WO1986001534A1 - Recombinant dna and its use - Google Patents

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WO1986001534A1
WO1986001534A1 PCT/JP1984/000423 JP8400423W WO8601534A1 WO 1986001534 A1 WO1986001534 A1 WO 1986001534A1 JP 8400423 W JP8400423 W JP 8400423W WO 8601534 A1 WO8601534 A1 WO 8601534A1
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dna
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plasmid
reaction solution
fragment
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PCT/JP1984/000423
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Inventor
Masakazu Kikuchi
Yukio Fujisawa
Original Assignee
Takeda Chemical Industries, Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a novel recombinant DNA and its use. Further for more hepatitis B virus surface antigen P 3 1 co one de to DNA a promoter a region 3, the recombinant DNA obtained by ⁇ -terminated transformant and the transformant containing the recombinant DNA And producing and accumulating hepatitis B virus surface antigen P31 in the culture, and collecting the same.
  • Hepatitis B is a viral disease that occurs frequently, especially in tropical Africa, Southeast Asia and the Far East, and has been epidemiologically suggested to cause chronic hepatitis, cirrhosis, and even primary liver cancer.
  • the etiology is hepatitis B virus (HBV), a type of DNA virus, which is a spherical particle with a diameter of 42 nm and bears the name of the discoverer.
  • the outer layer has HBV surface antigens (hereinafter abbreviated as HBsAg), which are divided into subtypes such as adr, adw, ayr, and ayw depending on their antigenicity. Adw and a dr types are found in Japan.
  • HBsAg antibodies against a viral superficial antigen protect the virus from infection.
  • HBV a vaccine against hepatitis B based on HBsAg can be considered. Where power, HB
  • ⁇ V can only infect human chimpanzees, and attempts to infect cultured cells have not been successful. For this reason, HBsAg is limited to being obtained from the blood of human infected individuals, and the obtained small abductors, etc., can only be used as a diagnostic reagent material and cannot be used for production of pectin. State.
  • HBsAg gene HBsAg structural gene
  • the location and base sequence of the HBsAg gene were determined for the ayw type, which is common in Europe and the United States !: Galibert, F. et al. Nature, 2 ⁇ 1, 646 (1979); Carnay, P. et al., Nucleic Acids Res. ', 7, 335 (1979)], and its expression in Escherichia coli as a hybrid protein has been reported [Charnay, P. Edman, JC et al., Nature, 286, 893 (1980).
  • Coding the hepatitis B virus surface antigen P31 a recombinant DNA comprising a DNA inserted into the 3rd end of the promoter region,
  • Recombinant DNA comprising a DNA encoding hepatitis B virus surface antigen P31 inserted at the 3 'and 3' termini of the promoter region; I) a transformant containing NA; and
  • An object of the present invention is to provide a method for producing hepatitis B virus surface antigen P31, which comprises producing and accumulating virus surface antigen P31 and collecting the virus.
  • the NA may be of any subtype (adr, adw, ayr, ayw), for example they can be prepared by the following method. Plasmid PBR322—EcoHI / ⁇ 33C incorporating a 3.2 kb adw-type HBV DNA described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-194948 or Nucleic Acids Res., Ll, 1747 U983). pHBV933 (abbreviated as pHBV933) can be double-digested with restriction enzymes Hpal and EcoRI to obtain a 961 bp DNA fragment containing a part of the pre-S region. This fragment [3 4 ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ ??
  • the DNA encoding adw HBsA P31 is represented by the nucleotide sequence of 28 to 873 of the DNA sequence shown in Fig. 1.
  • DNA mosquito, adr-type HBsAg P31 is encoded. It is shown in Figure 2 as DNA! )
  • DNAs represented by the base sequence order of 10 to 855 are listed.
  • DNA encoding P31 may be virus-derived or chemically synthesized. '' DNA_ encoding ayr-type and ayw-type HBsAg P31 is also as described above. -G-can be prepared according to the method.
  • P31 By inserting the DNA encoding P31 into the end of the promoter region that functions in various hosts (eg, Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, animal cells), P31 can be introduced. It is possible to construct a recombinant DNA capable of expressing the coding DNA.
  • hosts eg, Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, animal cells
  • the promoter region may be any region as long as it contains a site necessary for initiating mRNA synthesis by the binding of RNA polymerase.
  • a DNA encoding P31 when Escherichia coli is used as a host, a DNA encoding P31 can be inserted into the 3 and terminus of a promoter region that can function in Escherichia coli, and a recombinant DNA capable of expressing DNA encoding P31 can be used. s can be built. For example, P31-encoding DNA is introduced into the expression vectors pTRP-601 and pTRP771 described in JP-A-58-201979 by the action of T4 DNA ligase. I do.
  • Escherichia coli eg, C600 strain, 2904 strain, W3110 strain, RR1 strain, PR13 strain, etc.
  • Escherichia coli was purified by a known method [Cohen'S.N. Et al. Proc. Nat and Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)] or a method analogous thereto.
  • the promoter to be used does not need to be limited to the trp promoter (trp-p), for example, the recA promoter (Japanese Patent Laid-Open No. 59-e509), the lac promoter, the sp promoter, etc. May be used.
  • Transformants carrying the novel recombinant plasmid DNA containing P31-encoding DNA obtained as described above include, for example, ampicillin resistance, tetracycline resistance, or resistance to both drugs. Can be selected as an expression.
  • the 294 strain is a known bacterium [Backman, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 4174 (197)].
  • Hmm It has also been deposited with the Institute for Fermentation, Osaka; sometimes referred to as IFO, as IO-141 171. It encodes P31 among these resistant strains
  • a new recombinant plasmid containing NA To search for a strain that harbors DNA, for example, the following technique is used: One strand of the adapter 1 described above, 5 AATTCC AC GCATTGTAT 3, and T 4 polynucleotide - labeled with a radioactive isotope ⁇ 3 ⁇ 4 by using the r _32p_ aT P by kinase, this as a Sagu ⁇ (probe), known per se of the colonies one * Haiburidize one Chillon method [Grunstein, M. and Hogness, DS, Proc ⁇ Natl. Acad. Sci. USA, 3961 (1975) makes it possible to reliably search for positively resistant clones among drug-resistant transformants already obtained.
  • the transformant thus selected is cultured in a medium known per se.
  • a medium for example, L-9 broth, Penassay (; Penassay) broth and M-9 medium containing glucose and casamino acid [Mi'ller, J., Experiments in Molecular Genetics, 431-433 C Cold Spring
  • yeast transformants can be transformed as follows. Bacteria-Yeast Shuttle 'Vector-YE pi 3 [Broach, JR et al., Gene,, 21 (1979)], pSH15 and pSHl9 [Harashima, S. et al., Mol. Cell.
  • yeast promoter region for example, an inhibitory acid phosphatase gene promoter region [Meyhack, BB, EMBOJ., 6. »675 (1982)], a glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene promoter region! Hoi land, JP and Holland. MJ, J. Biol.
  • “Plasmid DNA was isolated from the transformants selected in this manner by an extraction method (Birnboim, HC and Doly, J., Nucleic Acids Res.,, 1513 (1979)) and used. Saccharomyces cerevisiae, such as AH22R— (leu 2 his canlcir + ph. 80 Ba Proc. Natl. Acad Sci. USA 80, 1 1983) K3 3-7 BC pho.80-AH22, pho8-2) derived from 3 or AH22R— or K33—8D (pho80—AH22, pho8-2 trpi) Natn. A. et al., Proc. Nat and Acad. Sci. USA, 75, 1927 (1978) J or a method analogous thereto. No power; Saccharomyces ⁇ Serebishes are preferred.
  • Saccharomyces cerevisiae AH22 has been deposited with the Fermentation Research Institute as IF 0-110 134, and is still to be deposited on September 4, 1984, with the Microorganisms Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology (FRI I).
  • the yeast transformant is cultured in a medium known per se, such as Burkholder's minimal medium [: Bostian, KL Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7, 4505 (1980: s). Culture of yeast transformants is usually 15 1 to 403 ⁇ 4, preferably 24 to 37 ° C.
  • the reaction is carried out for 0 to 96 hours, preferably 24 to 72 hours, and if necessary, ventilation and stirring can be applied.
  • the cells are collected by a known method, suspended in a buffer, and then treated with lysozyme or sonication in the case of a transformant of Escherichia coli, or with Zymolyase (in the case of a transformant of yeast).
  • the product breaks down by mechanical destruction with a glass bead or the like.
  • P31 can be extracted more advantageously by adding a surface active agent such as Triton X-100, deoxycore, or a protein denaturant such as guanidine hydrochloride.
  • Isolation of P31 from the supernatant obtained by centrifugation may be performed by a generally known method for purifying a hydrophobic protein.
  • the P31 activity of the animal can be measured, for example, by binding the sample to cellulose paper activated with bucmane and then using 125 A (available from Dynabot Inc.) Direct immunoassay method for reaction with anti-HBsAg antibody [Fujisawa, Y. et al., Nucleic Acids Res., 1_l, 3581 (1983)].
  • a DNA encoding P31 is inserted into the 3 'end of a promoter region which can function in Bacillus subtilis or animal cells, and a known DNA is used.
  • bacteria and yeast are more preferable as a host capable of producing P31.
  • the generated P31 may or may not be glycosylated.
  • H Bs A transformant containing the g DNA by production of surface antigen gene products, the force is known to growth of the transformant itself is inhibited;, P 3 according to the present invention
  • the use of DNA encoding 1 eliminates growth inhibition and increases P31 production.
  • FIG. 1 shows the DNA sequence encoding adr-type HBsAgP31 (: upper row) and the corresponding amino acid sequence (lower row).
  • FIG. 2 shows the DNA sequence encoding adw-type HBsAgP31 (upper row) and the corresponding amino acid sequence (lower row).
  • Fig. 3 shows the construction diagram of plasmid PPH017-1 with the symbols E, S, B,
  • H and X represent EcoRI, Sa1I, BamHI, HindI, and Xhol, respectively.
  • - Figure 4 shows the construction diagram of the plasmid pPKT 700-1 with the symbols E, 'S, ⁇
  • H and X represent EcoRI, Sa1I, BaniHI-, HindI and Xhol, respectively.
  • FIG. 5 shows a construction diagram of the plasmid PGLD906-1, wherein symbols, S, B, H and X represent EcoM, Sa1I, BamHI, Hindf and Xhol, respectively.
  • FIG. 6 shows a construction diagram of the expression plasmid pTRP P31-R for adr-type HBsAgP31 for Escherichia coli, where the symbols, B, C and JP represent EcoRI, BamHI, Clal and PstI, respectively.
  • FIG. 7 shows a construction diagram of the expression plasmid pTRP P31 -W2 for adw-type HBsAgP31 for Escherichia coli, where the symbols _E, B, C and P represent EcoRI, BamHI, Clal and PstI, respectively.
  • Figure 8 shows the expression plasmid for adr-type HBsAgP31 for yeast pGL DP31 left-handed fOMPI — R, pPHO P3 1—R and pPKT P31—R are shown in the construction diagram, symbols E, B, S, H, X and C are EcoRI, BamHI, SalI, Hindi, XhoI and C1 respectively. a Represents I.
  • FIGS. 9 and 10 show the construction diagrams of the expression plasmid pPHO P 3 ⁇ —W of the adw-type HBsHgP31 for yeast, and the symbols B, P, B, C, S and H are EcoRI and Pst I, respectively. , BamHI, C1aI, Sa1I and HindH. -Best mode for carrying out the invention
  • T4 polynucleotide 'kinase (Takara Shuzo) in 50 ⁇ £ reaction solution [5 OmM Tris-HCl (pH 7. ⁇ ), 10 mM MgCl 2 , 10 mM 5'-end was phosphorylated at 37 ° C for 1 hour in mM 2 -mercaptoethanol, 100 M ATP].
  • the reaction solution [40 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), 6.6 mM MgCl 2 , 1 mM 2-mercaptoethanol i 33 ⁇ d ATP, 33 M dGTP, 33 ⁇ ⁇ dTTP, 33 ⁇ dCTP] at 12 ° C for 30 min.
  • the DNA fragment was blunt-ended, deproteinized with phenol, and precipitated with cold ethanol.
  • the 294 strain was transformed according to the method of Cohen et al., And the plasmid pPHOl2 in which the Xhol site of the plasmid pPHOl2 was changed to the Sail site was selected from the ampicillin-resistant transformants. 12-1 was obtained (see Fig. 3).
  • DNA was precipitated by adding cold ethanol. After electrophoresis of DNA 0.5 ⁇ ⁇ from each fraction using 1% agarose 'slab gel under the conditions described in Reference Example 1, nitrocellulose finoleta C Schleicher and Schul 1; [Southern, EM, J. Mol. Biol “9_8, 503 (1975)]
  • TEN buffer (1 OmM Tris-HC1 (pH 8.0, 200 mM)
  • the reaction solution was used to transform E. coli DH1 CManiatis, T. et al., Molecular Cloning, Co Id Spring Harbor Laboratory, 254-255 (1982)], and about 1 transformant showing tetracycline resistance was transformed. I got 300 pieces. From among these, transformants containing the PGK gene were cloned using the above-mentioned 32 P-labeled synthetic probe in a colony 'Hive: Lydidase [Suggs, SV et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Gr..P Separated from the gel by the method described in 1.
  • 10 units of the restriction enzyme Xhol (Takara Shuzo) [30 mM reaction solution [10 mM Tris-HCl (pH 7.5, 7 mM MgCl 2 , 100 mM NaCl, 7 mM 2- mercapto).
  • electrophoresis was performed using 0.7% agarose 'slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After electrophoresis, refer to the 7.7 kb DNA fragment. It was separated from the gel by the method described in Example 1 (see Fig. 4).
  • the plasmid pPKT567DNA10 described in 2 of Reference Example 2 was combined with 10 units of each restriction enzyme Hindi [Xhol with 0 ⁇ ⁇ reaction solution (50 mM Tris-HCl C pH 7.6), 50 mM NaCl, After incubating for 2 hours at 37 ° C in 1 mM dithiothreitol, 10 mM MgCl 2 ), electrophoresis was performed using 1.2% agarose-slab gel under the conditions described in Reference Example 1. The Okb DNA fragment was separated from the gel (see FIG. 4).
