PT86640B - Processo de preparacao de antigenios de superficie do virus b de hepatite e de antigenios/hibridos que os contem - Google Patents

Processo de preparacao de antigenios de superficie do virus b de hepatite e de antigenios/hibridos que os contem Download PDF

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Description

invento refere-se a antigénios do vírus B da hepatite e a antigénios híbridos contendo-os e à clonação de genes que codificam esses antigénios em levedura por utilização de técni cas de ADN recombinante.
Antecedentes do invento
A. Vacinas da Hepatite B
A infecção com vírus B da hepatite (HBV) é um problema de saúde grave e muito disseminado. A infecção pode manifestar^ -se por fases agudas ou crónicas. Nos Estados Unidos, o número de casos de hepatite aguda é estimado em pelo menos 100 000 por ano com uma taxa de fatalidade de 1 a 2 por cento e o predomínio de portadores crónicos de HBV entre adultos saudáveis varia entre 0,1 e 1% dependendo da idade e classe social. Na América do Sul o predomínio de portadores crónicos é de cerca de 1 a 3%; na U.R.S.S. e na Europa do Sul de cerca de 3 a 6%; e na z z
Asia e África mais de 10%.
Nos países desenvolvidos existe a necessidade de uma vacina para as pessoas em risco elevado de exposição, tal como pacientes e pessoal das unidades médicas em que o sangue é manu seado, pessoal militar, esposos de portadores crónicos, viaja_n tes para áreas com elevada endemicidade, recém-nascidos de po_r tadores crónicos, homossexuais, prostitutas e drogados. Nos países do terceiro mundo existe a necessidade de uma vacina ba rata para imunização em massa. Os programas de imunização em massa podem, em última análise, não só afectar a incidência de hepatite aguda e o conjunto dos portadores crónicos como também reduzir a morbilidade e mortalidade resultantes de hepatite scti va crónica e carcinoma hepatocelular.
As partículas de Dane que se pensa serem os viriões da he patite B e que são isoláveis de pacientes infectados, têm um diâmetro de cerca de 42 nm. Cada uma consiste num invólucro &Ί 100
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-3compreendendo o antigénio de superfície da hepatite 8 (AgsHB), um capsídeo (AgcHB), uma polimerase endógena e um genoma de ADN. 0 genoma é circular e duplamente enrolado com uma região de cordão simples constituída por cerca de 200 bases. A região de cordão simples pode ser cheia, in vitro, por acção da polimerase endógena. 0 cordão maior contém aproximadamente 3 200 bases.
Desde há muito que é difícil preparar vacinas de HBV por_ que se tem mostrado difícil propagar o vírus em cultura de tecido e porque o único hospedeiro conhecido é o homem. No entanto, os chimpanzés também podem ser infectados, em laboratório, com o vírus.
Valenzuela et ai. (Nature, 29B, 347-350, 1982) descreveram a síntese de AgsHB em levedura usando um vector de expressão onde a sequência de codificação de AgsHB é um fragmento Taql-Hpal com 835 pares de bases (pb) e o promotor é o promotor de levedura para álcool-desidrogenase. Vários pequenos relató rios anteriores mostravam a existência de investigação antes desta referência. São eles: Valenzuela et al. (Arch. Biol. Med. Exp. (Chile), .14(1), 21-22, 1981) que refere a expressão, em levedura, de um fragmento de ADN contendo uma sequência que codifica uma proteína semelhante a AgsHB ligada a uma região do promotor de levedura para álcool-desidrogenase; um artigo em Scrip N°. 616, pag. 14 (12 de Agosto de 1981) em que se afirma que uma equipa de investigadores dos Estados Unidos na qual se inclui P. Valenzuela e W. 3. Rutter anunciaram a produção em levedura de do revestimento proteico que rodeia o vírus B da hepatite; e Zuckerman (Nature, 295, 98-99, 1982) que refere que W. 3. Rutter noticiou a expressão de AgsHB glicosilado em células de levedura.
Foi referido que os componentes antigénicos de HBV, tal como AgsHB foram preparados em bactérias, depois da inserção de uma molécula de ADN recombinante contendo um gene que codifica o antigénio. Burrell et al. (Nature, 279, Número 5708, 43-47, 1979) referiram a expressão na estirpe HB101 de E. coli de sequências de ADN de HBV clonadas em plasmídeo pBR322.
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-4Murray et al., Publicação do Pedido de Patente Europeia Número 13 828, 1980, referem a preparação de um vector recombinante que pode codificar antigénios de HBV incluindo o AgsHB na estirpe HB101 de E, coli. 0 vector é preparado a partir de ADN da partícula de Dane e do plasmídeo pBR322. Os autores afirmam que os hospedeiros úteis podem incluir outros hospedei, ros bacterianos, leveduras e outros fungos, células de animais ou de plantas e outros hospedeiros embora o único hospedeiro exemplificado no pedido seja a E. coli.
Charnay, et al. (Nature, 286, 893-895, 1980) referiram a construção de um bacteriófago contendo uma fusão de gene /3 -qa lactosidase e do gene estrutural de AgsHB. 0 bacteriófago dirige a síntese de uma proteína de fusão compreendendo determinantes antigénicos tanto de AgsHB como de -galactosidase.
Tiollais et al., Pedido de Patente do Reino Unido n2. 2 034 323, refere a preparação de um colifago contendo ADN de HBV. 0 ADN do fago HBU fundido é transformado na estirpe C600 de E, coli.
No Pedido de Patente do Reino Unido nS. 2 070 621 refere-se um plasmídeo que compreende uma parte do gene de AgsHB e o promotor e o gene Z do operão lactose, que pode ser clonado em E. coli,
Rutter et al., Publicação do Pedido de Patente Europeia nS. 20 251, 1980, referem vectores recombinantes que incluem um vector recombinante compreendendo fragmentos de plasmídeo pBR322 b BamHI do ADN do HBV que podem ser usados para transformar E. coli. Outro vector que compreende um fragmento BamHI do ADN do HBV e uma porção do operão triptofano foi usado para obter a expressão na estirpe HB101 de E, coli.
Edman et al, (Nature, 291, Número 5815, 503-506, 1981) descrevem a construção de plasmídeos que dirigem a síntese em E. coli do AgcHB e de uma proteína de fusão do AgsHB com /3 -lactamase, sob o controlo da região reguladora do operão triptofano.
Pumpen et al. (Gene, 30, 201-210, 1984) referem que em E.
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-5coli são sintetizadas pequenas quantidades de proteínas monómeros e proteínas de fusão do AgsH3 usando para detecção anti corpos criados contra monómero de AgsHB desnaturado.
Outras referências que discutem a inserção de ADN do HBV em bactérias incluem Charnay, et al. (Prog. Med. Virol., 27, 88-92, (1981); MacKay et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S. 78, Número 7, 4510-4514, 1981); Fritsch et al. (C.R. Acad. Sei., 287, Número 16, 1453, (1978); Patente do Reino Unido 2 034 323 (Deru/ent No. 46874C) e Pasek et al. (Nature, 282, No. 6, 575, 1979).
ADN do HBV tem também sido clonado em células de mamífero. Estas incluem linhas de células humanas, de ratinho e de hepatoma humano. Por exemplo Dubois et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S., 77, Número 8, 4549-4553, 1980) referem a trans. formação de células de ratinho com um plasmídeo contendo o genoma do HBV e a expressão de AgsHB, Hirschman et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S., 77, Número 9, 5507-5511 , 1980) referem a produção de partículas semelhantes ao HBV por células HeLa transformadas com ADN do HBV.
Os procedimentos para a preparação de vacina do HBV usari do AgsHB de sangue humano são descritos por Funakoshi et al. (Prog. Med. Virol., 27, 163-167, 1981) e Maupas et al. (Prog. Med. Virol., 27, 185-201, 1981). A vacina preparada por Funakoshi et al. contém 40 y^g de AgsHB purificado, tratado com formalina, fosfato, cloreto de sódio, 20 mg de manitol; e 0,1% de hidróxido de alumínio como adjuvante. No último documento, Maupas et al. referem que uma dose de vacina continha 1 ml de AgsHB purificado, tratado com formalina, contendo 2-10 ^ug/ml de proteína (método de Lowry) e 0,1% de hidreto de alumínio. 0 protocolo usado no estudo referido por Maupas et al. exigia três injecções com intervalos de um mês e um reforço passado um ano; os autores propuseram um protocolo que consiste em djj as injecções de AgsHB concentrado com um intervalo de três meses .
Outras referências à preparação de vacinas do HBV inclu67 100
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-6 — em Maupas et al., Adamowicz et al., e Funakoshi et al. nas páginas 3, 37 e 57, respectivamente, de Hepatitis B Vaccine INSERM Symposium No. 18, edit. por Maupas e Guesry, 1981, Elsevier/North-Holland Biomedical Press.
Têm-se usado leveduras como organismos hospedeiros, para a expressão de outras sequências de ADN que não são do HBV. Por exemplo, Fraser et al., Pedido de Patente do Reino Unido 2 068 969 referem a preparação de ovalbumina da galinha em levedura; Scrip NQ. 640, p. 11 (4 de Novembro de 1981) contém a informação de que está a ser preparado, em levedura, um tipo de interferão. Na Patente Europeia 11 562 (Deriuent Ns. 38762C) são referidos plasmídeos híbridos de levedura contendo o gene “f* de levedura ura^ no plasmídeo 2 antigénio de superfície autêntico do vírus B da hepati te (AgsHB) pode ser recolhido do plasma de indivíduos infectados, sob a forma de uma partícula de cerca de 22 nm que compre, ende duas proteínas conhecidas como P24 e o seu derivado glico silado GP28, sendo ambas codificadas pela sequência de codificação, com 226 aminoácidos, do genoma do HBV conhecida por sequência de codificação de proteína S. A sequência de codifica ção completa com 163 aminoácidos, que precede imediatamente a sequência de codificação de proteína S no genoma do HBV é aqui designada por sequência de codificação Pre S. 0s 55 aminoácidos da sequência de codificação Pre S que precedem imediatamer? te a sequência de codificação de proteína S são aqui designados por sequência de codificação Pre S2 e os restantes 108 aminoácidos da sequência de codificação Pre S são designados por s_e quência de codificação Pre 81. A sequência de codificação Pre S ou qualquer sua porção menor é também designada por proteína precursora do AgsHB.
Para completar, deve notar-se que a sequência de codificação Pre S completa para alguns subtipos do HBV (p.e. ayui) tem 163 codões enquanto que a sequência de codificação Pre 5 completa para os outros subtipos de HBV (p.e. adu^) tem 174 co dões. Em qualquer dos casos, a região Pre S2 consiste nos 55 codões que precedem imediatamente a sequência de codificação de proteína S.
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-7A sequência de codificação Pre S2 codifica para o sítio de ligação ou receptor de polialbumina encontrado na superfície das partículas de Dane e na superfície de algumas partículas de AgsHB isoladas de soros de pacientes infectados por HBV. Embora a região Pre S2 preceda imediatamente a região de codificação de proteína S no genoma de HBV, a região Pre S2 não es_ tá envolvida no conjunto das partículas de AgsHB. Ver, p.e., Persing et al., (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 3.2, 3440-3444, 1985).
Valenzuela et al. (Nature, 298, 347-350, 1982) referem
I que se encontraram partículas semelhantes às de AgsHB depois do rompimento de células de levedura transformadas com um vector contendo a sequência de codificação de proteína S e concluíram que as partículas de AgsHB são sintetizadas em levedura.
Harford et al. (Developments in Biological Standardization,54, 125-139, 1983) referem que se encontraram partículas semelhantes às de AgsHB depois do rompimento de células de levedura transformadas com um vector contendo 18 aminoácidos da sequência de codificação da ornitina-carbamoíl-transferase que precedem imediatamente os 42 aminoácidos do N-terminal da sequência de codificação Pre S2 que precede imediatamente a sequência de codificação de proteína S.
Laub et al. (3. Virology, 48 (1), 271-286, 1983) referem a construção de um vector de substituição precoce do vírus de Simio 40 que tem uma grande porção do AON do genoma do HBV, incluindo a sequência de codificação de proteína Pre S-S e a expressão dessa porção transformada em células CV-1 transforma das com SV-40 (células COS).
Stibbe et al. (3. Virology, 46(2), 626-628, 1983) referem que glicoproteínas menores do AgsHB, denominadas GP33 e GP36, são codificadas pela sequência de codificação de proteína Pre S2-S. Stibbe et al. (Dev. Biol. Stand., 54, 33-43,
1983) referem que partículas de AgsHB contendo grandes quantidades de GP33 e GP36 não induziram títulos maiores de anticorpo antiproteína S do que as partículas de AgsHB quase sem GP33 e GP36.
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-8Heerman et al. (J. Virei., 52 (2), 396-402, 1984) referem que a sequência de codificação completa com 389 aminoácidos, compreendendo a sequência de codificação de proteína Ξ e a sequência de codificação Pre Ξ, codifica para um polipéptido, P39, que foi encontrado em partículas de HBV e filamentos de antigénios virais de superfície em conjunto com a sua forma glicosilada, GP42, e para os outros polipéptidos associados ao antigénio de superfície de HBV, P24, GP27, GP33 e GP36.
Neurath et al. (Science, 224, 392-394, 1984) referem que os polipéptidos com a sequência dos 26 aminoácidos do aminoI -terminal da sequência de codificação Pre-S2 actuam como imuno génio e sugerem que se podem utilizar para testes de diagnésti co, anticorpos seleccionados pelo imunogénio.
Michel et al, (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 81, 7708-7712, 1984) descrevem sínteses de AgsHB transportando recept£ res de polialbumina de soro humano, células de ovário do erice to chinês (CHO) transfectadas com um plasmídeo transportando a sequência de codificação de proteína Pre S2-S.
Persing et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 82, 3440-3444, 1985) referem que células L de ratinho transformadas com uma sequência de codificação de proteína Pre S2-S produzem três polipéptidos relacionados com AgsHB (24 000, 27 000 e ) 35 000 daltons) podendo todos ser organizados em partículas complexas imunorreactivas de AgsHB com 22 nm de diâmetro que se ligam a albumina de soro humano polimerizada (HSA); enqua_n to que células L de ratinho transformadas com a sequência de codificação de proteína Pre S2-S contendo uma mutação de deslo cação na estrutura, vizinha da extremidade 3' da região Pre S2 produz apenas os polipéptidos com 24 000 e 27 000 daltons orqa nizados em partículas imunorreactivas de AgsHB com 22 nm de diâmetro que não são capazes de ligar HSA. Persing et al. concluem que a sequência de codificação de proteína Pre S2-S codifica a espécie de 35 000 dalton, que a proteína Pre S2 é responsável pela actividade de ligação à HSA do AgsHB mas que não é necessária para a reunião e secreção das partículas de AgsHB; e que o polipéptido principal de AgsHB (i.e. a espécie
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-9com 24 000 dalton) não é fundamentalmente derivada ds clivagem dos precursores maiores (i.e. as espécies com 27 000 e 35 000 dalton) codificados pela sequência de codificação de proteína Pre S2-S.
Milich et al. (Science, 228, 1195-1199, (1985) referem que vacinas que contêm partículas de HBV com Pre S2 e AgsHB, preparadas a partir de células de ovário do criceto chinês (CHO) transfectadas com um plasmídeo contendo a sequência de codificação de proteína Pre S2-S, em determinados ratinhos, pçi dem apresentar ausência de resposta a vacinas que apenas contêm | AgsHB; e que os 26 resíduos de aminoácidos no terminal NH2 do polipéptido de 33 000 dalton codificado pela sequência de cod.i ficação de proteína Pre S2-S representa um sítio dominante de ligação de anticorpo, na região Pre 52.
Michel et al., Vaccines 86”, Brouin et al., Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1986), 359-363, discutem a síntese em células de CHO, de partículas de antigénio de superfície da Hepatite B contendo 0 produto de expressão da região Pre S2.
Neurath et al. (Nature, 315, 154-156, 1985) referem que a região Pre S codifica para proteínas no invólucro de HBV com domínios reconhecidos especifícamente pelas células do fígado; a sequência de codificação de proteína Pre S2-S codifica para uma proteína presente nas partículas de HBV; péptidos sintéti cos correspondendo às proteínas Pre-S codificadas pelo gene, são imunogénicos; e concluem que as vacinas de HBV devem conter determinantes Pre S.
Valenzuela et al. (Biotechnology, J, 317-320, 1985) refe, rem a expressão da sequência de codificação completa de proteí, na Pre 82-Ξ em levedura transformada com essa sequência de codificação; e referem também que estas células de levedura sin tetizam, de facto, uma partícula contendo AgsHB e Pre 52 que é muito semelhante, em relação às propriedades de microscopia electrónica e de sedimentação, a partículas contendo apenas AgsHB e que a região Pre-52 não pressupãe a capacidade de formar partículas semelhantes às partículas de AgsHB com 22 nm. Valenzuela et al. referem também que se tem posto a hipótese
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-10de o HBV penetrar no fígado, ligando polialbumina ao seu receptor de polialbumina, que por sua vez liga o receptor de polialbumina à célula de fígado e assim o vírus torna-se interno e que o receptor de polialbumina do HBV é codificado pela regiSo Pre S2. Valenzuela conclui que uma vacina contendo Pre S2 produzirá anticorpos que, além de inactivarem o HBV através do mecanismo normal, podem interferir com o modo como o vírus entra nas células do fígado.
Takeda Chemical Ind. KK, Publicação do Pedido de Patente Europeia N9. 171908-A, reivindica a produção em levedura de
I proteína P31 não glicosilada do antigénio de superfície do ví- rus B da hepatite.
Chiron Corporation, Publicação do Pedido de Patente Euro peia No. 0 174 444 A2, reivindica um método para preparar partículas de AgsHB contendo proteína P31 em levedura.
Quadro I que se segue compara as sequências de aminoácidos da região Pre S2, conhecidas, com a sequência de aminoácidos Pre S2 do HBV do presente invento:
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-11..aí 1
Quadro I - Comparação da sequência da aminoácidos da região pre 52 de diferentes serotipos de HBV
Sub- Região de codificação Pre S2
tipo
de
HBV Referên-
-55 -50 -40 -30 -20 -10 0 cia
adui
I
MqWNSTAFHQALqDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSSSARTGDPVTN
A região de cod_i ficação Pre S2 do invento
adu/ T L I 1
adiu L L I I 2
adiu I 3
adw K I 4
adr T L V TT P IFS AP 5
adr T L V TT P I S AP 6
ayw T T VLTT PL IFS I A L 7
adyw 1 4 T T V TTT P IFS I fl|_ 8
Chave para as abreviaturas dos aminoácidos
Asp D Acido aspártico Ile I Isoleucina
Thr T T reonina Leu L Leucina
Ser 5 Serina T yr Y T irosina
Glu E Acido Glutâmico Phe F Fenilala-
nina
Pro P Prolina His H Histidina
Gly G Glicina Lys K Lisina
Ala A Alanina Arg R Arginina
Cys C Cisteína T rp W T riptofano
Vai V Valina Gin Q Glutamina
Met M Metionina Asn N Asparagina
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-12Bibliografia
1. Valenzuela et al., In Animal Virus Genetics (Field, Oaenisch and Fox eds) p. 57-70, Academic Press, Neiu York (1980).
2. Choiu et al., Fourth Annual Congress for Recombinant DNA Research, San Diego, USA, 1984.
3. Fujisatua et al., Nucl. Acids Res., 11, 4601-4610 (1983).
4. Lo et al., Biochem Biophys, Res. Com., 2., 382-388 (1986).
5. Fujisatua et al., citado anteriormente.
6. 0no et al., Nucl. Acid Res., 11, 1747-1757 (1983).
7. Galibert et al., Nature, 281, 646-650 (1979).
8. Pasek et al., Nature, 282, 575-579 (1979).
B. Vacinas da Malária
Vários estudos recentes sugerem que a imunidade protecto ra, num hospedeiro sensível à infecção por uma espécie particu, lar de Plasmodium na fase de esporozoíto, pode ser mediada por anticorpos produzidos por esse hospedeiro para a proteína de superfície da fase de esporozoíto do ciclo de vida do Plasmodium (proteína CS) do esporozoíto particular.
As proteínas de esporozoíto de alguns tipos de Plasmodium têm sido clonadas e algumas delas têm sido expressas por técni. cas de ADN recembinante.
Nussenzweig et al. (Patente dos E.U.A. 4 466 917) referem um polipéptido de esporozoíto identificado como proteína P-44 e a sua clonação e expressão em E. coli.
Sharma et al. (Science, 228, 879-882, 1985) referem a ex. pressão em levedura de uma porção da proteína de fase de esporozoíto do ciclo de vida do Plasmodium knotulesi (CS) usando um vector de expressão contendo a região reguladora 5’ do gene da levedura para álcool-desidrogenase I em vez da região a montajn te 5· da sequência do gene CS do P. knoujlesi
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-13A Publicação de Pedido PCT Número W084-02922-A da Neuj York University refere a clonação de uma porção da região de codificação para a unidade de repetição da proteína de superfí cie da fase de esporozoíto do ciclo de vida (CS) do P. knouilesi e a expressão em E. coli das suas fusões beta-lactamase e betai -galactosidase.
Kemp et al., Publicação do Pedido de Patente PCT Número W084-02917-A, referem a clonação e expressão em E. coli de uma sequência de codificação para a proteína CS derivada de uma fa se do P. falciparum no sangue.
Dame et al, (Science, 225, 593, 1984) referem a clonação e expressão da proteína CS do P. falciparum em E. coli. A prai teína é descrita como compreendendo cerca de 412 aminoácidos com um peso molecular aproximado de 44 000. Ela compreende 41 repetições em tandem de um tetrapéptido. Péptidos sintéticos com 7, 11 e 15 resíduos derivados da região repetida ligam -se a anticorpos monoclonais criados contra a proteína CS.
Ellis et al. (Nature, 302, 536-538, 1983) referem a expressão de uma fusão de beta-lactamase-proteína CS de P. knowlesi em E, coli.
Enea et al. (Proc. Natl, Acad. Sei., USA, 81, 7520-7524,
1984) referem uma estrutura de unidade repetida análoga na proteína CS de P. cynomolgi e a clonação e expressão da prote.1 na CS em E. coli bem como uma descrição da sua sequência de codificação.
Bailou et al. (Science, 228, 996-999, 1985) referem que péptidos sintéticos da região de repetição da proteína CS do Plasmodium falciparum, conjugados com albumina de soro bovino (BSA) ou com tiroglobulina, produzem respostas de anticorpos em ratinhos e coelhos, e concluem que uma vacina contra a fase de esporozoíto do parasita da malária pode ser desenvolvida usando péptidos sintéticos da região de repetição da proteína CS conjugados com uma proteína veículo.
Weber et al. (Molecular and Bacterial Parasitology, 15, 305-316, 1985) referem o uso de um gene de proteína CS clona67 100
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-14do de uma estirpe brasileira de P. falcíparum como sonda para análise da estrutura de outras 17 estirpes de P. falcíparum, por hibridação de ácido nucleico e concluem que o gene da proteína CS se mantém muito e que o desenvolvimento da vacina da malária com a proteína CS não deverá ser complicado com a varia ção de estirpes.
Arnot et al, (Science, 230, 815-818, 1985) referem a cio nação da proteína CS do P, vivax e descrevem a sua sequência de codificação completa e concluem que a sequência de codifica ção da proteína CS de P. vivax é homóloga da do gene CS de P. knowlesi mas não da do P» falcíparum.
Sharma et al. (Science, 229, 779-782, 1985) descrevem a sequência nucleótida completa da região de codificação do gene CS da estirpe Nuri de P. knowlesi.
Young et al. (Science, 228, 958-962, 1985) referem a expressão de proteínas CS de P. falcíparum em E, coli para utili zação potencial numa vacina contra malária humana.
The Walter and Eliza Hall Institute of Medicai Research, Publicação do Pedido de Patente PCT Ne. W084/02917, 1984, descrevem sequências de polinucleótidos construídas artificialmejn te, correspondendo substancialmente a todo ou a uma porção do ARNm ou ADN genómico de P. falcíparum> o péptido corresponder» te a essa sequência e um método para a sua produção; uma compo sição para estimular respostas imunes contra antigénios de P. falcíparum num mamífero, compreendendo esse péptido.
Mazier et al. (Science, 231, 156-159, 1986) descrevem que anticorpos criados em ratinhos imunizados com vários pépti dos recombinantes e sintéticos da proteína CS de P. falcíparum foram analisados em relação à actividade protectora num sistema de cultura de hepatócitos humanos e verificou-se que exibiam um efeito protector contra o parasita em três pontos: ligação à superfície do hepatócito, entrada e desenvolvimento intracelular subsequente do esporozoíto.
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C. Vacinas Polivalentes
Valenzuela et al. (Biotechnology, J, 323-327, 1985) refe. rem a utilização do receptor de polialbumina do AgsHB codifica do pela sequência de codificação Pre 32 como meio para preparar vacinas polivalentes. Valenzuela et al. referem também a preparação de uma partícula híbrida de AgsHB e de glicoproteína D do vírus de Herpes simplex 1 (HSV-lgD) expressando uma sei quência de codificação híbrida HSV-lgD-proteína Pre S2-S, em levedura.
Valenzuela, Hepatitis B subunit vaccines using recombinant DNA Techniques, 15 de Maio. 1985 Bio-Expo-5-Meeting, Bo_s ton Massachussetts, refere que com um híbrido, como a partícula AgsHB-HSV-lgD descrita acima, existe um problema de imuno-dominância do AgsHB em relação ao imunogénio estranho presente na sua superfície.
Chiron Corporation,Publicação do Pedido de Patente Europeia NQ. 0 175 261 reivindica uma nova partícula híbrida contendo pelo menos uma porção maior do antigénio de superfície da Hepatite B fundida a um ou mais oligopéptidos, sendo o poli, péptido híbrido capaz de formar uma partícula num hospedeiro celular, apresentando pelo menos um epítopo de pelo menos um oligopéptido.
As proteínas podem sofrer modificações post-tradução e algumas delas podem afectar profundamente a conformação e função das proteínas. A presença de cadeias de oligossacáridos em proteínas pre Sl-preS2-S e pre S2-S derivadas de humanos Heerman et al. em 3. Virol., 52., 396-402, 1984; Stibbe e Gerlich em Virology, 123, 436-442, 1982; Stibbe e Gerlich em J. Virol., 46, 626-628, 1983) e presumivelmente de ácido miris. tico na proteína pre Sl-pre S2-S (Persing et al., Resumos dos trabalhos apresentados no encontro de 1986 sobre Biologia Mole cular dos vírus B da Hepatite, 28-31 de Agosto, 1986, Cold Spring Harbor Laboratory pode influenciar a formação da partícula, a conformação das proteínas na partícula e a antigenicidade e imunogenicidade destas partículas.
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-16A levedura (Saccharomyces cerevisiae) tem uma capacidade enzimática para a glicosilação da proteína (Bailou, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Metabolism and Gene Expression; Strathern, Oones e Broach Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1982), p. 335-360) e acilação de ácidos gordos (Towler e Glasler in Proc. Natl. Acad. Sei., 83, 2812-2816, 1986) semelhante à das células eucarióticas superiores.
Verificou-se que as glicoproteínas virais de superfície expressas em levedura são glicosiladas. Oabbar et al. (Proc. Natl. Acad. Sei., 82., 2019-2023, 1985) referem que a expressão em levedura do gene de hemaglutinina do vírus da gripe teve co mo resultado uma proteína de hemaglutinina glicosilada. Wen e Schlesinger (Proc. Natl. Acad. Sei», 83, 3639-3643, 1986) refe rem que a expressão de glicoproteínas do vírus de Sindbis e de estomatite vesicular, em levedura, deu formas glicosiladas des. tas proteínas virais. Fujisauua et al. (Resumos dos trabalhos apresentados no encontro de 1986 sobre Biologia Molecular de Vírus B da Hepatite, 28-31 de Agosto, 1986, Cold Spring Harbor Laboratory, página 62) referem que a expressão do gene pre S2-S em levedura resulta na síntese de duas formas glicosiladas da proteína pre S2-S. Kniskern et al. (Resumos dos trabalhos apresentados no encontro de 1986 sobre Propostas Modernas para Novas Vacinas, Incluindo a Prevenção da SIDA, 9-14 de Setembro, 1986, Cold Spring Harbor Laboratory, página 89) referem que a expressão do gene pre Sl-pre S2-S em levedura tem como resulta do a síntese de duas proteínas pre Sl-pre S2-S de 45 kD e 39 kD. Persing et al. (Resumos dos trabalhos apresentados no encontro de 1986 sobre Biologia Molecular de Vírus B da Hepatite, 2Θ-31 de Agosto, 1986, Cold Spring Harbor Laboratory, página 19) referem que marcando células C0S7, que expressam proteínas pre Sl-pre S2-S, pre S2-S e S, com ácido mirfstico H se obtém como resultado a presença do marcador na proteína pre Sl-pre S2-S.
As proteínas de fusão expressas em levedura e reunidas numa partícula são purificadas de acordo com o esquema geral:
Adsorção e desadsorção em aerosil (1) —> precipitação
6Ί 100
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-17de CaC^ (2) —> adsorção e desadsorção em fenilagarose ou fenilboronato-agarose (3) —> centrifugação em gradiente de CsCl ou cromatografia de permuta iónica em DEAE.
passo 1 é descrito na publicação do Pedido EP 0 204 680 e o passo 3 é descrito na publicação do Pedido EP 0 199 698 no que se refere à fenilagarose, A combinação específica dos pas. sos (1) e (3) é capaz de realizar uma limpeza drástica do mate rial contaminante (eliminação de 90% de proteínas, hidratos de carbono e 50% de lípidos). Esta combinação nova permite 0 bom funcionamento dos passos cromatográficos seguintes.
No caso das proteínas de fusão estarem glicosiladas, us.a -se fenilboronato (PBA) como adsorvente de afinidade. A pH 9,0 o grupo boronato forma complexos covalentes com grupos cis-diol potenciais nas cadeias laterais glicosiladas. Ocasionalmente, têm-se usado geles de PBA para a purificação de glicoproteínas solúveis mas não para a purificação de partículas contendo gli coproteínas inseridas na bicamada de lípido (Ver, Cook, et al., Analytical Biochemistry, 149, 349-353, 1985; Middle, et al., Biochemical Oournal, 209, 771-779, 1983; Cook, et al,, Biochi mica et Biophysica Acta, 828, 205-212, 1985; Maestasane, et al., Journal of Chromatography, 189, 225-231, 1980). Em virtu de dos múltiplos centros de ligação de ligandos na partícula têm que se usar geles de PBA com uma densidade PB-ligando muito baixa, p.e. geles de PBA com um teor de boronato <10 yxg/ml de gel, preferivelmente com 5y*g de boronato/ml de gel. A uti lização de geles de fenilboronato com um teor em boronato muito baixo permite a cromatografia de afinidade de partículas contendo glicoproteínas inseridas.
Sumário do Invento
Este invento refere-se a uma molécula de ADN recombinante compreendendo uma sequência de codificação, funcional, de ADN fundida, em fase, a uma porção da região Pre S2 de uma sequência de codificação da proteína Pre S2-S do vírus B da Hepa tite (HBV). 0 termo sequência de codificação ou região de codificação como usado aqui engloba também qualquer seu deri
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-18vado funcional. Com o termo derivado funcional pretende-se designar uma sequência de codificação com alterações de aminoácidos que, quando apropriado, não interferem com a formação de partículas e/ou que retém imunogenicidade quando essa retenção é desejável. Este derivado funcional pode ser preparado por mutagenese específica de sítio, convencional, tal como pelos métodos descritos por Botstein et al. (Science, 229, 1193-1201,
1985). Preferivelmente esta molécula de ADN também compreende uma região reguladora que, preferivelmente, deriva do gene de levedura arg3.
