JP2702899B2 - 肝炎ｂ型ウイルスワクチン - Google Patents
肝炎ｂ型ウイルスワクチンInfo
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は組換型ＤＮＡ技法を
用いることによる酵母におけるＢ型肝炎表面抗原をコー
ドする遺伝子のクローニングおよび該酵母が産生する抗
原からの肝炎Ｂ型ウイルスワクチンの製造に関する。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】肝炎
Ｂ型ウイルス(ＨＢＶ)による感染症は重く、広範囲にわ
たる健康上の問題である。感染症は急性または慢性の様
相で発現する。米国における急性肝炎の症例数は少なく
とも１年につき１０万件であり、致死率が１〜２％と見
積られている。米国においては、健常成人中の慢性保菌
者の蔓延率は年令、社会的階級により、０.１〜１％の
間で変化している。南アメリカでは、慢性保菌者の蔓延
率は約１〜３％、ソ連および南ヨーロッパでは、約３〜
６％、アジアおよびアフリカでは１０％以上である。発
達した国々では、血液を取扱う医療部署の患者および要
員、軍要員、慢性保菌者の配偶者、高ＨＢＶ風土地域へ
の旅行者、慢性保菌者の新生児、ホモセックスの人、売
春婦および麻薬常用者のようなウイルス接触の高い危険
性のある人々のためのワクチンの要求が存在する。第三
世界の国々においては大衆免疫付与のための安価なワク
チンの要求が存在する。大衆免疫付与計画は急性肝炎の
発生や慢性保菌者が留ることに究極的に影響するばかり
でなく、慢性活性肝炎および肝細胞癌の罹病率および死
亡率も減少させることができる。 【０００３】肝炎Ｂ型のビリオンであると考えられ、感
染患者から単離できるデーン(Ｄane)粒子は約４２nmの
径を有する。各々、肝炎Ｂ型表面抗原(ＨＢsＡg)からな
る外皮、キャプシド(ＨＢcＡg)、内生ポリメラーゼおよ
びＤＮＡゲノムから構成されている。該ゲノムは環状
で、約２００の塩基からなる１本鎖域を有する２本鎖で
ある。該１本鎖域はinvitroで該内生ポリメラーゼの作
用によって詰込み(fill in)を行なうことができる。よ
り長い鎖は約３２００の塩基を含有する。組織培養中で
ＨＢＶを増殖させるのが困難であることが示されてお
り、また、唯一公知の宿主がヒトであるため、従来、Ｈ
ＢＶワクチンを製造することは困難であった。感染した
ヒトから少量のＨＢＶ抗原標品が単離されている。エフ
・デイ・シイ・レポーツ(Ｆ−Ｄ−Ｃ Ｒeports.pp.３〜
４,Ｊuly１９,１９８２)には最近開発されたＢ型肝炎ワ
クチンの臨床研究の報文が掲載されている。 【０００４】バレンツエラら〔Ｖalenzuela et al.,Ｎa
ture,Ｖol.２９８,３４７〜３５０(１９８２)〕は表現
ベクターを用いた酵母におけるＨＢsＡgの合成を報告し
ており、それでは該ＨＢsＡgコード付け配列が８３５bp
のＴaql−Ｈpalフラグメントで、プロモーターが該酵母
アルコール・デヒドロゲナーゼI．プロモーターであ
る。この文献より以前にいくつかの簡単な研究報文があ
る。これらは、酵母アルコール・デヒドロゲナーゼ・プ
ロモーター域に結紮されているＨＢsＡgに類似した蛋白
をコードする配列を含むＤＮＡフラグメントの酵母にお
ける表現を報告しているバレンツエラらの報文〔Ｖalen
zuela et al.,Ａrch．Ｂiol．Ｍed．Ｅxp．(Ｃhile),Ｖ
ol.１４(１),２１〜２２(１９８１)〕、ピイ・バレンツ
エラおよびダブリュウ・ジェイ・ルッター(Ｐ.Ｖalenzu
ela and Ｗ．Ｊ．Ｒutter)を含む米国の研究チームが酵
母における「蛋白−被膜周囲肝炎Ｂ型ウイルス」の産生を
発表したと報じているスクリップ中の報告〔Ｓcrip Ｎ
o.６１６,p.１４(Ａug.１２,１９８１)〕およびダブリ
ュウ・ジェイ・ルッター(Ｗ．Ｊ．Ｒutter)が酵母細胞
におけるグリコシル化ＨＢsＡgの表現を報告したと報じ
ているツカーマンの報文〔Ｚuckerman, Ｎature,Ｖol.
２９５、９８〜９９(１９８２)〕である。 【０００５】ＨＢsＡgのようなＨＢＶの抗原性成分は該
抗原をコードする遺伝子を含む組換型ＤＮＡ分子を挿入
した細菌中で製造されてきた。バーレルら〔Ｂurrell e
t al.,Ｎature,Ｖol.２７９,Ｎo.５７０８,４３〜４７
(１９７９)〕はプラスミドpＢＲ３２２中でクローンし
たＨＢＶ ＤＮＡ配列のイー・コリ(Ｅ.coli)ＨＢ１０
１株における表現を報告している。ヨーロッパ特許出願
第１３８２８号において、マレーら(Ｍurray et al．)
は、イー・コリＨＢ１０１株において、ＨＢsＡgを含め
て、ＨＢＶ抗原をコードできる組換型ベクターの製造を
開示している。このベクターはデーン粒子ＤＮＡおよび
プラスミドpＢＲ３２２から製造される。マレーらは、
有用な宿主には他の細菌宿主、酵母および他の真菌、動
物または植物細胞およびその他の宿主が包含されうると
述べているが、示されている唯一の宿主はイー・コリで
ある。チャーネイら〔Ｃharney et al.,Ｎature,Ｖol.
２８６,８９３〜８９５(１９８０)〕はβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子と該ＨＢsＡg構造遺伝子の融合物を有する
バクテリオファージの構造を報告している。該バクテリ
オファージはＨＢsＡgおよびβ−ガラクトシダーゼ両方
の抗原性決定子からなる融合蛋白の合成を命令する。 【０００６】英国特許出願第２０３４３２３号におい
て、チオライスら(Ｔiollais et al)はＨＢＶ ＤＮＡ
を含有するコリファージの製造を開示している。融合フ
ァージ−ＨＢＶ ＤＮＡがイー・コリＣ６００株中に形
質転換されている。最初にＰＣＴ出願ＷＯ８１／００５
７７号として公開された英国特許出願第２０７０６２１
号には、ＨＢsＡg遺伝子の一部、プロモーターおよびラ
クトース・オペロンのＺ遺伝子からなり、イー・コリ中
でクローンできるプラスミドが開示されている。ヨーロ
ッパ特許出願第２０２５１号においてルッターら(Ｒutt
er et al)はプラスミドpＢＲ３２２およびＨＢＶ ＤＮ
ＡのＢamＨIフラグメントからなり、イー・コリの形質
転換に使用できる組換型ベクターを包含する組換型ベク
ターを開示している。ＨＢＶ ＤＮＡのＢamＨIフラグ
メントおよびトリプトファン・オペロンの一部からなる
他のベクターがイー・コリＨＢ１０１株における表現を
得るために使用された。エドマンら〔Ｅdman et al．,
Ｎature,Ｖol.２９１,Ｎo.５８１５,５０３〜５０６(１
９８１)〕はトリプトファン・オペロン調節域の調節の
下、イー・コリにおいてＨＢcＡgおよびβ−ラクタマー
ゼ−ＨＢsＡg融合蛋白の合成を命令するプラスミドの構
造を記載している。 【０００７】ＨＢＶ ＤＮＡの細菌中への挿入を開示し
た他の文献にはチャーネーらの文献〔Ｃharnay et al.,
Ｐrog．Ｍed．Ｖirol．,Ｖol.２７,８８〜９２(１９８
１)〕、マツケイらの文献〔Ｍackay et al．,Ｐroc．Ｎ
atl．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.,Ｖol.７８,Ｎo.７,４５１０
〜４５１４(１９８１)〕、フリッチエら〔Ｆritsch eta
l.,Ｃ．Ｒ．Ａcad．Ｓci.,Ｖol.２８７,Ｎo．１６,１４
５３(１９７８)〕、英国特許明細書第２０３４３２３号
(Ｄerwent Ｎo.４６８７４Ｃ)およびパセクらの文献
〔Ｐaseket al．,Ｎature,Ｖol.２８２,Ｎo.６,５７５
(１９７９)〕が包含される。ＨＢＶ ＤＮＡは哺乳動物
細胞中でもクローンされている。これらには、ヒト、マ
ウスおよびヒト肝癌細胞系が包含される。例えばデュボ
イスら〔Ｄubois etal．,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．
Ｕ.Ｓ.,Ｖol.７７,Ｎo.８,４５４９〜４５５３(１９８
０)〕はマウス細胞のＨＢＶゲノム含有プラスミドによ
る形質転換およびＨＢsＡgの表現を報告している。ヒル
シュマンら〔Ｈirschman et al.,Ｐroc．Ｎatl．Ａca
d．Ｓci．Ｕ.Ｓ.,Ｖol.７７,Ｎo.９,５５０７〜５５１
１(１９８０)〕はＨＢＶ ＤＮＡで形質転換させたＨe
Ｌa細胞によるＨＢＶ様粒子の産生を報告している。 【０００８】ヒト血液からのＨＢsＡgを用いるＨＢＶワ
クチンの製造法がフナコシら〔Ｆunakashi et al., Ｐr
og．Ｍed．Ｖirol.,Ｖol.２７,１６３〜１６７(１９８
１)〕およびマウパスら〔Ｍaupas et al.,Ｐrog．Ｍe
d．Ｖirol.,Ｖol.２７,１８５〜２０１(１９８１)〕に
より報告されている。フナコシらによって製造されたワ
クチンは４０μgの精製したホルマリン処理ＨＢsＡg、
リン酸塩、塩化ナトリウム、２０ｍｇのマンニトールお
よびアジュバントとして０.１％の水酸化アルミニウム
を含有する。後者の報文において、マウパスらはワクチ
ンの１投与量が２〜１０μg／mｌの蛋白〔ローリー(Ｌo
wry)法〕および０.１％の水酸化アルミニウムを含有す
る精製したホルマリン処理ＨＢsＡg１mｌであると報告
している。マウパスらによって報告された研究で用いた
方法では１ケ月間隔で３回注射し、１年後に１回ブース
ターを要求しており、マウパスらは３ケ月間隔で２回濃
ＨＢsＡgの注射を提案している。ＨＢＶワクチン製造に
ついての他の文献にはヘパチテイスＢワクチンＩＮＳＥ
ＲＭシンポジウム(Ｈepatitis Ｂ Ｖaccine ＩＮＳＥＲ
Ｍ Ｓymposium Ｎo.１８,edit．by Ｍaupas and Ｇu
esry,１９８１,Ｅlsevier／Ｎorth−ＨollandＢiomedic
al Ｐress)の、各々、３、３７および５７頁のマウパ
スら、アダモビツツら(Ａdamowiczet al)およびフナコシ
らのものが包含される。酵母は他のある種のＤＮＡ配列
の宿主生物として使用されている。例えば、英国特許出
願第２０６８９６９号において、フレーザーら(Ｆraser
et al)は酵母におけるニワトリ・オバルブミンの製造
を開示している。スクリップ６４０号〔ＳcripＮo.６４
０,Ｐ１１(Ｎov.４,１９８１)〕はあるタイプのインタ
ーフエロンが酵母中で製造される旨の報告を包含してい
る。ヨーロッパ特許第１１５６２号(Ｄerwent Ｎo.３８
７６２Ｃ)では、２μプラスミド中にura３+酵母遺伝子
を含有するハイブリッド酵母プラスミドが報告されてい
る。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明は、ＨＢsＡgをコ
ードできるヌクレオチド配列および酵母、サッカロミセ
ス・セレビシアエ(Ｓaccharomyces cerevisiae)におい
て該ＨＢsＡg配列の転写を行なうことのできる酵母arg
３遺伝子から誘導された調節域からなる組換型ＤＮＡ分
子の製法に関する。該分子は該ＨＢsＡg配列および該調
節域が挿入されたベクターを含有し、該ベクターは酵母
ベクターの製造または該ＨＢsＡgおよび調節域の保存に
使用できる。本明細書においては、該プラスミドで形質
転換された微生物のような該組換型ＤＮＡ分子を含有す
る微生物も記載する。本発明はまた、ＨＢsＡg配列のよ
うなコード付け配列挿入のためのarg３調節域およびそ
れに隣接する制限部位を有し、該コード付け配列の表現
によって合成された蛋白が異質アミノ酸残基を欠くよう
になるプラスミドも包含する。また、本発明には、本発
明によって製造されたＨＢsＡgのワクチン有効量および
適当な担体からなるヒトにおけるＨＢＶ感染に対する保
護惹起用のワクチンも包含される。さらに、本発明は、
該組換型ＤＮＡ分子および該分子を含有する微生物の製
法ならびにＨＢsＡgおよびＨＢsＡg含有ワクチンの製法
も包含する。 【００１０】 【発明の実施の態様】添付図面中、図１はpＲＩＴ１０
６０１の制限エンドヌクレアーゼ開裂地図である。図２
はpＲＩＴ１０６０６の制限エンドヌクレアーゼ開裂地
図である。図３はpＭＣ２００の制限エンドヌクレアー
ゼ開裂地図である。図４はpＭＣ２００における３３０
０bp ＨindIII酵母ＤＮＡ挿入物の一部分のヌクレオチ
ド配列で、この部分にはＨincII、ＢglIIおよびＥcoＲI
部位が含まれている。図５はpＲＩＴ１０６７１およびp
ＲＩＴ１０６７３の製造を示すフローシートである。図
６はpＲＩＴ１０７４９の製造を示すフローシートであ
る。図７はpＲＩＴ１０７６１およびpＲＩＴ１０７６４
の製造を示すフローシートである。 【００１１】本発明の組換型ＤＮＡ分子は、ＨＢsＡg用
の構造遺伝子を含むヌクレオチド配列を、酵母において
該ＨＢsＡg配列の転写を命令でき、それにより、その表
現が行なうことのできる酵母arg３調節域と融合させる
ことにより製造される。本明細書において、「組換型Ｄ
ＮＡ分子」なる語は該ＨＢsＡgコード付け配列および該
調節域を含有するＤＮＡフラグメントならびにプラスミ
ドまたはファージ・ベクターのような該フラグメントを
含む他のＤＮＡ分子を意味する。「調節域」なる語はプロ
モーター域および転写に必要な他の配列を含む配列を意
味する。該酵母arg３調節域は、それがＨＢsＡgコード
付け配列表現用の強力なプロモーターとなることができ
るので、特に有利である。「ＨＢsＡg」なる語は構造的に
ＨＢsＡg標品と同じであるか、ＨＢsＡg標品と実質的に
同じ抗原性決定子を有する蛋白、すなわち、ＨＢsＡg標
品を特異的に認識し、それと反応する抗体の生成を惹起
することができるか、抗ＨＢsＡg抗体によって特異的に
認識される蛋白を意味する。 【００１２】該ＨＢsＡgコード付け配列は、感染したヒ
ト血清中のデーン粒子より抽出したＤＮＡから、ＤＮＡ
ポリメラーゼ、好ましくは、内生ポリメラーゼで１本鎖
域に詰込み、ついで、制限エンドヌクレアーゼで消化す
ることにより単離できる。エンドヌクレアーゼの選択
は、部分的に、実際に用いるデーン粒子に依存する。例
えば、後記の実施例で示すように、adw抗原型のある種
のデーン粒子のＨＢＶＤＮＡのＨＢsＡgコード付け配列
は単一のＢamＨIフラグメント上で単離でき、ayw抗原型
のある種のデーン粒子のＨＢＶ ＤＮＡのＨＢsＡgコー
ド付け配列はＨhaIフラグメント上で単離できる。同じ
抗原型のデーン粒子のＨＢＶ ＤＮＡが制限部位の異な
ったパターンを示すこともある。本発明で用いるＤＮＡ
フラグメントを製造するためのＤＮＡの制限、本発明で
用いる組換型ＤＮＡ分子製造のためのかかるフラグメン
トの結紮および微生物への挿入は前記の、また、後記す
る文献に開示されている技法のような、公知の技法によ
って行なわれる。条件はＤＮＡおよび酵素の変性をさけ
るように選択する。例えば、pＨは約７.０〜１１.０に
保持するように緩衝され、温度は約６０℃以下に保つ。
好ましくは、制限は約３０〜４０℃で行ない、結紮は約
０〜１０℃で行なう。本発明の実施に用いる制限酵素お
よびリガーゼは商業的に入手でき、それに付されている
指示に従って使用すべきである。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
が好ましいリガーゼである。 【００１３】調節域へのＨＢsＡg配列の融合は後記の実
施例に示すような中間ベクターの使用によって行なうこ
とができる。別法として、ＨＢsＡg配列は、調節域を含
むベクター中に直接挿入することができる。ベクターは
本発明のＤＮＡフラグメントを担持し、保持できるＤＮ
Ａで、例えば、ファージやプラスミドを包含する。ファ
ージ中でＤＮＡフラグメントをクローンする技法は、例
えば、チャーネーら〔Ｃharnay et al.,Ｎature,Ｖol.
