JPS63283586A - 酵母によるピー・ファルシパルム・サーカムスポロゾイトタンパク質の発現 - Google Patents
酵母によるピー・ファルシパルム・サーカムスポロゾイトタンパク質の発現Info
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、酵母Ｉこよるピー・ファルシパルムサーカム
スポロゾイトタンパク質の発現および免疫保護量のその
ようなタンパク質からなることを特徴とするワクチンに
関する。
スポロゾイトタンパク質の発現および免疫保護量のその
ようなタンパク質からなることを特徴とするワクチンに
関する。
発明の背景
多数の近年の研究は、原虫期のプラスモジウム（Ｐ ｌ
ａｓｍｏｄｉｕｍ ）の特定の種醗こよる感染に対し感
受性の宿主における保護免疫は、そのような宿主によっ
て産生される抗体を介して特定の原虫期のサーカムスポ
ロゾイトタンパク質（ＣＳタンパク質）に伝達されうる
ということを示唆している。本発明は、組換え体ＤＮＡ
法により、酵母によるヒトマラリア寄生虫ピー・ファル
シパルムのＣＳタンパク質またはその免疫原性誘導体の
産生を可能にする。
ａｓｍｏｄｉｕｍ ）の特定の種醗こよる感染に対し感
受性の宿主における保護免疫は、そのような宿主によっ
て産生される抗体を介して特定の原虫期のサーカムスポ
ロゾイトタンパク質（ＣＳタンパク質）に伝達されうる
ということを示唆している。本発明は、組換え体ＤＮＡ
法により、酵母によるヒトマラリア寄生虫ピー・ファル
シパルムのＣＳタンパク質またはその免疫原性誘導体の
産生を可能にする。
そのようなＣＳタンパク質を、イー・コリのようなグラ
ム陰性菌細胞よりもむしろ酵母において調製する場合の
よく知られた、確実なエンドトキシンの発酵特性を包含
する多数の理由により、そのようなピー・７アルシパル
ムＣＳタンパク！（７）産生のために酵母を用いるのが
好ましい。
ム陰性菌細胞よりもむしろ酵母において調製する場合の
よく知られた、確実なエンドトキシンの発酵特性を包含
する多数の理由により、そのようなピー・７アルシパル
ムＣＳタンパク！（７）産生のために酵母を用いるのが
好ましい。
スツセンツベークら（Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ ｅｔ
ａｌ、 ）、米国特許第４４６６９１７号は、Ｐｆ−４
４タンパク質として同定されているプラスモジウム・フ
ァルシパルムからの原虫ポリペプチドならびにそのクロ
ーニングおよびイー・コリにおける発現を開示している
。
ａｌ、 ）、米国特許第４４６６９１７号は、Ｐｆ−４
４タンパク質として同定されているプラスモジウム・フ
ァルシパルムからの原虫ポリペプチドならびにそのクロ
ーニングおよびイー・コリにおける発現を開示している
。
シャーマら、サイエンス（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ、
。
。
５ｃｉｅｎｃｅ）、２２８．２７９〜２８２ （１９８
５）は、ピー・ノウレジ（Ｐ、 ｋｎｏｗｌｅｓｉ ）
ＣＳ遺伝子配列の５′上流領域の代りに酵母アルコー
ルデヒドロゲナーゼＩ遺伝子の５′調節領域を含有する
発現ベクターを用いた酵母によるプラスモジウム・ノウ
レジのサーカムスポロゾイトタンパク質（ＣＳ）の一部
の発現を開示している。
５）は、ピー・ノウレジ（Ｐ、 ｋｎｏｗｌｅｓｉ ）
ＣＳ遺伝子配列の５′上流領域の代りに酵母アルコー
ルデヒドロゲナーゼＩ遺伝子の５′調節領域を含有する
発現ベクターを用いた酵母によるプラスモジウム・ノウ
レジのサーカムスポロゾイトタンパク質（ＣＳ）の一部
の発現を開示している。
ニューヨーク大学、ＰＣＴ出願番号ＷＯ３４−０２９２
２−Ａは、ピー！−ノワレシＣＳタンパク質リピートユ
ニットについてのコーディング領域の一部のクローニン
グおよびイー・コリにおけるそのベータ・ラクタマーゼ
およびベータ・ガラクトシダーゼ融合の発現を開示して
いる。
２−Ａは、ピー！−ノワレシＣＳタンパク質リピートユ
ニットについてのコーディング領域の一部のクローニン
グおよびイー・コリにおけるそのベータ・ラクタマーゼ
およびベータ・ガラクトシダーゼ融合の発現を開示して
いる。
ケンプら（Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ、 ）、ＷＯ３４−０
２９１７−Ａは、ピー・ファルシパルム（Ｐ、 ｆａｌ
ｃｉｐａｒｕｍ ）の血液期から得られたＣＳタンパク
質についてのコーディング配列のイー・コリにおけるク
ローニングおよび発現を開示している。
２９１７−Ａは、ピー・ファルシパルム（Ｐ、 ｆａｌ
ｃｉｐａｒｕｍ ）の血液期から得られたＣＳタンパク
質についてのコーディング配列のイー・コリにおけるク
ローニングおよび発現を開示している。
デイムら（Ｄａｍｅ ｅｔ ａｌ、 ）、サイエンス、
２２５゜５９３（１９８４）は、イー・コリにおけるピ
ー・７アルシパルムのＣＳタンパク質のクローニングお
よび発現を報告している。該タンパク質は、約４４００
０の分子量を有する約４１２アミノ酸からなるとして記
載されている。それは、テトラペプチドの４１タンデム
リピートからなる。合成７−１１１−および１５残基ペ
プチドは、該ＣＳタンパク質に対して誘起されるモノク
ローナル抗体に結合したリピート領域から得た。
２２５゜５９３（１９８４）は、イー・コリにおけるピ
ー・７アルシパルムのＣＳタンパク質のクローニングお
よび発現を報告している。該タンパク質は、約４４００
０の分子量を有する約４１２アミノ酸からなるとして記
載されている。それは、テトラペプチドの４１タンデム
リピートからなる。合成７−１１１−および１５残基ペ
プチドは、該ＣＳタンパク質に対して誘起されるモノク
ローナル抗体に結合したリピート領域から得た。
エリスら、ネイチャー（Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ、、
Ｎａｔｕｒｅ ）。
Ｎａｔｕｒｅ ）。
３０２．５３６（１９８３）は、イー・コリにおけるベ
ータ・ラクタマーゼーピー・ノウレジＣＳタンバク質融
合の発現を報告している。
ータ・ラクタマーゼーピー・ノウレジＣＳタンバク質融
合の発現を報告している。
ウェーパーラ、モレキュラー・アンド・バクテリア 、
１１／−パラシトロジー（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ 、
、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ） 、 １５．３０５〜
３１６（１９８５）は、核酸ハイブリダイゼーションに
よる１７種の他のピー・ファルシパルムの構造ヲ分析す
るためのプローブとしてのイー・コリにてクローニング
したピー・ファルシパルムのブラジリアン株のＣＳタン
パク質遺伝子の使用を開示しており、かつ、ＣＳタンパ
ク質遺伝子がピー・ファルシパルム中に高度に保存され
ており、かつ、該ＣＳタンパク質を用いたマラリアワク
チン開発が株変異によって複雑化する可能性がないと結
論している。
１１／−パラシトロジー（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ 、
、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ） 、 １５．３０５〜
３１６（１９８５）は、核酸ハイブリダイゼーションに
よる１７種の他のピー・ファルシパルムの構造ヲ分析す
るためのプローブとしてのイー・コリにてクローニング
したピー・ファルシパルムのブラジリアン株のＣＳタン
パク質遺伝子の使用を開示しており、かつ、ＣＳタンパ
ク質遺伝子がピー・ファルシパルム中に高度に保存され
ており、かつ、該ＣＳタンパク質を用いたマラリアワク
チン開発が株変異によって複雑化する可能性がないと結
論している。
アルノットら（Ａｒｎｏｔ ｅｔ ａｌ、） 、サイエ
ンス。
ンス。
２３０．８１５〜８１８（１９８５）は、クローン化ピ
ー・ビバックス（Ｐ、 ｖｉｖａｘ ）ゲノムＤＮＡの
バクテリオファージライブラリーからの同族遺伝子を単
離するためのピー・シノモルギ（Ｐ。
ー・ビバックス（Ｐ、 ｖｉｖａｘ ）ゲノムＤＮＡの
バクテリオファージライブラリーからの同族遺伝子を単
離するためのピー・シノモルギ（Ｐ。
ｃｙｎｏｍｏｌｇｉ ） に由来するプローブを用い
るピー・ビバックスのＣＳタンパク質のクローニングお
よびその全コーディング配列の決定を開示しており、か
つ、ピー・ビバックスのＣＳタンパク質のコーディング
配列がピー・ノウレジのＣ８遺伝子のそレト類似してい
るがピー・ファルシパルムのそれとは類似していないと
結論している。
るピー・ビバックスのＣＳタンパク質のクローニングお
よびその全コーディング配列の決定を開示しており、か
つ、ピー・ビバックスのＣＳタンパク質のコーディング
配列がピー・ノウレジのＣ８遺伝子のそレト類似してい
るがピー・ファルシパルムのそれとは類似していないと
結論している。
ヤングら（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ、） 、サイエンス
、 ２２８ 。
、 ２２８ 。
９５８〜９６２（１９８５）は、ヒトマラリアワクチン
に用いうるイー・コリにおけるピー・ファルシパルムＣ
Ｓタンパク質の発現を開示している。
に用いうるイー・コリにおけるピー・ファルシパルムＣ
Ｓタンパク質の発現を開示している。
ザ・ウオルター・アンド・エリザ・ホール・インステイ
チュート・オブ・メディカル・リサーチ（Ｔｈｅ Ｗａ
ｉｔｅｒ ａｎｄ Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ Ｉｎ５ｔｉ
ｔｕｔｅ ｏｆＭｅｄｉｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ）
、ＰＣＴ特許出願ＷＯ３４１０２９１７は、ピー・ファ
ルシパルムｍ ＲＮ ＡまたはゲノムＤＮＡの全部また
は一部醗ζ実質的に対応する人工的に組立てたポリヌク
レオチド配列、そのような配列に対応するペプチドおよ
びその作製法およびそのようなペプチドからなる補乳類
のピー・ファルシパルム抗原に対する免疫応答を刺激す
る組成物を開示している。
チュート・オブ・メディカル・リサーチ（Ｔｈｅ Ｗａ
ｉｔｅｒ ａｎｄ Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ Ｉｎ５ｔｉ
ｔｕｔｅ ｏｆＭｅｄｉｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ）
、ＰＣＴ特許出願ＷＯ３４１０２９１７は、ピー・ファ
ルシパルムｍ ＲＮ ＡまたはゲノムＤＮＡの全部また
は一部醗ζ実質的に対応する人工的に組立てたポリヌク
レオチド配列、そのような配列に対応するペプチドおよ
びその作製法およびそのようなペプチドからなる補乳類
のピー・ファルシパルム抗原に対する免疫応答を刺激す
る組成物を開示している。
メイツアーら（Ｍａｚｉｅｒ ｅｔ ａｔ、 ） 、サ
イエンス。
イエンス。
２３１．１５６〜１５９（１９８６）は、ピー・ファル
シパルムのサーカムスポロゾイトタンパク質のいくつか
の組換え体および合成ペプチドにて免疫化したマウスに
て誘起した抗体を、ヒト肝細胞培養系における保護活性
について評価したということを開示している。
シパルムのサーカムスポロゾイトタンパク質のいくつか
の組換え体および合成ペプチドにて免疫化したマウスに
て誘起した抗体を、ヒト肝細胞培養系における保護活性
について評価したということを開示している。
バールら、「新規ワクチンおよびエイズへの最新のアプ
ローチＪ （Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ、、 ”Ｍｏｄｅｒ
ｎ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏ Ｎｅｗ Ｖａｃｃｉｎ
ｅｓ ａｎｄ Ａｉｄｓ ’ ） 、２２頁、コールド
、スフリング・ハーバ−、ニューヨーク、１９８６年９
月３〜１４日は、酵母アルコール・デヒドロゲナーゼ−
２／グリセルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロ
ゲナーゼハイブリッドプロモーターに融合したピー・ビ
バックスＣＳタンパク質コーディング配列の一部のニス
・セレビシアによる発現を開示している。バールらは、
該ピー・ビバックスＣＳタンパク質の発現のための調節
されたハイブリッドプロモーターの使用を開示している
。このプロモーターの正確な構造は開示されていない。
ローチＪ （Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ、、 ”Ｍｏｄｅｒ
ｎ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏ Ｎｅｗ Ｖａｃｃｉｎ
ｅｓ ａｎｄ Ａｉｄｓ ’ ） 、２２頁、コールド
、スフリング・ハーバ−、ニューヨーク、１９８６年９
月３〜１４日は、酵母アルコール・デヒドロゲナーゼ−
２／グリセルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロ
ゲナーゼハイブリッドプロモーターに融合したピー・ビ
バックスＣＳタンパク質コーディング配列の一部のニス
・セレビシアによる発現を開示している。バールらは、
該ピー・ビバックスＣＳタンパク質の発現のための調節
されたハイブリッドプロモーターの使用を開示している
。このプロモーターの正確な構造は開示されていない。
該プロモーターへの融合のために用いられるＣ８遺伝子
配列は、該細胞膜における挿入のための「アンカー」領
域であるＣ−末端領域を欠く。その正確な境界が明記さ
れていない。構築に用いられる該遺伝子配列が、また、
単一配列を含有するか否かも開示されていない。
配列は、該細胞膜における挿入のための「アンカー」領
域であるＣ−末端領域を欠く。その正確な境界が明記さ
れていない。構築に用いられる該遺伝子配列が、また、
単一配列を含有するか否かも開示されていない。
発明の要約
本発明は、発現調節配列蚤こ機能的に結合したＤＮＡ配
列からなり、かつ、所望により、さらに、酵母にて機能
的であるレプリコンからなる組換え体ＤＮＡベクターで
あって、該ＤＮＡ配列が、プラスモジウム・７アルシパ
ルムのサーカムスポロゾイトタンパク質のコーディング
配列を含有することを特徴とする組換え体ＤＮＡベクタ
ーに関する。
列からなり、かつ、所望により、さらに、酵母にて機能
的であるレプリコンからなる組換え体ＤＮＡベクターで
あって、該ＤＮＡ配列が、プラスモジウム・７アルシパ
ルムのサーカムスポロゾイトタンパク質のコーディング
配列を含有することを特徴とする組換え体ＤＮＡベクタ
ーに関する。
本発明は、また、組換え体ＤＮＡベクターにより形質転
換した酵母宿主細胞であって、該ベクターが発現調節配
列に機能的に結合したＤＮＡ配列からなり、かつ、所望
により、さらに、該宿主細胞にて機能的であるレプリコ
ンからなり、該ＤＮＡ配列配列カフラスモジワクァルシ
パルムのサーカムスポロゾイトタンパク質のコーディン
グ配列を含有することを特徴とする酵母宿主細胞に関す
る。
換した酵母宿主細胞であって、該ベクターが発現調節配
列に機能的に結合したＤＮＡ配列からなり、かつ、所望
により、さらに、該宿主細胞にて機能的であるレプリコ
ンからなり、該ＤＮＡ配列配列カフラスモジワクァルシ
パルムのサーカムスポロゾイトタンパク質のコーディン
グ配列を含有することを特徴とする酵母宿主細胞に関す
る。
本発明は、また、そのような組換え体ベクターにより酵
母宿主細胞を形質転換することを特徴とするそのような
形質転換宿主細胞の調製法に関する。
母宿主細胞を形質転換することを特徴とするそのような
形質転換宿主細胞の調製法に関する。
本発明は、また、組換え体ＤＮＡベクターにより形質転
換した酵母宿主細胞を適当な培地にて培養し、かつ、そ
のような宿主の培養溶解物からそのようなタンパク質を
単離することからなり、該ベクターが発現調節配列に機
能的ｆこ結合し口ＮＡ配列からなり、かつ、所望により
、さらに、該宿主細胞において機能的であるレプリコン
からなり、１ＤＮＡ配列２＞（７’ラスモジワム・ファ
ルシパルムのサーカムスポロゾイトタンパク質のコーデ
ィング配列を含有することを特徴とするプラスモジウム
・ファルシパルムのサーカムスポロゾイトタンパク質の
調製法に関する。本発明は、また、そのように調製した
タンパク質および免疫保護量のそのようなタンパク質か
らなることを特徴とするワクチン１こ関する。
換した酵母宿主細胞を適当な培地にて培養し、かつ、そ
のような宿主の培養溶解物からそのようなタンパク質を
単離することからなり、該ベクターが発現調節配列に機
能的ｆこ結合し口ＮＡ配列からなり、かつ、所望により
、さらに、該宿主細胞において機能的であるレプリコン
からなり、１ＤＮＡ配列２＞（７’ラスモジワム・ファ
ルシパルムのサーカムスポロゾイトタンパク質のコーデ
ィング配列を含有することを特徴とするプラスモジウム
・ファルシパルムのサーカムスポロゾイトタンパク質の
調製法に関する。本発明は、また、そのように調製した
タンパク質および免疫保護量のそのようなタンパク質か
らなることを特徴とするワクチン１こ関する。
第１図は、ｐＲＩＴｌｏ、１６２の作製を示した７０−
シートである。
シートである。
第２図は、プラスミドｐＲＩＴ１０１７２、ｐＲＩＴ１
２５７０およびｐＲＩＴ １２５６９の制限エンドヌク
レアーゼ地図である。
２５７０およびｐＲＩＴ １２５６９の制限エンドヌク
レアーゼ地図である。
第３図は、ｐＲＩＴ １２２９０の制限エンドヌクレア
ーゼ地図である。