  • Escherichia coli 1 was transformed by the method described in 1 to obtain about 1200 tetracycline-resistant transformants, which were strongly hybridized with the 32 P-labeled probe by colony hybridization. Transformants were separated. Plasmid PGLD9 was isolated from this transformant by the above-described extraction method and digested with HindJI.A 2.2 kb insert DNA was detected, and the insert DNA was analyzed by jSouthern method. Hybridization was confirmed (see Fig. 5).
  • the 0.36 kb DNA fragment 1 was reacted with a DNA polymerase I large 'fragment under the conditions described in Reference Example 1 to change the cohesive end of aq I to a blunt end.
  • 1 ⁇ 9 of this fragment and 50 n of the phosphorylated Xhol linker described in Reference Example 1 were mixed, and allowed to bind by the action of T4 DNA ligase under the conditions described in Reference Example 1.
  • After the reaction add an excess amount of Xhol and allow it to work at 37 ° C for 4 hours.
  • use a Sepharose 4B column to bind the linker-bonded 0.36 kb DNA under the conditions described in 2 of Reference Example 2. The fragments were separated.
  • the DNA fragment 6 ⁇ was added with 2 units of the restriction enzyme HhaI in a 50 reaction solution [10 mM Tris-HC (pH 7.5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol)].
  • a 50 reaction solution 10 mM Tris-HC (pH 7.5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol)].
  • HhaI restriction enzyme
  • a plasmid PGLD906-1 converted to the XhoI3 ⁇ 43 ⁇ 4i force sSall site of the plasmid PGLD906 was prepared (see FIG. 5).
  • + Replacement Example 1 Construction of recombinant DNA molecule expressing adr-type hepatitis B virus surface antigen P31 gene and transformation of Escherichia coli with the DNA molecule
  • the plasmid pBR322-BamHINO HBr33ODNA (abbreviated as pHBr330) described in JP-A-59-79485 and Nucleic Acids Res., Above, 1747 (1983).
  • pHBr330 The plasmid pBR322-BamHINO HBr33ODNA (abbreviated as pHBr330) described in JP-A-59-79485 and Nucleic Acids Res., Above, 1747 (1983).
  • a reaction solution of 100 / i (100 mM Tris-) with BamHI was added to the plasmid pHBr 330 50 / ⁇ with a restriction solution of 20 units each of EcoRI (Takara Shuzo) and BamHI.
  • HC 1 pH 7.5
  • the DNA polymerase I large fragment was allowed to act on 50 ong of BamHI plasmid pHBrP31 under the conditions described in Reference Example 1 to make the adhesive end blunt, and then removed with phenol.
  • the protein was precipitated and the DNA was precipitated with cold ethanol.
  • Ligation was carried out by the action of T4 DNA ligase under the conditions described in Example 1.
  • the reaction solution was used to transform E. coli 294 strain, and the transformant was examined by the method described in Reference Example 1, and the BamHI site of the plasmid pHBrP31 was converted to Pstj;
  • the plasmid pHBrP 31-17 was separated (see Figure 6).
  • reaction solution 100 units of the pHBrP 31-1750 ⁇ with 20 units of each of the restriction enzyme Clal and Pstl (Takara Shuzo)! After reacting for 3 hours at 37 ° C in 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 50 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ], the reaction solution was purified using 1.0 agarose-slab gel. Electrophoresis was performed under the conditions described in Reference Example 1. After electrophoresis, 1.42 kb DNA The fragment was separated from the gel by the method described in Reference Example 1.
  • the strain (Escherichia coli 294 / pTRP P31-R) was deposited with the Fermentation Research Institute as IFO-144355, and from July 10, 1984, Deposited with the Technical Research Institute (FRI) under the accession number F ERM P—77009.
  • Example 2 Construction of recombinant DNA molecule expressing adw-type hepatitis B virus surface antigen P31 gene and Escherichia coli using the DNA molecule
  • the plasmid pBR—EcoRI / HBV933 DNA (abbreviated as pHBV933) described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 58200/1976 and Nucleic Acids Res ,, 11, 17747 (1983) is a special feature. It was prepared by the method of Reference Example 1 described in No. 5 -2 01 796 6 ⁇ . 2 ⁇ Add 2 units of restriction enzyme Hpa to the plasmid
  • coli was The 294 strain was transformed, and the transformant was examined by the method described in Reference Example 1 to obtain a plasmid pHBV933-5 in which the Hpal site of the plasmid PHBV933 was converted to a Pstl site (No. 1). See Figure 7).
  • reaction solution 800 ⁇ ⁇ of the plasmid pHBVg 33-5 DNA and 500 units of restriction enzyme Pstl! : 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 OmM MgCl 2 , 50 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ] at 37 ° C. for 20 minutes, and immediately deproteinized with phenol.
  • the reaction solution was subjected to electrophoresis using 1.0% agarose slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After the electrophoresis, a 1.7 kb DNA fragment partially digested with Pstl was fractionated from the gel by the method described in Reference Example 1 (see FIG. 7).
  • the Escherichia coli strain (Esche-richia coli 294 / pTRP P31-W2 :) carrying the plasmid pTRP P31-W2 was deposited with the Fermentation Research Institute as IF0-144356. It was deposited with the Research Institute of Microbial Industry and Technology (FRI) on July 10, 1980 under the accession number F ERM P-770. ⁇
  • Example 3 Construction of a recombinant DNA molecule for yeast expressing the adr-type hepatitis B virus surface antigen P31 gene and transformation of yeast with the DNA molecule
  • the reaction solution was subjected to electrophoresis using 1.0% agarose 'slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After the electrophoresis, a 1.42 kb DNA fragment was fractionated from the gel by the method described in Reference Example 1.
  • AH22R-1 was transformed by the method of Hinnen et al.
  • the yeast transformant (AH22R-no pPHOPa 1- R) that was retained was isolated.
  • transformants can be cultured by a usual method to obtain the desired P31.
  • Example 4 adw-type hepatitis B virus surface antigen P31 gene is expressed-construction of recombinant DNA molecule for yeast and transformation of yeast by said DNA molecule. '. 1 described in Example 2 Plasmid PHBV 933 DNA, 2 ⁇ 2.
  • Electrophoresis was performed using 1.2% agarose slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After electrophoresis, contains DNA fragment encoding adw-type P31
  • the 0.96 kb DNA fragment was separated from the gel by the universal method described in Reference Example 1 (see FIG. 9). .
  • the DNA polymerase I large 'fragment was allowed to act on the 0.98 kb DNA fragment of 2 ⁇ under the conditions described in Reference Example 1 to make the cohesive ends blunt, followed by deproteinization with phenol and cold ethanol. DNA was precipitated. According to the method described in (3) of Example 3, the 0.98 kb DNA fragment was ligated with 5'-P-d (CGTCGACG :), Bethesda Research Co., Ltd. The fraction containing the 0.99 kb DNA fragment (DNA encoding adw-type P31) was collected using Sepharose 4B column, and the DNA was precipitated with cold ethanol (No. 9).
  • C T4D NA under the conditions described in Reference Example 1 was obtained by combining 200 ng of SalI Kouyida pPHO 17-1, 200 ng described in Example 3, and 200 ng of the above-mentioned 0.99 kb DNA fragment. It was bound by the action of ligase. Using the reaction solution, E. coli 294 strain was transformed. The transformant was prepared by the method described in Reference Example 1, and a 0.99 kb DNA fragment containing DNA encoding adw-type P31 was transformed into PHO. A strain (Escherichia coli 294 / pPHO P31-W) carrying 5 promoters and the plasmid pPHO P31-W inserted in the forward direction was isolated.
  • the yeast host AH22R-1 is transformed by the method of Hinnen et al., And the yeast transformation retaining the plasmid is performed.
  • Sacha-romyces cerevisiae AH22R ⁇ / pPHOP31-W was isolated (see Fig. 9).
  • strains Sacharomyces cerevisiae AH 22 R- / pPHO P 31- W
  • I FO- 1 0 1 3 6 the Institute for Fermentation, also, industrial technology from September 4, 1984 year Institute of Microbiological Technology (FR replacement) 1) Accession number? £ 1 ⁇ ] ⁇ P — deposited as 7 8 2 6
  • a plasmid containing DNA encoding adw-type P31 and a PGK promoter or a GLD promoter can also be constructed according to the above method.
  • the above plasmid pTRP P31-W2 was added with 20 units of the restriction enzyme Pstl to a reaction solution of 100 [10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM ⁇ g C12, 50 mM NaCl, l After reacting at 37 ° C for 20 minutes in 37 mM dimethylthiothiol), the reaction solution is subjected to electrophoresis using 0.8% agarose-slab gel under the conditions described in Reference Example 1. . 'After electrophoresis, separate the 4.6 kb linear DNA molecule that has been cleaved at one site with Pstl from the gel by the method described in Reference Example 1 (see Fig. 10).
  • This transformant can be cultured by a usual method to obtain the desired P31.
  • Each transformant containing the P31 gene expression plasmid obtained in Examples 1 and 2 was cultured in M-9 medium containing 1.0% glucose and 1.0% casamino acid at 37 ° C for 6 hours. The cells were collected and washed with a buffer (30 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM ⁇ a C 1, 5 mM EDTA:! The cells were washed with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0). Lysate consisting of 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride, and 5 lysozyme And lysed.
  • the HBsAgl unit is the number of counts of the anti-HBsAg antibody attached to 1 ng of HBsAg small particles Auslia ⁇ —125 kit attached to 125 A.
  • Example 6 Expression of P31 gene in yeast-Example Each yeast transformant containing the P31 gene expression plasmid obtained in Examples 3 and 4 was cultured in Burkholder and its low-phosphate medium at 30 ° C for 2 days, and the cells were collected. Washed with physiological saline.
  • the recombinant D D ⁇ provided by the present invention and the transformant containing the recombinant DNA are useful for producing HBsAg P31 and provided by the present invention.
  • HBsAg P31 is useful as a vaccine useful for preventing HBV infection.

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Abstract

B-Type hepatitis virus surface antigen P31 can be prepared by culturing a transformant containing recombinant DNA having a P31-coding DNA introduced into a 3'-terminal of the promoter region.

Description

明 細 書  Specification
組み換え D N Aおよびその用途  Recombinant DNA and its uses
技術分野 Technical field
本発明は新規な組み換え DNAおよびその用途に関する。 さらに詳し くは B型肝炎ウイルス表面抗原 P 3 1をコ一ドする DNAをプロモータ 一領域の 3，末端に揷入してなる組み換え DNA ,該組み換え DNAを 含有する形質転換体および該形質転換体を培養し、 培養物中に B型肝炎 ウィルス表面抗原 P 3 1を生成蓄積させ、 それを採取することを特徴と する B型肝炎ウィルス表面抗原 P 3 1の製造法に関する。 The present invention relates to a novel recombinant DNA and its use. Further For more hepatitis B virus surface antigen P 3 1 co one de to DNA a promoter a region 3, the recombinant DNA obtained by揷入-terminated transformant and the transformant containing the recombinant DNA And producing and accumulating hepatitis B virus surface antigen P31 in the culture, and collecting the same.
背景技術 Background art
B型肝炎は、 特に熱帯アフ リ カ、 東南アジアおよび極東において多発 . するウィルス性疾患であり、 慢性肝炎や肝硬変、 さらには原発性肝ガン の原因にもなることが疫学的に示唆されている。 病因は、 DNAウィル スの 1種である B型肝炎ゥィルス （： Hepatitis B virus;以下、 HBV と略称する：)で、 それは直径 42 nmの球状粒子で発見者の名を冠して デン（ Dane 粒子と呼ばれる。 その外層には、 HBV表面抗原（以下、 HB s A gと略称する があリ、 その抗原性の違いによって adr，adw， ayr, ayw などのサブタイプに分けられているが、 日本で見いだされる のは adw型および a dr型である。  Hepatitis B is a viral disease that occurs frequently, especially in tropical Africa, Southeast Asia and the Far East, and has been epidemiologically suggested to cause chronic hepatitis, cirrhosis, and even primary liver cancer. The etiology is hepatitis B virus (HBV), a type of DNA virus, which is a spherical particle with a diameter of 42 nm and bears the name of the discoverer. The outer layer has HBV surface antigens (hereinafter abbreviated as HBsAg), which are divided into subtypes such as adr, adw, ayr, and ayw depending on their antigenicity. Adw and a dr types are found in Japan.
B型肝炎患者の血中には、. デン粒子のほかに小型粒子や管状粒子が検 出され、 これらの粒子にはデン粒子と同じ型の HBsAgが認められてい る。 ウイルスの表在性抗原に対する抗体がそのウイルスの感染を防御す ることは他のゥィルスでも知られており、 HB Vの場合にも HBsAgを もとに B型肝炎に対するワクチンの製造が考えられる。 ところ力、 HB In the blood of hepatitis B patients, small particles and tubular particles are detected in addition to den particles, and the same type of HBsAg as den particles is found in these particles. It is also known in other viruses that antibodies against a viral superficial antigen protect the virus from infection. In the case of HBV, a vaccine against hepatitis B based on HBsAg can be considered. Where power, HB
. ヽ Vはヒトゃチンパンジーにしか感染せず、 培養細胞への感染の試みは成 功していない。 そのため HBsAgはヒ ト感染者血中からの入手に限定さ れており、 得られた小型拉子などは診断用試薬の材料としての需要を満 だすだけで、 ヮクチン製造にまわすことは不可能の状態である。 ヽ V can only infect human chimpanzees, and attempts to infect cultured cells have not been successful. For this reason, HBsAg is limited to being obtained from the blood of human infected individuals, and the obtained small abductors, etc., can only be used as a diagnostic reagent material and cannot be used for production of pectin. State.
分子生物学の最近の進歩により非細菌性の蛋白質をコードする DNA を細菌に導入し、 形質転換させることが可能になってきだ。 この遺伝子 組み換えの技術を応用し、 HBsAg構造遺伝子（以下、 HBsAg遺伝子 と略称する ）を細菌内で発現させることができれば、 HBV感染の危険 性のない HBsAgを大量に調製することが可能になり、 B型肝炎ワクチ ンの実用化への道が開かれる。  Recent advances in molecular biology have made it possible to introduce and transform DNA encoding non-bacterial proteins into bacteria. If this gene recombination technology can be applied to express the HBsAg structural gene (hereinafter abbreviated as HBsAg gene) in bacteria, it will be possible to prepare large amounts of HBsAg without the risk of HBV infection. The path to practical use of hepatitis B vaccine is opened.