２８６,８９３〜８９５(１９８０)〕および英国特許出
願第２０３４３２３号(Ｔiollais)によって開示されて
いる。好ましくは、ＨＢsＡg配列は調節域に対して、Ｈ
ＢsＡg配列の表現によって合成されたＨＢsＡgが異質ア
ミノ酸残基を持たないように位置させる。特に有用であ
ることが判明している調節域は、オルニチン・カルバモ
イルトランスフェラーゼ(ＯＣＴ)をコードする酵母arg
３遺伝子から由来するものである。このarg３調節域の
使用は、その作用が特異的および一般的調節機構の両方
に支配されるので有利である。クラビールら〔Ｃrabeel
etal., Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ., Ｖo
l.７８,５０２６(１９８１)〕によって報告されている
ように、これはプラスミドpＹe ura３arg３上で、イー
・コリ中でクローンされている。好ましい宿主は、アル
ギニン生合成経路が抑制解除されたサッカロミセス・セ
レビシアエ株、例えば、１c１６９７d株である。かかる
菌株の使用は、実施例で用いた他の菌株、ＤＣ５株と比
較して、arg３プロモーターからの表現増加をもたらせ
る。 【００１４】融合ＤＮＡフラグメントを酵母中にクロー
ンするための好ましいベクターはプロモーターＹＥp１
３で、これはイー・コリおよびサッカロミセス・セレビ
シアエの両方において複製、維持することができ、それ
故、シャトル・ベクターとして知られている。数種の他
の酵母ベクターが知られており、利用できる。ＨＢsＡg
および調節域は、順次あるいは、後記の実施例に示すよ
うに同時に酵母中に挿入できる。プラスミド・ベクター
による形質転換は、通常、本発明のＤＮＡ分子をプラス
ミドとして取込むこととなる。しかし組換現象のような
他の反応では該ＤＮＡ分子の染色体ＤＮＡ中への取込み
とすることもできる。本発明による酵母によって製造さ
れたＨＢsＡgと、適当な担体からなるヒトにおけるＨＢ
Ｖ感染に対する保護を惹起するワクチンは公知の技法に
よって製造することができる。水酸化アルミニウムのよ
うなアジュバントを使用することが望ましい。また、得
られたＨＢsＡgを他の免疫原と組合せて複合ワクチンを
製造することもできる。該ＨＢＶまたは複合ワクチン
は、例えば、皮下、静脈内または筋肉内経路で投与でき
る。本発明のＤＮＡフラグメントおよびそれによって製
造されたＨＢsＡgはまた、ＤＮＡハイブリッド形成技法
および種々のイムノアッセイによる生物試料中のＨＢＶ
検出用の探針としても用いることができる。つぎに実施
例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。実施例中、
％は、特に断らない限り重量％を意味する。 【００１５】 【実施例】 実施例１ ＨＢＶ ＤＮＡをpＢＲ３２２と組合わせることによる
中間プラスミドpＲＩＴ１０６０１の調製 ayw抗原型のＨＢsＡg陽性血清に、０.２８％の最終濃度
になるようにＣaＣl2を加えて脱繊維化し、ＳＷ２７ロ
ーター中、１０mＭトロメタミン−ＨＣl、１ＭＮaＣlお
よび１mＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液(pＨ７.５)中で調製
した１０〜２０％ショ糖グレジエント上、２７０００r.
p.mで２時間で遠心分離する。デーン粒子を含む透明な
ペレットを同じ緩衝液中に再懸濁させ、６５％ショ糖ク
ッションに重層させた緩衝２０％ショ糖上で遠心分離す
る。該クッション界面での乳白光バンドを回収し、同様
な２０〜６５％グレジエント上、２０００００×Ｇで４
時間遠心分離し、デーン粒子をペレット化する。 【００１６】Ａ．該デーン粒子を、５０mＭトロメタミ
ン−ＨＣl、１０mＭ ＭgＣl2、５００mＭ ＮaＣl、０.
５mＭジチオトライトール、各５０mＭのdＡＴＰ、dＣＴ
ＰおよびdＧＴＰならびに８μＭ32Ｐ−dＴＴＰ(３５０
Ｃi／mmole)を含有する反応混合液(pＨ８.０)に再懸濁
させ、該再懸濁粒子を３７℃で５時間イキュベートする
ことにより内生ＤＮＡポリメラーゼを用いてデーン粒子
内のＨＢＶゲノムの１本鎖域を修復する。該再懸濁液を
１０mＭトロメタミン−ＨＣl、１０mＭ ＥＤＴＡ、１０
０mＭ ＮaＣlおよび０.０２％ドデシル硫酸ナトリウム
を含有する緩衝液(pＨ７.５)で希釈してpＨ７.５とし、
３７℃にて１時間プロナーゼ０.５ｍｇ／mｌと共にイン
キュベートし、ついで、フェノール抽出およびエタノー
ル沈澱を行なう。ＢamＨI制限エンドヌクレアーゼによ
る該ＤＮＡの消化は、アガロースゲル電気泳動および該
ゲルのオートラジオグラフィーによって判定されるよう
に、約１４５０bpおよび１６００bpのサイズを有する放
射活性フラグメントを産生する。 【００１７】Ｂ．デーン粒子ＤＮＡ約３０ngを、標識し
ていないdＴＴＰの存在下、内生ＤＮＡポリメラーゼを
用いて修復し、前記と同様にして抽出、回収する。該Ｄ
ＮＡを、あらかじめＢamＨI制限エンドヌクレアーゼで
消化し、アルカリ性ホスファターゼで処理した１００ng
のプラスミドpＢＲ３２２と混合する。プラスミドpＢＲ
３２２は組換型ＤＮＡ法に通常用いられるもので、入手
の制限なしにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション(Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection)に寄託
番号３７０１７として寄託されている。該混合液をフェ
ノールで抽出し、エタノールで沈澱させ、遠心分離し、
乾燥させて、５０mＭトロメタミン−ＨＣl、１mＭＡＴ
Ｐ、１０mＭＭgＣl2、１０mＭジチオトライトール、５
０μg／mｌゼラチンおよび２単位／mｌＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを含有する混合液１２μｌ(pＨ７.５)に再懸濁させ
る。該懸濁液を１０℃で４時間インキュベートし、つい
で氷上で１８時間保持する。結紮したＤＮＡ混合物は、
コーヘンら〔Ｃohenet al., Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓc
i．Ｕ.Ｓ., Ｖol.６９,２１１０,(１９７２)〕の方法に
従って調製したイー・コリＫ１２株Ｃ６００のコンピテ
ント細胞を形質転換するのに用いられる。形質転換体を
アンピシリン２００μg／mｌを含有する固体培地上で選
択する。単離したコロニーについて、pＢＲ３２２のＢa
mＨI部位への異種ＤＮＡフラグメント挿入を示すテトラ
サイクリン耐性の欠失をスクリーニングする。このよう
な形質転換体クローンの１つがプラスミドpＲＩＴ１０
６０１を含有することが判明し、これはＢamＨＩエンド
ヌクレアーゼによる消化によって４.６０bpのpＢＲ３２
２フラグメントならびに１６００bpおよび１４５０bpの
ＨＢＶ ＤＮＡフラグメントを与えることが判明した。
イー・コリＫ１２株Ｃ６００(pＲＩＴ１０６０１)培養
物は欧州特許条約(ＥＰＣ)およびブダペスト条約に従
い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
(アメリカ合衆国メリイランド州、ロックビル)に１９８
２年６月２日付で寄託番号ＡＴＣＣ３９１３２として寄
託されている。プラスミドpＲＩＴ１０６０１の制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂地図を図１に示す。 【００１８】Ｃ．種々の制限酵素によるデーン粒子ＤＮ
ＡおよびpＲＩＴ１０６０１の消化によって生じるフラ
グメントのサイズをつぎのとおり比較した。デーン粒子
ＤＮＡ、すなわち、ＨＢＶ ＤＮＡを前記の内生ポリメ
ラーゼ反応により、または精製ＤＮＡをイー・コリ由来
のＤＮＡポリメラーゼIで処理することによって32Ｐで
標識する。標識されたＨＢＶ ＤＮＡをpＲＩＴ１０６
０１と混合し、該混合物を制限エンドヌクレアーゼで処
理し、アガロースゲル上で電気泳動にかける。該ゲルを
臭化エチジウムで染色し、紫外線光下で写真撮影してＤ
ＮＡフラグメントの位置づけをし、ついで、乾燥してオ
ートラジオグラフィーにかけ、放射活性ＨＢＶ ＤＮＡ
フラグメントの位置づけをする。つぎの標識されたＨＢ
ＶフラグメントがpＲＩＴ１０６０１フラグメントのサ
イズに正確に一致することが判明した:１４５０および
１６００bp ＢamＨIフラグメント;１３３０bp ＨpaI
フラグメント;および１１３０bp ＢamＨI−ＸhoIフラ
グメント。標識されたデーン粒子ＤＮＡはまた、サザー
ン〔Ｓouthern．Ｊ．Ｍol．Ｂiol., Ｖol.９８,５０３
(１９７５)〕の技法により、アガロースゲルからニトロ
セルロース・フイルター上に移した後、pＲＩＴ１０６
０１のＢamＨI消化によって遊離される１４５０および
１６００bpの両方にフラグメントと特異的にハイブリッ
ド形成する。これらの結果は、pＲＩＴ１０６０１上の
クローンされたＤＮＡ挿入物がＨＢＶゲノムに相当し、
pＲＩＴ１０６０１上での２つのＢamＨIフラグメントの
相対的な方向が該ビリオンにおけると同じであることを
示している。pＲＩＴ１０６０１は後記の実施例１０に
おいてpＲＩＴ１０６７１を調製するのに使われる。 【００１９】実施例２ ＨＢＶ ＤＮＡをpＡＣＹＣ１８４と組合わせることに
よる中間プラスミド、pＲＩＴ１０６１６の調製 デーン粒子を前記と同様にadw抗原型のＨＢsＡg陽性血
清から単離する。32Ｐで標識されたＨＢＶ ＤＮＡの制
限エンドヌクレアーゼ分析は該ＤＮＡが１つのＥcoＲＩ
部位を含んでいることを示した。標識されていないヌク
レオチドと用いる内生ポリメラーゼ反応によって詰込ん
だＨＢＶ ＤＮＡをＥcoＲＩで消化する。この制限ＤＮ
ＡをあらかじめＥcoＲＩで消化し、アルカリ性ホスファ
ターゼで処理したプラスミドpＡＣＹＣ１８４と混合す
る。プラスミドpＡＣＹＣ１８４は、入手の制限なしに
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託
番号３７０３３として寄託されている。該混合物をＴ４
ＤＮＡリガーゼで結紮する。この結紮ＤＮＡ混合物をイ
ー・コリＫ１２株 Ｃ６００のコンピテント細胞を形質
転換するのに用いる。形質転換体をテトラサイクリン
(１５μg／mｌ)寒天培地上で選択し、pＡＣＹＣ１８４
のＥcoＲＩの部位における挿入を示すクロラムフェニコ
ール耐性の欠失についてスクリーニングする。形質転換
コロニーは、該ＨＢＶ ＤＮＡからなる３２００bp挿入
物をＥcoＲＩ部位に有するpＡＣＹＣ１８４からなるプ
ラスミドpＲＩＴ１０６１６を含有することが判明し
た。pＲＩＴ１０６１６の制限地図を図２に示す。イー
・コリＫ１２株Ｃ６００(pＲＩＴ１０６１６)はヨーロ
ッパ特許条約およびブタペスト条約に従いアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションに１９８２年６月２
日付で寄託番号ＡＴＣＣ３９１３１として寄託されてい
る。 【００２０】実施例３ pＲＩＴ１０６１６をpＢＲ３１３と組合わせることによ
る、ＨＢsＡgをコードするヌクレオチド配列を含有する
中間プラスミド、pＲＩＴ１０６４０の調製 pＲＩＴ１０６１６をカーンら〔Ｋahn et al.,Ｍethods
in Ｅnzymology,Ｖol.６８,２６８,(１９７９)〕の記
載に実質的に従いＣsＣl−臭化エチジウム密度グレジエ
ント遠心分離法により精製する。該ＤＮＡをＢamＨIエ
ンドヌクレアーゼで消化し、プラスミドpＢＲ３１３の
ＢamＨI消化、アルカリ性ホスファターゼ処理ＤＮＡと
混合し、結紮し、実施例１の記載と実質的に同様にして
イー・コリＫ１２株Ｃ６００のコンピテント細胞を形質
転換するのに用いる。プラスミドpＢＲ３１３は、入手
の制限なしにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託番号３７０１８として寄託されている。形
質転換体をアンピシリン含有寒天培地上で選択し、pＢ
Ｒ３１３のＢamＨI部位における挿入を示すテトラサイ
クリン耐性の欠失についてスクリーニングする。形質転
換コロニーは、ＢamＨI部位に１３５０bp挿入物を有す
るpＢＲ３１３からなるプラスミド、pＲＩＴ１０６４０
を含むことが判明した。該挿入物は、ＨＢsＡgをコード
できるヌクレオチド配列である。該挿入物は推定的ＨＢ
sＡg前駆体蛋白部分および完全表面抗原をコードし、ま
た、５６５bpの３'非コード付け配列を含有する。 【００２１】実施例４ 酵母arg３遺伝子をpＢＲ３２２と組合わせることによ
る、arg３調節域を含有する中間プラスミド、pＭＣ２０
０の調製 arg３遺伝子を特定する３３００bp酵母ＤＮＡフラグメ
ントを、pＹeura３arg３をＨindIIIで消化することによ
り得る。プラスミドpＹeura３arg３については、クラビ
ールら〔Ｃrabeel et al.,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓc
i．Ｕ.Ｓ.,Ｖol.７８,５０２６,(１９８１)〕によって
記載されている。該３３００bpフラグメントをpＢＲ３
２２のＨindIII部位中にクローンし、実質的に前記と同
様にしてイー・コリＫ１２株ＭＭ２９４中に形質転換さ
せる。形質転換体をアンピシリン培地上で選択し、テト
ラサイクリン耐性についてスクリーニングする。形質転
換コロニーは、ＨindIII部位に挿入物を有するpＢＲ３
２２からなるプラスミドpＭＣ２００を含有することが
判明した。このプラスミドは、以下の実施例に記載する
ように酵母細胞においてＨＢsＡgヌクレオチド配列の転
写を行なうことのできるarg３調節域を含んでいる。イ
ー・コリＫ１２株ＭＭ２９４(pＭＣ２００)はヨーロッ
パ特許条約およびブダペスト条約に従いアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションに１９８２年６月２日
付で寄託番号ＡＴＣＣ３９１３０として寄託されてい
る。 【００２２】オルニチンカルバモイルトランスフェラー
ゼ(ＯＣＴ)のためのＮ−末端コード付け配列部分および
５'−非翻訳先端域の部分を含め、arg３遺伝子の一部の
ヌクレオチド配列は、ヒュイゲンら( Ｈuyghen et a
l., Ａrch．Ｉntl．Ｐhysical．Ｂiochem.,Ｖol.８９,
Ｂ１７２,(１９８１)〕によって決定されている。図４
にこの公知の配列の２１０bpフラグメントを示す。該２
１０bpフラグメントはpＭＣ２００中の３３００bpＨind
III酵母ＤＮＡ挿入物上に独特なＨincII、ＢglIIおよび
ＥcoＲＩ部位を含有し、該ＯＣＴ蛋白コード付け配列の
ための開始コードンは図４中の四角で囲んだＡＴＧコー
ドンと考えられる。ＨＢsＡg単独またはＨＢsＡg前駆体
とクローンしたＨＢＶ ＤＮＡ由来のＨＢsＡgをコード
する配列の酵母ＤＮＡのＨincII、ＢglIIまたはＥcoＲ
Ｉ部位への導入は遺伝子融合をもたらし、該遺伝子融合
が融合部位を越えて翻訳を継続させるための正しい方向
にある場合には、該arg３調節域から転写、翻訳された
ハイブリッド蛋白を産生するものと考えられる。 【００２３】実施例５ pＲＩＴ１０６４０をpＭＣ２００と組合わせることによ
る、ＨＢsＡgおよび調節域を含む中間プラスミド、pＲ
ＩＴ１０６７１およびpＲＩＴ１０６７２の調製 pＭＣ２００ ５μgをＢglII６.４単位で３７℃にて２.