ーゼ地図である。
第４図は、ｐＲＩＴ １２５７０の作製を示したフロー
シートである。
シートである。
第５図は、ｐＭｃ２００の制限エンドヌクレアーゼ地図
である。
である。
第１Ａ図は、クローンλｍＰｆｌの塩基配列決定法を示
した概略制限地図である。
した概略制限地図である。
第２Ａ図は、ピー・ファルシパルムカラのＣＳタンパク
質遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
質遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
発明の詳説
「プラスモジウム・ファルシパルムのサーカムスポロゾ
イトタンパク質」なる語は、プラスモジウム・ファルシ
パルムの原虫の免疫優性表面抗原（ＣＳタンパク質）を
意味する。
イトタンパク質」なる語は、プラスモジウム・ファルシ
パルムの原虫の免疫優性表面抗原（ＣＳタンパク質）を
意味する。
プラスモジウム・ファルシパルムのＣＳタンパク質コー
ディング配列は、デイムら（Ｄａｍｅ ｅｔ ａｌ、）
。
ディング配列は、デイムら（Ｄａｍｅ ｅｔ ａｌ、）
。
サイエンス、２２５．５９３〜５９９（１９８４）Ｇこ
開示されている。
開示されている。
本明細書において用いられているように、「サーカムス
ポロゾイトタンパク質Ｊ、ｒ、ＣＳＪまたは「ＣＳタン
パク質」なる語は、プラスモジウム・ファルシパルムの
全長サーカムスポロゾイトタンパク質ならびにそのいず
れもの免疫誘導体の両方ヲ包含スる。プラスモジウム・
ファルシパルムのサーカムスポロゾイトタンパク質の「
免疫誘導体」なる語は、（ａ）保護免疫活性を保持して
いる、全長ＣＳタンパク質コーディング配列のサブフラ
グメントまたは一連のタンテ゛ムサブフラグメントによ
ってコードされた誘導体のようなプラスモジウム・ファ
ルシパルムのサーカムスポロゾイトタ。
ポロゾイトタンパク質Ｊ、ｒ、ＣＳＪまたは「ＣＳタン
パク質」なる語は、プラスモジウム・ファルシパルムの
全長サーカムスポロゾイトタンパク質ならびにそのいず
れもの免疫誘導体の両方ヲ包含スる。プラスモジウム・
ファルシパルムのサーカムスポロゾイトタンパク質の「
免疫誘導体」なる語は、（ａ）保護免疫活性を保持して
いる、全長ＣＳタンパク質コーディング配列のサブフラ
グメントまたは一連のタンテ゛ムサブフラグメントによ
ってコードされた誘導体のようなプラスモジウム・ファ
ルシパルムのサーカムスポロゾイトタ。
ンパク質のいずれもの誘導体、またはｆｂｌ保護免疫活
性を保持しているプラスモジウム・ファルシパルムのサ
ーカムスポロゾイトタンパク質の修飾コーディング配列
から得られるいずれものタンパク質を意味する。そのよ
うな免疫誘導体は、ホトシュタインら（Ｂｏｔｓｔｅｉ
ｎ ｅｔ ａｌ、） 、サイエンス、２２９゜１１９３
（１９８５）の方法によるような常法により調製できる
。ピー・ファルシパルムのＣＳタンパク質コーディング
配列のいくつかの合成免疫誘導体が、バーローら（Ｂａ
１ｌｏｕ ｅｔ ａｌ、 ）、サイエンス、２２８．９
９６〜９９９（１９８５）に開示されている。
性を保持しているプラスモジウム・ファルシパルムのサ
ーカムスポロゾイトタンパク質の修飾コーディング配列
から得られるいずれものタンパク質を意味する。そのよ
うな免疫誘導体は、ホトシュタインら（Ｂｏｔｓｔｅｉ
ｎ ｅｔ ａｌ、） 、サイエンス、２２９゜１１９３
（１９８５）の方法によるような常法により調製できる
。ピー・ファルシパルムのＣＳタンパク質コーディング
配列のいくつかの合成免疫誘導体が、バーローら（Ｂａ
１ｌｏｕ ｅｔ ａｌ、 ）、サイエンス、２２８．９
９６〜９９９（１９８５）に開示されている。
本発明の組換え体ベクターは、発現調節配列に機能的に
結合したＤＮＡ分子からなり、かつ、所望により、さら
に、酵母にて機能的であるレプリコンからなり、該ＤＮ
Ａ分子がプラスモジウム・ファルシパルムのサーカムス
ポロゾイトタンパク質のコーディング配列を含有するこ
とを特徴とする。「レプリコン」なる語は、それ１こよ
り形質転換した宿主酵母微生物においてそのような組換
え体ベクターを保持する機能を果たすＤＮＡの最小領域
を意味する。そのようなレプリコンは、よく知られてい
る。「発現調節配列」なる語は、構造遺伝子のコーディ
ング配列の転写を調節するいずれもの領域を意味する。
結合したＤＮＡ分子からなり、かつ、所望により、さら
に、酵母にて機能的であるレプリコンからなり、該ＤＮ
Ａ分子がプラスモジウム・ファルシパルムのサーカムス
ポロゾイトタンパク質のコーディング配列を含有するこ
とを特徴とする。「レプリコン」なる語は、それ１こよ
り形質転換した宿主酵母微生物においてそのような組換
え体ベクターを保持する機能を果たすＤＮＡの最小領域
を意味する。そのようなレプリコンは、よく知られてい
る。「発現調節配列」なる語は、構造遺伝子のコーディ
ング配列の転写を調節するいずれもの領域を意味する。
そのような発現調節配列は、よく知られている。好まし
い発現調節配列としては、酵母グリセルアルデヒド−３
Ｐ−デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＴＤＨ３）プロモーター
およヒ酵母オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ
遺伝子（ＡＲＧ３）転写終止領域が挙げられる。
い発現調節配列としては、酵母グリセルアルデヒド−３
Ｐ−デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＴＤＨ３）プロモーター
およヒ酵母オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ
遺伝子（ＡＲＧ３）転写終止領域が挙げられる。
他の有用な発現調節配列領域の例としては、エノラーゼ
、アルドラーゼおよびホスホグリセレートキナーゼをコ
ードする遺伝子のようなグルコース分解経路の酵母遺伝
子、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子および、一
般的に、アルギナーゼ遺伝子のような異化作用に包含さ
れる遺伝子に由来するものが挙げられる。そのようなベ
クターは、プラスモジウム・ファルシパルムのＣＳコー
ディング配列を、既にレプリコンおよび発現調節配列を
含有するベクター中に同位相にて、該ＤＮＡ分子がその
ような発現調節配列：こ機能的に結合するように挿入す
ることによるような常法により調製できる。その中に該
ＣＳコーディング配列を挿入するための有用なベクター
の例としては、イー・コリおよびニス・セレビシＩ（Ｓ
、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）の両方曝こおいて複製およ
び保持が可能であり、したがって、シャトルベクターと
して知られているプラスミドＹＥｐ１３が挙げられる。
、アルドラーゼおよびホスホグリセレートキナーゼをコ
ードする遺伝子のようなグルコース分解経路の酵母遺伝
子、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子および、一
般的に、アルギナーゼ遺伝子のような異化作用に包含さ
れる遺伝子に由来するものが挙げられる。そのようなベ
クターは、プラスモジウム・ファルシパルムのＣＳコー
ディング配列を、既にレプリコンおよび発現調節配列を
含有するベクター中に同位相にて、該ＤＮＡ分子がその
ような発現調節配列：こ機能的に結合するように挿入す
ることによるような常法により調製できる。その中に該
ＣＳコーディング配列を挿入するための有用なベクター
の例としては、イー・コリおよびニス・セレビシＩ（Ｓ
、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）の両方曝こおいて複製およ
び保持が可能であり、したがって、シャトルベクターと
して知られているプラスミドＹＥｐ１３が挙げられる。
いくつかの他の酵母ベクターが知られており、かつ、入
手可能である。酵母昏こおける自律性複製配列（レプリ
コン）機能を含有するプラスミドベクターによる形質転
換は、通常、プラスミドとしての本発明のＤＮＡ分子の
染色体外保持をもたらす。そのようなレプリコンは、よ
く知られている。酵母において機能的なレプリコンを含
有しないプラスミドベクタ一番こよる形質転換は、該Ｄ
ＮＡ分子の染色体ＤＮＡ中への取り込みを生じつる。好
ましくは、該ＤＮＡ分子は、酵母サツカロミセス（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ）属、特に、ニス・セレビシ
Ｉにおいて発現の可ｔなベクターに結合する。
手可能である。酵母昏こおける自律性複製配列（レプリ
コン）機能を含有するプラスミドベクターによる形質転
換は、通常、プラスミドとしての本発明のＤＮＡ分子の
染色体外保持をもたらす。そのようなレプリコンは、よ
く知られている。酵母において機能的なレプリコンを含
有しないプラスミドベクタ一番こよる形質転換は、該Ｄ
ＮＡ分子の染色体ＤＮＡ中への取り込みを生じつる。好
ましくは、該ＤＮＡ分子は、酵母サツカロミセス（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ）属、特に、ニス・セレビシ
Ｉにおいて発現の可ｔなベクターに結合する。
本発明に用いるＤＮＡフラグメントを調製するためのＤ
ＮＡの制限、本発明に用いる組換え体ＤＮＡ分子を調製
するためのそのようなフラグメントの結合および微生物
中への挿入は、実質的に前記文献に開示された方法によ
るような公知の方法）こよって行なわれる。条件を選ん
で、ＤＮＡおよび酵素の変性を避ける。例えば、ｐＨが
約７．０〜１１．０になるように緩衝し、かつ、温度は
約６０℃以丁に保つ。好ましくは、制限は約３０〜４０
℃の温度にて行ない、かつ、結合は約０〜１０’Ｃにて
行なう。本発明の実施に用いられる制限酵素およびリガ
ーゼは商業的に入手でき、かつ、添付の指示に従って使
用する。Ｔ４リガーゼは、好ましいりガーゼである。
ＮＡの制限、本発明に用いる組換え体ＤＮＡ分子を調製
するためのそのようなフラグメントの結合および微生物
中への挿入は、実質的に前記文献に開示された方法によ
るような公知の方法）こよって行なわれる。条件を選ん
で、ＤＮＡおよび酵素の変性を避ける。例えば、ｐＨが
約７．０〜１１．０になるように緩衝し、かつ、温度は
約６０℃以丁に保つ。好ましくは、制限は約３０〜４０
℃の温度にて行ない、かつ、結合は約０〜１０’Ｃにて
行なう。本発明の実施に用いられる制限酵素およびリガ
ーゼは商業的に入手でき、かつ、添付の指示に従って使
用する。Ｔ４リガーゼは、好ましいりガーゼである。
種々のフラグメントおよび最終構築物は、常法に従って
結合できる。多くの場合、遺伝子を単離し、制限地図を
作成し、ならび）こ塩基配列決定が行なわれる。ある程
度まで、該遺伝子の制限、要すれば、Ｂａｌ ３１によ
る制限、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発、プライマー修
復のようなそれ以上の操作を用いることにより、該ＯＳ
タンパク質コーディング配列のような問題の配列を選択
して、所望の配列を含有し、かつ、適当な末端を有する
所望の大きさのフラグメントを提供しうる。該制限部位
が問題の領域の内部にある場合、配列を結合するため、
ならびに欠損配列を置換するためにリンカ−およびアダ
プターを用いることができる。単離した種々のフラグメ
ントは、電気泳動、電気溶出により精製し、他の配列に
結合し、クローニングし、再単離し、かつ、それ以上の
操作を行なう。
結合できる。多くの場合、遺伝子を単離し、制限地図を
作成し、ならび）こ塩基配列決定が行なわれる。ある程
度まで、該遺伝子の制限、要すれば、Ｂａｌ ３１によ
る制限、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発、プライマー修
復のようなそれ以上の操作を用いることにより、該ＯＳ
タンパク質コーディング配列のような問題の配列を選択
して、所望の配列を含有し、かつ、適当な末端を有する
所望の大きさのフラグメントを提供しうる。該制限部位
が問題の領域の内部にある場合、配列を結合するため、
ならびに欠損配列を置換するためにリンカ−およびアダ
プターを用いることができる。単離した種々のフラグメ
ントは、電気泳動、電気溶出により精製し、他の配列に
結合し、クローニングし、再単離し、かつ、それ以上の
操作を行なう。
該ＣＳタンパク質コーディング配列の転写を調節するた
めの発現調節配列の使用は、無いか低い水準の該ＣＳタ
ンパク質コーディングの発現とともに該宿主細胞を高密
度まで増殖させ、ついで、周囲の条件、例えば、栄養、
温度などを変えることにより発現を誘発させつる。
めの発現調節配列の使用は、無いか低い水準の該ＣＳタ
ンパク質コーディングの発現とともに該宿主細胞を高密
度まで増殖させ、ついで、周囲の条件、例えば、栄養、
温度などを変えることにより発現を誘発させつる。
例えば、ＧＡＬ４調節領域を用いた場合、該酵母をグリ
セロール−乳酸配合高栄養培地にて高密度′、例えば、
中央または後期対数期まで増殖し、ついで炭素源をガラ
名ドースに取り変えることができる。ＰＨ０５調節につ
いては、約０．１〜０．５ｍＭの、′高すン酸塩濃度に
て該細胞を増殖しつる。
セロール−乳酸配合高栄養培地にて高密度′、例えば、
中央または後期対数期まで増殖し、ついで炭素源をガラ
名ドースに取り変えることができる。ＰＨ０５調節につ
いては、約０．１〜０．５ｍＭの、′高すン酸塩濃度に
て該細胞を増殖しつる。
温度感受性に対しては、該細胞を２５°〜３７℃にて増
殖し、ついで、適当ならば、約５°〜２０℃まで温度を
変化させることができる。該宿主細胞は、用いた調節領
域に関連した調節系を有する。
殖し、ついで、適当ならば、約５°〜２０℃まで温度を
変化させることができる。該宿主細胞は、用いた調節領
域に関連した調節系を有する。
該発現調節への該ＣＳタンパク質コーディング配列の融
合は、中間ベクターの使用により達成でき、または、別
法として、該コーディング配列は、該発現調節配列を含
有するベクター中に直接挿入できる。好ましくは、該Ｃ
Ｓタンパク質コーディング配列の発現により合成したタ
ンパク質が外来性アミノ酸残基を欠（ように該ＣＳタン
パク質コーディング配列を該発現調節配列に関連して配
置する。
合は、中間ベクターの使用により達成でき、または、別
法として、該コーディング配列は、該発現調節配列を含
有するベクター中に直接挿入できる。好ましくは、該Ｃ
Ｓタンパク質コーディング配列の発現により合成したタ
ンパク質が外来性アミノ酸残基を欠（ように該ＣＳタン
パク質コーディング配列を該発現調節配列に関連して配
置する。
本発明は、また、そのような組換え体ベクターにより形
質転換した酵母宿主細胞およびそのような宿主の調製法
に関する。そのような形質転換は、イト−ら、ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（Ｉｔｏｅｔａｌ、、 Ｊ
、 Ｂａｃｔｅｒ、）、 １５３ 、１６３〜１６８（
１９８３）の方法のような常法Ｉこより行なう。
質転換した酵母宿主細胞およびそのような宿主の調製法
に関する。そのような形質転換は、イト−ら、ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（Ｉｔｏｅｔａｌ、、 Ｊ
、 Ｂａｃｔｅｒ、）、 １５３ 、１６３〜１６８（
１９８３）の方法のような常法Ｉこより行なう。
好ましい酵母宿主細胞としては、サツカロミセス１１１
＋こ属スるもの、特Ｉこ、サツカロミセス・セレビシア
種番こ属するものが挙げられる。
＋こ属スるもの、特Ｉこ、サツカロミセス・セレビシア
種番こ属するものが挙げられる。
本発明は、また、本発明の形質転換酵母細胞を適当な培
地にて培養し、かつ、そのような宿主細胞の培養溶解物
からそのようなタンパク質を単離することを特徴とする
プラスモジウム・ファルシパルム・サーカムスポロゾイ
トタンパク質の調製法に関する。「適当な培地」なる語
は、該形質転換宿主が生存可能であり、かつ、そのよう
な宿主が回収可能量の該ＣＳタンパク質を発現しうる培
地を意味する。明らかなようＩこ、用いる適当な培地は
、用いる宿主細胞蚤こ依存する。そのような宿主の培養
溶解物からの該ＣＳタンパク質の単離は、通常のタンパ
ク質単離法により行なわれる。
地にて培養し、かつ、そのような宿主細胞の培養溶解物
からそのようなタンパク質を単離することを特徴とする
プラスモジウム・ファルシパルム・サーカムスポロゾイ
トタンパク質の調製法に関する。「適当な培地」なる語
は、該形質転換宿主が生存可能であり、かつ、そのよう
な宿主が回収可能量の該ＣＳタンパク質を発現しうる培
地を意味する。明らかなようＩこ、用いる適当な培地は
、用いる宿主細胞蚤こ依存する。そのような宿主の培養
溶解物からの該ＣＳタンパク質の単離は、通常のタンパ
ク質単離法により行なわれる。
本発明は、また、本発明の方法により調製した免疫保護
量のピー・ファルシパルムＣＳタンパク質を含有するワ
クチンに関する。「免疫保護」なる語は、充分な本発明
のＣＳタンパク質を感染しタヒト宿主に投与して、その
後のピー・ファルシパルム寄生生物感染に対して充分な
保護抗体応答を誘発することを意味する。本発明のワク
チンにおいて、好ましくは、生理的ｐＨに緩衝した本発
明のポリペプチド、すなわち、本発明の形質転換酵母宿
主細胞により発現したピー・ファルシパルムＣＳタンパ
ク質の水溶液は、直接用いることができる。別法として
、予備凍結乾燥を用い、または用いずに該ポリペプチド
を種々の公知のアジュバントのいずれかと混合し、また
は吸着しうる。そのようなアジュバントとしては、特に