現在知られている 4種のサブタイプすなわち adw， adr, ayw, ayrの うち、 欧米に多い ayw型については HBsAg遺伝子の存在部位およびそ · の塩基配列が決定され!： Galibert , F. ら， ature, 2^1, 646 ( 1979)； C arnay , P. ら , Nucleic Acids Res.'， 7, 335( 1979) 〕 ，雑種蛋白質として大腸菌内での発現力 '報告されている〔 Charnay, P. ら， Nature, 286, 893(1980) ; Edman, J. C. ら ， Nature,  Among the four known subtypes, ie, adw, adr, ayw, and ayr, the location and base sequence of the HBsAg gene were determined for the ayw type, which is common in Europe and the United States !: Galibert, F. et al. Nature, 2 ^ 1, 646 (1979); Carnay, P. et al., Nucleic Acids Res. ', 7, 335 (1979)], and its expression in Escherichia coli as a hybrid protein has been reported [Charnay, P. Edman, JC et al., Nature, 286, 893 (1980).
291 , 503(1981； Jo 291, 503 (1981; Jo)
また、 日本で多く見出されている adw型および adr型については、 本 発明者らの一部は HBsAg遺伝子を含む DN Aの創製に成功し、 当該遺 伝子の DNA塩基配列ならびにゲノム上の位置を決定し、 さらにこの組 み換え！) N Aを含有する形質転換体を培養して HBs Agを大量生産する 途を開いた（特開昭 5 8 - 1 94 8 9 7号公報，特開昭 5 8 - 2 0 1 7 9 6号^，特開昭 5 9— 7 4 98 5号公報：)。  In addition, for the adw type and adr type found in Japan, some of the present inventors have succeeded in creating a DNA containing the HBsAg gene, and have determined the DNA base sequence of the gene and the genome. Determine the position, and then rearrange this! ) Culture of NA-containing transformants has opened the way to mass-produce HBsAg (Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 58-1948997 and 58-2101976). ^, Japanese Unexamined Patent Publication No. Sho 59-79485 :).
最近、 Machida, A. ら〔 astr oent erology, 85, 268 ( 1983 )つ によって示されたように、 B型 ウィ ルス e抗原陽性の患者血漿から  Recently, as shown by Machida, A. et al. (Astronomy, 85, 268 (1983),
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得られた HBsAg小型粒子中には、 従来同定されていだ P— I (分子量 2 2〜 2 4キロ 'ダルト ン ） ， P - D C分子量 2 5〜 2 9.5キロ ' ダル 卜 ン )などの主要ぺプチドに加えて〔 Peterson, D. L, ら ， Proc, Nat 1. Acad. Sci . USA, 74 , 1530( 1977；], P 3 1蛋白（分子 量 3 1キロ -ダルト ンク と P 3 5蛋白 (： P 3 1に糖が結合した複合蛋白 で分子量 3 5キロ 'ダル卜ン ）が存在していることが証明された。 P31 は P— Iの N末端に p're— S領域の5 5個のァ ミノ 残基が付加したも ので、 この領域中に重合ヒ 卜 アルブミン（： poly - HS A ) の受容体が 存在していることも明らかにされている。 一方、 肝細胞表面にもこの受 容体があることから、 poly—HS Aを介してデン粒子が肝細胞に付着 し増殖がおこると考えられている。 従って、 デン粒子上の poiy— H S A受容体が P 3 1に対する抗体でマス クされれば、 該粒子は肝細胞と結 · 合できなくなり H B V感染がより有効に予防できると期待されている。 発明の開示 '- 本発明は . Among the small HBsAg particles obtained, major elements such as P-I (molecular weight of 22 to 24 kg 'Dalton) and P-DC molecular weight of 25 to 29.5 kg' Dalton) which have been identified so far have been identified. in addition to peptide [Peterson, D. L, et al, Proc, Nat 1. Acad Sci USA , 74, 1530 (1977;..], P 3 1 protein (molecular weight 3 1 kg - Dalt links and P 3 5 protein . (: P 3 1 sugar molecular weight 3 5 kg 'Dar Bokun a composite protein bound to) has been demonstrated to be present P31 5 of P're- S region to the N-terminus of the P- I Since five amino residues have been added, it has been shown that a receptor for polymerized human albumin (: poly-HSA) exists in this region. Because of this receptor, it is thought that den-particles attach to hepatocytes via poly-HSA and proliferate, so that the poiy-HSA receptor on the den-particles is an anti-P31 receptor. In if it is masked, the particles are expected to HBV infection becomes impossible hepatocytes and binding-coupling can be more effectively prevent the disclosure of the invention '-. The present invention.
(1) B型肝炎ウイルス表面抗原 P 3 1をコ一ドする: DNAをプロモータ —領域の3， 末端に揷入してなる組み換え D NA， (1) Coding the hepatitis B virus surface antigen P31: a recombinant DNA comprising a DNA inserted into the 3rd end of the promoter region,
(2) B型肝炎ゥィルス表面抗原 P 3 1をコードする DN Aをプロモータ 一領域の3， 末端に揷入してなる組み換え I) N Aを含有する形質転換体 および (2) Recombinant DNA comprising a DNA encoding hepatitis B virus surface antigen P31 inserted at the 3 'and 3' termini of the promoter region; I) a transformant containing NA; and
(3) B fF炎ウイルス表面抗原 P 3 1をコ一ドする DNAをプロモータ —領域の 3' 末端に挿入してなる組み換え DNAを含有する形質転換体 を培養し、 培養物中に B型肝炎ウィ ルス表面抗原 P 3 1を生成蓄積させ、 それを採取することを特徴とする B型肝炎ゥィルス表面抗原 P 3 1め製 造法を提供するものである。  (3) A transformant containing the recombinant DNA obtained by inserting the DNA encoding the B fF inflammation virus surface antigen P31 into the 3 'end of the promoter region is cultured, and hepatitis B is added to the culture. An object of the present invention is to provide a method for producing hepatitis B virus surface antigen P31, which comprises producing and accumulating virus surface antigen P31 and collecting the virus.
差換え Replacement
Ο 本発明で用いられる B型肝炎ゥィルス表面抗原 P 3 1をコードする DΟ D encoding hepatitis B virus surface antigen P31 used in the present invention
N Aはいずれのサブタィプ（ adr ,adw, ayr , ayw )のものであっても よく、 たとえばそれらは下記の方法によって調製することができる。 特開昭 5 8 - 1 9 4 8 9 7号公報あるいは Nucleic Acids Res., ll, 1747 U 983 )に記載されている 3.2 kb の adw型 HBVDNAが 組み込まれたプラスミ ド PBR322— EcoHI/ΉΒ 33 C pHBV933 と略称）を制限酵素 Hpal と EcoRIで 2重消化すると、 pre— S頜 域の一部を含む 9 6 1 bp の DNA断片を得ることができる。 この断片 に〔 34Ι^¾^Ι??ΤΤΑΑ5,〕の配列を含む適当なアダプタ—を結合 させることによって P 3 1をコードする DNAを作製することができる。 まだ、 特開昭 5 9 - 7 4 9 85号公報または Nuc 1 e i c Acids Res., ϋ, 1747 (1983) に記載されている 3.19 kbの adr型 HB VDN Aが組み込まれたプラス ミ ド pBR322-BamHI/HBr 33 OCpHBr 3 3 0と略称：）を、 制限酵素 EcoRIと BamHIで 2重消化すると、 pre— S領域の一部を含む 1 39 8 b pの D N A断片を得ることができ る。 この断片に上記のアダプターを結合させることによって P 3 1をコ — ドする DN Aを調製することができる。 The NA may be of any subtype (adr, adw, ayr, ayw), for example they can be prepared by the following method. Plasmid PBR322—EcoHI / ΉΒ33C incorporating a 3.2 kb adw-type HBV DNA described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-194948 or Nucleic Acids Res., Ll, 1747 U983). pHBV933 (abbreviated as pHBV933) can be double-digested with restriction enzymes Hpal and EcoRI to obtain a 961 bp DNA fragment containing a part of the pre-S region. This fragment [3 4Ι ^ ¾ ^ Ι ?? ΤΤΑΑ5 , ] appropriate adapters comprising sequences - can be prepared DNA encoding P 3 1 by coupling. The plasmid pBR322-, in which a 3.19 kb adr-type HB VDN A described in JP-A-59-74885 or Nucl eic Acids Res., Ϋ, 1747 (1983) is still incorporated. BamHI / HBr 33 OCpHBr 330 :) is double digested with the restriction enzymes EcoRI and BamHI to obtain a 1398 bp DNA fragment containing a part of the pre-S region. By binding the above adapter to this fragment, DNA encoding P31 can be prepared.
adw HBsA P 3 1をコードする DN Aとしては第 1図に示される DN A配列のうち、 塩基配列順序 2 8〜87 3で示される. D N Aカ、 adr型 HBsAg P 3 1をコ一ドする DNAとしては第 2図で示される！） N A配列のうち、 塩基配列順序 1 0〜8 5 5で示される DN Aがあげら し o  The DNA encoding adw HBsA P31 is represented by the nucleotide sequence of 28 to 873 of the DNA sequence shown in Fig. 1. DNA mosquito, adr-type HBsAg P31 is encoded. It is shown in Figure 2 as DNA! ) Among the NA sequences, DNAs represented by the base sequence order of 10 to 855 are listed. O
また、 ： P 3 1をコードする DNAはウ ィ ルス由来のものでも、 化学合 成したものでもよい。 ' ayr型および ayw型 HBsAg P 3 1をコードする D N A_も上記した方 換ん OMPI一 ― g ― 法に準じて調製することができる。 DNA encoding P31 may be virus-derived or chemically synthesized. '' DNA_ encoding ayr-type and ayw-type HBsAg P31 is also as described above. -G-can be prepared according to the method.
この; P 3 1をコ一ドする DNAを各種宿主 (：例、 大腸菌，枯草菌，酵 母，動物細胞 )で機能するプロモータ一領域の 3， 末端に揷入すること により、 P 3 1をコ一ドする DN Aを発現させうる組み換え DN Aを構 築することができる。  By inserting the DNA encoding P31 into the end of the promoter region that functions in various hosts (eg, Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, animal cells), P31 can be introduced. It is possible to construct a recombinant DNA capable of expressing the coding DNA.
プロモータ一領域は、 RNAポリメラ一ゼが結合することによって mRNA合成を開始させるのに必要な部位を含む領域であれば、 いかな るものであってもよい。  The promoter region may be any region as long as it contains a site necessary for initiating mRNA synthesis by the binding of RNA polymerase.
だとえば大腸菌を宿主として用いる場合、 P 3 1をコードする DNA を大腸菌で機能しうるプロモータ一領域の 3， 末端に揷入すれば、 P31 をコ一ドする DNAを発現しうる組み換え DNA力 s構築できる。 たとえ ば、 特開昭 5 8 - 2 0 1 79 6号公報に記載の発現用べクタ一 pTRP- 601 , pTRP771などに、 P 3 1をコードする DNAを T 4 DNAリ ガーゼの作用により揷入する。 この反応液を用いて、' 大腸菌（例、 C 6 0 0株， 2 9 4株， W3 1 1 0株， RR l株， PR 1 3株など）を 公知の方法〔 Cohen'S.N.ら， Proc. Natし Acad. Sci. USA, 69， 2110(1972)〕もしくはそれに準ずる方法によって形質転換する。 使用するプロモーターは、 trpプロモータ一（ trp— p )に限定する 必要はなく、 だとえば recAプロモータ一〔特開昭 5 9— e 5 0 99号〕 ， lacプロモータ一，ス Pしプロモータ一などを使用してもよい。 For example, when Escherichia coli is used as a host, a DNA encoding P31 can be inserted into the 3 and terminus of a promoter region that can function in Escherichia coli, and a recombinant DNA capable of expressing DNA encoding P31 can be used. s can be built. For example, P31-encoding DNA is introduced into the expression vectors pTRP-601 and pTRP771 described in JP-A-58-201979 by the action of T4 DNA ligase. I do. Using this reaction solution, Escherichia coli (eg, C600 strain, 2904 strain, W3110 strain, RR1 strain, PR13 strain, etc.) was purified by a known method [Cohen'S.N. Et al. Proc. Nat and Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)] or a method analogous thereto. The promoter to be used does not need to be limited to the trp promoter (trp-p), for example, the recA promoter (Japanese Patent Laid-Open No. 59-e509), the lac promoter, the sp promoter, etc. May be used.
上記のようにして得られた P 3 1をコードする DN Aを含む新規な組 み換えプラスミド DN A!を保持する形質転換体は、 たとえばアンピシリ ン耐性，テ卜ラサイクリン耐性あるいはこれら両薬剤耐性を表現形とし て選ぶことができる。 なお、 2 94株は公知の菌〔 Backman，K.ら ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 73 , 4174( 197 〕であり財団法人 差換え  Transformants carrying the novel recombinant plasmid DNA containing P31-encoding DNA obtained as described above include, for example, ampicillin resistance, tetracycline resistance, or resistance to both drugs. Can be selected as an expression. The 294 strain is a known bacterium [Backman, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 4174 (197)].