５時間消化し、０.１Ｍグリシン、０.０１ＭＭgＣl2・６
Ｈ2Ｏおよび０.０１mＭＺnＣl2を含有する等容量の緩衝
液(pＨ１０.５)で希釈し、ウシ腸アルカリ性ホスファタ
ーゼ０.５単位と共に３７℃にて３０分間インキュベー
トし、５'末端リン酸塩残基を除去する。該混合液を緩
衝液−飽和フェノールで２回、エーテルで３回抽出す
る。ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、０.０１Ｍトロメ
タミン緩衝液(pＨ７.５)に溶解する。pＲＩＴ１０６４
０ ２５μgをＢamＨIで消化し、ＨＢＶ ＤＮＡの１３
５０bp ＢamＨIフラグメントを切除する。該１３５０b
pフラグメントを調製アガロースゲル電気泳動および電
気溶出により精製する。溶出ＤＮＡをエタノール沈澱に
より回収、濃縮し、０.０１Ｍトロメタミン緩衝液( pＨ
７.０)２０μｌ中に溶解する。ＨＢsＡgコード付け配列
を含むＢamＨIフラグメント０.３μgをＢglII消化pＭＣ
２００ ０.５μgと混合し、該混合物をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼと共にインキュベーションして結紮する。 【００２４】該結紮ＤＮＡをイー・コリＫ１２株ＭＭ２
９４のコンピテント細胞を形質転換するのに用いる。形
質転換体を２００μg／mｌアンピシリン含有寒天平板上
で選択する。アンピシリン寒天培地上で連続継代して１
２個の耐性コロニーを単離し、ビルンボイムら〔Ｂirnb
oim et al.,Ｎucl．Ａcid．Ｒes.,Ｖol.７,１５１３(１
９７９)〕により記載された方法によってプラスミドを
単離する。アガロースゲル電気泳動による分析は、すべ
てのプラスミドがＨpaIによって制限され、ＢamＨIフラ
グメントの挿入を示し、また、挿入フラグメントの両方
の方向が１２個の形質転換コロニー中にあることを示し
ている。該プラスミドはＣsＣl−臭化エチジウム密度グ
レジエント遠心分離法によって単離される。１つのプラ
スミド、pＲＩＴ１０６７１は、ＨＢsＡgコード付け配
列の転写のための正しい方向でＢglII部位に融合された
ＢamＨIフラグメントを含み、ＯＣＴの１８個のＮ−末
端アミノ酸、推定的ＨＢsＡg前駆体蛋白の４２個のアミ
ノ酸およびＨＢsＡgの２２６個のアミノ酸からなる２８
６個のアミノ酸融合蛋白を生じる。該融合蛋白は以下の
実施例８で示されるＨＢsＡgである。pＲＩＴ１０６７
１を含有する形質転換体を、イー・コリＫ１２株ＭＭ２
９４(pＲＩＴ１０６７１)と命名する。pＲＩＴ１０６７
１を図５に示す。中間プラスミドとしてのpＲＩＴ１０
６４０の使用は必須ではない。例えば、該ＢamＨIフラ
グメントはpＲＩＴ１０６１６から切り出すことができ
る。もう１つのプラスミド、pＲＩＴ１０６７２は、Ｈ
ＢsＡgコード付け配列の転写のための正しくない方向に
あるＢamＨIフラグメントを含んでいる。このプラスミ
ドを含む形質転換体をイー・コリＫ１２株ＭＭ２９４(p
ＲＩＴ１０６７２)と命名する。 【００２５】実施例６ pＲＩＴ１０６７１およびpＲＩＴ１０６７２をシャトル
ベクターＹＥp１３と組合わせることによるプラスミ
ド、pＲＩＴ１０６７３およびpＲＩＴ１０６７４シャト
ルベクターの調製 ベクターＹＥp１３はイー・コリ・サッカロミセス・セ
レビシアエ・シャトルベクターである。ベクターＹＥp
１３はブローチら〔Ｂroach et al.,Ｇene,Ｖol.８,１
２１,(１９７９)〕に記載されており、ジエイ・ヒック
ス(Ｊ．Ｈicks,Ｃold．Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratories
Ｎew Ｙork,Ｕ.Ｓ.Ａ)によって供給された。小さいＨi
ndIIIフラグメントを、ＨindIIIによる消化でプラスミ
ドから切除し、該プラスミドを再結紮して、単一のＨin
dIII部位を含む誘導プラスミド、ＹＥp１３ＨindIIIを
調製する。精製ＹＥp１３ＨindIIIをＨindIIIで消化
し、アルカリ性ホスファターゼで処理して再結紮を抑制
する。該ＤＮＡをフェノール抽出およびエタノール沈澱
によって回収する。 【００２６】精製pＲＩＴ１０６７１およびpＲＩＴ１０
６７２をＢamＨIで消化し、アルカリ性ホスファターゼ
で処理してpＢＲ３２２部分の再形成を抑制する。該処
理ＤＮＡをさらにＨindIIIで消化して調節域−ＨＢsＡg
遺伝子融合を含む４６５０bpＨindIIIフラグメントを遊
離させ、ついで、その試料をフェノールで抽出し、エタ
ノールで沈澱させる。pＲＩＴ１０６７１およびpＲＩＴ
１０６７２から誘導したＤＮＡ調製物各０.４μgを、別
々に、ＨindIII消化ＹＥp１３ＨindIII０.４μgと混合
し、該混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベー
トする。各結紮混合物の一部分をイー・コリＫ１２株Ｍ
Ｍ２９４のコンピテント細胞を形質転換するのに用い
る。形質転換体をアンピシリン寒天培地上で選択する。
形質転換体コロニーを単離し、ビルンボイムら〔Ｂirnb
oim et al., Ｎucl．Ａcid．Ｒes.,Ｖol.７,１５１３
(１９７９)〕によって記載された方法により、それらの
プラスミドの内容を調べた。形質転換体コロニーの１
つ、イー・コリＫ１２株ＭＭ２９４(pＲＩＴ１０６７
３)は第 図に示すような正しい方向で、ＹＥp１３Ｈin
dIII上に挿入されたpＲＩＴ１０６７１からのＨindIII
フラグメントを含むプラスミド、pＲＩＴ１０６７３を
含有する。もう１つの形質転換体コロニー、イー・コリ
Ｋ１２株ＭＭ２９４(pＲＩＴ１０６７４)は、ＹＥp１３
ＨindIII上に正しくない方向で挿入されたpＲＩＴ１０
６７２からのＨindIIIフラグメントを含むプラスミド、
pＲＩＴ１０６７４を含有している。 【００２７】実施例７ pＲＩＴ１０６７３およびpＲＩＴ１０６７４による酵母
の形質転換 プラスミドpＲＩＴ１０６７３およびpＲＩＴ１０６７４
を、イー・コリＫ１２株ＭＭ２９４(pＲＩＴ１０６７
３)およびＭＭ２９４(pＲＩＴ１０６７４)の清澄な溶解
質よりＣsＣl−臭化エチジウム密度グレジエント遠心分
離法によって単離する。 【００２８】Ａ．サッカロミセス・セレビシアエ株ＤＣ
５ブローチら〔Ｂroach et al.,Ｇene,Ｖol.８,１２１,
(１９７９)〕によって記載されている。サッカロミセス
・セレビシアエ株ＤＣ５(leu２〜３、leu２〜１１３、h
is３、can１〜１１)は、ジエイ・ヒックス(Ｊ．Ｈicks,
Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratories Ｎew Ｙork,Ｕ.
Ｓ.Ａ)から得られ、ヨーロッパ特許条約およびブダペス
ト条約にしたがってアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション(アメリカ合衆国メリイランド州、ロック
ビル)に１９８２年６月２日に寄託番号２０６３０とし
て寄託されている。プロトプラスト化をβ−グルコウロ
ニダーゼ(０.２４単位／mｌ最終濃度)およびアリールス
ルファターゼ(１.２単位／mｌ最終濃度)の混合物を用い
て０.８Ｍソルビトール、０.０３Ｍβ−メルカプトエタ
ノールおよび０.１Ｍリン酸カルシウム緩衝液(pＨ７.
５)中で行なう以外は、ハイネンら〔Ｈinnen et al.,
Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.,Ｖol.７５,１
９２９(１９７８)〕によって記載された方法によってＤ
Ｃ５株の細胞を増殖させ、形質転換用に調製する。酵母
プロトプラストを、別々に、pＲＩＴ１０６７３ １０
μgおよびpＲＩＴ１０６７４ １０μgと共にインキュ
ベートし、形質転換体をロイシン欠損再生寒天培地中で
選択する。再生寒天培地中で増殖したコロニーを回収
し、０.６７５％アミノ酸欠損酵母窒素基本培地、２％
グルコース２％寒天および８０μg／mｌヒスチジンを含
有する固体培地上に画線塗抹し、３０℃で増殖させる。
ＤＣ５株の１コロニーはpＲＩＴ１０６７３で形質転換
され、これをサッカロミセス・セレビシアエ株ＤＣ５(p
ＲＩＴ１０６７３)と命名する。もう１つのコロニーはp
ＲＩＴ１０６７４で形質転換され、これをサッカロミセ
ス・セレビシアエ株ＤＣ５(pＲＩＴ１０６７４)と命名
する。 【００２９】ＤＣ５(pＲＩＴ１０６７３)株およびＤＣ
５(pＲＩＴ１０６７４)株の培養物を８０μg／mｌヒス
チジン加酵母窒素基本培地中で、６２０μmにおいて０.
３３〜１.０の光学密度が得られるまで増殖させる。Ｄ
Ｃ５(pＲＩＴ１０６７４)株は調節域に対して正しくな
い方向で融合されたＨＢsＡgコード付け配列を含んでい
るので陰性対照として有用である。細胞を遠心分離によ
り回収し、リン酸塩緩衝食塩水(ＰＢＳ)で洗浄し、１m
Ｍフッ化フェニルメチルスルホニル(ＰＭＳＦ)加ＰＢＳ
５mｌ中に２０〜１６０倍濃度で再懸濁させる。細胞
を、フレンチ・プレッシャーセル( Ｆrench Ｐressure
Ｃell)に１２０００psi(８３ＭＰa)で２回通過させて破
壊し、溶解質を７７００×Ｇで１５分間、ついで３００
００×Ｇで３０分間遠心分離する。上澄液を回収し、マイ
レックス(Ｍillex)ＧＶメンブラン上で濾過する。上澄
液における特異抗−ＨＢsＡg抗体と反応する蛋白の存在
を、Ａusria（登録商標）ラジオイムノアッセイ法によ
りテストする。このようにして調製されたサッカロミセ
ス・セレビシアエ株ＤＣ５(pＲＩＴ１０６７３)の清澄
細胞抽出物はＰＢＳで１６〜２５６倍に希釈してテスト
した場合でも陽性反応を与え、一方、ＤＣ５(pＲＩＴ１
０６７４)株抽出物は、抗−ＨＢsＡg抗体と反応する蛋
白の存在に関するこの分析では陰性であった。 【００３０】Ｂ．サッカロミセス・セレビシアエ株１c
１６９７d サッカロミセス・セレビシアエ株１c１６９７dはヨーロ
ッパ特許条約およびブダベスト条約に従ってアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに１９８２年６月
２日に寄託番号ＡＴＣＣ２０６３１として寄託されてい
る。前記の方法を用い、アルギニン栄養緩徐株１c１６
９７d(argＪ±、leu２〜１)をpＲＩＴ１０６７３およびp
ＲＩＴ１０６７４で形質転換させる。該栄養緩徐株のロ
イシン非依存性コロニーの１つをpＲＩＴ１０６７３で
形質転換させ、サッカロミセス・セレビシアエ株１c１
６９７d(pＲＩＴ１０６７３)と命名する。もう１つのロ
イシン非依存性コロニーを、pＲＩＴ１０６７４で形質
転換させサッカロミセス・セレビシアエ株１c１６９７d
(pＲＩＴ１０６７４)と命名する。１c１６９７d(pＲＩ
Ｔ１０６７３)株および１c１６９７d(pＲＩＴ１０６７
４)株の培養物を２０μg／mｌアルギニン補足酵母窒素
基本培地中で増殖させる。細胞を回収し、細胞抽出物を
前記と同様にして調製する。１c１６９７d(pＲＩＴ１０
６７３)株の清澄細胞抽出物は、１／２０４８まで希釈
してもＡusria（登録商標）ラジオイムノアッセイにお
いて陽性の結果を示すが、１c１６９７d(pＲＩＴ１０６
７４)株の抽出物では、この分析において一様に陰性で
あった。これらの結果から、ＤＣ５株およびpＲＩＴ１０
６７３で形質転換された１c１６９７d株の酵母細胞は、
ＨＢsＡg決定子を有する融合蛋白の形態でＨＢsＡgを特
異的に合成すると結論づけられる。 【００３１】実施例８ サッカロミセス・セレビシアエ株１c１６９７d(pＲＩＴ
１０６７３)からのＨＢsＡgによるウサギの免疫法 サッカロミセス・セレビシアエ株１c１６９７d(pＲＩＴ
１０６７３)を６２０μmにおける光学密度が０.６０と
なるまで増殖させ、遠心分離によって採集する。細胞を
１mＭ ＰＭＳＦ加ＰＢＳ中に４０倍濃度で再懸濁す
る。清澄細胞抽出物を実施例７に記載の方法に従って調
製する。同様にして、１c１６９７d(pＲＩＴ１０６７
４)株の清澄細胞抽出物を調製する。これらの抽出物を
ウサギの免疫付与に用いる。６匹のウサギからなる第１
群には、フロインド完全アジュバント１mｌと混合した
１c１６９７d(pＲＩＴ１０６７３)株抽出物１mｌを非経
口的注入で第０、９、１５、３０および３７日目に与え
る。３匹のウサギからなる第２群には、フロインド完全
アジュバント１mｌと混合した１c１６９７d(pＲＩＴ１
０６７４)株抽出物１mｌ非経口的注入で同じ日に与え
る。両群から第０(免疫付与前)、２３、５１、および６
５日目に、また、第１群からは第４４日目にも血清を採
取し、Ａusab（登録商標）ラジオイムノアッセイを用い
て抗−ＨＢsＡg抗体の存在をテストした。これらの結果
を第１表に示す。これらの結果は、１c１６９７d(pＲＩ
Ｔ１０６７３)株からの抽出物の注入を受けた６匹のウ
サギのうち４匹がＨＢsＡgに対する抗体を生じたことを
示している。１c１６９７d(pＲＩＴ１０６７４)株から
の抽出物の注入を受けた３匹の対照のウサギはいずれも
抗−ＨＢsＡg抗体産生の形跡を示していない。これらの
結果から、１c１６９７d(pＲＩＴ１０６７３)株抽出物
はＨＢsＡgを含み、重篤な副作用なしにヒトにおけるＨ
ＢＶ感染に対する保護を惹起するためのワクチンに用い
ることができると結論される。 【００３２】 【表１】 【００３３】実施例９ arg３調節域を含有するpＭＣ２００からのプラスミド、
pＲＩＴ１０７４９の調製 精製pＭＣ２００をＨincIIで消化し、１０％アクリルア
ミドゲル上で電気泳動にかける。arg３調節域を含有す
る１９４０bpフラグメントを電気溶出およびエタノール
沈澱によって該ゲルより回収する。該フラグメント約４
μgを１２.５mＭ ＭgＣl2、１２.５mＭ ＣaＣl2、２
００mＭ ＮaＣl、１mＭ ＥＤＴＡおよび２００mＭト
ロメタミン−ＨＣlを含有する緩衝液(pＨ８.０)１００
μｌ中でＢal３１エキソヌクレアーゼ０.２単位と共に
３０℃にて１〜３秒間インキュベートする。該処理ＤＮ
Ａをフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させる。そ
の１μgをデオキシヌクレオチド三リン酸塩の存在下で
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートしていず
れもの１本鎖端部を修復し、ついで、ＥcoＲＩエンドヌ
クレアーゼで消化する。この方法で、Ｂal３１による切
除により種々の長さのＤＮＡフラグメントが産生され
る。各フラグメントは一端に固定したＥcoＲＩ延長部を
有し、もう一つの端部は元のＨincII部位およびＯＣＴ
蛋白開始コードンからいくらかの距離を置いて位置した
鈍化端(blunt end)となっている。arg３調節域を含有す