Este invento refere-se também a um vector recombinante que compreende uma molécula de ADN recombinante ligada operati vamente a uma região reguladora, contendo a molécula de ADN uma sequência de codificação, funcional, de ADN fundida, em fase, a uma porção da região Pre S2 de uma sequência de codificação de proteína Pre S2-S de HBV. 0 termo região reguladora como usado aqui pretende designar uma sequência de ADN que contém uma região promotora e outras sequências necessárias à transcrição e tradução de uma sequência de codificação.
Este invento refere-se também a uma célula hospedeira eu. cariótica transformada com um vector recombinante, na qual o referido vector compreende uma molécula de ADN ligada operativamente a uma região reguladora e na qual a referida molécula de ADN contém uma sequência de codificação funcional, de ADN, fundida, em fase, a uma porção da região Pre S2 de uma sequência de codificação de proteína Pre S2-S de HBV. Este invento refere-se também a um método para preparar essa célula hospede^ ra transformada, que compreende transformar uma célula hospedejL ra eucariótica com esse vector recombinante.
Este invento refere-se também a um método para preparar uma partícula híbrida contendo proteína de AgsHB que contêm e/ /ou apresenta um péptido codificado por uma sequência de codificação funcional, de ADN, que compreende cultivar uma célula hospedeira eucariótica transformada com um vector recombinante, em meios de cultura apropriados, e isolar a partícula de um li sado ou extracto de células dessa cultura de hospedeiro, com67 100
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-19preendendo o referido vector uma molécula de ADN ligada operatiuamente a uma região reguladora, contendo a molécula de ADN a sequência de codificação funcional, de ADN, fundida, em fase, a uma porção da região Pre S2 de uma sequência de codificação Pre S2-S da proteína de HBV.
Este invento refere-se também a uma partícula imunogénica híbrida compreendendo uma partícula de antigénio de superfí cie do vírus B da Hepatite (AgsHB) que contém e/ou apresenta um péptido codificado por uma sequência de codificação, funcio nal, de ADN.
Este invento refere-se também a uma vacina compreendendo uma quantidade imuno-protectora dessas partículas híbridas.
Este invento refere-se também a uma micela compreendendo essa partícula híbrida e poli-sorbato e a uma vacina compreendendo uma quantidade imuno-protectora dessas micelas.
Com o termo sequência de codificação, funcional, de ADN pretende-se designar uma sequência de codificação de ADN que, quando fundida, em fase, a uma porção da região Pre S2 da sequência de codificação de proteína Pre S2-S de HBV, não está envolvida e não interfere com a reunião da partícula de AgsHB.
As sequências funcionais de codificação de ADN preferidas, incluem, não lhes estando limitadas, (a) a sequência de codificação completa de proteína Pre S de HBV ou um seu deriv.a do imunogénico, tal como» mas não só, a sequência de codificação de proteína Pre S2, Pre SI ou Pre Sl-Pre S2j e (b) outras sequências de codificação imunogénicas tal como a sequência de codificação da proteína de superfície da fase de esporozoíto do ciclo de vida do Plasmodium ou qualquer seu derivado imu nogénico, a sequência de codificação do gene de invólucro de HIV ou qualquer seu derivado imunogénico, especialmente, a sequência de codificação do péptido C?, péptido 121 ou do péptido de Dreesman ou um seu derivado imunogénico.
Este invento refere-se também a uma região de codificação de proteína Pre SI de HBV que codifica para a seguinte sequência de aminoácidos:
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-20-163
ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT
Met Gly Thr Asn Leu Ser Vai Pro Asn Pro
GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT
Gly Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro
GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT
Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp
TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG
T rp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His T rp
CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA
Pro Ala Ala Asn Gin Vai Gly Vai Gly Ala
TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC
Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly
GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG
Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gin Ala Gin
GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT
Gly Ile Leu Thr Thr Vai Ser Thr Ile Pro
CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA
Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gin Ser Gly
AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA
Arg Gin Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
A GA GAC AGT CAT CCT CAG GCC
Arg Asp Ser His Pro Gin Ala
ou a uma região de codificação de proteína Pre S2 de HBV ou a uma região de codificação de proteína Pre S2-S de HBV na qual a sua porção Pre 32 codifica para a seguinte sequência de ami boácidos:
-55 -50
Met-Gln-T rp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp-40 -30
Pro-A rg-Val-Arg-Gly-Leu-T yr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-SerSer&Ί 100
SKR 12044-2
-21-2 0 Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile-Ser-i° Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Hsn; um vector de ADN recombinante compreendendo essa região de codificação de proteína Pre Sl, Pre S2 ou Pre S2-S, ligada operativamente a uma região reguladora; uma célula hospedeira transformada contendo esse vector; um processo para preparar essa célula transformada, que compreende transformar uma célula hospedeira com esse vector; a proteína codificada por essa região de codificação; um processo para preparar essa proteína; uma vai cina compreendendo uma quantidade imuno-protectora dessa proteína, a partícula codificada por essa região de codificação de proteína Pre S2-S; um processo para preparar essa partícula, uma vacina compreendendo uma quantidade imuno-protectora dessa partícula e uma micela compreendendo essa partícula e pjo li-sorbato, e uma vacina compreendendo uma quantidade imuno-pro tectora dessas micelas.
Este invento refere-se também a um vector de ADN recombi nante compreendendo uma sequência de codificação completa de proteína Pre Sl-Pre S2-S ou uma sequência de codificação de proteína Pre Sl-sequência de codificação, funcional, de ADN-Pre S2-S ou um seu derivado imunogénico, ligada operativamente a uma região reguladora; a uma célula de levedura, hospedeira, transformada com esse vector; a um método para preparar esse hospedeiro transformado, que compreende transformar uma célula de levedura, hospedeira, com esse vector; a um método de preparar proteína codificada pela sequência de codificação de proteína Pre Sl-Pre S2-S ou pela sequência de codificação de proteína Pre Sl-sequência de codificação, funcional, de ADN-Pre S2-S ou por um seu derivado imunogénico; a uma pro teína preparada por esse método; a uma vacina compreendendo uma quantidade imuno-protectora dessa proteína; a uma partícu la contendo polipéptido codificado pela sequência de codificação de proteína Pre Sl-Pre S2-S ou pela sequência de codificação de proteína Pre Sl-sequência de codificação funcional, de ADN-Pre S2-S ou por um seu derivado imunogénico; a um método
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-22para a sua preparação, uma vacina compreendendo uma quantidade imuno-protectora dessas partículas, uma micela compreendendo essa partícula e poli-sorbato e uma vacina compreendendo uma quantidade imuno-protectora dessas micelas.
Este invento também se refere a uma sequência de codificação de proteína Pre Sl-Pre S2 ou a uma sequência de codifica çãa de proteína Pre Sl-Pre S2-S cuja porção Pre Sl-Pre S2 compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
REGIDO PRE-S1
-163
ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT
Met Gly Thr Asn Leu Ser Vai Pro Asn Pro
GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT
Gly Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro
GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT
Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp
TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG
T rp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His T rp
CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA
Pro Ala Ala Asn Gin Vai Gly Vai Gly Ala
TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC
Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly
GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG
Gly Ile Leu Gly T rp Ser Pro Gin Ala Gin
GGC ATA TTG ACC A CA GTG TCA A CA ATT CCT
Gly Ue Leu Thr Thr Vai Ser Thr Ile Pro
CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA
Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gin Ser Gly
AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA
Arg Gin Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
A GA GAC AGT CAT CCT CAG GCC
Arg Asp Ser His Pro Gin Ala
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-23REGlfiO PRE-S2
-55
ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAA
Met Gin T rp Asn Ser Thr Ala Phe His Gin
GCT CTG CAG GAT CCC AGA GTC AGG GGT CTG
Ala Leu Gin Asp Pro Arg Vai Arg Gly Leu
TAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGA
T yr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly
ACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCT
Thr Vai Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser
CAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGG
His Ile Ser Ser Ser Ser Ala Arg Thr Gly
GAC CCT GTG ACG AAC
Asp Pro Vai Thr Asn
Este invento também se refere a um vector recombinante compreendendo essa nova sequência de codificação de proteína Pre Sl-Pre S2 ou Pre Sl-Pre S2-S, ligada operativamente a uma sequência de controlo de expressão; uma célula hospedeira transformada com esse vector; um método para preparar esse hospedeiro transformado, que compreende trabsformar uma célula hospedeira com esse vector; a um método para preparar proteína codificada por essa sequência de codificação de proteína Pre Sl-Pre S2 ou Pre Sl-Pre S2-S ou um seu derivado imunogénico; à proteína preparada por esse método; a uma vacina compreendendo uma quantidade imuno-protectora dessa proteína; a uma partícula contendo polipéptido codificado por essa sequêri cia de codificação de proteína Pre Sl-Pre S2-S ou um seu derivado imunogénico; a um método para a sua preparação, a uma va cina compreendendo uma quantidade imuno-protectora dessas partículas e a uma micela compreendendo essa partícula e poli-sor bato.
Apresenta-se seguidamente a chave das abreviaturas dos aminoácidos usados neste
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Asp Acido aspártico Ile Isoleucina
Thr Treonina Leu Leucina
Ser Serina Tyr T irosina
Glu Acido glutâmico Phe Fenilalanina
Pro Prolina His Histidina
Gly Glicina Lis Lisina
Ala Alanina Arg Arginina
Cys Cisteína T rp T riptofano
Vai Valina Gin Glutamina
Met Metionina Asn Asparagina
Breve Descrição das Figuras
A Figura 1 é um mapa da clivagem por endonuclease de res.
trição de pRITlOóOl.
A Figura 2 é um mapa da clivagem por endonuclease de res.
trição de pRIT10616.
A Figura 3 é um mapa de clivagem por endonuclease de res.
trição de pMC200.
A Figura 4 é a sequência de nucleótidos de uma porção do
ADN de levedura HindIII de 3300 pb inserido em pMC200, porção
que contém sítios HincII, BglII : e EcoRI.
1 A Figura 5 é um diagrama de blocos ilustrando a prepara-
Ção de pRIT10671 e pRIT10673»
A Figura 6 é um diagrama de blocos ilustrando a prepara-
ção de pRIT10749.
A Figura 7 é um diagrama de blocos ilustrando a prepara-
ção de pRIT10761 e pRIT10764.
A Figura 8 é um diagrama de blocos ilustrando a prepara-
ção de pRIT10167 (Exemplo 1), pRIT10158 e pRIT10162 (Exemplo
3); pRIT10158, pRIT10677, e pRIT10909 (Exemplo 4); pRIT10911 (Exemplo 5); pRIT10679, pRIT10903, pRIT10914 (Exemplo 6);
pRIT12211, pRIT12209 e pRIT12230 (Exemplo 7); e pRIT12288 e pRIT12322 (Exemplo 8).
A Figura 9 ê um mapa da clivagem por endonuclease deres67 100
SKR 12044-2
-25trição de pRIT10172.
A Figura 10 é um mapa da clivagem por endonuclease de restrição de pRIT12290.
A Figura 11 é um mapa de clivagem por endonuclease de restrição de pRIT12322 que ilustra quais das suas porçães são derivadas de pRIT12230 e pRIT12288.
A Figura 12 é um diagrama de blocos ilustrando a preparação de pRIT12571; pRIT12573; pRIT12572 e de pRIT12574.
A Figura 13 ê um mapa de clivagem por endonuclease de restrição de pRIT12309.
A Figura 14 é um diagrama de blocos ilustrando a prepara, ção de pRIT12314 e de pRIT12544.
A Figura 15 é um diagrama de blocos ilustrando a prepara ção de pRIT12658.
A Figura 16 é um mapa da clivagem por endonuclease de restrição de pRIT12662.
A Figura 17 é um diagrama de blocos ilustrando a prepara
ção de pRIT12660.
A Figura 18 é um diagrama de blocos ilustrando a prepara
ção de pRIT12845 (a3 »b,c :,d,e,f).
A Figura 1A é um diagrama de blocos ilustrando a preparai
ção de pRIT12662.
A Figura 2A apresenta um mapa esquemático de restrição e a estratégia de sequenciação do clone ÃMPfl.
A Figura 3A apresenta a sequência de nucleétidos do gene da proteína da fase de esporozoíto do ciclo de vida do P. falciparum.
A Figura 4A apresenta a sequência de codificação de ADN PreSl-Pre S2 compreendendo pRIT12792.
A Figura 1B é um mapa esquemático de restrição da região do invólucro de vírus B HIV.
A Figura 2B ilustra a construção do plasmídeo pRIT12893.
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-26A Figura 3B ilustra a construção do plasmídeo pRIT12897.
A Figura 4B ilustra a construção do plasmídeo pRIT12899.
A Figura 5B ilustra a construção do plasmídeo pRITX.
Descrição Detalhada do Invento
Expressão de AgsHB em Levedura
Região reguladora como aqui usada significa uma sequêri cia de ADN que contém sequências necessárias ou desejáveis para transcrição e tradução de uma sequência de codificação. Es. tas regiões reguladoras são em geral, colocadas em 5’ e adjacentes à sequência de codificação que se deseja expressar. Pre ferivelmente, uma outra região de ADN de levedura, contendo um sinal para a terminação da transcrição, é colocada imediatameri te a 3’ em relação à região de codificação a ser expressa de modo a efectuar a terminação do transcrito.
AgsHB como usado aqui significa um antigénio contendo proteínas codificadas pela sequência de codificação de proteína S do genoma de HBV, sendo esse AgsHB estruturalmente semelhante ao AgsHB autêntico ou possuindo essencialmente os mesmos determinantes antigénicos codificados pela sequência de codifi cação de proteína S que o AgsHB autêntico, isto é, é capaz de estimular uma resposta imune que reconhece e reage especificamente com AgsHB autêntico ou é especificamente reconhecido por anticorpos anti-AgsHB.
A sequência de codificação de AgsHB pode ser isolada de ADN extraído das partículas de Dane em soro humano infectado, enchendo a região de cordão único com uma ADN-polimerase, de preferência a polimerase endógena, seguindo-se a digestão com uma endonuclease de restrição. A escolha da endonuclease dependerá, em parte, das partículas de Dane particulares. Por exemplo, a sequência de codificação de AgsHB de ADN de HBV de certas partículas de Dane do serótipo adw pode ser isolada num único fragmento BamHI; a sequência de codificação de AgsHB de ADN de HBV de certas partículas de Dane do serotipo ayuj pode ser isolada num fragmento Hhal. 0 ADN de HBV das partículas
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-27de Dane do mesmo serotipo podem também exibir padrões diferentes de sítios de restrição.
A restrição de ADN para preparar fragmentos de ADN usada neste invento, a ligação desses fragmentos para preparar molécu las de ADN recombinante usada neste invento e a inserção em mi crorganismos são realizadas por técnicas conhecidas tais como as descritas nas referências citadas anterior e subsequentemeri te. As condiçães são seleccionadas de modo a evitar-se a desnaturação do ADN e enzimas. Por exemplo, o pH é tamponado para permanecer em cerca de 7,0 a 11,0 e a temperatura é mantida abaixo de cerca de 605C. A restrição é efectuada preferivelmerj te a uma temperatura de cerca de 30 a 409C e a ligação é efectua da a cerca de 0 a ÍOSC. As enzimas de restrição e as ligases usadas na realização deste invento estão disponíveis no comércio e devem ser usadas de acordo com as instruções anexas. A ligase preferida é a T4 ADN-ligase.
0s vários fragmentos e construções finais devem ser juntos de acordo com as vias convencionais. Em muitos casos, is_o laram-se os genes e fizeram-se mapas de restrição e sequenciaram-se. Neste âmbito, pode seleccionar-se a sequência de inte resse, tal como a sequência de AgsHB, por restrição do gene, usando outras manipulações à medida do necessário, tais como resseção com Bal31, mutagénese in vitro, restauração por primer ou análogos, para proporcionar um fragmento de dimensão desejada, incluindo a sequência pretendida e tendo os terminais apropriados. Podem ser usados ligantes e adaptadores para unir as sequências, assim como para substituir as sequências perdidas, quando um sítio de restrição usado era interno à região de interesse. 0s vários fragmentos que são isolados pç) dem ser purificados por electroforese, electro-eluídos, ligados a outras sequências, clonados, re-isolados e manipulados de outra forma.
A utilização de regiões reguladoras para controlar a transcrição do gene estrutural de interesse, tal como a sequêri cia de AgsHB pode permitir o crescimento das células hospedeiras a densidade elevada com níveis baixos ou inexistentes de
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SKR 12044-2 , ,k. .
-28expressão do gene estrutural, tal como a sequência de AgsHB, e em seguida induzir a expressão por alteração das condições ambientais, p.e., nutriente, temperatura, etc..
Por exemplo, com a região reguladora GAL4, as células de levedura podem ser cultivadas em meios ricos com uma combinação de glicerol e ácido láctico, para se obter densidade elevja da, por exemplo a meio da fase log ou no seu final, seguindo-se a mudança da fonte de carbono para galactose. Como outro exemplo, para a regulação com PH05, podem cultivar-se as células a uma concentração de fosfato elevada de cerca de 7 mM de | ΚΗ2Ρ0^ e em seguida recuperar e ressuspendê-las em meio sem fosfato para efectuar a desrepressão e expressão. Para sensibilidade à temperatura, podem cultivar-se as células a 259-379C e em seguida alterar a temperatura, como adequado, em cerca de 5S a 209C. As células hospedeiras terão o sistema regulador associado à região reguladora usada.
A fusão da sequência de AgsHB à região reguladora pode ser efectuada por utilização de vectores intermediários. Alternativamente, a sequência de AgsHB pode ser inserida directa mente num vector que contém a região reguladora. Um vector é ADN que pode transportar e manter o fragmento de ADN do invento, incluindo, por exemmplo, fagos e plasmídeos. Técnicas pa) ra clonar fragmentos de ADN em fagos são descritas, por exemplo, por Charnay et al. Nature, Volume 286, 893-895 (1980) e Tiollais, Pedido de Patente do Reino Unido 2 034 323. Preferivelmente, a sequência de AgsHB é posicionada em relação à re gião reguladora de modo que o AgsHB sintetizado por expressão da sequência de AgsHB seja devido a resíduos aminoácidos estranhos.
Numa concretização deste invento, a sequência de codificação de AgsHB em conjunto com 42 codões da proteína precursora de AgsHB (pre S-S) foram fundidos, em fase, a seguir ao 189 aminoácido da sequência de codificação da proteína de levedura para OCT que é transcrita a partir do promotor arg\ Esta cons trução dá origem a uma partícula híbrida contendo proteína de AgsHB contendo mais 60 aminoácidos no N-terminal além dos 226
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-29aminoácidos característicos da proteína S.
Um exemplo de região reguladora é a derivada do gene de levedura, arg^, que codifica para ornitina-carbamoíl-transferase (OCT). A região reguladora arg^ é sujeita aos mecanismos de controlo tanto específico como geral. Ela foi clonada em
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E. coli no plasmídeo pYeura arg como foi descrito por Crabeel et al., Proc. Natl. flcad. Sei. U.S.A., Volume 78, 6026 (1981). Hospedeiros preferidos são estirpes de 5. cerevisiae nas quais a via bio-sintética da arginina é des-reprimida, tal como a estirpe lcl697d. A utilização destas estirpes tem como resultado uma expressão aumentada do promotor arg^ quando comparada com a da estirpe DC5. Exemplos de outras regiães reguladoras úteis incluem as derivadas de genes de levedura da via glicolítica tal como as que codificam para enolase, aldolase, fosfoglicerato-quinase e gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase; o gene de levedura para álcool desidrogenase e em geral os genes envolvidos em catabolismo, como por exemplo o gene para ajo ginase.
Um vector preferido para clonação, em levedura, do fragmeri to de ADN fundido, é o plasmídeo YEpl3 que é capaz de replicação e manutenção tanto em E. coli como em S, cerevisiae e é, portari to, conhecido como um vector vaivém . Conhecem-se e estão disponíveis muitos outros vectores de levedura. 0 AgsHB e regiães reguladoras podem ser inseridos, sequencial ou simultaneamente, num vector de levedura. A transformação com vectores plasmíd.e os contendo sequências de replicação autónomas (replicães) fun cionais em levedura terá, geralmente, como resultado a manutenção extra-cromossómica da molécula de ADN do invento como pias, mídeo. Estes replicães são bem conhecidos na arte. A transformação cam vectores plasmídeos que não contêm replicões funcionais em levedura pode ter como resultado a incorporação da molécula de ADN em ADN cromossómico.
Podem preparar-se, por técnicas conhecidas, vacinas para estimulação da protecção contra infecção por HBV em humanos, compreendendo AgsHB produzido por levedura de acordo com o invento, e um veículo adequado. A utilização de um adjuvante,
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-30tal como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio é desejável. 0 AgsHB produzido deste modo também pode ser combinado com outros imunogénios para preparar vacinas de combinação. As vacinas de HBV ou de combinação podem ser administradas, por exemplo, por via subcutânea, intravenosa ou intramuscular. 0 fragmento de ADN do invento e o AgsHB produzido por ele, também podem ser usados como sonda para detecção de HBV em amostras biológicas por técnicas de hibridação de ADN e vários imu no-ensaios.
EXPRESSÃO DE UMA MOLÉCULA DE ADN CONTENDO UFIA SEQUENCIA DE C0I DIFICAÇÃO FUNCIONAL DE ADN FUNDIDA, EM FASE, A UMA PORÇÃO DA
REGIÃO PRE 52 DE UMA SEQUENCIA DE CODIFICAÇÃO DE PROTEÍNA PRE S2-S DE HBV
Este invento também se refere a uma molécula de ADN recombinante compreendendo uma sequência de codificação funcional de ADN fundida, em fase, a uma porção da região Pre S2 de uma sequência de codificação de proteína Pre S2-S de HBV. 0 termo sequência de codificação ou região de codificação, como usado aqui, também engloba qualquer seu derivado funcional. 0 termo derivado funcional significa uma sequência de codifica ção envolvendo alterações em aminoácidos, que, quando desejado, não interfere com a formação da partícula e/ou retém imunogeni ) cidade. Estes derivados funcionais podem ser preparados por mutagénese específica de sítio, convencional. As técnicas de mutagénese específica de sítio são descritas por Botstein et al., Scíence, 229, 1193-1201 (1985). Esta fusão pode ocorrer no N-terminal da região Pre S2 ou em algum ponto da região Pre S2. Podem existir quatro tipos de fusão, i.e., no terminal 5' da região Pre S2 completa, num ponto da região Pre S2 de modo que o ADN de Pre S2 esteja a flanquear ambos os lados da sequência de codificação funcional de ADN, no terminal 5’ de uma porção truncada da região Pre S2 ou no terminal 5' da região de codificação de proteína S, de modo que a fusão não contenha ADN de Pre S2. Conhecem-se várias sequências de codj. ficação de proteína Pre S2-S e podem preparar-se ou isolar-se por técnicas conhecidas. referências citadas aqui, su67 100
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-31pga _7Numa concretização deste invento, a região reguladora ARG3 em conjunto com 18 aminoácidos da proteína de levedura para OCT foi fundida, em fase, a uma sequência de codificação de proteína Pre S2-S truncada, de modo a que a sequência fundida contenha 42 codães da sequência de codificação de proteína Pre S2-S em conjunto com a sequência completa de codificação de proteína S. Sequências de codificação funcionais de ADN, preferidas, incluem a sequência de codificação da proteína de superfície da fase de esporozoíto do ciclo de vida do Plasmodium ou qualquer seu derivado imunogénico, a sequência de codificação do gene invólucro de HIV ou qualquer seu deriva, do imunogénico, especialmente a sequência de codificação do péptido C?, do péptido 121 ou do péptido de Dreesman ou qualquer seu derivado imunogénico e a sequência de codificação de proteína Pre S2, Pre S1 ou a sequência de codificação de proteína completa Pre Sl-Pre S2-S ou qualquer seu derivado imuno génico. Por exemplo, uma sequência de codificação funcional de ADN preferida é constituída pelos 13 primeiros codães do N-terminal da sequência de codificação Pre S2 que são depois ligados aos 42 codães do C-terminal de uma região Pre S2 truncada de uma sequência de codificação de proteína Pre S2-S. 0 termo derivado imunogénico significa uma sequência que é uma versão derivada ou modificada de uma sequência que ocorre naturalmente e que retém ou melhora a actividade imunogénica protectora da sequência natural. Estes derivados imunogénicos podem ser preparados por técnicas convencionais. 0 termo sequência de codificação de proteína Pre S2, Pre SI ou completa Pre Sl-Pre S2-S, como usado aqui inclui qualquer seu derivado imunogénico.
A expressão proteína de superfície da fase esporozoíto do ciclo de vida do Plasmodium significa um antigénio de superfície, imunodominante, no esporozoíto do Plasmodium ou qual, quer seu derivado imunogénico. Proteínas de superfície da fase de esporozoíto (CS) incluem, mas não lhes estão limitadas, as proteínas que são derivadas de Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale. P. malariae, P. falciparum, P. vivax, P. ovale e P. malariae infectam os humanos.
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O| <Qi
-32A sequência de codificação da proteína CS do Plasmodium falciparum ê descrita por Dame et al., Science, 225, 593-599 (1984). A sequência de codificação da proteína CS do P, vivax é descrita por Arnot et al., Science, 230, 815-818 (1985). A sequência de codificação da proteína CS do P. knowlesi é descrita por Sharma et al., Science, 229, 779-782 (1985). Enea et al., Proc. Natl. Açad» Sei. USA, 81, 7520-7524 (1984), descrevem a sequência de codificação da proteína CS do P. cynomolgi. As sequências de codificação da proteína CS de outras espécies de Plasmodium são conhecidas (ver referências citadas anteriormente) e/ou podem ser derivadas por técnicas convencio nais.
Como usados aqui os termos CSP ou proteína CS incluem tanto a proteína natural, de comprimento total, da fase de esp rozoíto do ciclo de vida do Plasmodium como qualquer seu deriv do imunogénico. 0 termo derivado imunogénico da proteína CS do Plasmodium significa (a) qualquer derivado da proteína CS de Plasmodium que retém actividade protectora imunogénica ou (b) qualquer proteína derivada de uma sequência de codificação modificada da proteína CS do Plasmodium que retém actividade protectora imunogénica. Esses derivados imunogénicos podem ser preparados por técnicas convencionais. Alguns derivados imuno génicos, sintéticos, da sequência de codificação da proteína CS do P. falciparum são descritos em Bailou et al., Science, 228, 996-999 (1985). Ver também, Mazier et al., Science, 231, 156-159 (1986).
Conhece-se a sequência de codificação de CS para várias espécies de Plasmodium e pode preparar-se ou isolar-se por técnicas conhecidas. /Ver. p.e., Colman et al., W084-02922-A (proteína CS do £. knouilesi) e Dame et al., Science, 225, 593 (1984) (proteína CS do £. falciparum) 7» Uma molécula de ADN contendo a sequência de codificação de CS ou qualquer outra se quência de codificação funcional de ADN, fundida, em fase, a uma porção da região Pre S2 de uma sequência de codificação de proteína Pre S2-S de HBV pode ser construída por técnicas convencionais, tal como por ligação da sequência de codificação
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-33de CS, ou de qualquer outra sequência de codificação funcional de ADN, em fase, a qualquer codão da região de codificação Pre S2 de 55 aminoácidos da sequência de codificação de proteína Pre S2-S.
Preferivelmente, apôs a ligação da sequência de codifica ção de CS, ou de qualquer outra sequência de codificação funcional de ADN, permanece sequência de codificação Pre S2 sufi ciente para assegurar uma presença óptima da proteína CS ou de qualquer proteína de sequência de codificação funcional de ADN na superfície da partícula de AgsHB, i.e. deverá restar região Pre S2 suficiente para que o polipéptido codificado pela região Pre S2 actue como ponte entre o produto da sequência de codifi cação funcional de ADN da proteína e a superfície da partícula AgsHB. Tem sido referido que os 26 aminoácidos do terminal arni no da sequência de codificação Pre S2 representam um sítio de ligação dominante do anticorpo na região Pre 52. /~Ver, e.g., Milich et al., Science, 228, 1195-1199 (1985)_/· Assim, se se deseja preparar uma partícula híbrida que contém e/ou apresenta tanto os epítopos de Pre S2 como os epítopos de CS, ou de qualquer outra sequência de codificação funcional, epítopos, é preferível inserir a sequência de codificação de CS, ou qualquer outra sequência de codificação funcional de ADN, num ponto da região de codificação Pre 32 que permita a preparação de uma partícula híbrida que contém e/ou apresenta tanto os epfto pos de Pre S2 como os de CS ou qualquer outra sequência de codificação funcional de ADN, epítopos.
vector recombinante deste invento compreende uma molécu la de ADN recombinante do presente invento (i.e. uma sequência de codificação funcional de ADN fundida, em fase, a uma porção da região Pre S2 de uma sequência de codificação de proteína Pre S2-S do HBV) ligada operativamente a uma região reguladora. Este vector pode ainda compreender um replicão funcional em Ijí vedura. Com o termo replicão pretende-se dizer a região mínima de ADN que funciona para manter, estavelmente e extracromossomicamente, esse vector recombinante, num organismo hospedeiro, de levedura, transformado com esse vector. Estes repli.
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-34cões são bastante conhecidos na arte. 0 termo região reguladora significa qualquer região de ADN que regula a transcrição e tradução da sequência de codificação que se deseja exprejs sar. Estas regiães reguladoras são bastante conhecidas na arte. Um tal vector pode ser preparado por técnicas convencionais tal como por inserção, em fase, da molécula de ADN deste invento num uector que já contém um replicão e uma região requ ladora, de modo que a molécula de ADN seja ligada operativame£ te a essa região reguladora. Preferivelmente, a molécula de ADN é ligada a um vector capaz de expressão na levedura do género Saccharomyces.
Este invento também se refere a uma célula hospedeira, de levedura, transformada com esse vector recombinante e a um método para preparar esse hospedeiro transformado, compreendejg do transformar uma célula de levedura hospedeira com □ vector recombinante deste invento. Esta transformação é realizada por técnicas convencionais, como aquelas que já aqui se descre veram. As células de levedura preferidas incluem as que pertencem ao género Saccharomyces, em particular, as que pertencem às espécies Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces carlsberqensis.
Este invento refere-se também a um método para preparar uma partícula híbrida contendo proteína de AgsHB que contém e/ /ou apresenta o produto da sequência de codificação funcional de ADN, compreendendo esse método cultivar as células de levedura hospedeiras, transformadas, deste invento, em meios de cul tura apropriados e isolar a partícula do lisado ou extracto c_e lular dessa cultura de hospedeiros. As expressães presente ou contém e/ou apresenta significam que a proteína da sequê_n cia de codificação funcional de ADN está contida na partícula híbrida contendo a proteína do AgsHB de modo a permitir uma resposta imune à proteína da sequência de codificação funcional de ADN a ser produzida. Quando se deseja, embora não seja essencial, a presença da proteína da sequência de codifica ção funcional de ADN não interfere com a actividade imunogénica dos epítopos de AgsHB, obtendo-se assim uma vacina bivalen6Ί 100
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te. Preferivelmente, a proteína da sequência de codificação funcional de ADN está presente na partícula de AgsHB de modo que o número máximo quer dos epítopos da proteína de sequência de codificação funcional de ADN quer dos epítopos da proteína da sequência de codificação funcional de ADN e dos de AgsHB sejam expostos adequadamente. Meios de cultura apropriados significa meios que permitam ao hospedeiro transformado sobreviver e que permitam também que esse hospedeiro expresse numa quantidade recuperável, o produto proteico híbrido da sequência de codificação funcional de ADN sequência de codificação de proteína Pre S2-S, do vector com o qual é tranformado. E evidente para um especialista que os meios de cultura apropriados dependerão da célula hospedeira usada. 0 isolamento da partícula híbrida deste invento, de um lisado ou extracto celular dessa cultura de hospedeiros, é realizado por técnicas convencionais de isolamento de proteínas.