ん 発酵研究所（ Institute for Fermentation, Osaka； 〕 （ I FO と略 Tることもある）に、 I O— 1 4 1 71として寄託もされてい る。 これらの耐性株の中から P 3 1をコードする N Aを含有する新規 な組み換えプラスミ ド: DN Aを保持する菌株を探し出すには、 たとえば 次の手法が用いられる。 前述したアダプタ一の一方の鎖， 5AATTCC AC GCATTGTAT3, を T 4ポリ ヌク レオチド · キナーゼによって r _32p_AT P を用いて放射性同位^ ¾で標識し、 これを探釺（ プ ローブ） として、 それ自体公知のコロニ一 *ハイブリダィゼ一シヨン法 〔 Grunstein, M. and Hogness, D. S. , Proc · Natl. Acad. Sci . USA, 3961 ( 1975 〕 によって、 すでに得た薬剤耐性の形質転換体の 中から陽性を示すク口一ンを確実に探し出すことができる。 Hmm It has also been deposited with the Institute for Fermentation, Osaka; sometimes referred to as IFO, as IO-141 171. It encodes P31 among these resistant strains A new recombinant plasmid containing NA: To search for a strain that harbors DNA, for example, the following technique is used: One strand of the adapter 1 described above, 5 AATTCC AC GCATTGTAT 3, and T 4 polynucleotide - labeled with a radioactive isotope ^ ¾ by using the r _32p_ aT P by kinase, this as a Sagu釺(probe), known per se of the colonies one * Haiburidize one Chillon method [Grunstein, M. and Hogness, DS, Proc · Natl. Acad. Sci. USA, 3961 (1975) makes it possible to reliably search for positively resistant clones among drug-resistant transformants already obtained.
このようにして選択されだ形質転換体をそれ自体公知の培地で培養す る。 培地としては、 例えば Lブロス ，ペナセィ （； Penassay )ブロスお よびグルコース，カザミノ酸を含む M— 9培地〔 Mi'ller, J., Experi- ments in Molecular Genetics, 431—433 C Cold Spring  The transformant thus selected is cultured in a medium known per se. As the medium, for example, L-9 broth, Penassay (; Penassay) broth and M-9 medium containing glucose and casamino acid [Mi'ller, J., Experiments in Molecular Genetics, 431-433 C Cold Spring
Harbor Laboratory, New York, 1972； 力 ^挙げられる。 ここに、 必要によりプロモータ一を効率よく働かせるために、 たとえば 3 ?—ィ ' ' ンド リルアク リル酸のような薬剤を加えることができる。  Harbor Laboratory, New York, 1972; Here, if necessary, a drug such as 3-hydroxyacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently.
該形質転換体の培養は通常 1 5〜 43 °C ，好ましくは 2.8 °C〜 4 0°C で 2〜2 4時間，好ましくは 4〜1 6時間行い、 必要により通気や攪拌 を加えることもできる。 - 宿主として、 たとえば酵母を利用するときには、 酵母形質転換体を次 のように^することができる。 菌一酵母シャ卜ル 'ベクタ一 YE pi 3 [Broach, J. R. ら， Gene, , l 21〔 1979 )〕， pSHl5と pSHl 9〔Harashima,S.ら， Mol. Cell.Biol., 4.771 ( 1984 ] 差換え に、 酵母プロモーター領域，たとえば抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子 プロモーター領域〔 Meyhack, B. B,EMBOJ. , 6. » 675 ( 1982 )〕， グリセルアルデヒ ド 3—リン酸デヒ ドロゲナーゼ遺伝子のプロモータ 一領域！： Hoi land, J.P. and Holland.M. J., J. Biol. Chem, 255 , 2596( 1980 〕 ，あるいは 3—ホスホグリセ口リン酸キナーゼ遺伝 子のプロモータ一領域〔 Dobson,M. J. ら ， Nucleic Acids Res., 0 , 2625C 1982； 3 を揷入したのち、 その直後に Ρ 3 1をコードす る DNAを T 4DNAリ ガーゼの作用によって結合させる。 この反応液 を用いて、 前述の宿主大腸菌を前述の Cohenらの方法によって形質転換 する。 このようにして得られた P 3 1をコードする DNAを含む新規な 組み換え DN Aを保持する形質転換体は、 たとえばアンピ リン耐性を 表現型として選ぶことができる。 この耐性株の中から P 3 1をコ一ドす る υΝΑをもつ新規な組み換えプラスミ ド DNAを保持する菌株を探し 出すには、 前述の方法が同様に用いられる。 ' Culture of the transformant is usually performed at 15 to 43 ° C, preferably 2.8 to 40 ° C for 2 to 24 hours, preferably 4 to 16 hours. If necessary, aeration and stirring may be applied. it can. -When yeast is used as a host, for example, yeast transformants can be transformed as follows. Bacteria-Yeast Shuttle 'Vector-YE pi 3 [Broach, JR et al., Gene,, 21 (1979)], pSH15 and pSHl9 [Harashima, S. et al., Mol. Cell. Biol., 4.771 (1984) Replacement In addition, a yeast promoter region, for example, an inhibitory acid phosphatase gene promoter region [Meyhack, BB, EMBOJ., 6. »675 (1982)], a glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene promoter region! Hoi land, JP and Holland. MJ, J. Biol. Chem, 255, 2596 (1980), or the promoter-region of the 3-phosphoglycerate phosphate kinase gene [Dobson, MJ et al., Nucleic Acids Res., 0, 2625C 1982: Immediately after the insertion of 3, the DNA encoding Ρ31 is ligated by the action of T4 DNA ligase, and the above-mentioned reaction mixture is used to transform the host E. coli into the method of Cohen et al. The transformant carrying the novel recombinant DNA containing the P31-encoding DNA thus obtained can be selected, for example, as a phenotype for ampilin resistance. The method described above is similarly used to search for strains that carry a novel recombinant plasmid DNA having a P31-encoding υΝΑ from among them.
" このようにして選択された形質転換体からプラス ミ ド DNAをアル力 リ抽出法〔 Birnboim，H. C. and Doly, J., Nucleic Acids Res., ， 1513 ( 1979)〕によって単離し、 これを用いて酵母、 たとえば口 ィシン要求 f生のサッカロ ミ セス · セレピ ェ（ Saccharomyces cerevisiae , たとえば A H 2 2 R— ( leu 2 his can l cir + ph。80バ Proc. Natl. Acad Sci. USA 80, 1 1983； 3 あるいは AH 2 2 R— より誘導された K 3 3 - 7 B C pho.80-AH22 , pho 8- 2 )または K 3 3 — 8 D( pho80— AH22， pho8-2 trpi； を、 公 知の方法〔 Hinnen'A. ら ， Proc. Natし Acad. Sc i · US A， 75 , 1927 ( 1978) J またはそれに準ずる方法によって形質転換する。 璋 '主としての酵母はこれらに限定されることはない力；、 サッカロミ セス · セ レビシェが好ましい。 "Plasmid DNA was isolated from the transformants selected in this manner by an extraction method (Birnboim, HC and Doly, J., Nucleic Acids Res.,, 1513 (1979)) and used. Saccharomyces cerevisiae, such as AH22R— (leu 2 his canlcir + ph. 80 Ba Proc. Natl. Acad Sci. USA 80, 1 1983) K3 3-7 BC pho.80-AH22, pho8-2) derived from 3 or AH22R— or K33—8D (pho80—AH22, pho8-2 trpi) Natn. A. et al., Proc. Nat and Acad. Sci. USA, 75, 1927 (1978) J or a method analogous thereto. No power; Saccharomyces · Serebishes are preferred.
なお、 Saccharomyces cerevisiae AH22 は財団法人発酵研 究所に I F 0— 1 0 1 3 4として寄託され、 まだ、 昭和 5 9年 9月 4 日から工業技術院微生物ェ 術研究所 ( FR I に受託番号 F E RM P— 7 8 2 4として寄託されている。 得られた酵母の形質転換体は、 それ自体公知の培地で培養する。 培地 としては、 だとえば Burkholder 最小培地〔： Bos ti an, K. L. ら ， Proc.Nat l.Acad. Sci. USA , 7 , 4505 ( 1980 ：力 s挙げられる '酵母の形質転換体の培養は通常 1 5¾〜4 0¾ ，好ましくは 2 4°C〜 3 7 で 1 0〜 9 6時間，好ましくは 2 4〜 7 2時間行い、 必要により 通気や攪拌を加えることもできる。  Saccharomyces cerevisiae AH22 has been deposited with the Fermentation Research Institute as IF 0-110 134, and is still to be deposited on September 4, 1984, with the Microorganisms Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology (FRI I). The yeast transformant is cultured in a medium known per se, such as Burkholder's minimal medium [: Bostian, KL Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7, 4505 (1980: s). Culture of yeast transformants is usually 15 1 to 40¾, preferably 24 to 37 ° C. The reaction is carried out for 0 to 96 hours, preferably 24 to 72 hours, and if necessary, ventilation and stirring can be applied.
培養後、 公知の方法で菌体を集め、 緩衝液に懸濁させたのち、 大腸菌 の形質転換体の場合にはリゾチームあるいは超音波処理によって、 また 酵母の形質転換体の場合にはザィモリエース 〔 キ リンビール㈱製〕ある いはガラスビースなどによる機械的破壊によって菌体を破壌する。 ここ へ、 ト リ 卜 ン X— 1 0 0 ,デォキシコーレ一卜などの界面活' f生剤，ある いは塩酸グァニジンなどの蛋白変性剤を加えることによって P 3 1をよ り有利に抽出することができる。 遠心分離によって得られだ上澄液から の P 3 1の単離は、 通常知られている疎水性蛋白質の精»法にしたが J よい。  After culturing, the cells are collected by a known method, suspended in a buffer, and then treated with lysozyme or sonication in the case of a transformant of Escherichia coli, or with Zymolyase (in the case of a transformant of yeast). The product breaks down by mechanical destruction with a glass bead or the like. Here, P31 can be extracted more advantageously by adding a surface active agent such as Triton X-100, deoxycore, or a protein denaturant such as guanidine hydrochloride. Can be. Isolation of P31 from the supernatant obtained by centrifugation may be performed by a generally known method for purifying a hydrophobic protein.
ί¾¾物の P 3 1活性は、 だとえば試料をブ cム " アンで活 化された セルロース ·ペーパーに結合させたのち、 オースリア Π— 1 2 5 ( ダイ ナボッ卜社製）の125 I—抗 HBsAg抗体と反応させる direct immunoassay法「 Fuj isawa，Y.ら, Nucleic Acids Res. , 1 _l ， 3581 (1983)〕 （二よって測定することカできる。 The P31 activity of the animal can be measured, for example, by binding the sample to cellulose paper activated with bucmane and then using 125 A (available from Dynabot Inc.) Direct immunoassay method for reaction with anti-HBsAg antibody [Fujisawa, Y. et al., Nucleic Acids Res., 1_l, 3581 (1983)].
差換え OMPI _ Replacement OMPI _
' WIF0~ 宿主として、 たとえば枯草菌，動物細胞を使用する場合においては枯 草菌，動物細胞で機能しうるプロモータ一領域の 3' 末端に P 3 1をコ ードする DN Aを挿入し、 自体公知の方法により、 該組み換え DN Aで 宿主を形質転換させ、 形質転換体を培養することにより、 P 3 1を製造 することができる力' 宿主としては 菌，酵母がより好ましい。 生成される P 3 1はグリコシル化されていても、 また、 グリコシル化 されていなくてもよレヽ。 、 - 一般に、 H Bs Ag D N Aを含有する形質転換体は表面抗原遺伝子産物 の産生により、 形質転換体自体の生育が阻害されることが知られている 力；、 本発明によれば P 3 1をコードする DNAを用いると生育阻害が解 除され、 P 3 1の産生量が増大する。 '' WIF0 ~ For example, when using Bacillus subtilis or animal cells as a host, a DNA encoding P31 is inserted into the 3 'end of a promoter region which can function in Bacillus subtilis or animal cells, and a known DNA is used. By transforming a host with the recombinant DNA according to the method, and culturing the transformant, bacteria and yeast are more preferable as a host capable of producing P31. The generated P31 may or may not be glycosylated. - Generally, H Bs A transformant containing the g DNA by production of surface antigen gene products, the force is known to growth of the transformant itself is inhibited;, P 3 according to the present invention The use of DNA encoding 1 eliminates growth inhibition and increases P31 production.
明細書，請求の範囲，図面および要約書で用いる記号の意義は第 1表 に示すとおりである。 DNA デォキシ リボ核酸  The meaning of symbols used in the description, claims, drawings and abstracts is as shown in Table 1. DNA deoxyribonucleic acid
RNA リボ核酸  RNA ribonucleic acid
m RN A メッセンジャー UNA  m RN A Messenger UNA
A · ' アデニン  A · '' Adenine
T チミン  T thymine
G グァニン  G Guanin
C シ 卜 シン  C Sit Shin
d A T P デォキシアデノシン三リン酸  d ATP Deoxyadenosine triphosphate
d T T P デォキ i /チミジン三リン酸  d T T P deoki i / thymidine triphosphate
d GT P デォキシグアノシン三リン酸  d GT P Deoxyguanosine triphosphate
d C T P デォキシシチジン三リン酸 差換え ATP アデノシン三リン酸 d CTP Deoxycytidine triphosphate Replacement ATP Adenosine triphosphate
E DTA エチレンジァ ミ ン四酢酸 E DTA Ethylenediaminetetraacetic acid
S DS ドデシル硫酸ナ卜 リ ウム  S DS sodium dodecyl sulfate
G 1 y グリシン  G 1 y Glycine
A 1 a マラニ、ノ  A 1 a
V a 1 ノ《リン  V a 1 no 《Rin
Le u ロイ シン  Le u Roy Shin
l i e イ ソロイ シン l i e I Soroi Shin
S e r セ リ ン  Ser Serine
T h r スレオニン  T h r threonine
C y s システィン  C y s Sistine
Me t メチォ.ニン  Me t Mechi. Nin
G 1 u グルタ ミ ン酸  G 1 u Glutamate
As p ァスパラギン酸  As p Aspartic acid
L y s リ ジン  Lys resin
A r g アルギニン  A r g Arginine
H i s ヒスチジン  H is histidine
P h e フェニルァラニン  P he Phenylalanine
T y r チロシン  T y r tyrosine
T r p ト リプ卜 ファン  T r p Trip Fan
P r o プロリ ン  Pro proline
A s n ァスノ ラギン  A s n Asno Lagin
G i n グルタ ミン  G in Glutamine
ΑρΓ アンピシ リン耐性遺伝子 Αρ Γ Ampicillin resistance gene
Tcr テ卜ラサイクリ ン耐性遺伝子 Tc r Te Bok Rasaikuri down resistance gene
差換え OMPI PR PB プロモーター Replacement OMPI P R P B promoter
ars l ォ一 卜 ノマス ♦ レフ"リ ケーシヨン ' シークェンス l  ars l ノ Nomas ♦ Ref “Rec” 'Sequence l
(autonomous replication sequence l )  (autonomous replication sequence l)
I R ィンバーテツド ' リピ一卜 (inverted repeat ) 図面の簡単な説明  I R inverted 'inverted repeat' Brief description of the drawings
第 1図は adr型 HBsAgP 3 1をコードする DNA配列 (：上段）およ び対応するァミノ酸配列（下段）を示す。  FIG. 1 shows the DNA sequence encoding adr-type HBsAgP31 (: upper row) and the corresponding amino acid sequence (lower row).