る約１４８０bpのフラグメントを７.５％アクリルアミ
ドゲル上で電気泳動、ついで、電気溶出およびエタノー
ル沈澱に付して単離する。このカットバック調節域は、
以下の実施例１０に記載されるように、ＯＣＴアミノ酸
配列を欠く蛋白合成に先立つ転写をプロモートすること
ができるので好ましい。 【００３４】第２の一連の反応では、pＭＣ２００をＸb
aIで消化し、５'−１本鎖端部をＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸塩と共にインキ
ュベートして詰込むか、鈍化端とする。このＤＮＡをＥ
coＲＩで消化し、３'からＸbaI部位までに位置する酵母
ＤＮＡ配列と、pＢＲ３２２を含む約５７００bpの大き
なＥcoＲＩ−Ｔ４／ＸbaIフラグメントを電気泳動、電
気溶出およびエタノール沈澱によって精製する。このフ
ラグメントを該１４８０bpプロモーター含有フラグメン
トと混合し、これに結紮する。該結紮混合物をイー・コ
リＫ１２株ＭＭ２９４のコンピテント細胞を形質転換す
るのに用いる。形質転換体をアンピシリン寒天培地上で
選択する。プラスミドＤＮＡをビルンボイム〔Ｂirnboi
m etal.,Ｎucl．Ａcid．Ｒes.,Ｖol.７,１５１３、(１９
７９)〕の記載した方法によって形質転換体コロニーよ
り単離し、ＸbaIでの消化によってＸbaI部位の存在につ
いてスクリーニングする。ＸbaI部位は、第２の一連の
反応からのフラグメント上の詰込まれたＸbaI部位が、
ＸbaI認識配列であるＴＣＴＡＧＡを新しい位置で復元
させるように、３'Ｔ残基で終わる第１の一連の反応か
らのもう１つのフラグメントに結紮しているプラスミド
にのみ存在している。ＸbaI部位を有するプラスミドをp
ＲＩＴ１０７４９と命名した。これらの操作を示すフロ
ーシートを図６に示す。イー・コリＫ１２株ＭＭ２９４
(pＲＩＴ１０７４９)は、ヨーロッパ特許条約およびブ
ダペスト条約に従ってアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション(アメリカ合衆国メリイランド州、ロッ
クビル)に、１９８２年６月２日付で寄託番号ＡＴＣＣ
３９１３３として寄託されている。 【００３５】pＲＩＴ１０７４９の試料をＢstＥIIおよ
びＸbaIの組合せで消化する。切除されたarg３調節域の
サイズは、ＢstＥIIおよびＸbaIで同様に消化されたpＭ
Ｃ２００との比較により、また、フックら〔Ｆuchs et
al.,Ｇene,Ｖol.４,１(１９７８)〕によって記載されて
いるファージφx１７４ＤＮＡフラグメントの公知の分
子量を参照することにより約２１０bpと算定された。p
ＲＩＴ１０７４９のＢstＥII−ＸbaIフラグメントのＤ
ＮＡ配列を決定するため、プラスミドＤＮＡをＢstＥII
で消化し、交換キネーションによってγ−32Ｐ−ＡＴＰ
で標識し、ついで、ＢamＨIエンドヌクレアーゼで消化
して２０００bpフラグメントを遊離させ、電気溶出およ
びエタノール沈澱によって精製する。標識フラグメント
のＤＮＡ配列化はマキサムら〔Ｍaxam et al., Ｍetho
ds in Ｅnzymology,Ｖol.６５,４９９,(１９８０)〕に
よって記載された化学的修飾法に従って行なわれる。こ
の配列の１部分は、 ＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＴＧＴＡＣＡＣＴＣＧＴＣＴＡＧＡ と決定された。アンダーラインを施したヌクレオチド
は、５７００bp ＥcoＲＩ−Ｔ４／ＸbaIフラグメント
から誘導される。図４に示すＤＮＡ配列の相当区域と比
較すると、修復されたＸbaI部位が、pＭＣ２００酵母Ｄ
ＮＡ挿入物における元のＨincII部位のヌクレオチド９
個上流の５'非翻訳先端域中に位置することがわかる。 【００３６】実施例１０ pＲＩＴ１０７４９をpＲＩＴ１０６０１と組合わせるこ
とによる、ＨＢsＡgおよび調節域を含有するプラスミ
ド、pＲＩＴ１０７５９およびpＲＩＴ１０７６１の調製 pＲＩＴ１０６０１をＨhaIエンドヌクレアーゼで消化
し、７.５％アクリルアミドゲル上で電気泳動に付す。
１１００bpフラグメントを電気溶出およびエタノール沈
澱によって回収する。このフラグメントの一部のＤＮＡ
配列は、ピーターソンら〔Ｐeterson et al.,Ｖiral Ｈ
epatitis,Ｇ.Ｎ.Ｖyas,Ｓ.Ｎ.Ｃohen andＲ.Ｓchmid.Ｅ
ds.,Ｆranklin Ｉnstitute Ｐress,Ｐhiladelphia,Ｕ.
Ｓ.Ａ.(１９７８,Ｐ５６９)によって記載されているよ
うな、ayw抗原型ＨＢsＡgの公知のＮ−末端アミノ酸配
列に対応する配列を含有する。該フラグメントは、５'
〜ＨＢsＡg開始コードンに位置する６個のヌクレオチ
ド、完全なＨＢsＡgコード付け配列および約３９０個の
３'非翻訳ヌクレオチドを含有する。プラスミドpＲＩＴ
１０７４９のＤＮＡをＸbaIで消化し、該ＤＮＡ約４０
０ngを精製ＨhaIフラグメント約２８０ngと混合する。
該混合物を２０mＭトロメタミン−ＨＣl、１０mＭ Ｍg
Ｃl2,１mＭジチオトレイトールならびにdＡＴＰ、dＣＴ
Ｐ、dＧＴＰおよびdＴＴＰ各３３mＭを含有する緩衝液
(pＨ７.５)２０μｌ中で３７℃にて３０分間Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ０.５単位と共にインキュベートする。該
反応混合液に１mＭＡＴＰ２.５μｌ,１０mＭ ＥＤＴＡ
２.５μｌおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ２μｌ(２単位)を
加え、該混合液を１５℃にて１６時間インキュベートす
る。 【００３７】該結紮混合物をイー・コリＫ１２株ＭＭ２
９４のコンピテント細胞を形質転換するのに用い、アン
ピシリン耐性形質転換体を選択する。プラスミド調製物
をいくつかのこれらの形質転換体より作り、制限エンド
ヌクレアーゼ消化およびゲル電気泳動により分析した。
その結果は鈍化端ＨＢＶフラグメントがＸbaI消化pＲＩ
Ｔ１０７４９中に両方の可能な方向で挿入されているこ
とを示している。このようなプラスミドの１つ、pＲＩ
Ｔ１０７６１はarg３プロモーターからＨＢsＡg配列を
転写するための正しい方向の１１００bp挿入物を含み、
ＢstＥIIおよびＸbaIによる連続的消化により２７１bp
フラグメントを生ずる。このpＲＩＴ１０７６１を図７
に示す。第２のプラスミド、pＲＩＴ１０７５９は正し
くない方向で挿入物を包含し、ＢstＥIIおよびＸbaIエ
ンドヌクレアーゼの組合わせで消化すると、１１７５bp
と算定されるフラグメントを生ずる。pＲＩＴ１０７６
１について、arg３調節域−ＨＢsＡg挿入接合部におけ
るヌクレオチドの配列を、γ−32Ｐ−ＡＴＰによるＸba
I末端の交換キネーション標識付けの後、マキサムら
〔Ｍaxam et al., Ｍethods in Ｅnzymology,Ｖol.６
５,４９９(１９８０)〕の化学的修飾法を用いて２７１b
p ＢstＥII−ＸbaIフラグメントを配列化することによ
り決定する。arg３調節域−ＨＢsＡg接合部に対して決
定された配列はＴＡＣＡＣＴＣＧＴＣＴＡＣＴＧＡＡＣ
ＡＴＧである。ＸbaI制限部位がＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼによって完全には修復されず、グアニン残基１つを欠
失していることがわかる。該arg３非翻訳先端部にはＨ
ＢＶ起源の６個のヌクレオチド、ＣＴＧＡＡＣが直接続
き、さらにＨＢsＡg開始コードン、ＡＴＧおよびＨＢs
Ａg構造遺伝子のコード付け配列が続いている。ＨＢsＡ
g開始コードンはarg３プロモーターの下流にある最初の
開始コードンである。そのため、該ＤＮＡから転写され
たmＲＮＡの翻訳はそのコードンで開始され、合成され
たＨＢsＡgは異質アミノ残基を欠失することになる。合
成されたＨＢsＡgは融合蛋白ではなく、ＨＢsＡg標品と
構造的に本質的に同じものである。 【００３８】実施例１１ pＲＩＴ１０７６１をＹＥp１３ＨindIIIと組合わせるこ
とによるプラスミドpＲＩＴ１０７６４およびpＲＩＴ１
０７６５の調製 pＲＩＴ１０７６１およびpＲＩＴ１０７５９を別々にＰ
stIおよびＢamＨIで消化してpＢＲ３２２レプリコン部
分を破壊し、ついでＨindIIIで消化して挿入されたＨＢ
Ｖ ＤＮＡおよび調節域を担持するＤＮＡフラグメント
を遊離させる。該ＤＮＡをフェノールで抽出し、エタノ
ールで沈澱させ、０.０１Ｍトロメタミン−ＨＣlおよび
０.００１Ｍ ＥＤＴＡを含有する緩衝液(pＨ７.５)に
溶解する。各ＤＮＡ調製物の０.６μgを前記と同様な方
法で調製されるＹＥp１３ＨindIIIのＨindIII消化、ア
ルカリ性ホスファターゼ処理ＤＮＡ０.３μgと混合し、
該混合物を結紮する。該結紮混合物をイー・コリＫ１２
株ＭＭ２９４のコンピテント細胞の形質転換に用い、ア
ンピシリン耐性形質転換体を選択する。１つの形質転換
体は、pＲＩＴ１０７６１由来のＨindIIIフラグメント
をＹＥp１３ＨindIII上に挿入してなるプラスミドpＲＩ
Ｔ１０７６４を含有することが示された。また、別の形
質転換体はpＲＩＴ１０７５９由来ＨindIIIフラグメン
トをＹＥp１３ＨindIII上に挿入してなるプラスミドpＲ
ＩＴ１０７５９を含有することが示された。pＲＩＴ１
０７６１およびpＲＩＴ１０７６４の調製フローシート
を図７に示す。 【００３９】実施例１２ pＲＩＴ１０７６４およびpＲＩＴ１０７６５による酵母
の形質転換 pＲＩＴ１０７６４およびpＲＩＴ１０７６５を実施例１
１で調製された形質転換体の培養物よりＣsＣl−臭化エ
チジウム密度グレジエント遠心分離法によって単離し、
各１０μgを実施例７に記載の方法により酵母株１c１６
９７dの細胞を形質転換するのに用い、再生寒天培地上
でロイシン−非依存性形質転換体を選択する。これらの
形質転換から生ずるロイシン−非依存性コロニーを菌株
１c１６９７d(pＲＩＴ１０７６４)と命名する。もう１
つの形質転換体をサッカロミセス・セレビシアエ株１c
１６９７d(pＲＩＴ１０７６５)と命名する。これらの菌
株の培養物を２％グルコースおよび２０μg／mｌアルギ
ニン補足酵母窒素基本培地中で６２０μmにおける光学
密度が０.８０〜０.８８となるまで増殖させる。細胞を
集め、細胞不含抽出液を調製し、実施例７に記載される
ようにＡusria（登録商標）ラジオイムノアッセイによ
りＨＢsＡgについて分析する。１c１６９７d(pＲＩＴ１
０７６４)の抽出物は、ＰＢＳによる希釈度が１／１０
２４まででもこの分析において陽性の結果を示すが、１
c１６９７d(pＲＩＴ１０７６５)株は非希釈抽出物でも
この分析において一様に陰性であった。遺伝学およびラ
ジオイムノアッセイの結果より、サッカロミセス・セレ
ビシアエ株１c１６９７d(pＲＩＴ１０６７４)の細胞
は、ヒトにおけるＨＢＶ感染に対する保護を重篤な副作
用なしで惹起するためのワクチンに使用できるＨＢsＡg
を合成すると結論される。
用いることによる酵母におけるＢ型肝炎表面抗原をコー
ドする遺伝子のクローニングおよび該酵母が産生する抗
原からの肝炎Ｂ型ウイルスワクチンの製造に関する。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】肝炎
Ｂ型ウイルス(ＨＢＶ)による感染症は重く、広範囲にわ
たる健康上の問題である。感染症は急性または慢性の様
相で発現する。米国における急性肝炎の症例数は少なく
とも１年につき１０万件であり、致死率が１〜２％と見
積られている。米国においては、健常成人中の慢性保菌
者の蔓延率は年令、社会的階級により、０.１〜１％の
間で変化している。南アメリカでは、慢性保菌者の蔓延
率は約１〜３％、ソ連および南ヨーロッパでは、約３〜
６％、アジアおよびアフリカでは１０％以上である。発
達した国々では、血液を取扱う医療部署の患者および要
員、軍要員、慢性保菌者の配偶者、高ＨＢＶ風土地域へ
の旅行者、慢性保菌者の新生児、ホモセックスの人、売
春婦および麻薬常用者のようなウイルス接触の高い危険
性のある人々のためのワクチンの要求が存在する。第三
世界の国々においては大衆免疫付与のための安価なワク
チンの要求が存在する。大衆免疫付与計画は急性肝炎の
発生や慢性保菌者が留ることに究極的に影響するばかり
でなく、慢性活性肝炎および肝細胞癌の罹病率および死
亡率も減少させることができる。 【０００３】肝炎Ｂ型のビリオンであると考えられ、感
染患者から単離できるデーン(Ｄane)粒子は約４２nmの
径を有する。各々、肝炎Ｂ型表面抗原(ＨＢsＡg)からな
る外皮、キャプシド(ＨＢcＡg)、内生ポリメラーゼおよ
びＤＮＡゲノムから構成されている。該ゲノムは環状
で、約２００の塩基からなる１本鎖域を有する２本鎖で
ある。該１本鎖域はinvitroで該内生ポリメラーゼの作
用によって詰込み(fill in)を行なうことができる。よ
り長い鎖は約３２００の塩基を含有する。組織培養中で
ＨＢＶを増殖させるのが困難であることが示されてお
り、また、唯一公知の宿主がヒトであるため、従来、Ｈ
ＢＶワクチンを製造することは困難であった。感染した
ヒトから少量のＨＢＶ抗原標品が単離されている。エフ
・デイ・シイ・レポーツ(Ｆ−Ｄ−Ｃ Ｒeports.pp.３〜
４,Ｊuly１９,１９８２)には最近開発されたＢ型肝炎ワ
クチンの臨床研究の報文が掲載されている。 【０００４】バレンツエラら〔Ｖalenzuela et al.,Ｎa
ture,Ｖol.２９８,３４７〜３５０(１９８２)〕は表現
ベクターを用いた酵母におけるＨＢsＡgの合成を報告し
ており、それでは該ＨＢsＡgコード付け配列が８３５bp
のＴaql−Ｈpalフラグメントで、プロモーターが該酵母
アルコール・デヒドロゲナーゼI．プロモーターであ
る。この文献より以前にいくつかの簡単な研究報文があ
る。これらは、酵母アルコール・デヒドロゲナーゼ・プ
ロモーター域に結紮されているＨＢsＡgに類似した蛋白
をコードする配列を含むＤＮＡフラグメントの酵母にお
ける表現を報告しているバレンツエラらの報文〔Ｖalen
zuela et al.,Ａrch．Ｂiol．Ｍed．Ｅxp．(Ｃhile),Ｖ
ol.１４(１),２１〜２２(１９８１)〕、ピイ・バレンツ
エラおよびダブリュウ・ジェイ・ルッター(Ｐ.Ｖalenzu
ela and Ｗ．Ｊ．Ｒutter)を含む米国の研究チームが酵
母における「蛋白−被膜周囲肝炎Ｂ型ウイルス」の産生を
発表したと報じているスクリップ中の報告〔Ｓcrip Ｎ
o.６１６,p.１４(Ａug.１２,１９８１)〕およびダブリ
ュウ・ジェイ・ルッター(Ｗ．Ｊ．Ｒutter)が酵母細胞
におけるグリコシル化ＨＢsＡgの表現を報告したと報じ
ているツカーマンの報文〔Ｚuckerman, Ｎature,Ｖol.