Este invento também se refere a uma vacina contendo as partículas híbridas deste invento. Esta vacina conterá uma quantidade imuno-protectora das partículas híbridas deste invento e é preparada por técnicas convencionais. Imuno-protectora significa que são administradas partículas híbridas deste invento, suficientes para induzir uma resposta de anticorpos, protectora, suficiente, contra o agente contra o qual se pretende protecção,sem efeitos secundários graves. Preferi, velmente, a vacina deste invento compreende a micela deste invento, i.e. uma micela compreendendo a partícula deste invento e poli-sorbato. A quantidade preferida de poli-sorbato que a referida micela compreende é de 5-50^g de poli-sorbato por 100yAg de proteína. A micela pode ser preparada pelo método descrito na Publicação do Pedido de Patente Europeia n^. 0 199 69Θ.
Na vacina do invento, pode usar-se directamente uma solu ção aquosa das partículas híbridas do invento, preferivelmente tamponada a pH fisiológico. Alternativamente, a partícula pode ser misturada ou adsorvida com qualquer dos vários adjuvantes conhecidos. Estes adjuvantes incluem, entre outros, hidróxido de alumínio.
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-36A preparação de vacina é descrita na generalidade em Neui Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A., 1978.
A quantidade da partícula híbrida deste invento presente em cada dose de vacina é seleccionada como a quantidade que iri duz uma resposta imuno-protectora sem os efeitos secundários adversos significativos das vacinas típicas. Esta quantidade variará com o imunogénio específico utilizado e com o facto de a vacina ter adjuvantes ou não. Geralmente, é de esperar que cada dose compreenda 1-1000^ug de proteína, preferivelmente
1-200yug. A quantidade óptima para uma vacina particular pode ser determinada por estudos padrão que envolvem a observação de títulos de anticorpos e outras respostas em pacientes. Depois de uma vacinação inicial, os pacientes receberão, de preferência, um reforço passadas cerca de 4 semanas, seguido de reforços repetidos de seis em seis meses durante o período de tempo em que o risco de infecção existir.
A resposta imune à partícula híbrida deste invento pode ser aumentada pela utilização de adjuvante, tal como, mas não limitado a, hidróxido de alumínio.
Para exemplificar a partícula híbrida deste invento, uma sequência de ADN com 64 codães codificando para o epítopo rep.e titivo da proteína CS do Plasmodium falciparum e uma sequência de codificação de CS com oito codães ver Dame et al., Science, 225, 593-599 (1984)_7 foram, cada uma delas, inserida, em fase, numa porção da sequência de codificação Pre S2 num vector de expressão de levedura compreendendo um replicão, a sequência de codificação de proteína Pre S2-S e uma região reguladora apropriada. Ambos os vectores de expressão, i.e. um contendo a sequência de CS de 64 codães e outro contendo a sequência de CS de 8 codães, foram, cada um deles, introduzidos em células de levedura hospedeiras e analisaram-se extractos destas células transformadas para determinação da presença de epítopos de AgsHB e de epítopos de CS na mesma molécula.
0s resultados obtidos em análises de immunoblot usando
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-37um conjunto de cinco anticorpos monoclonais específicos para CS e um anticorpo monoclonal criado contra AgsHB derivado de levedura purificada mostram que se obteve uma proteína híbrida com 37 000 quilodalton (kd) dos lisados de levedura transfor mada com o vector contendo a sequência de codificação de CS com 64 codões fundida em fase com a sequência de codificação de proteína Pre S2-S e que se obteve uma proteína híbrida de 30 000 kd dos lisados de levedura transformada com o vector contendo a sequência de codificação de CS com 8 codães fundida em fase com a sequência de codificação de proteína Pre S2-S. A reunião destas proteínas em estruturas do tipo partícula de AgsHB foi demonstrada por análises por gradientes de CsCl e de sacarose, cromatografia líquida de pressão elevada (HPLC) e mi croscopia electrónica. A presença dos epítopos de CS no exterior destas partículas foi mostrada pela acessibilidade do ep.í topo de CS pelos anticorpos específicos para CS num ensaio ELISA. A presença de epítopos de AgsHB nc exterior destas pa.r tículas foi demonstrada por radio-imuno-ensaio (AUSRIA II, Abbott) ou por ensaio ELISA (Enzygnost-HBsAg, Behringiuerke).
NOVAS SEQUÊNCIAS DE CODIFICAÇÃO DE PROTEÍNA PRE S2 E PRE S2-S
As novas sequências de codificação de proteína Pre S2 e Pre S2-S de HBV, deste invento, são de um subtipo adw de HBV que foi isolado do plasmídeo pRIT10616. As expressães sequência de codificação ou região de codificação, como aqui usadas, englobam também qualquer seu derivado funcional. Com a expressão derivado funcional pretende-se dizer uma sequêjn cia de codificação com alteraçães nos aminoácidos que, quando apropriado, não interfere com a formação de partículas e/ou que retém imunogenicidade quando essa retenção é desejável. Estes derivados funcionais podem ser preparados por mutagénese específica de sítio, convencional, tal como pelo método de Botstein et al., Science, 229, 1193-1201 (1985). Estas sequêjn cias de codificação de proteína Pre S2 e Pre S2-S podem ser re cuperadas, por procedimentos convencionais de ADN recombinante, do plasmídeo pRIT10616 que foi depositado(como C600 da estirpe E« coli K12) de acordo com o Tratado de Budapeste na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, em 2 de Junho de
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-381982, sob o número de acesso ATCC 38131. A região Pre S2 destas novas sequências de codificação de proteína codificam para a seguinte sequência de aminoácidos:
-55 -50
Met-Gln-T rp-Asn-S er-T hr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp-40 -30 Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-20
Ser-Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile-10 Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn.
Esta região também pode ser obtida por síntese convencio nal de oligonucleótidos sintéticos. Um derivado funcional pre ferido da sequência de codificação Pre S2-S deste invento é um derivado em que o aminoácido alanina (GCT) em -45 seja modificado via mutagénese específica de sítio numa treonina (ACT). Este derivado funcional tem como resultado um nível de expressão pelo Saccharomyces cerevesiae transformado com ele, duas vezes maior, comparado com o da sequência de codificação não modificada deste invento.
Um vector recombinante deste invento compreende a sequêri cia de codificação de proteína Pre S2 ou Pre-S2-S, do presente invento, ligada operativamente a uma região reguladora. Esse vector pode ainda conter um replicão dependendo da preferência e/ou do hospedeiro usado. 0 termo replicão significa a região mínima de ADN que funciona para manter , estável e extracromossomicamente, esse vector recombinante num organismo hospedeiro, eucariético ou procariético, transformado com esse ve£ tor. Estes replicães são bastante conhecidos na arte. A expressão região reguladora significa qualquer sequência de ADN que contenha uma região promotora e outras sequências necessárias à transcrição de uma sequência de codificação. Estas regiães reguladoras são bastante conhecidas na arte. Um tal vector pode ser preparado por técnicas convencionais, tal como inserindo a sequência de codificação de proteína Pre S2 ou Pre S2-S deste invento, em fase, num vector que já contém
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-39um replicão e uma região reguladora, de modo que a molécula de ADN seja ligada operativamente a essa região reguladora. Preferivelmente, a molécula de ADN é ligada a um vector capaz de expressão em levedura, tal como em Saccharomyces.
Este invento também se refere a uma célula hospedeira transformada com esse vector recombinante e a um método de pre paração desse hospedeiro transformado. Essa transformação é realizada por técnicas convencionais. As células hospedeiras podem ser procarióticas ou eucarióticas. As células hospedeiras preferidas são eucarióticas, especialmente, células de levedura e incluem as que pertencem ao género Saccharomyces, em particular, as que pertencem às espécies Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces carlsberqensis.
Este invento também se refere a um método de preparação de uma proteína codificada pela sequência de codificação de proteína Pre Ξ2 ou Pre S2-S, deste invento, método que compreende cultivar as células hospedeiras transformadas deste inven to em meios de cultura apropriados, e isolar a proteína de flui do da cultura de células hospedeiras ou do lisado ou extracto celular dessa cultura de hospedeiros, dependendo da capacidade das células hospedeiras segregarem essa proteína. Por meios de cultura apropriados entendem-se os meios que permitirão ao hospedeiro transformado deste invento sobreviver e que permiti rão também que esse hospedeiro expresse a sequência de codificação de proteína Pre 52 ou Pre S2-S deste invento em quantida de recuperável. E evidente para um especialista que os meios de cultura apropriados dependerão da célula hospedeira usada. 0 isolamento da proteína Pre S2-S deste invento de um lisado de cultura,ou do fluido de cultura,desse hospedeiro é realizado por técnicas convencionais de isolamento de proteína. A proteína preparada pelo método deste invento pode ser glicosila da dependendo da capacidade da célula hospedeira para □ fazer. Se se deseja uma proteína desglicosilada, a proteína deste invento deverá ser preparada utilizando uma célula hospedeira in capaz de efectuar essa glicosilação ou empregando mutagénese convencional específica de sítio na sequência de codificação da proteína antes de realizar o processo deste invento, tal c_o
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-40mo pelo método de Botstein et al., Science, 229, 1193-1201 (1985).
Este invento refere-se também a uma vacina contendo uma quantidade imuno-protectora de proteína Pre 52 ou Pre S2-S deste invento. Esta vacina pode ser preparada por técnicas convencionais.
Este invento refere-se também a um método de preparação de uma partícula híbrida contendo proteína de AgsHB que compre ende proteína codificada pela sequência de codificação de proteína Pre S2-S, deste invento, método que compreende cultivar as células hospedeiras eucarióticas, transformadas, deste invento em meios de cultura apropriados e isolar a partícula do fluido de cultura das células hospedeiras ou de um lisado ou extracto celular dessa cultura de hospedeiros, dependendo da capacidade das células hospedeiras transformadas segregarem es. sas partículas. Por meios de cultura apropriados entendem-se os meios que permitem que os hospedeiros transformados des. te invento sobrevivam e que permitem também que esse hospedeiro expresse a sequência de codificação de proteína Pre S2-S, deste invento, sob a forma de partícula e em quantidade recupe.
z rável. E evidente para um especialista que os meios de cultura apropriados dependerão da célula hospedeira usada. 0 isolameri to da partícula híbrida deste invento, de um lisado de cultura ou do fluido da cultura desse hospedeiro é realizado por técni cas de isolamento convencionais.
Este invento também se refere a uma vacina contendo as partículas híbridas deste invento. Esta vacina conterá uma quantidade imuno-protectora das partículas híbridas deste invento e é preparada por técnicas convencionais. Preferivelmeri te, a vacina deste invento compreende a micela deste invento,
i.e. uma micela compreendendo a partícula deste invento e poli-sorbato. A quantidade preferida de poli-sorbato incluída nessa micela é de 5-50de poli-sorbato por lOO^g de proteí. na, A micela pode ser preparada pelo método descrito na Publ_i cação do Pedido de Patente Europeia NS. 0 199 698.
Na vacina do invento, pode usar-se directamente uma solu.
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-41ção aquosa da proteína Pre S2-S ou da partícula híbrida do invento, preferivelmente tamponada a pH fisiológico. Alternativamente, a proteína ou partícula podem ser misturadas ou adso_r vidas com qualquer dos vários adjuvantes conhecidos. Esses adjuvantes incluem, entre outros, hidróxido de alumínio.
A preparação da vacina é descrita na generalidade em Neiu Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A., 197Θ. A eri capsulação em lipossomas ê descrita por exemplo por Fullerton, Patente dos E.U. 4 235 877. A conjugação de proteínas com macromoléculas é descrita por exemplo por Likhite, Patente dos E.U. 4 372 945 e por Armor et al., Patente dos E.U. 4 474 757.
A quantidade de proteína Pre S2-S ou de partícula híbrida deste invento, contida em cada dose de vacina é seleccionada como a quantidade que induz uma resposta imuno-protectora sem efeitos secundários adversos, significativos em vacinas típicas. Essa quantidade variará com o imunogénio específico usado e com o facto de a vacina ser adjuvada ou não. Geralmeji te, é de esperar que cada dose compreenda l-lOOO^g de proteína, preferivelmente 1-200^g. A quantidade óptima para uma \ja cina particular pode ser determinada por estudos padrão envolvendo a observação em pacientes de títulos de anticorpos e outras respostas. Depois de uma vacinação inicial, os pacientes receberão, de preferência, um reforço passadas cerca de 4 sema nas, seguido de reforços repetidos de seis em seis meses dura_n te o período em que o risco de infecção existir.
A resposta imune à proteína Pre S2-S ou à partícula híbrida deste invento é aumentada pelo uso de adjuvante, como por exemplo, mas não só de hidróxido de alumínio.
NOVA SEQUÊNCIA DE CODIFICAÇÃO DE PROTEÍNA PRE SI
A nova sequência de codificação de proteína Pre SI de HBV deste invento, é de um subtipo adu/ de HBV que foi isolado de plasmídeo pRIT10616. 0 termo sequência de codificação ou região de codificação como usado aqui engloba também qualquer seu derivado funcional. Pelo termo derivado funcional enten
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-42de-se uma sequência de codificação, envolvendo alterações de aminoácidos que, quando desejado, não interfere com a formação da partícula e/ou que retém imunogenicidade. Esses derivados funcionais podem ser preparados por mutagenese convencional es. pecífica de sítio, tal como pelo método de Botstein et al., Science, 229, 1193-1201 (1985). Essa sequência de codificação de proteína Pre SI pode ser recuperada, por procedimentos convencionais de ADN recombinante, do plasmídeo pRIT10616 que foi depositado(como 0600 da estirpe E. coli K12) de acordo com o Tra tado de Budapeste na American Type Culture Collection, Rockvil le, Maryland, em 2 de Junho de 1982 sob o número de acesso mTCC 38131. A região Pre S1 codifica para a seguinte sequência de aminoácidos:
-163
ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT
Met Gly Thr Asn Leu Ser Vai Pro Asn Pro
GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT
Gly Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro
GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT
Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp
TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG
T rp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His T rp
CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA
Pro Ala Ala Asn Gin Vai Gly Vai Gly Ala
TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC
Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly
GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG
Gly Ile Leu Gly T rp Ser Pro Gin Ala Gin
GGC ATA TTG ACC A CA GTG TCA ACA ATT CCT
Gly Ile Leu Thr Thr Vai Ser Thr Ile Pro
CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA
Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gin Ser Gly
AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA
A rg Gin Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
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-43AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC Arg Asp Ser His Pro Gin Ala
Esta região também pode ser obtida por síntese convencio nal de oligonucleétidos sintéticos.
Um vector recombinante deste invento compreende uma sequência de codificação da proteína Pre Sl, do presente invento, ligada operativamente a uma região reguladora e pode compreender, adicionalmente, um replicão, dependendo da preferência e/ /ou do hospedeiro a ser usado. 0 termo replicão significa a região mínima de ADN que funciona de modo a manter, estável e extracromossomicamente, esse vector recombinante, num organismo eucariótico ou procariótico transformado com esse vector. Estes replicões são bastante conhecidos na arte. A expressão região reguladora significa uma sequência de ADN que contém uma região promotora e outras sequências necessárias à transcrição de uma sequência de codificação. Estas regiães reguladoras são bastante conhecidas na arte. Esse vector pode ser preparado por técnicas convencionais tal como p.e. inserindo a sequência de codificação de proteína Pre Sl, deste invento, em fase, num vector que já contém um replicão e região reguladora, de modo que a molécula de ADN seja ligada operativamente a essa região reguladora. Preferivelmente, a molécula de ADN é ligada a um vector capaz de expressão em levedura, tal como em Saccharomyces.
Este invento também se refere a uma célula hospedeira transformada com esse vector recombinante e a um método para preparar esse hospedeiro transformado. Essa transformação é realizada por técnicas convencionais. As células hospedeiras podem ser procariéticas ou eucarióticas. As células hospedeiras preferidas são eucarióticas, especialmente células de levje dura e incluem as pertencentes ao género Saccharomyces, em particular, as que pertencem à espécies Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces carlsberqensis.
Este invento também se refere a um método para preparar proteína codificada pela sequência de codificação de proteína
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-44Pre Sl, deste invento, método que compreende cultivar células hospedeiras transformadas deste invento em meios de cultura apropriados e isolar a proteína do fluido da cultura de células hospedeiras ou de um lisado ou extracto celular dessa cultura de hospedeiros dependendo da capacidade das células hospedeiras transformadas segregarem essa proteína. Meios de cultura apropriados designa os meios que permitirão ao hospedeiro transformado deste invento sobreviver e que permitirão também a esse hospedeiro expressar a sequência de codificação de proteína Pre Sl deste invento em quantidade recuperável. Será evidente para um especialista que os meios de cultura apropria dos dependerão da célula hospedeira usada. 0 isolamento da proteína Pre Sl, deste invento, de um lisado de cultura,ou do fluido de cultura,desse hospedeiro é realizado por técnicas de isolamento convencionais. A proteína preparada pelo método des. te invento pode ser glicosilada dependendo da capacidade da cé lula hospedeira o fazer. Se se deseja uma proteína desglicosi lada, deve preparar-se a proteína deste invento utilizando uma célula hospedeira incapaz de efectuar essa glicosilação ou usajn do mutagenése convencional específica de sítio na sequência de codificação da proteína, antes de realizar o processo deste i_n vento. A mutagénese específica de sítio é realizada por exemplo pelo método de Botstein et al., Science, 229, 1193-1201 (1985).
Este invento também se refere a uma vacina contende a pro teína Pre Sl deste invento. Esta vacina conterá uma quantidade imuno-protectora da proteína Pre Sl deste invento e é prepja rada por técnicas convencionais.
Na vacina do invento, pode usar-se directamente uma solu ção aquosa da proteína Pre Sl do invento, preferivelmente, tam ponada a pH fisiológico. Alternativamente a proteína Pre Sl pode ser misturada ou adsorvida em qualquer das vários adjuvajn tes conhecidos. Estes adjuvantes incluem, entre outros, hidr.0 xido de alumínio.
A preparação de vacina é descrita na generalidade em Neiu Trends and Developments in Vaccines, editado por l/oller et al.,
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-45University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A., 1978, A encapsulação em lipossomas é descrita, por exemplo , por Fullerton, Patente dos E.U. 4 235 877. A conjunção de proteínas com macromoléculas é descrita por exemplo por Likhite, Patente dos E.U. 4 372 945 e por Armor et al., Patente dos E.U.
474 757.
A quantidade da proteína Pre SI do presente invento presente em cada dose de vacina, é seleccionada como a quantidade que induz uma resposta imuno-protectora sem efeitos secundários adversos, significativos em vacinas típicas. Esta quantida | de variará com o imunogénio específico usado e com o facto de a vacina ser adjuvada ou não. Geralmente, é de esperar que ca da dose compreenda 1-1000^ug de proteína, preferivelmente 1-200 yug. A quantidade óptima para uma vacina particular pode ser determinada por estudos padrão envolvendo a observação de títulos de anticorpos e de outras respostas em pacientes. Depois de uma vacinação inicial, os pacientes receberão, de preferência, um reforço passadas cerca de 4 semanas, seguido de re_ forços repetidos de seis em seis meses durante o período em que existir risco de infecção. A resposta imune à proteína Pre SI deste invento é aumentada por utilização de adjuvante, tal como, mas não só, hidróxido de alumínio.
) NOVA SEQUENCIA DE CODIFICAÇÃO DE PROTEÍNA PRE Sl-PRE 52-S
Este invento também se refere a uma sequência de codificação de proteína Pre Sl-Pre S2-S de HBV, cuja porção Pre 51-Pre S2 compreende a seguinte sequência de aminoácidos:
REGIÃO PRE-S1
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ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG
Met Gly Thr Asn Leu Ser Vai Pro Asn Pro Leu
GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT
Gly Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro
GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT
Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp
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,.,^β
TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG
T rp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His T rp
CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA
Pro Ala Ala Asn Gin Vai Gly Vai Gly Ala
TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC
Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly
GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG
Gly Ile Leu Gly T rp Ser Pro Gin Ala Gin
GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT
Gly Ile Leu Thr Thr Vai Ser Thr Ile Pro
CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA
Pro Pro Ala Ser Thr Asn A rg Gin Ser Gly
AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA
Arg Gin Pro Thr Pro Ue Ser Pro Pro Leu
A GA GAC AGT CAT CCT CAG GCC
A rg Asp Ser His Pro Gin Ala
REGIÃO PRE-S2
ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAA
Met Gin T rp Asn Ser Thr Ala Phe His Gin
GCT CTG CAG GAT CCC AGA GTC AGG GGT CTG
Ala Leu Gin Asp Pro Arg Vai Arg Gly Leu
TAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGA
Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly
ACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCT
Thr Vai Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser
CAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGG
His Ile Ser Ser Ser Ser Ala Arg Thr Gly
GAC CCT GTG ACG AAC
Asp Pro Vai Thr Asn
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-47A nova sequência de codificação de proteína Pre Sl-Pre S2-S do HBV, deste invento, é de um subtipo adiu de HBV que foi isolado de plasmídeo pRIT10616 que, como se disse acima, está disponível na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, sob o número de acesso ATCC 38131. A expressão sequência de codificação ou região de codificação, como aqui usada, engloba também qualquer seu derivado funcional. A expressão derivado funcional designa uma sequência de codifica ção com alterações de aminoácidos que, quando apropriado, não interfere com a formação de partículas e/ou retém imunogenicidade quando essa retenção é desejável. Estes derivados funcio nais podem ser preparados por mutagénese convencional específi ca de sítio, p.e., pelo método de Botstein et al., Science, 229, 1193-1201 (1985).
Um vector recombinante deste invento compreende a sequêjn cia de codificação de proteína Pre Sl-Pre S2-S, do presente ijn vento, ligada operativamente a uma região reguladora. Este vector pode ainda conter um replicão, dependendo da preferência e/ou do hospedeiro a ser usado. 0 termo replicão significa a região de ADN mínima que funciona de modo a manter, estável e extracromossomicamente, esse vector recombinante num organismo hospedeiro, eucariético ou procariótico, transformado com esse vector. Estes replicões são bastante conhecidos na arte. A expressão região reguladora significa qualquer sequência de ADN que contém uma região promotora e outras sequências necessárias à transcrição de uma sequência de codificação que regula a transcrição de uma sequência de codificação de gene estrutural. Estas regiões reguladoras são bastante co nhecidas na arte. Esse vector pode ser preparado por técnicas convencionais, p.e., inserindo a sequência de codificação de proteína Pre Sl-Pre S2-S deste invento, em fase, num vector que já contém um replicão e região reguladora, de modo que a molécula de ADN seja ligada operativamente a essa região reguladora. Preferivelmente, a molécula de ADN é ligada a um vector capaz de expressão em levedura, tal como em Saccharomyces.
Este invento também se refere a uma célula hospedeira transformada com esse vector recombinante e a um método de pre
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-48paração desse hospedeiro transformado. Esta transformação é realizada por técnicas convencionais. As células hospedeiras podem ser procarióticas ou eucarióticas. As células hospedej. ras preferidas são eucarióticas, especialmente células de leve; dura e incluem as pertencentes ao género Saccharomyces, em par; ticular as que pertencem às espécies Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces carlsberqensis.
Este invento também se refere a um método de preparação de uma proteína codificada pela sequência de codificação de proteína Pre Sl-Pre S2-S deste invento, método que compreende cultivar células hospedeiras transformadas deste invento, em meios de cultura apropriados, e isolar a proteína do fluido de cultura das células hospedeiras ou de um lisado ou extracto celular dessa cultura de hospedeiros, dependendo da capacidade da célula hospedeira segregar essa proteína. Por meios de cul tura apropriados entendem-se os meios que permitirão, ao hospedeiro transformado deste invento, sobreviver e que permitirão também que esse hospedeiro expresse o produto da sequência de codificação de proteína Pre-Sl Pre S2-S deste invento em quantidade recuperável. Será evidente para o especialista que os meios de cultura apropriados dependem da célula hospedeira usada. D isolamento da proteína Pre Sl-Pre S2-S deste invento de um lisado de cultura,ou do fluido de cultura, desse hospedei ro é realizado por técnicas convencionais de isolamento de pro teína. A proteína preparada pelo método deste invento pode ser glicosilada dependendo da capacidade da célula hospedeira para o fazer. Se se deseja uma proteína desglicosilada, a pro teína deste invento deve ser preparada utilizando uma célula hospedeira incapaz de efectuar essa glicosilação ou usando mutagénese convencional específica de sítio na sequência de codi. ficação da proteína, antes de realizar o processo deste invento, p.e. pelo método de Botstein et al., Science, 229, 1193-1201 (1985). A sequência de codificação Pre Sl-Pre S2-S deste invento será expressa como uma proteína glicosilada por uma célula de levedura ou de mamífero, hospedeira, transformada com ela. A sequência de codificação Pre Sl-Pre S2-S deste invento será expressa como uma proteína N-miristilada por uma cé
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-49lula de levedura hospedeira, transformada com ela.
Este invento também se refere a uma vacina que contém uma quantidade imuno-protectora de proteína Pre Sl-Pre S2-S deste invento. Esta vacina pode ser preparada por técnicas convencionais .
Este invento também se refere a um método de preparação de uma partícula híbrida contendo proteína de AgsHB que compre, ende proteína codificada pela sequência de codificação de proteína Pre Sl-Pre S2-S deste invento, método que compreende cul tivar as células hospedeiras, eucarióticas, transformadas deste invento em meios de cultura apropriados e isolar a partícula do fluído de cultura de células hospedeiras ou de um lisado ou extracto celular dessa cultura de hospedeiros, dependendo da capacidade das células hospedeiras transformadas segregarem es. sa proteína. Por meios de cultura apropriados entendem-se os meios que permitirão ao hospedeiro transformado deste invejn to sobreviver e que permitirão também que esse hospedeiro expresse a sequência de codificação de proteína Pre Sl-Pre S2-S deste invento sob a forma de partícula e em quantidade recuperável. Será evidente para o especialista que os meios de cultura apropriados dependerão da célula hospedeira usada. 0 is£ lamento da partícula deste invento, de um lisado de cultura, ou do fluído da cultura, desse hospedeiro é realizado por técnicas de isolamento convencionais.
Este invento também se refere a uma vacina contendo as partículas híbridas deste invento. Esta vacina conterá uma quantidade imuno-protectora das partículas híbridas deste invento e é preparada por técnicas convencionais. Preferivelmeri te, a vacina deste invento compreende a micela deste invento,
i.e. uma micela compreendendo a partícula deste invento e poli, -sorbato. A quantidade preferida de poli-sorbato compreendida nessa micela é de 5-50^g de poli-sorbato por 100^g de prote_í na. A micela pode ser preparada pelo método descrito na Publ^ cação do Pedido de Patente Europeia N2. 0 199 698.
Na vacina do invento pode usar-se directamente uma solução aquosa da proteína Pre Sl-Pre S2-S ou da partícula hibrida
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-50deste invento, preferivelmente tamponada a pH fisiológico. AjL ternativamente, a proteína ou partícula podem ser misturadas ou adsorvidas em qualquer dos vários adjuvantes conhecidos. Es tes adjuvantes incluem, entre outros, hidróxido de alumínio.
A preparação da vacina á descrita na generalidade em Neiu Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A., 1978. A e_n capsulação em lipossomas é descrita, por exemplo, por Fullerton, Patente dos E.U. 4 235 877. A conjugação de proteínas com macromoléculas á descrita, por exemplo por Likhite, Patente dos | E.U. 4 372 945 e por Armor et al., Patente dos E. U. 4 474 757.
A quantidade da proteína Pre Sl-Pre S2-S ou da partícula híbrida do presente invento, presente em cada dose de vacina é seleccionada como sendo uma quantidade que induz uma resposta imuno-protectora sem efeitos secundários adversos, significati vos em vacinas típicas. Esta quantidade variará com o imunogé. nio específico a usar e com □ facto da vacina ser adjuvada ou não. Geralmente, é de esperar que cada dose compreenda 1-1000 ^g de proteína, preferivelmente 1-200 y^g. A quantidade óptima para uma vacina particular pode ser determinada por estudos pa ârão envolvendo observação de títulos de anticorpos e outras res. postas em pacientes. Depois de uma vacinação inicial, os paci.
| entes receberão de preferência um reforço, passadas cerca de 4 semanas, seguido de reforços repetidos de seis em seis meses durante o período em que exista risco de infecção.
A resposta imune à proteína Pre Sl-Pre S2-S ou à partícu la híbrida deste invento é aumentada pelo uso de adjuvante, p.e., mas não só, hidróxido de alumínio.
EXPRESSÃO DE PROTEÍNA PRES1-PRES2-S EM LEVEDURA
Este invento também se refere a um vector de ADN recombi nante compreendendo uma sequência de codificação de proteína PreSl-PreS2-S completa, ligada operativamente a uma sequência de controlo de expressão. 0 termo sequência de codificação ou região de codificação como aqui utilizado engloba também qualquer seu derivado funcional. Por derivado funcional en67 100
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-51tende-se uma sequência de codificação com alterações de aminoácidos que, quando apropriado, não interfere com a formação de partícula e/ou que retém imunogenicidade quando se deseja essa retenção. Estes derivados funcionais podem ser preparados por mutagenese convencional específica de sítio tal como pelo méto do de Botstein et al., Science, 229, 1193-1201 (1985). Aquele vector pode ainda compreender um replicão, dependendo da prefe rência e/ou do hospedeiro a ser usado. Preferivelmente, a sequência de codificação de proteína Pre Sl-Pre S2-S usada é a deste invento.
termo replicão significa a região de ADN mínima que funciona para manter, estável e extracromossomicamente esse vector recombinante num organismo de levedura hospedeiro trans formado com o vector deste invento. Estes replicões são bastari te conhecidos na arte. Por região reguladora entende-se qual, quer sequência de ADN que contenha uma região promotora e outras sequências necessárias à transcrição de uma sequência de codificação que regula a transcrição de uma sequência de codificação de gene estrutural. Estas regiões reguladoras são ba.s tante conhecidas na arte. Esse vector pode ser preparado por técnicas convencionais, p.e., inserindo uma sequência de codificação de proteína PreSl-PreS2-S, em fase, num vector que já contém um replicão e região reguladora, de modo que a molécula de ADN seja ligada operativamente a essa região reguladora. Preferivelmente, a molécula de ADN é ligada a um vector capaz de expressão em levedura, género Saccharomyces. Preferivelmeri te, a sequência de codificação de proteína PreSl-PreS2-S conti. da no vector deste invento é a sequência de codificação de prjo teína PreSl-PreS2-S deste invento descrita acima. Estes vecto res são também úteis para a inserção, aí, de sequências de codificação funcionais de ADN para permitir a expressão da resul tante sequência de codificação PreSl - sequência de codificação, funcional, de ADN - de proteína PreS2-S compreendida por esse vector. Assim, este invento também se refere a uma molécula de ADN recombinante compreendendo uma sequência de codifi cação, funcional, de ADN fundida, em fase, na região PreSl da sequência de codificação de proteína PreSl-Pre S2-S, de modo
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-52que a sequência funcional de ADN ou forma uma inserção na região Pre SI ou substitui parte da região Pre SI e possivelmente uma porção da região Pre S2, e a um vector compreendendo es. sa molécula de ADN recombinante. Ver, por exemplo, Exemplo 21A, infra. Por sequência de codificação, funcional, de ADN entende-se uma sequência de codificação de ADN que,quando fundida, em fase, numa região Pre SI da sequência de codificação de proteína Pre Sl-Pre S2-S, não está envolvida e não interfere com a reunião da partícula de AgsHB. As sequências de codificação, funcional, de ADN incluem, mas não lhes estão limitadas, a sequência de codificação de CS de Plasmodium ou qualquer seu derivado imunogénico, a sequência de codificação do gene de in vólucro de HIV ou qualquer seu derivado imunogénico, especialmente a sequência de codificação do péptido C?, do péptido 121 ou do péptido de Dreesman como se exemplificará em seguida ou sequências de codificação para péptidos de interesse de outros vírus, especialmente as sequências para proteínas de revestimento ou para proteínas de superfície de outros parasitas.