第 2図は adw型 HBsAgP 3 1をコ一ドする DNA配列（上段）およ び対応するァミノ ¾@£列（下段 )を示す。  FIG. 2 shows the DNA sequence encoding adw-type HBsAgP31 (upper row) and the corresponding amino acid sequence (lower row).
第 3図はプラス ミ ド PPH017— 1の構築図を示し、 記号 E , S , B , Fig. 3 shows the construction diagram of plasmid PPH017-1 with the symbols E, S, B,
Hおよび Xはそれぞれ Ec oRI , S a 1 I , BamHI , H i n d Iおよび Xholを表わす。 - 第 4図はプラス ミ ド pPKT 700—1の構築図を示し、 記号 E ,'S ， ΒH and X represent EcoRI, Sa1I, BamHI, HindI, and Xhol, respectively. -Figure 4 shows the construction diagram of the plasmid pPKT 700-1 with the symbols E, 'S, Β
, Hおよび Xはそれぞれ Ec oRI , Sa 1 I , B aniHI-, Hi n d I および Xholを表わす。 , H and X represent EcoRI, Sa1I, BaniHI-, HindI and Xhol, respectively.
第 5図はプラスミ ド PGLD906— 1の構築図を示し、 記号 ， S , B , Hおよび Xはそれぞれ EcoM , Sa 1 I , BamHI ,Hi ndf および Xholを表わす。  FIG. 5 shows a construction diagram of the plasmid PGLD906-1, wherein symbols, S, B, H and X represent EcoM, Sa1I, BamHI, Hindf and Xhol, respectively.
第 6図は大腸菌用 adr型 HBsAgP 3 1の発現プラスミ ド pTRP P 3 1—Rの構築図を示し、 記号 ， B ， Cおよび JPはそれぞれ Eco RI， BamHI , Clalおよび Ps t Iを表わす。  FIG. 6 shows a construction diagram of the expression plasmid pTRP P31-R for adr-type HBsAgP31 for Escherichia coli, where the symbols, B, C and JP represent EcoRI, BamHI, Clal and PstI, respectively.
第 7図は大腸菌用 adw型 HBsAgP 3 1の発現プラスミ ド pTRP P 3 1—W2の構築図を示し、 記号 _E , B , Cおよび Pはそれぞれ Eco RI , BamHI , Clalおよび； Pst Iを表わす。  FIG. 7 shows a construction diagram of the expression plasmid pTRP P31 -W2 for adw-type HBsAgP31 for Escherichia coli, where the symbols _E, B, C and P represent EcoRI, BamHI, Clal and PstI, respectively.
第 8図は酵母用 adr型 HBsAgP 3 1の発現プラス ミ ド pGL D P 31 左換え f OMPI — R , pPHO P3 1— Rおよび pPKT P 31— Rの構築図を示し、 記 号 E , B , S , H , Xおよび Cはそれぞれ EcoRI , BamHI， Sal I， Hindi, Xh o Iおよび C 1 a Iを表わす。 Figure 8 shows the expression plasmid for adr-type HBsAgP31 for yeast pGL DP31 left-handed fOMPI — R, pPHO P3 1—R and pPKT P31—R are shown in the construction diagram, symbols E, B, S, H, X and C are EcoRI, BamHI, SalI, Hindi, XhoI and C1 respectively. a Represents I.
第 9および 1 0図は酵母用 adw型 HBsHgP 3 1の発現プラス ミ ド pPHO P 3 ί—Wの構築図を示し、 記号 B , P , B , C , Sおよび H はそれぞれ EcoRI , Ps t I , BamHI ,C 1 a I , Sa 1 Iおよび Hi ndH を表わす。 - 発明を実施するための最良の形態  FIGS. 9 and 10 show the construction diagrams of the expression plasmid pPHO P 3 ί—W of the adw-type HBsHgP31 for yeast, and the symbols B, P, B, C, S and H are EcoRI and Pst I, respectively. , BamHI, C1aI, Sa1I and HindH. -Best mode for carrying out the invention
参考例 1 酵母抑制性酸性ホスファターゼ ' プロモータ一（PH05— P) を含有する発現用ベクターの作製 Reference Example 1 Preparation of Expression Vector Containing Yeast-Suppressing Acid Phosphatase 'Promoter-1 (PH05-P)
酵母 Saccharomyces cerevisiae S 2 8 8 C 株由来の抑制性酸 f生ホ スファタ一ゼ遺伝子（PH05)と構成性酸性ホスファタ一ゼ遺伝子（ P . "HO 3 を含む 7· 9 k b DN A断片を含む大腸菌プラスミ ド（pJAl) 〔 Kramer ,R. A. and Anderson, N， Proc. Natl. "Acad. Sci. USA , 77 , 6541 C 1980 j , 5 0 ？に 2 0ュニッ トの lj限酵素 BamHI 〔宝酒造㈱製〕 と 2 0ュニッ 卜の制限酵素 Sail 〔宝酒造㈱製〕を  Escherichia coli containing a 7.9 kb DNA fragment containing the inhibitory acid f-raw phosphatase gene (PH05) and the constitutive acid phosphatase gene (P.HO3) derived from the yeast Saccharomyces cerevisiae S288-C Plasmid (pJAl) [Kramer, RA and Anderson, N., Proc. Natl. "Acad. Sci. USA, 77, 6541 C 1980 j, 50? 20 units of lj restriction enzyme BamHI [Takara Shuzo Co., Ltd.] And 20 units of restriction enzyme Sail (Takara Shuzo)
I 0 0 μ£ の反応液〔 1 0 mM Tr is-HC 1 (pH 8.0 , 7 mM Mg C 12， 1 0 0 mM NaC 1， 2 mM 2—メルカプトエタノール〕中で 3 7 •C , 3時間作用させた後、 1.0 %ァガロース（ Sigma 社製 ） ' スラブ ゲルを用いて緩衝液〔 1 0 OmM Tr is-HC 1 , 1 0 0 mM ホウ酸， 2 mM EDT A C pH 8.3 ) 〕中.， 1 0 V , 2時間電気泳動にかけだ。 泳動後、 0.6 3 kb DN A断片を含むゲル片を透析チューブ内に封入し、 泳動用緩衝液内に沈め、 該 DNA断片をゲルから電気的に溶出した I 0 0 mu £ of reaction solution [1 0 mM Tr is-HC 1 (pH 8.0, 7 mM Mg C 1 2, 1 0 0 mM NaC 1, 2 mM 2- mercaptoethanol] 3 7 in • C, 3 After allowing to act for a time, use 1.0% agarose (manufactured by Sigma) in a buffer solution (10 OmM Tris-HC1, 100 mM boric acid, 2 mM EDT AC pH 8.3) using slab gel. Start electrophoresis at 10 V for 2 hours. After the electrophoresis, the gel fragment containing the 0.63 kb DNA fragment was sealed in a dialysis tube, submerged in an electrophoresis buffer, and the DNA fragment was electroeluted from the gel.
DcDonell,M.W. ら ， J.Mol.Biol, 110 , 119( 1 977 ) 〕。 透析チ ュ- ブ内液をフエノ一ル抽出さらにエーテル抽出した後、  DcDonell, M.W. et al., J. Mol. Biol, 110, 119 (1977)]. After extracting the solution in the dialysis tube with phenol and ether,
差涣ぇ Difference
Figure imgf000014_0001
Mになるように加え、 つづいて 2倍量の冷 タノールを加えて— 2 0。C で DNAを沈澱させだ。
Figure imgf000014_0001
Add to volume M, then add 2 volumes of cold ethanol— 20 . Precipitate the DNA with C.
\ のプラス ミ ド pSHi 9 に 2ユニッ トの制限酵素 BamHIと 2 ュニッ 卜の制限酵素 Sal Iを 2 0 の反応液〔 1 ひ mM Tris-HCl C pH 8.0 , 7 mM MgCl2 , 1 0 0 mM NaCl , 2 mM 2—メルカプ 卜エタノール〕中で 3 7°C , 2時間作用させた後、 該反応液を 0.8 %ァ ガロース · スラブゲルを用いて上述の条件下で電気泳動にかけだ。 泳動 後、 8.0 kb DNA断片を上述の方法によってゲルから分取し、 フエノ —ルで除蛋白し、 冷ェタノ 一ルで！) N Aを沈澱させた（第 3図参照）。 該 8.0 kb DNA断片 4 0 0 n gと前記 0.6 3 kb DNA断片 2 0' 0 ng とを混合し、 2 0 の反応液に 6 6 mM Tris-HCl ( pH 7.6 ) , 6.6 mM MgCl 2 , 1 0 mMジチ才スレイ 卜 ール ， 1 mM AT P ， 2ュニ ッ卜の T 4 D NAリガーゼ（宝酒造㈱製：） 〕中、 1 4°Cで一夜作用させ て DNAを結合させた。 この反応液を用いて大腸菌 2 9 4株を前記 Cohen らの方法に従って形質転換した。 アンピシリ ン耐性を指標とし て選択された形質転換体の中から、 プラスミ ド DNAを前記アルカ リ抽 出法によって単離し、 分子量と制限酵素による分解パターンを調べ、 pSHl 9の BamHI— Sa 部位に、 pjAl から単離された 0.6 3 kb DNA断片が揷入されたプラスミ ド pPHOl 2を分離した（第 3図参照:)。 \ Positive Mi de PSHi 9 to 2 units restriction enzyme BamHI and 2 Yuni' 2 0 reaction liquid restriction enzyme Sal I in Bok [1 Facial mM Tris-HCl C pH 8.0, 7 mM MgCl 2, 1 0 0 mM After reacting at 37 ° C. for 2 hours in NaCl, 2 mM 2-mercaptoethanol], the reaction solution was subjected to electrophoresis using 0.8% agarose-slab gel under the above conditions. After the electrophoresis, the 8.0 kb DNA fragment was collected by minute from the gel by the method described above, Fueno - deproteinized Le, with cold Etano Ichiru! ) NA was precipitated (see Figure 3). 400 ng of the 8.0 kb DNA fragment and 20'0 ng of the above 0.63 kb DNA fragment were mixed, and 66 mM Tris-HCl (pH 7.6), 6.6 mM MgCl 2, 10 The DNA was allowed to act overnight at 14 ° C. in 1 mM ATP, 1 mM ATP, 2 units of T4 DNA ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.). Using this reaction solution, Escherichia coli 294 was transformed according to the method of Cohen et al. Plasmid DNA was isolated from the transformants selected using ampicillin resistance as an index by the above-described alkaline extraction method, and the molecular weight and the degradation pattern by restriction enzymes were examined. At the BamHI-Sa site of pSHl9, A plasmid pPHOl2 into which a 0.63 kb DNA fragment isolated from pjAl was inserted was separated (see FIG. 3).
3 のプラス ミ ド pPHOl 2 DNAに 2ュニッ 卜 の制限酵素 Sal I を 2 0 ί の反応液に 1 0 mM Tris— HC1 (ρΗ 7.5 , 7mMMgC 1„ , 1 7 5 mM NaC 1 , 0.2 M E D T A , 7 mM 2—メルカプ卜ェタノ一 ル 〕中で 3 7 ， 2時間作用させた後、 フエメールで除蛋白し、 冷エタ ノールで DN Aを沈澱させた。 この DNA , Ζμ に 1 2ュニッ 卜の B A L 3 1ヌク レアーゼ（ Bethesda Research Laboratories社製 を 換え / OMPI 5 0 £ の反応液〔 2 0 mM Tr is-HC 1 ( H 8.1 ； , 1 2 mM Ca C 12 , 1 2 mM MgCl2 , 1 mM E I) T A〕中で 3 0 °C , 2分間作用さ せた後、 フエノールで除蛋白し、 冷エタノールで DNAを沈澱させた 第 3図参照：)。 3 plasmid pPHOl 2 DNA and 2 units of restriction enzyme Sal I in 20 ml of reaction solution 10 mM Tris-HC1 (ρΗ7.5, 7 mM MgC 1 „, 175 mM NaC 1, 0.2 MEDTA, 7 mM 2—mercaptoethanol] for 37 to 2 hours, deproteinized with female email, and precipitated with cold ethanol.12 Units of BAL 3 in DNA, こ の μm 1 Nuclease (changed from Bethesda Research Laboratories) / OMPI 5 0 £ of reaction solution [2 0 mM Tr is-HC 1 (H 8.1;, 1 2 mM Ca C 1 2, 1 2 mM MgCl 2, 1 mM EI) TA ] 3 0 ° C, 2 min act in After that, the proteins were deproteinized with phenol and the DNA was precipitated with cold ethanol: see Fig. 3 :).
2 0 Ong の Xhol リンカ一 d ( C C T C G AGG ) N ew England 20 Ong's Xhol Linker d (C C T C G AGG) New England
BioLabs 社製〕に 3ュニッ 卜の T 4ポリヌク レオチド ' キナーゼ〔宝 酒造㈱製〕を 5 0 μ£ の反応液〔 5 OmM Tris-HCl(pH 7. β ) ， 1 0 mM MgCl2 , 1 0 mM 2 —メルカプ卜エタノール ， 1 0 0 M AT P〕中で 3 7°C， 1時間作用させて、 5'末端をリン酸化した。 BioLabs) and 3 units of T4 polynucleotide 'kinase (Takara Shuzo) in 50 μ £ reaction solution [5 OmM Tris-HCl (pH 7.β), 10 mM MgCl 2 , 10 mM 5'-end was phosphorylated at 37 ° C for 1 hour in mM 2 -mercaptoethanol, 100 M ATP].