、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチドおよびキル
Ａのようなサポニン類が挙げられる。さらに典型的な別
法として、該ポリペプチドをリポソームのような微粒子
内にカプセル化できる。さらにもう１つの典型的な別法
において、該ポリペプチドを死滅ボルデテラ（Ｂｏｒｄ
ｅｔｅｌｌａ ）または破傷風トキソイドのような免疫
刺激高分子蚤こコンジュゲートできる。
量のピー・ファルシパルムＣＳタンパク質を含有するワ
クチンに関する。「免疫保護」なる語は、充分な本発明
のＣＳタンパク質を感染しタヒト宿主に投与して、その
後のピー・ファルシパルム寄生生物感染に対して充分な
保護抗体応答を誘発することを意味する。本発明のワク
チンにおいて、好ましくは、生理的ｐＨに緩衝した本発
明のポリペプチド、すなわち、本発明の形質転換酵母宿
主細胞により発現したピー・ファルシパルムＣＳタンパ
ク質の水溶液は、直接用いることができる。別法として
、予備凍結乾燥を用い、または用いずに該ポリペプチド
を種々の公知のアジュバントのいずれかと混合し、また
は吸着しうる。そのようなアジュバントとしては、特に
、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチドおよびキル
Ａのようなサポニン類が挙げられる。さらに典型的な別
法として、該ポリペプチドをリポソームのような微粒子
内にカプセル化できる。さらにもう１つの典型的な別法
において、該ポリペプチドを死滅ボルデテラ（Ｂｏｒｄ
ｅｔｅｌｌａ ）または破傷風トキソイドのような免疫
刺激高分子蚤こコンジュゲートできる。
ワクチン調製は、「ワクチンの新傾向および展開」、ボ
ラ−ら編、ユニバージチー・ハーク・プレス、ボルチモ
ア、メリーランド、米国（ＮｅｗＴｒｅｎｄｓ ａｎｄ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ
、 ｅｄｉｔｅｄ ｂｙＶｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ、
、 Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ 、
Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ。
ラ−ら編、ユニバージチー・ハーク・プレス、ボルチモ
ア、メリーランド、米国（ＮｅｗＴｒｅｎｄｓ ａｎｄ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ
、 ｅｄｉｔｅｄ ｂｙＶｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ、
、 Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ 、
Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ。
Ｍａｒｙｌａｎｄ 、 Ｕ、Ｓ、Ａ ） １９７８年に
一般的に記載されている。リポソーム内へのカプセル化
は、例えば、フラートン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ ）、米
国特許第４２３５８７７号に記載されている。高分子へ
のタンパク質のコンジュゲーシヨンは、例えば、リクハ
イト（Ｌ １ｋｈｉｔｅ ）、米国特許第４３７２９４
５号およびアーマ−ら（Ａｒｍｏｒ ｅｔ ａｌ、 ）
、米国特許第４４７４７５７号によって開示されている
。キルＡの使用は、例えば、ダルスガードら、アクタ・
ベテリナリア・スカンジナビ力（Ｄａｌｓｇａａｒｄ
ｅｔ ａｌ、。
一般的に記載されている。リポソーム内へのカプセル化
は、例えば、フラートン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ ）、米
国特許第４２３５８７７号に記載されている。高分子へ
のタンパク質のコンジュゲーシヨンは、例えば、リクハ
イト（Ｌ １ｋｈｉｔｅ ）、米国特許第４３７２９４
５号およびアーマ−ら（Ａｒｍｏｒ ｅｔ ａｌ、 ）
、米国特許第４４７４７５７号によって開示されている
。キルＡの使用は、例えば、ダルスガードら、アクタ・
ベテリナリア・スカンジナビ力（Ｄａｌｓｇａａｒｄ
ｅｔ ａｌ、。
Ａｃｔａ、 Ｖｅｔ、 ５ｃａｎｄ、 ） 、 １８
、３４９ （１９７７）によって開示されている。
、３４９ （１９７７）によって開示されている。
それぞれのワクチン用量蚤こ存在する酵母由来ピー・フ
ァルシパルムＣＳポリペプチドの盪は、顕著な副作用が
誘発されることなく、免疫保護応答を誘発する量として
選択される。そのような量は、いずれの特定のポリペプ
チドを用いるか、および該ワクチンをアジュバントする
か否かにより変化する。一般的ｉこ、それぞれの用量は
、１〜１０００μｙ１好ましくは、１０〜２００μｙの
ポリペプチドを含有すると考えらｎる。特定のワクチン
の最適量は、患者における抗体力価および他の応答の観
察を包含する標準的試験ｔこよって確かめることができ
る。最初のワクチン接種後、患者は、好ましくは、約４
週間口にブーストを受け、ついで感染の危険性がある限
り、６力月毎にブーストを繰り返えす。
ァルシパルムＣＳポリペプチドの盪は、顕著な副作用が
誘発されることなく、免疫保護応答を誘発する量として
選択される。そのような量は、いずれの特定のポリペプ
チドを用いるか、および該ワクチンをアジュバントする
か否かにより変化する。一般的ｉこ、それぞれの用量は
、１〜１０００μｙ１好ましくは、１０〜２００μｙの
ポリペプチドを含有すると考えらｎる。特定のワクチン
の最適量は、患者における抗体力価および他の応答の観
察を包含する標準的試験ｔこよって確かめることができ
る。最初のワクチン接種後、患者は、好ましくは、約４
週間口にブーストを受け、ついで感染の危険性がある限
り、６力月毎にブーストを繰り返えす。
実施例
つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、これらに限定されるものではない。
、これらに限定されるものではない。
温度は、全て、摂氏で示す。ＤＮＡ操作に用いた酵素は
、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、ニュー・イン
グランド・バイオラボおよび／またはバーリンが−（Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ 。
、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、ニュー・イン
グランド・バイオラボおよび／またはバーリンが−（Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ 。
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ａｎｄ １
０ｒ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ） から入手し、かつ、
該供給者の指示に従って用いた。
０ｒ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ） から入手し、かつ、
該供給者の指示に従って用いた。
以下の実施例において、つぎの略語を用いうる。
ＹＮＢ ： ２％グルコースを含有するアミノ酸不含の
酵母窒素塩基〔ディフコ・ラボ（ＤＮｆｃｏ Ｌａｂ）
）０．６７５％ ＰＢＳ ニリン酸塩緩衝生理食塩水（ｐＨ７，４）（１
７？当り） ： ８．０ 、ｊｉ！ ＮａＣｎ 、 ０
．２ ｆｉ ＫＣｎ 、１．１５ｐ Ｎａ２ ＨＰ ０
４．０．２９ＫＨ２ＰＯ４，０，１、ｊｉ’ ＣａＣｌ
２．０、１ 、Ｆ Ｍｇｃｇ２− ６ Ｈ２０ＢＳＡ
：ウシ血清アルブミン（Ａ４３７８、シグマ） Ｌブロス（１４１１’当り）：１ｏｙトリプトン、５Ｉ
ＮａＣ／１１５ｊｉ酵母エキストラクト、１ ｒｎＱ
０． Ｉ ＭＭｇＳＯ４ｉオートクレーブに付した後５
ｍｅのチアミン（１■／ｍ（りの滅菌溶液を加える。固
体培地については、１４当り１５ｇの寒天を加える。
酵母窒素塩基〔ディフコ・ラボ（ＤＮｆｃｏ Ｌａｂ）
）０．６７５％ ＰＢＳ ニリン酸塩緩衝生理食塩水（ｐＨ７，４）（１
７？当り） ： ８．０ 、ｊｉ！ ＮａＣｎ 、 ０
．２ ｆｉ ＫＣｎ 、１．１５ｐ Ｎａ２ ＨＰ ０
４．０．２９ＫＨ２ＰＯ４，０，１、ｊｉ’ ＣａＣｌ
２．０、１ 、Ｆ Ｍｇｃｇ２− ６ Ｈ２０ＢＳＡ
：ウシ血清アルブミン（Ａ４３７８、シグマ） Ｌブロス（１４１１’当り）：１ｏｙトリプトン、５Ｉ
ＮａＣ／１１５ｊｉ酵母エキストラクト、１ ｒｎＱ
０． Ｉ ＭＭｇＳＯ４ｉオートクレーブに付した後５
ｍｅのチアミン（１■／ｍ（りの滅菌溶液を加える。固
体培地については、１４当り１５ｇの寒天を加える。
Ｘ−ｇａｌ：５−ブロモ−４−クロロインドイル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド 実施例Ａ プラスミドｐＲＩＴ１０１６７の組立テ出発
材料はｐＢＲ３２２上にクローンされたＴＤＨ３遺伝子
をコード付けする酵母ＤＮＡの２．１ｋｂＨｉｎｄ Ｉ
ｎフラグメントを含有するプラスミドｐ６ｙであった。
Ｄ−ガラクトピラノシド 実施例Ａ プラスミドｐＲＩＴ１０１６７の組立テ出発
材料はｐＢＲ３２２上にクローンされたＴＤＨ３遺伝子
をコード付けする酵母ＤＮＡの２．１ｋｂＨｉｎｄ Ｉ
ｎフラグメントを含有するプラスミドｐ６ｙであった。
ｐＢＲ３２２はポリバーら（Ｂｏｌｉｖａｒｅｔ ａｌ
、）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、２．９５〜１１３ （１９
７７）によって記載されている。該ｐ６ｙプラスミドは
ムステイら（Ｍｕｓｔｉ ｅｔ ａｌ、）、ジーン（Ｇ
ｅｎｅ）、ｊ土、１３３（１９８３）によって組立てら
れ、かつ特徴付けされており、ザ・ナショナル・インス
ティチュート・オブ・ヘルス（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａ
ｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｔｈ ）のエム・
ローゼンベルグ（Ｍ、 Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ） ｔ１士
から入手した。該Ｈｉｎｄ■フラグメントをＥｃｏＲＩ
部位が破壊されたｐＢＲ３２２上に再クローンしてプラ
スミドｐＲＩＴ１０１６４（非本質的な操作）を得た。
、）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、２．９５〜１１３ （１９
７７）によって記載されている。該ｐ６ｙプラスミドは
ムステイら（Ｍｕｓｔｉ ｅｔ ａｌ、）、ジーン（Ｇ
ｅｎｅ）、ｊ土、１３３（１９８３）によって組立てら
れ、かつ特徴付けされており、ザ・ナショナル・インス
ティチュート・オブ・ヘルス（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａ
ｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｔｈ ）のエム・
ローゼンベルグ（Ｍ、 Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ） ｔ１士
から入手した。該Ｈｉｎｄ■フラグメントをＥｃｏＲＩ
部位が破壊されたｐＢＲ３２２上に再クローンしてプラ
スミドｐＲＩＴ１０１６４（非本質的な操作）を得た。
ＴＤＨ３コーディング配列のＡＴＧコドンのＧ残基に位
置するＢａｍＨＩを生じかつＴＤＨ３プロモーター活性
を有するＨｉｎｄ Ｉｆｆ −ＢａｍＨＴ ＤＮＡフ
ラグメントを得るようにＴＤＨ３配列が１傷であって操
作によって変化しない以下の操作を行った。実質的には
カーノら（Ｋａｈｎ ｅｔａｌ 、） 、メソッズ・イ
ン・エンザイモロシ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ）、６８．２６８（１９７９）によって
記載されている如くに、前記の如く調製したｐＲＩＴ１
０１６４のＤＮＡをＣｓＣ１！−臭化エチジウム密度勾
配遠心分離に２回付すことによって精製した。ＸｂａＩ
エンドヌクレアーゼ７５単位でｐＲＩＴ１０１６４．Ｄ
ＮＡ １５０μ２を完全に消化し、フェノールオヨヒ
エーテルで抽出し、エタノールで沈殿させ、ＤＮＡを１
μｌ当たり１μｙの濃度で０、ＯＩＭトロメタミンーＨ
Ｃｊ 緩衝液に再懸濁した。
置するＢａｍＨＩを生じかつＴＤＨ３プロモーター活性
を有するＨｉｎｄ Ｉｆｆ −ＢａｍＨＴ ＤＮＡフ
ラグメントを得るようにＴＤＨ３配列が１傷であって操
作によって変化しない以下の操作を行った。実質的には
カーノら（Ｋａｈｎ ｅｔａｌ 、） 、メソッズ・イ
ン・エンザイモロシ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ）、６８．２６８（１９７９）によって
記載されている如くに、前記の如く調製したｐＲＩＴ１
０１６４のＤＮＡをＣｓＣ１！−臭化エチジウム密度勾
配遠心分離に２回付すことによって精製した。ＸｂａＩ
エンドヌクレアーゼ７５単位でｐＲＩＴ１０１６４．Ｄ
ＮＡ １５０μ２を完全に消化し、フェノールオヨヒ
エーテルで抽出し、エタノールで沈殿させ、ＤＮＡを１
μｌ当たり１μｙの濃度で０、ＯＩＭトロメタミンーＨ
Ｃｊ 緩衝液に再懸濁した。
このＸｂａＩ処理ＤＮＡの２０ ｔｉｐ試料をＢａ７７
３１ヌクレアーゼで消化してＡＴＧコドンとＸｂａＩ
部位間のＤＮＡの６１塩基対を切り取った。最終反応容
量２００μ／中のＤＮＡ２０．に’当たりＢａｌ！３１
ヌクレアーゼ１単位を用い、６００ｍＭ Ｎａ−Ｃム１
２ｍＭ ＣａＣｅ２．１２ｍＭ ＭｇＣｌ！２．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、２０ｍＭ トロメタえンーＨＣ１！、ｐＨ
３，１を含有する緩衝液中、３０℃にて１〜３分間、Ｂ
ａｉ’３１での消化を行った。
３１ヌクレアーゼで消化してＡＴＧコドンとＸｂａＩ
部位間のＤＮＡの６１塩基対を切り取った。最終反応容
量２００μ／中のＤＮＡ２０．に’当たりＢａｌ！３１
ヌクレアーゼ１単位を用い、６００ｍＭ Ｎａ−Ｃム１
２ｍＭ ＣａＣｅ２．１２ｍＭ ＭｇＣｌ！２．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、２０ｍＭ トロメタえンーＨＣ１！、ｐＨ
３，１を含有する緩衝液中、３０℃にて１〜３分間、Ｂ
ａｉ’３１での消化を行った。
エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧ
ＴＡ）の添加によって酵素反応を停止して２０ｍＭの終
濃度とし、試料を等容量のフェノール、エーテルで抽出
し、エタノールで沈殿させた。各ＤＮＡ試料を１０ｍＭ
トロメタミンーＨＣ／緩衝液、ｐＨ７，５の２０μＥに
再懸濁した。各ＤＮＡ試料約２．５μｙをＨｐａＩエン
ドヌクレアーゼで消化し、ＨｐａＩ−ＸｂａＩフラグメ
ントの大きさをｐＲＩＴ１０１６４からの３３５ｂｐ
ＨｐａＩ−ＸｂａＩフラグメントと比較することによ
って、Ｂａｌ！３１消化の程度を測定した。Ｂａ／３１
での２分間消化はｐＲＩＴ１０１６４ のＸｂａＩ−Ｈ
ｐａＩフラグメントから約４１〜８８個のヌクレオチド
を除去することが判明した。
ＴＡ）の添加によって酵素反応を停止して２０ｍＭの終
濃度とし、試料を等容量のフェノール、エーテルで抽出
し、エタノールで沈殿させた。各ＤＮＡ試料を１０ｍＭ
トロメタミンーＨＣ／緩衝液、ｐＨ７，５の２０μＥに
再懸濁した。各ＤＮＡ試料約２．５μｙをＨｐａＩエン
ドヌクレアーゼで消化し、ＨｐａＩ−ＸｂａＩフラグメ
ントの大きさをｐＲＩＴ１０１６４からの３３５ｂｐ
ＨｐａＩ−ＸｂａＩフラグメントと比較することによ
って、Ｂａｌ！３１消化の程度を測定した。Ｂａ／３１
での２分間消化はｐＲＩＴ１０１６４ のＸｂａＩ−Ｈ
ｐａＩフラグメントから約４１〜８８個のヌクレオチド
を除去することが判明した。
この結果は、同様数の塩基対がＡＴＧコド塞向 ・かう
他のＸｂａＩ末端から除去されたことを意味する。２分
間のＢａ１３１消化から回収したＤＮＡ ５μ２をＢａ
ｍＨＩエンドヌクレアーゼで消化し、フェノールで抽出
し、エタノール沈：股によって回収した。
他のＸｂａＩ末端から除去されたことを意味する。２分
間のＢａ１３１消化から回収したＤＮＡ ５μ２をＢａ
ｍＨＩエンドヌクレアーゼで消化し、フェノールで抽出
し、エタノール沈：股によって回収した。
デオキシヌクレオチドトリホスフェートの序在において
、このＤＮＡをＴ４ポリメラーゼ５単位で処理して満た
し、ＢａｍＨＩおよびいずれのＢａＩ！３１一本鎖末端
をも平滑末端とし、フェノールで抽出し、エタノール沈
殿によって回収した。このＤＮＡ２．３μｙをＴ４ＤＮ
ＡＩＪガーゼ５単位で処理し、結んだ混合物の半分を用
いてコーヘンら（Ｃｏｈｅｎ ｅｔａｌ、）、プロシー
ディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
ンエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ 。
、このＤＮＡをＴ４ポリメラーゼ５単位で処理して満た
し、ＢａｍＨＩおよびいずれのＢａＩ！３１一本鎖末端
をも平滑末端とし、フェノールで抽出し、エタノール沈
殿によって回収した。このＤＮＡ２．３μｙをＴ４ＤＮ
ＡＩＪガーゼ５単位で処理し、結んだ混合物の半分を用