Este invento também se refere a uma célula hospedeira, de levedura, transformada com esse vector recombinante e a um método para preparar esse hospedeiro transformado. Esta trans. formação é realizada por técnicas convencionais. As células de levedura são as preferidas e incluem as pertencentes ao género Saccharomyces, em particular as que pertencem à espécie Saccharomyces cerevisiae.
Este invento também se refere a um método de preparação de uma proteína codificada por uma sequência de codificação de proteína Pre Sl-Pre S2-S ou por sequência de codificação de proteína Pre SI - sequência de codificação, funcional, de ADN - Pre S2-S, método que compreende cultivar as células hospedei, ras transformadas deste invento, em meios de cultura apropriados, e isolar a proteína do fluido da cultura de células hospe. deiras ou de um lisado ou extracto celular dessa cultura de hospedeiros, consoante a capacidade das células hospedeiras se gregarem essa proteína. Meios de cultura apropriados são os meios que permitirão que o hospedeiro transformado deste inverj
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-53to sobreviva e que permitirão que esse hospedeiro expresse um produto da sequência de codificação de proteína Pre Sl-Pre S2-S ou da sequência de codificação de proteína Pre 51 - sequência de codificação, funcional, de ADN - Pre S2-S em quantidade recuperável. Será evidente para o especialista que os meios de cultura apropriados dependerão da célula hospedeira usada. 0 isolamento da proteína Pre Sl-Pre S2-S ou da proteína Pre S1 - sequência de codificação, funcional, de ADN - Pre S2-S de um lisado celular ou do fluido de cultura dessa cultura de hospedeiros é realizado por técnicas convencionais de isolamento de proteínas. A proteína preparada pelo método deste invento pode ser glicosilada dependendo da capacidade das células para o fazer. Se se deseja uma proteína desglicosilada, a proteína deste invento deverá ser preparada utilizando uma célula hospj? deira incapaz de efectuar essa glicosilação, ou usando mutagénese convencional específica de sítio na sequência de codifica ção da proteína antes de realizar o processo deste invento, p.e. pelo método de Botstein et al., Science, 229, 1193-1201 (1985).
Este invento também se refere a uma vacina contendo uma quantidade imunoprotectora de proteína Pre Sl-Pre S2-S ou proteína Pre SI - sequência de codificação, funcional de ADN - Pre S2-S produzida pelo método deste invento. Esta vacina pode ser preparada por técnicas convencionais.
Este invento também se refere a um método de preparação de uma partícula híbrida que compreende proteína codificada p.e la sequência de codificação de proteína Pre Sl-Pre S2-S ou sequência de codificação de proteína Pre S1 - sequência de codifi cação, funcional, de ADN - Pre S2-S, método que compreende cul tivar células de levedura hospedeiras, transformadas deste invento, em meios de cultura apropriados, e isolar a partícula do fluído de cultura de células hospedeiras ou de um lisado ou extracto celular dessa cultura de hospedeiros, consoante a capacidade das células hospedeiras transformadas segregarem essas partículas. Por meios de cultura apropriados entendem-se os meios que permitirão ao hospedeiro transformado sobreviver e
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-54que permitirão também qua esse hospedeiro expresse a sequência de codificação de proteína Pre Sl-Pre S2-S ou sequência de codificação de proteína Pre SI - sequência de codificação, funcional, de ADN - Pre S2-S sob forma de partícula em quantidade recuperável. Será evidente para o especialista que os meios de cultura apropriados dependerão da célula hospedeira usada. 0 isolamento da partícula deste invento de um lisado de cultura, ou do fluido da cultura, desse hospedeiro é realizado por técni cas de isolamento convencionais.
Este invento também se refere a uma vacina que contém as partículas deste invento. Esta vacina conterá uma quantidade imuno-protectora das partículas deste invento e é preparada por técnicas convencionais. Preferivelmente, a vacina deste in vento compreende a micela deste invento, i.e. uma micela compre endendo a partícula deste invento e poli-sorbato. A quantidade preferida de poli-sorbato compreendida nessa micela é de 5-50 y^g de poli-sorbato por 100 de proteína. A micela pode ser pre parada pelo método descrito na Publicação do Pedido de Patente Europeia N2. 0 199 698.
Na vacina do invento, pode usar-se directamente uma solu ção aquosa da proteína Pre Sl-Pre S2-S ou proteína Pre SI - se. quência de codificação, funcional, de ADN - Pre S2-S ou da pa.r tícula do invento, preferivelmente tamponada a pH fisiológico. Alternativamente, a partícula de proteína pode ser misturada ou adsorvida em qualquer dos vários adjuvantes conhecidos. Es. tes adjuvantes incluem, entre outros, hidróxido de alumínio.
A preparação da vacina é descrita na generalidade em Neuj Trends and Developments in l/accines, editado por Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A., 1978. A encapsulação em lipossomas é descrita, por exemplo, por Fullex ton, Patente dos E.U. 4 235 877. A conjugação de proteínas com macromoléculas é descrita, por exemplo, por Likhite, Pate£ te dos E.U. 4 372 945 e por Armor et al., Patente dos E.U.
474 757.
A quantidade da proteína Pre Sl-Pre S2-S ou da proteína Pre SI - sequência de codificação, funcional, de ADN - Pre S2-S
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-55□u da partícula do presente invento, presente em cada dose de vacina é seleccionada como sendo a quantidade que induz uma res. posta imuno-protectora sem efeitos secundários adversos, significativos em vacinas típicas. Esta quantidade variará com o imunogénio específico usado e com o facto da vacina ser adjuv.a da ou não. Geralmente, é de esperar que cada dose compreenda
1-1000 de proteína, preferivelmente 1-200 y*g. A quantidade óptima para uma vacina particular pode ser determinada por estudos padrão envolvendo observação de títulos de anticorpos e outras respostas em pacientes. Depois de uma vacinação inicial, os pacientes receberão, de preferência um reforço passadas cerca de 4 semanas, seguido de reforços repetidos de seis em seis meses durante □ período em que existir risco de infecção.
A resposta imune da proteína Pre Sl-Pre S2-S ou da prote_í na Pre SI - sequência de codificação, funcional, de ADN - Pre S2-S ou partícula deste invento é aumentada pela utilização de adjuvante tal como, mas não apenas, hidróxido de alumínio.
EXEMPLOS
Nos exemplos do invento que se seguem, que são ilustrati. vos e não limitativos
- Todas as percentagens estão em peso e todas as temperaturas estão em graus Celsius (centígrados).
- As enzimas usadas nas manipulaçães com ADN foram obtidos em Bethesda Research Laboratories, Neui England Biolabd, e/ou Boehringer, e foram usados de acordo com as instruçães dos fabricantes.
- Meios de crescimento de levedura : meio selectivo : YNB (base de azoto para levedura sem aminoácidos (Difco Labs) 0,675 % (p/v) contendo 2/3 (p/v) de glucose).
- Meio YEPD: 1/ (p/v) de extracto de levedura, 2/ p/v de peja tona e 2% (p/v) de glucose.
- Os métodos de ADN recombinante estão descritos em Molecular Cloning, T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Lab. (1982).
- PMSF: fluoreto de fenilmetilsulfonilo.
6Ί 100
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-56- Podem usar-se as seguintes abreviaturas:
PBS: solução salina tamponada com fosfato (por litro):
(pH 7,4) 8,0 gramas de NaCl
0,2 gramas de KC1
1,15 gramas de Na2HP0^
0,2 gramas de Kh^PO^
0,1 gramas de CaCl2
0,1 gramas de MgCl2 . 6H20
ΒΞΑ: Albumina de soro bovino (^4373» Sigma)
X-gal: 5-bromo-4-cloro-indoíl-^-D-galactopiranosido, vendido por Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri.
CALDO-L (por litro):
gramas de Triptona gramas de NaCl gramas de extrato de levedura ml de MgSO^ 0,1M
Adicionar 5 ml de solução asséptica de tiamina (mg/ml) depois da operação em autoclave. Para meios sólidos, adicionar 15 g de ágar por litro.
Exemplo 1. Construção do plasmídeo pRIT10167 material de partida foi 0 plasmídeo p6y contendo o fragmento HindlII, com 2,1 kb, do ADN de levedura que codifica 0 gene TDH3 clonado em pBR322. 0 pBR322 é descrito por Bolívar et al. (Gene, 2., 95-113, 1977). 0 plasmídeo p6y foi construído e caracterizado por Musti et al. (Gene, 25, 133, 1983) e obtido do Dr. M. Rosenberg of the National Institute of Health. 0 fra gmento HindlII foi re-clonado num derivado de pBR 322 no qual 0 s_í tio EcoRI tinha sido destruído para dar 0 plasmídeo pRIT10164 (um artifício não essencial). Efectuaram-se as manipulaçães seguintes de modo a criar-se um sítio BamHI localizado no res_í duo G do codão ATG da sequência de codificação de TDH3 e para obter 0 fragmento de ADN HindIII-BamHI com a actividade do pro motor TDH3 no qual as sequências TDH3 estão intactas e não são alteradas pela manipulação. 0 ADN de pRIT10164, preparado como se descreveu acima foi purificado por dois ciclos de centrífuga
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ção em gradientes de densidade de CsCl - brometo de etídio essencialmente como descrito por Kahn et al. (Methods in Enzymolcgy, 6.8, 268, 1979). Digeriram-se 150 ytg de ADN de pRIT10164 para acabamento, com 75 unidades de endonuclease Xbal, extraiu -se com fenol e éter, precipitou-se com etanol e ressuspendeu-se o ADN em tampão de trometamina-HCl 0,01 M a uma concentração de 1 yug por yEL. Digeriram-se amostras de 20 y*g deste ADN, tratado com Xbal, com nuclease Bal31 para ressecar os 61 pares de bases do ADN entre o codão ATG e o sítio Xbal. As digestões com Bal31 foram realizadas a 309 durante 1 a 30 minutos em tam pão contendo NaCl 600mM, CaC^ 12 mM, MgC^ 12 mM, EDTA 1 mM, trometamina-HCl 20 mM, pH3,l, usando uma unidade de nuclease Bal31 por 20 y/g de ADN num volume reaccional final de 200 yd.
As reacções das enzimas foram paradas por adição de ácido etileno-bis (oxietilenonitrilo) tetra-acético (EGTA) para se obter uma concentração final de 20 mM e extrairam-se as amos, tras com volumes iguais de fenol e éter, e precipitaram-se com etanol. Cada amostra de ADN foi ressuspensa em 20 ytL de tampão trometamina-HCl 10 mM, pH 7,5. A extensão da digestão com Bal31 foi medida digerindo cerca de 2,5 jug de cada amostra de ADN com endonuclease Hpal e comparando o tamanho dos fragmentos Hpal-Xbal com o fragmento Hpal-Xbal de 335 pb de pRIT10164. Me rificou-se que uma digestão de 2 minutos com Bal31 remove cerca de 41 a 88 nucleótidos do fragmento Xbal-Hpal de pRIT10164.
Este resultado indica que um número semelhante de pares de bases foi removido da outra extremidade Xbal próxima do codão ATG. Digeriram-se com endonuclease BamHI 5 y*g do ADN recu perado do digerido de 2 minutos com Bal31, extrairam-se com fe nol e recuperaram-se por precipitação com etanol. Este ADN foi tratado com 5 unidades de T4 polimerase na presença de trifosfa tos de desoxinucleótido para encher e tornar lisa a extremidade de BamHI e quaisquer extremidades de cordão único de Bal31, extraídos com fenol e recuperados por precipitação com etanol. Trataram-se 2,3 y*g deste ADN com 5 unidades de T4 ADN ligase e usou-se metade da mistura de ligação para transformar células competentes da estirpe MM294 de E. coli K12 preparada de acordo
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-58com □ método de Cohen et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. 69, 2110, 1972). Um ml da população E. coli transformada foi diluída em 350 ml de caldo-L com 200 yvg/ml de ampicilina e purificou-se o ADN plasmídeo total da cultura resultante.
deste ADN de plasmídeo contendo uma população de mo léculas plasmídicas com delecçães de cerca de 40 a 80 pares de bases, induzidas por Bal31 foram digeridos sequencialmente com 75 unidades de endonuclease HindIII e 96 unidades de endonucleai se BamHI para libertar fragmentos de ADN dos plasmídeos em que um sítio BamHI tinha sido recriado depois dos tratamentos descritos anteriormente, isto é, onde a digestão com Bal31 tinha terminado num resíduo G. Este digerido de ADN foi passado num gel preparativo de agarose a 1% e os fragmentos HindlII-BamHI, correspondentes aos tamanhos de 1100 a 1000 pb, foram excisados do gel em duas fatias, uma correspondente ao ADN de cerca de 1070 pb e a outra correspondente a cerca de 1030 pb. 0 ADN foi recuperado das duas fatias de gel de agarose por ciclos de cojn gelação e descongelação seguidos de centrifugação a alta velocidade da pelota de agarose. 0 líquido sobrenadante foi filtrado através de um filtro Millipore GV Millex e o ADN recuperado por dois ciclos de precipitação com etanol e ressuspenso em 20 yJL de tampão trometamina-HCl 0,01 Fl, pH 7,5.
Análises por electroforese em gel de agarose e comparação com um digerido HindIII mais Xbal de ADN de pRIT10164 e com os fragmentos de um digerido HindIII mais EcoRI do ADN do fago A mostraram que se obtiveram duas populaçBes distintas de fragmentos HindIIΙ-BamHI, uma com um tamanho estimado de cerca de 1070 pb e uma com um tamanho estimado de cerca de 1030 pb comparados com o fragmento HindiIΙ-Xbal parenteral com 1120 pb de pRIT10164. Cerca de 100 ng da população de fragmentos HindIII-BamHI com 1030 pb foi ligada com 200 ng de plasmídeo pUC9 que tinha sido digerido com endonucleases HindiII e BamHI e tratado com fosfatase alcalina (ver, Shine, Patente dos E.U. Ne, 4 264 731) e a mistura de ligação foi usada para transformar células competentes da estirpe JM103 de E. coli, sendo a seleç. ção feita com base na resistência à ampicilina. A transforma67 100
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-59ção da estirpe JM103 de E. coli foi efectuada de acordo com o método de Cohen et al. citado anteriormente.
Tanto o plasmídeo vector pUC9 como a estirpe receptora 3M103 de E. coli foram descritos por Vieira e Messing in Gene, 19, 259, 1982 e foram obtidos de 0. Messing (Univ. of Minnesota). 0 vector pUC9 é vendido por Amersham (Buckinghamshire, Reino Unido) e Pharmacia (Uppsala, Suécia). A estirpe JM103 de E« coli é obtenível de □. Messing (Univ. of Minnesota). Outra estirpe E. coli com as características da estirpe JM103 de E. coli, i.e., JM101, pode ser obtida na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, sob o número de acesso ATCC 33876, e pode, também, ser usada como hospedeiro. Obtiveram-se cerca de 400 colónias resistentes à ampicilina por ml e destas, 98 colónias foram testadas em meio contendo X-gal. Destas, 95 eram brancas indicando uma inserção sucedida de um fragmento de ADN estranho entre os sítios HindiII e BamHI no vector.
Prepararam-se plasmídeos de colónias de transformantes individuais por um procedimento a pequena escala (Birnboim e Doly, Nucl, Acid Res., Ί_, 1513, 1979) após amplificação dos plasmídeos por adição de espectinomicina (150 ^ig/ml) às culturas de crescimento.
Os plasmídeos recombinantes foram analisados em acrilami da-geles a 7,5% após digestão dupla com endonucleases Ayall e BamHI e comparados com o fragmento Avall-Xbal de 450 pb compre endendo a região de codificação do promotor-N-terminal de pRIT10164, e com os fragmentos de um digerido com Hpall de ADN de pBR322. Um fragmento AyalI-BamHI correspondendo a delecçães de 20 a 90 pares de bases estava presente em 35 dos 36 plasmídeos examinados, quando comparados com pRIT10164. Escolheram-se para estudo posterior três plasmídeos representando delecçães de cerca de 80 pares de bases (pRIT10166), 50 pares de ba ses (pRIT10167-Figura 8) e 45 pares de bases (pRIT10165). ADN dos plasmídeos foi preparado por centrifugação em densidade de CsCl-brometo de etídio e 25 «g de cada um foi digerido com ' 32
EcoRI. As extremidades de EcoRI foram marcadas com /-P -ATP
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-60por tratamento de permuta com quinase e a sequência de nucleóti dos dos fragmentos HindIII-EcoRI de cada plasmídeo foi determi nada pelos métodos de modificação química de Maxam e Gilbert (Methods in Enzymology, 65, 499, 1980). A marcação e sequencj. ação de cada sítio EcoRI na porção do vector pUC9 de cada pias, mídeo recombinante é um meio conveniente para determinar a sequência em torno do sítio BamHI adjacente, marcando o final da delecção no fragmento de ADN TDH3. Esta análise de sequenciação mostrou que no plasmídeo pRIT10166, o sítio BamHI é recriai do num resíduo G localizado na região não traduzida 5’, 25 pares de bases a montante do codão ATG; em pRIT10165, o sítio BamHI está localizado na segunda base do terceiro codão; e em pRIT10167, o sítio BamHI está localizado nc resíduo G do codão ATG.
fragmento HindIII-BamHI de ADN TDH3 construído assim em pRIT10167 contém todas as sequências necessárias à activida. de do promotor TDH3, numa fcrma não alterada.
Exemplo 2. Construção do vector pRIT10172.
A inserção de ADN HindiIΙ-BamHI TDH3 de 1050 pb, de pRIT10167, preparado como descrito nc Exemplo 1, foi reclonada no vector vaivém YEpl3 descrito por Broach et al. (Gene, B, 121, 1979) entre o sítio HindIII na porção de ADN com 2 micron do vector e o sítio BamHI para dar o plasmídeo recombinante pRIT12159. 0 ADN de pRIT12159 foi então digerido com endonucleases Xbal e BamHI e o fragmento resultante com 1650 pb foi ligado em lugar de um fragmento Xbal-BamHI semelhante contendo o promotor arg3 no plasmídeo pRIT10774. 0 plasmídeo pRIT10774 é descrito por Cabezon et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S., 81, 6594-6598,
1986), e compreende o replicão YEpl3 do qual se fez a delecção dos sítios BamHI e Xhol dos vectores naturais por manipulação in vitrq, em conjunto com uma inserção Hindi Π-BamHI de 1470 pb compreendendo a região do promotor arg^e um fragmento BamHI-HindlII de 1150 pb compreendendo a região de terminação de transcrição de arg\ A substituição da inserção do promotor arg em pRIT10774 pela inserção do promotor TDH3 origina o pias, mídeo pRIT10172 que contém portanto um único sítio BamHI locali
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SKR 12044-2 zado no codão ATG da inserção do promotor TDH3 e precedendo um sinal funcional para terminação de transcrição no fragmento de ADN BamHl-HindI11 arg5 com 1150 pb. ADN estranho pode assim ser clonado neste sítio. Além disso, as duas inserções de ADN estão ligadas por sítios HindIII permitindo a remoção do módulo de unidade de expressão (cassette), como fragmento HindIII de 2200 pb, para inserção noutros vectores. A Figura 9 é um mapa de clivagem, por endonuclease de restrição, de pRIT10172.
Exemplo 3. Construção de pRIT12290.
Um fragmento HindiII-EcoRI com 1050 pb de pRIT10167 (Figura 8), preparado como se descreveu no Exemplo 1 e contendo o fragmento HindiII-BamHI do promotor TDH3 em conjunto com a pajr te BamHI-Smal-EcoRI do poli-ligante pUC9, foi clonado entre os sítios Hindi 11 e EcoRI de um plasmídeo derivado de pBR322, ao qual se fez previamente a delecção do sítio BamHI, enchendo com T4 ADN polimerase e religando. 0 plasmídeo recombinante resulta_n te foi identificado como pRIT12176.
ADN plasmídico de pRIT10158 (Figura θ), preparado como se descreve no Exemplo 4 (b), abaixo, foi digerido com endonuclease EcoRI e tratado com T4 ADN polimerase para encher as extensões de cordão único de EcoRI. Esta preparação foi ainda digerida com endonuclease Clal. Uma outra amostra ds ADN de pRIT10158 foi digerida com endonucleases Clal e HaelII e re cuperou-se um fragmento Clal-HaelII de 1150 pb, transportando a região de terminação de transcrição do gene arg^, por electro forese preparativa em gel de agarose e por electroeluição. Es. te fragmento foi ligado com o ADN pRlTlO158 tratado com EcoRI, T4 ADN polimerase e Clal e a mistura de ligação foi usada para transformar células competentes da estirpe MM294 de E. coli preparadas, como descreveu Cohen et al., acima, para resistência à ampicilina. A partir das colónias transformadas isolou-se um plasmídeo, identificado como sendo o pRIT10162, no qual o fragmento de terminação de transcrição Clal-HaelII arg5 foi inserido em pRIT10158 entre os sítios Clal e cheio nos sítios EcoRI e no qual o sítio EcoRI foi recriado. A Figura 8 é um diagrama de blocos que ilustra a preparação de pRIT10162. 0
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-62ADN plasmídico de pRIT10162 foi digerido com endonucleases EcoRI e PstI e misturado com ADN plasmídico de pRIT12176 preparado da forma descrita anteriormente (também digerido com endonuclea ses EcoRI e Pstl) e a mistura foi ligada e usada para transfor. mar células da estirpe MM294 de E. coli K12, para resistência à ampicilina, pelos métodos de Cohen et al., citados anteriormente. Recuperou-se um plasmídeo, pRIT12208, de um colónia que sofreu esta transformação, no qual o grande fragmento EcoRI-Pstl, com 4630 pb, de pRIT12176 tinha sido ligado ao pequeno fragmento EcoRI-PstI com 1930 pb, de pRIT10162 e no qual a região de terminação de transcrição arg^ está agora justaposta ao promotor TDH3. As regiões de ADN arg^ e TDH3 podem ser excisji das de pRIT12208 como um fragmento único com 2200 pb, por digestão com endonuclease HindIII. Para obter a outra orientação deste fragmento, em relação às sequências de vector, o fragmento HindiII, com 2200 pb, de pRIT12208 foi reclonado no sítio HindIII de um plasmídeo derivado, no qual os sítios naturais EcoRI e BamHI tenham sido separadamente delectados por enchimento com T4 ADN polimerase e religação. 0 plasmídeo resultante, com o fragmento HindIII, com 2200 pb, inserido na ori entação oposta em relação às sequências de vector quando compa. rado com pRIT12208, é identificado por pRIT12290. A Figura 10 é um mapa de clivagem, por endonuclease de restrição, de pRIT12290. Em ambos os vectores pRIT12208 e pRIT12290, os fragmentos do promotor TDH3 e de terminação de transcrição arg^ são separados por sítios de restrição únicos BamHI, Smal e EcoRI úteis na clonação de fragmentos de ADN transportando sequências de codificação e as regiães do promotor e de terminação de transcrição podem ser excisadas em conjunto num fragmen to Hindi11, com 2200 pb, com um módulo ou '‘cassette para trans ferência para outros vectores.
sítio BamHI é especialmente útil, uma vez que está localizado no codão ATO do gene TDH3 e pode ser empregue para fu são de outros genes ao promotor TDH3 com vista a expressá-los em levedura, como se exemplifica abaixo. Estas fusães podem ser recuperadas de derivados de pRIT12208 ou de pRIT12290 na forma de cassettes” ou módulos para inserção em vectores vai67 100
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vém em levedura, por digestão com endonuclease HindlII ou por utilização de outras endonucleases de restrição que cortam em sítios de restrição flanqueadores.
Exemplo 4. Construção de Plasmídeos pRIT10677, pRIT10909 e pRIT10158.
a) pRIT10677
Excisou-se de pRIT10616 um fragmento BamHI, com 1372 pb, de ADN de HBV clonado (Harford et al., Dev. Biol. Standard, 541 125-130, 1983) e misturou-se e ligou-se com ADN de pBR327 diqe rido com endonuclease BamHI. Este fragmento BamHI contém parte da região percursora de AgsHB, a sequência de codificação de AgsHB e sequências de não codificação 3’. A partir da mistura de ligação seleccionou-se um plasmídeo pRIT10677, que tem o fragmento BamHI de HBV inserida no sítio BamHI do vector numa orientação tal que o sítio Xbal no ADN de HBV esteja próximo do sítio Sall no vector pBR327. A Figura 8 é um diagrama de blocos que ilustra a preparação de pRIT10677.
b) pRIT10909 fragmento HindlII com 3300 pb do plasmídeo pMC200 (dis ponível na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, E.U.A. sem restrição, sob o número de acesso ATCC 39131), descrito por Crabeel M. et al. (EMBO 0., 2, 205-212, 1983) foi reclonado num plasmídeo derivado no qual o sítio natural
EcoRI tinha sido delectado enchendo com T4 ADN polimerase e re ligando. Seleccionou-se um plasmídeo recombinante resultante, pRIT10158 (Figura 8), no qual o gene HindIII arg3 tem a região 3* do gene arg3 proximaLdo sítio Clal no vector pBR322 modificado. A partir de pRIT10158 recuperou-se um fragmento Clal-HaelII com 1150 pb, que transporta a região de terminação de transcrição do gene arg3. Este fragmento com 1150 pb foi ligado com e_n donucleases Clal e Hpal digeridas com ADN de plasmídeo pRIT10677 (preparado como descrito na Parte a, acima) para fundir a região de terminação arg3 no sítio Hpal a jusante da região de codifica, ção de AgsHB. 0 plasmídeo resultante é o pRIT10909. A Figura 8 é um diagrama de blocos que ilustra a preparação de pRIT10909.
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SKR 12044-2 ·>»!
-64A Figura 3 é um mapa de clivagem, por endonuclease de restrição, de pMC200.
Exemplo 5, Construção de plasmídeos pRIT10911 e pRIT10912 sitio BamHI em pRIT10167 (Exemplo 1) e o sítio natural BamHI localizado na região precursora do gene de AgsHB de um vírus HBV do serotipo adiu clonado em pRIT10616 (Harford et al., Dev. Biol. Standard, 54, 125-130, 1983) estão na mesma estrutu ra de leitura traducional permitindo a construção de uma fusão do fragmento do promotor TDH3 que fornece o códão ATG aos | 42 códões da sequência precursora de AgsHB seguidos por 226 có.
dães da sequência de codificação de AgsHB característica. A fonte do fragmento de ADN de HBV para esta fusão foi um plasmí deo pRIT10909 (ver, Exemplo 4, parte b, acima) contendo uma parte codificando a inserção BamHIHpal, com 935 pb, da região precursora de AgsHB, a sequência de codificação total de AgsHB e 128 pb do ADN nãotraduzido em 3’ ao qual foi fundido, a jusa.n te do sítio Hpal, um fragmento de ADN HaelII-ClalII, com 1150 pb, do pRIT10158 contendo a região de terminação de transcrição arg^· 0 pRIT10158 é descrito no Exemplo 4, parte B acima. 0 fragmento EcoRI-BamHI com 2085 pb foi excisado de pRIT10909 e inserido entre os sítios EcoRI e BamHI de pRIT10167, preparado como se descreveu no Exemplo A, de modo a originar o plasmídeo } pRIT10911. 0 fragmento HindIII com 3135 pb de pRIT10911 contendo os sinais de transcrição de ADN de levedura e as sequências de codificação de AgsHB, foi então inserido no vector vai. vém YEpl3 para dar o plasmídeo pRIT10912. A Figura 8 é um dia grama de blocos ilustrando a preparação de PRIT10911.
Exemplo 6. Construção de plasmídeos pRIT10903 e pRIT10914 objectivo das construçães descritas abaixo foi remover nucleótidos em excesso da extremidade 5' de um fragmento de ADN codificando pelo menos a porção N-terminal da sequência de codificação de AgsHB maduro de tal modo que se crie um sítio de restrição de 6 pares de bases na primeira base do segundo códão. 0 fragmento resultante pode então ser fundido com fragmentos de promotor com um sítio de restrição com 6 pares de bases no có67 100
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-65dão de iniciação usando nucleases de Mung Bean (feijão tipo soja) ou SI para retirar as extensões de cordão único e criar extremidades rombas para ligação como mostrado por Rosenberg et al., Methods in Enzymology, 1010, 123 (1983).
Excisou-se deste plasmídeo um fragmento FnuDII com 1225 pb de ADN de HBV de pRIT10616 (Ver, Harford et al. (1983) Deuel. Biol. Standard, 54, 125-130) e que codifica o gene de AgsHB, e ligou-se com ligantes sintéticos octoméricos EcoRI e clonou-se o fragmento no sítio EcoRI do vector pACYC184 para dar pRIT10679 (Fig. 8). 0 vector pACYC184 foi recebido de S.
Cohen e é descrito por Chang A.C.Y. e Cohen S. (1978), □. Bacte riol., 134, 1141- 1156. 0 pACYC184 está também disponível na
American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, E.U.A., sob o número de acesso ATCC 37033. A partir deste fragmento EcoRI (FnuDII) obteve-se um fragmento EcoRI-Xbal com 125 pb que contém a região C terminal do percursor de AgsHB, o códão ATG do AgsHB e 90 pb da sequência de codificação de AgsHB. Es. te fragmento EcoRI-Xbal com 125 pb foi introduzido entre os sí. tios EcoRI e Xbal de pRIT10158 (Ver Exemplo 4 (b), anterior). 0 plasmídeo resultante, pRIT10903, contém assim um único sítio
EcoRI localizado na junção entre ADN de arg e ADN de HBV e tem 3 um único sítio Xhol localizado na região promotora arg . A Figura 8 é um diagrama de blocos que ilustra a preparação de pRIT10903.
150 Jjq de ADN de plasmídeo pRIT10903, preparado por centrifugação em gradientes de densidade de CsCl-brometo de etidio, foram digeridos com 80 unidades de endonuclease EcoRI, ex, traídos com fenol, precipitados com etanol e ressuspensos, a 1 %g por yú, em tampão de trometamina HC1 10 mM (pH 7,5). 0 ADN foi dividido em três amostras de 50 yug e incubado durante 50, 75 e 90 segundos com nuclease Bal31 a 30Q. Cada mistura reaccional continha o tampão de reacção citado no Exemplo 1, 50 juq de ADN de pRIT10903 digerido com EcoRI e 2,5 unidades de nuclea se Bal31 num volume final de 500 yúL. As reacções foram paradas por adição de EGTA numa concentração final de 20 mM, arrefece_n do em gelo, extracção com um volume igual de fenol e precipita ção com etanol. As amostras de ADN tratadas com Bal31 foram,
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... -66cada uma, tomadas em 50 jul de tampão trometamina-HCl 10 mM e digeridas, 2,5 ^g, com endonuclease BstEII e comparadas num acrdlamida gel a 7,5% com um digerido, com endonuclease EcoRI mais BstEII, de pRIT10903 que liberta um fragmento de 285 pb. Verificou-se que o tratamento com nuclease Bal31 durante 75 segundos a 309 reduziu o tamanho deste fragmento EcoRIBstEII em 10 a 60 pares de bases, dando uma série de bandas discretas que se presume representem a remoção de 10, 30, 45 e 60 pares de bases de ADN. A ressecção de 29 pares de bases do sítio FnuDII original removeria todo o ADN precursor de AgsHB e o códão ATG de AgsHB.