4 ng の 5'末端がリ ン酸化された X hoi リ ンカ一〔 5'— P— d ( C C 4 ng of 5'-phosphorylated X hoi linker [5'-P-d (CC
TCGAGG ) 〕と 4 0 0 ngの前述の BAL― 31で処理された pPHO 1 2 DNAとを混合し、 前述の条件下で T 4 DNAリガーゼの作用で結 合させた。 この反応液を用いて大腸菌 2 9 4株を Cohen らの方法に従 つて形質転換した。 アンピシリン耐性を指標として選択された形質転換 体の中から、 プラス ミ ド DNAを前記アルカリ抽出法によって単離し、 BamHI と Xhol による 2重消化物の大きさが 0.5 5 kb であるプラス ミ ド pPHO 17を選択した。 BAL— 3 1ヌク レアーゼ処理に-よって、 PHO 5 の開始コドン ATGの上流 2 0 b p が除去されだことが、 TCGAGG)] and 400 ng of pPHO12 DNA treated with BAL-31 described above were mixed and ligated under the conditions described above by the action of T4 DNA ligase. Using this reaction solution, E. coli 294 was transformed according to the method of Cohen et al. Plasmid DNA was isolated from the transformants selected using ampicillin resistance as an indicator by the alkaline extraction method, and plasmid pPHO17 having a double digest of 0.55 kb with BamHI and Xhol was 0.55 kb. Was selected. BAL—31 nuclease treatment removed 20 bp upstream of the ATG initiation codon ATG.
D i deoxynuc leo t i de 法 S an ge r , F. ら ， Proc. Natl .Acad. Sci, USA, 7 4 , 5463 ( 1977 )：)による DNA塩基配列の分析によって明 らかになつた（第 3図参照 。 The analysis was made clear by DNA nucleotide sequence analysis using the Di deoxynuc leotide method Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 74, 5463 (1977) :). See Figure 3.
次に、 該プラス ミ ド pPHO 17 , 2 μ9 に 4ュニッ卜の制限酵素 Xho I 〔宝酒造㈱製〕を 2 0 μ£ の反応液 (： 6mM Tris-HCl (ρΗ7.9 : 1 5 0 mM NaCl , 6mM MgCl2 , 6 mM 2 —メルカプ卜エタノール 〕中で3 7°C , 2時間作用させた後、 フエノールで除蛋白し、 冷ェタノ 差換え ールで DNAを沈澱させた。 Next, 4 μl of restriction enzyme XhoI (Takara Shuzo) was added to the plasmid pPHO 17, 2 μ9 and 20 μ £ of a reaction solution (6 mM Tris-HCl (ρΗ7.9 : 150 mM NaCl). , 6mM MgCl 2, 6 mM 2 - mercapto Bok ethanol] after act 3 7 ° C, 2 hours in, deproteinized with phenol, cold Etano presumed dead, switch To precipitate the DNA.
該 DNA 1 ？ に 5ユニッ トの DNAポ リメラ一ゼ I ラージ ' フ ラグメ ン 卜 （New England Bio Labs社製〕を 3 0 μί の反応液〔 4 0 mM リン酸カリ ゥム緩衝液（ pH 7.5 ) , 6.6 mM MgCl2 , 1 mM 2—メ ルカプ卜エタノール i 3 3 ίΜ d ATP , 3 3 M dGTP , 3 3 μΜ dTTP， 3 3 ίΜ dCTP〕中で 1 2°C , 3 0分間作用させて、 接 着末端を平滑末端にしだ後、 フエノ ールで除蛋白し、 冷エタノールで D ΝΑを沈澱させた。 該 DNA断片 5 0 Ong と、 前述の条件下で.リン酸 化されだ Sa リンカ一〔 5'— P— d ( GGT CGACC ) 〕 ( New England BioLabs社製：） , 5 0 ng とを混合し、 前述の条件下で T 4 DNAリ ガーゼの作用で結合させた。 この反応液を用いて大腸菌 2 9 4 株を Cohen らの方法に従って形質転換させ、 アンピシリ ン耐性の形質 転換体の中から、 プラスミ ド pPHOl 2の Xhol部位が Sail部位に変 換したプラスミ ド pPHO 12— 1 を取得した（第 3図参照：)。 The DNA 1? 5 units of DNA Primer I Large 'Fragment (New England Bio Labs) was added to 30 µl of the reaction solution [40 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), 6.6 mM MgCl 2 , 1 mM 2-mercaptoethanol i 33 ίΜ d ATP, 33 M dGTP, 33 μ Μ dTTP, 33 ίΜ dCTP] at 12 ° C for 30 min. The DNA fragment was blunt-ended, deproteinized with phenol, and precipitated with cold ethanol.The DNA fragment (50 Ong) and the phosphorylated Sa linker [5 ' —P—d (GGTCGACC)] (New England BioLabs :), 50 ng, and allowed to bind under the conditions described above by the action of T4 DNA ligase. The 294 strain was transformed according to the method of Cohen et al., And the plasmid pPHOl2 in which the Xhol site of the plasmid pPHOl2 was changed to the Sail site was selected from the ampicillin-resistant transformants. 12-1 was obtained (see Fig. 3).
参考例 2 酵母ホスホグリセリン酸キナーゼ ' プロモータ一（ P G -Reference Example 2 Yeast phosphoglycerate kinase 'promoter-1 (PG-
P を含有する発現用ベクターの作製 Construction of expression vector containing P
① ホスホグリセリ ン酸キナーゼ遺伝子 (： PGK〕のクローニング ① Cloning of phosphoglycerate kinase gene (PGK)
Cryer,D.R.らの方法！ Methods in Cell Biology, Vol. XII, P.39~44( 1975；〕によって調製された Saccharomyces cere- visiae協会 3号株（ I FOから入手できる の染色体 DNA , 3 5 0 g に 2 0 0ュニットの制限酵素 Hind I 〔宝酒造㈱製〕を 1 meの反応 液〔 1 OmM Tris-HCl ( H 7.5 ) ， 7 mM MgC 12 , 6 0 mM NaC 1 〕中 3 7 ， 3時間作用させだ後、 1 %ァガロース · スラブゲル を用いて参考例 1に記載の条件下で電気泳動にかけた。 泳動後、 ァガロCryer, DR's method! Methods in Cell Biology, Vol. XII, p. 39-44 (1975;), prepared by Saccharomyces cerevisiae Society No. 3 (chromosomal DNA available from IFO, 200 units per 350 g). restriction enzyme Hind I a [Takara Shuzo Co., Ltd.] 1 me of a reaction solution [1 OmM Tris-HCl (H 7.5 ), 7 mM MgC 1 2, 6 0 mM NaC 1 ] 3 7, 3 hours after reacted, 1 The gel was subjected to electrophoresis using the agarose slab gel under the conditions described in Reference Example 1.
'スゲルを分割することにより DNA断片を大きさの順ヒ 1から 1 0の 差換え 画分に分.けた。 各画分のァガロースゲル片をそれぞれ透析チューブに封 入し、 参考例 1に記載の条件下でゲル片から DNAを電気的に溶出した。 'Replace DNA fragments in order of size from 1 to 10 by splitting sgel Divided into fractions. An agarose gel piece of each fraction was sealed in a dialysis tube, and DNA was electrically eluted from the gel piece under the conditions described in Reference Example 1.
溶出液をフエノ 一ル処理した後、 冷エタノールを加えて DN Aを沈澱さ せた。 各画分からの DN A 0.5 ί ^ を 1 %ァガロース ' スラブゲルを 用いて参考例 1に記載の条件下で電気泳動を行つだ後、 ニトロセルロー スフィノレタ一 C Schleicher and Schul 1 社製； (二 Southernの方法 〔 Southern, E.M., J. Mol. Biol" 9_8 , 503 ( 1975 )〕に従って DN After the eluate was treated with phenol, DNA was precipitated by adding cold ethanol. After electrophoresis of DNA 0.5ί ^ from each fraction using 1% agarose 'slab gel under the conditions described in Reference Example 1, nitrocellulose finoleta C Schleicher and Schul 1; [Southern, EM, J. Mol. Biol "9_8, 503 (1975)]
Aを吸着させた。 P GK〔 Dobson, M. J. ら， Nucleic Acide Res , A was adsorbed. P GK [Dobson, M. J. et al., Nucleic Acide Res,
1_0 , 2625 ( 1982 )〕の N末端側からの 5個のアミノ酸をコ一 ドする オ リ ゴヌク レオチ ドに相補な 5'—TGAAGATAAAGACAT— 3 Crea， R.ら〔； Proc.Natl. Acad. Sci. USA , 75 ， 5765(1978 )〕の方法 によって合成し、 該オリ ゴヌク レオチ ド 1/ ^に l 0 iCiの r—〔32P〕- . 1_0, 2625 (1982)], 5'-TGAAGATAAAGACAT-3 Crea, R. et al., Which is complementary to an oligonucleotide encoding the five amino acids from the N-terminal side; Proc. Natl. Acad. Sci. . USA, 75, 5765 (1978 ) was synthesized by the method of], r- of the cage Gonuku Reochi de 1 / ^ to l 0 ICI [32 P] -.
AT P C Amersham社製） と 1 0ュニッ ト の T 4ポリヌク レオチ ド 。 ATPC Amersham) and 10 units of T4 polynucleotide.
キナーゼとを 3 0 ^ の反応.液〔 5 OmM Tris-HClC pH 7.6 , Reaction of kinase with 30 ^ solution (5 OmM Tris-HClC pH 7.6,
10 mM MgC 12 , 1 0mM2—メルカプトエタノール〕中で 3 7°C , 10 mM MgC 12, 10 mM 2- mercaptoethanol] at 37 ° C,
3 0分間作用させ、 5'末 ί¾を32 JPで標識した。 該反応液に 2 0 OmM The mixture was allowed to act for 30 minutes, and the 5 ′ terminal was labeled with 32 JP. 20 OmM
ED A C ρΗ 8· 0 )を 1 0 ί 添加し、 1容量のフエノ ールで除蛋白 した後、 TEN緩衝液 (： 1 OmM Tris -HC1 (pH 8.0 , 2 0 0 mM After adding 10 ί of EDAC (80Η) and deproteinizing with 1 volume of phenol, TEN buffer (1 OmM Tris-HC1 (pH 8.0, 200 mM)
NaCl , 1 mM E DT A〕で平衝化したセファロ一ス 4 B( Pharmacia 社製 ' カラム（ 0.2 5 X 2 5C7B )に力 ナて void volume 付近に溶出 される標識された該ォリ ゴヌクレオチ下を集め、 P GK遺伝子をスクリ —ニングするためのプローブとして用いた。 上記の二トロセル口一スフ ィルターと該プローブを用いて前記 Southernの方法でブロッティ ング を行ったところ、 プローブは、 2.6 k b〜 2.9 kb DNA断片が含まれ る分画番号 3の試料と強くハイブリダィ ズしだ。 NaCl, 1 mM EDTA], and the column was eluted near the void volume by force on Sepharose 4B (Pharmacia's column (0.25 × 25C7B)) equilibrated with the labeled oligonucleotide. When the blotting was performed by the Southern method using the above-described two-trocell filter and the above-mentioned probe, the probe was found to have a size of 2.6 kb or less. It hybridized strongly with the sample of fraction number 3 containing the 2.9 kb DNA fragment.
差換え .' .。： -' 、 Replacement. '.. :-',
、 、 次に、 クロ一ニング 'ベクタ一 pTR 26 2〔 Roberts, T.M. ら， Gene, 1 2 , 123 ( 1980)3 , 1 0 /^ に 1 0ュニッ 卜の制限酵素 Hindiを 5 0 の反応液〔 1 0 mM Tri s - HC 1 ( pH 7.5 , 7 mM MgCl2 , 6 OmM NaC 1〕中で 3 7°C， 2時間作用させた後、 フエノ —ルで除蛋白し、 冷エタノールで DNAを沈澱させた〔 Hindu 消化 pTR262 )。 Hindi消化 pTR 262 0.1 μ 9 と分画番号 3の DNA 0.2 ？ とを混合し、 参考例 1に記載の条件下で Τ 4 DNAリガ一ゼの 作用によって結合させた。 該反応液を用いて大腸菌 DH 1 CManiatis, T. ら , Molecular Cloning, Co Id Spr ing Harbor Laboratory, 254〜 25 5 ( 1982 ) 〕 を形質転換させ、 テトラサイクリ ン耐性を示 す形質転換体約 1 3 0 0個を得だ。 この中から P GK遺伝子を含有する 形質転換体を、 上述の32 P標識合成プローブを用いるコロニー 'ハイブ ： リダイゼ一シヨン〔 Suggs, S.V. ら ， Proc. Natl. Acad. Sci. ,, Next, 10 units of the restriction enzyme Hindi were added to 50 reaction mixtures [1] in Cloning 'vector-1 pTR262 [Roberts, TM et al., Gene, 12, 123 (1980) 3, 10 / ^. 0 mM Tri s - HC 1 ( pH 7.5, 7 mM MgCl 2, 6 OmM NaC 1 ] after act 3 7 ° C, 2 hours in, Fueno - deproteinized Le, the DNA was precipitated with cold ethanol [Hindu digestion pTR262). Hindi digested pTR 262 0.1 μ9 and fraction 0.2 DNA 0.2? Were mixed under the conditions described in Reference Example 1 by the action of Τ4 DNA ligase. The reaction solution was used to transform E. coli DH1 CManiatis, T. et al., Molecular Cloning, Co Id Spring Harbor Laboratory, 254-255 (1982)], and about 1 transformant showing tetracycline resistance was transformed. I got 300 pieces. From among these, transformants containing the PGK gene were cloned using the above-mentioned 32 P-labeled synthetic probe in a colony 'Hive: Lydidase [Suggs, SV et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
US A , 7_8 ' 6613 (1981； J によって選択しだ。 ォー卜 ラジオグ ラフィ一で強いシグナルが認められた形質転換体から、 前述のアル力リ 抽出法によってプラスミ ド pPKT3を単離し、 Hindm で分解したとこ ろ 2. 9 5 k b UN Aのィンサ一トが検出され、 Southernの方法で調べ ると該インサー卜は該プローブとハイプリすることが確認されだ。 U.S.A., 7_8 '6613 (1981; selected by J. Plasmid pPKT3 was isolated from transformants that showed a strong signal in the autoradiography by the above-described extraction method, and was transformed with Hindm. At the time of decomposition, an insert of 2.95 kb UNA was detected. Examination by the Southern method confirmed that the insert hybridized with the probe.