いてコーヘンら（Ｃｏｈｅｎ ｅｔａｌ、）、プロシー
ディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
ンエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ 。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）、６９．２１１０（１９７２）
の方法によって調製したイー・コリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）
Ｋ１２株ＭＭ２９４のコンピテント細胞を形質転換した
。形質転換されたイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）集団１１
ｅを２００μｙｈｅアンピシリンを含むＬ−ブロス３５
０ｄ中に希釈し、得られた培４物から全プラスミドＤＮ
Ａを精製した。
の方法によって調製したイー・コリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）
Ｋ１２株ＭＭ２９４のコンピテント細胞を形質転換した
。形質転換されたイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）集団１１
ｅを２００μｙｈｅアンピシリンを含むＬ−ブロス３５
０ｄ中に希釈し、得られた培４物から全プラスミドＤＮ
Ａを精製した。
約４０〜８０個の塩基対のＢａ／３１誘発欠失を有する
プラスミド分子の集団を含有するこのプラスミドＤＮＡ
８０μ２を、順次Ｈｉｎｄ［［エンドヌクレアーゼ７５
単位およびＢａｍＨｉエンドヌクレアーゼ９６単位で消
化して、前記処理後ＢａｍＨＩ部位が再生された、すな
わちＢａｌ ３１ 消化がＧ残基で終止し７たプラス
ミドからＤＮＡ フラグメントを得た。
プラスミド分子の集団を含有するこのプラスミドＤＮＡ
８０μ２を、順次Ｈｉｎｄ［［エンドヌクレアーゼ７５
単位およびＢａｍＨｉエンドヌクレアーゼ９６単位で消
化して、前記処理後ＢａｍＨＩ部位が再生された、すな
わちＢａｌ ３１ 消化がＧ残基で終止し７たプラス
ミドからＤＮＡ フラグメントを得た。
このＤＮＡの消化は調製１％アガロースゲル上で行い、
１１００〜１０００ｂｐの大きさに対応する所望のＨｉ
ｎｄ ｍ−ＢａｍＨＩフラグメントを、一方が約１０７
０ｂｐのＤＮＡに対応し他方が約１０３０ｂｐに対応す
る２片でゲルから切り出した。凍結し、次いで解凍し、
続いて高速遠心してアガロースをペレット化する工程に
よってＤＮＡを２つのアガロースゲル片から回収した。
１１００〜１０００ｂｐの大きさに対応する所望のＨｉ
ｎｄ ｍ−ＢａｍＨＩフラグメントを、一方が約１０７
０ｂｐのＤＮＡに対応し他方が約１０３０ｂｐに対応す
る２片でゲルから切り出した。凍結し、次いで解凍し、
続いて高速遠心してアガロースをペレット化する工程に
よってＤＮＡを２つのアガロースゲル片から回収した。
上澄液をミリポアＧ■ミレツクス・フィルター（Ｍｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ ＧＶ Ｍｉｌｌｅｘｆｉｌｔｅｒ）を通
して濾過し、エタノール沈殿に２回付すことによってＤ
ＮＡを回収し、０．ＯＩＭトロメタミンーＨＣ１！緩衝
液、ｐ Ｈ７，５の２０μｇに再懸濁した。
ｌｉｐｏｒｅ ＧＶ Ｍｉｌｌｅｘｆｉｌｔｅｒ）を通
して濾過し、エタノール沈殿に２回付すことによってＤ
ＮＡを回収し、０．ＯＩＭトロメタミンーＨＣ１！緩衝
液、ｐ Ｈ７，５の２０μｇに再懸濁した。
アガロースゲル電気泳動による分析ならびにｐＲＩＴ１
０１６４ＤＮＡのＨｉｎｄＬＩＩとＸｂａＩ による消
化および７ア一ジ人ＤＮＡのＨｉｎｄ［［とＥｃｏＲＩ
による消化からのフラグメントとの比較は、ｐＲＩＴ１
０１６４からの１１２０ｂｐの親のＨｉｎｄｎｌ−Ｘｂ
ａＩフラグメントと比して１つは約１０７０ｂｐ と評
価され、もう１つは約１０３０ｂｐの大きさと評両され
る２種の区別されるＨｉｎｄ ｍ−ＢａｍＨＩフラグメ
ントの集団が得られたことを示した。１０３０ｂｐＨｉ
ｎｄ ＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメント集団の約１００
ｎｊ９を、ＨｉｎｄｌＩ［およびＢａｍＨＩエンドヌク
レアーゼで消化されかつアルカリホスファターゼで処理
されたプラスミドｐＵＣ９２００ｎｙで結び（シャイン
（。
０１６４ＤＮＡのＨｉｎｄＬＩＩとＸｂａＩ による消
化および７ア一ジ人ＤＮＡのＨｉｎｄ［［とＥｃｏＲＩ
による消化からのフラグメントとの比較は、ｐＲＩＴ１
０１６４からの１１２０ｂｐの親のＨｉｎｄｎｌ−Ｘｂ
ａＩフラグメントと比して１つは約１０７０ｂｐ と評
価され、もう１つは約１０３０ｂｐの大きさと評両され
る２種の区別されるＨｉｎｄ ｍ−ＢａｍＨＩフラグメ
ントの集団が得られたことを示した。１０３０ｂｐＨｉ
ｎｄ ＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメント集団の約１００
ｎｊ９を、ＨｉｎｄｌＩ［およびＢａｍＨＩエンドヌク
レアーゼで消化されかつアルカリホスファターゼで処理
されたプラスミドｐＵＣ９２００ｎｙで結び（シャイン
（。
５ｈｉｎｅ）、米国特許第４２６４７３１号参照）、結
んだ混合物を用いてアンピシリン耐性について選択され
たイー・コリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）株ＪＭＩＯ３のコンピ
テント細胞を形質転換した。イー・コリ（Ｅ。
んだ混合物を用いてアンピシリン耐性について選択され
たイー・コリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）株ＪＭＩＯ３のコンピ
テント細胞を形質転換した。イー・コリ（Ｅ。
ｃａｌ ｉ）株ＪＭ１０３の形質転換は前掲のコーヘン
ら（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ、）の方法によって行った
。
ら（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ、）の方法によって行った
。
ｐＵＣ９ベクタープラスミドおよび受容体イー・フリ（
Ｅ、 ｃｏｌｉ ）株ＪＭ１０３は共にビエイラおよび
メツシング（Ｖｉｅｉｒａ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ
）によりジーン（Ｇｅｎｅ）、１９．２５９（１９８２
）中に記載されており、ジエイ・メッシング（Ｊ 、Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ）（ミネソタ大学）より入手した。ｐＵｃ
９ベクターはアメルスハム（Ａｍｅｒｓｈａｍ） （パ
ツキンガムＥ’ｒ−” （Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉ
ｒｅ）、英国）およびファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ） （ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、スウェーデン）
から商業的に入手可能である。イー・コリ（’Ｅ、ｃｏ
ｌｉ）株ＪＭＩ ０３はジエイ・メッシング（Ｊ、Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ） （ミネソタ大学）より入手可能である。
Ｅ、 ｃｏｌｉ ）株ＪＭ１０３は共にビエイラおよび
メツシング（Ｖｉｅｉｒａ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ
）によりジーン（Ｇｅｎｅ）、１９．２５９（１９８２
）中に記載されており、ジエイ・メッシング（Ｊ 、Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ）（ミネソタ大学）より入手した。ｐＵｃ
９ベクターはアメルスハム（Ａｍｅｒｓｈａｍ） （パ
ツキンガムＥ’ｒ−” （Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉ
ｒｅ）、英国）およびファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ） （ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、スウェーデン）
から商業的に入手可能である。イー・コリ（’Ｅ、ｃｏ
ｌｉ）株ＪＭＩ ０３はジエイ・メッシング（Ｊ、Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ） （ミネソタ大学）より入手可能である。
イー・コリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）株ＪＭ１０３ の特性
を有するもう１つのイー・コ！Ｊ （Ｅ、ｃｏｌｉ）株
、すなわち、ＪＭＩＯＩは受託番号ＡＴＣＣ３３８７６
下、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｕｉｌｌｅ）
、メリーランド州、から入手でき、また、これは宿主と
して用いることもできる。１ ｍｅ当たり約４００ の
アンピシリン耐性コロニーを得、そのうち９８のコロニ
ーヲＸ−ｇａｌを含有する培地上でテストした。９５は
白色であり、ベクター上のＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａ
ｍＨＩ部位間に外来性ＤＮＡフラグメントが首尾よく挿
入されたことを示す。
を有するもう１つのイー・コ！Ｊ （Ｅ、ｃｏｌｉ）株
、すなわち、ＪＭＩＯＩは受託番号ＡＴＣＣ３３８７６
下、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｕｉｌｌｅ）
、メリーランド州、から入手でき、また、これは宿主と
して用いることもできる。１ ｍｅ当たり約４００ の
アンピシリン耐性コロニーを得、そのうち９８のコロニ
ーヲＸ−ｇａｌを含有する培地上でテストした。９５は
白色であり、ベクター上のＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａ
ｍＨＩ部位間に外来性ＤＮＡフラグメントが首尾よく挿
入されたことを示す。
増殖する培養物へのスペクチノマイシン（１５０μ、９
／ｄ）の添加によるプラスミドのｔｌＩｌ後、スモール
・スケール（ｓｍａｌｌ ５ｃａｌｅ） 法〔ビルン
ボイムおよびトリイ（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏ
ｌｙ）、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌ
、 Ａｃ１ｄＲｅｓ 、 ）、７．１５１３、（１９７
９）］によって個々の形質転換体コロニーからのプラス
ミドを調製した。
／ｄ）の添加によるプラスミドのｔｌＩｌ後、スモール
・スケール（ｓｍａｌｌ ５ｃａｌｅ） 法〔ビルン
ボイムおよびトリイ（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏ
ｌｙ）、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌ
、 Ａｃ１ｄＲｅｓ 、 ）、７．１５１３、（１９７
９）］によって個々の形質転換体コロニーからのプラス
ミドを調製した。
Ａｖａ口およびＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼでの二重
消化の後、組換体プラスミドを７．５％アクリルアミド
ゲル上で分析し、ｐＲＩＴ１０１６４のプロモーター−
だ端コーディング頭載よりなる４５０ｂｐ ＡｖａＩＩ
−ＸｂａフラグメントおよびｐＢＲ３２２ＤＮＡのＨｐ
ａ口消化のフラグメントと比較した。
消化の後、組換体プラスミドを７．５％アクリルアミド
ゲル上で分析し、ｐＲＩＴ１０１６４のプロモーター−
だ端コーディング頭載よりなる４５０ｂｐ ＡｖａＩＩ
−ＸｂａフラグメントおよびｐＢＲ３２２ＤＮＡのＨｐ
ａ口消化のフラグメントと比較した。
ｐＲＩＴ１０１６４と比較すると２０〜９０個の塩基対
の欠失に対応するＡｖａローＢａｍＨＩフラグメントが
調べた３６のプラスミドのうち３５に存在していた。約
８０の塩基対（ｐＲＩＴ１０１６６） 、５０（７）塩
基対（ｐＲＩ’Ｔ’１ｏ１６７ 、第１図）および４５
の塩基対（ｐＲＩＴ１０１６５） の欠失を示す３種
のプラスミドを後の実験用に選択した。ＣｓＣ１−臭化
エチジウム密度遠心分離によってプラスミドＤＮＡを１
凋製し、各２５μ２をＥｃｏＲＩで消化した。ＥｃｏＲ
Ｉ末端を交換キネ−ジョンによりａ−３２ｐ−Ａ”ｒｐ
でラベルし、マキサムおよびギルバー） （Ｍａｘａｍ
ａｎｄ’ Ｇ１１ｂｅｒｔ）の化学修飾法、メソッズ・
イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６５．４９９（１９８０）、によ
って各プラスミドからのＨｉｎｄ ｕｌ −ＥｃｏＲＩ
フラグメントのヌクレオチド配列を決定した。各組換体
プラスミドのｐＵｃ９ベクタ一部におけるＥｃｏＲＩ部
位のラベル、およびそこからの配列決定は、ＴＤＨ３Ｄ
ＮＡフラグメントに入れる欠失末端を特徴づける隣接Ｂ
ａｍＨＩ部位のまわりの配列を決定する常法である。こ
の配列決定分析は、プラスミドｐＲＩＴ１０６６におい
ては、ＡＴＧ コドンより２５塩基対上流の５′非翻
訳領域に位置するＧ残基に３ａｍＨＩ部位が再生し；ｐ
ＲＩＴ１０１６５においては、ＢａｍＨｉ部位は第３コ
ドンの第２塩基に位置し；および、ｐＲＩＴ１０１６７
においては、ＢａｍＨＩ部位はＡＴＧコドンのＧ残基に
位置することを示した。
の欠失に対応するＡｖａローＢａｍＨＩフラグメントが
調べた３６のプラスミドのうち３５に存在していた。約
８０の塩基対（ｐＲＩＴ１０１６６） 、５０（７）塩
基対（ｐＲＩ’Ｔ’１ｏ１６７ 、第１図）および４５
の塩基対（ｐＲＩＴ１０１６５） の欠失を示す３種
のプラスミドを後の実験用に選択した。ＣｓＣ１−臭化
エチジウム密度遠心分離によってプラスミドＤＮＡを１
凋製し、各２５μ２をＥｃｏＲＩで消化した。ＥｃｏＲ
Ｉ末端を交換キネ−ジョンによりａ−３２ｐ−Ａ”ｒｐ
でラベルし、マキサムおよびギルバー） （Ｍａｘａｍ
ａｎｄ’ Ｇ１１ｂｅｒｔ）の化学修飾法、メソッズ・
イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６５．４９９（１９８０）、によ
って各プラスミドからのＨｉｎｄ ｕｌ −ＥｃｏＲＩ
フラグメントのヌクレオチド配列を決定した。各組換体
プラスミドのｐＵｃ９ベクタ一部におけるＥｃｏＲＩ部
位のラベル、およびそこからの配列決定は、ＴＤＨ３Ｄ
ＮＡフラグメントに入れる欠失末端を特徴づける隣接Ｂ
ａｍＨＩ部位のまわりの配列を決定する常法である。こ
の配列決定分析は、プラスミドｐＲＩＴ１０６６におい
ては、ＡＴＧ コドンより２５塩基対上流の５′非翻
訳領域に位置するＧ残基に３ａｍＨＩ部位が再生し；ｐ
ＲＩＴ１０１６５においては、ＢａｍＨｉ部位は第３コ
ドンの第２塩基に位置し；および、ｐＲＩＴ１０１６７
においては、ＢａｍＨＩ部位はＡＴＧコドンのＧ残基に
位置することを示した。
ｐＲＩＴ１０１６７においてかく組立てらｎたＴＤＨ３
ＤＮＡのＨｉｎｄ ＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントは
不変形におけるＴＤＨ３プロモーター活性に８纒なすべ
ての配列を含有する。
ＤＮＡのＨｉｎｄ ＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントは
不変形におけるＴＤＨ３プロモーター活性に８纒なすべ
ての配列を含有する。
実施例Ｂ ベクターｐＲＩＴ１０１７２の組立て実施例
Ａに記載した如くに調製したｐＲＩＴ１０１６７からの
１０５０ｂｐ Ｈｉｎｄ［Ｉ−ＢａｍＨＩ ＴＤＨ３Ｄ
ＮＡインサートを、ベクターの２ミクロン（ｍｉｃｒｏ
ｎ）ＤＮＡ部分にあるＨｉｎｄｌｎ部位とＢａｍＨＩ部
位間の部位−チら（Ｂｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ、）、ジ
ーン（Ｇｅｎｅ）、８．１２１（１９７９）によって記
載されているＹＥｐ１３シャトルベクター上に再クロー
ンして組換体プラスミドｐＲＩＴ１２１５９を得た。次
いでｐＲＩＴ１２１５９のＤＮＡをＸｂａＩおよびＢ
ａｍＩ（Ｉエンドヌクレアーゼで消化し、得られた１６
５０ｂｐ フラグメントをプラスミドｐＲＩＴ１０７
７４上のＡＲＧ３プロモーターを含有する同様のＸｂａ
Ｉ−ＢａｍＨＩフラグメントの位置に結んだ。プラスミ
ドｐ ＲＩ Ｔ １０７７４はカベシンら（Ｃａｂｅｚ
ｏｎ ｅｔ ａｉ、）、プロシーデイングズ・オブ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サンエンシズ（Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）Ｕ。
Ａに記載した如くに調製したｐＲＩＴ１０１６７からの
１０５０ｂｐ Ｈｉｎｄ［Ｉ−ＢａｍＨＩ ＴＤＨ３Ｄ
ＮＡインサートを、ベクターの２ミクロン（ｍｉｃｒｏ
ｎ）ＤＮＡ部分にあるＨｉｎｄｌｎ部位とＢａｍＨＩ部
位間の部位−チら（Ｂｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ、）、ジ
ーン（Ｇｅｎｅ）、８．１２１（１９７９）によって記