Digeriram-se 5 jajq de ADN de pRIT10903, que tinham sido tratados com Bal31 durante 75 segundos, com 8 unidades de nuclease XhoI, extraíram-se com fenol e precipitaram-se com etanol. Este ADN foi então incubado com 5 unidades de /4 ADN polimerase na presença de trifosfatos de desoxinucleótidos para encher e dar origem a finais lisos das extremidades Xhol e Bal31, tratado com fenol e precipitado com etanol. 0 ADN foi então incubado com 5 unidades de T4 ADN ligase durante 16 horas a 162 e usou-se a mistura para transformar células competejn tes da estirpe MM294 de E. coli K12 em resistentes à ampicilina, de acordo com o método de Cohen et al. citado acima. Recu peraram-se cerca de 2000 colónias resistentes à ampicilina por ml depois de se colocarem em placas. Os plasmídeos foram preparados a partir de 47 colónias individuais por um procedimento a pequena escala (ver Birnboim et al. citado anteriormente) e verificou-se que 23 das 47 retinham um sítio Xhol indicativo do enchimento sucedido do sítio Xhol original e ligação a uma extremidade 3’ terminando num resíduo G. Estes 23 plasmídeos foram ainda digeridos com endonucleases Xhol e Xbal para se d£ terminar o tamanho do pequeno fragmento de restrição em comparação com o fragmento EcoRI-Xbal original de pRIT10903.
Identificaram-se vários plasmídeos com delecçães que se estimou variarem entre 25 e 40 pares de bases. Para estudo pos. terior seleccionou-se um plasmídeo, pRIT10914 que se estima cori ter um fragmento XhoIXbal de 95 a 100 pares de bases. A Figura
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é um diagrama de blocos que ilustra a preparação de pRIT10914. 0 ADN deste plasmídeo foi purificado por centrífuga ção em gradiente de densidade de CsCl-brometo de etídio e diqe riram- ‘ ’/n ------ -- ---*-----'-ase Xbal.
-ATP e o ADN marcado foi digerido com 15 unidades de endonuclea se HindIII. 0 pequeno fragmento Hindi Π-Xbal com 765 pb foi isolado por electroforese em acrilamida-gel e a electro-eluição seguida por precipitação com etanol. A sequência de nucleótidos no sítio Xhol e à sua volta foi determinada por sequenciação deste fragmento a partir do terminal Xbal marcado, usando os métodos de modificação química de Maxam e Gilbert, citados anteriormente. Os valores da sequência mostraram que o sítio Xhol estava localizado na primeira base do segundo códão da se quência de codificação de AgsHB.
Xhol
CTCGAGAAC nucleótidos de AgsHB
Este fragmento é portanto adequado para fusão na extensão BamHI do fragmento «do promotor TDH3 em pRIT10167 (Exemplo 1) após remoção das extremidades de cordão único.
Exemplo 7. Construção de plasmídeos pRIT12211, pRIT12209, pRIT12230 e pRIT12265 plasmídeo pRIT10911, preparado como se descreveu no Exemplo 5, foi usado como suporte para manipulações posteriores. Para introduzir sítios de restrição desejáveis, o plasmí deo foi digerido com endonucleases BamHI e Xbal e o fragmento excisado foi substituído por um fragmento BamHI-Xbal, com 2275 pb, do plasmídeo pRIT10158 (Exemplo 4). Esta manipulação tem como resultado o plasmídeo pRIT12211 no qual o fragmento do promotor. HindIII-BamHI, TDH3 está ao lado de um fragmento BamHI-Xbal contendo □ sítio Xhol seguido por um fragmento Xbal-HindlII compreendendo a região C-terminal da sequência de codificação do AgsHB e 128 pb do ADN de não codificação em 3', fundida à região de terminação de transcrição arg com 1150 pb.
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-68A Figura 8 é um diagrama de blocos que ilustra a preparação de pRIT12211. 0 plasmídeo pRIT12211 foi digerido com endonucleases Xhol e Xbal, removendo-se assim um fragmento de 1600 pb que foi substituído pelo fragmento XhoIXbal de 94 pb do ADN de AgsHB modificado a partir de pRIT10914, preparado como se descreveu no Exemplo 5. Esta fragmento com 94 pb foi purificado por electroforese em acrilamida-gel de um digerido com Xhol mais Xbal de ADN de pRIT10914 e em seguida por electroeluição da fatia de gel apropriada e recuperação do ADN por precipitação com etanol.
plasmídeo, pR!T12209, resultante da introdução do fragmento de 94 pb (ver Fig. 8) foi purificado por centrifugação de densidade de CsCl-brometo de etídio e 50 y*g de ADN de pRIT12209 foram digeridos com 90 unidades de endonuclease BamHI e 60 unidades de endonuclease Xhol para remover 990 pb de ADN estranho entre o promotor TDH3 e a região de codificação de AgsHB e em seguida extraídos com fenol e precipitados com etanol. 16 yi»g deste ADN foram incubados durante 30 minutos a 309 com 20 unidades de nuclease Mung Bean (PL Biochemicals) num volume de 125 yuâ., 0 tampão usado para a incubação foi acetato de sódio 30 mM (pH 4,6), NaCl 250 mM, ZnC^ 1 mM e glicerol a 5%. A reacção foi parada por adição de dodecilsulfato de sódio para dar uma concentração final de 0,2% e extraiu, -se com um volume igual de fenol e precipitou-se com etanol. Uma alíquota de 0,5 yUg desta amostra tratada com nuclease Mung Bean foi incubada com 2 unidades de T4 ADN ligase durari te 16 horas a 169 e em seguida digerida com 2 unidades de endonuclease BamHI para destruir quaisquer moléculas de vector que tenham escapado aos tratamentos anteriores. Esta mistura foi usada para transformar células competentes da estirpe MM294 de E. coli K12 com selecção para resistência à ampicilina de acordo com o método de Cohen et al. citado anteriormente. Recuperaram-se da mistura de transformação cerca de 2000 colónias resistentes à ampicilina por ml, e prepararam-se plasmíde. os por um procedimento a pequena escala (de acordo com □ método de Birnboim et al., citado anteriormente), a partir de culturas amplificadas de 24 desses transformantes.
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-69- . .χ*
Após digestão com endonuclease HindiII, 15 cTos 24 plasmí deos deram duas bandas de ADN com tamanhos de 2700 pb (vector pUC9) e 3000 pb. A banda de 3000 pb tem o tamanho esperado pa ra a fusão da sequência de codificação de AgsHB e da região de terminação arg com o fragmento promotor TDH3.
Para estudo posterior tomaram-se quatro plasmídeos candi. datos. 0 ADN de cada plasmídeo foi digerido com endonuclease Xbal e marcado por quinação de permuta com P-ATP seguida por digestão com endonuclease HindiII e isolamento do fragmento HindlII-Xbal de 1190 pb por electroeluição e precipitação com etanol depois de electroforese com acrilamida-gel. A sequência de cada fragmento foi determinada pelos métodos de modificação química de Maxam e Gilbert, citados acima. Verifi cou-se que dois plasmídeos tinham a sequência correcta, ATGGAGAAC, para fusão perfeita da região promotora TDH3 ao gene de AgsHB. Um destes plasmídeos, pRIT12230 foi usado para manipulações posteriores. A figura 8 é um diagrama de blocos que ilustra a preparação de pRIT12230. 0 ADN deste plasmídeo (pRIT12230) foi digerido com endonuclease HindiII e o fragmento de 3000 pb, contendo a sequência de codificação de AgsHB fundida com □ promotor TDH3, foi ligado no vector vaivém YEpl3. 0 plasmídeo resultante, pRIT12265, foi transformado em levedura da estirpe DC5, (MATa, leu2-3, leu2-112, his3, canl-11) (obtida de 3. Broach (State University of N.Y. Stony Brook) e disponível, sem restrições, a partir da American Type Culture Collection sob o número de acesso ATCC 20630) usando o procedi, mento de transformação de Ito et al., 3. Bact, 153, 163 (1983).
Exemplo 8. Construção dos plasmídeos pRIT12288, pRIT12322
A construção do plasmídeo pRIT12230 (Exemplo 7) contém ADN de HBV de não codificação com 128 pb localizado em 3' a ju. sante do codão de paragem do gene estrutural de AgsHB.
Para remover os 128 pb de ADN, cerca de 25 jvg de pRIT12230, preparados como descrito no Exemplo 7 acima, são d.i geridos com endonucleases Accl e EcoRI. 0 pRIT12230 contém um só sítio Aççl localizado na sequência de codificação de gene S,
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-707 nucleótidos antes do códão de paragem TAA. 0 ADN digerido foi submetido a electroforese num gel de agarose a 1% e recupei rou-se do gel o fragmento maior do vector, com 4200 pb, por electroeluição e precipitação com etanol.
Para inserção entre os sítios Aççl e EcoRI de pRIT12330 sintetizam-se moléculas ligantes de ADN, artificiais, compostas por um cordão 12 mer e por um cordão 14 mer, com as sequências que se seguem:
5' ATACATTTAACG 3 mer
TGTAAATTGCTTAA 5' mer
Isto restaurará os códões correctos do C-terminal de AgsHB, □ códão de paragem TAA, e proporcionará um sítio EcoRI não presente em mais lado algum no promotor TDH3 ou as sequências de codificação do AgsHB para adição dos fragmentes de ter, minação de transcrição.
Misturaram-se 100 pmoles do cordão simples, sintético, 12 mer e 100 pmoles do cordão simples, sintético, 14 mer, num volume final de 10-20 yd, aqueceram-se a 703 durante 15 minutos e deixaram-se voltar, lentamente, à temperatura ambiente, durante um período de 3 h permitindo o emparelhamentc (annealing) dos dois cordões ao longo das suas sequências complementares. A esta mistura emparelhada adicionou-se cerca de 0,15 pmol (400 ng) do fragmento AççI-EcoRI de 4200 pb de pRIT12230, 10x tampão de ligação concentrado e 2 unidades de T4 ADN ligase.
Esta mistura foi incubada durante 4 horas a 169 antes da adição de mais 2 unidades de T4 ADN ligase e em seguida incuba da durante a noite, em gelo. A mistura ligada é usada para transformar células competentes da estirpe MM294 em resistentes à ampicilina de acordo com õ método de Cohen et al. (Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 69, 2110, 1972), Os plasmídeos foram preparados a partir de 12 ou mais colónias individuais pelo proce dimento de Birnboim e Doly (Nucl. Acids Res., 2, 1513, 1979) e
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-71examinados por análise com endonucleases de restrição. Os pias, mídeos com inserção do ligante Aççl a EcoRI mostrarão uma única banda de ADN de 4200 pb na digestão com qualquer das enzimas Accl ou EcoRI. A correcção da inserção do ligante nesse plasmídeo pode ser verificada por sequenciação de ADN quer do sítio EcoRI quer do sítio Accl pelo método de modificação química de Maxam e Gilbert (Methods in Enzymology, 65, 499, 1980).
Para proporcionar um fragmento de terminação de transcri ção, um plasmídeo com a inserção ligante AccI-EcoRI, obtido co mo se descreveu anteriormente, é digerido com endonuclease EcoRI e tratado com fosfatase alcalina (Shine 3., Patente dos E.U. 4 264 731). 0 fragmento HindiII, com 2650 pb, de pRIT10162, obtido como se descreveu no Exemplo 3, foi reclonado no sítio HindlII do plasmídeo vector pBR327 para formar o plasmídeo pRIT12288. 0 pBR327 é descrito em Soberon et al. (Ge» ne, 2» 287-305, 1980), e pode ser preparado como é descrito no Exemplo 10, parte b, infra, a partir do plasmídeo pRIT12309 que pode ser obtido na American Type Culture Collection sob o número de acesso ATCC 67187. A Figura 8 é um diagrama de blocos que mostra a construção de pRIT12288.
A orientação do fragmento HindiII em pRIT12288 é tal que justaponha a região de terminação de transcrição arg com os sítios de restrição EcoRI e Ciai na parte pBR327. A partir de pRIT12288, obtém-se um fragmento EcoRI com 1180 pb que transporta a região de terminação de transcrição arg\ Este fragmento é ligado ao derivado pRIT12230 digerido com EcoRI e trata do com fosfatase alcalina descrito acima e os plasmídeos resul tantes da mistura de ligação são examinados quanto à inserção e orientação do fragmento EcoRI com 1180 pb. A orientação da inserção pode ser obtida por digestão com endonuclease HindlII que libertará fragmentos de 2880 e 2720 pb se a orientação da inserção estiver como desejada.
Construiu-se um plasmídeo, pRIT12322, no qual o ligante AccI-EcoRI substitui os 128 pb de ADN de HBV não desejado e no qual estava presente o fragmento EcoRI de 1180 pb do pRIT12288, com a orientação desejada, a jusante da sequência de codifica67 100
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-72ção do AgsHB. Pode excisar-se de pRIT12322 um fragmento HindiII de 2900 pb, que transporta o módulo de expressão para a síntese de AgsHB incluindo o promotor TDH3, a sequência de codificação de AgsHB e a região de terminação de transcrição arg . A figu ra 8 ê um diagrama de blocos que mostra a construção de pRIT12322. l/er, também a Figura 11, que é um mapa de endonucle ase de restrição de pRIT12232 e que mostra que porções suas re sultaram de pRIT122B8 e de pRIT12230.
Exemplo 9. Construção do plasmídeo pRIT12329
Como se descreveu no Exemplo 8, acima, □ pRIT12322 contém um fragmento HindlII com 2900 pb com todos os sinais necessários à expressão de AgsHB a partir do promotor TDH3. Este módulo foi ligado num vector vaivém para introdução em células de levedura.
ADN do vector vaivém YEpl3 foi digerido com endonuclea se HindlII e fosfatase alcalina e usado como receptor para a introdução do fragmento HindiII de pRIT12322, preparado como se descreveu no Exemplo 8. Isolou-se o plasmídeo pRIT12329 que consiste no replicão YEpl3 em conjunto com o fragmento módulo HindiII de 2900 pb descrito no Exemplo 8.
Exemplo 10. Construção dos vectores plasmídeos para expressão de antigénio híbrido AgsHB-CS em levedura
A· Construção dos Plasmídeos pRIT12573 e pRIT12574 plasmídeo WR201 foi obtido no Walter Reed Army Institjj te of Research e resulta da inserção dum fragmento EcoRI, com
2,3 kilobase (kb), de λ mPfl (Dame et al., Science, 225, 593-599, 1984) codificando o gene completo da proteína de superfície da fase de esporozoíto do ciclo de vida do Plasmodium falciparum, num vector pUC8. A figura 2A mostra um mapa de restrição esquemático e a estratégia de sequenciação do clone AmPfl. As posições dos sítios de clivagem com enzima de restrição apresentadas na figura furam determinadas a partir da sequência e confirmadas por digestão: A, Avall; Ac, Accl; B, Bstnl; D, Dral; Dd, Ddel; F, Fokl; N, Ndelj R, Rsal; S, StuI; T, TthlII; Tq, Taql; X, XhoII. As setas indicam
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SKR 12044-2 a origem, direcção e extensão das sequências determinadas. A região de codificação da proteína CS é mostrada com uma linha a cheio. A figura 3A mostra a sequência de nucleótidos do gene da proteína CS de P. falciparum. Apresenta-se a sequência de nucleótidos do gene da proteína CS em AmPfl. 0 vector pUC8 é descrito por Vieira et al. (Gene, 19,, 259, 1982). 0 pUC8 é vendido por Amersham and Pharmacia. Purificou-se um fragmento StuI-Rsal do plasmídeo WR201, com 1215 pares de bases (pb), contendo a sequência de codificação da proteína CS menos os primeiros 52 pb (Figura 12), electroeluindo de um poliacrilamida-gel a 7,5/ de electroforese. Este fragmento foi digerido com Sau3A para gerar fragmentos mais pequenos que incluem, entre outros, um fragmento Sau3A com 192 pb que codifica 16 repetições de tetrapéptidos da proteína CS e três fragmen tos Sau3A idênticos, com 24 pb, codificando 2 repetições de te trapéptidos da proteína CS.
plasmídeo pRIT10911 (preparado como se descreveu no Exemplo 5) é um derivado de pUC9 que transporta uma cassette HindiII de 3136 pb contendo um fragmento com 1050 pb, HindiII-BamHI promotor de levedura gliceraldeído-3P-desidrogenase (TDH3) (que fornece o ATG) fundido no sítio BamHI a um fragme_n to BamHI-Hpal, com 935 pb, de ADN de HBV, codificando os 42 ami noácidos (aa) do C-terminal da região pre-S2, 226 aa do gene S (serotipo aduj) e 128 pb do ADN de não codificação em 3’. 0 g.e ne S é flanqueado por um fragmento de ADN de levedura, com 1150 pb, transportando o terminador de transcrição arg · 0 pUC9 é descrito por Vieira et al. (Gene, JL9, 259-268, 1982).
sítio BamHI de pRIT10911, localizado no códão de iniciação ATG está em fase com os sítios Sau3A do epítopo repetitivo de CS de Plasmodium falciparum. 0 ADN do plasmídeo pRIT10911 foi digerido com endonuclease BamHI, tratado com fosfatase alcalina, extraído com fenol e recuperado por precipitação com etanol. Misturaram-se 0,2 jlig deste ADN com 0,2 y*g do digerido de Sau3A do fragmento do gene de CS StuI-Rsal, preparado como aci ma, trataram-se com T4 ADN ligase e a mistura de ligação foi usada para transformar células competentes da estirpe MM294 de E. coli K12 preparadas de acordo com o método de Cohen et al.
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-74(Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 69, 2110, 1972). Prepararam-se 32 plasmideos a partir de colónias de transformantes individuais, usando um procedimento em pequena escala (Birnboim et al., Nucleic Acids Research, 1513, 1979) apôs amplificação do plasmídeo por adição de espectinomicina (300^g por ml) às culturas de crescimento. Os plasmideos recombinantes foram analisados em electroforese em acrilamida-gel a 7,5%, após dupla digestão com endonucleases BamHI e Xbal, e foram compara dos com o fragmento BamHI-Xbal, com 219 pb, de pRIT10911 (compreendendo a primeira sequência de codificação com 42 aminoáci dos do precursor da região Pre S2 e o início da região de AgsHB) e com fragmentos de um digerido de /xl74 ADN, com HaelII»
De entre os 32 plasmideos, um recombinante apresentou um fragmento BamHIXbal de 411 pb que corresponde à inserção do fragmento Sau3A de 192 pb na orientação correcta e foi.designa do por pRIT12572. Outro recombinante apresentou um fragmento BamHI-Xbal de 243 pb correspondente à inserção do fragmento de Sau3A de 24 pb na orientação correcta e foi designado por pRIT12571. A Figura 12 é um diagrama de blocos ilustrando a preparação de pRIT12571 e pRIT12572.
Os fragmentos HindIII de pRIT12572 e de pRIT12571, contendo o promotor TDH3, a sequência de codificação híbrida CS-AgsHB e a região de terminação arg3 foram reclonados em YEpl3, para dar, respectivamente, plasmideos pRIT12574 e pRIT12573 (Figura 12). 0 YEpl3 é descrito por Broach et al. (Gene, 8.,
121-133, 1979). A Figura 12 é um diagrama de blocos ilustrando a preparação de pRIT12573 e pRIT12574.
Os plasmideos pRIT10912, pRIT12574 e pRIT12573 foram introduzidos em levedura S_, cerevisiae, estirpe DC-5 (a, leu2-3, leu2-112, his3, canl-11), e em levedura S_. cerevisiae, estirpe 10S44C (pep4-3 leu2-3, leu2-112) obtidas de M. Crabeel do Ceria Institute, Anderlecht, Bélgica, (ver, também Cabezon, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A., 81, 6594-6598, 1984) por transformação de células tratadas com acetato de lítio (Ito et al.,
3. Bacteriol., 153, 163-168, 1983) e selecção para independência de leucina. A estirpe de levedura DC5 foi depositada na
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-Ί5American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, E.U.A., de acordo com os regulamentos do tratado de Budapeste, em 2 de □unho de 1982, sob o número de acesso ATCC 20630. A estirpe de levedura 10S44C foi depositada na American Type Culture Col. lection, Rockville, Maryland, E.U.A., de acordo com os regulamentos do Tratado de Budapeste, em 18 de Agosto de 1986, sob o número de acesso ATCC 20819. Prevê-se que a esperada proteína híbrida para pRIT12573 contenha 277 aminoácidos e que para pRIT12574 contenha 333 aminoácidos.
J
E também possível adicionar ou aumentar a região do epítopo CS no vector do invento. Por exemplo, nos plasmídeos pRIT12572 e pRIT12571 podem ligar-se fragmentos Sau3A adicionais, de ADN de proteína CS, p.e. fragmentos Sau3A de 192 pb ou de 24 pb, nos sítios BamHI, como se segue:
ADN de plasmídeo de pRIT12572 ou de pRIT12571 é digerido com endonuclease BamHI e tratado com fosfatase alcalina. 0 fragmento Stul-Rsal, de 1215 pb, de plasmídeo WR201, obtido co mo se descreveu anteriormente, é digerido com endonuclease Sau3A para libertar os fragmentos de 192 pb e de 24 pb contendo as repetições de tetrapéptidos. Estes fragmentos são mistu rados com os vectores pRIT12572 ou pRIT12571 tratados com fosfatase alcalina e com BamHI, tratados com T4 ADN ligase e as misturas são transformadas em células de E. coli K12, de acordo com procedimentos convencionais com selecção para resistência à ampicilina. Analisaram-se os plasmídeos das colónias de transformantes, relativamente ao tamanho dos fragmentos BamHI-Xbal, por digestão com endonuclease e compararam-se com ADN de pRIT12572 ou pRIT12571 digerido de modo semelhante, especialmente com os fragmentos BamHI-Xbal, de 411 pb e 243 pb, de pRIT12572 e pRIT12571, que transportam a fusão entre as repeti, ções CS e parte da sequência de codificação pre S2-S. 0 aumeri to do tamanho destes fragmentos em 192 pb ou 24 pb, é indicati vo da inserção de um fragmento de repetição de tetrapéptido no sítio BamHI de pRIT12572 e pRIT12571. A presença de um sítio BamHI nesses plasmídeos é indicativa de inserção dos fragmentos Sau3A de 192 pb ou de 24 pb na orientação correcta para fusão
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-76no códão ATG. Se se desejar, este processo descrito acima pode ser repetido para introduzir mais fragmentos Sau3A de 192 pb ou de 24 pb, codificando as repetições de tetrapéptidos CS e para alongar a região de tetrapéptidos de CS na partícula hí brida. Como se afirmou acima, os fragmentos HindIII desses de, rivados de pRIT12572 ou de pRIT12571 transportando o módulo ou cassettes de expressão podem ser excisados e inseridos em YEpl3 ou outro vector de clonação em levedura adequado para in trodução em células de levedura por técnicas convencionais.
B. Construção de pRIT12309, pRIT12314 e de um vector vaivém de expressão pRIT12377 contendo a sequência de ADN completa, com 2 micron, em levedura plasmídeo pRIT12309 consiste na sequência completa de ADN de 631Θ pb, com 2 micron, de levedura, clonada no sítio EcoRI do vector plasmídeo pBR327. A sequência de ADN de 6318 pb, com 2 micron, foi obtida do plasmídeo pCl/19 de 3. Broach, Princeton University, N3. 0 plasmídeo pRIT12309 foi depositado em 18 de Agosto de 1986 na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, E.U.A., em £. coli K12 estirpe MM924 de acordo com os regulamentos do Tratado de Budapeste sob o número de acesso ATCC 67187. A Figura 13 é um mapa de endonuclease de restrição de pRIT12309. A inserção, em pBR327, da sequência de ADN com 2 micron, através de um dos dois sítios EcoRI presentes nessa molécula interrompe a região de codificação A de 2 micron e torna a molécula híbrida resultante, pRIT12309, ineficaz para a função de gene A, também designada por função FLP. Para uma descrição da estrutura de 2 micron e função ver Broach 3., The Molecular Biology of the yeast Saccharomyces: Life cycle and Inheritance, pág. 445-470, Strathern 3.N., 3ones E.W. e Broach 3.R. (Eds), Cold Spring Harbor Laboratory, Neuj York (1981).
pBR327 é descrito por Soberon et al. (Gene, _9, 287-305, 1980) e foi obtido de F. Bolivar (Department of Molecular Biology, National University of México, México 20DF). E evidente para o especialista que o pBR327 pode ser recuperado a partir do plasmídeo pRIT12309 anterior, preparando ADN de plasmídeo
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-77pRIT12309, recuperado da estirpe de £. coli depositada na American Type Culture Collection sob o número de acesso ATCC 67187, por qualquer um dos numerosos métodos convencionais, di. gerindo este ADN com endonuclease EcoRI, ligando o digerido e transformando células competentes de E,. coli K12 em resistentes à ampicilina ou à tetraciclina com a mistura de ligação. Um número substancial das colónias de transformantes conterá plasmídeos nos quais apenas a parte pBR327 de pRIT12309 está presente sem qualquer dos dois fragmentos de ADN de 2 micron.
fragmento Clal-Sall de 2850 pb contendo a cassette de expressão TDH3-arg'? e as sequências flanqueadoras pBR322 de pRIT12290 (descrito no Exemplo 3 anterior) foi reclonado no vector pRIT12309, entre os sítios Ciai e Sall. 0 plasmídeo re sultante pRIT12314 foi digerido com endonuclease Sall e ligado com o fragmento Sall-Xhol, de 2218 pb, de YEpl3 contendo o gene de levedura LEU2. A Figura 14 é um diagrama de blocos que ilustra a preparação de pRIT12314. YEpl3 está disponível na American Type Culture Collection sob o número de acesso ATCC 37115. A mistura de ligação foi usada para transformar células competentes da estirpe JA221, preparadas de acordo com o método de Cohen et al (anterior) em independentes da leucina e resistentes à ampicilina.
A estirpe 3A221 está disponível ao público e foi obtida de M. Rosenberg, Smith Kline & French Laboratories, Inc., Philadelphia e pode ser obtida na American Type Culture Collection sob o número de acesso ATCC 33875.
Um plasmídeo, pRIT12544, foi obtido de uma colónia desta transformação, no qual o fragmento de gene LEU2 Sall-Xhol de 2218 pb foi inserido no sítio Sall de pRIT12314. A orientação da inserção é tal que recria o sítio Sall no lado mais próximo da cassette de expressão TDH3-arg\ 0 plasmídeo pRIT12544 é um vector vaivém E. coli - levedura com sítios únicos BamHI e Smal localizados entre as regiões do promotor TDH3 e de termina ção de transcrição arg que são adequados para inserção das se, quências de codificação de ADN para efectuar a sua expressão a partir do promotor TDH3. A Figura 14 é um diagrama de blocos
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-78que ilustra a preparação de pRIT12544.
C. Construção do Plasmídeo pRIT12658 fragmento Hindi11, de 3328 pb, de pRIT12574, um deriva^ do de YEpl3 preparado como foi descrito no Exempla 10, Parte A, foi reclonado num plasmídeo pBR322 Δ BamHI (onde o sítio BamHI foi destruído por enchimento com T4 ADN polimerase) para dar pRIT12608 onde o sítio BamHI, localizado no códão de iniciação ATG da sequência de codificação de CS - AgsHB, é único (Figura 15). 0 fragmento BamHI-SalI, de 2550 pb, de pRIT12608,
I contendo a sequência de codificação CSAgsHB, a região de termi nação de transcrição arg e a sequência flanqueadora pBR322, foi reclonado entre os sítios BamHI e Sall de pRIT12544 (Figura 15), descrito anteriormente, para dar o plasmídeo pRIT12658 (Fig. 15). Esta troca colocou as sequências de codificação de CS-AgsHB sob o controlo do promotor TDH3 num vector vaivém cojn pleto de levedura, com 2 micron. A Figura 15 é um diagrama de blocos que ilustra a preparação de pRIT12658.
Exemplo 11. Síntese de proteína híbrida em levedura
Estirpes DC5 ou 10S44C de levedura (Saccharomyces cerevisiae) foram transformadas de acordo com o método de Ito et al. (J. Bacteriol., 153, 163-168, 1983) com cada um dos plasmídeos > pRIT10912 (Exemplo 5), pRIT12573 (Exemplo 10); pRIT12574 (Exem pio 10) ou pRIT12658 (Exemplo 10), ou dos plasmídeos pRIT12329, (Exemplo 9) e pRIT10172 (Exemplo 2), e foram cultivadas, separadamente, em meio liquido sem leucina (YNB ou YNB + 80jng/ml de histidina) e colhidas em fase log média. Recolheram-se as células de 1 ou 2 ml d^ultura, por centrifugação, e ressuspejn deram-se em 50 jjX de tris-HCl 0,125 M (pH6,8) contendo glicerol a 20%, SDS a 4%, ureia 6 M 2-mercaptoetanol a 10%. Após incuba ção durante 5 minutos (min.) a 100°, dividiu-se a amostra ao meio e fez-se a electroforese das duas metades através de um gel de separação a 12,5/ó, gel de stacking a 5% de acordo com o método de Laemmli (Nature, 227, 680, 1971).
As sequências de proteína na CS e de AgsHB foram identificadas por técnicas de immunoblotting de proteína (Ver,
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-79Burnette, Anal. Biochem., 112, 195-203, 1981; Gershoni e Pala de, Anal. Biochem., 131, 1-15, 1983; Tou/bin e Gordon, 0. Immunol. Methods, 72, 313-340, 1984). Após electroblotting das proteínas num filtro de nitrocelulose (Schleicher e Schull, 0,45 ) (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 76,
4350-4354, 1979) o filtro foi pre^-incubado durante uma hora a 372C com gelatina a 3% em PBS. Subsequentemente, o filtro foi lavado 5 vezes, durante 5 min. de cada vez, com PBS contendo Tween 20 a 0,1% (monolaurato de polietileno-sorbitano) e metade da folha foi tratada, durante uma hora à temperatura ambieri te, com uma mistura de cinco anticorpos monoclonais contra pro teína CS (Dame et al., Science, 225, 593-599, 1984) em PBS, ge. latina a 1%. A outra metade da folha foi tratada com um anticorpo monoclonal contra AgsHB, HepYTAS12, em PBS, gelatina a 1%. HepYTAS12 é um anticorpo criado contra AgsHB derivado de levedura, purificado, que é dirigido contra um epítopo resistente à redução e à desnaturação. As folhas de filtro foram lavadas 5 vezes, durante 5 min. de cada vez, com PBS, Ttueen 20 a 0,1% e adicionou-se um segundo anticorpo de carneiro anti-ra to biotinilado (Amersham) em PBS, gelatina a 1%, durante uma hora à temperatura ambiente. As folhas foram de novo lavadas com PBS, Tu/een 20 a 0,1%, 5 vezes, durante 5 min. de cada vez, e foram incubadas durante 30 min. à temperatura ambiente com complexo de estreptavidina-peroxidase de rábano biotinilada (HRP) (Amersham). As folhas foram de novo lavadas 3 vezes, cinco minutos de cada vez, com PBS, Tween 20 a 0,1% e finalmeri te foram incubadas com 30 3L de H^O^ e com HRP Color Development Reagent contendo 4-cloro-l-naftol (BioRad), 30 mg em 10 ml de metanol, em 50 ml de PBS. Estimou-se o peso molecular dos antigénios a partir de marcadores de proteína pré-corados, ovalbumina, alfaquimotripsinogénio, beta-lactoglobina, lisosima, citocromo C (BRL).
As duas estirpes de levedura, DC5 e 10S44C, transformadas com pRIT12573, mostraram produzirem um antigénio que reage com anticorpos tanto anti-CS como anti-AgsHB e que tem um peso molecular estimado de 30 000 quilodaltons (kd). Ambas as estir pes de levedura DC5 e 10S44C, transformadas quer com pRIT12574
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-80quer com pRIT12658 mostraram produzir um antigénio capaz de reagir com anticorpos anti-CS e anti-AgsHB, e que tem um peso molecular estimado de 37 000 kd. Detectou-se também antigénio com peso molecular inferior, indicativo de alguma degradação da proteína híbrida. As amostras de controlo, de células contendo plasmídeos sem quaisquer sequências de CS ou de AgsHB (pRIT10172) não apresentaram qualquer reacção. As amostras de controlo, de células contendo plasmídeos apenas com sequências de AgsHB (pRIT12329 ou pRIT10912) apresentaram reacção sé com anticorpos anti-AgsHB.
