurde zwischen der BamH I- und SaI I-Stelle von pRIT 12544 (Fig. 15) wie vorstehend beschrieben kloniert. Es entstand das Plasmid pRIT 12658 (Fig. 15). Durch diesen Austausch wurde die CS-HBsAG-codierende Sequenz in einem Hefe-Shuttle-Vektor, der die komplette 2 Mikron DNA enthält, unter die Kontrolle des TDH3-Promotors gestellt. Fig. 15 zeigt die Herstellung von pRIT12658.

Beispiel 11

Synthese eines hybriden Proteins in Hefe

Die Hefestämme (Saccharomycescerevisiae) DC 5 oder 10S44C wurden nach dem von Ito et al., J. Bacteriol., 153 (1983), 163-168, beschriebenen Verfahren jeweils mit den Plasmiden pRIT10912 (Beispiel 5), pRIT12573 (Beispiel 10), pRIT12574 (Beispiel 10), pRIT 12658 (Beispiel 10), pRIT 12329 (Beispiel 9) und pRIT 10172 (Beispiel 2) transformiert, sodann in flüssigem Medium, dem Leucin fehlte (YNB oder YNB + 80μg/гг^\ Histidin) getrennt kultiviert und in der niittleren logphase geerntet. Zellen von 1 oder 2 ml Kultur wurden durch Zentrifugation gesammelt und in 50 μΙ 0,125 M Tris-HCI (pH8,6)-Puffer, der 20% Glycerin, 4% SDS, 6M Harnstoff und 10% 2-Mercaptoäthanol enthielt, resuspendiert. Nach einer Inkubation von 5 Minuten bei 100⁰C wurde die Probe in Hälften geteilt, die dann in einem 12,5%igen Trenn-, 5%igem Schicht-Gel nach dem Verfahren von Laemmli (Nature, 227 [1971], 680) elektrophoretisch aufgetrennt wurden.

HBsAg- und CS-Protein-Sequenzen wurden durch die Protein-Immunoblot-Technik (vgl. Burnette, Anal. Biochem., 112 [1981], 195-203; Gershoni and Palade, Anal. Biochem., 131 [1983], 1-15; Towbin and Gordon, J. Immunol. Methods, 72 [1984], 313-340), identifiziert. Nach dem elektrischen Transfer der Proteine auf ein Nitrocellulosefilter (Schleicher und Schüll, 0,45 цт) (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 76 [1979], 4350-4354), wurde das Filter 1 Stunde bei 37°C in 3% gelatineenthaltendem PBS vorinkubiert. Nachfolgend wurde das Filter 5mal jeweils 5 Minuten mit PBS, das 0,1 % Tween 20 (Polyoxyäthylensorbitanmonoiaurat) enthält, gewaschen und eine Hälfte des Filters 1 Stunde bei Raumtemperatur mit einer Mischung von 5 monoklonalen Antikörpern gegen das CS-Protein (Dame et al., Science, 225 [1984], 593-599), in PBS, 1 % Gelatine, behandelt. Die andere Hälfte des Filters wurde mit einem monokonalen Antikörper gegen HBsAg, HepYTAS 12, in PBS, 1 % Gelatine, behandelt. HepYTÄS12 ist ein Antikörper gegen gereinigtes HBsAg aus Hefe, der gegen das reduktions-und denaturierungsresistente Epitop gerichtet ist. Die Filter wurden jeweils 5 Minuten mit PBS, 0,1 % Tween 20 gewaschen und mit einem zweiten biotinylierten Antimaus-Schafantikörper (Amersham) in PBS, 1 % Gelatine, 1 Stunde bei Raumtemperatur behandelt. Die Filter wurden wieder mit PBS, 0,1 % Tween 20, 5mal jeweils 5 Minuten gewaschen und dann 30 Minuten bei Raumtemperatur mit einem Streptavidinbiotinylierten Meerrettich-Peroxidase (HRP)-Komplex (Amersham) behandelt. Die Filter wurden wieder 3mal jeweils 5 Minuten mit PBS, 0,1 % Tween 20, gewaschen und schließlich mit 30μΙ H₂O₂ und HRP-Farbentwicklerreagens, das 30mg 4-Chloronaphthalin-1-ol (BioRad) in 10ml Methanol und 50 ml PBS enthält, inkubiert. Die Molekulargewichte der Antigene wurden durch den Vergleich mit den vorher angefärbten Proteinmarkern Ovalbumin, Alphachymotrypsinogen, beta-Lactoglobulin, Lysozym, Cytochrom C (BRL) abgeschätzt.

Beide Hefestämme DC 5 und 10S44C, die mit pRIT 12573 transformiert wurden, zeigten die Produktion eines Antigens, das mit beiden Anti-CS- und Anti-HBsAg-Antikörpern reagiert und ein geschätztes Molekulargewicht von 30 kd aufweist. Beide Hefestämme DC 5 und 10S44 C, die mit pRIT 12574 oder pRIT 12658 transformiert wurden, zeigten die Produktion eines Antigens, das mit beiden Anti-CS-und Anti-HBsAg-Antikörpern reagiert und das ein geschätztes Molekulargewicht von 37 kd besitzt. Einige Antigene mit kleineren Molekulargewichten wurden ebenfalls gefunden, die auf den Abbau des hybriden Proteins schließen lassen. Kontroll proben von Zellen, die Plasm ide enthalten ohne CS- oder HBsAg-Sequenzen (pRIT 10172), zeigten keine Reaktion. Kontrollproben von Zellen, die Plasm ide enthalten mit nur HBsAg-Sequenzen (pRIT 12329 oder pRIT 10912), zeigten nur eine Reaktion mit den Anti-HBsAg-Antikörpern.