② PGKプロモータ一断片の単離 ② Isolation of one fragment of PGK promoter
プラス ミ ド pPKT3l N A 5 0 に 5 0ュニッ 卜の制限酵素  Plasmid pPKT31 NA 50 to 50 units of restriction enzyme
Hindiを 1 0 Ο ί^の反応液〔 1 0 mM Tris-HCl (pH 7.5 ) , 7 mM MgCl2 , 6 0 mM NaC 1 〕中で 3 7°C， 2時間作用させた後、 1 %ァガロース · スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気泳動 に力 ナだ。 泳動後、 2.9 5 k b DNA断片を参考例 1に記載の方法によ つてゲルから分取した（第 4図参照：)。 After reacting Hindi at 37 ° C for 2 hours in a 10 の ί ^ reaction solution (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl 2 , 60 mM NaC 1), 1% agarose · Use of slab gel for electrophoresis under the conditions described in Reference Example 1. After the electrophoresis, a 2.95 kb DNA fragment was fractionated from the gel by the method described in Reference Example 1 (see FIG. 4).
差換え 該 2.9 5 kb DNA断片 5 に 5ュニッ トの制限酵素 SailをReplacement 5 units of restriction enzyme Sail was added to the 2.95 kb DNA fragment 5.
2 0 の反応液〔 1 0 mM Tr is-HC 1 ( pH 7.5 ) , 7mM MgCl2, 1 75 mM NaCl , 7 mM' 2—メルカプ卜エタノール〕中で 3 7。C , 3 時間作用させだ後、 1.2 %ァガロース ' スラブゲルを用いて参考例 1に 記載の条件下で電気泳動にかけた。 泳動後、 2.1 kb DNA断片を参考 例 1に記載の方法によってゲルから分取しだ。 該 2.l k b DNA断片 0.5 と、 プラス ミ ド pBR322の Hindi— Sal I 消化によって得ら れだ 3.74 k b DNA 0.5/^ とを混合し、 参考例 1に記載の条件下 で T 4DNAリガーゼの作用によって結合させた。 該反応液を用いて大 腸菌 DH 1を形質転換させ、 アンピシ リ ン耐性の形質転換体から所望す るブラス ミ ド pPKT 101 を取得した (：第 4図参照 ) ο 2 The reaction solution [1 0 mM Tr is-HC 1 (pH 7.5), 7mM MgCl 2, 1 75 mM NaCl, 7 mM '2- mercapto Bok ethanol] 0 3 in 7. After allowing C to act for 3 hours, the mixture was subjected to electrophoresis using 1.2% agarose 'slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After the electrophoresis, a 2.1 kb DNA fragment was separated from the gel by the method described in Reference Example 1. With the 2 .lkb DNA fragments 0.5, mixing the resulting et Leda 3.74 kb DNA 0.5 / ^ and by Hindi- Sal I digestion of the positive Mi de pBR322, by the action of T 4 DNA ligase under the conditions described in Reference Example 1 Combined. Escherichia coli DH1 was transformed using the reaction solution to obtain the desired plasmid pPKT101 from the ampicillin-resistant transformant (see FIG. 4).
次に、 PGK遺伝子の構造遺伝子領域を取り除くために、 まず該プラ . スミ ド pPKTlOl DNA 1 0/ί に 1 0ュニットの制限酵素 Sal I を 3 0 t £ の反応液〔 1 0 mM Tris -HC 1 ( H 7. "5 ) ， 7 mM Mg Cl2 , 1 7 5mM NaCl， 0.2 M EDTA , 7mM 2—メ ルカプ卜エタ ノール〕中で 3 7¾， 3時間作用させ、 フエノールで除蛋白し、 冷エタ ノ一ルで DN Aを沈澱させた C Sal I消化 pPTKlO 1)。 つづいて、 Sal I '/肖ィ匕 pPTKl 01 1 に 1 0ュニッ 卜の BAL31ヌク レアーゼ を 2 0 ^ の反応液〔 2 OmM Tris-HCl H 8.1 , 1 2mM Ca Cl2, 12mM MgCl2 , 1 mM E D T A〕中で室温， 5分間作用させ だ後、 直ちに 1容量のフエノールを加えて反応を停止させ、 冷エタノー ルで DNAを沈澱させだ（ BAL消化 pPTKioi )。 参考例 1に記載 されたリン酸ィ匕 Xhol リンカ一 5 0 ng と B AL消化 pPTKlO 1 0.2 μ とを混合し、 参考例 1に記載の条件下で Τ 4 DN Αリ ガーゼの作用 によって結合させた。 その後、 該反応液で大腸菌 DH lを形質転換させ、 差換え ^RtA^ アン ピシ リ ン耐性を示す形質転換体の中から、 pPKTl Ol の Sai lサ ィ 卜からプロモータ一領域の方向へ 0.6 9 k b が除かれだプラスミ ド pPKT567 ¾H^t。 Dideoxynucleotide法によって DN A塩基配列を 調べたところ、 PPKT 567では B AL 3 1の作用によって P GK構造 遺伝子と 5'—近傍領域一 2 4までが除かれだことが証明されだ（第 4図 参照 )。 Next, in order to remove the structural gene region of the PGK gene, first, 10 units of the restriction enzyme Sal I was added to the plasmid pPKTlOl DNA 10 / ί in a 30 t £ reaction solution [10 mM Tris-HC 1 (H 7. "5), 7 mM Mg Cl 2, 1 7 5mM NaCl, 0.2 M EDTA, 7mM 2- main Rukapu Bok ethanol] in at 3 7¾, allowed to act for 3 hours, deproteinized with phenol, cold CPT-digested pPTKlO 1) in which DNA was precipitated with ethanol.10 Then, 10 units of BAL31 nuclease were added to Sal I '/ Sho-i-Dai pPTKl 01 1 in a 20 ^ reaction mixture [2 OmM Tris-HCl H 8.1, 1 2mM Ca Cl 2, 12mM MgCl 2, 1 mM EDTA ] at room temperature in, after having allowed to act for 5 minutes, the reaction was stopped immediately by adding 1 volume of phenol, DNA with cold ethanol (BAL digested pPTKioi) 50 ng of the phosphorylation Xhol linker described in Reference Example 1 and 10.2 μL of BAL digested pPTKlO were mixed under the conditions described in Reference Example 1. 4 DN Α The reaction solution was used to transform Escherichia coli DH1 and the replacement ^ RtA ^ From the transformants showing ampicillin resistance, the plasmid pPKT567¾H ^ t was obtained by removing 0.69 kb from the SaiP site of pPKTl Ol in the direction of the promoter region. Examination of the DN A nucleotide sequence by Dideoxynucleotide method, it is proved that until P GK structural gene and 5'-region near one 2 4 is removed by the action of the PPKT 567 B AL 3 1 (see FIG. 4 ).
③ 発現用ベクターの構築 - 大腸菌一酵母シャト ル ' ベクタ一 PSHl 9 5 ？ に 6ユニットの制 限酵素 Sal Iを 2 0 £ の反応液〔 1 0 mM Tris-HCl ( pH 7, 5 ) , 7 mM MgCl2 , 1 7 5 mM NaCl , 0.2 mM E D T A , 7 mM 2—メ ルカプトエタノール〕中で 3 7°C , 2時間作用させた後、 フエノールで 除蛋白し、 冷エタノールで沈澱させた。 該 DNA μψ に； DNAポリ メラ一ゼ I ラージ ' フラグメン 卜を参考例 1に記載の条件下で作用さ せ、 Sail の接着末端を平滑末端に変えた。 該 DNA断片 5 0 0 n g と 参考例 1に記載されたリン酸化 Xhol リ ンカ一 5 O n g とを混合し、 参 考例 1に記載の条件下で T 4 DNAリガーゼの作用によって結合させた。 該反応液で大腸菌 DH1を形質転換させ、 アンピシ リ ン耐性の形質転換 体の中から、 pSHl9の Sai l部位が Xhol部位に転換したプラス ミ ド pSHl 9-1 を保持する形質転換体を得た〔第 4図参照：).。 ③ Construction of expression vector-Escherichia coli-yeast shuttle 'vector-PSHl 95? Add 6 units of the restriction enzyme SalI to the reaction solution (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl 2 , 175 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 7 mM After working at 37 ° C for 2 hours in [Lucaptoethanol], the proteins were deproteinized with phenol and precipitated with cold ethanol. The DNA polymerase I large 'fragment was allowed to act on the DNA under the conditions described in Reference Example 1 to change the cohesive end of Sail to a blunt end. 500 ng of the DNA fragment and 5 O ng of the phosphorylated Xhol linker described in Reference Example 1 were mixed and bound by the action of T4 DNA ligase under the conditions described in Reference Example 1. Escherichia coli DH1 was transformed with the reaction solution, and from the transformants resistant to ampicillin, a transformant retaining plasmid pSHl9-1 in which the Sail site of pSHl9 was converted to an Xhol site was obtained. [See Fig. 4 :).
該プラス ミ ド pSHl9— 1 DNA 1 5 ？ に 2 4ュニッ 卜の制限酵 素 Hindi を 1 0 0 ^ の反応液 1 0 mM Tri s-HCl ( H 7.5 , 7mM MgCl2 , 6 0 mM NaCl 〕 中で 3 7°C， l 0分間作用させだ後、 直ちに 0.2M EDTAを 1 0 ^添加し反応を停止させた。 反応液を、 0.7 %ァガ σ—ス ·スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気 泳動にかけ、 Hind]!で 1箇所切断された 8.3 kb DN'A断片を参考例 差換え じ!〈ヒ The plasmid pSH19-1 DNA 15? 2 4 Yuni' Bok restriction enzyme reaction solution 1 0 mM of iodine Hindi 1 0 0 ^ Tri s- HCl (H 7.5, 7mM MgCl 2, 6 0 mM NaCl ] 3 7 ° C in, is allowed to act l 0 min Immediately after that, the reaction was stopped by adding 10 M of 0.2 M EDTA, and the reaction solution was subjected to electrophoresis using 0.7% agar sigma-slab slab gel under the conditions described in Reference Example 1. 8.3 kb DN'A fragment cut at one place with!
Gr..P: 1に記載の方法でゲルから分取した。 該 8.3kb DNA断片3 に 10ュニッ 卜の制限酵素 Xhol〔宝酒造㈱製〕を 3 0 の反応液〔 1 0 mM Tr is-HCl ( pH 7.5 , 7 mM MgCl2 , 100 mM NaCl, 7 mM2—メルカプトエタノール〕中で 3 7°C， 2時間作用させた後、 . 0.7 %ァガロース ' スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気 泳動を行つだ。 泳動後、 7.7 k b DNA断片を参考例 1に記載の方法に よってゲ^から分取した（第 4図参照）。 Gr..P: Separated from the gel by the method described in 1. To the 8.3 kb DNA fragment 3 was added 10 units of the restriction enzyme Xhol (Takara Shuzo) [30 mM reaction solution [10 mM Tris-HCl (pH 7.5, 7 mM MgCl 2 , 100 mM NaCl, 7 mM 2- mercapto). After working for 2 hours at 37 ° C in ethanol, electrophoresis was performed using 0.7% agarose 'slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After electrophoresis, refer to the 7.7 kb DNA fragment. It was separated from the gel by the method described in Example 1 (see Fig. 4).
参考例 2の②に記載のプラス ミ ド pPKT567DNA 10 に、 各 1 0ュニッ卜の制限酵素 Hindi [と Xholとを 0卢^の反応液〔50mM Tris-HCl C pH 7.6 ) ， 5 0 mM NaCl , 1 mM ジチオスレイ ト一 ル， 1 0 mM MgCl2〕中で 37¾ , 2時間作用させだ後、 1.2 %ァガ ロース · スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気泳動を行い、. 1.4 Okb DN A断片をゲルから分取した（第 4図参照）。 The plasmid pPKT567DNA10 described in ② of Reference Example 2 was combined with 10 units of each restriction enzyme Hindi [Xhol with 0 卢 ^ reaction solution (50 mM Tris-HCl C pH 7.6), 50 mM NaCl, After incubating for 2 hours at 37 ° C in 1 mM dithiothreitol, 10 mM MgCl 2 ), electrophoresis was performed using 1.2% agarose-slab gel under the conditions described in Reference Example 1. The Okb DNA fragment was separated from the gel (see FIG. 4).
該 1.40kbDNA断片 0.2卢 と上述の 7.7 kb DNA断片0.5 i とを混合し、 参考例 1に記載の条件下で T 4 DNAリガーゼの作用によ つて結合させた。 該反応液で大腸菌 DH lを形質転換させ、 アンピシ リ ン耐性の形質転換体の中から、 所望するプラスミ ド PPKT700 を保持 する形質転換体を取得しだ。 次に、 参考例 1に記載した方法に従って、 該プラスミ ド PPKT 700 の Xhol部位が Sail部位に変^されたプラ ス ミ ド PPKT700— 1を作製した（第 4図参照：)。  0.2% of the 1.40 kb DNA fragment and 0.5 i of the 7.7 kb DNA fragment described above were mixed and bound by the action of T4 DNA ligase under the conditions described in Reference Example 1. Escherichia coli DH1 was transformed with the reaction solution, and a transformant having the desired plasmid PPKT700 was obtained from ampicillin-resistant transformants. Next, according to the method described in Reference Example 1, a plasmid PPKT700-1 in which the Xhol site of the plasmid PPKT700 was changed to a Sail site was prepared (see FIG. 4).