Estes resultados mostram que uma proteína híbrida com o peso molecular esperado, contendo tanto sequências de CS como de AgsHB, é sintetizada em levedura transformada com um plasmí deo contendo a sequência de codificação de CS fundida em fase à sequência de codificação Pre S2-AgsHB.
Além disso, embora a intensidade da banda na reacção anti-AgsHB fosse aproximadamente igual para pRIT12573 e pRIT12574, a intensidade da reacção anti-CS fci muito maior para pRIT12574 do que para pRIT12573. Isto indica que para as mesmas quantidades de sequências de AgsHB, em pRIT12574, existem mais sequências do epítcpo repetitivo da proteína CS do que em pRIT12573.
Exemplo 12. Síntese de partículas híbridas apresentando epípoto CSP
Cultivaram-se, até ao final da fase log, estirpes de leve, dura (Saccharomyces csrevisiae) DC5 ou 10S44C contendo quer pRIT10172 (Exemplo 2), pRIT12329 (Exemplo 9), pRIT12573 (Exemplo 10) quer pRIT12574 (Exemplo 10), em meio selectivo (200 ml de YNB ou de YNB + 80 ^g/ml de histidina). Recolheram-se as células por centrifugação e ressuspenderam-se em 10 ml de tampão fosfato de sódio 50 mM (pH 7,4) contendo Tween 20 a 0,5% (monolaurato de polioxietileno-sorbitano), PMSF 1 mFi (fluoreto de fenilmetilsulfonilo) e isopropanol a 2,5%. As células foram abertas por duas passagens através de uma Prensa Francesa a 20 000 psi (1,38 x 10 Pa). A suspensão foi centrifugada dura_n te 30 min. a 30 000 xg. A concentração total de proteína do 11
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-81quido sobrenadante (extracto celular bruto), foi medida pelo método de Lotury et al (0. Biol. Chem., 193, 265-275, 1951) usando albumina de soro bovino como padrão. A presença de AgsHB foi analisada usando um conjunto de radio-imunoensaio (AUSRIA II) vendido por Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois ou usando um conjunto ELISA (Enzygnost-HBsAg micro) vendido por Behringwerke, Marburg, Alemanha Ocidental. A disp.o nibilidade para uma imunorreacção, apresentada pelas sequências CS nas partículas de AgsHB, foi testada no ensaio ELISA mejn cionado acima. As amostras a ser testadas, em diluiçães apropriadas (em PBS contendo BSA a 0,2/ó) foram deixadas ligar (durante a noite e à temperatura ambiente) ao anti-AgsHB de fase sólida (conjunto Enzygnost). As partículas de AgsHB ligadas foram incubadas durante uma hora a 379C com uma diluição de 1/10 000 (em PBS contendo BSA a 0,1/) de uma mistura de cinco anticorpos monoclonais dirigidos contra a proteína CS (Dame et al., Science, 225, 593-599, 1984), como primeiro anticorpo, e em seguida foram incubadas com uma diluição de 1/500 (em PBS contendo BSA a 0,1/) de Ig de carneiro anti-rato biotinilada (Amersham), como segundo anticorpo, durante uma hora a 372C. A detecção foi efectuada por incubação com uma diluição de 1/1000 (em PBS contendo BSA a 0,1/) de complexo de estreptavidina-pero xidase de rábano biotinilada (Amersham) e cromogénio do conjun to Enzygnost durante 30 min. a 372C. Entre as incubações lavai ram-se os tabuleiros quatro vezes com solução de lavagem do conjunto Enzygnost. 0 desenvolvimento da cor foi medido a 510 nm num Titertek Multiskan (Dynatech).
A medição da concentração de proteína e de actividade AUSRIA (Quadro II) em extractos celulares brutos mostrou que o pRIT12573 dirige a expressão de AgsHB ao mesmo nível que o pRIT12329. No entanto, o pRIT12574 mostrou uma actividade AUSRIA cerca de dez vezes inferior. A análise destes extractos por immunoblot mostrou, nestes três casos, uma quantidade igual de proteína relacionada com AgsHB, sintetizada.
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-82Quadro II - Actividade AUSRIA em extractos celulares brutos
Plasmídeo Gene Proteína AgsHB (RIA) Proteína AgsHB ng/ mg
(mg/ ml) (ng/ml)
pRIT10172 - 5,6 0 0
pRIT12329 S 3,3 5700 1730
pRIT12573 CS( 24 pb) PreS2-S 3,6 4000 1110
pRIT12574 CS(192 pb) PreS2-S 2,8 450 160
► ensaio ELISA mostrou que está presente nos extractos de pRIT12573 e de pRIT12574 (Quadro III) uma estrutura que expressa tanto o epítopo AgsHB comoo CS e que existem mais epítoi pos CS por epítopos AgsHB que reagem em extractos de pRIT12574 do que em extractos de pRIT12573.
Para examinar a natureza destas estruturas positivas para RIA e ELISA, misturou-se um ml de extractos celulares brutos com CsCl 1,5 M em fosfato de sódio 50 mM (pH 7,4) e centrifugou. -se durante 40 horas a 40 000 xg num rotor Beckman SW50.1. As fracçães recolhidas foram analisadas relativamente à presença de actividade de ligação a anticorpo para AgsHB e CS usando os ) métodos RIA e ELISA descritos anteriormente. Verificou-se que a actividade antigénica de AgsHB e CS se co-equilibra em ambos os gradientes de pRIT12573 e pRIT12574. Verificou-se que as suas densidades flutuantes (buoyant density) eram ligeiramente maiores (rho = 1,20 g/crn ) do que a do pRIT12329 (rho = 1,18 g/ cm\
Análises das fracçães de gradiente, por immunoblot coji firmaram os resultados RIA/ELISA. Só se encontraram sequências de AgsHB e/ou de CS nas fracçães que reagiram no ensaio RIA/ELJ. SA.
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ν...Μβ*?.ΐ03·»
..*·*·
-83Quadro III - Epítopos de AgsHB e CS presentes em antigênios ligados a anticorpo anti-AgsHB imobilizado
Extracto celular bruto de: Diluição ELISA (AgsHB) 0D510 nm ELISA (CS) 0D510 nm
10S44C (pRIT10172) lOOx 0,000 0,065
10S44C (pRIT12329) 100x 0,580 0,054
200x 0,341 0,041
400x 0,188 0,056
10S44C (pRIT12573) lOOx 1,298 1,596
200x 1,080 1,299
400x 0,702 0,898
800x 0,336 0,560
1600x 0,155 0,323
3200x 0,075 0,189
10S44C (pRIT12574) lOOx 0,662 1,678
200x 0,370 1,506
400x 0,183 1,130
800x 0,079 0,798
1600x 0,044 0,449
3200x 0,061 0,205
Estes resultados indicam que a proteína híbrida produzida por expressão de pRIT12573 e pRIT12574 se reúne em partículas semelhantes às partículas de AgsHB com 22 nm, depois da síntese em levedura. As partículas produzidas por expressão de pRIT12573 e de pRlT12574 expãe as sequências CS no seu extje rior como se vê pela sua capacidade em reagir com anticorpos anti-CS. No caso de pRIT12574, essas sequências CS obstruem parcialmente a acessibilidade do determinante ja de AgsHB (o principal responsável pela actividade AUSRIA) no teste RIA.
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-84Exemplo 13.
A. Purificação das partículas híbridas extracto celular bruto da estirpe de levedura 10S44C contendo pRIT12574, preparado como se descreveu no Exemplo 10, foi clarificado por precipitação com polietileno-glicol (PEG) 400 e concentrado por ultrafiltração num AMICON DC equipado com um cartucho possuindo interrupção cut-off a 100 000 daltons.
Purificaram-se ainda mais as partículas híbridas por mé| todos conhecidos na técnica, por exemplo, centrifugação com
CsCl, cromatografia em hidroxiapatite e filtração em gel.
A preparação purificada, final, de extracto celular de 10S44C contendo pRIT12574 mostrou um pico principal no volume de exclusão de uma coluna HPLC TSK-3000 (LKB) que continha tari to a antigenicidade de AgsHB como de CS. Electroforese em SDS. poliacrilamida-gel (Laemmli, Nature, 227, 680, 1971) seguida por coloração com prata (Wray et al., Anal. Biocnem., 118, 197-203, 1981) mostrou uma banda maior de peso molecular estimado (PM) de 37 000 kd. A microscopia electrónica após coloração negativa com acetato de uranilo mostrou partículas com aproximadamente o mesmo tamanho e forma dos AgsHB derivados de leveI dura.
B. Purificação das partículas híbridas
Preparara-se extractos de levedura brutos por abertura, com Dyno Mill, das células de levedura lavadas, na presença de um peso igual de tampão de extracção de fosfato de sódio 50 mM (pH 8,1) suplementado com Titriplex III 4 mM, Tuieen 20 a 1/, PMSF 4 mM e isopropanol a 10/,
Os desperdícios celulares são removidos por centrifugação a 11 000xg durante 90 min. Quinhentos ml de extracto celular bruto são ajustados a pH 7,2 com ácido acético IN e agitados durante a noite a 49C na presença de 10 g de sílica coloidal (Aerosil 380, Degussa). Subsequentemente, a suspensão é centrifugada a 3 500 g durante 1 hora e a pelota é lavada três ve. zes com 150 ml de NaCl 0,15 M suplementado com PMSF 2 mM e EDTA
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-855 mM durante J5 min. Finalmente a pelota de Aerosil é eluída com 250 ml de tampão pirofosfato 10 mM (pH 9,5) contendo Tuueen 20 a 2%, a 3790 durante 3 horas. Ao desorvido adiciona-se, qo ta a gota, uma solução de CaCl2 1 M até uma concentração final de 30 mM de CaCl2 e o pH é ajustado a 7. A solução ó deixada a 42C, durante a noite e centrifugada a 6 500 g durante 15 minutos. 0 sobrenadante é dialisado contra 2 x 5 1 de Tris 10 mM/HCl (pH 7,1) a 42C e subsequentemente diluído quatro vezes com tampão de diálise.
Após adição de CaCl2 30 mM e NaCl 1 M, a solução de anti génio, diluída, ajustada a pH 7,1, é passada através de uma cjd luna de 150 ml de Phenyl Sepharose FF, equilibrada no mesmo tampão Tris contendo CaC^/NaCl, a um caudal de 30 cm/h. Subs.e quentemente a coluna é lavada com tampão de equilibração até que a ureia 0D280nm diminua até zero,
M em Tris 10 mM/HCl, pH 9.
eluída ao mesmo caudal com
Alternativamente, a solução de antigénio dialisada e diluída quatro vezes é suplementada com (NH^^SO^ a 20% (pH 7) e passada numa coluna de 150 ml de Phenyl Sepharose FF, equilibrada em Tris 10 mK/HCl (pH 7,1), (NH^^SO^ a 20%, a um caudal de 30 cm/h. Após 1 auagem da coluna com tampão de equilibração, a co luna é eluída, ao mesmo caudal, com Tris 10 mM/HCl, pH 7,1.
As fracções de antigénio positivas são reunidas e finalmente centrifugadas num ou dois gradientes de densidade de CsCl sucessivos, a 42C e 245 000 g durante 65 h. As partículas híbridas purificadas de Cs-AgsHB têm uma densidade flutuante de 1,23 g/cm^.
Exemplo 14. Imunogenicidade das Partículas híbridas
Incularam-se, em animais laboratoriais, partículas híbri das, purificadas da estirpe 10S44C de 5. cerevisiae contendo pRIT12574, preparadas pelo método do Exemplo 13, tal como estão ou com hidróxido de alumínio como adjuvante (Young et al., Science 228, 958-962, (1985).
Ratinhos C57B1/6 (6-8 semanas), cobaias, e coelhos foram imunizados subcutaneamente ou intraperitonealmente nos 0, 219
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Tf ^-í··'·;^
-86e 492 dias. Os animais foram sangrados nos 72, 282, 562 e 842 dias. Deixou-se 0 sangue coagular a 42C durante a noite e separaram-se os soros e armazenaram-se a -705C até se usarem.
Os coelhos, 2 grupos de 2 animais cada, receberam, em ca da imunização, 10 ykg da proteína híbrida CS-AgsHB em doses de 1,0 ml, com ou sem hidróxido de alumínio. Como controlo, 2 coe, lhos foram imunizados com 10 y>g de Heptavax B'-' (Merck Sharpe & Dohme) seguindo 0 mesmo esquema de inoculação. Os ratinhos e as cobaias, em grupos de cinco animais, receberam, em cada imunização, respectivamente, 1 yxg e 5 y*g de proteína híbrida, em doses de 0,5 ml. 0s animais não imunizados serviram como controlos.
Para determinação das respostas dos anticorpos, os soros dos ratinhos foram reunidos em cada grupo enquanto que os soros das cobaias e dos coelhos foram analisados individualmente. Os títulos de anticorpos anti-CS foram medidos por ensaio ELISA usando a proteína CS recombinante R32tet32 como antigénio(Ver, Young et al., Science, 228, 958-962, 1985). Os títulos Anti-AgsHB foram determinados usando o conjunto AUSAB (Abbott Labo ratories) e a referência WHO.
Nem as cobaias nem os ratinhos desenvolveram respostas apreciáveis dos anticorpos ao AgsHB apesar dos repetidos refojç ços. Pelo contrário, as duas espécies animais desenvolveram anticorpos anti-CS e estas respostas foram aumentadas pelos re forços. Obteve-se uma absorvância de 1,0 no ensaio ELISA com diluições de soro de 1600 vezes (ratinhos) e 9000 vezes (cobai. as). A imunogenicidade das partículas híbridas não foi aumentada pela adsorção em hidróxido de alumínio.
Pelo contrário, os coelhos desenvolveram anticorpos para CS e AgsHB. 0s títulos recíprocos a uma absorvância de 1,0 no ensaio ELISA anti-CS foram de entre 80C e 3 200. Os títulos anti-AgsHB obtidos com as partículas híbridas adsorvidas em hi dróxido de alumínio foram de entre 4 000 e 20 000 mUl/ml enquanto que os coelhos imunizados com Heptavax deram títulos de
6/ a 10 mUI/ml. A adsorção das partículas híbridas em hidró. xido de alumínio aumentou a resposta imunitária.
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-87Os soros dos ratinhos cobaias e coelhos reagiram todos, fortemente, na reacção da precipitina de circunsporozoíto e inibiram também in vitro a invasão das células de hepatoma por esporozoíto (Young et al., Science 228, 958-962, 1985). (Ver Quadro IV). Ambas as reacções são indicativas de uma resposta imunoprotectora.
Quadro IV - Reactividade da precipitina de circumsporozoíto (CSP) e percentagem de inibição da invasão por esporczoíto ISl) das células de hepatoma HepG2-A 16
I ___________________________________________________________________________________________________________________
Animais 1 semana depois do 25 reforço Reactividade CSP o) % ISI
(4+ 2 +
Soros dos ratinhos reunidos 14 9 2 91/
Coelho 36 22 3 0 96%
Cobaia #1107 24 1 0 100/
grau de reactividade CSP é indicado entre parêntesis:
- Reactividade CSP não detectável
2+ - precipitado granular na superfície do esporozoíto
4+ - filamento do tipo fio do fim do esporozoíto
Exemplo 15. Preparação de vacina
Prepara-se uma vacina ilustrativa do presente invento co mo se segue: a uma solução aquosa, tamponada de hidróxido de alumínio a 3% (fosfato de sódio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 6,8; es. terilizados por filtração) adiciona-se, com agitação e em tampão semelhante, a partícula do invento, até uma concentração final de 100 y*g/ml de polipéptido e 0,5 mg/ml de alumínio (Al3+). 0 pH é mantido a 6,8. A mistura é deixada durante a noite a cerca de 02C. Adiciona-se timerosol até uma concentrai ção final de 0,005%. 0 pH é medido e se necessário ajustado a pH 6,8.
Embora o que se expôs descreva completamente o invento e todas as suas concretizações preferidas, ê evidente que o in67 100
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-asvento não está limitado às concretizações descritas particulaj? mente mas pelo contrário inclui todas as modificações abrangidas pelo âmbito das reivindicações.
EXEMPLOS DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNA Pre S2-S E DE PROTEÍNA Pre Sl-Pre S2-S POR LEVEDURA
Foi agora descoberto que a inserção, numa levedura, da re gião de codificação da proteína Pre S2-S deste invento em vector de expressão em levedura tem como resultado a síntese de partículas semelhantes às autênticas partículas de AgsHB com 22 nm expondo proteína Pre S2 glicosilada nas suas superfícies . Não tinha sido anteriormente referido, correctamente, que a le, vedura, transformada com qualquer porção do genoma de HBV expressa um produto glicosilado.
Os exemplos que se seguem referem-se à expressão em leve, dura da forma glicosilada de uma proteína contendo a região Pre S2 em adição à proteína S do antigénio de superfície da He patite B. A proteína pode ser extraída e purificada a partir de células de levedura na forma de partículas para uso como va cina para humanos. A proteína Pre Sl-Pre S2-S expressa em células de levedura, é também glicosilada e também pode ser daí extraída e purificada na forma de partículas para uso numa vacina contra vírus B da Hepatite.
Em relação às investigações sobre a glicosilação, deve notar-se o seguinte:
1. Os exemplos 25, 26 e 27 referem-se a ligação a concanavali. na, A, efeito de tunicamicina e sensibilidade a Endo H, res. pectivamente. Cada um deles prova quer a espécie da proteína pre S2-S de 33 kd é glicosilada. Assim, a glicosila ção foi provada por três métodos independentes;
2. a especificidade destes reagentes é a seguinte, em termos gerais:
a) a concanavalina A liga-se preferencialmente a resíduos manose;
b) a tunicamicina inibe todos os tipos de glicosilação que são ligados N-glicosidicamente a asparagina;
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c) a endoglicosidase H cliva os oligossacáridos com muita manose ligada a asparagina deixando um resíduo N-acetilglucosamina ligado à asparagina;
3. dos resultados combinados, dos Exemplos 25, 26, 27 e do que se expôs, deduz-se que existe uma cadeia de oligossacárido, ligada em N, na forma de 33 kd da proteína pre S2-S (inibi ção por tunicamicina, sensibilidade a Endo H) que é do tipo de manose elevada (sensibilidade a Endo H). 0 desvio observado no peso molecular (cerca de 3 000) após tratameji to com tunicamicina e digestão com Endo H, indica que a es. trutura de oligossacárido é composta por cerca de 10 resíduos de açúcar. Esta á a extensão aproximada de uma glico silação nuclear, em levedura. Assim, provavelmente apenas um dos três sítios de glicosilação potenciais na proteína Pre S2-S está glicosiladoj
4. os esquemas de purificação descritos nos Exemplos 28 e 29 contêm ambos um passo de cromatografia de afinidade baseado em resíduos de açúcar de uma glicoproteína;
5. o fenilboronato tem uma especificidade por grupos 1,2-cis-diol (2 grupos 0H adjacentes posicionados estereoquimicamente na mesma direcção)j
6. a Lentil Sepharose á específica para glucose/manose.
Exemplo 16. Construção de pRIT12662 - um vector E. coli conte_n do a cassette de expressão de Pre S2-S (Figura 16).
plasmídeo pRIT12290, obtido como se descreveu no Exemplo 3 anterior, foi modificado pela inserção de um fragmento adaptador sintético BamHI-EcoRI codificando os aminoácidos do N-terminal da região pre S2 entre os fragmentos do promotor TDH3 e do terminador ARG3. Conseguiu-se isto da seguinte forma:
o plasmídeo pRIT12290 foi digerido com enzimas BamHI e EcoRI e desfosforilado com fosfatase alcalina, 200 pmoles do adaptador sintético fosforilado:
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Λ-· r
-90-
Gin T rp
BamHI 5' GATO CAG TGG 3’ EcoRI
3' GTC ACCTTAA 5'
foram ligadas com 0,1 pmoles do plasmídeo pRIT12290 desforilado em BamHI-EcoRI usando 1 unidade (U) de T4 ligase e usadas para transformar a estirpe MM294 de E. coli em resistente à ampicilina. Identificou-se e reteve-se um transformante que inclui o plasmídeo desejado com o adaptador sintético inserido entre os sítios BamHI e EcoRI. 0 plasmídeo foi identificado como pRIT12621. Começando com o plasmídeo pRIT12621, os passos seguintes foram a eliminação dos quatros pares de bases extra (o núcleo do sítio BamHI), de modo a pôr o códão ATG em fase com o segundo códão da região Pre S2, e a inserção de um fragmento EcoRI, contendo o resto da região de codificação pre S2 e a região de codificação S completa, no sítio EcoRI de pRIT12621 para completar a região de codificação pre S2-S inteira.
Nesta etapa as manipulações do ADN, incluindo subsequente linearização, delecção e recircularização do plasmídeo pRIT12621, foram realizadas sem amplificação, por transformação dos plasmí deos intermediários usando o seguinte procedimento:
linearizaram-se 30 pmoles (120 yUg) de ADN de pRIT12621 com 120 U de BamHI. Após eliminação da enzima de restrição por extracção com fenol, o plasmídeo foi precipitado com etanol e ressuspenso em tampão apropriado para digerir as extensões do cordão único BamHI com 280 unidades (U) de nuclease de mung bean. A nuclease foi eliminada por extracção com fenol segui da de precipitação com etanol. 0 plasmídeo assim tratado foi ressuspenso em tampão de ligação e recircularizado com 10 unidai des de T4 ligase.
A preparação contendo o plasmídeo ligado foi tratada com fenol, precipitada com etanol e ressuspensa em tampão apropria, do e digerida com enzima EcoRI. Após eliminação de endonuclea^ se EcoRI por tratamento com fenol e precipitação com etanol, ressuspenderam-se 0,05 pmoles (0,2 jjq') de ADN no tampão de li gação de modo a serem ligadas com 0,4 pmoles (0,2 ug) de um
.....f
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-91fragmento EcoRI com 838 pares de bases isolado de pRIT12581, que contém toda a região de codificação C-terminal da proteína pre S2-S. Pode construir-se, como se segue, um plasmídeo essencialmente semelhante ao pRIT12581. 0 vector pUC9 (vendido por Amersham e Pharmacia) é digerido com endonuclease EcoRI e tratado com fosfatase alcalina (Shine, Patente dos E.U.
264 731). 0 plasmídeo pRIT10616 (ATCC 39131) é digerido com endonucleases de restrição EcoRI e Accl e o fragmento EcoRI-Aççl 826 contende parte da região de codificação Pre S2-S é recuperado por electroforese preparativa em acrilamida-gel e
slectroeluição. Cerca de 0,4 pmoles (0,2 yug) deste fragmento
são misturados com cerca de 10 pmoles do seguinte adaptador siri
tético de 12 pb previamente temperado (annealed) como
Ile
Tyr Stop
5' ATACATTTAACG 3'
Aççl EcoRI
3’ TGTAAATTGCTTAA 5 ’
descrito no Exemplo 8 atrás, e a mistura é tratada com 14 ADN ligase e digerida com endonuclease de restrição EcoRI. Adicio nam-se à mistura assim tratada cerca de 0,2 y*g do vector pUC9 tratado com fosfatase alcalina e digerido com EcoRI, preparado como se descreveu anteriormente, e a mistura é tratada com T4 ADN ligase e usada para transformar células competentes de E. coli K12 em resistentes à ampicilina, por procedimentos cori vencionais. Examinaram-se as colónias do transformante para determinar a presença de um plasmídeo consistindo no vector pUC9 de 2650 pb em conjunto com um fragmento EcoRI de 838 pb composto do fragmento EcoRI-AccI pre S2-3 de 826 pb en conjunto com o ligante sintético AccI-EcoRI. A correcção da constru ção assim identificada pode ser verificada por sequenciação de ADN usando o método de modificação química de Maxam e Gilbert (Methods in Enzymology, 65, 499, 1980), preferivelmente de um único sítio de restrição flanqueador no poli-ligante pUC9.
A mistura de ligação contendo o ADN de plasmídeo de pRIT12621, tratado como se descrc-iveu anteriormente, e o fragmeji
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-92to EcoRI, de 838 pb, de pRIT12581 foi usada para transformar a estirpe MM294 de E. coli, de acordo com o método de Cohen et al. citado anteriormente. Reteue-se um transformante contendo um plasmídeo com o fragmento EcoRI na orientação correcta e identificou-se como pRIT12662 (Ver, Figura 1A e Figura 16). A Figjj ra 1A é um diagrama de blocos ilustrando a preparação de pRIT12662. A Figura 16 é um mapa de endonuclease de restrição de pRIT12662. A região pre S2 de pRIT12662 foi sequenciada pe. lo procedimento de modificação química de Maxam e Gilbert (Methods in Enzymology, 65, 499, 1980) para verificar que a es. trutura de leitura de codificação no terminus N era a seguinte:
Met Gin Trp Asn Ser
AAAC AAAC AAA ATG CAG TGG AAT TCC pTDH3 região de codificação pre S2-S
Serâ evidente para o especialista que o vector pRIT12662 também pode ser usado para a introdução de mais sequências de ADN funcionais na região Pre S2 por manipulação in vitro apropriada do ADN do vector. A sequência de codificação pre S2 contém sítios de restrição para endonucleases EcoRI, PstI e BamHI. Qualquer destes sítios pode ser usado para introdução de sequências de ADN funcionais codificando péptidos de interesse para criar fusões, em fase, com a região pre 32. Estas fusões serão do tipo pre 32 - sequência introduzida - pre S2-S. Estes sítios de restrição também podem ser manipulados in vitro para criar outros vectores e proporcionar outros sítios ou estruturas de leitura para inserção de sequências de ADN funcionais, p.e. pelo método de Botstein et al. (Science, 229, 1193-1201, 1985).
Exemplo 17. Construção de pRIT12377 e de pRIT12660, um plasmídeo de levedura expressando a proteína pre S2-S
ADN de plasmídeo pRIT12309, obtido como se descreveu no Exemplo 10 (B), foi digerido com endonuclease Sall e ligado com um fragmento Xhol-Sall de 2218 pb de ADN contendo o gene de levedura LEU2 obtido por digestão de YEpl3 e purificação do
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-93fragmento por electroforese em acrilamida-gel. A mistura ligada foi usada para transformar células de E. coli K12, estirpe 3A221, preparadas de acordo com o procedimento de Cohen et al., citado anteriormente, sendo a selecção feita em relação à resistência à ampicilina e à independência de leucina. A estirpe 3A221 foi obtida de M. Rosenberg, Smith Kline and French Laboratories, Philadelphia, Pennsylvania, E.U.A., e está dispjo nível na American Type Culture Collection sob o número de aces so 33875. Identificou-se um plasmídeo, pRIT12377, a partir de uma colónia de transformantes, que contém o fragmento LEU2 Xhol-Sall de 2218 pb inserido no sítio Sall de pRIT12309.
A orientação do fragmento no vector é tal que recria o sítio Sall no lado Aval da parte pBR327 do vector. 0 plasmídeo pRIT12377 é um vector vaivém levedura-E. coli possuindo as fu_n ções necessárias à selecção, replicação e manutenção em ambos os organismos.
fragmento HindIII, de 3050 pares de bases, de pRIT12662 (Exemplo 16), contendo a cassette de expressão de pre S2-S foi purificado por electroforese em acrilamida-gel, tratado com T4 polimerase e ligado a pRIT12377, previamente aberto por enzima EtemHI θ reparado por T4 polimerase. Esta preparação foi usada para transformar a estirpe MM294 de E. coli em resistente à ampicilina de acordo com o método de Cohen et al. citado anteriormente. Reteve-se um transformante de E. coli que inclui o plasmídeo pRIT12660. A Fig. 17 é um diagrama de blocas ilus trando a preparação de pRIT12660.
Este plasmídeo, pRIT12660 foi usado para transformar duas estirpes de S. cerevisiae, i.e., estirpe DC5 cirB e estirpe 10S44C circs, de acordo com o método descrito por Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 79, 2157-2161, 1978).
As estirpes DC5 cir^ e 10S44C cir^ foram depositadas na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A., de acordo com o Tratado de Budapeste em 18 de Agosto de 1986 sob o número de acesso ATCC 20820 e ATCC 20818, respectivamente.
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-a·#5* >L
-94Exemplo 18» A região pre S2 no plasmídeo pRIT12662
A região pre S2 no plasmídeo pRIT12662 foi sequenciada usando o método de modificação química de Maxam e Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sei», 74, 560-564, 1977) e verificou-se que existiam alterações em quatro pares de bases conduzindo a alte rações em três aminoácidos em relação a outro vírus de serotipo adu>2 (Valenzuela et al», 1980 - Quadro I, página 11). Um resíduo alanina em vez de um resíduo treonina na posição 45, um fenilalanina em vez de um leucina na posição 34 e um resíduo serina em vez de um resíduo isoleucina na posição 11. A última alteração afecta um resíduo que era invariável em todos os serotipos conhecidos até agora (Lo et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 2t 382-388, 1986).
Exemplo 19. Síntese de partículas transportando um receptor para albumina de soro humano polimerizada (pHSA)
Estirpes de levedura (S, cerevisiae) DC5 cirS ou 10S44C cir3 contendo pRIT12660 ou pRIT12363 (Exemplo 16) foram cultivadas em meio selectivo /~200 ml de YNB + 80 l,g/ml de histidina (DC5 cirS) ou YNB (10S44C cir9)_J7 em fase log. (o pRIT12363 é idêntico a pRIT12660 excepto no gene derivado de hepatite; o pRIT12363 contém apenas o gene S). As células foram recolhidas por centrifugação e ressuspensas em fosfato de sódio 50 mM pH 8,0, contendo Tuieen 20 a 0,5/o (monolaurato de polietileno-sorbitano), PMSF 1 mM (fluoreto de fenilmetilsulf onilo) e is o, propanol a 2,5/o. As células foram quebradas por passagem, duas vezes, através de uma Prensa Francesa a 20 000 psi (1,38 x 10θ Pa). A suspensão foi centrifugada durante 30 min. a 30 000 X g. A concentração total da proteína no líquido sobrenadante (extracto celular bruto) foi medida pelo método de Lou/ry et al., (J. Biol. Chem., 193, 265-275, 1951), usando albumina de soro bovino como padrão, A presença de material relacionado com AgsHB foi determinada usando um conjunto de radio-imunoensaio (AUSRIA II) vendido por Abbott Laboratories. Os resultados (Quadro V) indicam que o pRIT12660 dirige a síntese de material antigenicalmente relacionado com as partículas de AgsHB. 0 ní vel de expressão, baseado na actividade AUSRIA ê semelhante às
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das estirpes de levedura DC5 cirS e 10S44C cir3.
Num radio-imunoensaio para detectar um rsceptor para albumina de soro humano polimerizada (pHSA) (Pontisso et al., 3. Virol Methods, 6., 151-159, 1983), extractos celulares brutos de pRIT12660 contendo células deram uma reacção positiva o mesmo não acontecendo com extractos celulares brutos de pRIT12363 contendo células. Não foi observada reacção acima da linha de fundo (background) com albumina de soro bovino.
A centrifugação de equilíbrio em CsCl dos extractos celu lares brutos de pRIT12660 contendo células mostrou que o material positivo em AUSRIA formava uma banda, a cerca de rho = 1,20 g/cm^ tal como o fazem as partículas de AgsHB derivadas de soro ou de levedura. 0 material recuperado desta porção do gradie_n te dá um resultado positivo no teste de pHSA.
Os resultados mencionados acima mostram que em células de levedura contendo pRIT12660 é expressa uma proteína relacio nada com AgsHB que é reunida numa estrutura do tipo das partículas de 22 nm de soro e que expõe um receptor para pHSA na sua superfície.