Diese Ergebnisse zeigen, daß ein HybridprotEin mit dem erwarteten Molekulargewicht, das CS- und HBsAg-Sequenzen enthält, in jenen Hefen synthetisiert wird, die mit einem Plasmid transformiert wurden, das die CS-codierende Sequenz in Ablese-Phase mit der Pre S2-HBsAg-codierenden Sequenz fusioniert enthält.

Ferner wurde gezeigt, daß die Bandenintensität in der Anti-HBsAg-Reaktion für das Protein von pRITl 2573 und pRIT 12574 etwa dieselbe ist, während die Intensität der Anti-CS-Reaktion für ein Protein von pRIT 12574 wesentlich höher ist als für ein Protein von pRIT12573. Dies zeigt an, daß bei der gleichen Menge an HBsAg-Sequenzen mehr Sequenzen des sich wiederholenden EpitopsdesCS-Proteins in pRIT 12574 als in pRITl 2573 vorhanden sind.

Beispiel 12

Synthese von hybriden Partikeln, die das CSP-Epitop präsentieren

Die Hefestämme (Saccharomyces cerevisiae) DC5 oder 10S44C, die entweder pRIT10772 (Beispiel 2), pRIT12329 (Beispiel 9), pRIT 12573 (Beispiel 10) oder pRIT 12574 (Beispiel 10) enthalten, wurden in einem Selektivmedium (200ml YNB oder YNB + 80 pg/ml Histidin) bis zum Ende der log-Phase kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in 10ml eines 5OmM Natriumphosphatpuffers (pH7,4), derO,5%Tween 20 (Polyoxyäthylensorbitan-monolaurat), 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) und 2,5% Isopropanol enthält, resuspendiert. Die Zellen wurden aufgeschlossen, indem sie zweimal durch eine French-Presse bei einem Druck von (1,38 x 10⁸Pa) (20000 psi) geführt wurden. Die Suspension wurde 30 Minuten bei 30000 χ g abzentrifugiert. Die Gesamtprotein-Konzentration des flüssigen Überstandes (Rohzellextrakt) wurde nach einem von Lowry et al. (J. Biol. Chem., 193 [1951], 265-275), beschriebenen Verfahren mit Rinderserumalbumin als Standard gemessen. Die Anwesenheit von HBsAg wurde durch Anwendung eines Radioimmun-Test-Kits (AUSRIAII, Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois) oder eines ELISA-Kits (Enzygnost-HBsAg Mikro, Behringwerke, Marburg), untersucht. Die Verfügbarkeit von CS-Sequenzen in den HBsAg-Partikeln für Immunreaktionen wurde in dem vorstehend angesprochenen ELISA-Test untersucht. Geeignete Verdünnungen von Proben, die getestet werden sollen (in PBS, das 0,2% BSA enthält), konnten über Nacht an die Anti-HBsAg-Festphase (Enzygnost Kit) binden. Die gebundenen HBsAg-Partikel wurden 1 Stunde bei 37°C mit einer 1:10000-Verdünnung (in PBS, das 0,1 % BSA enthält) einer Mischung von 5 monoklonalen Antikörpern gegen das CS-Protein (Dame et al., Science, 225 [1984], 593-599) als ersten Antikörper inkubiert, und dann mit einer 1:500-Verdünnung (in PBS, das 0,1 % BSA enthält) eines biotinylierten Anti-Maus-Schaf-Immunglobulins (Amersham) als zweiten Antikörper 1 Stunde bei 37⁰C inkubiert. Der Nachweis ergab sich durch die Inkubation einer 1:1 000-Verdünnung (in PBS, das 0,1 % BSA enthält) eines Streptavidin-biotinylierten Meerrettich-Peroxidase-Komplexes (Amersham) und einem Chromogen aus dem Enzygnost-Kit 30 Minuten bei 37°C.Zwischen den einzelnen Inkubationsschritten wurden die Tabletts 4mal mit einer Waschlösung aus dem Enzygnost-Kit gewaschen. Die Farbentwicklung wurde bei 510 nm in einem (Titertek Multiskan, Dynatech)-Photometer bestimmt. Die Messung der Proteinkonzentration und der AUSRIA-Aktivität (Tabelle II) in Rohzellextrakten ergab, daß pRITl 2573 zur gleichen Expressionshöhe von HBsAg führt, wie pRITl 2329. pRITl 2574 zeigte jedoch eine 10fach niedrigere AUSRIA-Aktivität. Immunblot-Analysen dieser Extrakte ergaben, daß in diesen drei Fällen eine gleiche Menge von HBsAg-verwandtem Protein synthetisiert wird.

Tabelle II: AUSRIA-Aktivität in Rohzellextrakten

Plasmid	Gen	S	Protein	HBsAg(RIA)	HBsAg
		CS (24bp)PreS2-S	(mg/ml)	(ng/ml)	ng/mg
		CS(192bp)PreS2-S			Protein
pRIT10172	_	5,6	0'	0
pRIT12329	3,3	5 700	1730
pRIT12573	3,6	4 000	1110
pRIT12574	2,8	450	160

Der ELISA-Test ergab, daß in pRIT12573und pRIT12574-Extrakten (Tabelle 111) eine Struktur vorliegt, die HBsAg und CS-Epitope exprimiert, und daß mehr reagierende CS-Epitope pro HBsAg-Epitope in pRITl 2574-Extrakten als in pRITl 2573-Extrakten vorliegen.

Um die Natur dieser im RIA- und ELISA-Test positiven Strukturen zu untersuchen, wurde 1 ml der Rohzellextrakte mit 1,5 M Cäsiumchlorid in 5OmM Natriumphosphat (pH 7,4) gemischt und 40 Stunden bei 40000xg in einem Beckman SW50.1 Rotor zentrifugiert. Gesammelte Fraktionen wurden auf Anwesenheit von HBsAg- und CS-Antikörper-Bindungsaktivität in den vorstehend beschriebenen RIA- und ELISA-Tests untersucht. HBsAg-und CS-antigene Aktivität lag jeweils in der gleichen Fraktion der Gradienten von pRIT12573 und pRIT12574 vor. Ihre Schwimmdichte war geringfügig höher (rho = 1,20g/cm³) als jene in dem Gradienten von pRIT12329 (rho = І.ІЭд/ст³).