載されているＹＥｐ１３シャトルベクター上に再クロー
ンして組換体プラスミドｐＲＩＴ１２１５９を得た。次
いでｐＲＩＴ１２１５９のＤＮＡをＸｂａＩおよびＢ
ａｍＩ（Ｉエンドヌクレアーゼで消化し、得られた１６
５０ｂｐ フラグメントをプラスミドｐＲＩＴ１０７
７４上のＡＲＧ３プロモーターを含有する同様のＸｂａ
Ｉ−ＢａｍＨＩフラグメントの位置に結んだ。プラスミ
ドｐ ＲＩ Ｔ １０７７４はカベシンら（Ｃａｂｅｚ
ｏｎ ｅｔ ａｉ、）、プロシーデイングズ・オブ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サンエンシズ（Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）Ｕ。
５−８１．６５９４〜６５９８（１９８６） 、ならび
にカベシンら（Ｃａｂｅｚｏｎ ｅｔ ａｌ、）、１９
８４手１月３０日出願の米国持許出＠５７５１２２号に
記載されており、それはＡＲＧ３プロモーター領域より
なる１４７０ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩインサ
ートおよびＡＲＧ３転写終止領域よりなる１１５０ｂｐ
ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄｌＩＩ フラグメントと共に
、ｉｎ ｖｉｔｒｏ操作によってそれから天然ベクター
のＢａｍＨＴおよびＸｈｏＩ部位が欠失されたＹＥｐ１
３レプリコンよりなる。ＴＤＨ３プロモーターインサー
トによるｐＲＩＴ１０７７４上のＡＲＧ３プロモーター
インサートの１ｉｌｔ４は、ＴＤＨ３プロモーターイン
サートのＡＴＧコドンに位置しかツ１１５０ｂｐ Ｂ
ａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ［［ＡＲＧ３ ＤＮＡフラグメント
上の転写終止についての機能シグナルに先行する単一の
ＢａｍＨＩ部位を含有するプラスミドｐＲＩＴ１０１７
２を与える。従って、外来ＤＮＡをこの部位でクローン
することができる。さらに、このＤＮＡ インサート
は、他のベクター上への挿入用の２２００ｂｐ Ｈｉ
ｎｄ［［フラグメントとしての発現単位モジュール（カ
セット）の除去を可能とするＨ ｉ ｎｄ１１１部位と
境界を接する。第２図はｐＲＩＴ１０１７２の制限エン
ドヌクレアーゼ切断地図である。
にカベシンら（Ｃａｂｅｚｏｎ ｅｔ ａｌ、）、１９
８４手１月３０日出願の米国持許出＠５７５１２２号に
記載されており、それはＡＲＧ３プロモーター領域より
なる１４７０ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩインサ
ートおよびＡＲＧ３転写終止領域よりなる１１５０ｂｐ
ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄｌＩＩ フラグメントと共に
、ｉｎ ｖｉｔｒｏ操作によってそれから天然ベクター
のＢａｍＨＴおよびＸｈｏＩ部位が欠失されたＹＥｐ１
３レプリコンよりなる。ＴＤＨ３プロモーターインサー
トによるｐＲＩＴ１０７７４上のＡＲＧ３プロモーター
インサートの１ｉｌｔ４は、ＴＤＨ３プロモーターイン
サートのＡＴＧコドンに位置しかツ１１５０ｂｐ Ｂ
ａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ［［ＡＲＧ３ ＤＮＡフラグメント
上の転写終止についての機能シグナルに先行する単一の
ＢａｍＨＩ部位を含有するプラスミドｐＲＩＴ１０１７
２を与える。従って、外来ＤＮＡをこの部位でクローン
することができる。さらに、このＤＮＡ インサート
は、他のベクター上への挿入用の２２００ｂｐ Ｈｉ
ｎｄ［［フラグメントとしての発現単位モジュール（カ
セット）の除去を可能とするＨ ｉ ｎｄ１１１部位と
境界を接する。第２図はｐＲＩＴ１０１７２の制限エン
ドヌクレアーゼ切断地図である。
実施例１
ビイ・ファルシパルム・シルカムスポロゾイテ（Ｐ、
Ｐａｌｃｉｐａｒｕｍ Ｃｉｒｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔ
ｅ ） 蛋白質コーディング配列からその推測される
シグナル配列を除いたものの酵母における発現Ａ、プラ
スミドｐＲＩＴ１２５７０およびｐＲＩＴ１２５６９の
組立て プラスミドＷＲ２０１はウォルター・リード・アーミイ
・インステイチュート・オプ・リサーチ（Ｗａｌｔｅｒ
Ｒｅｅｄ Ａｒｍｙ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ）より入手したが、これは完全なシルカ
ムスポロゾイテ（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ
）蛋白質遺伝子プラスモデイウム・ファルシパルム（Ｐ
ｌｏｓｍｏｄｉｕｍｆ ａ ｌｃ ｉｐａｒｕｍ ）を
コード付けするλｍｐｆｌ（ジーンら（’Ｄａｍｅ ｅ
ｔ ａｌ、）、寸イエンス（５ｃｉｅｎｃｅ）、２２５
．５９３〜５９９ら、゛・１、（１９８４）参照〕 か
らの２．３キロベース（ｋｂ）ＥｃｏＲＩ フラグメ
ントのベクターｐＵＣ８への挿入から碍られるものであ
る。
Ｐａｌｃｉｐａｒｕｍ Ｃｉｒｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔ
ｅ ） 蛋白質コーディング配列からその推測される
シグナル配列を除いたものの酵母における発現Ａ、プラ
スミドｐＲＩＴ１２５７０およびｐＲＩＴ１２５６９の
組立て プラスミドＷＲ２０１はウォルター・リード・アーミイ
・インステイチュート・オプ・リサーチ（Ｗａｌｔｅｒ
Ｒｅｅｄ Ａｒｍｙ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ）より入手したが、これは完全なシルカ
ムスポロゾイテ（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ
）蛋白質遺伝子プラスモデイウム・ファルシパルム（Ｐ
ｌｏｓｍｏｄｉｕｍｆ ａ ｌｃ ｉｐａｒｕｍ ）を
コード付けするλｍｐｆｌ（ジーンら（’Ｄａｍｅ ｅ
ｔ ａｌ、）、寸イエンス（５ｃｉｅｎｃｅ）、２２５
．５９３〜５９９ら、゛・１、（１９８４）参照〕 か
らの２．３キロベース（ｋｂ）ＥｃｏＲＩ フラグメ
ントのベクターｐＵＣ８への挿入から碍られるものであ
る。
第１Ａ図はクローンλｍｐｆｌの模式的な制限地図およ
び配列決定法を示す。該図に示された制限酵素切断部位
の位置は配列から決定し、消化によって確認した： Ａ
、Ａｖａ口；Ａｃ、 ＡｃｃＩ ；ａ、 Ｂｓ ｔｎＩ
； Ｄ、ＤｒａＩ； Ｄｄ、ＤｄｅＩ； Ｆ％ＦｏｋＩ
； Ｎ、ＮｄｅＩ； Ｒ，ＲｓａＩ； Ｓ、５ｔｕＩ；
Ｔ、ＴｔｈＩＩＩ； Ｔｑ、ＴａｑＩ；Ｘ、Ｘｈｏ口
。矢印は決定された配列の複製開始点、方向および大き
さを示す。Ｃ８蛋白質コーディング領域は太線として示
す。
び配列決定法を示す。該図に示された制限酵素切断部位
の位置は配列から決定し、消化によって確認した： Ａ
、Ａｖａ口；Ａｃ、 ＡｃｃＩ ；ａ、 Ｂｓ ｔｎＩ
； Ｄ、ＤｒａＩ； Ｄｄ、ＤｄｅＩ； Ｆ％ＦｏｋＩ
； Ｎ、ＮｄｅＩ； Ｒ，ＲｓａＩ； Ｓ、５ｔｕＩ；
Ｔ、ＴｔｈＩＩＩ； Ｔｑ、ＴａｑＩ；Ｘ、Ｘｈｏ口
。矢印は決定された配列の複製開始点、方向および大き
さを示す。Ｃ８蛋白質コーディング領域は太線として示
す。
第２Ａ図はビイ・ファルシパルム（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐ
ａｒｕｍ）からのＣ８蛋白質遺１云子のヌクレオチド配
列を示す。λｍｐｆｌにおけるＣ８蛋白質遺伝子のヌク
レオチド配列を示す。ベクターｐＵＣ８はビエイラら（
Ｖｉｅｉｒａ ｅｔ ａｌ、）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、
１９．２５９（１９８２）によって記載されている。ベ
クターｐｕｃｓはアメルスハム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、
パツキンガム’ｑ−１７（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉ
ｒｅ）、英国、およびファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）、ピスカタウエイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュ
ージャージ州、米国およびウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）
、スウェーデンから商業的に入手可能である。ビイ・フ
ァシパルム（Ｐ。
ａｒｕｍ）からのＣ８蛋白質遺１云子のヌクレオチド配
列を示す。λｍｐｆｌにおけるＣ８蛋白質遺伝子のヌク
レオチド配列を示す。ベクターｐＵＣ８はビエイラら（
Ｖｉｅｉｒａ ｅｔ ａｌ、）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、
１９．２５９（１９８２）によって記載されている。ベ
クターｐｕｃｓはアメルスハム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、
パツキンガム’ｑ−１７（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉ
ｒｅ）、英国、およびファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）、ピスカタウエイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュ
ージャージ州、米国およびウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）
、スウェーデンから商業的に入手可能である。ビイ・フ
ァシパルム（Ｐ。
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ） Ｃ３蛋白質コ一デイング配
列の最初の５２ｂｐを除いたものを含有するプラスミド
ＷＲ２０１の１２１５塩基対（ｂｐ ） ５ｔｕＩ−Ｒ
ｓａ Ｉ フラグメントを７．５％ポリアクリルアミド
電気泳動ゲルからの電気溶出によって精製した。制限エ
ンドヌクレアーゼＳｔｕ ＩはＣ８蛋白質遺云子を配列
の１８番目のコドンにおいて切断する。Ｃ８蛋白質の最
初のアミノ酸１６個の配列は切断されたシグナルペプチ
ドを特徴づけるものであるので〔ダーメら（Ｄａｍｅ
ｅｔ ａｌ、）、サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ）、２５
５．５９３〜５９９（１９８４月、これらのアミノ酸は
恐ら（はスボロゾイテ（５ｐＯｒＯＺＯｉｔｅ ）上の
成熟Ｃ８蛋白質には欠けているであろう。
列の最初の５２ｂｐを除いたものを含有するプラスミド
ＷＲ２０１の１２１５塩基対（ｂｐ ） ５ｔｕＩ−Ｒ
ｓａ Ｉ フラグメントを７．５％ポリアクリルアミド
電気泳動ゲルからの電気溶出によって精製した。制限エ
ンドヌクレアーゼＳｔｕ ＩはＣ８蛋白質遺云子を配列
の１８番目のコドンにおいて切断する。Ｃ８蛋白質の最
初のアミノ酸１６個の配列は切断されたシグナルペプチ
ドを特徴づけるものであるので〔ダーメら（Ｄａｍｅ
ｅｔ ａｌ、）、サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ）、２５
５．５９３〜５９９（１９８４月、これらのアミノ酸は
恐ら（はスボロゾイテ（５ｐＯｒＯＺＯｉｔｅ ）上の
成熟Ｃ８蛋白質には欠けているであろう。
かくして、プラスミドＷＲ２０１の１２１５ｂｐＳｔｕ
Ｉ−ＲｓａＩフラグメントは、配列から予想される成熟
Ｃ８蛋白質の最初の２個のアミノ酸を除くすべてをコー
ド付けすべきものである。この平滑末端５ｈｕＩ−Ｒｓ
ａＩフラグメントを、実施例Ｂに記載した如く調製した
酵母発現ベクターｐＲＩＴ１０１７２のＤＮＡポリメラ
ーゼ修復ＢａｍＨＩ部位に隣接する翻訳開始コドンに同
相で融合した（満たした１３ａｍＨＩ部位の５ｔｕＩ部
位への結びはＢａｍＨ１部位を再形成する）。プラスミ
ドｐＲＩＴ１０１７２のＤＮＡ をＢａｍＨＩエンドヌ
クレアーゼで消化し、イー・コリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノーフラグメント）で処理
し、フェノールで抽出し、エタノール沈殿によって回収
した。このＤＮＡ０．４μ！？を前記ＷＲ２０１からの
１２１５ ｂｐＳｔｕＩ−ＲｓａＩフラグメント０．２
ｔｔｆｉｌと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処理し、結
んだ混合物を用いてコーヘンら（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａ
ｌ、）、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、） ＵＳＡ、６９．２１１０（
１９７２）の方法により調製したイー・コリ（Ｅ、ｃｏ
ｌｉ）Ｋ１２株ＭＭ２９４のコンピテント細胞を形質転
換した。ニックトランスレーションにより３２Ｐでラベ
ルした５ｔｕＩ−ＲｓａＩフラグメントをプローブとし
て用い、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）５４１のフィル
ター上のコロニーハイブリダイゼーション〔グルンシュ
タインおよびホグネス（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ
Ｈｏｇｎｅｓｓ）、プロシーデイングズ・かブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、） ＵＳＡ、７２．
３９６１（１９７５）］の方法によって１２００のコロ
ニーをテストした。コロニーのうち２０％は該プローブ
に関して陽性のシグナルを与えた。スモール・スケール
（ｓｍａｌｌ ５ｃａｌｅ）法〔ビルンボイムら（Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍ ｅｔ ａｌ、）、スフレイック・アシツ
ズ０リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ ）、７ １５１３（１９７３）］によって陽
性ココロニからの２８のプラスミドを調製した。Ｂａｍ
ＨＩおよび５ａｌＩエンドヌクレアーゼでの二改消化に
より５ｔｕＩ−ＲｓａＩフラグメントの配位をテストし
た。
Ｉ−ＲｓａＩフラグメントは、配列から予想される成熟
Ｃ８蛋白質の最初の２個のアミノ酸を除くすべてをコー
ド付けすべきものである。この平滑末端５ｈｕＩ−Ｒｓ
ａＩフラグメントを、実施例Ｂに記載した如く調製した
酵母発現ベクターｐＲＩＴ１０１７２のＤＮＡポリメラ
ーゼ修復ＢａｍＨＩ部位に隣接する翻訳開始コドンに同
相で融合した（満たした１３ａｍＨＩ部位の５ｔｕＩ部
位への結びはＢａｍＨ１部位を再形成する）。プラスミ
ドｐＲＩＴ１０１７２のＤＮＡ をＢａｍＨＩエンドヌ
クレアーゼで消化し、イー・コリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノーフラグメント）で処理
し、フェノールで抽出し、エタノール沈殿によって回収
した。このＤＮＡ０．４μ！？を前記ＷＲ２０１からの
１２１５ ｂｐＳｔｕＩ−ＲｓａＩフラグメント０．２
ｔｔｆｉｌと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処理し、結
んだ混合物を用いてコーヘンら（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａ
ｌ、）、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、） ＵＳＡ、６９．２１１０（
１９７２）の方法により調製したイー・コリ（Ｅ、ｃｏ
ｌｉ）Ｋ１２株ＭＭ２９４のコンピテント細胞を形質転
換した。ニックトランスレーションにより３２Ｐでラベ
ルした５ｔｕＩ−ＲｓａＩフラグメントをプローブとし
て用い、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）５４１のフィル
ター上のコロニーハイブリダイゼーション〔グルンシュ
タインおよびホグネス（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ
Ｈｏｇｎｅｓｓ）、プロシーデイングズ・かブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、） ＵＳＡ、７２．
３９６１（１９７５）］の方法によって１２００のコロ
ニーをテストした。コロニーのうち２０％は該プローブ
に関して陽性のシグナルを与えた。スモール・スケール
（ｓｍａｌｌ ５ｃａｌｅ）法〔ビルンボイムら（Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍ ｅｔ ａｌ、）、スフレイック・アシツ
ズ０リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ ）、７ １５１３（１９７３）］によって陽
性ココロニからの２８のプラスミドを調製した。Ｂａｍ
ＨＩおよび５ａｌＩエンドヌクレアーゼでの二改消化に
より５ｔｕＩ−ＲｓａＩフラグメントの配位をテストし
た。
プラスミドのうち、７のプラスミドは正しい配位のフラ
グメントを宵しくそのうちの１つはｐＲＩＴ１２５７０