Quadro VA - Actividade AUSRIA em extractos de células em bruto
Estirpe Plasmídeo Proteína mg/ ml Antigenicidade relacionada com a AgsHB ng/ ml Antigenicidade relacionada com a AgsHB, ng/ /mg de proteína
DC5 eira pRIT12660 13,4 7 522
DC5 cir9 pRIT12660 12,6 7 555
10S44C cirS pRIT12660 10,8 6 556
10S44C cir3 pRIT12660 9,5 6 631
Exemplo 20. Verifica-se que são expressas quatro espécies de
proteínas relacionadas com a S, em levedura transformada com pR!T12660
Para analisar os monémeros de proteína relacionada com
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J' -- Μ*'”' is
-96AgsHB expressos em células contendo pRIT12660, cultivaram-se c& lulas em meio selectivo, em balões Erlenmeyer ou em fermentadçj res, em fase log e recolheram-se por centrifugação.
Ao aglomerado de células (0,1 grama) adicionaram-se primeiro 20 yd. de PMSF 40 mM em isopropanol e em seguida 200yd de tampão de amostra para electroforese em SDS-poliacrilamida-gel (Tris-HCl 0,125 M, pH 6,8 contendo glicerol a 20%, SDS a 4%, ureia 6 M e 2-mercaptoetanol a 10%). As amostras foram submetidas a vortex e diluiram-se depois alíquotas de 2 a 20 ^il em tampão de amostra até um volume final de 40 incubaram-se d_u rante 5 minutos a 1002 e submeteram-se a electroforese através de um gel de separação 12,5/ó, 'btacking 5% de acordo com o método de Laemmli (Nature, 227, 680, 1971).
Apés electroblotting (Touibin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 76, 350-4354, 1979) das proteínas num filtro de nitrocelulose (0,45 y>m, BioRad), o filtro foi pré-incubado durante uma hora a 372C com gelatina a 3% em PBS. 0 filtro foi incubado com um anticorpo monoclonal dirigido contra um epítopo resistente à desnaturação e redução de AgsHB derivado de hu manos (monoclonal 6 obtido de H. Thcmas, Royal Free Hospital, Londres, Inglaterra) e detectou-se ligação de anticorpo por in cubação sucessiva com Ig de carneiro anti-rato biotinilada (RPN 1021, Amersham, diluição de 1/250 em PBS contendo gelatina a 1%), complexo de estreptavidina-peroxidase de rábano bioti nilada (RPN 1051, Amersham, Diluição de 1/400 em PBS contendo gelatina a 1%) e finalmente com 30 JLLL de H2O2 e reagente HRP Color Development contendo 4-cloro-l-naftol (BioRad), 30 mg em 10 ml de metanol em 50 ml de PBS. Entre as incubações, 0 filtro foi lavado com PBS contendo Tuieen 20 a 0,1/.
immunoblot mostrou 4 bandas de proteína relacionada com a proteína Ξ (p23) de pesos moleculares estimados de cerca de 33 kd, 30 kd, 28 kd e 25 kd que são detectadas por anticorpo monoclonal. A maior parte do material relacionado com S eri contra-se na banda de proteína de 33K e verificou-se que migra va ligeiramente mais depressa do que a proteína gp33 descrita por Stibbe and Gerlich (Virology, 123, 436-442, 1982). A banda
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-97de proteína mais pequena detectada migrava mais devagar do que a proteína S (p23) sintetizada em levedura.
Exemplo 21. As quatro espécies de proteína relacionadas com S (de 33Kd, 30Kd, 28Kd e 25Kd) são reunidas em partículas.
Prepararam-se extractos celulares brutos de pRIT12660 (Exemplo 16) contendo células de levedura, como se descreveu no Exemplo 19 ou triturando células de levedura num Dynomill na presença de um peso igual de tampão de extracção (Tris 200 mM, NaCl 3 M, EDTA 10 mM, ácido etileno-glicol-bis (beta-amino etil-éter)-N,N,N N '-tetra-acético (EGTA) 10 mM, PMSF 4 mM, iso. propanol a 10/) e centrifugando, subsequentemente, durante 45 minutos a 30 000 X g.
As partículas comandadas por pRIT12660 foram parcialmente purificadas a partir do extracto celular bruto por ultrafil. tração, centrifugação de equilíbrio em CsCl e cromatografia em hidroxiapatite, métodos conhecidos na técnica. As quatro bandas de proteína de material relacionado com S detectadas por análise por Western blot co-purifiçaram durante estes passos de purificação. Uma análise por immuno-blot (tal como descrita no Exemplo 20) das fracções de CsCl positivas em AUSRIA, após centrifugação de equilíbrio, mostraram que as quatro bandas relacionadas com S estavam presentes nas mesmas proporções relativas em cada fracção.
material é assim distribuído de uma forma homogenea ρ_ε las fracções de pico do gradiente.
Exemplo 22. As proteínas 33Kd e 30Kd transportam um receptor de albumina de soro humano polimerizada
Polimerizou-se albumina de soro humano (Sigma, A 8763) por tratamento com glutaraldeído (Merck, A-12179) e purificou-se de acordo com Pontisso et al. (0. Virol. methods, 6_, 151-159, 1973). A reactividade das quatro proteínas relacionadas com S em relação a pHSA foi testada por um procedimento de Western blot. As preparações de partículas comandadas por pRIT12660, parcialmente purificadas, (Exemplo 21) foram separa.
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das por electroforese em SDS-poliacrilamida-gel e transferidas para uma membrana de nitrocelulose como se descreveu no Exemplo 20. 0 filtro de nitrocelulose foi sucessivamente incubado com pHSA (15 jug/ml em PBS contendo gelatina a 1%), anti-soro de coelho para albumina humana (Behringujerke, ORCB 04/05, diluição de 1/125 em PBS contendo gelatina a 1%, Ig de burro anti-coelho biotinilada (Amercham RPN 1004, diluição de 1/250 em PBS contendo gelatina a 1%, estreptavidina-peroxidase de rábano biotinilada (Amersham RPN 1051 diluição de 1/400 em PBS con tendo gelatina a 1%) e finalmente com ^02 e 4-cloro-l-naftol como se descreveu no Exemplo 20.
As duas bandas de proteína relacionadas com a S maiores (a 33Kd e 30Kd) reagiram com pHSA, as duas mais pequenas (28Kd e 25Kd) não deram reacção.
Exemplo 23. As proteínas de 33Kd e 30Kd contêm uma sequência específica para a região pre S2 da proteína pre S2-S.
Sintetizou-se um péptido correspondendo em 23 das 26 posições aos 26 aminoácidos do N-terminal da proteína pre S2-S ( NF^-Met-Glu-T rp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp-Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Leu-Pro-Ala-Gly-Cys-COOH) e acoplou, -se via C-terminal a hemocianina de keyhole Limpet (espécie de lapa) (Península Laboratories). Imunizaram-se coelhos, sub cutaneamente com 100 do conjugado (que corresponde a 20 w
de péptido) em adjuvante completo de Freund, administram-se re forços nos 83 e 159 dias com mais 100 ug de conjugado em adju vante completo de Freund e nos 289, 699 e 1499 dias com 100 de conjugado em PBS. 0 desenvolvimento do título de anticorpos foi seguido recolhendo amostras de sangue a intervalos regulares e testando diluições de soro por incubação em péptido sintético fixado em fase sólida. Os anticorpos ligados foram detectados por proteína A iodada (Netu England Nuclear). Para aplicações em immunoblot seleccionaram-se soros com títulos anti-péptido superiores ou iguais a 1/5120. 0 sorc foi usado tal como estava após uma diluição de 100 vezes ou após purificação parcial de IgG. A IgG foi parcialmente purificada por precipitação com Na2S0^ (120 mg por ml de soro), ressuspensão £>Ί 100
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. tf
-99em PBS e reprecipitação com P^^SO^ a 14/. A solução de IgG ressuspensa foi dessalinizada por passagem numa coluna PD10 (Pharmacia).
A detecção da reactividade destes anticorpos em relação às proteínas relacionadas com a S em immunoblots foi realizada com Ig de burro anti-coelho biotinilada, estreptavidina-peroxidase de rábano biotinilada e H2*^2 e 4-cloro-l-naftol co mo se descreveu no Exemplo 22.
As proteínas das preparações, parcialmente purificadas, de partículas comandadas por pRIT12660 (Exemplo 21), foram seI paradas por electroforese em SDS-poliacrilamida-gel e transferidas para nitrocelulose como se descreveu no Exemplo 20. Foi também passadas sobre o gel proteína S (p23) de partículas puri ficadas de levedura que inclui pRIT12363. 0 immunoblot” mostrou que as duas bandas de proteína, relacionadas com a S, maio res (a 33Kd e 30Kd) reagem com os anticorpos anti-péptido enquanto que as duas mais pequenas (28 Kd e 25Kd) não dão reacção. A proteína S (p23) não dá reacção com os anticorpos anti-pépti do.
Exemplo 24. Anticorpos humanos anti-Hepatite B de pessoas infectadas naturalmente reconhecem epitopo(s) nas proteínas pre S2-S de 33Kd e 30Kd não presente(s) na proteína S.
I
A reactividade da gama-globulina reunida de sujeitos humanos positivos em relação à anti-hepatite B (Belgian Red Cross, 100-150 IU/ml Lot 85A08) em relação às quatro proteínas relacio nadas com a S foi testada pelo procedimento de immunoblot des. crito no Exemplo 20. Uma preparação de partículas comandadas por pRIT12660, parcialmente purificada (Exemplo 21), foi disso, ciada por SDS e as proteínas separadas por electroforese em SDS-poliacrilamida-gel. Após transferência das proteínas para nitrocelulose, a membrana foi incubada com uma diluição de 10 vezes de gama-globulina anti-Hepatite B em PBS. Contendo gela tina a 1%. A ligação do anticorpo foi detectada por incubação sucessiva com Ig de carneiro anti-humano biotinilada (Amersham RPN1003, diluição de 1/250 em PBS contendo gelatina a 1/) estre ptavidina-peroxidase de rábano biotinilada e finalmente com
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-100H202 e 4-cloro-l-naftol como se descreveu no Exemplo 20.
As duas bandas de proteínas relacionadas com S, maiores (a banda de 33Kd e a de 30Kd) reagem com anticorpos humanos, as duas mais pequenas (a banda de 28Kd e a de 25Kd) não dão reacção. A proteína S (p23) derivada de partículas de células de levedura contendo pRIT12363 não reage com estes anticorpos humanos. Estes resultados mostram que a gama-globulina obtida de pessoas infectadas reconhece especificamente epítopos presentes em proteínas pre S2-S desnaturadas e reduzidas que estão ausentes da proteína S desnaturada e reduzida. Sabe-se que os epítopos presentes em proteína S derivada de soro humano e levedura são predominantemente conformacionais.
Exemplo 10A. As espécies de proteína de 33Kd contêm uma estru tura oligossacárida contendo manosil.
A proteína pre S2-S das preparações, parcialmente purifi cadas, de partículas de células de 10S44C cir^ contendo pRIT12660, foi separada electroforeticamente e transferida para nitrocelulose como se descreveu no Exemplo 20. Fez-se também passar sobre o gel a proteína S de partículas purificadas da levedura contendo pRIT12363 e de partículas de AgsHB de soro humano infectado obtido de Dr. W.H. Gerlich, Department of Medicai Microbiology, Universidade de Gõttingen, República Federal da Alemanha.
Metade do filtro de nitrocelulose foi incubado em 50 JUg/ /ml de concanavalina A (Calbiochem grau A) em tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, CaCl2 1 mM, MnCl2 1 mM, Tiueen 20 a 0,05%, e subsequentemente com 30 g/ml de peroxidase de rábano (Sigma tipo VI P 8375) em tris 10 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Tuieen 20 a 0,05% e finalmente com H202 e 4-cloro-l-naftol como se descreveu no Exemplo 20.
Entre as incubações o filtro foi lavado com tris 10 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Tiueen 20 a 0,05% (Hawkes, Anal Biochem, 123, 143-146, 1982; Clegg, Anal. Biochem., 127, 389-394, 1982). A outra metade do filtro de nitrocelulose foi incubada com anticorpo monoclonal 6 e tratada como se descreveu no Exem pio 20.
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-101A banda de proteína de 33Kd reage com os reagentes conca navalina A-peroxidase ao passo que nenhuma das bandas de proteína de 30Kd, 28Kd, 25Kd ou da proteína S derivada de células contendo pRIT12363 o faz. Na presença de metil-alfa~D-manopiranósido 0,1 M a ligação de concanavalina A à proteína de 33Kd é abolida.
Exemplo 26. Uma estrutura oligossacarídica é ligada N-glicosi. dicamente a asparagina
Cultivaram-se células contendo pRIT12660 e pRIT12377 (Exemplo 17) em meio selectivo (YNB + 80 ^a/ml de histidina (DC5 cir9) ou YNB (10S44C CirS)__7a 0D^2Qnm=0,2. Adicionou-se tu nicamicina (Calbiochem) até uma concentração final de 10 g/ml e incubaram-se as culturas durante 30 min. a 309C. Em seguida adicionaram-se 20ja.Ci de o-metionina (1000 Ci/mmol) (New England Nuclear) por ml e incubaram-se as culturas durante mais 15 minutos. Centrifugaram-se, numa microcentrífuga, 2 ml da cultura celular marcada, tratada ou não tratada com tunicamici na e ressuspendeu-se o aglomerado de células em 40 de SDS a 1% e quebraram-se por agitação com um misturador vortex durante 2 min. na presença de 0,3 grama de esferas de vidro (diâ metro 0,45 - 0,50 mm).
A imuno-precipitação foi realizada essencialmente de acordo com Oulius et al., (Cell, 36, 309-318, 1984). 0 1 isado foi aquecido durante 3 minutos (Min.) a 1009, diluído com 0,5 ml de PBS contendo Triton X100 a 1%, desoxicolato de sódio a 0,5/o e SDS a 0,1% e de novo aquecido durante 1 min. a 1009.
Adicionaram-se 25 ^uL, de uma suspensão a 10% de Immuno-precipitin pré-lavada (células Staph A fixadas em formalina, Bethesda Research Laboratories) ao extracto fervido e incubaram-se a 09 durante 30 min. A mistura foi clarificada por cen trifugação durante 5 min. numa microcentrífuga. Ao líquido so brenadante, adicionaram-se 2,5 yd. ce anticorpo monoclonal 6 ejs pecífico para proteína S (ver Exemplo 20) e incubou-se a mistu ra durante 1 hora a 09. Outra porção (25 Jjl) de Immuno-precipitin foi então adicionada e incubada durante 30 min. a 09. Os
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-102complexos imunes foram recolhidos por centrifugação (5 min. numa microcentrifuga) e lavados com PBS contendo ureia 2 M, com PBS contendo 2-mercaptcetanol a 1% e finalmente com PBS. As pelotas finais lavadas foram ressuspensas em tampão de amos, tra para electroforese, como se descreveu no Exemplo 20.
As amostras contendo 10 cpm foram submetidas a electroforese num SDS-poliacrilamida-gel a 12,5% (ver Exemplo 20). Após electroforese, os geles foram fixados em metanol a 40%, ácido acético a 10%, tratados com Amplify (Amersham) para fluo, rografia, secos em papel de filtro sob vácuo e submetidos a | fluorografia usando filme X-omat S de Kodak a -702.
Isto mostrou que as células contenda pRIT12660 sintetizam uma proteína de 33Kd na ausência de tunicamicina e uma proteína de 30Kd na presença de tunicamicina. As duas bandas estão ausentes nas amostras correspondentes de células contendo pRIT12377.
Este resultado mostra que a proteína pre S2-S de 33Kd ex. pressa em estirpes de levedura DC5 cir2 contém uma porção oligossacarídica ligada N-glicosidicamente a asparagina. Provavelmente haverá apenas uma cadeia oligossacarídica ligada à forma de 33Kd da proteína pre S2-S que não é muito maior do que uma glicosilação do núcleo.
I
Exemplo 27. A estrutura oligossacarídica é do tipo da manose elevada
Trataram-se extractos celulares brutos de células conten do pRIT12660 ou de preparações destes extractos, parcialmente purificadas, de partículas contendo pre S2-S (Exemplo 21), com endo-N-acetilglucosaminidase (Endo H.; EC.3.2.1.96) de Streptomyces plicatus obtida de Neui England Nuclear.
Ferveram-se partículas parcialmente purificadas ( SOyLL, 450 yxíj/ml de proteína) durante 3 minutos a 1002 na presença de dodecilsulfato de sódio a 0,1%, diluiram-se dez vezes com citra to de sódio 100 mM, pH 5 e adicionaram-se 2,4 1 de Endo H (74 ^g/ml) a 240 JL>1 desta mistura. As amostras com ou sem Endo H foram incubadas durante 4 horas a 372. A análise das amostras
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... . -<· ··:;*«*
-103tratadas com Endo H e não tratadas, por electroforese em SDS-p liacrilamida-gel e por imunnoblotting, com detecção pelo ant corpo monoclonal 6 dirigido contra a proteína S como se descre veu no Exemplo 20, mostrou o desaparecimento da banda de 33Kd e o aparecimento de uma banda de 31Kd após o tratamento com Endo Η. A banda de 31Kd reage também com os reagentes concana valina A-peroxidase, descritos anteriormente. A posição das outras bandas (30Kd, 28Kd e 25Kd) não se deslocou após tratamento com Endo H. Tempos de incubação maiores ou concentrações de Endo H mais elevadas produziram resultados idênticos. 0 re sultado mostra que a estrutura oligossacarídica ligada à proteína de 33Kd é do tipo de muita manose e tem a extensão aproximada de uma glicosilação no núcleo.
Exemplo 28. Purificação de partículas contendo proteína pre S2-S
Prepara-se extracto de levedura bruto, contendo partículas pre S2-S, triturando as células de levedura lavadas num Dynomill na presença de um peso igual de tampão de extracção, fosfato de sódio 50 mM pH 8,1, EDTA 4 mM, Ttueen 20 a 1,0/, PMSF 4 mM e isopropanol a 10/ ou tris-HCl, pH 9,0, NaCl 3,0 M, EDTA 10 mM EGTA 10 mM (ácido etileno-glicol (beta)amino-etiléter-N, N,N',N’-tetra-acético), Ttueen 20 a 0,1,.., PMSF 4 mM e isopropanol a 10/.
homogeneizado è ajustado a pH 8,0 ou 9,0 respectivamejn te e subsequentemente centrifugado durante 45 minutos a 30 000 X g.
A 500 ml do extracto de levedura bruto, com o pH ajustado a 7,2, adicionam-se 10 g de sílica coloidal (Aerosil 380 Degus sa). A suspensão coloidal é agitada durante a noite a 42 e subsequentemente centrifugada a baixa velocidade. A pelota de Aerosil é lavada três vezes com 150 ml de NaCl 0,15 M durante 1/4 hora e em seguida eluída descontinuamente com 250 ml de tanj pão pirofosfato 10 mM (pH 9,3) contendo Ttueen 20 a 2/, a 379 dui rante 3 horas. 0 dessorvido, uma solução amarelada, levemente opalescente, é passado numa coluna de 50 ml de fenilboronato de Agarose (Amicon) equilibrada com tampão pirofosfato 10 mM pH |w- |o
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-1049,0. 0 caudal é de 15 ml/hora.
A coluna é ainda lavada com 2 volumes de coluna de tampão de equilibração e em seguida é eluída na direcção inversa com sorbitol 100 mM em Tris 50 mM (pH 7,2) a um caudal de 15 ml/ho ra. As fracçães de pico elufdas são reunidas e após ajustameji to do pH para 8,1, são passadas numa coluna DEAE-Fractogel TSK equilibrada em Tris 50 mM, pH 8,1. A partícula é eluída nc mesmo tampão contendo NaCl 75 mM. -se os ácidos nucleicos residuais 0 balanço é apresentado nc Quadro
Depois deste ( < 1 yzg/2 0 jug VI.
passo, removemde proteína).
Quadro VI Purificação em dois passos de partículas contendo pre S2-S
Fracção ml mg de proteína re lacionada com a S (RIA) mg de proteína mg de lípidos mg polisacáridos
Extracto 500 11,3 14 600 S 9flí -X z_ 7,850
bruto
Dessorvido de aerosil 270 5,96
Fluxo através da coluna de PBA 315 2,83*
Eluído da coluna PBA 70 2,8
385 554 249
365 36 0 267
2,9
insuficientemente glicosilada para ser retida na coluna.
material purificado dos extractos de células contendo pRIT12660, como se descreveu neste Exemplo 28, e centrifugado em equilíbrio em CsCl, foi preparado para exame ao microscópio electrónico após coloração com acetato de uranilo. 0 exame mos. trou a presença de estruturas discretas de oartículas com diâme tros de cerca de 19 microns e que essas partículas híbridas cori tinham entre 5 e 20 ug de Tmeen 20 por 100 ug de proteína.
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NB'·'
-105Exemplo 29. Cromatografia de afinidade em lentil-sepharose
Neste exemplo, o passo de cromatografia em fenilboronato de agarose ê substituído por cromatografia em lentil-sepharose (Pharmacia).
Passaram-se numa coluna de 5 ml de lentil Agarcse, equilibrada em tampão de equilibração tal como tampão Tris 10 mM (pH 7,2), NaCl 0,14 M e Tween a 0,3.^, 50 ml de dessorvido de Aerosil, obtido como se descreveu no Exemplo 28. A coluna foi lavada com 2 volumes de coluna de tampão de equilibração, p.e., Tampão Tris 10 mM (pH 7,2) e em seguida eluída com aditivo de açúcar com especificidade para lentil, p.e. alfa-metilmanopira nosido 0,5 M em tampão de equilibração. 0 balanço é apresenta do no Quadro VII.
Quadro VII Aplicação de cromatografia de afinidade em lentil
Sepharose na purificação de partículas contendo pre S2-S
Fracção Volume (ml) y«g de proteína cionada com a (RIA) relji S Proteína total
Extracto bruto 100 2 170 8 g
Dessorvido de 50 1 700 138 mg
aerosil
Fluxo através de 5 0 428 -
Lentil-sepharose
Eluído de 12,5 925 1,26 mg
Lentil-sepharose
exame revelou que as partículas híbridas purificadas, como se descreveu aqui, contêm entre 5 e 50 y^g de Tween 20 por 100 ytig de proteína.
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.......*
-106Exemplo 30. Imunogenicidade da partícula de pre 52-S
A imunogenicidade das partículas preparadas a partir de extractos de células contendo pRIT12660 (Exemplo 16) foi estudada em duas estirpes de ratinhos: Balb/c (h^-d) e NMR1 (f^-Q). As partículas foram absorvidas em Al(OH)^ antes da injecção e injectaram-se, intraperitonealmente (I.P.), os ratinhos com 0,3 y<£) de material reactivo em RIA. Um mês depois da imunização sangraram-se os ratinhos e reuniram-se os soros dos ratinhos do mesmo grupo. 0 título dos anticorpos anti-S foi dete_r minado nos soros reunidos usando um conjunto AUSAB (fibbott Labs) e a referência WHO. Os títulos foram convertidos em miu/ /ml usando a fórmula de Hollinger (Hollinger et al., em Szmuness et al., eds. Virai Hepatitis, Philadelphia : Franklin Ins titute Press, 451-466, 1982). Determinaram-se os anticorpos anti-pre S2 usando um ensaio de fase sólida (RIA) no qual o péptido sintético pre S2 do Exemplo 23 é absorvido em plástico e detectaram-se os anticorpos ligados com uma IgG de cabra an125 ti-ratinho marcada com I. 0s resultados sumarizados no Qua dro VIII mostram que as partículas de células contendo pRIT12660 induzem tanto anticorpos anti-S como anticorpos anti -péptido pre S2 nas duas estirpes de ratinhos, com títulos mais elevados de anticorpos, anti-péptido pre 32 induzidos, nos rati nhos NMRI do que nos Balb/c. 0 título anti-S obtido nos ratinhos Balb/c ou NMRI é 2 a 3 vezes maior do que o título obtido com uma dose mais elevada de partículas de células contendo pRIT12363 que não contêm a sequência preS2. Os determinantes PreS aumentam a resposta aos determinantes S. Este efeito melhorador não se revela se o péptido sintético preS2 é injectado em conjunto com partículas sem pre 32. Além disso, o pépti do sintético preS2 sozinho é incapaz de induzir anti-soros ari ti-preS2.
Isto indica que a associação de determinantes preS2 e determinantes S na mesma partícula é necessária para obter uma resposta anti-preS2. Além disso, esta associação resulta numa melhor resposta anti-S.
Os resultados dos estudos de imunogenicidade referidos
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-107aqui, relativos à partícula PreS2-S são sumarizados no Quadro
VIII.
Quadro VIII Imunogenicidade da partícula de preS2-S
Preparação injectada Dose de anti génio relacionado com s (^) (1) Título de
anticorpos anti-S (mIU/ml)(2) anticorpos anti-preS2 (3) Balb/c NMR1
Balb/c NMR1
Partícula S derivada de levedura co mandada por pRIT12363 1,7 1404 719 0 2
Partícula S derivada de levedura co mandada por pRIT12363 + péptido sintético preS2: 0,08 yug 1,55 748 1163 0 4
Péptido siri tético preS2: 0,08 ytg 2 1 0 4
Partícula (PreS2-S) d.e rivada de le vedura, comandada por pRIT12660 0,3 3344 2418 8 120
(1) determinada por utilização de um conjuntc AUSRIA (Abbott Labs) e da Preparação de Preferência Internacional Propos. ta fornecida por Dr. Schild, Mational Institute of Biological Standardization, London, como padrão.
(2) determinado usando um conjunto AUSAB (Abbott Labs) e o pa. drão da Organização Mundial de Saúde.
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-108(í) determinados usando um radio-imunoensaio de fase sólida e péptido sintético preS2 adsorvido em plástico.
título é a diluição que dá uma ligação significativa da anticorpo (2,5 vezes 0 valor obtido com um soro de controlo negativo).
EXEMPLOS DA EXPRESSÃO Dfl SEQUENCIA DE CODIFICAÇÃO INTEIRA DA PROTEÍNA PRESl-PreS2-S, EM LEVEDURA
Exemplo 31. Construção do plasmídeo pRIT12845 que expressa a proteína preSl-preS2-S em levedura primeiro passo foi a fusão da região promotora TDH3 com a região N-terminal de preSl do genoma de HBV. 0 material de partida foi □ plasmídeo pRIT12792 que inclui um fragmento Ncol-Xbal contendo a sequência de codificação de preSl-preS2 con excepção do último codão asparagina. 0 sítio Ncol sobrepõe-se ao codão ATG do resíduo de aminoácido -163 da sequência preSl do HBV. A sequência do fragmento Ncol-Xbal é apresentada na Figura 4A.
Um plasmídeo essencialmente semelhante a pRIT12792, ide_n tificado como pRIT12793 (5940 pb), foi depositado na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, E.U.A., de acordo com os regulamentos do Tratado de Budapeste, sob □ número de acesso ATCC 67193 em 5 de Setembro de 1986. A partir do plasmídeo pRIT12793, pode-se recuperar um fragmento Ncol-Xbal de 495 pb que contém uma sequência de codificação completa preSl-preS2. Este fragmento difere do apresentado na Figura 4A num nucleótido com a sequência ACGAAÇTAATAATCTAGfl na extremidade 3’ do fragmento. 0 nucleótido diferente está sublinhado. Nos exemplos que se seguem, o PRIT12792 pode ser substituído por PRIT12793. Os dois fragmentos Ncol-Xbal contidos em pRIT12792 e pRIT12793 foram derivados por manipulação in vitro de ADN da região PreSl-PreS2 do ADN de estirpe de vírus B da Hepatite (serotipo adw) clonado em plasmídeo pRIT10616. 0 plasmídeo pRIT10616 está disponível na American Type Culture Collection sob 0 número de acesso ATCC 39131.
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-109Digeriram-se 52 g de pRIT12792 com enzimas de restrição Ncol e Xbal e trataram-se com nuclease Mung Bean de forma a eliminar as extensões 5'. Ligaram-se 600 ng (2 pmol) do fragmejn to NcoIXbal de 495 pb tratado e purificado com 170 ng (0,02 pmol) de vector pRIT12314 que tinha sido aberto, anteriormente, com enzimas BamHI e Smal e trataram-se também com nuclease mung bean. 0 pRIT12314 contém o fragmento de 2 micron, inteiro, de S. cerevisiae e uma cassette de expressão na qual o promotor TDH3 está separado do terminador ARG3 por um ligante BamHI-Smal-EcoRI:
BamHI EcoRI
Smal
...... ATGGATCCCCGGGAATTC. . . .
pTDH.j tATG?
Uma descrição mais detalhada da construção de pRIT12314 é feita no Exemplo 10(B) anterior. A mistura de ligação descrita acima foi usada para transformar E, coli MM294 em resistente à ampicilina, de acordo com o método de Cohen et al., citado anteriormente. Retiveram-se seis transformantes conteri do um plasmídeo no qual o fragmento preSl-preS2 estava inserido na orientação correcta. Estes eram os plasmídeos pRIT12843 (a.....f) (Figura 18). 0 segundo passo foi a inserção em cada um dos plasmídeos pRIT12843 (a.....f) descritos anteriormente, da região de codificação de S para reconstituir o gene inteiro preSl-S2-S.
Isto foi feito do seguinte modo:
digeriu-se cada um dos plasmídeos pRIT12843 (a.....f) com enzi.
mas BamHI e SalI. 0 sítio BamHI é colocada no início da região preS2, o sítio Sall é colocado antes do terminador ARG3 em pBR327. Ligaram-se 80 ng (0,012 JLmol) do maior fragmento BamHI-Sall (10 400 pb) purificado a partir de cada plasmídeo pRIT12843 (a.....f), com 3C0 ng (0,11 pmol) do pequeno fragmeri
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-110to BamHI-SalI de pRIT12660 (Exemplo 16). 0 pequeno fragmento
BamHI-SalI (4800 pb) de pRIT12660 contém parte da sequência de codificação preS2-S seguida pelas sequências do terminador ARG e pela sequência de levedura LEU2. Após ligação e transformação de E. coli Mivi294 com cada um dos plasmídeos pRIT12843 (a.....f), de acordo com o método de Cohen et al, citado anteriormente, obteve-se uma série de clones resistentes à ampicilina contendo os plasmídeos designados por pRIT12845 (a.....f). A Figura 18 é um diagrama de blocas que ilustra a preparação de pRIT12845 (a.....f). Estes plasmídeos pRIT12845 (a.....f) foram usados para transformar individualmente a estirpe 10S44C cir9 de S. cerevisiae de acordo com o método de Ito et al., ci tado anteriormente. A análise do crescimento das culturas dos clones individuais das leveduras transformadas foi realizada testando extractos celulares brutos nos tastes AUSRIA (fibbott) disponíveis comercialmente. Cs extractos celulares brutos foram produzidos por rompimento de células do levedura ressuspen sas em PBS contendo Ttueen 20 a 0,5.:3, PMSF 2 mH e isopropanol a 5%. Foi testado um transformante de cada uma das seis transformações separadas Λοο™ pRIT12845 (a.....f)_J7. Cinco dos seis transformantes testados deram um AUSRIA positivo.
Para testar se uma proteína com c tamanho correcto produ ziu a antigenicidade relacionada com S detectada pelo AUSRIA submeteram-se as amostras de extractos brutos, descritas acima, ao procedimento de immuncblot descrito no Exemplo 20. Quatro dos cinco transformantes positivos em AUSRIA mostraram uma pro teína relacionada com a S com cerca de 39K. Um transformante (extracto a) apresentou uma proteína relacionada com a S de 23K. Reteve-se o transformante de levedura, PRIT12845, que ex. pressa a proteína 39K, presente no extracto (e). l/er Figura 18.