Immunblot-Analysen der Gradienten-Fraktionen bestätigten die RIA/ELISA-Ergebnisse. HBsAg- und/oder CS-Sequenzen wurden nur in jenen Fraktionen gefunden, die im RIA/ELISA-Test reagierten.

Tabelle III: Im Antigen vorhandene HBsAg- und CS-Epitope, gebunden an immobilisierte anti-HBsAg-Antikörper

Rohzell-Extraktaus:	Verdünnung	ELISA(HBsAg)	EUSA(CS)
		OD₅₁₀nm	OD₆₁₀ nm
10S44C(pRIT10172)	10Ox	0,000	0,065
10S44C(pRIT12329)	10Ox	0,580	0,054
	200x	0,341	0,041
	40Ox	0,188	0,056
10S44C(pRIT12573)	10Ox	1,298	1,596
	200x	1,080	1,299
	40Ox	0,702	0,898
	80Ox	0,336	0,560
	1 60Ox	0,155	0,323
	3 20Ox	0,075	0,189
10S44C(pRIT12574)	100x	0,662	1,678
	20Ox	0,370	1,506
	40Ox	0,183	1,130
	80Ox	0,079	0,798
	1 60Ox	0,044	0,449
	320Ox	0,061	0,205

Diese Ergebnisse zeigen, daß die hybriden Proteine, die von pRIT12573 und pRIT12574in Hefe exprimiert werden, zu Partikeln zusammengesetzt werden, die ähnlich den 22 nm großen HBsAg-Partikeln sind. Die Partikel, die durch die Expression von pRIT12573 und pRIT12574 hergestellt werden, zeigen die CS-Sequenzen auf ihrer Oberfläche, was durch ihre Fähigkeit mit Anti-CS-Antikörpern zu reagieren, belegt wird. Im Falle von pRIT12574 verhindern jene CS-Sequenzen im RIA-Test teilweise die Zugänglichkeit der a-Determinante von HBsAg (die hauptsächlich für die AUSRIA-Aktivität verantwortlich ist).

Beispiel 13

A. Reinigung von hybriden Partikeln

Der Rohzellextrakt des Hefestammes 10S44C, der pRIT12574, hergestellt gemäß Beispiel 10, enthält, wurde durch Polyäthylenglykol (PEG) 400-Präzipitation gereinigt und durch Ultrafiltration in einer AMICON DC-Kammer konzentriert. Diese Kammer enthält eine Membran, die Proteine nur bis zu einer Größe von 100kd durchläßt.

Die weitere Reinigung der hybriden Partikel wurde nach üblichen Verfahren, wie CsCI-Zentrifugation, Hydroxyapatit-Chromatographie und Gelfiltration, durchgeführt.

Der endgereinigte Zellextrakt von 10S44C, der pRIT12574 enthält, zeigte im Ausschlußvolumenn einer HPLC TSK-3000-Säule (LKB) einen Hauptpeak, der HBsAg und CS-Antigenität besitzt. SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (Laemmli, Nature, 227 [1971], 680), der eine Silberfärbung (Wray et al.. Anal. Biochem., 118 [1981], 197-203) folgte, zeigte eine Hauptbande mit einem geschätzten Molekulargewicht (MW) von 37 kd. Die Elektronenmikroskopie nach negativer Färbung mit Uranylacetat zeigte Partikel, die etwa die gleiche Größe und Form besitzen wie aus Hefe erhaltenes HBsAg.

B. Reinigung von hybriden Partikeln

Rohhefezellextrakte werden hergestellt, indem die gewaschenen Hefezellen in Gegenwart des gleichen Gewichtes an 5OmM Natriumphosphat-Extraktionspuffer (pH 8,1), dem4mM Titriplex III, 1%Tween 20, 4mM PMSF und 10% Isopropanol zugesetzt sind, nach dem „DynomiH"-Verfahren aufgebrochen werden. Die Zelltrümmer werden durch 90minütige Zentrifugation bei 11 OOOxg entfernt. 500 ml des zentrifugierten Rohextraktes werden mit 1N Essigsäure auf pH 7,2 eingestellt und über Nacht bei 4°C in Gegenwart von 10g kolloidaler Kieselerde (Aerosil 380, Degussa) gerührt. Nachfolgend wurde die Suspension 1 Stunde bei 3500xg zentrifugiert und das Pellet dreimal in der Zeit von 15 Minuten mit 150ml 0,15M NaCI, dem 2mM PMSF und 5mM EDTA zugegeben sind, gewaschen. Schließlich wird das Aerosil-Pellet mit 250 ml 1OmM Pyrophosphatpuffer (pH 9,5), der 2% Tween 20 enthält, 3 Stunden bei 37°C eluiert. Dem Eluat wird tropfenweise eine 1M Calciumchloridlösunng bis zu einer Endkonzentration von 3OmM Calciumchlorid zugegeben und der pH-Wert auf 7 eingestellt. Die Lösung wird über Nacht bei 4°C stehengelassen unddann15 Minuten bei 6 500xg zentrifugiert. Der Überstand wird gegen 2 χ 51 10mMTris/HCI(pH7,1) bei4°C dialysiert und nachfolgend viermal mit Dialysepuffer verdünnt.

Nach Zugabe von 3OmM Calciumchlorid und 1M Natriumchlorid wird die auf pH 7,1 eingestellte verdünnte Antigenlösung an einer 150-ml-Säule aus Phenyl-Sepharose FF, die mit dem gleichen CaCI₂/NaCI-enthaltenden Tris-Puffer äquilibriert wurde, mit einer Flußrate von 30cm/Std. aufgetrennt. Nachfolgend wird die Säule mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bis die OD₂₈Onm gegen Null geht, und mit6M Harnstoff in 1OmM Tris/HCI pH 9 bei gleicher Flußrate eluiert.