と命名された、第２図）、１２のプラスミドは誤った配
位のフラグメントを有していた（そのうちの１つはｐＲ
ＩＴ１２５６９と命名された、第２図）。第４図はｐＲ
ＩＴ１２５７０の調製を説明するフローチャートである
。
グメントを宵しくそのうちの１つはｐＲＩＴ１２５７０
と命名された、第２図）、１２のプラスミドは誤った配
位のフラグメントを有していた（そのうちの１つはｐＲ
ＩＴ１２５６９と命名された、第２図）。第４図はｐＲ
ＩＴ１２５７０の調製を説明するフローチャートである
。
酢酸リチウム処理細胞の形質転換〔イト−ら（Ｎｏ ｅ
ｔ ａｌ、）、ジャーナル・オブ・バタテリオロジ−（
Ｊ 、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 、）、１５３．１６３−
１６８（１９８３））およびロイシン独立性についての
選択によって、プラスミドｐＲＩＴ１２５７０、ｐＲＩ
Ｔ１２５６９、およびｐＲＩＴ１０１７２をエム・クラ
ビール（Ｍ、Ｃｒａｂｅｅｌ ） 、セリア・インステ
イチュート（Ｃｅｒｉａ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）、アン
デルレヒト（Ａｎｄｅｒｌｅｃｈｔ ）、ベルギーより
入手した酵母（サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ））株ＤＣ
５（１ｅｕ２−３．１ｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３ 、ｃ
ａｎｌ−１１）および１０Ｓ４４Ｃ（１ｅｕ２−３．１
ｅｕ２−１１２ 、ｐｅｐ４−３） に導入した。こ
の組立てによって予想される蛋白質はベクター（ｐＲＩ
Ｔ１０１７２）配列に由来するそのＮＨ２末端における
３つのアミノ酸（Ｍｅｔ −Ａｓｐ−Ｐｒｏ−）に融合
した成熟ビイ・ファルシパルム（ｐ 、ｆａｌｃｉｐａ
ｒｕｍ：）ＣＳｔ白質の３９４のアミノ酸を含有する。
ｔ ａｌ、）、ジャーナル・オブ・バタテリオロジ−（
Ｊ 、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 、）、１５３．１６３−
１６８（１９８３））およびロイシン独立性についての
選択によって、プラスミドｐＲＩＴ１２５７０、ｐＲＩ
Ｔ１２５６９、およびｐＲＩＴ１０１７２をエム・クラ
ビール（Ｍ、Ｃｒａｂｅｅｌ ） 、セリア・インステ
イチュート（Ｃｅｒｉａ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）、アン
デルレヒト（Ａｎｄｅｒｌｅｃｈｔ ）、ベルギーより
入手した酵母（サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ））株ＤＣ
５（１ｅｕ２−３．１ｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３ 、ｃ
ａｎｌ−１１）および１０Ｓ４４Ｃ（１ｅｕ２−３．１
ｅｕ２−１１２ 、ｐｅｐ４−３） に導入した。こ
の組立てによって予想される蛋白質はベクター（ｐＲＩ
Ｔ１０１７２）配列に由来するそのＮＨ２末端における
３つのアミノ酸（Ｍｅｔ −Ａｓｐ−Ｐｒｏ−）に融合
した成熟ビイ・ファルシパルム（ｐ 、ｆａｌｃｉｐａ
ｒｕｍ：）ＣＳｔ白質の３９４のアミノ酸を含有する。
ニス・セレビシェ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）株
１０Ｓ４４Ｃはブダペスト条約の規定に従って、受託番
号ＡＴＣＣ２（１８）１９で、１９８６ｇｆ−８月１８
日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（
ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖ ｉ Ｉ ｌ
ｅ ）、メリーランド州、米国に寄託した。ニス・セレ
ビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＤＣ５はブダペ
スト条約の規定に従って、受託番号ＡＴＣＣ２０６３０
で、１９８２９ｆ−６月２日にアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ）に寄託した
。
１０Ｓ４４Ｃはブダペスト条約の規定に従って、受託番
号ＡＴＣＣ２（１８）１９で、１９８６ｇｆ−８月１８
日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（
ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖ ｉ Ｉ ｌ
ｅ ）、メリーランド州、米国に寄託した。ニス・セレ
ビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＤＣ５はブダペ
スト条約の規定に従って、受託番号ＡＴＣＣ２０６３０
で、１９８２９ｆ−６月２日にアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ）に寄託した
。
Ｂ、 酵母におけるビイ・ファルシパルム・シルカムス
ポロゾイテ（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍＣｉｒｃｕｍ
ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ）蛋白質の合成前記の如く調製
したｐＲＩＴ１２５７０、ｐＲＩＴ１２５６９またはｐ
ＲＩＴ１０１７２いずれかを含有する酵母（サツカロミ
セス°セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ） ）株ＤＣ５または１０３４４Ｃを、
ロイシンを欠く液体培地（ＹＮＢ＋８０μｆ；’ ／ｍ
ｅヒスチジンまたはＹＮＢ）中で別々に増殖させた。Ｃ
８蛋白質に対する５の単クローン抗体の混合物〔ダー〆
ら（’Ｄａｍｅ ｅｔ ａｌ、）、サイエンス（５ｃｉ
ｅｎｃｅ）、２２５．５９３−５９９（１９８４）］を
用い、蛋白質イムノブロッティング法〔バーネット（Ｂ
ｕｒｎｅｔｔｅ）、アナリテイカル・バイオケミストリ
ー（Ａｎａｌ。
ポロゾイテ（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍＣｉｒｃｕｍ
ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ）蛋白質の合成前記の如く調製
したｐＲＩＴ１２５７０、ｐＲＩＴ１２５６９またはｐ
ＲＩＴ１０１７２いずれかを含有する酵母（サツカロミ
セス°セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ） ）株ＤＣ５または１０３４４Ｃを、
ロイシンを欠く液体培地（ＹＮＢ＋８０μｆ；’ ／ｍ
ｅヒスチジンまたはＹＮＢ）中で別々に増殖させた。Ｃ
８蛋白質に対する５の単クローン抗体の混合物〔ダー〆
ら（’Ｄａｍｅ ｅｔ ａｌ、）、サイエンス（５ｃｉ
ｅｎｃｅ）、２２５．５９３−５９９（１９８４）］を
用い、蛋白質イムノブロッティング法〔バーネット（Ｂ
ｕｒｎｅｔｔｅ）、アナリテイカル・バイオケミストリ
ー（Ａｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１１２．１９５〜２０３（１９８
１）；ゲルショニおよびパラデ（Ｇｅｒｓｈｏｎｉ ａ
ｎｄ Ｐａ１ａｄｅ）、アナリテイカル・バイオケミス
トリー（Ａｎａｌ。
１）；ゲルショニおよびパラデ（Ｇｅｒｓｈｏｎｉ ａ
ｎｄ Ｐａ１ａｄｅ）、アナリテイカル・バイオケミス
トリー（Ａｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ）、１３１．１〜１５（１９８３）
；ｌ−ウビンおよびゴルドン（Ｔｏｗｂｉｎ ａｎｄ
Ｇｏｒｄｏｎ ） 、ジャーナル・オブ・イミュノロジ
カル・メソッズ（Ｊ。
；ｌ−ウビンおよびゴルドン（Ｔｏｗｂｉｎ ａｎｄ
Ｇｏｒｄｏｎ ） 、ジャーナル・オブ・イミュノロジ
カル・メソッズ（Ｊ。
Ｉｒｒｍｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ） 、７２．３１
３〜３４０ （１９８４）参照〕によってＣ８蛋白質配
列を同定した。蛋白質のニトロセルロースフィルター上
への電気プロッティング（シュライヘルおよびジュール
（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ ５ｃｈｊｉ口１）、
０．４５ｕ） （）ウビンら（Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａ
ｔ、）、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）、Ｕ、Ｓ、Ａ、 、 ７６．
４３５０〜４３５４（１９７９））の後、該フィルター
をＰＢＳ 中の３％ゼラチンで、３７°にて１時間プ
レインキュベ、−トシた。続いて、フィルターを、各回
０．１％トウイーン（Ｔｗｅｅｎ） ２０ （ポリオキ
シエチレンソルビタンモノラウレート）を含有するＰＢ
Ｓで、５分間、５回洗浄し、ＰＢＳ、１％ ゼラチン中
、Ｃ８蛋白質に対する５の単クローン抗体の混合物〔ダ
ーメら（Ｄａｍｅ ｅｔ ａｌ、）、サイエンス（５ｃ
ｉｅｎｃｅ）、２２５，５９３〜５９９、（１９８４）
］でシートを室温にて１時間処理した。各回ＰＢＳ、ｏ
、ｉ％トウイーン（Ｔｗｅｅｎ） ２０で、フィルター
シートを５分間、５回洗浄し、ＰＢＳ、１％ゼラチン中
の第２のビオチン処理したヒツジ抗−マウス抗体（アメ
ルスハム（Ａｍｅｒｓｈａｍ） ）を室温にて１時間で
添加した。シートをＰＢＳ、０．１％トウイーン（Ｔｗ
ｅｅｎ） ２０ で５分間、５回再洗浄し、ストレプ
トアビジン−ビオチン処理したホースラディツシュ・ペ
ルオキシダーゼ（ＨＲＰ） 複合体（アメルスハム（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ ）と共に室温で３０分間インキュベー
トした。各回ＰＢＳ、０．１％トウイーン（Ｔｗｅｅｎ
） ２０で、シートを５分間、３回再洗浄し、最後にＰ
ＢＳ５０ｒｒｌｅ 中、メタノール１０ｒｎｅ中のＨ２
Ｏ２３０μｌ および４−クロロ−１−ナフトールを含
有するＨＲＰ 色彩現象試薬（バイオラド（ＢｉｏＲａ
ｄ） ） と共にインキュベートした。抗原の分子量
はあらかじめ染色した蛋白質マーカー、卵アルブミン、
アルファーキモトリプシノーゲン、ベーターラクトグロ
ブリン、リゾチウム、チトクロームＣ（ＢＲＬ）から見
積った。
３〜３４０ （１９８４）参照〕によってＣ８蛋白質配
列を同定した。蛋白質のニトロセルロースフィルター上
への電気プロッティング（シュライヘルおよびジュール
（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ ５ｃｈｊｉ口１）、
０．４５ｕ） （）ウビンら（Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａ
ｔ、）、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）、Ｕ、Ｓ、Ａ、 、 ７６．
４３５０〜４３５４（１９７９））の後、該フィルター
をＰＢＳ 中の３％ゼラチンで、３７°にて１時間プ
レインキュベ、−トシた。続いて、フィルターを、各回
０．１％トウイーン（Ｔｗｅｅｎ） ２０ （ポリオキ
シエチレンソルビタンモノラウレート）を含有するＰＢ
Ｓで、５分間、５回洗浄し、ＰＢＳ、１％ ゼラチン中
、Ｃ８蛋白質に対する５の単クローン抗体の混合物〔ダ
ーメら（Ｄａｍｅ ｅｔ ａｌ、）、サイエンス（５ｃ
ｉｅｎｃｅ）、２２５，５９３〜５９９、（１９８４）
］でシートを室温にて１時間処理した。各回ＰＢＳ、ｏ
、ｉ％トウイーン（Ｔｗｅｅｎ） ２０で、フィルター
シートを５分間、５回洗浄し、ＰＢＳ、１％ゼラチン中
の第２のビオチン処理したヒツジ抗−マウス抗体（アメ
ルスハム（Ａｍｅｒｓｈａｍ） ）を室温にて１時間で
添加した。シートをＰＢＳ、０．１％トウイーン（Ｔｗ
ｅｅｎ） ２０ で５分間、５回再洗浄し、ストレプ
トアビジン−ビオチン処理したホースラディツシュ・ペ
ルオキシダーゼ（ＨＲＰ） 複合体（アメルスハム（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ ）と共に室温で３０分間インキュベー
トした。各回ＰＢＳ、０．１％トウイーン（Ｔｗｅｅｎ
） ２０で、シートを５分間、３回再洗浄し、最後にＰ
ＢＳ５０ｒｒｌｅ 中、メタノール１０ｒｎｅ中のＨ２
Ｏ２３０μｌ および４−クロロ−１−ナフトールを含
有するＨＲＰ 色彩現象試薬（バイオラド（ＢｉｏＲａ
ｄ） ） と共にインキュベートした。抗原の分子量
はあらかじめ染色した蛋白質マーカー、卵アルブミン、
アルファーキモトリプシノーゲン、ベーターラクトグロ
ブリン、リゾチウム、チトクロームＣ（ＢＲＬ）から見
積った。
ｐＲＩＴ１２５７０由来蛋白質含有細胞に特異的な免疫
反応は分子量が３００００〜５０ｏｏｏ ダルトンの
範囲の蛋白質種を示した。これは酵母によって発現され
たビイ・ファルシパルム（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ
）Ｃ３ｆｆｉ縁生酸生成物均質であることを示す。この
不均質物質はＤＣ５形質転換細胞よりも１０Ｓ４４′Ｃ
形質転換細胞からの蛋白質のうちにより多く見い出され
た。
反応は分子量が３００００〜５０ｏｏｏ ダルトンの
範囲の蛋白質種を示した。これは酵母によって発現され
たビイ・ファルシパルム（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ
）Ｃ３ｆｆｉ縁生酸生成物均質であることを示す。この
不均質物質はＤＣ５形質転換細胞よりも１０Ｓ４４′Ｃ
形質転換細胞からの蛋白質のうちにより多く見い出され
た。
実施例２
抗体応答−エライヤ法、酵母調製ビイ・ファルシパルム
（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ） ＣＳ蛋白に対する
抗１ｍ清めＣ８反応性、肝細胞遮断 本発明の方法により酵母によって調製したビイ・ファル
シパルム（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＣＳポリペプ
チドは、ここに参照のために挙げる１９８５手２月７日
出願のバロウら（Ｂａ１ｌｏｕ ｅｔ ａｌ、）、米国
特許出願６９９１１６号に概説されている方法によりそ
の免疫原性を評価することができる。
（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ） ＣＳ蛋白に対する
抗１ｍ清めＣ８反応性、肝細胞遮断 本発明の方法により酵母によって調製したビイ・ファル
シパルム（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＣＳポリペプ
チドは、ここに参照のために挙げる１９８５手２月７日
出願のバロウら（Ｂａ１ｌｏｕ ｅｔ ａｌ、）、米国
特許出願６９９１１６号に概説されている方法によりそ
の免疫原性を評価することができる。
実施例３
酵母によって発現されたビイ・ファルシパルム（Ｐ 、
ｆａ ｌｃ ｉｐａｒｕｍ）ＣＳ ’ｉＪｃ白貢を含
有するワクチン 本発明のワクチンの一例を以下の如くに調製する＝３％
水酸化アルミニウムの緩衝水性溶液（１０ｍＭリン酸ナ
トリウム、１５０ｍＭＮａＣｇ、ｐＨ６，８：濾過滅菌
）に、同緩衝液中の酵母由来の本発明のビイ・ファルシ
パルム（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＣＳポリペプチド
を撹拌しながら加えて終濃度をポリペプチド１００μｇ
／ｒｕｇ およびアルミニ９ム（Ａ／”十）０．５１１
！ｇ／ｍｇとする。ｐＨを６．８に維持する。混合物を
約０６にて一晩放置する。チメロサールを加えて終濃度
ｏ、ｏ ｏ ｏ ｓ％とする。ｐＨをチェックし、要す
れば６．８に調整する。
ｆａ ｌｃ ｉｐａｒｕｍ）ＣＳ ’ｉＪｃ白貢を含
有するワクチン 本発明のワクチンの一例を以下の如くに調製する＝３％
水酸化アルミニウムの緩衝水性溶液（１０ｍＭリン酸ナ
トリウム、１５０ｍＭＮａＣｇ、ｐＨ６，８：濾過滅菌
）に、同緩衝液中の酵母由来の本発明のビイ・ファルシ
パルム（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＣＳポリペプチド
を撹拌しながら加えて終濃度をポリペプチド１００μｇ
／ｒｕｇ およびアルミニ９ム（Ａ／”十）０．５１１
！ｇ／ｍｇとする。ｐＨを６．８に維持する。混合物を
約０６にて一晩放置する。チメロサールを加えて終濃度
ｏ、ｏ ｏ ｏ ｓ％とする。ｐＨをチェックし、要す
れば６．８に調整する。
実施例４
ビイ・ファルシパルム（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）Ｃ
Ｓ ｉ白質のテトラペプチドリピート領域の免疫原性蛋
白質を酵母において発現するためのベクターの組立て Ａ、ｐＲＩＴ１２９９０の組立て Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて満たし、再び結ぶ
ことによって、実施例Ａに記載した如くに調製しか−）
ｐＵｃ９ポリリンカーのＢａｍＨＩ−８ｍａ／Ｉ−Ｅｃ
ｏＲＩ 部分と共にＨｉｎｄｕ−ＢａｍＨＩ ＴＤＨ３
プロモーターフラグメントを含有するｐＲＩＴ１０１６
７（第１図、）からの１０５０ｂｐ Ｈｉｎｄｌ［−Ｅ
ｃｏＲＩフラグメントを、ＢａｍＨＩ 部位であらかじ