Exemplo 32. A proteína preSl-proS2-S é reunida em partículas que transportam um receptor de albumina de soro humano polimerizada e um epítopo de preSl nas suas superfícies
Prepararam-se, como se descreve no Exempla 19, extractos celulares brutos de estirpes de levedura 1GS44C cirS que inclu
100
SKR 12044-2 —111— em quer pRlT12845, pRlT12660 quer pRIT12377 e estirpe de levedura DC5 cirS que incluem pRIT12363. A determinação da ccnceri tração total de proteína e da antigenicidade relacionada com AgsHB e a detecção de um receptor de albumina ds soro humano polimerizada foram realizadas como se descreveu no Exemplo 19. 0 resultado mostrou uma forte actividade de ligação de albumina de soro humano polimerizada, presente em extractos da estirpe 10S44C cir9 contendo pRIT12843 e pRIT12660 (ver também Exempla 10) que está ausente em extractos da estirpe 10344C cir^ englo bando pRIT12377 cu da estirpe DC5 cir^ englobando pRIT12363,
A centrifugação de equilíbrio em CsCl dos extractos celu lares brutos de células de 1CS44C cirQ contendo pRIT12845 (des critas no Exemplo 12) e a medição da antigenicidade relacionada com AgsHB por ensaio ALiSRIA nas fracçães de CsCl, mostraram / 3 que o antigénio formava banda em torno de rho - 1,2 g/cm . is. to foi confirmado por análise de immunoblot das fracçoes de CsCl. A actividade da ligação do anticorpo PreSl nas fracções de CsCl foi testada pele ensaio ELISA descrito ns Exemplo 12. Depois de deixar o antigénio ligar-se ao anti-AgsHB de fase só, lida, incubou-se o antigénio ligado, com anticorpo monoclonal Fial8/7 (Exemplo 31) que foi então detectado por Ig anti-ratinho biotinilada, complexo de estreptavidina-peroxidase de rába no biotinilada e cromogénio como se descreveu no Exemplo 12.
Verificou-se que a actividade de ligação de anticorpo es. pecífico de preSl se co-equilibra com a antigenicidade relacio nada com AgsHB no gradiente de CsCl. Estes resultados mostram que a proteína preSl-pre32-S produzida em células 10S44C cirS englobando pRIT12845 è reunida em partículas semelhantes às partículas de AgsHB com 22 nm derivadas de sorc. As partículas expõem nas suas superfícies sequências específicas de preSl assim comc um receptor de albumina de soro humano polime rizada. A partir do nível de actividade destas partículas no teste AUSRIA e da intensidade da reacção da proteína preSl-preS2-S numa análise ''immunoblot, pode concluir-se que os de. terminantes 3 da partícula são parcialmente obstruídos ou deformados pela presença das sequências preS na partícula.
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-112Exemplo 33. Em levedura transformada com pRIT12845 são expres. sas duas proteínas de peso molecular de cerca de 33 e 45 quilo deltons (KD), transportando ambas epítopos de preSl, preS2 e S
Analisaram-se monómeros de proteína relacionada com AgsHB, expressa em células contendo pRIT12845, do modo descrito no Exemplo 20.
A migração e a imunorreactividade das proteínas celulares foram comparadas com as das proteínas de partículas de AgsHB (serotipo ad) purificadas a partir de soro humano (obtido de Dr. W.H, Gerlich, Departamento de Microbiologia Médica, Univej? sidade de Gottingen, República Federal da Alemanha).
Usaram-se três imunorreagentes para analisar as proteínas :
anticorpo monoclcnal (obtido de H. Thomas - Exemplo 20) reconhecendo um epítopo de S
- um anti-soro de coelho polivalente contra o péptido sintéti co preS2 (descrito no Exemplo 23) anticorpo monoclonal MA18/7 específico para um epítopo preSl descrito por Heermann et al. (0. Virol., 52, 396-402, 1984).
immunoblot mostrou a presença, entre as proteínas ce lulares derivadas de células 10S44C contenda pRIT12845, de duas proteínas que reagem especificamente com todos os três imunorreagentes descritos acima. 0 peso molecular destas duas proteí. nas foi estimado em cerca de 38 000 e 45 000 daltons. A avalia ção do peso molecular foi feita com base na migração das proteí. nas de AgsHB derivadas de sorc como definido por Heerman et al. (3. Virol., 52., 396-402, 1984). A proteína pre Sl-pre S2-S de 38 000 dalton comandada por pRIT12845 migra ligeiramente mais depressa do que a proteína p39 de pre Sl-pre S2-S, derivada de partículas de AgsHB. A proteína p39 de partículas de soro humano de serotipo ad tem, presumivelmente, uma região pre S1 de 119 aminoâcidos (Heermann et al., J. Virol., 52, 396-402, 1984). 0 pRIT12845 codifica uma região pre SI de 108 aminoâcidos.
0s resultados anteriores mostram que células de levedura que incluem pRIT12845 expressam duas proteínas com cerca de 38
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-113e 45 kD transportando epítopos de pre 31, de pre 32 bem como de S.
Exemplo 34. A espécie de 45 kD da proteína pre Sl-preS2-S transporta uma cadeia oligossacarídica, do tipo com muita mano se, ligada N-glicosidicamente
Bomperam-se células que incluem pRIT12845 com um peso igual de esferas de vidro (diâmetro de 0,45-0,50 mm) num peso igual de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 7,4) contendo SDS a 2,u e EDTA 8 mM, por agitação com um misturador Vortex.
Após centrifugação aqueceu-se o sobrenadante durante 4 minutos a 1003.
Diluiram-se 10 yj. do fluido sobrenadante, aquecido, com 40 yl de tampão de citrato de sódio 25 mH (pH 5,0), e adiciona ram-se 2 p- de EndoH (74 y/q/ml) (ver, Exemplo 27). Incubaram-se as amostras com ou sem EndoH, durante 2,5 horas a 379.
As amostras tratadas com EndoH ou não tratadas foram ana lisadas por electroforese de SDS-poliacrilamida-gel e immunoblotting como se descreveu no Exemplo 20.
A mancha foi analisada com anticorpo monoclonal 6 (específico para S) e MA18/7 (específico para pre 31) (ver, Exemplo 33).
immunoblot mostrou, tanto com monoclonal 6 como com monoclonal MA18/7, o desaparecimento de uma banda de 45 kD e o aparecimento de uma banda de 41 kD após tratamento com EndoH. A migração da banda de 38 kD não foi afectada pelo tratamento com EndoH.
Estes resultados mostram que a espécie de 45 kD da proteína pre 31-pre S2-S transporta uma cadeia oligossacarídica do tipo com muita manose, ligada N-glicosidicamente.
Exemplo 35. A proteína preSl-preS2-S de 38 kD contém ácido mi rístico ligado covalentemente, presente numa ligação amida
Fizeram-se crescer em YN8 células da estirpe de levedura 10544C cir9 incluindo quer pRIT12845, pRIT12660 quer pRIT12377
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SKR 12044-2 :· -,ϊ .9·?$»· ; . .-. .,. «Mtf
-114a um 0D,or, m de 0,4*
Unm
As células (20 ml de cultura) foram marcadas durante 60 min com 1 mCi de ácido mirístico marcado com 3H (Netu England Nuclear) e em seguida recolhidas por centrifugação. As células foram lavadas com HgO fria, ressuspensas em 100 yd de tris-HC1 5 mM (pH 7,4) contendo DTT (5 mM), SDS a l;,á e PMSF 1 mM, e rompidas com 100 mg de esferas de vidro por seis estímulos de 30 segundos de mistura vigorosa num Vortex arrefecendo em gelo entre cada mistura. Os desperdícios foram removidos por centrifugação durante 1 minuto numa centrífuga Eppendorf 5414 } (Towler e Glaser, Proc. Natl. Acad. Sei., 83, 2812-2816, 1986).
Trataram-se 20 yxl do extracto durante 3,5 h à temperatura ambi. ente com 7 yxl de hidroxilamina 4 M, glicina 20 mM, preparadas recentemente, pH 10.
As amostras tratadas e não tratadas com hidroxilamina fo ram sujeitas a electroforese de SDS-poliacrilamida-gel e fluorografia como se descreveu no Exemplo 26. As amostras não tra tadas com hidroxilamina foram também sujeitas a análise por immunoblot com o anticorpo monoclonal que reconhece um epíto po de S, como se descreveu no Exemplo 20.
immunoblot apresentou resultados idênticos aos descritos nos Exemplos 20 e 33.
fluorografo mostrou uma banda marcada de 38 kD só presente no extracto celular de células incluindo pRIT12845, que era estável à hidroxilamina, indicando que o marcador 3H-mirís. tato está presente numa ligação amida. Não se detectaram bandas marcadas específicas dos extractos de células que incluem pRIT12660.
Estes resultados indicam que a proteína pre S1-S2-S de 38 kD contém ácido mirístico, ligado covalentemente, presente numa ligação amida. Em geral, o miristato liga-se covalentemente a proteínas, via ligação amida, a uma glicina amino-terminal. Isto sugere que o iniciador Met foi removido da prote^ na pre Sl-pre S2-S e que □ resíduo Gly na posição 2 se tornou disponível para acilação com ácido mirístico.
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-115Exemplo 36. Utilização dos vectores preSl para inserção de se quências de codificação funcionais de ADN material de partida é ADN de plasmídeo pRIT12793 descri to no Exemplo 31 anterior. 0 pRIT12793 contém a sequência de codificação pre Sl-pre S2 num fragmento Ncol-Xbal de 495 pb. 0 ADN de plasmídeo pRIT12793 é digerido com endonuclease de restrição Ncol, tratado com T4 ADN polimerase paca encher as extre midades coesivas e digerido com endonuclease Xbal. 0 fragmento
Ncol/T4 ADN p oli meras e/Xbal é purificado por electrofocese em poliacrilamida-gel e electroeluição e inserido no vector pUC12 anteriormente digerido com endonucleases Smal e Xbal. 0 vector de clonação pUC12 ê vendido por Amersham (Little Chalfont, Bucks, Reino Unido) e por Pharmacia (Piscataiuay, NJ). 0 plasmídeo pRITX é obtido como se mostra na Figura 4 5B. Na região pre Sl-pre S2 do plasmídeo pRITX, um único sítio Ncol sobrepõe-se ao codão de início ATG da região pre Sl e está presente um sítio Xbal adjacente e a jusante da codão de paragem TAA do terminal C das sequências de codificação pre-S2. No plasmídeo está pre sente um único sítio de restrição BstX próximo da extremidade N-terminal da região de codificação pre Sl.
Será evidente para o especialista que o vector pRITX ou vectores derivados semelhantes contendo as sequências pre S1-S2 podem ser usados para introdução de sequências de codificação funcionais de ADN codificando péptidos de interesse para criar fusões, em fase, na região pre Sl por inserção no sítio BstX.
Além disso, as sequências de codificação funcionais ce ADN podem ser introduzidas por digestão de pRITX e derivados com combinações de endonucleases BstX e BamHI ou EcoRI ou Pstl e inserção da sequência de codificação funcional de ADN entre estes sítios, removendo assim a maior parte da região de codifi cação pre Sl e a parte N-terminal da sequência pre 82. Estas fusões serão do tipo pre Sl - sequência de codificação, funcio nal, de ADN introduzida pre S2. Logo que essas fusões sejam realizadas, elas podem ser recombinadas noutros plasmídeos con tendo o resto das sequências pre Sl-pre 32 e sequências necessárias para manutenção e replicação em E. coli e 3. cerevisiae
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-116como se exemplificou no Exemplo 16A.
Exemplo 37. Fusão de péptido de proteínas de vírus HTLV-III à região preS2 de sequências preS2-S para criar naves partículas híbridas
A região preS2 de uma sequência de codificação de preS2-S de H3V pode também ser usada para a inserção ou fusão de ssquêri cias de péptidos de outros antigénios virais, incluindo o ageri te causador da síndroma SIDA humana, c retrovírus conhecido co mo HIV, HTLV-III ou LAV.
genoma clonado de um vírus HIV foi descrito por Ratner L. et al. (Nature, 313, 277-284, 1985) e por Shaw G. et al. (Science, 226, 1165-1171, 1984). A partir deste cisne genómico podem obter-se vários sub-fragmentos, como sequências funcionais de codificação de ADN que correspondem a regiães de péptido com interesse para fusão da sequência preS2-S para for, mar novas partículas híbridas contendo epítcpos das proteínas do vírus HIV. Estas partículas híbridas podem servir como base para uma vacina humana para protecçãc contra o agente infeç. cioso HIV.
Entre as regiães de pêptidos com interesse encontram-se as seguintes:
a. péptido C7. Esta região corresponde a uma extensão de 45 resíduos de aminoácidos imediatamente adjacente ao sítio de processamento do precursor do invólucro e foi definida por Starcich B.R. et al. (Cell, 45, 637-648, 1986).
b. Péptido 121. Esta região corresponde a uma sequência de aminoácidos, relativamente conservada, presente em vári as proteínas do invólucro de transmembranas retrovirais (ver Cianciolo G.3. et al. (Science, 230, 453-455, 1985). Pensa-se que esta sequência participa na patogenese de imunossupressão induzida por retrovirus (Snyderman R. e Cianciolo G.3., Immunol. Today, 5, 240, 1984).
c. Péptido de Dreesman11. Um péptido sintético correspondendo à sequência de aminoácidos 735 a 752 da glicoproteína
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-117do precursor do invólucro de HIV foi usada por Kennedy R.C. et al. (Science, 231, 1556-1559, 1986) para imunizar coelhos e o anti-soro de coelho foi usado para investigar o reconhecimento de proteínas do invólucro de HIV por anticorpos induzidos. Os resultados sugerem que esta região pode induzir uma resposta imunitária dirigida contra a glicoproteína nativa.
A. Fusão da sequência de ADN correspondendo ao péptido C7 de um isolado de HTLV-III com a região preS2-S em pRIT10911.
material de partida foi o plasmídeo pBH10-R2 contendo o genoma de HIV clonado em BH10 isolado. Este plasmídeo foi obtido de R.C. Gallo, National Institutes of Health, Bethesda, MD, Excisou-se um fragmento Sall-Xhol, de 3108 pb, de ADN de origem virai do pBH10-R2 e clonou-se entre os sítios SalI e Xhol de pUC18 para criar o plasmídeo pRIT12901. Apresenta-se um mapa de restrição deste fragmento Sall-Xhol na Figura IB. 0 plasmídeo pUClB ê descrito por Norrander 0. et al. (Gene, 26, 101-106, 1983) e está comercialmente disponível na Pharmacia Inc., Piscataujay N.J.
Para criar a fusão, digeriu-se ADN de pRIT12901 com endo. nucleases BglII e MboII, e isolou-se o fragmento com 117 pb por electroforese em acrilamida-gel e electroeluição (ver Figjj ra IB). 0 ADN deste fragmento foi tratado com nuclease Mung Bean para remover extensões de cordão simples e ligado com ADN de pRIT10911 (ver Exemplo 5, anterior) que tinha sido digerido com endonuclease BamHI e tratado com nuclease Mung Bean Isolou-se, desta mistura de ligação, um plasmídeo, pRIT12893, no qual o fragmento BqlII-MboII, de 117 pb, de pRIT12901 tinha sido inserido em pRIT10911. A sequência de nucleótidos ao lori go da junção de fusão entre o prcmotor TDH3 e o fragmento tratado com nuclease mung bean, HTLV-ΙΠ BglII-MboII de 117 pb, inserido em pRIT12893, foi determinada e verificou-se que se removeram da extremidade BglH do fragmento 10 nucleótidos em excesso. A sequência encontrada foi a seguinte:
5' ATGGAGGAGGAGATATGAGGGA 3’
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-118na qual o primeiro codão ATO sublinhado é o da região promotora TDH3 de pRIT10911 e o segundo e um codão ATG interno do fragmento do péptido 07« 0 segundo codão ATG sobrepõe-se a um de terminação TGA. Este codãc de terminação está na mesma estrutura de leitura do primeiro codão ATG. A determinação da sequência de ADN da extremidade 3’ da região de fusão em pRIT12893 mostrou a sequência correcta para a fusão em fase da extremidade do fragmento de HTLV-III, tratado com nuclease mung bean, Fibol I, com a sequência preS2 em pRIT10911 como se mostra na Figura 2B.
ADN de pRlT12893 foi então digerido com endonuclease HindllI e o fragmento de 3250 pb foi isolado e purificado por electroforese em gel de agarose e electroeluição. 0 fragmento
HindiII de 3250 pb foi então inserido no sítio HindlII de plasmídeo YEpl3 para criar pRIT12894. 0 ADN do plasmídeo foi então usado para transformar células de levedura da estirpe DC5 e 10S44C em independentes de leucina pelo método de Ito et al., como se citou no Exemplo 10 anterior.
A transcrição e tradução em células de levedura do ADN de fusão C7-preS2-3 sm pRIT12894 terá como resultado a síntese de um pequeno péptido de 5 resíduos começando no codão ATG de TDH3 e terminando no codão TGA, sublinhado acima e do péptido de fusão C7-preS2-S começando no segundo codão ATG interno da sequência C7. Esta fusão contém 38 resíduos de aminoácidos do péptido C7 em lugar dos 45 resíduos do fragmento de C7, intacto,
Λ tratado com nuclease mung bean-BqlII-MboII. E evidente que se podem examinar e sequenciar outros plasmídeos recuperados da mesma mistura de ligação como pRIT12893, para determinar se eles transportam uma fusão correspondendo ao fragmento completo.
B. Fusão da sequência de ADN correspondendo ao Péptido 121 com a região preS2-S em pRIT12901.
Para criar a fusão, o ADN de pRIT12901 (descrito na Parte A anterior) foi digerido com endonucleases Hhal e HindiII para libertar o fragmento de 230 pb apresentado na Figura 1B. Este fragmento foi purificado por electroforese em acrilamida67 100
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-119-gel e electroeluição e tratadc com T4 ADN polimarase para encher extensões de cordão simples. 0 fragmento assim tratado foi ligado com ADN de pRIT10911 que tinha sido digerido com BamHI e nuclease mung hean. A partir desta mistura de ligação identificou-se um plasmídeo, pRIT12897, no qual o fragmento de 230 pb de ADN de HIV tinha sido inserido na estrutura de leitura correcta para fusão com a sequência preS2 de pRIT10911 como se mostra na Figura 3B. C ADN do plasmídeo pRIT12897 foi então digerido com endonuclease HindiII, e o fragmento de 3365 pb contendo o promotor TDH3, a fusão HIV-preS2-S e o terminador | ARG3, foi purificado por electroforese em gel de agarose e electroeluição. Este fragmento de 3365 pb foi ligado em YEpl3 digerido com endonuclease HindiII para formar o plasmídeo pRIT12898. 0 ADN deste plasmídeo (pRIT12893) foi então usado para transformar células de levedura da estirpe DC5 e 10S44C em independentes de leucina pelo método de Ito et al, como se citou no Exemplo 10 anterior.
C. Fusão da sequência de ADN correspondente ao péptido Dreesman com a região preS2 em pRIT10911.
Sintetizou-se um fragmento de 60 pb de ADN sintético, com a sequência apresentada abaixo, por meios convencionais, co mo dois cordões simples que foram então emparelhados:
I 5' GATCTCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGA 3»
3' AGCTGTCCGGGCTTCCTTATCTTCTTCTTCCACCTCTCTCT 5'
5’ GACAGAGACAGATCCCCG 3'
3’ CTGTCTCTGTCTAGGGGCCTAC 5’
Este fragmento tem extensões 5' BglII e 3' BamHI de cordão simples. Misturaram-se e ligaram-se cerca de 200 ng de um fragmento de cordão duplo e 3C0 ng de ADN de plasmídeo pRIT10911 digerido com BamHI. A partir desta mistura de ligação identificou-se e recuperou-se um plasmídeo, pRIT12899, no qual o fragmento de 60 pb tinha sido inserido no sítio BamHI de pRIT10911 de modo a criar uma fusão em fase como se mostra na
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-120Figura 4B. 0 ADN de pRIT12899 foi digerido com endonuclease
HindIII e o fragmento HindIII de 3200 pb foi purificada por electroforese em gel de agarose e electroeluição. Este fragmen. to HindIII foi inserida no sítio HindIII de YEpl3 para criar plasmídeo pRIT12900. 0 ADN do plasmídeo pRIT12900 fci então usado para transformar células de levedura das estirpes DC5 e 10S44C em independentes da leucina pelo método de Ito et al» citado no Exemplo 10 anterior.
Exemplo 38. Expressão de proteínas de fusão a partir de pRIT12894 e pRIT12898
Fizeram-se crescer, separadamente, estirpes de levedura DC5 ou 10S44C que incluem YEpl3, pRIT12363, pRIT10912, pRIT12894 ou pRIT12898, em meio líquido sem Isucina (YNB + 80y^g/ml de histidina ou YNB) e analisaram-se as proteínas celulares pelo procedimento de immunoblot1’ descrito no Exemplo 11, usando co mo primeiro anticorpo um anticorpo monoclonal dirigido contra um epítopo resistente à desnaturação e à redução, de AgsHB derivado de humanos (monoclonal 6 obtido de H. Thomas, Royal Free Hospital, Londres, Inglaterra). 0 pRIT10912 é descrito no Exejn pio 5 anterior. 0 pRIT12894 e o pRIT12898 são descritos no Exemplo 37, anterior. 0 pRIT12363 transporta o gene S de HBV fundido ao promotor TDH3 como o fragmento HindiII de 2900 pb de pRIT12322 (Exemplo 8) inserido num plasmídeo vector de levedura idêntico a pRIT12377 (Exemplo 10, parte B anterior) e produz AgsHB sob o controlo do promotor TDH3.
immunoblot mostrou uma banda da proteína relacionada com proteína S de peso molecular estimado de cerca de 32 kD e_n tre as proteínas celulares totais de estirpes de levedura DC5 ou 10S44C transformadas com pRIT12894. Entre as proteínas celulares totais das estirpes de levedura DC5 ou 10S44C incluindo pRIT12898 estava presente uma banda de proteína relacionada com proteína S, de peso molecular estimado de cerca de 45 kD, ao passo que estava presente uma banda de proteína relacionada com proteína S, de peso molecular estimado de cerca de 29 kD, entre as proteínas celulares totais da estirpe de levedura DC5 que inclui pRIT10912.
&Ί 100
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-1210s extractos celulares brutos de levedura da estirpe
DC5 incluindo pRIT12363, pRIT10912 ou pRIT12894 foram preparados como se descreve no Exemplo 12. A concentração de proteína e a actividade AUSRIA foram medidas como se descreveu no Exemplo 12. A análise por immunoblot destes extractos foi realizada como se descreveu anteriormente.
A centrifugação de equilíbrio em CsCl dos extractos brutos (descrita no Exemplo 12) e a medição da antigenicidade relacionada com AgsHB por ensaio AUSRIA nas fracções de CsCl, mo.s trou que o antigénic formava bar.da à volta de rho = 1,2 g/cm\ Isto foi confirmado por análise por immunoblot das fracções de CsCl.
Estes resultados mostram que a proteína de fusão de 32 kD produzida em células de levedura da estirpe DC5 transportando pRIT12894 é reunida em partículas semelhantes às partículas de AgsHB de 22 nm derivadas de soro humano. A partir do nível de actividade destas partículas no teste AUSRIA e da intensidade da reacção da proteína de 32 kD na análise por immunoblot po, de concluir-se que os determinantes S da partícula são parcial, mente obstruídos ou deformados pela presença das sequências C7.
A partir destes resultados conclui-se que as células de levedura das estirpes DC5 e 1GS44C transformadas com pRIT12894 ou com pRIT12898 sintetizam especificamente uma proteína de fu são com peso molecular de cerca de 32 kD ou 45 kD, rsspectivamente, transportando ambas um epítopo S.
z
E evidente para o especialista que as partículas híbridas transportando os epítopos do péptido do vírus HIV podem ser extraídas e purificadas por meios convencionais, a partir de culturas de células de levedura transformadas com pR!T12894, pRIT12898 e pRIT12900. Estas partículas purificadas podem então ser formuladas, na presença ds adjuvantes tal como Al(OH)^ ou AlPO^, em vacinas para uso humano. A dose preferida varia, rá na gama de 1-1000 ds proteína e é determinada por ensaios convencionais. E evidente que o invento tal como aqui exejn plificado inclui outras regiões de péptidos das proteínas virais do HIV que podem ser fundidas à região preS2-S de sequên67 100
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-122cias de codificação de HBV para formar partículas híbridas apresentando um epítcpo ds HIV de interesse.

Claims (18)

1 - Método de preparação de uma célula eucariótica hospe. deira transformada, caracterizado por compreender transformar uma célula eucariótica hospedeira com um vector que compreende uma molécula de ADN recombinante ligada operativamente a uma região reguladora contendo uma sequência de codificação de ADN funcional fundida, em fase, com uma porção da região PreS2 de uma sequência PreS2-S de proteína do HBV onde a sequência de codificação de ADN funcional codifica também a proteína de superfície de Plasmodium presente durante a fase de esporozoíto do ciclo de vida ou uma sequência de gene envelope de HIV ou um péptido Dreesman de HIV.
2 - Método, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por □ hospedeiro ser uma célula de levedura.
3 - Método, de acordo com a reivindicação 2, caracteriza. do por o hospedeiro pertencer ao género Saccharomyces.
4 - Método, de acordo com a reivindicação 3, caracteriza. do por o hospedeiro pertencer às espécies Saccharomyces cerevisiae ou Saccharomyces carlsberqensis.
5 - Método, de acordo com a reivindicação 4, caracteriza. do por o hospedeiro ser da estirpe DC5, DC5 cir°, 1DS44C ou 10S44C cir°.
6 - Método, de preparação de uma partícula híbrida contendo proteína de AgsHB que contém e/ou apresenta um péptido co dificado por uma sequência de codificação de ADN funcional, ca racterizado por compreender cultivar uma célula eucariótica hos. pedeira transformada com um vector em meios de cultura apropria dos e isolar a partícula de um lisado ou extracto das células dessa cultura de hospedeiro, onde o referido vector é um vector que compreende uma molécula de ADN recombinante ligada operativamente a uma região reguladora contendo uma sequência de codificação de ADN funcional fundida, em fase, com uma poj?
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SKR 12044-2 «-124ção da região PreS2 de uma sequência Pre S2-S da proteína do HBV onde a sequência de codificação de ADN funcional codifica também a proteína de superfície de Plasmodium presente durante a fase esporozoíto do ciclo de vida ou uma sequência de gene envelope de HIV tal como a proteína de HIVC7, a proteína de HIV contendo o péptido 121 ou o péptido Dreesman de HIV.
7 - Processo de preparação de uma célula hospedeira trans. formada, caracterizado por compreender transformar uma célula hospedeira com a região de codificação Pre SI da proteína do HBV que codifica a seguinte sequência de aminoácidos:
-163
ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT Met Gly Thr Asn Leu Ser Vai Pro Asn Pro GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT Gly Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG T rp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His T rp CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA Pro Ala Ala Asn Gin Vai Gly Vai Gly Ala TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG Gly Ile Leu Gly T rp Ser Pro Gin Ala Gin GGC ATA TTG ACC A CA GTG TCA ACA ATT CCT Gly Ile Leu Thr Thr Vai Ser Thr Ile Pro CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gin Ser Gly AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA A rg Gin Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu A GA GAC AGT CAT CCT CAG GCC Arg Asp Ser His Pro Gin Ala
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-125-
8 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a região estar compreendida num vector de ADN recombinante.
9 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o hospedeiro ser uma célula de levedura.
10 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracteri zado por o hospedeiro pertencer ao género Saccharomyces.
11 - Processo de preparação da proteína codificada pela região de codificação Pre SI da proteína, da reivindicação 7, caracterizado por compreender cultivar uma célula hospedeira transformada com a região, em meios de cultura apropriados e isolar a proteína de um lisado ou extracto das 9 células dessa cultura de hospedeiro.
12 - Processo de preparação de uma célula hospedeira transformada, caracterizado por compreender transformar uma cé lula hospedeira com uma região de codificação Pre S2 da proteí. na do HBV ou uma região de codificação Pre S2-S da proteína do HBV, na qual a sua porção Pre S2 codifica a seguinte sequência de aminoácidos:
Thr
-55 -50 ou
Met-Gln-T rp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp-40 -30
Pro-A rg-Val-A rg-Gly-Leu-T yr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-SerSer-20 Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile-Ser-10
Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-As n
13 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a região estar compreendida num vector de ADN recom binante.
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14 - Processo de preparação de proteína codificada pela região de codificação Pre S2 ou Pre S2-S, da proteína da reivindicação 12, caracterizado por compreender cultivar uma célu la hospedeira transformada com a região, em meios de cultura apropriados, e isolar a proteína de um lisado ou extracto de células dessa cultura de hospedeiro.
15 - Processo de preparação de uma partícula codificada pela região de codificação Pre S2-S da proteína da reivindicação 12, caracterizado por compreender cultivar uma célula hospedeira transformada com a região, em meios de cultura apropri ados, e isolar a proteína de um lisado ou extracto de células dessa cultura de hospedeiro.
16 - Método de preparação de uma célula hospedeira de le. vedura transformada, caracterizado por compreender transformar uma célula hospedeira de levedura com um vector de ADN recombi. nante compreendendo uma sequência de codificação Pre S2-S da proteína ligada operativamente a uma região reguladora.
17 - Método de preparação de proteína codificada pela se quência de codificação Pre Sl-Pre S2-S da proteína, caracterizado por compreender cultivar uma célula hospedeira de levedura transformada com um vector de ADN recombinante compreendendo uma sequência de codificação Pre Sl-Pre S2-S da proteína li. gada operativamente a uma região reguladora, em meios de cultu ra apropriados, e isolar a proteína de um lisado ou extracto de células dessa cultura de hospedeiro.
1Θ - Método de preparação de uma partícula contendo poli, péptido codificado pela sequência de codificação Pre Sl-Pre S2-S da proteína que compreende cultivar uma célula hospedeira de levedura transformada com um vector de ADN recombinante com preendendo uma sequência de codificação Pre Sl-Pre S2-S da pro teína ligada operativamente a uma região reguladora, em meios de cultura apropriados, e isolar a partícula de um lisado ou extracto de células dessa cultura de hospedeiro.
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-12719 - Método de preparação de uma célula hospedeira de le vedura transformada, caracterizado por compreender transformar uma célula hospedeira de levedura com um vector de ADN recombi nante, caracterizado por compreender a seguinte sequência de codificação Pre S1-S2 da proteína ligada operativamente a uma região reguladora:
Região Pre S1
-163
ATG GGG ACG A AT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG Met Gly Thr Asn Leu Ser Vai Pro Asn Pro Leu GGA TTC TTT ccc GAT CAT CAG TTG GAC CCT Gly Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC A AT CCA GAT Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG T rp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His T rp CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA Pro Ala Ala Asn Gin Vai Gly Vai Gly Ala TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG Gly Ile Leu Gly T rp Ser Pro Gin Ala Gin GGC ATA TTG ACC A CA GTG TCA A CA ATT CCT Gly Ile Leu Thr Thr Vai Ser Thr Ile Pro CCT CCT GCC TCC ACC A AT CGG CAG TCA GGA Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gin Ser Gly AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCri CCT CTA Arg Gin Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu A GA GAC AGT CAT CCT CAG GCC A rg Asp Ser His Pro Gin Ala
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-128Região Pre S2
-55 ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CA A Met Gin T rp Asn Ser Thr Ala Phe His Gin GCT CTG CAG GAT CCC A GA GTC AGG GGT CTG Ala Leu Gin Asp Pro Arg Vai Arg Gly Leu TAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGA Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly ACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCT Thr Vai Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser CAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGG His Ile Ser Ser Ser Ser Ala Arg Thr Gly GAC CCT GTG ACG AAC Asp Pro Vai Thr Asn
20 - Processa de preparação de proteína codificada pela região de codificação Pre Sl-Pre £2 da proteína, da reivindicação 19.
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