２９５、９８〜９９(１９８２)〕である。 【０００５】ＨＢsＡgのようなＨＢＶの抗原性成分は該
抗原をコードする遺伝子を含む組換型ＤＮＡ分子を挿入
した細菌中で製造されてきた。バーレルら〔Ｂurrell e
t al.,Ｎature,Ｖol.２７９,Ｎo.５７０８,４３〜４７
(１９７９)〕はプラスミドpＢＲ３２２中でクローンし
たＨＢＶ ＤＮＡ配列のイー・コリ(Ｅ.coli)ＨＢ１０
１株における表現を報告している。ヨーロッパ特許出願
第１３８２８号において、マレーら(Ｍurray et al．)
は、イー・コリＨＢ１０１株において、ＨＢsＡgを含め
て、ＨＢＶ抗原をコードできる組換型ベクターの製造を
開示している。このベクターはデーン粒子ＤＮＡおよび
プラスミドpＢＲ３２２から製造される。マレーらは、
有用な宿主には他の細菌宿主、酵母および他の真菌、動
物または植物細胞およびその他の宿主が包含されうると
述べているが、示されている唯一の宿主はイー・コリで
ある。チャーネイら〔Ｃharney et al.,Ｎature,Ｖol.
２８６,８９３〜８９５(１９８０)〕はβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子と該ＨＢsＡg構造遺伝子の融合物を有する
バクテリオファージの構造を報告している。該バクテリ
オファージはＨＢsＡgおよびβ−ガラクトシダーゼ両方
の抗原性決定子からなる融合蛋白の合成を命令する。 【０００６】英国特許出願第２０３４３２３号におい
て、チオライスら(Ｔiollais et al)はＨＢＶ ＤＮＡ
を含有するコリファージの製造を開示している。融合フ
ァージ−ＨＢＶ ＤＮＡがイー・コリＣ６００株中に形
質転換されている。最初にＰＣＴ出願ＷＯ８１／００５
７７号として公開された英国特許出願第２０７０６２１
号には、ＨＢsＡg遺伝子の一部、プロモーターおよびラ
クトース・オペロンのＺ遺伝子からなり、イー・コリ中
でクローンできるプラスミドが開示されている。ヨーロ
ッパ特許出願第２０２５１号においてルッターら(Ｒutt
er et al)はプラスミドpＢＲ３２２およびＨＢＶ ＤＮ
ＡのＢamＨIフラグメントからなり、イー・コリの形質
転換に使用できる組換型ベクターを包含する組換型ベク
ターを開示している。ＨＢＶ ＤＮＡのＢamＨIフラグ
メントおよびトリプトファン・オペロンの一部からなる
他のベクターがイー・コリＨＢ１０１株における表現を
得るために使用された。エドマンら〔Ｅdman et al．,
Ｎature,Ｖol.２９１,Ｎo.５８１５,５０３〜５０６(１
９８１)〕はトリプトファン・オペロン調節域の調節の
下、イー・コリにおいてＨＢcＡgおよびβ−ラクタマー
ゼ−ＨＢsＡg融合蛋白の合成を命令するプラスミドの構
造を記載している。 【０００７】ＨＢＶ ＤＮＡの細菌中への挿入を開示し
た他の文献にはチャーネーらの文献〔Ｃharnay et al.,
Ｐrog．Ｍed．Ｖirol．,Ｖol.２７,８８〜９２(１９８
１)〕、マツケイらの文献〔Ｍackay et al．,Ｐroc．Ｎ
atl．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.,Ｖol.７８,Ｎo.７,４５１０
〜４５１４(１９８１)〕、フリッチエら〔Ｆritsch eta
l.,Ｃ．Ｒ．Ａcad．Ｓci.,Ｖol.２８７,Ｎo．１６,１４
５３(１９７８)〕、英国特許明細書第２０３４３２３号
(Ｄerwent Ｎo.４６８７４Ｃ)およびパセクらの文献
〔Ｐaseket al．,Ｎature,Ｖol.２８２,Ｎo.６,５７５
(１９７９)〕が包含される。ＨＢＶ ＤＮＡは哺乳動物
細胞中でもクローンされている。これらには、ヒト、マ
ウスおよびヒト肝癌細胞系が包含される。例えばデュボ
イスら〔Ｄubois etal．,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．
Ｕ.Ｓ.,Ｖol.７７,Ｎo.８,４５４９〜４５５３(１９８
０)〕はマウス細胞のＨＢＶゲノム含有プラスミドによ
る形質転換およびＨＢsＡgの表現を報告している。ヒル
シュマンら〔Ｈirschman et al.,Ｐroc．Ｎatl．Ａca
d．Ｓci．Ｕ.Ｓ.,Ｖol.７７,Ｎo.９,５５０７〜５５１
１(１９８０)〕はＨＢＶ ＤＮＡで形質転換させたＨe
Ｌa細胞によるＨＢＶ様粒子の産生を報告している。 【０００８】ヒト血液からのＨＢsＡgを用いるＨＢＶワ
クチンの製造法がフナコシら〔Ｆunakashi et al., Ｐr
og．Ｍed．Ｖirol.,Ｖol.２７,１６３〜１６７(１９８
１)〕およびマウパスら〔Ｍaupas et al.,Ｐrog．Ｍe
d．Ｖirol.,Ｖol.２７,１８５〜２０１(１９８１)〕に
より報告されている。フナコシらによって製造されたワ
クチンは４０μgの精製したホルマリン処理ＨＢsＡg、
リン酸塩、塩化ナトリウム、２０ｍｇのマンニトールお
よびアジュバントとして０.１％の水酸化アルミニウム
を含有する。後者の報文において、マウパスらはワクチ
ンの１投与量が２〜１０μg／mｌの蛋白〔ローリー(Ｌo
wry)法〕および０.１％の水酸化アルミニウムを含有す
る精製したホルマリン処理ＨＢsＡg１mｌであると報告
している。マウパスらによって報告された研究で用いた
方法では１ケ月間隔で３回注射し、１年後に１回ブース
ターを要求しており、マウパスらは３ケ月間隔で２回濃
ＨＢsＡgの注射を提案している。ＨＢＶワクチン製造に
ついての他の文献にはヘパチテイスＢワクチンＩＮＳＥ
ＲＭシンポジウム(Ｈepatitis Ｂ Ｖaccine ＩＮＳＥＲ
Ｍ Ｓymposium Ｎo.１８,edit．by Ｍaupas and Ｇu
esry,１９８１,Ｅlsevier／Ｎorth−ＨollandＢiomedic
al Ｐress)の、各々、３、３７および５７頁のマウパ
スら、アダモビツツら(Ａdamowiczet al)およびフナコシ
らのものが包含される。酵母は他のある種のＤＮＡ配列
の宿主生物として使用されている。例えば、英国特許出
願第２０６８９６９号において、フレーザーら(Ｆraser
et al)は酵母におけるニワトリ・オバルブミンの製造
を開示している。スクリップ６４０号〔ＳcripＮo.６４
０,Ｐ１１(Ｎov.４,１９８１)〕はあるタイプのインタ
ーフエロンが酵母中で製造される旨の報告を包含してい
る。ヨーロッパ特許第１１５６２号(Ｄerwent Ｎo.３８
７６２Ｃ)では、２μプラスミド中にura３+酵母遺伝子
を含有するハイブリッド酵母プラスミドが報告されてい
る。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明は、ＨＢsＡgをコ
ードできるヌクレオチド配列および酵母、サッカロミセ
ス・セレビシアエ(Ｓaccharomyces cerevisiae)におい
て該ＨＢsＡg配列の転写を行なうことのできる酵母arg
３遺伝子から誘導された調節域からなる組換型ＤＮＡ分
子の製法に関する。該分子は該ＨＢsＡg配列および該調
節域が挿入されたベクターを含有し、該ベクターは酵母
ベクターの製造または該ＨＢsＡgおよび調節域の保存に
使用できる。本明細書においては、該プラスミドで形質
転換された微生物のような該組換型ＤＮＡ分子を含有す
る微生物も記載する。本発明はまた、ＨＢsＡg配列のよ
うなコード付け配列挿入のためのarg３調節域およびそ
れに隣接する制限部位を有し、該コード付け配列の表現
によって合成された蛋白が異質アミノ酸残基を欠くよう
になるプラスミドも包含する。また、本発明には、本発
明によって製造されたＨＢsＡgのワクチン有効量および
適当な担体からなるヒトにおけるＨＢＶ感染に対する保
護惹起用のワクチンも包含される。さらに、本発明は、
該組換型ＤＮＡ分子および該分子を含有する微生物の製
法ならびにＨＢsＡgおよびＨＢsＡg含有ワクチンの製法
も包含する。 【００１０】 【発明の実施の態様】添付図面中、図１はpＲＩＴ１０
６０１の制限エンドヌクレアーゼ開裂地図である。図２
はpＲＩＴ１０６０６の制限エンドヌクレアーゼ開裂地
図である。図３はpＭＣ２００の制限エンドヌクレアー
ゼ開裂地図である。図４はpＭＣ２００における３３０
０bp ＨindIII酵母ＤＮＡ挿入物の一部分のヌクレオチ
ド配列で、この部分にはＨincII、ＢglIIおよびＥcoＲI
部位が含まれている。図５はpＲＩＴ１０６７１およびp
ＲＩＴ１０６７３の製造を示すフローシートである。図
６はpＲＩＴ１０７４９の製造を示すフローシートであ
る。図７はpＲＩＴ１０７６１およびpＲＩＴ１０７６４
の製造を示すフローシートである。 【００１１】本発明の組換型ＤＮＡ分子は、ＨＢsＡg用
の構造遺伝子を含むヌクレオチド配列を、酵母において
該ＨＢsＡg配列の転写を命令でき、それにより、その表
現が行なうことのできる酵母arg３調節域と融合させる
ことにより製造される。本明細書において、「組換型Ｄ
ＮＡ分子」なる語は該ＨＢsＡgコード付け配列および該
調節域を含有するＤＮＡフラグメントならびにプラスミ
ドまたはファージ・ベクターのような該フラグメントを
含む他のＤＮＡ分子を意味する。「調節域」なる語はプロ
モーター域および転写に必要な他の配列を含む配列を意
味する。該酵母arg３調節域は、それがＨＢsＡgコード
付け配列表現用の強力なプロモーターとなることができ
るので、特に有利である。「ＨＢsＡg」なる語は構造的に
ＨＢsＡg標品と同じであるか、ＨＢsＡg標品と実質的に
同じ抗原性決定子を有する蛋白、すなわち、ＨＢsＡg標
品を特異的に認識し、それと反応する抗体の生成を惹起
することができるか、抗ＨＢsＡg抗体によって特異的に
認識される蛋白を意味する。 【００１２】該ＨＢsＡgコード付け配列は、感染したヒ
ト血清中のデーン粒子より抽出したＤＮＡから、ＤＮＡ
ポリメラーゼ、好ましくは、内生ポリメラーゼで１本鎖
域に詰込み、ついで、制限エンドヌクレアーゼで消化す
ることにより単離できる。エンドヌクレアーゼの選択
は、部分的に、実際に用いるデーン粒子に依存する。例
えば、後記の実施例で示すように、adw抗原型のある種
のデーン粒子のＨＢＶＤＮＡのＨＢsＡgコード付け配列
は単一のＢamＨIフラグメント上で単離でき、ayw抗原型
のある種のデーン粒子のＨＢＶ ＤＮＡのＨＢsＡgコー
ド付け配列はＨhaIフラグメント上で単離できる。同じ
抗原型のデーン粒子のＨＢＶ ＤＮＡが制限部位の異な
ったパターンを示すこともある。本発明で用いるＤＮＡ
フラグメントを製造するためのＤＮＡの制限、本発明で
用いる組換型ＤＮＡ分子製造のためのかかるフラグメン
トの結紮および微生物への挿入は前記の、また、後記す
る文献に開示されている技法のような、公知の技法によ
って行なわれる。条件はＤＮＡおよび酵素の変性をさけ
るように選択する。例えば、pＨは約７.０〜１１.０に
保持するように緩衝され、温度は約６０℃以下に保つ。
好ましくは、制限は約３０〜４０℃で行ない、結紮は約
０〜１０℃で行なう。本発明の実施に用いる制限酵素お
よびリガーゼは商業的に入手でき、それに付されている
指示に従って使用すべきである。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
が好ましいリガーゼである。 【００１３】調節域へのＨＢsＡg配列の融合は後記の実
施例に示すような中間ベクターの使用によって行なうこ
とができる。別法として、ＨＢsＡg配列は、調節域を含
むベクター中に直接挿入することができる。ベクターは
本発明のＤＮＡフラグメントを担持し、保持できるＤＮ
Ａで、例えば、ファージやプラスミドを包含する。ファ
ージ中でＤＮＡフラグメントをクローンする技法は、例
えば、チャーネーら〔Ｃharnay et al.,Ｎature,Ｖol.