め欠失したｐＢＲ３２２誘導体プラスミドのＨｉ ｎｄ
ＤＩ およびＥＣｏＲＩ部位間に再クローンした。得
られた組換体プラスミドをｐＲＩＴ１２１７６ と同
定された。
Ｓ ｉ白質のテトラペプチドリピート領域の免疫原性蛋
白質を酵母において発現するためのベクターの組立て Ａ、ｐＲＩＴ１２９９０の組立て Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて満たし、再び結ぶ
ことによって、実施例Ａに記載した如くに調製しか−）
ｐＵｃ９ポリリンカーのＢａｍＨＩ−８ｍａ／Ｉ−Ｅｃ
ｏＲＩ 部分と共にＨｉｎｄｕ−ＢａｍＨＩ ＴＤＨ３
プロモーターフラグメントを含有するｐＲＩＴ１０１６
７（第１図、）からの１０５０ｂｐ Ｈｉｎｄｌ［−Ｅ
ｃｏＲＩフラグメントを、ＢａｍＨＩ 部位であらかじ
め欠失したｐＢＲ３２２誘導体プラスミドのＨｉ ｎｄ
ＤＩ およびＥＣｏＲＩ部位間に再クローンした。得
られた組換体プラスミドをｐＲＩＴ１２１７６ と同
定された。
実施例５、後掲、に記載した如くに調製したｐＲＩＴ１
０１５８（第１図）のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩエ
ンドスクレアーゼで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで
処理してＥｃｏＲＩ一本鎖伸長を満たした。この調製物
をＣａｔＩエンドスクレアーゼでさらに消化した。ｐＲ
ＩＴ１０１５８ ＤＮＡのさらなる試料％ＣＩ！ａＩお
よびＨａｅｍエンドヌクレアーゼで消化し、ＡＲＧ３遺
伝子の転写終止領域を有する１ １５０ ｂｐ ＣＪａ
Ｉ −Ｈａｅ ＩＩＩフラグメントを調製アガロース
ゲル電気泳動および電気溶出によって回収した。このフ
ラグメントをＥｃｏＲＩ 、 Ｔ４ ＤＮＡポリメラー
ゼ、Ｃ１ａＩ処理ｐＲＩＴ１０１５８ ＤＮＡで結び、
結んだ混合物を用いてコーヘンら（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ
ａｌ。
０１５８（第１図）のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩエ
ンドスクレアーゼで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで
処理してＥｃｏＲＩ一本鎖伸長を満たした。この調製物
をＣａｔＩエンドスクレアーゼでさらに消化した。ｐＲ
ＩＴ１０１５８ ＤＮＡのさらなる試料％ＣＩ！ａＩお
よびＨａｅｍエンドヌクレアーゼで消化し、ＡＲＧ３遺
伝子の転写終止領域を有する１ １５０ ｂｐ ＣＪａ
Ｉ −Ｈａｅ ＩＩＩフラグメントを調製アガロース
ゲル電気泳動および電気溶出によって回収した。このフ
ラグメントをＥｃｏＲＩ 、 Ｔ４ ＤＮＡポリメラー
ゼ、Ｃ１ａＩ処理ｐＲＩＴ１０１５８ ＤＮＡで結び、
結んだ混合物を用いてコーヘンら（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ
ａｌ。
）、前掲、によって記載されている如くに調製したイー
・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＭＭ２９４のコンピテント細
胞を形質転換してアンピシリン耐性とした。
・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＭＭ２９４のコンピテント細
胞を形質転換してアンピシリン耐性とした。
形質転換コロニーからＣ／ａ Ｉ −Ｈａｅｌｌｌ Ａ
ＲＧ３転写終とフラグメントがＣ１ａｌおよび満たされ
たＥｃｏＲＩＩエンドスクレアーゼで消化し、（やはり
ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩエンドヌクレアーゼで消化し
た）前記の如（に調製したｐＲＩＴ１２１７６のプラス
ミドＤＮＡと混合し、混合物を結び、これを用いてコー
ヘンら（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｔ、）、前掲、の方法に
よりイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ＭＭ２９４の
細胞を形質転換してアンピシリン耐性とした。ＰＲＩＴ
１２１７６からの大きな４６３０ｂｐ ＥｃｏＲＩ Ｐ
ｓｔＩフラグメントがｐＲＩＴ１０１６２からの小さな
１９３０ｂｐＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ フラグメントに
結ばれ、かつＡＲＧ３転写終止領域が今やＴＤＨ３プロ
モーターに並置されるこの形質転換からのコロニーから
プラスミドｐＲＩ７１２２（１８）を回収した。ＡＲＧ
３およびＴＤＨ３ＤＮＡ領域はＨｉｎｄ ｍエンドヌク
レアーゼでの消化により単一の２２００ｂｐフラグメン
トとしてｐＲＩＴ１２２（１８）から切り出すことがで
きる。ベクター配列に関してこのフラグメントの他の配
位ヲ得るために、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによって満た
し、再び結ぶ之゛とによって、ｐＲＩＴ１２２（１８）
からの２２００ｂｐ Ｈｉｎｄｌ［フラグメントを再ク
ローンして天然ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位が別々
に欠失されてしまっているｐＢＲ３２２誘導本プラスミ
ドのＨｉｎｄｌ［Ｉ部位に入れた。ｐＲＩＴ１２２（１
８）に比してベクター配列に関して反対の配位で挿入さ
れた２２００ｂｐ Ｈｉｎｄｌ［［フラグメントを有す
る得られたプラスミドはｐＲＩＴ１２２９０ と同定さ
れる。
ＲＧ３転写終とフラグメントがＣ１ａｌおよび満たされ
たＥｃｏＲＩＩエンドスクレアーゼで消化し、（やはり
ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩエンドヌクレアーゼで消化し
た）前記の如（に調製したｐＲＩＴ１２１７６のプラス
ミドＤＮＡと混合し、混合物を結び、これを用いてコー
ヘンら（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｔ、）、前掲、の方法に
よりイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ＭＭ２９４の
細胞を形質転換してアンピシリン耐性とした。ＰＲＩＴ
１２１７６からの大きな４６３０ｂｐ ＥｃｏＲＩ Ｐ
ｓｔＩフラグメントがｐＲＩＴ１０１６２からの小さな
１９３０ｂｐＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ フラグメントに
結ばれ、かつＡＲＧ３転写終止領域が今やＴＤＨ３プロ
モーターに並置されるこの形質転換からのコロニーから
プラスミドｐＲＩ７１２２（１８）を回収した。ＡＲＧ
３およびＴＤＨ３ＤＮＡ領域はＨｉｎｄ ｍエンドヌク
レアーゼでの消化により単一の２２００ｂｐフラグメン
トとしてｐＲＩＴ１２２（１８）から切り出すことがで
きる。ベクター配列に関してこのフラグメントの他の配
位ヲ得るために、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによって満た
し、再び結ぶ之゛とによって、ｐＲＩＴ１２２（１８）
からの２２００ｂｐ Ｈｉｎｄｌ［フラグメントを再ク
ローンして天然ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位が別々
に欠失されてしまっているｐＢＲ３２２誘導本プラスミ
ドのＨｉｎｄｌ［Ｉ部位に入れた。ｐＲＩＴ１２２（１
８）に比してベクター配列に関して反対の配位で挿入さ
れた２２００ｂｐ Ｈｉｎｄｌ［［フラグメントを有す
る得られたプラスミドはｐＲＩＴ１２２９０ と同定さ
れる。
第３図はｐ″ＲＩＴ１２２９０の制限エンドヌクレアー
ゼ切断地図である。ｐＲＩＴ］２２（１８）およびｐＲ
ＩＴ１２２９０の両ベクターにおいて、コーディング配
列を有するＤＮＡフラグメントのクローニングに有用な
ユニークＢａｍＨ１，ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩ制限部
位によってＴＤＨ３プロモーターおよびＡＲＧ３転写終
止フラグメントは分離され、プロモーターおよび転写終
止領域は他のベクターへの移入用モジュールまたはカセ
ットとして一緒に２２００ｂｐＨｉｎｄ Ｍ フラグメ
ント上に切り出すことができる。
ゼ切断地図である。ｐＲＩＴ］２２（１８）およびｐＲ
ＩＴ１２２９０の両ベクターにおいて、コーディング配
列を有するＤＮＡフラグメントのクローニングに有用な
ユニークＢａｍＨ１，ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩ制限部
位によってＴＤＨ３プロモーターおよびＡＲＧ３転写終
止フラグメントは分離され、プロモーターおよび転写終
止領域は他のベクターへの移入用モジュールまたはカセ
ットとして一緒に２２００ｂｐＨｉｎｄ Ｍ フラグメ
ント上に切り出すことができる。
ＢａｍＨＩ部位はＴＤＨ３遺伝子のＡＴＧコドンに位置
しているので特に有用であり、それは以下に例示する如
（酵母において他の遺伝子を発現する観点より、他の遺
伝子のＴＤＨ３プロモーターへの融合に用いることがで
きる。Ｈｉｎｄ ｍエンドヌクレアーゼでの消化により
、またはフランキング制限部位にて切断を行う他の制限
エンドヌクレアーゼの使用により、かかる融合体を、酵
母シャトルベクター上への挿入用のカセットまたはモジ
ュールの形態でｐＲＩＴ１２２（１８） もしくはｐＲ
ＩＴＩ２２９０誘導体から回収することができる。
しているので特に有用であり、それは以下に例示する如
（酵母において他の遺伝子を発現する観点より、他の遺
伝子のＴＤＨ３プロモーターへの融合に用いることがで
きる。Ｈｉｎｄ ｍエンドヌクレアーゼでの消化により
、またはフランキング制限部位にて切断を行う他の制限
エンドヌクレアーゼの使用により、かかる融合体を、酵
母シャトルベクター上への挿入用のカセットまたはモジ
ュールの形態でｐＲＩＴ１２２（１８） もしくはｐＲ
ＩＴＩ２２９０誘導体から回収することができる。
Ｂ、ビイ、７７／Ｌｚシパルム（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒ
ｕｍ） ＣＳ蛋白質テトラペプチドリピート領域の一部
の導入用合成リンカ−を含有するプラスミドの組立て 前記パートＡに記載した如（に調製したプラスミドｐＲ
ＩＴ１２２９０をＢａｍＨＩ およびＥｃｏＲＩエン
ドスクレアーゼで消化し、以下の構造を有する合成りＮ
Ａフラグメントと混合する。
ｕｍ） ＣＳ蛋白質テトラペプチドリピート領域の一部
の導入用合成リンカ−を含有するプラスミドの組立て 前記パートＡに記載した如（に調製したプラスミドｐＲ
ＩＴ１２２９０をＢａｍＨＩ およびＥｃｏＲＩエン
ドスクレアーゼで消化し、以下の構造を有する合成りＮ
Ａフラグメントと混合する。
５’ ＧＡＴＣＣＴＴＡＡＧ ３’ＧＡＡＴＴ
ＣＴＴＡＡ フラグメント混合物をアニールシ、Ｔ ４ ＤＮＡリガ
ーゼで結び、常法に従ってこれを用いてイー・コリ（Ｅ
、ｃｏｌ ｉ）株ＭＭ２９４のコンピテント細胞を形質
転換してアンピシリン耐性とする。単一コロニーから調
製したプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＢ ａ ｍＨＩエ
ンドヌクレアーゼ制限部位の存在について、ならびにも
とのｐＲＩＴ１２２９０ベクター上に存在するが所望の
組換体上には存在しないＳｍａ １１部位の非存在につ
いて調べる。選択したプラスミドの正しさはＤＮＡ配列
決定によって証明できる。合成りＮＡフラグメントの挿
入はＴＤＨ３ＡＴＧコドンによるＢａｍＨ１部位を再生
し、ＡＴＧコドンと同相の停止コドン（ＴＡＡ）を提供
する。
ＣＴＴＡＡ フラグメント混合物をアニールシ、Ｔ ４ ＤＮＡリガ
ーゼで結び、常法に従ってこれを用いてイー・コリ（Ｅ
、ｃｏｌ ｉ）株ＭＭ２９４のコンピテント細胞を形質
転換してアンピシリン耐性とする。単一コロニーから調
製したプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＢ ａ ｍＨＩエ
ンドヌクレアーゼ制限部位の存在について、ならびにも
とのｐＲＩＴ１２２９０ベクター上に存在するが所望の
組換体上には存在しないＳｍａ １１部位の非存在につ
いて調べる。選択したプラスミドの正しさはＤＮＡ配列
決定によって証明できる。合成りＮＡフラグメントの挿
入はＴＤＨ３ＡＴＧコドンによるＢａｍＨ１部位を再生
し、ＡＴＧコドンと同相の停止コドン（ＴＡＡ）を提供
する。
カカるプラスミドを生成させる目的は、ビイ・ファルシ
パルム（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＣＳ蛋白質テトラ
ペプチドリピート領域の１９２塩基対の部分のＴＤＨ３
プロモーター領域への融合に適したベクターを生成し、
およびかかるコーディング領域に対しすぐに３′側の停
止コドンを提供することにある。
パルム（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＣＳ蛋白質テトラ
ペプチドリピート領域の１９２塩基対の部分のＴＤＨ３
プロモーター領域への融合に適したベクターを生成し、
およびかかるコーディング領域に対しすぐに３′側の停
止コドンを提供することにある。
Ｃ，ビイ・ファルシパルム（Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ） Ｃ３蛋白質テトラペプチドリピート領域の１９２
塩基対部分を含有するプラスミドの組立て、 実施例
１に記載した如くに精製し、かっＣ８蛋白質コーディン
グ配列から最初の５２ｂｐを除いたものを含有するプラ
スミドＷＲ２０１の１２１５ｂｐＳｔｕｌ−ＲｓａＩフ
ラグメントをＳａｕ３Ａで消化して、とりわけＣ５ｉ白
質の１６のテトラペプチドリピートについてコード付け
する１９２ｂｐ Ｓａｕ３Ａフラグメントを包含するよ
り小さいフラグメントを得る。ＡＴＧ開始コドンに位置
する前記パ−トＢの修飾ｐＲＩＴ１２２９０ベクターの
Ｂ ａ ｍ−ＨＩ部位はビイ・ファルシパルム（Ｐ、ｆ
ａｌｃｉｐａｒｕｍ）のＣ８蛋白質のくり返しエピトー
プのＳａｕ３Ａ部位と同相である。
ｍ） Ｃ３蛋白質テトラペプチドリピート領域の１９２
塩基対部分を含有するプラスミドの組立て、 実施例
１に記載した如くに精製し、かっＣ８蛋白質コーディン
グ配列から最初の５２ｂｐを除いたものを含有するプラ
スミドＷＲ２０１の１２１５ｂｐＳｔｕｌ−ＲｓａＩフ
ラグメントをＳａｕ３Ａで消化して、とりわけＣ５ｉ白
質の１６のテトラペプチドリピートについてコード付け
する１９２ｂｐ Ｓａｕ３Ａフラグメントを包含するよ
り小さいフラグメントを得る。ＡＴＧ開始コドンに位置
する前記パ−トＢの修飾ｐＲＩＴ１２２９０ベクターの
Ｂ ａ ｍ−ＨＩ部位はビイ・ファルシパルム（Ｐ、ｆ
ａｌｃｉｐａｒｕｍ）のＣ８蛋白質のくり返しエピトー
プのＳａｕ３Ａ部位と同相である。
このプラスミドのＤＮＡをＢａｍＨＩエンドヌクレアー
ゼで消化し、フェノールで抽出し、エタノール沈殿によ
って回収する。このＤＮＡ ０．２μｇを前記した如く
に調製したＳｔｕ Ｉ −Ｒｓａ ＩフラグメントのＳ
ａｕ３Ａ消化体の約０．１ ＝０．２ μｇと混合し、
Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼで処理じ、結んだ混合物を用いて
、常法に従い、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＭＭ２９
４ のコンピテント細胞を形質転換してアンピシリン耐
性とする。個々の形質転換体からのプラスミドを調製し
、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ エンドヌクレアーゼで
の二重消化の後、７．５％アクリルアミドゲル上で分析
し、親ベクター、５ｔｕｌ−ＲｓａＩＣ３遺伝子フラグ
メントのＳａｕ ３Ａ消化体、および適当な分子量のマ
ーカー、例えばφ×１７４ＤＮＡ のＨａｅ ｍ消化体
と比較する。
ゼで消化し、フェノールで抽出し、エタノール沈殿によ
って回収する。このＤＮＡ ０．２μｇを前記した如く
に調製したＳｔｕ Ｉ −Ｒｓａ ＩフラグメントのＳ
ａｕ３Ａ消化体の約０．１ ＝０．２ μｇと混合し、
Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼで処理じ、結んだ混合物を用いて
、常法に従い、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＭＭ２９
４ のコンピテント細胞を形質転換してアンピシリン耐
性とする。個々の形質転換体からのプラスミドを調製し
、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ エンドヌクレアーゼで
の二重消化の後、７．５％アクリルアミドゲル上で分析
し、親ベクター、５ｔｕｌ−ＲｓａＩＣ３遺伝子フラグ
メントのＳａｕ ３Ａ消化体、および適当な分子量のマ
ーカー、例えばφ×１７４ＤＮＡ のＨａｅ ｍ消化体
と比較する。
２００ｂｐのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩは、ＣＳコーディ
ング配列のＡＴＧ 開始コドンへの歯合について所望の
配位である１９２ｂｐ Ｓａｕ３Ａフラグメントの挿入
に対応する。所望の配位である１９２ｂｐＳａｕ３Ａフ
ラグメントの挿入は、ＡＴＧコドンにおいてＢａｍＨＩ