Alternativwirddiedialysierte und viermal verdünnte Antigenlösung mit 20% (NH₄I₂SO₄ (pH 7) ergänzt und an einer 150 ml Säule aus Phenyl-Sepharose FF, die in 1OmM Tris/HCI (pH 7,1) 20% (NH₄J₂SO₄ äquilibriert wurde, bei einer Flußrate von 30cm/Std. aufgetrennt. Nach dem Waschen der Säule mit dem Äquilibrierungspuffer wurde die Säule bei gleicher Flußrate mit 1OmM Tris/HCI, pH 7,1, eluiert.

Die Antigen-positiven Fraktionen wurden vereinigt und schließlich bei 4°C in einem oder zwei aufeinanderfolgenden Cäsiumchlorid-Dichtegradienten 65 Stunden bei 245000xg zentrifugiert. Die gereinigten hybriden CS-HBsAg-Partikel besitzen eine Schwimmdichte von 1,23g/cm³.

Beispiel 14

Immunogenität von hybriden Partikeln

Hybride Partikel, gereinigt aus dem Hefestamm Saccharomyces cerevisiae 10S44C, der pRIT12574 enthält, und gemäß Beispiel 13 hergestellt, wurden in dieser Form oder mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans in Labortiere gespritzt (Young et al.,

Science 228 [1985], 958-962).

C57B1/6-Mäuse (6-8 Wochen alt), Meerschweinchen und Kaninchen wurden an den Tagen 0, 21 und 49 subcutan und intraperitoneal immunisiert. Die Tiere wurden an den Tagen 7, 28, 56 und 84 ausgeblutet. Nach dem Gerinnen des Blutes über Nacht bei 4⁰C wurde das Serum abgetrennt und bis zu seiner Verwendung bei —70°C eingefroren.

Kaninchen, zwei G ruppenn von jeweils zwei Tieren, erhielten bei jeder Immunisierung 10pg des hybriden CS-HBsAg-Proteins in 1 ml Dosen mit oder ohne Aluminiumhydroxid. Als Kontrolle wurden zwei Kaninchen mit Юцд Heptavax B® (Merck Sharpe & Dohme) nach dem gleichen Impfschema immunisiert. Mäuse und Meerschweinchen, in Gruppen von 5 Tieren, erhielten bei jeder Immunisierung 1 und 5pg des hybriden Proteins in 0,5ml Dosen. Nicht-immunisierte Tiere dienten als Kontrollen.

Zur Bestimmung der Antikörperantwort wurden die Seren von Mäusen für jede Gruppe zusammengefaßt, während die Seren von Meerschweinchen und Kaninchen einzeln untersucht wurden. Anti-CS-Antikörpertiter wurden im ELISA-Test gemessen, wobei das rekombinante CS-Protein R32tet32 als Antigen verwendet wurde (vgl. Young et al., Science, 228 [1985], 958-962).

Anti-HBsAg-Titer wurden mit dem AUSAB-Kit (Abbott Laboratories) und dem WHO-Standard bestimmt.

Weder Meerschweinchen noch Mäuse entwickelten eine nennenswerte Antikörperantwort auf HBsAg bei wiederholter Verabreichung. Dagegen entwickelten diese Tierspezies eine Anti-CS-Antikörperantwort, die durch wiederholte Verabreichung verstärkt wurde. Im ELISA-Test wurde ein Absorptionswert von 1 bei 1 600fachen (Mäusen) und 900fachen (Meerschweinchen) Serumverdünnungen erhalten. Die Immunogenität der hybriden Partikel wurde nicht durch Adsorption an Aluminiumhydroxid

verstärkt.

Im Gegensatz dazu entwickelten Kaninchen Antikörper gegen CS und HBsAg. Reziproke Titer mit einem Adsorptionswert von 1 im Anti-CS ELISA-Test ergaben 800 und 3200. Anti-HBsAg-Titer, die mit den hybriden Partikeln erhalten wurden, welche an Aluminiumhydroxid adsorbiert waren, ergaben 4000 und 2000OmU l/m I, während die Kaninchen, die mit Heptavax immunisiert wurden, einen Titer von 10^s bis 10⁶mUI/ml ergaben. Die Adsorption der Hybrid-Partikel an Aluminiumhydroxid verstärkte die

Immunantwort.

Seren von Mäusen, Meerschweinchen und Kaninchen reagierten stark in der (circumsporozoid)-Präzipitin-Reaktion und inhibierten in vitro auch gut das Eindringen von Sporozoiten in Leber-Tumorzellen (Young et al., Science, 228 [1985], 958-962) (vgl. Tabelle IV). Beide Reaktionen zeigen eine schützende Immunantwort an.

Tabelle IV: (Circumsporozoid)-Präzipitin (CSP)-Reaktivität und prozentuale Inhibierung des Eindringens von Sporozoiten (% IES) in HepG2-A 16 Lebertumorzellen

Tiere

1 Wochenach der zweiten Verabreichung

Vereinigte Mäuseseren Kaninchen #36 Meerschweinchen # 1107

Die CSP-Reaktivität wird in Klammern angegeben:

0 - keineerkennbareCSP-Reaktivität

2+ - granuläres Präzipitatauf derSporozoiten-Oberfläche

4+ — fadenförmiges Filament vom EndederSporozoiten

Beispiel 15

Konstruktion von pRIT12662 - ein E.coli Vektor, der die Pre S2-S-Expressionseinheit enthält (Fig. 16) Das Plasmid pRIT12290, hergestelt gemäß Beispiel 3, wurde modifiziert, indem das synthetische BamHI-Eco-RI-Verlängerungsfragment, das für die N-terminalen Aminosäuren der Pre S2-Region codiert, zwischen die TDHS-Promotor- und arg³-Terminator-Fragmente ligiert wird. Dies wurde folgendermaßen durchgeführt:

Das Plasmid pRIT12290 wurde mit den Endonucleasen BamHI und EcoRI gespalten und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. 20OpMoI des phosphorylierten synthetischen Verlängerungs-Fragments

GIn Trp

BamHI 5'GATC CAG TGG 3' EcoRI

3' GTC ACCTTAA 5'

wurden mit 0,1 pMol des BamHI-EcoRI geschnittenen und dephosphorylierten Plasmids pRIT12290 ligiert, indem eine Einheit (U) der T4 DNA-Ligase verwendet wurde. Mit der Ligationsmischung wurde der E.coli Stamm MM294 transformiert und auf Ampicillin-Resistenz selektioniert. Eine Transformante, die das gewünschte Plasmid mit dem synthetischen Verlängerungsfragment zwischen der BamHI- und EcoRI-Stelle besitzt, wurde identifiziert und isoliert. Das Plasmid wurde mit pRIT12621 bezeichnet. Im nächsten Schritt wurden die vier zusätzlichen Basenpaare (Kern der BamHI-Stelle) in pRIT12621 entfernt, um das ATG-Codon in Ablesephase mit dem zweiten Codon des Pre S2-Region zu bringen. Im nächsten Schritt wurde ein EcoRI-Fragment, das den Rest der Pre S2-codierenden Region und die komplette S-codierende Region enthält, in die EcoRI-Stelle von pRIT12621 ligiert. Es wurde die komplette Pre S2-S-codierende Sequenz erhalten. In diesem Stadium wurden die DNA-Manipulationen, die nachfolgend das Linearisieren, das Herbeiführen von Deletion und das Rezirkularisieren des Plasmids pRIT12621 umfassen, ohne Amplifikation durch Transformation der als Zwischenprodukt verwendeten Plasmide durchgeführt. Es wurde folgendermaßen verfahren:

3OpMoI (120pg) der pRIT12621 DNA wurden mit 120 Einheiten von BamHI linearisiert. Nach der Abtrennung des Restriktionsenzyms durch Phenolextraktion wurde das Plasmid durch Äthanol prazipitiert und in den entsprechenden Puffer aufgenommen, um die Einzelstrangbereiche der BamHI-Stelle mit 280 Einheiten der Mungo-Bohnen-Nuclease zu verdauen. Die

CSP-Reaktivität	2+	0)	%IES
(4+	9	2
14	3	0	91%
22	1	0	96%
24		100%

Nuclease wurde durch Phenolextraktion entfernt, der dann eine Äthanolpräzipitation folgte. Das so behandelte Plasmid wurde in dem Ligationspuffer resuspendiert und mit 10 Einheiten der T4 DNA-Ligase rezirkularisiert.

Der das ligierte Plasmid enthaltende Ansatz wurde mit Phenol extrahiert, mit Äthanol präzipitiert und in dem entsprechenden Puffer aufgenommen und mit dem Enzym EcoRI gespalten. Nach der Abtrennung der EcoRI-Endonuclease durch Phenolextraktion und Äthanol-Präzipitation wurden 0,05pMol (0,2цд der DNA) in dem Ligationspuffer resuspendiert und mit 0,4pMol (0,2pg) eines 838bp großen EcoRI-Fragments, das aus pRIT12581 isoliert wurde und das die gesamte C-terminale codierende Region des Pre S2-S-Proteins enthält, ligiert.

Ein Plasmid, das im wesentlichen dem pRIT12581 ähnlich ist, kann folgendermaßen konstruiert werden. Der Vektor pUC9 (erhältlich bei Amersham und Pharmacia) wird mit der Endonuclease EcoRI verdaut und mit alkalischer Phosphatase (US-PS 4264731) behandelt. Das Plasmid pRIT10616 (ATCC 39131) wird mit EcoRI und Accl gespalten und das 826pb große EcoRI-Accl-Fragment, das einen Teil der Pre S2-S-codierenden Region enthält, durch präparative Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Elektroelution erhalten. Etwa 0,4 pMol (0,2 pg) von diesem Fragment werden mit etwa 1OpMoI eines synthetischen Verlängerungsfragmentes, das die folgenden 12 bp besitzt und das, wie in Beispiel 8 beschrieben, durch Aneinanderlagern der beiden Einzelstränge entstanden ist, gemischt.

He

Tyr Stop

5' ATACATTTAACG 3'

Accl EcoRI

3' TGTAAATTGCTTAA 5'

Die vorstehend erhaltene Mischung wird mit T4 DNA-Ligase behandelt und dann mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten. Zu dieser so behandelten Mischung werden 0,2pg des EcoRI-gespaltenen und mit alkalischer Phosphatase behandelten pUC9-Vektors, der wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, gegeben und die Mischung mitT4 DNA-Ligase behandelt. Mit dieser Mischung wurden kompetente Zellen des E.coli Sammtes K12 transformiert und auf Ampicillin-Resistenz selektioniert. Kolonien dieser Transformanten wurden auf die Anwesenheit eines Plasmids untersucht, das neben dem 2650bp großen pUC9-Vektor-Fragments auch ein 838 bp großes EcoRI-Fragment besitzt. Dieses EcoRI-Fragment umfaßt ein 826 bp großes EcoRI-Accl-Pre S2-S-Fragment und den 12 bp großen synthetischen Accl-EcoRI-Linker. Die Richtigkeit dieser so identifizierten Konstruktion kann durch DNA-Sequenzierung nach Maxam und Gilbert bewiesen werden. Vorzugsweise erfolgt die DNA-Sequenzierung, ausgehend von einer Restriktionsstelle, die nur im pUC9-Polylinker einmal vorkommt. Die Ligationsmischung, die die PJasmid-DNA von pRIT12621 behandelt wie vorstehend beschrieben, und das 838 bp große EcoRI-Fragment von pRIT12581 enthält, wurde verwendet, um den E.coli Stamm MM294 nach Cohen et al., a.a.O., zu transformieren. Eine Transformante, die ein Plasmid mit demm EcoRI-Fragment in richtiger Orientierung enthält, wurde identifiziert und das Plasmid als pRIT12662 bezeichnet (vgl. Fig. 1A und Fig. 16). Fig. 1A zeigt die Herstellung von pRIT12662, Fig. 16zeigt eine Restriktionskarte von pRIT12662. Die Pre S2-Region von pRIT12662 wurde nach Maxam und Gilbert sequenziert, um den Leserahmen am N-Terminuszu überprüfen, der wie folgt aussieht:

	AAA	Met	GIn Trp	Asn	Ser
AAAC		ATG	CAG TGG	AAT	TCC
pTDH3			pre S2-S
		modifizierte Region

Dem Fachmann ist es bekannt, daß der Vektor pRIT12662 auch verwendet werden kann, um weitere funktioneile DNA-Sequenzen durch geeignete In-vitro-Manipulationen des Vektors in die Pre S2-Region einzuführen. Die Pre S2-codierende Sequenz enthält die Restriktionsstellen für die EcoRI, Pstl und BamH I-Endonucleasen. Jede dieser Restriktionsstellen kann verwendet werden, um funktionell DNA-Sequenzen, die für interessierende Peptide codieren, einzuführen und in Ablesephase Fusionen mit der Pre S2-Region zu schaffen. Solche Fusionen werden von dem Pre S2-eingeführten Sequenz-Pre S2-S-Typ sein. Diese Restriktionsstellen können auch in vitro durch das beispielsweise von Botstein et al., Science, 229 (1985), 1193-1201, beschriebenen Verfahren manipuliert werden, um andere Vektoren zu schaffen und andere Restriktionsstellen oder Leserahmen zur Insertion von funktionellen DNA-Sequenzen zu liefern.

Beispiel 16

Konstruktion von pRIT12377 und pRIT12660, einem Hefeplasmid, das das Pre S2-S-Protein exprimiert DNA des Plasmids pRIT 12309, hergestellt gemäß Beispiel 10B, wurde mit der Endonuclease Sail gespalten und mit einem 2218bp großen XhoI-Sal I-DNA-Fragment ligiert, das das Hefe LEU 2-Gen enthält und das durch Verdauung von YEp 13 und durch Reinigung aus einem Polyacrylamidgel erhalten wurde. Die Ligationsmischung wurde zur Transformation von Zellen des E.coli K 12 Stammes JA221 verwendet und sodann auf Ampicillin-Resistenz und Leucin-Unabhängigkeit selektioniert. Der Stamm JA221 ist von der American Type Culture Collection unter 33875 erhältlich. Aus einer transformierten Kolonie wurde das Plasmid pRIT 12377 identifiziert, das das 2218 bp große LEU 2 Xho I-Sal I-Fragment in der Sall-Stelle von pRIT 12309 enthält. Die Orientierung des Fragments ist derartig, daß die wiedererhaltene SaI I-Stelle auf jener Seite der pBR 327 DNA vorliegt, auf der auch die Aval-Stelle liegt. Das Plasmid pRIT 12377 ist ein E. coli Hefe-Shuttle-Vektor, der die notwendigen Funktionen für die Selektion, Replikation und Stabilität in beiden Organismen besitzt.

Das 3050 bp Hind HI-Fragment von pRIT 12662 (Beispiel 16), das die Pre S 2-S-Expressionseinheit enthält, wurde durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese gereinigt, mitT4-Polymerase behandelt und in pRIT 12377 ligiert. pRIT 12377 war zuvor durch BamH I geöffnet worden und durch die T4 DNA-Polymerase behandelt worden. Diese Ligationsmischung wurde zum Transformieren von Zellen des E.coli Stammes MM 294 verwendet. Die Zellen wurden sodann auf Ampicillin-Resistenz selektioniert. Eine E. coli-Transformante, die das Plasmid pRIT12660 besitzt, wurde erhalten. Fig. 17 zeigt die Herstellung von pRIT 12660.

Dieses Plasmid, pRIT 12660, wurde verwendet, um zwei Stämme von Saccharomyces cerevisiae, nämlich Stamm DC4cir°und Stamm 10S44Ccir°gemäß Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 79 (1978), 2157-2161, zu transformieren. Beide Stämme, DC5cir° und 10S44C cir", wurden in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, gemäß Budapester Vertrag am 18. Aug. 1986 unter ATCC20820 und ATCC20818 hinterlegt.

Beispiel 17

Die Pre S2-Region in dem Plasmid pRIT12662

DiePreS2-Regionindem Plasmid pRIT 12662 wurde nach Maxam und Gilbert sequenziert. Es wurde gefunden, daß im Vergleich zu einem anderen Virus des adw2-Serotyps (Valenzuela et al., a. a. O., 1980-Tabelle I, S. 11) vier Basenaustausche vorliegen, die zu drei Aminosäureaustauschern führen. An der Position 45 ein Alaninrest anstelle eines Threoninrestes, an der Position 34 ein Phenylalaninrest anstelle eines Leucinrestes und an der Position 11 ein Serinrest anstelle eines Isoleucinrestes. Der letzte Austausch betrifft einen Rest, der bisher in allen bekannten Serotypen nicht verändert war (Lo et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 2 [1986],382-388).