２８６,８９３〜８９５(１９８０)〕および英国特許出
願第２０３４３２３号(Ｔiollais)によって開示されて
いる。好ましくは、ＨＢsＡg配列は調節域に対して、Ｈ
ＢsＡg配列の表現によって合成されたＨＢsＡgが異質ア
ミノ酸残基を持たないように位置させる。特に有用であ
ることが判明している調節域は、オルニチン・カルバモ
イルトランスフェラーゼ(ＯＣＴ)をコードする酵母arg
３遺伝子から由来するものである。このarg３調節域の
使用は、その作用が特異的および一般的調節機構の両方
に支配されるので有利である。クラビールら〔Ｃrabeel
etal., Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ., Ｖo
l.７８,５０２６(１９８１)〕によって報告されている
ように、これはプラスミドpＹe ura３arg３上で、イー
・コリ中でクローンされている。好ましい宿主は、アル
ギニン生合成経路が抑制解除されたサッカロミセス・セ
レビシアエ株、例えば、１c１６９７d株である。かかる
菌株の使用は、実施例で用いた他の菌株、ＤＣ５株と比
較して、arg３プロモーターからの表現増加をもたらせ
る。 【００１４】融合ＤＮＡフラグメントを酵母中にクロー
ンするための好ましいベクターはプロモーターＹＥp１
３で、これはイー・コリおよびサッカロミセス・セレビ
シアエの両方において複製、維持することができ、それ
故、シャトル・ベクターとして知られている。数種の他
の酵母ベクターが知られており、利用できる。ＨＢsＡg
および調節域は、順次あるいは、後記の実施例に示すよ
うに同時に酵母中に挿入できる。プラスミド・ベクター
による形質転換は、通常、本発明のＤＮＡ分子をプラス
ミドとして取込むこととなる。しかし組換現象のような
他の反応では該ＤＮＡ分子の染色体ＤＮＡ中への取込み
とすることもできる。本発明による酵母によって製造さ
れたＨＢsＡgと、適当な担体からなるヒトにおけるＨＢ
Ｖ感染に対する保護を惹起するワクチンは公知の技法に
よって製造することができる。水酸化アルミニウムのよ
うなアジュバントを使用することが望ましい。また、得
られたＨＢsＡgを他の免疫原と組合せて複合ワクチンを
製造することもできる。該ＨＢＶまたは複合ワクチン
は、例えば、皮下、静脈内または筋肉内経路で投与でき
る。本発明のＤＮＡフラグメントおよびそれによって製
造されたＨＢsＡgはまた、ＤＮＡハイブリッド形成技法
および種々のイムノアッセイによる生物試料中のＨＢＶ
検出用の探針としても用いることができる。つぎに実施
例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。実施例中、
％は、特に断らない限り重量％を意味する。 【００１５】 【実施例】 実施例１ ＨＢＶ ＤＮＡをpＢＲ３２２と組合わせることによる
中間プラスミドpＲＩＴ１０６０１の調製 ayw抗原型のＨＢsＡg陽性血清に、０.２８％の最終濃度
になるようにＣaＣl2を加えて脱繊維化し、ＳＷ２７ロ
ーター中、１０mＭトロメタミン−ＨＣl、１ＭＮaＣlお
よび１mＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液(pＨ７.５)中で調製
した１０〜２０％ショ糖グレジエント上、２７０００r.
p.mで２時間で遠心分離する。デーン粒子を含む透明な
ペレットを同じ緩衝液中に再懸濁させ、６５％ショ糖ク
ッションに重層させた緩衝２０％ショ糖上で遠心分離す
る。該クッション界面での乳白光バンドを回収し、同様
な２０〜６５％グレジエント上、２０００００×Ｇで４
時間遠心分離し、デーン粒子をペレット化する。 【００１６】Ａ．該デーン粒子を、５０mＭトロメタミ
ン−ＨＣl、１０mＭ ＭgＣl2、５００mＭ ＮaＣl、０.
５mＭジチオトライトール、各５０mＭのdＡＴＰ、dＣＴ
ＰおよびdＧＴＰならびに８μＭ32Ｐ−dＴＴＰ(３５０
Ｃi／mmole)を含有する反応混合液(pＨ８.０)に再懸濁
させ、該再懸濁粒子を３７℃で５時間イキュベートする
ことにより内生ＤＮＡポリメラーゼを用いてデーン粒子
内のＨＢＶゲノムの１本鎖域を修復する。該再懸濁液を
１０mＭトロメタミン−ＨＣl、１０mＭ ＥＤＴＡ、１０
０mＭ ＮaＣlおよび０.０２％ドデシル硫酸ナトリウム
を含有する緩衝液(pＨ７.５)で希釈してpＨ７.５とし、
３７℃にて１時間プロナーゼ０.５ｍｇ／mｌと共にイン
キュベートし、ついで、フェノール抽出およびエタノー
ル沈澱を行なう。ＢamＨI制限エンドヌクレアーゼによ
る該ＤＮＡの消化は、アガロースゲル電気泳動および該
ゲルのオートラジオグラフィーによって判定されるよう
に、約１４５０bpおよび１６００bpのサイズを有する放
射活性フラグメントを産生する。 【００１７】Ｂ．デーン粒子ＤＮＡ約３０ngを、標識し
ていないdＴＴＰの存在下、内生ＤＮＡポリメラーゼを
用いて修復し、前記と同様にして抽出、回収する。該Ｄ
ＮＡを、あらかじめＢamＨI制限エンドヌクレアーゼで
消化し、アルカリ性ホスファターゼで処理した１００ng
のプラスミドpＢＲ３２２と混合する。プラスミドpＢＲ
３２２は組換型ＤＮＡ法に通常用いられるもので、入手
の制限なしにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション(Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection)に寄託
番号３７０１７として寄託されている。該混合液をフェ
ノールで抽出し、エタノールで沈澱させ、遠心分離し、
乾燥させて、５０mＭトロメタミン−ＨＣl、１mＭＡＴ
Ｐ、１０mＭＭgＣl2、１０mＭジチオトライトール、５
０μg／mｌゼラチンおよび２単位／mｌＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを含有する混合液１２μｌ(pＨ７.５)に再懸濁させ
る。該懸濁液を１０℃で４時間インキュベートし、つい
で氷上で１８時間保持する。結紮したＤＮＡ混合物は、
コーヘンら〔Ｃohenet al., Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓc
i．Ｕ.Ｓ., Ｖol.６９,２１１０,(１９７２)〕の方法に
従って調製したイー・コリＫ１２株Ｃ６００のコンピテ
ント細胞を形質転換するのに用いられる。形質転換体を
アンピシリン２００μg／mｌを含有する固体培地上で選
択する。単離したコロニーについて、pＢＲ３２２のＢa
mＨI部位への異種ＤＮＡフラグメント挿入を示すテトラ
サイクリン耐性の欠失をスクリーニングする。このよう
な形質転換体クローンの１つがプラスミドpＲＩＴ１０
６０１を含有することが判明し、これはＢamＨＩエンド
ヌクレアーゼによる消化によって４.６０bpのpＢＲ３２
２フラグメントならびに１６００bpおよび１４５０bpの
ＨＢＶ ＤＮＡフラグメントを与えることが判明した。
イー・コリＫ１２株Ｃ６００(pＲＩＴ１０６０１)培養
物は欧州特許条約(ＥＰＣ)およびブダペスト条約に従
い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
(アメリカ合衆国メリイランド州、ロックビル)に１９８
２年６月２日付で寄託番号ＡＴＣＣ３９１３２として寄
託されている。プラスミドpＲＩＴ１０６０１の制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂地図を図１に示す。 【００１８】Ｃ．種々の制限酵素によるデーン粒子ＤＮ
ＡおよびpＲＩＴ１０６０１の消化によって生じるフラ
グメントのサイズをつぎのとおり比較した。デーン粒子
ＤＮＡ、すなわち、ＨＢＶ ＤＮＡを前記の内生ポリメ
ラーゼ反応により、または精製ＤＮＡをイー・コリ由来
のＤＮＡポリメラーゼIで処理することによって32Ｐで
標識する。標識されたＨＢＶ ＤＮＡをpＲＩＴ１０６
０１と混合し、該混合物を制限エンドヌクレアーゼで処
理し、アガロースゲル上で電気泳動にかける。該ゲルを
臭化エチジウムで染色し、紫外線光下で写真撮影してＤ
ＮＡフラグメントの位置づけをし、ついで、乾燥してオ
ートラジオグラフィーにかけ、放射活性ＨＢＶ ＤＮＡ
フラグメントの位置づけをする。つぎの標識されたＨＢ
ＶフラグメントがpＲＩＴ１０６０１フラグメントのサ
イズに正確に一致することが判明した:１４５０および
１６００bp ＢamＨIフラグメント;１３３０bp ＨpaI
フラグメント;および１１３０bp ＢamＨI−ＸhoIフラ
グメント。標識されたデーン粒子ＤＮＡはまた、サザー
ン〔Ｓouthern．Ｊ．Ｍol．Ｂiol., Ｖol.９８,５０３
(１９７５)〕の技法により、アガロースゲルからニトロ
セルロース・フイルター上に移した後、pＲＩＴ１０６
０１のＢamＨI消化によって遊離される１４５０および
１６００bpの両方にフラグメントと特異的にハイブリッ
ド形成する。これらの結果は、pＲＩＴ１０６０１上の
クローンされたＤＮＡ挿入物がＨＢＶゲノムに相当し、
pＲＩＴ１０６０１上での２つのＢamＨIフラグメントの
相対的な方向が該ビリオンにおけると同じであることを
示している。pＲＩＴ１０６０１は後記の実施例１０に
おいてpＲＩＴ１０６７１を調製するのに使われる。 【００１９】実施例２ ＨＢＶ ＤＮＡをpＡＣＹＣ１８４と組合わせることに
よる中間プラスミド、pＲＩＴ１０６１６の調製 デーン粒子を前記と同様にadw抗原型のＨＢsＡg陽性血
清から単離する。32Ｐで標識されたＨＢＶ ＤＮＡの制
限エンドヌクレアーゼ分析は該ＤＮＡが１つのＥcoＲＩ
部位を含んでいることを示した。標識されていないヌク
レオチドと用いる内生ポリメラーゼ反応によって詰込ん
だＨＢＶ ＤＮＡをＥcoＲＩで消化する。この制限ＤＮ
ＡをあらかじめＥcoＲＩで消化し、アルカリ性ホスファ
ターゼで処理したプラスミドpＡＣＹＣ１８４と混合す
る。プラスミドpＡＣＹＣ１８４は、入手の制限なしに
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託
番号３７０３３として寄託されている。該混合物をＴ４
ＤＮＡリガーゼで結紮する。この結紮ＤＮＡ混合物をイ
ー・コリＫ１２株 Ｃ６００のコンピテント細胞を形質
転換するのに用いる。形質転換体をテトラサイクリン
(１５μg／mｌ)寒天培地上で選択し、pＡＣＹＣ１８４
のＥcoＲＩの部位における挿入を示すクロラムフェニコ
ール耐性の欠失についてスクリーニングする。形質転換
コロニーは、該ＨＢＶ ＤＮＡからなる３２００bp挿入
物をＥcoＲＩ部位に有するpＡＣＹＣ１８４からなるプ
ラスミドpＲＩＴ１０６１６を含有することが判明し
た。pＲＩＴ１０６１６の制限地図を図２に示す。イー
・コリＫ１２株Ｃ６００(pＲＩＴ１０６１６)はヨーロ
ッパ特許条約およびブタペスト条約に従いアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションに１９８２年６月２
日付で寄託番号ＡＴＣＣ３９１３１として寄託されてい
る。 【００２０】実施例３ pＲＩＴ１０６１６をpＢＲ３１３と組合わせることによ
る、ＨＢsＡgをコードするヌクレオチド配列を含有する
中間プラスミド、pＲＩＴ１０６４０の調製 pＲＩＴ１０６１６をカーンら〔Ｋahn et al.,Ｍethods
in Ｅnzymology,Ｖol.６８,２６８,(１９７９)〕の記
載に実質的に従いＣsＣl−臭化エチジウム密度グレジエ
ント遠心分離法により精製する。該ＤＮＡをＢamＨIエ
ンドヌクレアーゼで消化し、プラスミドpＢＲ３１３の
ＢamＨI消化、アルカリ性ホスファターゼ処理ＤＮＡと
混合し、結紮し、実施例１の記載と実質的に同様にして
イー・コリＫ１２株Ｃ６００のコンピテント細胞を形質
転換するのに用いる。プラスミドpＢＲ３１３は、入手
の制限なしにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託番号３７０１８として寄託されている。形
質転換体をアンピシリン含有寒天培地上で選択し、pＢ
Ｒ３１３のＢamＨI部位における挿入を示すテトラサイ
クリン耐性の欠失についてスクリーニングする。形質転
換コロニーは、ＢamＨI部位に１３５０bp挿入物を有す
るpＢＲ３１３からなるプラスミド、pＲＩＴ１０６４０
を含むことが判明した。該挿入物は、ＨＢsＡgをコード
できるヌクレオチド配列である。該挿入物は推定的ＨＢ
sＡg前駆体蛋白部分および完全表面抗原をコードし、ま
た、５６５bpの３'非コード付け配列を含有する。 【００２１】実施例４ 酵母arg３遺伝子をpＢＲ３２２と組合わせることによ
る、arg３調節域を含有する中間プラスミド、pＭＣ２０
０の調製 arg３遺伝子を特定する３３００bp酵母ＤＮＡフラグメ
ントを、pＹeura３arg３をＨindIIIで消化することによ
り得る。プラスミドpＹeura３arg３については、クラビ
ールら〔Ｃrabeel et al.,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓc
i．Ｕ.Ｓ.,Ｖol.７８,５０２６,(１９８１)〕によって
記載されている。該３３００bpフラグメントをpＢＲ３
２２のＨindIII部位中にクローンし、実質的に前記と同
様にしてイー・コリＫ１２株ＭＭ２９４中に形質転換さ
せる。形質転換体をアンピシリン培地上で選択し、テト
ラサイクリン耐性についてスクリーニングする。形質転
換コロニーは、ＨindIII部位に挿入物を有するpＢＲ３
２２からなるプラスミドpＭＣ２００を含有することが
判明した。このプラスミドは、以下の実施例に記載する
ように酵母細胞においてＨＢsＡgヌクレオチド配列の転
写を行なうことのできるarg３調節域を含んでいる。イ
ー・コリＫ１２株ＭＭ２９４(pＭＣ２００)はヨーロッ
パ特許条約およびブダペスト条約に従いアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションに１９８２年６月２日
付で寄託番号ＡＴＣＣ３９１３０として寄託されてい
る。 【００２２】オルニチンカルバモイルトランスフェラー
ゼ(ＯＣＴ)のためのＮ−末端コード付け配列部分および
５'−非翻訳先端域の部分を含め、arg３遺伝子の一部の
ヌクレオチド配列は、ヒュイゲンら( Ｈuyghen et a
l., Ａrch．Ｉntl．Ｐhysical．Ｂiochem.,Ｖol.８９,
Ｂ１７２,(１９８１)〕によって決定されている。図４
にこの公知の配列の２１０bpフラグメントを示す。該２
１０bpフラグメントはpＭＣ２００中の３３００bpＨind
III酵母ＤＮＡ挿入物上に独特なＨincII、ＢglIIおよび
ＥcoＲＩ部位を含有し、該ＯＣＴ蛋白コード付け配列の
ための開始コードンは図４中の四角で囲んだＡＴＧコー
ドンと考えられる。ＨＢsＡg単独またはＨＢsＡg前駆体
とクローンしたＨＢＶ ＤＮＡ由来のＨＢsＡgをコード
する配列の酵母ＤＮＡのＨincII、ＢglIIまたはＥcoＲ
Ｉ部位への導入は遺伝子融合をもたらし、該遺伝子融合
が融合部位を越えて翻訳を継続させるための正しい方向
にある場合には、該arg３調節域から転写、翻訳された
ハイブリッド蛋白を産生するものと考えられる。 【００２３】実施例５ pＲＩＴ１０６４０をpＭＣ２００と組合わせることによ
る、ＨＢsＡgおよび調節域を含む中間プラスミド、pＲ
ＩＴ１０６７１およびpＲＩＴ１０６７２の調製 pＭＣ２００ ５μgをＢglII６.４単位で３７℃にて２.