部位を再生する。
ング配列のＡＴＧ 開始コドンへの歯合について所望の
配位である１９２ｂｐ Ｓａｕ３Ａフラグメントの挿入
に対応する。所望の配位である１９２ｂｐＳａｕ３Ａフ
ラグメントの挿入は、ＡＴＧコドンにおいてＢａｍＨＩ
部位を再生する。
加えて、かかるプラスミドのＳａｕ３Ａでの消化は、Ｃ
８蛋白質くり返しエピトープを含有する５ｔｕＩ−Ｒｓ
ａＩフラグメントの消化から得られるものと同一のサイ
ズの１９２ｂｐフラグメントヲ生成する。この組立体は
、ＴＤＨ３プロモーター境界におけるＡＴＧ コドン
からＣ８くり返しエピトープインサートを通って伸び、
Ｓａｕ３Ａ部位のすぐ僧り の３′側であってＥｃｏＲＩ部位のすぐの５′の導入さ
八 れた合成りＮＡフラグメント中のＴＡＡコドンで終止す
る６７個のアミノ酸のオープンリーディングフレームを
含有するであろう。組立ての正しさはＤＮＡ配列決定法
によって証明でき、プラスミドのＨｉｎｄＩＩエンドス
クレアーゼでの消化は、ＴＤＨ３プロモーター、Ｃ８く
り返しエピトープおよびＡＲＧ３終止領域よりなる２３
９０ｂｐのＨｉｎｄ ＩＩフラグメントを生成するであ
ろう。このＨｉｎｄｌｕフラグメントはいずれの適当な
酵母ベクター、例えばＹＥｐｌＢ上にも再クローンでき
、常法に従って酵母に導入できる。
８蛋白質くり返しエピトープを含有する５ｔｕＩ−Ｒｓ
ａＩフラグメントの消化から得られるものと同一のサイ
ズの１９２ｂｐフラグメントヲ生成する。この組立体は
、ＴＤＨ３プロモーター境界におけるＡＴＧ コドン
からＣ８くり返しエピトープインサートを通って伸び、
Ｓａｕ３Ａ部位のすぐ僧り の３′側であってＥｃｏＲＩ部位のすぐの５′の導入さ
八 れた合成りＮＡフラグメント中のＴＡＡコドンで終止す
る６７個のアミノ酸のオープンリーディングフレームを
含有するであろう。組立ての正しさはＤＮＡ配列決定法
によって証明でき、プラスミドのＨｉｎｄＩＩエンドス
クレアーゼでの消化は、ＴＤＨ３プロモーター、Ｃ８く
り返しエピトープおよびＡＲＧ３終止領域よりなる２３
９０ｂｐのＨｉｎｄ ＩＩフラグメントを生成するであ
ろう。このＨｉｎｄｌｕフラグメントはいずれの適当な
酵母ベクター、例えばＹＥｐｌＢ上にも再クローンでき
、常法に従って酵母に導入できる。
また、該プラスミドをＢ ａ ｍＨＩエンドヌクレアー
ゼで消化し、混合し、５ｔｕＩ−ＲｓａＩＣ３＜り返し
エピトープフラグメントのＳａｕ３Ａ消化体と再び結ん
で、最初のコピーと同相であるエピトープのタンデムコ
ピーを導入することができ、もしインサートの配位が正
しいならばＡＴＧコドンにおいてＢａｍＨＩ部位を再生
するであろう。この操作を（り返して２個、３個、４個
等のタンデムコピーよりなる１９２ｂｐエピトープフラ
グメントの一連のリピートを組み立てることができる。
ゼで消化し、混合し、５ｔｕＩ−ＲｓａＩＣ３＜り返し
エピトープフラグメントのＳａｕ３Ａ消化体と再び結ん
で、最初のコピーと同相であるエピトープのタンデムコ
ピーを導入することができ、もしインサートの配位が正
しいならばＡＴＧコドンにおいてＢａｍＨＩ部位を再生
するであろう。この操作を（り返して２個、３個、４個
等のタンデムコピーよりなる１９２ｂｐエピトープフラ
グメントの一連のリピートを組み立てることができる。
この方法はオープンリーディングフレームの長さを増大
し、その結果、１３１．１９５および２５９個のアミノ
酸よりなる漸時長くなる蛋白質となる。
し、その結果、１３１．１９５および２５９個のアミノ
酸よりなる漸時長くなる蛋白質となる。
これらの組立体のＨｉｎｄＩＩ［エンドヌクレアーゼで
の消化は、実施例１に記載した如き公知方法による形質
転換および酵母への導入用に適した酵母ベクター上に再
クローンできる発現カセットを含有する漸時より長くな
るフラグメントを生じるであろう。
の消化は、実施例１に記載した如き公知方法による形質
転換および酵母への導入用に適した酵母ベクター上に再
クローンできる発現カセットを含有する漸時より長くな
るフラグメントを生じるであろう。
実施例５
プラスミドｐＲＩＴ１０１５８の組立てＴ４ ＤＮＡポ
リメラーゼで満たし、再び結ぶことによって、クラビー
ル・エムら（Ｃｒａｂｅｅｌ Ｍ、 ｅｔａｌ、） ；
ニアローピーアン・モレキュラー・バイオロジー・
オーガナイゼーション・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、）、
２，２０５〜２１２（１９８３）によって記載されてい
る（受託番号ＡＴＣＣ３９１３１下、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ）、
ｏ ツクビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州
、米国、から制限なしに入手可能な）プラスミドｐＭｃ
２００からの３３００ｂｐ ＨｉｎｄＩｒ［フラグメン
トを天然ＥｃｏＲＩ部位が欠失されてしまっているｐＢ
Ｒ３２２誘導体プラ誘導体プラスミド−ンした。Ｈｉｎ
ｄ［［ＡＲＧ３遺伝子インサートが修飾ｐＢＲ３２２ベ
クター上のＣｌａＩ部位に接するＡＲＧ３遺伝子の３′
鎮域を有する得られた組換体プラスミド、ｐＲＩＴ１０
１５８（第１図）を選択した。第５図はｐＭｃ２００
の制限エンドヌクレアーゼ切断地図である。
リメラーゼで満たし、再び結ぶことによって、クラビー
ル・エムら（Ｃｒａｂｅｅｌ Ｍ、 ｅｔａｌ、） ；
ニアローピーアン・モレキュラー・バイオロジー・
オーガナイゼーション・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、）、
２，２０５〜２１２（１９８３）によって記載されてい
る（受託番号ＡＴＣＣ３９１３１下、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ）、
ｏ ツクビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州
、米国、から制限なしに入手可能な）プラスミドｐＭｃ
２００からの３３００ｂｐ ＨｉｎｄＩｒ［フラグメン
トを天然ＥｃｏＲＩ部位が欠失されてしまっているｐＢ
Ｒ３２２誘導体プラ誘導体プラスミド−ンした。Ｈｉｎ
ｄ［［ＡＲＧ３遺伝子インサートが修飾ｐＢＲ３２２ベ
クター上のＣｌａＩ部位に接するＡＲＧ３遺伝子の３′
鎮域を有する得られた組換体プラスミド、ｐＲＩＴ１０
１５８（第１図）を選択した。第５図はｐＭｃ２００
の制限エンドヌクレアーゼ切断地図である。
以上、本発明の好ましい具体例について説明したが、本
発明の精神を逸脱することなく、種々の変形および１ぎ
飾を加えることができることは当業者に明らかであり、
それらも本発明範囲のものである。
発明の精神を逸脱することなく、種々の変形および１ぎ
飾を加えることができることは当業者に明らかであり、
それらも本発明範囲のものである。
第１図は、ｐＲＩＴ１０１６２の作製を示したフローシ
ートである。 第２図は、プラスミドｐＲＩＴ１０１７２ 、ｐＲＩＴ
１２５７０およびｐＲＩＴ１２５６９の制限エンドヌク
レアーゼ地図である。 第３図は、ｐＲＩＴ１２２９０の制限エンドヌクレアー
ゼ地図である。 第４図は、ｐＲＩＴ１２５７０の作製を示したフロ。 −シートである。 第５図は、ｐＭｃ２００ の制限エンドヌクレアーゼ地
図である。 第１Ａ図は、クローンλｍｐｆｌの塩基配列決定法を示
した概略制限地図である。 第２Ａ図は、ピー・ファルシパルムかラノＣＳタンパク
質遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
ートである。 第２図は、プラスミドｐＲＩＴ１０１７２ 、ｐＲＩＴ
１２５７０およびｐＲＩＴ１２５６９の制限エンドヌク
レアーゼ地図である。 第３図は、ｐＲＩＴ１２２９０の制限エンドヌクレアー
ゼ地図である。 第４図は、ｐＲＩＴ１２５７０の作製を示したフロ。 −シートである。 第５図は、ｐＭｃ２００ の制限エンドヌクレアーゼ地
図である。 第１Ａ図は、クローンλｍｐｆｌの塩基配列決定法を示
した概略制限地図である。 第２Ａ図は、ピー・ファルシパルムかラノＣＳタンパク
質遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
Claims (41)
- （１）発現調節配列に機能的に結合したＤＮＡ配列から
なり、該ＤＮＡ配列がプラスモジウム・ファルシパルム
（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のサ
ーカムスポロゾイトタンパク質のコーディング配列を含
有することを特徴とする組換え体ＤＮＡベクター。 - （２）さらに酵母において機能的であるレプリコンから
なる前記第（１）項のベクター。 - （３）該発現調節配列が酵母グリセルアルデヒド−３Ｐ
−デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）プロモーターからなる
前記第（１）項のベクター。 - （４）該発現調節配列が、さらに、ＡＲＧ３転写終止領
域からなる前記第（３）項のベクター。 - （５）ほぼその最初の５０ｂｐを除いたピー・ファルシ
パルムＣＳタンパク質コーディング配列を含有するＷＲ
２０１の１２１５ｂｐ ＳｔｕＩ−ＲｓａＩフラグメン
トからなる前記第（４）項のベクター。 - （６）ｐＲＩＴ１２５７０である前記第（５）項のベク
ター。 - （７）ほぼその最初の５０ｂｐを除いたピー・ファルシ
パルムＣＳタンパク質コーディング配列を含有するＷＲ
２０１の１２１５ｂｐ ＳｔｕＩ−ＲｓａＩフラグメン
トのＳａｕ３Ａ消化に由来するピー・ファルシパルムＣ
Ｓタンパク質の１６テトラペプチドリピートをコードす
る１９２ｂｐ Ｓａｕ ３Ａフラグメントまたはそのよ
うな１９２ｂｐ Ｓａｕ ３Ａフラグメントの２、３、
４またはそれ以上のタンデムコピーからなる前記第（４
）項のベクター。 - （８）組換え体ＤＮＡベクターにて形質転換した酵母宿
主細胞であつて、該ベクターが発現調節配列に機能的に
結合したＤＮＡ配列からなり、該ＤＮＡ配列がプラスモ
ジウム・ファルシパルムのサーカムスポロゾイトタンパ
ク質のコーディング配列を含有することを特徴とする酵
母宿主細胞。 - （９）該ベクターが、さらに、酵母にて機能的であるレ
プリコンからなる前記第（８）項の宿主。 - （１０）該発現調節配列が酵母グリセルアルデヒド−３
Ｐ−デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）プロモーターからな
る前記第（８）項の宿主。 - （１１）該発現調節配列が、さらに、ＡＲＧ３転写終止
領域からなる前記第（１０）項の宿主。 - （１２）該ベクターが、ほぼその最初の５０ｂｐを除く
ピー・ファルシパルムＣＳタンパク質コーディング配列
を含有するＷＲ２０１の１２１５ｂｐ ＳｔｕＩ−Ｒｓ
ａＩフラグメントからなる前記第（１１）項の宿主。 - （１３）該ベクターがｐＲＩＴ１２５７０である前記第
（１２）項の宿主。 - （１４）該ベクターが、ほぼその最初の５０ｂｐを除い
たピー・ファルシパルムＣＳタンパク質コーディング配
列を含有するＷＲ２０１の１２１５ｂｐ ＳｔｕＩ−Ｒ
ｓａＩフラグメントのＳａｕ ３Ａ消化に由来するピー
・ファルシパルムＣＳタンパク質の１６テトラペプチド
リピートをコードする１９２ｂｐ Ｓａｕ ３Ａフラグ
メントまたはそのような１９２ｂｐ Ｓａｕ ３Ａフラ
グメントの２、３、４またはそれ以上のタンデムコピー
からなる前記第（１１）項の宿主。 - （１５）サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
）属に属する前記第（８）項の宿主。 - （１６）エス・セレビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）種に属する前記第（１５）項の宿主。 - （１７）エス・セレビシア株ＤＣ５または１０Ｓ４４Ｃ
である前記第（１６）項の宿主。 - （１８）組換え体ＤＮＡベクターにて形質転換した酵母
宿主細胞であつて、該ベクターが発現調節配列に機能的
に結合したＤＮＡ配列からなり、該ＤＮＡ配列がプラス
モジウム・ファルシパルムのサーカムスポロゾイトタン
パク質のコーディング配列を含有することを特徴とする
酵母宿主細胞の調製法。 - （１９）該ベクターが、さらに、酵母にて機能的である
レプリコンからなる前記第（１８）項の調製法。 - （２０）該発現調節配列が酵母グリセルアルデヒド−３
Ｐ−デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）プロモーターからな
る前記第（１８）項の調製法。 - （２１）該発現調節配列が、さらに、ＡＲＧ３転写終止
領域からなる前記第（２０）項の調製法。 - （２２）該ベクターが、ほぼその最初の５０ｂｐを除く
ピー・ファルシパルムＣＳタンパク質コーディング配列
を含有するＷＲ２０１の１２１５ｂｐ ＳｔｕＩ−Ｒｓ
ａＩフラグメントからなる前記第（２１）項の調製法。 - （２３）該ベクターがｐＲＩＴ１２５７０である前記第
（２２）項の調製法。 - （２４）該ベクターが、ほぼその最初の５０ｂｐを除い
たピー・ファルシパルムＣＳタンパク質コーディング配
列を含有するＷＲ２０１の１２１５ｂｐ ＳｔｕＩ−Ｒ
ｓａＩフラグメントのＳａｕ ３Ａ消化に由来するピー
・ファルシパルムＣＳタンパク質の１６テトラペプチド
リピートをコードする１９２ｂｐ Ｓａｕ ３Ａフラグ
メントまたはそのような１９２ｂｐ Ｓａｕ ３Ａフラ
グメントの２、３、４またはそれ以上のタンデムコピー
からなる前記第（２１）項の調製法。 - （２５）該宿主がサッカロミセス属に属する前記第（１
８）項の調製法。 - （２６）該宿主がエス・セレビシア種に属する前記第（
２５）項の調製法。 - （２７）該宿主がエス・セレビシア株ＤＣ５または１０
Ｓ４４Ｃである前記第（２６）項の調製法。 - （２８）組換え体ＤＮＡベクターにて形質転換した酵母
宿主細胞を適当な培地中で培養し、かつ、そのような宿
主の培養溶解物からそのようなタンパク質を単離するこ
とからなり、該ベクターが発現調節配列に機能的に結合
したＤＮＡ配列からなり、該ＤＮＡ配列がプラスモジウ
ム・ファルシパルムのサーカムスポロゾイトタンパク質
のコーディング配列を含有することを特徴とするプラス
モジウム・ファルシパルムのサーカムスポロゾイトタン
パク質の調製法。 - （２９）該ベクターが、さらに、酵母にて機能的である
レプリコンからなる前記第（２８）項の調製法。 - （３０）該発現調節配列が酵母グリセルアルデヒド−３
Ｐ−デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）プロモーターからな
る前記第（２８）項の調製法。 - （３１）該発現調節配列が、さらに、ＡＲＧ３転写終止
領域からなる前記第（３０）項の調製法。 - （３２）該ベクターが、ほぼその最初の５０ｂｐを除く
ピー・ファルシパルムＣＳタンパク質コーディング配列
を含有するＷＲ２０１の１２１５ｂｐ ＳｔｕＩ−Ｒｓ
ａＩフラグメントからなる前記第（３１）項の調製法。 - （３３）該ベクターがｐＲＩＴ１２５７０である前記第
（３２）項の調製法。 - （３４）該ベクターが、ほぼその最初の５０ｂｐを除い
たピー・ファルシパルムＣＳタンパク質コーディング配
列を含有するＷＲ２０１の１２１５ｂｐ ＳｔｕＩ−Ｒ
ｓａＩフラグメントのＳａｕ ３Ａ消化に由来するピー
・ファルシパルムＣＳタンパク質の１６テトラペプチド
リピートをコードする１９２ｂｐ Ｓａｕ ３Ａフラグ
メントまたはそのような１９２ｂｐ Ｓａｕ ３Ａフラ
グメントの２、３、４またはそれ以上のタンデムコピー
からなる前記第（３１）項の調製法。 - （３５）該宿主がサッカロミセス属に属する前記第（２
８）項の調製法。 - （３６）該宿主がエス・セレビシア種に属する前記第（
３５）項の調製法。 - （３７）該宿主がエス・セレビシア株ＤＣ５または１０
Ｓ４４Ｃである前記第（３６）項の調製法。 - （３８）前記第（２６）、（２７）、（２８）、（２９
）、（３０）、（３１）、（３２）または（３３）項の
調製法により調製したタンパク質。 - （３９）免疫保護量の前記第（３８）項のタンパク質か
らなることを特徴とするワクチン。 - （４０）１〜１０００μｇの該タンパク質からなる前記
第（３９）項のワクチン。 - （４１）１０〜２００μｇの該タンパク質からなる前記
第（４０）項のワクチン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BE008791 | 1987-01-30 | ||
| BE8708791 | 1987-01-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63283586A true JPS63283586A (ja) | 1988-11-21 |
Family
ID=3883049
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63021138A Pending JPS63283586A (ja) | 1987-01-30 | 1988-01-29 | 酵母によるピー・ファルシパルム・サーカムスポロゾイトタンパク質の発現 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63283586A (ja) |
-
1988
- 1988-01-29 JP JP63021138A patent/JPS63283586A/ja active Pending
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