Beispiel 18

Konstruktion des Plasmids pRIT 12845, das in Hefe das Pre S1 - Pre S2-S-Protein exprimiert Im ersten Schritt wurde die TDH 3-Promotorregion mit der Pre S1-N-terminalen Region aus dem HBV-Genom fusioniert. Das Ausgangsmaterial war das Plasmid pRIT 12792, das ein 495 bp großes Ncol-Xbal-Fragment besitzt, das die Pre Si- Pre S 2-codierende Sequenz mit Ausnahme des letzten Asparagincodons enthält. Die Ncol-Stelle überlappt das ATG-Codon des Aminosäurerestes an derStelle-163 des HV-Pre S1-Sequenz. Die Sequenz des Ncol-Xbal-Fragmentes ist in Fig.4A gezeigt. Ein im wesentlichen ähnliches Plasmid zu pRIT 12792 ist pRIT 12793 (5940 bp), das bei der American Type Cultur Collection, Rockville, Maryland, USA, gemäß Budapester Vertrag am 5. Sept. 1986 unter ATCC 67193 hinterlegt wurde. Aus dem Plasmid pRIT 12793 kann ein 495 bp großes Nco I-Xba I-Fragment erhalten werden, das die vollständige Pre S1 - Pre S 2-codierende Sequenz enthält. Dieses Fragment, das am З'-Ende die Sequenz ACGAACTAATAATCTAGA besitzt, unterscheidet sich von jenem in Fig. 4 A gezeigten durch ein einziges Nucleotid. Dieses Nucleotid ist unterstrichen. In den folgenden Beispielen kann pRIT 12792 durch pRIT 12793 ersetzt werden. Die Nco I-Xba I-Fragmente, die in pRIT 12792 und pRIT 12793 enthalten sind, wurden durch In-vitro-Manipulation der Pre S1- Pre S2-DNA-Region des Hepatitis B-Virusstammes (Serotyp adw), dessen DNA in pRIT10616 kloniert ist, erhalten. Das Plasmid pRIT10616 ist von der American Type Culture Collection unter ATCC39131 erhältlich. 52pg von pRIT12792 wurden mit den Restriktionsenzymen Ncol und Xbal gespalten und mit Mungo- Bohnen-Nuclease behandelt, um die 5'-überstehenden Enden zu entfernen. 600ng (2pMol) des behandelten und gereinigten 495bp großen Ncol-Xbal-Fragmentes wurden mit 170 ng (0,02 pMol) des Vektors pRIT 12314 ligiert. pRIT 12314 war mit den Restriktionsenzymen BamH I und Sma I geöffnet worden und ebenfalls mit Mungo-Bohnen-Nuclease behandelt worden. pRIT12314 enthält das vollständige 2 Mikron DNA-Fragment von S.cerevisiae und eine Expressionseinheit, in der der TDH3-Promotor durch einen BamH I-Sma l-EcoRl-ünker von der arg³-Terminationsregion getrennt ist.

BamH I EcoRI

Sma I

ATGGATCCCCGGGAATTC ....

Promotor TDH₃ Terminationsregion ARG₃

Eine detaillierte Beschreibung der Konstruktion von ρRIT 12314 ist in Beispiel 10(B) zu finden. Die vorstehend beschriebene Ligationsmischung wurde zur Transformation von E.coli, Stamm MM 294, verwendet. Es wurde sodann auf Ampicillin-Resistenz selektioniert. Sechs Transformanten, die ein Plasmid enthalten, in dem das Pre S1- Pre S2-Fragment in richtiger Orientierung inseriert ist, wurden erhalten. Die Pl asm ide dieser Transformanten sind pRIT 12843 (a ... f) (Fig. 18).

Der zweite Schritt war die Inserierung der S-codierenden Region in jedes der Plasmide pRIT 12843 (a ... f), um das vollständige Pre S1 -S 2-S-Gen zu erhalten.

Dies wurde folgendermaßen durchgeführt:

Die Plasmide pRIT 128423 (a ... f) wurden jeweils mit den Enzymen BamH I und Sail geschnitten. Die BamHI-Stelle liegt am Beginn der Pre S2-Region, während die SaI I-Stelle hinter der arg³-Terminationsregion in der pBR327 DNA liegt.

80ng (0,012μΜοΙ) des größten BamHI-Sall-Fragments (10400 bp), das aus jedem Plasmid pRIT 12843 (a ...f) isoliert wurde, wurden mit 300 ng (0,17 pMol) des kleinen BamH I-Sall-Fragmentes von pRIT 12660 (Beispiel 16) ligiert. Das kleine (4800bp) BamH I-Sal I-Fragment von pRIT 12660 enthält einen Teil der Pre S2-S-codierenden Sequenz, die ARG-Terminationssequenzen unddieLEU2-Hefesequenz. Nach Ligierung und Transformation von E.coli, Stamm MM 294, mit jedem der Plasmide pRIT 12843 (a ... f) gemäß Cohen et al., a.a.O., wurden eine Reihe ampicillinresistenter Klone erhalten, die die bezeichneten Plasmide pRIT12845 (a...f) tragen. Fig. 18 zeigt die Herstellung von pRIT 12845 (a ...f). Diese Plasmide wurden verwendet, um einzeln den Saccharomyces cerevisiae Stamm 10S44C cir° gemäß Ito et al. zu transformieren. Kulturen von einzelnen transformierten Klonen wurden mit dem AUSRIA-Test (Abbott) getestet. Rohzellextrakte aus aufgeschlossenen Hefezellen wurden in PBS, das 0,5%Tween 20, 2mM PMSF und 5% Isopropanol enthält, resuspendiert. Aus jeder der sechs getrennten Transformationen [mit pR IT 12845 (a ...f)] wurde eine Transformante ausgewählt und getestet. Fünf der sechs getesteten Transformanten ergaben eine positiven AUSRIA-Test.

Zur Feststellung, ob ein Protein, das im AUSRIA-Test eine S-verwandte Antigenität zeigte, die vollständige Größe hat, wurden Proben der oben beschriebenen Rohzellextrakte im Immunblot, wie in Beispiel 20 beschrieben, untersucht. Vier der fünf im AUSRIA-Test positiven Transformanten zeigten ein S-verwandtes Protein von etwa 39 K. Eine Transformante (Extrakt a) zeigte ein S-verwandtes Protein von 23K. Das für die Expression des39K-Proteins im Extrakt (e) verantwortliche Plasmid wird pRIT12845 genannt; vgl. Fig.18.