５時間消化し、０.１Ｍグリシン、０.０１ＭＭgＣl2・６
Ｈ2Ｏおよび０.０１mＭＺnＣl2を含有する等容量の緩衝
液(pＨ１０.５)で希釈し、ウシ腸アルカリ性ホスファタ
ーゼ０.５単位と共に３７℃にて３０分間インキュベー
トし、５'末端リン酸塩残基を除去する。該混合液を緩
衝液−飽和フェノールで２回、エーテルで３回抽出す
る。ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、０.０１Ｍトロメ
タミン緩衝液(pＨ７.５)に溶解する。pＲＩＴ１０６４
０ ２５μgをＢamＨIで消化し、ＨＢＶ ＤＮＡの１３
５０bp ＢamＨIフラグメントを切除する。該１３５０b
pフラグメントを調製アガロースゲル電気泳動および電
気溶出により精製する。溶出ＤＮＡをエタノール沈澱に
より回収、濃縮し、０.０１Ｍトロメタミン緩衝液( pＨ
７.０)２０μｌ中に溶解する。ＨＢsＡgコード付け配列
を含むＢamＨIフラグメント０.３μgをＢglII消化pＭＣ
２００ ０.５μgと混合し、該混合物をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼと共にインキュベーションして結紮する。 【００２４】該結紮ＤＮＡをイー・コリＫ１２株ＭＭ２
９４のコンピテント細胞を形質転換するのに用いる。形
質転換体を２００μg／mｌアンピシリン含有寒天平板上
で選択する。アンピシリン寒天培地上で連続継代して１
２個の耐性コロニーを単離し、ビルンボイムら〔Ｂirnb
oim et al.,Ｎucl．Ａcid．Ｒes.,Ｖol.７,１５１３(１
９７９)〕により記載された方法によってプラスミドを
単離する。アガロースゲル電気泳動による分析は、すべ
てのプラスミドがＨpaIによって制限され、ＢamＨIフラ
グメントの挿入を示し、また、挿入フラグメントの両方
の方向が１２個の形質転換コロニー中にあることを示し
ている。該プラスミドはＣsＣl−臭化エチジウム密度グ
レジエント遠心分離法によって単離される。１つのプラ
スミド、pＲＩＴ１０６７１は、ＨＢsＡgコード付け配
列の転写のための正しい方向でＢglII部位に融合された
ＢamＨIフラグメントを含み、ＯＣＴの１８個のＮ−末
端アミノ酸、推定的ＨＢsＡg前駆体蛋白の４２個のアミ
ノ酸およびＨＢsＡgの２２６個のアミノ酸からなる２８
６個のアミノ酸融合蛋白を生じる。該融合蛋白は以下の
実施例８で示されるＨＢsＡgである。pＲＩＴ１０６７
１を含有する形質転換体を、イー・コリＫ１２株ＭＭ２
９４(pＲＩＴ１０６７１)と命名する。pＲＩＴ１０６７
１を図５に示す。中間プラスミドとしてのpＲＩＴ１０
６４０の使用は必須ではない。例えば、該ＢamＨIフラ
グメントはpＲＩＴ１０６１６から切り出すことができ
る。もう１つのプラスミド、pＲＩＴ１０６７２は、Ｈ
ＢsＡgコード付け配列の転写のための正しくない方向に
あるＢamＨIフラグメントを含んでいる。このプラスミ
ドを含む形質転換体をイー・コリＫ１２株ＭＭ２９４(p
ＲＩＴ１０６７２)と命名する。 【００２５】実施例６ pＲＩＴ１０６７１およびpＲＩＴ１０６７２をシャトル
ベクターＹＥp１３と組合わせることによるプラスミ
ド、pＲＩＴ１０６７３およびpＲＩＴ１０６７４シャト
ルベクターの調製 ベクターＹＥp１３はイー・コリ・サッカロミセス・セ
レビシアエ・シャトルベクターである。ベクターＹＥp
１３はブローチら〔Ｂroach et al.,Ｇene,Ｖol.８,１
２１,(１９７９)〕に記載されており、ジエイ・ヒック
ス(Ｊ．Ｈicks,Ｃold．Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratories
Ｎew Ｙork,Ｕ.Ｓ.Ａ)によって供給された。小さいＨi
ndIIIフラグメントを、ＨindIIIによる消化でプラスミ
ドから切除し、該プラスミドを再結紮して、単一のＨin
dIII部位を含む誘導プラスミド、ＹＥp１３ＨindIIIを
調製する。精製ＹＥp１３ＨindIIIをＨindIIIで消化
し、アルカリ性ホスファターゼで処理して再結紮を抑制
する。該ＤＮＡをフェノール抽出およびエタノール沈澱
によって回収する。 【００２６】精製pＲＩＴ１０６７１およびpＲＩＴ１０
６７２をＢamＨIで消化し、アルカリ性ホスファターゼ
で処理してpＢＲ３２２部分の再形成を抑制する。該処
理ＤＮＡをさらにＨindIIIで消化して調節域−ＨＢsＡg
遺伝子融合を含む４６５０bpＨindIIIフラグメントを遊
離させ、ついで、その試料をフェノールで抽出し、エタ
ノールで沈澱させる。pＲＩＴ１０６７１およびpＲＩＴ
１０６７２から誘導したＤＮＡ調製物各０.４μgを、別
々に、ＨindIII消化ＹＥp１３ＨindIII０.４μgと混合
し、該混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベー
トする。各結紮混合物の一部分をイー・コリＫ１２株Ｍ
Ｍ２９４のコンピテント細胞を形質転換するのに用い
る。形質転換体をアンピシリン寒天培地上で選択する。
形質転換体コロニーを単離し、ビルンボイムら〔Ｂirnb
oim et al., Ｎucl．Ａcid．Ｒes.,Ｖol.７,１５１３
(１９７９)〕によって記載された方法により、それらの
プラスミドの内容を調べた。形質転換体コロニーの１
つ、イー・コリＫ１２株ＭＭ２９４(pＲＩＴ１０６７
３)は第 図に示すような正しい方向で、ＹＥp１３Ｈin
dIII上に挿入されたpＲＩＴ１０６７１からのＨindIII
フラグメントを含むプラスミド、pＲＩＴ１０６７３を
含有する。もう１つの形質転換体コロニー、イー・コリ
Ｋ１２株ＭＭ２９４(pＲＩＴ１０６７４)は、ＹＥp１３
ＨindIII上に正しくない方向で挿入されたpＲＩＴ１０
６７２からのＨindIIIフラグメントを含むプラスミド、
pＲＩＴ１０６７４を含有している。 【００２７】実施例７ pＲＩＴ１０６７３およびpＲＩＴ１０６７４による酵母
の形質転換 プラスミドpＲＩＴ１０６７３およびpＲＩＴ１０６７４
を、イー・コリＫ１２株ＭＭ２９４(pＲＩＴ１０６７
３)およびＭＭ２９４(pＲＩＴ１０６７４)の清澄な溶解
質よりＣsＣl−臭化エチジウム密度グレジエント遠心分
離法によって単離する。 【００２８】Ａ．サッカロミセス・セレビシアエ株ＤＣ
５ブローチら〔Ｂroach et al.,Ｇene,Ｖol.８,１２１,
(１９７９)〕によって記載されている。サッカロミセス
・セレビシアエ株ＤＣ５(leu２〜３、leu２〜１１３、h
is３、can１〜１１)は、ジエイ・ヒックス(Ｊ．Ｈicks,
Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratories Ｎew Ｙork,Ｕ.
Ｓ.Ａ)から得られ、ヨーロッパ特許条約およびブダペス
ト条約にしたがってアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション(アメリカ合衆国メリイランド州、ロック
ビル)に１９８２年６月２日に寄託番号２０６３０とし
て寄託されている。プロトプラスト化をβ−グルコウロ
ニダーゼ(０.２４単位／mｌ最終濃度)およびアリールス
ルファターゼ(１.２単位／mｌ最終濃度)の混合物を用い
て０.８Ｍソルビトール、０.０３Ｍβ−メルカプトエタ
ノールおよび０.１Ｍリン酸カルシウム緩衝液(pＨ７.
５)中で行なう以外は、ハイネンら〔Ｈinnen et al.,
Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.,Ｖol.７５,１
９２９(１９７８)〕によって記載された方法によってＤ
Ｃ５株の細胞を増殖させ、形質転換用に調製する。酵母
プロトプラストを、別々に、pＲＩＴ１０６７３ １０
μgおよびpＲＩＴ１０６７４ １０μgと共にインキュ
ベートし、形質転換体をロイシン欠損再生寒天培地中で
選択する。再生寒天培地中で増殖したコロニーを回収
し、０.６７５％アミノ酸欠損酵母窒素基本培地、２％
グルコース２％寒天および８０μg／mｌヒスチジンを含
有する固体培地上に画線塗抹し、３０℃で増殖させる。
ＤＣ５株の１コロニーはpＲＩＴ１０６７３で形質転換
され、これをサッカロミセス・セレビシアエ株ＤＣ５(p
ＲＩＴ１０６７３)と命名する。もう１つのコロニーはp
ＲＩＴ１０６７４で形質転換され、これをサッカロミセ
ス・セレビシアエ株ＤＣ５(pＲＩＴ１０６７４)と命名
する。 【００２９】ＤＣ５(pＲＩＴ１０６７３)株およびＤＣ
５(pＲＩＴ１０６７４)株の培養物を８０μg／mｌヒス
チジン加酵母窒素基本培地中で、６２０μmにおいて０.
３３〜１.０の光学密度が得られるまで増殖させる。Ｄ
Ｃ５(pＲＩＴ１０６７４)株は調節域に対して正しくな
い方向で融合されたＨＢsＡgコード付け配列を含んでい
るので陰性対照として有用である。細胞を遠心分離によ
り回収し、リン酸塩緩衝食塩水(ＰＢＳ)で洗浄し、１m
Ｍフッ化フェニルメチルスルホニル(ＰＭＳＦ)加ＰＢＳ
５mｌ中に２０〜１６０倍濃度で再懸濁させる。細胞
を、フレンチ・プレッシャーセル( Ｆrench Ｐressure
Ｃell)に１２０００psi(８３ＭＰa)で２回通過させて破
壊し、溶解質を７７００×Ｇで１５分間、ついで３００
００×Ｇで３０分間遠心分離する。上澄液を回収し、マイ
レックス(Ｍillex)ＧＶメンブラン上で濾過する。上澄
液における特異抗−ＨＢsＡg抗体と反応する蛋白の存在
を、Ａusria（登録商標）ラジオイムノアッセイ法によ
りテストする。このようにして調製されたサッカロミセ
ス・セレビシアエ株ＤＣ５(pＲＩＴ１０６７３)の清澄
細胞抽出物はＰＢＳで１６〜２５６倍に希釈してテスト
した場合でも陽性反応を与え、一方、ＤＣ５(pＲＩＴ１
０６７４)株抽出物は、抗−ＨＢsＡg抗体と反応する蛋
白の存在に関するこの分析では陰性であった。 【００３０】Ｂ．サッカロミセス・セレビシアエ株１c
１６９７d サッカロミセス・セレビシアエ株１c１６９７dはヨーロ
ッパ特許条約およびブダベスト条約に従ってアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに１９８２年６月
２日に寄託番号ＡＴＣＣ２０６３１として寄託されてい
る。前記の方法を用い、アルギニン栄養緩徐株１c１６
９７d(argＪ±、leu２〜１)をpＲＩＴ１０６７３およびp
ＲＩＴ１０６７４で形質転換させる。該栄養緩徐株のロ
イシン非依存性コロニーの１つをpＲＩＴ１０６７３で
形質転換させ、サッカロミセス・セレビシアエ株１c１
６９７d(pＲＩＴ１０６７３)と命名する。もう１つのロ
イシン非依存性コロニーを、pＲＩＴ１０６７４で形質
転換させサッカロミセス・セレビシアエ株１c１６９７d
(pＲＩＴ１０６７４)と命名する。１c１６９７d(pＲＩ
Ｔ１０６７３)株および１c１６９７d(pＲＩＴ１０６７
４)株の培養物を２０μg／mｌアルギニン補足酵母窒素
基本培地中で増殖させる。細胞を回収し、細胞抽出物を
前記と同様にして調製する。１c１６９７d(pＲＩＴ１０
６７３)株の清澄細胞抽出物は、１／２０４８まで希釈
してもＡusria（登録商標）ラジオイムノアッセイにお
いて陽性の結果を示すが、１c１６９７d(pＲＩＴ１０６
７４)株の抽出物では、この分析において一様に陰性で
あった。これらの結果から、ＤＣ５株およびpＲＩＴ１０
６７３で形質転換された１c１６９７d株の酵母細胞は、
ＨＢsＡg決定子を有する融合蛋白の形態でＨＢsＡgを特
異的に合成すると結論づけられる。 【００３１】実施例８ サッカロミセス・セレビシアエ株１c１６９７d(pＲＩＴ
１０６７３)からのＨＢsＡgによるウサギの免疫法 サッカロミセス・セレビシアエ株１c１６９７d(pＲＩＴ
１０６７３)を６２０μmにおける光学密度が０.６０と
なるまで増殖させ、遠心分離によって採集する。細胞を
１mＭ ＰＭＳＦ加ＰＢＳ中に４０倍濃度で再懸濁す
る。清澄細胞抽出物を実施例７に記載の方法に従って調
製する。同様にして、１c１６９７d(pＲＩＴ１０６７
４)株の清澄細胞抽出物を調製する。これらの抽出物を
ウサギの免疫付与に用いる。６匹のウサギからなる第１
群には、フロインド完全アジュバント１mｌと混合した
１c１６９７d(pＲＩＴ１０６７３)株抽出物１mｌを非経
口的注入で第０、９、１５、３０および３７日目に与え
る。３匹のウサギからなる第２群には、フロインド完全
アジュバント１mｌと混合した１c１６９７d(pＲＩＴ１
０６７４)株抽出物１mｌ非経口的注入で同じ日に与え
る。両群から第０(免疫付与前)、２３、５１、および６
５日目に、また、第１群からは第４４日目にも血清を採
取し、Ａusab（登録商標）ラジオイムノアッセイを用い
て抗−ＨＢsＡg抗体の存在をテストした。これらの結果
を第１表に示す。これらの結果は、１c１６９７d(pＲＩ
Ｔ１０６７３)株からの抽出物の注入を受けた６匹のウ
サギのうち４匹がＨＢsＡgに対する抗体を生じたことを
示している。１c１６９７d(pＲＩＴ１０６７４)株から
の抽出物の注入を受けた３匹の対照のウサギはいずれも
抗−ＨＢsＡg抗体産生の形跡を示していない。これらの
結果から、１c１６９７d(pＲＩＴ１０６７３)株抽出物
はＨＢsＡgを含み、重篤な副作用なしにヒトにおけるＨ
ＢＶ感染に対する保護を惹起するためのワクチンに用い
ることができると結論される。 【００３２】 【表１】 【００３３】実施例９ arg３調節域を含有するpＭＣ２００からのプラスミド、
pＲＩＴ１０７４９の調製 精製pＭＣ２００をＨincIIで消化し、１０％アクリルア
ミドゲル上で電気泳動にかける。arg３調節域を含有す
る１９４０bpフラグメントを電気溶出およびエタノール
沈澱によって該ゲルより回収する。該フラグメント約４
μgを１２.５mＭ ＭgＣl2、１２.５mＭ ＣaＣl2、２
００mＭ ＮaＣl、１mＭ ＥＤＴＡおよび２００mＭト
ロメタミン−ＨＣlを含有する緩衝液(pＨ８.０)１００
μｌ中でＢal３１エキソヌクレアーゼ０.２単位と共に
３０℃にて１〜３秒間インキュベートする。該処理ＤＮ
Ａをフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させる。そ
の１μgをデオキシヌクレオチド三リン酸塩の存在下で
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートしていず
れもの１本鎖端部を修復し、ついで、ＥcoＲＩエンドヌ
クレアーゼで消化する。この方法で、Ｂal３１による切
除により種々の長さのＤＮＡフラグメントが産生され
る。各フラグメントは一端に固定したＥcoＲＩ延長部を
有し、もう一つの端部は元のＨincII部位およびＯＣＴ
蛋白開始コードンからいくらかの距離を置いて位置した
鈍化端(blunt end)となっている。arg３調節域を含有す
る約１４８０bpのフラグメントを７.５％アクリルアミ
ドゲル上で電気泳動、ついで、電気溶出およびエタノー
ル沈澱に付して単離する。このカットバック調節域は、
以下の実施例１０に記載されるように、ＯＣＴアミノ酸
配列を欠く蛋白合成に先立つ転写をプロモートすること
ができるので好ましい。 【００３４】第２の一連の反応では、pＭＣ２００をＸb
aIで消化し、５'−１本鎖端部をＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸塩と共にインキ
ュベートして詰込むか、鈍化端とする。このＤＮＡをＥ
coＲＩで消化し、３'からＸbaI部位までに位置する酵母
ＤＮＡ配列と、pＢＲ３２２を含む約５７００bpの大き
なＥcoＲＩ−Ｔ４／ＸbaIフラグメントを電気泳動、電
気溶出およびエタノール沈澱によって精製する。このフ
ラグメントを該１４８０bpプロモーター含有フラグメン
トと混合し、これに結紮する。該結紮混合物をイー・コ
リＫ１２株ＭＭ２９４のコンピテント細胞を形質転換す
るのに用いる。形質転換体をアンピシリン寒天培地上で
選択する。プラスミドＤＮＡをビルンボイム〔Ｂirnboi
m etal.,Ｎucl．Ａcid．Ｒes.,Ｖol.７,１５１３、(１９
７９)〕の記載した方法によって形質転換体コロニーよ
り単離し、ＸbaIでの消化によってＸbaI部位の存在につ
いてスクリーニングする。ＸbaI部位は、第２の一連の
反応からのフラグメント上の詰込まれたＸbaI部位が、
ＸbaI認識配列であるＴＣＴＡＧＡを新しい位置で復元
させるように、３'Ｔ残基で終わる第１の一連の反応か
らのもう１つのフラグメントに結紮しているプラスミド
にのみ存在している。ＸbaI部位を有するプラスミドをp
ＲＩＴ１０７４９と命名した。これらの操作を示すフロ
ーシートを図６に示す。イー・コリＫ１２株ＭＭ２９４
(pＲＩＴ１０７４９)は、ヨーロッパ特許条約およびブ
ダペスト条約に従ってアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション(アメリカ合衆国メリイランド州、ロッ
クビル)に、１９８２年６月２日付で寄託番号ＡＴＣＣ
３９１３３として寄託されている。 【００３５】pＲＩＴ１０７４９の試料をＢstＥIIおよ
びＸbaIの組合せで消化する。切除されたarg３調節域の
サイズは、ＢstＥIIおよびＸbaIで同様に消化されたpＭ
Ｃ２００との比較により、また、フックら〔Ｆuchs et
al.,Ｇene,Ｖol.４,１(１９７８)〕によって記載されて
いるファージφx１７４ＤＮＡフラグメントの公知の分
子量を参照することにより約２１０bpと算定された。p
ＲＩＴ１０７４９のＢstＥII−ＸbaIフラグメントのＤ
ＮＡ配列を決定するため、プラスミドＤＮＡをＢstＥII
で消化し、交換キネーションによってγ−32Ｐ−ＡＴＰ
で標識し、ついで、ＢamＨIエンドヌクレアーゼで消化
して２０００bpフラグメントを遊離させ、電気溶出およ
びエタノール沈澱によって精製する。標識フラグメント
のＤＮＡ配列化はマキサムら〔Ｍaxam et al., Ｍetho
ds in Ｅnzymology,Ｖol.６５,４９９,(１９８０)〕に
よって記載された化学的修飾法に従って行なわれる。こ
の配列の１部分は、 ＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＴＧＴＡＣＡＣＴＣＧＴＣＴＡＧＡ と決定された。アンダーラインを施したヌクレオチド
は、５７００bp ＥcoＲＩ−Ｔ４／ＸbaIフラグメント
から誘導される。図４に示すＤＮＡ配列の相当区域と比
較すると、修復されたＸbaI部位が、pＭＣ２００酵母Ｄ
ＮＡ挿入物における元のＨincII部位のヌクレオチド９
個上流の５'非翻訳先端域中に位置することがわかる。 【００３６】実施例１０ pＲＩＴ１０７４９をpＲＩＴ１０６０１と組合わせるこ
とによる、ＨＢsＡgおよび調節域を含有するプラスミ
ド、pＲＩＴ１０７５９およびpＲＩＴ１０７６１の調製 pＲＩＴ１０６０１をＨhaIエンドヌクレアーゼで消化
し、７.５％アクリルアミドゲル上で電気泳動に付す。
１１００bpフラグメントを電気溶出およびエタノール沈
澱によって回収する。このフラグメントの一部のＤＮＡ
配列は、ピーターソンら〔Ｐeterson et al.,Ｖiral Ｈ
epatitis,Ｇ.Ｎ.Ｖyas,Ｓ.Ｎ.Ｃohen andＲ.Ｓchmid.Ｅ
ds.,Ｆranklin Ｉnstitute Ｐress,Ｐhiladelphia,Ｕ.
Ｓ.Ａ.(１９７８,Ｐ５６９)によって記載されているよ
うな、ayw抗原型ＨＢsＡgの公知のＮ−末端アミノ酸配
列に対応する配列を含有する。該フラグメントは、５'
〜ＨＢsＡg開始コードンに位置する６個のヌクレオチ
ド、完全なＨＢsＡgコード付け配列および約３９０個の
３'非翻訳ヌクレオチドを含有する。プラスミドpＲＩＴ
１０７４９のＤＮＡをＸbaIで消化し、該ＤＮＡ約４０
０ngを精製ＨhaIフラグメント約２８０ngと混合する。
該混合物を２０mＭトロメタミン−ＨＣl、１０mＭ Ｍg
Ｃl2,１mＭジチオトレイトールならびにdＡＴＰ、dＣＴ
Ｐ、dＧＴＰおよびdＴＴＰ各３３mＭを含有する緩衝液
(pＨ７.５)２０μｌ中で３７℃にて３０分間Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ０.５単位と共にインキュベートする。該
反応混合液に１mＭＡＴＰ２.５μｌ,１０mＭ ＥＤＴＡ
２.５μｌおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ２μｌ(２単位)を
加え、該混合液を１５℃にて１６時間インキュベートす
る。 【００３７】該結紮混合物をイー・コリＫ１２株ＭＭ２
９４のコンピテント細胞を形質転換するのに用い、アン
ピシリン耐性形質転換体を選択する。プラスミド調製物
をいくつかのこれらの形質転換体より作り、制限エンド
ヌクレアーゼ消化およびゲル電気泳動により分析した。
その結果は鈍化端ＨＢＶフラグメントがＸbaI消化pＲＩ
Ｔ１０７４９中に両方の可能な方向で挿入されているこ
とを示している。このようなプラスミドの１つ、pＲＩ
Ｔ１０７６１はarg３プロモーターからＨＢsＡg配列を
転写するための正しい方向の１１００bp挿入物を含み、
ＢstＥIIおよびＸbaIによる連続的消化により２７１bp
フラグメントを生ずる。このpＲＩＴ１０７６１を図７
に示す。第２のプラスミド、pＲＩＴ１０７５９は正し
くない方向で挿入物を包含し、ＢstＥIIおよびＸbaIエ
ンドヌクレアーゼの組合わせで消化すると、１１７５bp
と算定されるフラグメントを生ずる。pＲＩＴ１０７６
１について、arg３調節域−ＨＢsＡg挿入接合部におけ
るヌクレオチドの配列を、γ−32Ｐ−ＡＴＰによるＸba
I末端の交換キネーション標識付けの後、マキサムら
〔Ｍaxam et al., Ｍethods in Ｅnzymology,Ｖol.６
５,４９９(１９８０)〕の化学的修飾法を用いて２７１b
p ＢstＥII−ＸbaIフラグメントを配列化することによ
り決定する。arg３調節域−ＨＢsＡg接合部に対して決
定された配列はＴＡＣＡＣＴＣＧＴＣＴＡＣＴＧＡＡＣ
ＡＴＧである。ＸbaI制限部位がＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼによって完全には修復されず、グアニン残基１つを欠
失していることがわかる。該arg３非翻訳先端部にはＨ
ＢＶ起源の６個のヌクレオチド、ＣＴＧＡＡＣが直接続
き、さらにＨＢsＡg開始コードン、ＡＴＧおよびＨＢs
Ａg構造遺伝子のコード付け配列が続いている。ＨＢsＡ
g開始コードンはarg３プロモーターの下流にある最初の
開始コードンである。そのため、該ＤＮＡから転写され
たmＲＮＡの翻訳はそのコードンで開始され、合成され
たＨＢsＡgは異質アミノ残基を欠失することになる。合
成されたＨＢsＡgは融合蛋白ではなく、ＨＢsＡg標品と
構造的に本質的に同じものである。 【００３８】実施例１１ pＲＩＴ１０７６１をＹＥp１３ＨindIIIと組合わせるこ
とによるプラスミドpＲＩＴ１０７６４およびpＲＩＴ１
０７６５の調製 pＲＩＴ１０７６１およびpＲＩＴ１０７５９を別々にＰ
stIおよびＢamＨIで消化してpＢＲ３２２レプリコン部
分を破壊し、ついでＨindIIIで消化して挿入されたＨＢ
Ｖ ＤＮＡおよび調節域を担持するＤＮＡフラグメント
を遊離させる。該ＤＮＡをフェノールで抽出し、エタノ
ールで沈澱させ、０.０１Ｍトロメタミン−ＨＣlおよび
０.００１Ｍ ＥＤＴＡを含有する緩衝液(pＨ７.５)に
溶解する。各ＤＮＡ調製物の０.６μgを前記と同様な方
法で調製されるＹＥp１３ＨindIIIのＨindIII消化、ア
ルカリ性ホスファターゼ処理ＤＮＡ０.３μgと混合し、
該混合物を結紮する。該結紮混合物をイー・コリＫ１２
株ＭＭ２９４のコンピテント細胞の形質転換に用い、ア
ンピシリン耐性形質転換体を選択する。１つの形質転換
体は、pＲＩＴ１０７６１由来のＨindIIIフラグメント
をＹＥp１３ＨindIII上に挿入してなるプラスミドpＲＩ
Ｔ１０７６４を含有することが示された。また、別の形
質転換体はpＲＩＴ１０７５９由来ＨindIIIフラグメン
トをＹＥp１３ＨindIII上に挿入してなるプラスミドpＲ
ＩＴ１０７５９を含有することが示された。pＲＩＴ１
０７６１およびpＲＩＴ１０７６４の調製フローシート
を図７に示す。 【００３９】実施例１２ pＲＩＴ１０７６４およびpＲＩＴ１０７６５による酵母
の形質転換 pＲＩＴ１０７６４およびpＲＩＴ１０７６５を実施例１
１で調製された形質転換体の培養物よりＣsＣl−臭化エ
チジウム密度グレジエント遠心分離法によって単離し、
各１０μgを実施例７に記載の方法により酵母株１c１６
９７dの細胞を形質転換するのに用い、再生寒天培地上
でロイシン−非依存性形質転換体を選択する。これらの
形質転換から生ずるロイシン−非依存性コロニーを菌株
１c１６９７d(pＲＩＴ１０７６４)と命名する。もう１
つの形質転換体をサッカロミセス・セレビシアエ株１c
１６９７d(pＲＩＴ１０７６５)と命名する。これらの菌
株の培養物を２％グルコースおよび２０μg／mｌアルギ
ニン補足酵母窒素基本培地中で６２０μmにおける光学
密度が０.８０〜０.８８となるまで増殖させる。細胞を
集め、細胞不含抽出液を調製し、実施例７に記載される
ようにＡusria（登録商標）ラジオイムノアッセイによ
りＨＢsＡgについて分析する。１c１６９７d(pＲＩＴ１
０７６４)の抽出物は、ＰＢＳによる希釈度が１／１０
２４まででもこの分析において陽性の結果を示すが、１
c１６９７d(pＲＩＴ１０７６５)株は非希釈抽出物でも
この分析において一様に陰性であった。遺伝学およびラ
ジオイムノアッセイの結果より、サッカロミセス・セレ
ビシアエ株１c１６９７d(pＲＩＴ１０６７４)の細胞
は、ヒトにおけるＨＢＶ感染に対する保護を重篤な副作
用なしで惹起するためのワクチンに使用できるＨＢsＡg
を合成すると結論される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 pＲＩＴ１０６０１の制限エンドヌクレアー
ゼ開裂地図を示す図面。 【図２】 pＲＩＴ１０６０６の制限ヌクレアーゼ開裂
地図を示す図面。 【図３】 pＭＣ２００の制限エンドヌクレアーゼ開裂
地図を示す図面。 【図４】 pＭＣ２００における３３００bp ＨindIII
酵母ＤＮＡ挿入物の一部分のヌクレオチド配列を示す図
面。 【図５】 pＲＩＴ１０６７１およびpＲＩＴ１０６７３
の製造を示すフローシート。 【図６】 pＲＩＴ１０７４９の製造を示すフローシー
ト。 【図７】 pＲＩＴ１０７６１およびpＲＩＴ１０７６４
の製造を示すフローシート。
ゼ開裂地図を示す図面。 【図２】 pＲＩＴ１０６０６の制限ヌクレアーゼ開裂
地図を示す図面。 【図３】 pＭＣ２００の制限エンドヌクレアーゼ開裂
地図を示す図面。 【図４】 pＭＣ２００における３３００bp ＨindIII
酵母ＤＮＡ挿入物の一部分のヌクレオチド配列を示す図
面。 【図５】 pＲＩＴ１０６７１およびpＲＩＴ１０６７３
の製造を示すフローシート。 【図６】 pＲＩＴ１０７４９の製造を示すフローシー
ト。 【図７】 pＲＩＴ１０７６１およびpＲＩＴ１０７６４
の製造を示すフローシート。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
(Ｃ１２Ｎ 1/19
Ｃ１２Ｒ 1:865）
(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ
Ｃ１２Ｒ 1:92）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:865）
(72)発明者 ドゥ・ビルド・ミシェル
ベルギー国ベー−1320ジェンバル、アベ
ニュー・ジュバール136番
(72)発明者 ハーフォード・ニジェル
ベルギー国ベー−1900オベリージュ、ジ
ェフ・ランボーラン９番
(56)参考文献 ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．298，（22
ＪＵＬＹ 1982），Ｐ．347−350
ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．282,
（1979），Ｐ．575−579
ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ
Ｉ．ＵＳＡ，ＶＯＬ．78，ＮＯ．４,
（1981），Ｐ．2606−2610
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．ＨＢsＡgをコードするヌクレオチド配列および酵母
において転写を行うことのできる調節域からなり、該配
列がＨＢsＡgの免疫原性を保持し、ＨＢsＡgの２２６個
のアミノ酸からなるポリペプチドと、そのＮ−末端にお
けるポリペプチド延長部とからなるポリペプチドをコー
ドし、該延長部は、一部がＨＢsＡgのプレ-Ｓ領域より
由来し、一部がＨＢsＡgのプレ-Ｓ領域より由来しない
ポリペプチドであって、該プレ-Ｓ領域より由来の部分
がＨＢsＡgの２２６個のアミノ酸に天然に先行する該Ｎ
−末端アミノ酸を含めて４２個までのアミノ酸により形
成されている組換型ＤＮＡ分子を含むプラスミドで形質
転換された酵母を培養し、産生されたポリペプチドを収
集することを特徴とするポリペプチドの製法。 ２．ＨＢsＡgの２２６個のアミノ酸からなるポリペプチ
ドとそのＮ−末端におけるポリペプチド延長部からなる
ＨＢsＡgの免疫原性誘導体であって、該延長部は、一部
がＨＢsＡgのプレ-Ｓ領域より由来し、一部がＨＢsＡg
のプレ-Ｓ領域より由来しないポリペプチドからなり、
該プレ-Ｓ領域より由来の部分がＨＢsＡgの２２６ポリ
ペプチドに天然に先行する該Ｎ−末端アミノ酸を含めて
４２個までのアミノ酸によって形成されていることを特
徴とするＨＢsＡg免疫原性誘導体。 ３．プレ-Ｓ領域より由来の延長部がＨＢsＡgポリペプ
チドの２２６番目のアミノ酸に天然に先行する４２個の
アミノ酸によって形成されている請求項２記載のＨＢs
Ａg免疫原性誘導体。 ４．プレ-Ｓ領域より由来しない延長部がオルニチン・
カルバモイルトランスフェラーゼのＮ−末端の１８個の
アミノ酸により形成されている請求項３記載のＨＢsＡg
免疫原性誘導体。 ５．ＨＢsＡgの２２６個のアミノ酸からなるポリペプチ
ドとそのＮ−末端におけるポリペプチド延長部からなる
ＨＢsＡgの免疫原性誘導体であって、該延長部は、一部
がＨＢsＡgのプレ-Ｓ領域より由来し、一部がＨＢsＡg
のプレ-Ｓ領域より由来しないポリペプチドからなり、
該プレ-Ｓ領域より由来の部分がＨＢsＡgの２２６ポリ
ペプチドに天然に先行する該Ｎ−末端アミノ酸を含めて
４２個までのアミノ酸によって形成されているＨＢsＡg
免疫原性誘導体と、医薬上許容される担体または賦形剤
とを組み合わせてなることを特徴とするワクチン。
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