Beispiel 19

Verwendung von Pre S 1-Vektoren гиг Insertion von funktionellen DNA-Sequenzen Das Ausgangsmaterial ist das in Beispiel 18 beschriebene Plasmid pRIT 12793. Das Plasmid enthält die Pre S1 - Pre S 2-codierende Sequenz auf einem 495 bp großen Ncol-Xbal-Fragment. Das Plasmid pRIT 12793 wird mit der Restriktionsendonuclease Ncol gespalten, mitT4 DNA-Polymerase zum Auffüllen der überhängenden Einzelstränge behandelt und mit Xbal- Endonuclease nachgeschnitten. Das so behandelte Ncol-Xbal-Fragment wurde durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Elektroelution gereinigt und in den Vektor pUC 12 inseriert, der mit den Endonucleasen Smal und Xbal gespalten war.

Der Klonierungsvektor pUC 12 ist erhältlich bei Amersham (Little Chalfont, Bucks, United Kingdom) und Pharmacia (Piscataway, NJ). Das Plasmid pRITX wird gemäß Fig. 5B erhalten. In der Pre S1-Pre S2-Region des Plasmids pRITX überlappt die einzige Ncol-Stelledas ATG-Startcodon der Pre S1-Region. Eine Xbal-Stelle ist direkt daneben und downstream desTAA-Stopcodons am C-Terminus der Pre S2-codierenden Sequenz vorhanden. Die einzige BstX-Restriktionsstelle ist nahe des N-terminalen Endes der Pre S1-codierenden Region.

Dem Fachmann ist bekannt, daß der Vektor pRITX oder ähnliche derivatisierte Vektoren, die die Pre S1 -S 2-Sequenzen enthalten, zur Inserierung an der BstXI-Stelle von weiteren funktionellen DNA-Sequenzen, die für interessierende Peptide codieren, verwendet werden können, um diese Sequenzen in Ablesephase mit der Pre S 1-Region zu fusionieren.

Darüber hinaus können funktioneile DNA-Sequenzen nach der Doppelverdauung von pRITX und Derivaten mit BstX und BamH I oder EcoRI und Pstl und der Entfernung des größeren Teils der Pre S 1-codierenden Region und des N-terminalen Teils der Pre S2-Sequenz zwischen die entsprechenden Restriktionsstellen eingeführt werden. Solche Fusionen werden vom Typ Pre S1-eingeführte funktioneile DNA-Pre S2-Sequenzen sein. Sind einmal solche Fusionen gemacht, können sie in andere Plasmide einrekombiniert werden, die den Rest der Pre S1-Pre S2-Sequenzen und jene Sequenzen enthalten, die für die Stabilität und Replikation in E.coli und Saccharomyces cerevisiae (vgl. Beispiel 16A) notwendig sind.

Beispiel 20

Impfstoffherstellung

Ein Impfstoff wird folgendermaßen hergestellt: zu einer gepufferten wäßrigen Lösung von 3% Aluminiumhydroxid (1OmM Natriumphosphat, 15OmM NaCI, pH 6,8; sterilisiert durch Filtration) werden erfindungsgemäß hergestellte Partikel in gleichem Puffer unter Rühren bis zu einer Endkonzentration des Polypeptids von 100pg/ml und des Aluminiums (Al³⁺) von 0,5mg/ml zugegeben. Der pH-Wert wird auf 6,8 gehalten. Die Mischung wird über Nacht bei 0⁰C stehengelassen. Thimersol wird bis zu einer Endkonzentration von 0,005% zugegeben. Der pH-Wert wird überprüft und, wenn nötig, wieder auf 6,8 eingestellt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Plasmodium-Impfstoffes, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Plasmoid-Gen, das für das entsprechende Oberflächenprotein codiert, oder einen Teil des Gens in Ablesephase an das З'-Ende mindestens eines Teils der Pre S2-Region des HBV-Genoms ligiert, wobei dieser Teil so groß ist, daß erfür ein immunogenes Protein codiert, dieses Füsions-DNA-Molekül an eine Expressionskontrollsequenz eines Expressionsvektors funktionell ligiert, das erhaltene rekombinante DNA-Molekül in einen eukaryontischen Wirtsorganismus einschleust, den erhaltenen transformierten Wirtsorganismus in einem Kulturmedium züchtet, aus dem Zell-Lysat oder Kulturmedium das rekombinante Oberflächenprotein bzw. das Hybridpartikel isoliert und mit üblichen Trägern und/oder Hilfsstoffen zu Dosierungseinheiten konfektioniert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung des rekombinanten Plasmodium-Oberflächenproteins bzw. Hybridpartikels die für das circumsporozoide (CS) Protein codierende DNA-Sequenz verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als CS-proteincodierende DNA-Sequenz ein für 16 sich wiederholende Tetrapeptide codierendes 192bp großes SaulllA-Fragment verwendet wird, wobei dieses Fragment durch SaulllA-Spaltung eines 1 215bp großen, für das CS-Protein minus der ersten 52 bp codierenden, Stu I-Rsa I-Fragments des Plasmids WR 201 erhalten wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich weitere Sau III A-Fragmente der CS-proteincodierenden DNA-Sequenz verwendet werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Expressionskontrollsequenz der TDH 3-Promoter verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als eukaryontischer Wirt eine Hefezelle verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefen solche der Gattung Saccharomyces verwendet werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefen solche der Art Saccharomyces cerevisiae oder Saccharomyces carlsbergensis verwendet werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefen solche des Stammes DC5, DC5cir°, 10S44C oder 10S44Ccir° verwendet werden.