参考例3 酵母グリセルアルデヒ ド 3— リン酸脱水素酵素 ·プロモー ター (： GL D— Ρ )を含有する発現用ベクターの作製 ① グリセルアルデヒ ド 3 — リン酸脱水素酵素遺伝子（ GL D )のク ローニング Reference Example 3 Preparation of Expression Vector Containing Yeast Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase Promoter (: GLD-II) ① Glyceraldehyde 3—Phosphate Dehydrogenase Gene (GLD) Cloning
GLDのうちの pgap491 [ Holland, J. P.ら ， J. Biol. Chem, 差換え 258, 529 U 1983 )〕の N末端側からの 5個のアミノ酸をコードす るオ リゴヌクレオチ ドに相補な 5し AGCAACTCTAACCAT— 3'を前 述の Crea，R.らの方法によって合成し、 参考例 2の①に記載の方法に従 つて32 Pで標識し、 プローブとして用いた。 参考例 2の①に記載した二 ト ロセル口一スフィ ルターと該プローブを用いて Southernブロッティ ングを行つだところ、 プローブは 2.0〜2.3 kb DNA断片が含まれる 分画番号 7の試料と強くノ、ィ ブリダィズしだ。 . Pgap491 in GLD [Holland, JP et al., J. Biol. Chem, Replacement 258, 529 U 1983)] and synthesized 5'AGCAACTCTAACCAT-3 ', which is complementary to the oligonucleotide encoding the 5 amino acids from the N-terminal side, by the method of Crea, R. et al. It was labeled with 32 P according to the method described in 2① and used as a probe. Where line Tsuda the Southern Burotti ring with two preparative Roseru port one Sufi Luther and the probe described in ① of Example 2, the probe and the sample of Fraction No. 7 that contains 2.0 to 2. 3 kb DNA fragment Strongly, it's hybridized. .
参考例 2の①に記載された Hind 消化 pTR262 0.1 /^ と分画番 号 7の DNA0.2 とを混合し、 参考例 1に記載の条件下で T 4 DN Aリ ガーゼの作用によって結合させだ。 該反応液を用いて、 参考例 2の The Hind-digested pTR262 0.1 / ^ described in ① of Reference Example 2 was mixed with DNA0.2 of Fraction No. 7, and bound by the action of T4 DNA ligase under the conditions described in Reference Example 1. It is. Using the reaction solution,
①に記載した方法で大腸菌 1を形質転換させ、 テ トラサイク リン耐 性形質転換体約 1 2 0 0個を取得し、 コロニー 'ハイ ブリダィ ゼ一ショ ンによって32 P標識プローブと強くハイ プリする形質転換体を分離した。 この形質転換体から前述のアル力リ抽出法によってプラスミ ド PGLD9 を単離し、 HindJI で分解したところ、 2.2 k b インサ一 卜 DNAが検 出され、 jSouthernの方法で調べるとこのィンサー卜 DNAは該プロ一 ブとハイブリすることが確認された（第 5図参照 ）。 Escherichia coli 1 was transformed by the method described in ① to obtain about 1200 tetracycline-resistant transformants, which were strongly hybridized with the 32 P-labeled probe by colony hybridization. Transformants were separated. Plasmid PGLD9 was isolated from this transformant by the above-described extraction method and digested with HindJI.A 2.2 kb insert DNA was detected, and the insert DNA was analyzed by jSouthern method. Hybridization was confirmed (see Fig. 5).
② GLDプロモーター断片の単離  ② Isolation of GLD promoter fragment
プラス ミ ド pGLD9 DNA 1 0 0 ？に 5 0ュニッ 卜の制限酵素 Hindi [を 20 Q £の反応液〔 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) , 7 mM MgCl2 , 60 mM NaCl 〕中で 3 7°C , 3時間作用させた後、 1.0 %ァ ガロース · スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気泳動にか けだ。 泳動後、 2.2 k b DNA断片を参考例 iに記載の方法によってゲ ルから分取した。 該 2.2 k b DNA断片 l 0 ？ に 1 0ュニットの制限 酵素 Hi nf l〔宝酒造㈱製〕を 5 0 ί の反応液 Γ 1 0 mM Tris-HCl C pH 7.5 , 7 mM MgC 12， 1 0 0 mM NaCl , 7 mM 2 —メルカプ 卜エタノール〕中で 3 7°C , 2時間作用させた後、 GLD用プローブを 用いて Southernの方法によって ィ ブリダィジ一シヨンを行ったとこ ろ、 該プローブは 0.5 kb DNA断片と結合した（第5図参照:)。 Plasmid pGLD9 DNA 100? After reacting with 50 units of the restriction enzyme Hindi [in a 20 Q £ reaction solution [10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl 2 , 60 mM NaCl]] at 37 ° C for 3 hours And electrophoresis using 1.0% agarose slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After electrophoresis, it was collected from the gel fractionated by 2. The method according to 2 kb DNA fragments in Reference Example i. The 2.2 kb DNA fragment l0? Add 10 units of restriction enzyme Hinfl (Takara Shuzo) to 50 反 応 of the reaction mixture Γ 10 mM Tris-HCl C pH 7.5, 7 mM MgC 1 2, 1 0 0 mM NaCl, 7 mM 2 - mercapto Bok ethanol] 3 7 ° C, 2 hours After working in, I by Southern method using a probe for GLD Buridiji Upon performing one shot, the probe bound to a 0.5 kb DNA fragment (see FIG. 5 ).
該 0.5 kb DNA断片 5 μ9- に、 各 1 0ュニッ 卜の制限酵素 Hhal 5 μ9- of the 0.5 kb DNA fragment was added to each 10 units of the restriction enzyme Hhal.
〔宝酒造㈱製〕と Taql ( New England BioLabs社製:） とを 30 ^ の反応液〔 1 0 mM Tris -HC1 C pH 7.5 , 5 0 mM NaCl , 1 0 mM MgCl2 , 1 mMジチオスレイ ト一ル〕中で 3 7 , 3時間作用さ せた後、 1.5 %ァガロース ' スラブゲルを用いて参考例 1に記載された 条件下で電気泳動にかけだ。 泳動後、 0.3 6 kb DNA断片を参考例 1 に記載の方法によってゲルから分取した（第 5図参照:）。 [Takara Shuzo Co., Ltd.] and Taql (New England BioLabs :) in a 30 ^ reaction solution [10 mM Tris-HC1 C pH 7.5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol ], And then subjected to electrophoresis using 1.5% agarose 'slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After the electrophoresis, a 0.36 kb DNA fragment was separated from the gel by the method described in Reference Example 1 (see FIG. 5).
該 0.3 6 kb DNA断片 1 に DNAポリ メラーゼ I ラージ ' フ ラグメントを参考例 1に記載の条件下で作用させ、 aq Iの接着末端を 平滑末端に変えた。 次に、 この断片 1 μ9 と参考例 1に記載されたリン 酸化 Xhol リ ンカ一 5 0 n とを混合し、 参考例 1に記載の条件下で T 4 DNAリガーゼを作用させて結合させだ。 反応後、 過剰量の Xho lを 加え 3 7°C ， 4時間作用させ、 次に参考例 2の①に記載した条件下でセ ファローズ 4 B · カラムを用いてリンカーの結合した 0.3 6 kb DNA 断片を分離した。  The 0.36 kb DNA fragment 1 was reacted with a DNA polymerase I large 'fragment under the conditions described in Reference Example 1 to change the cohesive end of aq I to a blunt end. Next, 1 μ9 of this fragment and 50 n of the phosphorylated Xhol linker described in Reference Example 1 were mixed, and allowed to bind by the action of T4 DNA ligase under the conditions described in Reference Example 1. After the reaction, add an excess amount of Xhol and allow it to work at 37 ° C for 4 hours. Then, use a Sepharose 4B column to bind the linker-bonded 0.36 kb DNA under the conditions described in ② of Reference Example 2. The fragments were separated.
一方、 上述の 2· 2 kb DNA断片 1 0 ^ に DNAポリメラ一ゼ I ラージ 'フラグメン 卜を参考例 1に記載の条件下で作用させ、 接着末端 を平滑末端に変えた後、 参考例 1に記載された条件下でリン酸化された Bam HI リンカ一!： 5，一 P - d CGC GGAT C C GC G) J C New England BioLabs社製） 5 0 ng を参考例 1に記載の条件下で T 4 D NAリガ一ゼの作用により結合させた。 反応後、 2 0ュニッ 卜の BamH 差換え Iを加えて、 3 7°C， 3時間作用させ、 次に参考例 2の①に記載した条 件下でセファローズ4 B · カラムを用いて リ ンカーの結合した 2.2 k b DNA断片を分離した。 該 DNA断片 6 ^ に 2ユニッ トの制限酵素 Hha Iを 5 0 の反応液〔 1 0 mM Tris-HC ( pH 7.5 , 50 mM NaCl , 1 0 mM MgCl2 , 1 mMジチオス レィ 卜 一ル〕中で 3 7°C , 2時間作用させた後、 1.0 %ァガロ一ス · スラブゲルを用いて参考例 1 に記載の条件下で電気泳動にかけた。 泳動後、 0.7 5 kb DNA断片を 参考例 1に記載の方法によってゲルから分取した（第 5図参照：)。 On the other hand, a DNA polymerase I large 'fragment was allowed to act on the 2.2-kb DNA fragment 10 ^ described above under the conditions described in Reference Example 1, and the cohesive ends were changed to blunt ends. Bam HI linker phosphorylated under the described conditions !: 5.1 P-d CGC GGAT CCGC G) (manufactured by JC New England BioLabs) 50 ng of T4 under the conditions described in Reference Example 1 It was bound by the action of DNA ligase. After reaction, replace 20 units of BamH. Adding I, 3 7 ° C, 3 hours to effect, to separate the 2.2 kb DNA fragment bound the linker by then using a Sepharose 4 B · columns in conditions under described ① of Example 2 . The DNA fragment 6 ^ was added with 2 units of the restriction enzyme HhaI in a 50 reaction solution [10 mM Tris-HC (pH 7.5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol)]. At 37 ° C for 2 hours, and electrophoresed on 1.0% agarose slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After electrophoresis, a 0.75 kb DNA fragment was used in Reference Example 1. The gel was fractionated by the method described (see FIG. 5).
③ 発現用ベクターの構築 ③ Construction of expression vector
参考例 2の③に記載のプラスミ ド pSHl9— 1 DNA l 0 μί に各 1 0ュニッ 卜の制限酵素 BamHi と Xho Iとを 5 0 μ€ の反応液〔 1 0 mM Tris-HCl ( pH 7.5 ， 7 mM MgCl2， 1 0 0 mM NaCl , 7 mM 2 —メルカプ卜エタノール〕中で 3 7。C， 2時間作用させだ後、 1.0 %ァガロース ' スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気 泳動にかけた。 泳動後、 8.0 kb の DNA断片を参考例 1に記載の方法 によつ.てゲルから分取した。 ， To 10 μl of the plasmid pSHl9-1 DNA 1 described in ③ of Reference Example 2, 10 μl of each of the restriction enzymes BamHi and XhoI was added to a 50 μ € reaction solution [10 mM Tris-HCl (pH 7.5, pH 7.5, In 7 mM MgCl 2 , 100 mM NaCl, 7 mM 2 —mercaptoethanol] 37. C, after acting for 2 hours, using 1.0% agarose 'slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After electrophoresis, a 8.0 kb DNA fragment was separated from the gel by the method described in Reference Example 1.
該 8.0 kb DNA断片 50 0 ng ，参考例 3の②に記載の 0.3 6 kb ϋΝΑ断片 2 0 0 ng および 0.7 5 kb DNA断片 2 0 0 ng とを混合 し、 参考例 1に記載の条件下で T 4 DNAリガーゼの作用.により結合さ せだ。 該反応液を用いて大腸菌 Dil iを形質転換させ、 アンピシリン耐 性形質転換体の中から 3種の DN A断片が結合したプラスミ ド pGLD 906 を保持する組み換え体を分離しだ。 次に、 参考例 1に記載しだ方 法に従って、 該プラス ミ ド PGLD906 の XhoI¾¾i力 sSall 部位に変 換されたプラスミ ド PGLD906— 1を作製した（第 5図参照：)。 + 差換え 実施例 1 adr型 B型肝炎ウィ ルス表面抗原 P 3 1遺伝子を発現する組 み換え DN A分子の構築および該 DN A分子による大腸菌の 形質転換 500 ng of the 8.0 kb DNA fragment, 200 ng of the 0.36 kb fragment described in ② of Reference Example 3, and 200 ng of the 0.75 kb DNA fragment were mixed, and the mixture was mixed under the conditions described in Reference Example 1. It was bound by the action of T4 DNA ligase. The reaction solution was used to transform Escherichia coli Dili, and a recombinant carrying the plasmid pGLD906 to which three types of DNA fragments were bound was separated from the ampicillin-resistant transformants. Next, in accordance with the method described in Reference Example 1, a plasmid PGLD906-1 converted to the XhoI¾¾i force sSall site of the plasmid PGLD906 was prepared (see FIG. 5). + Replacement Example 1 Construction of recombinant DNA molecule expressing adr-type hepatitis B virus surface antigen P31 gene and transformation of Escherichia coli with the DNA molecule
特開昭 5 9 - 7 4 9 8 5号公報および Nucleic Acids Res. 上上， 1747 ( 1983 )に記載されているプラス ミ ド pBR 322— BamHIノ HBr 33 ODNA ( pHBr 3 3 0とも略す：)は、 特開昭 5 8 - 2 0 1 7 9 6号公報に記載されている参考例 1の方法によって調製した。 該プラ ス ミ ド pHB r 330 50 /^に各 2 0ュニッ トの制限薛素 E co R I〔宝 酒造㈱製〕と B amHIとを 1 0 0 /i の反応液〔 1 0 0 mM Tris- HC 1 ( pH7.5 ) , 7 mM MgC 1。 ， 5 0 mM NaC 1 , 7 mM 2—メ ルカプトエタノール〕中で 3 7 °C , 3時間反応させた後、 1.0 ァガ口 ース · スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気泳動にかけた。 泳動後、 1.4 kb DNA断片を参考例 1に記載の方法によってゲルから 分取した（第 6図参照）。 '  The plasmid pBR322-BamHINO HBr33ODNA (abbreviated as pHBr330) described in JP-A-59-79485 and Nucleic Acids Res., Above, 1747 (1983). Was prepared by the method of Reference Example 1 described in JP-A-58-210796. A reaction solution of 100 / i (100 mM Tris-) with BamHI was added to the plasmid pHBr 330 50 / ^ with a restriction solution of 20 units each of EcoRI (Takara Shuzo) and BamHI. HC 1 (pH 7.5), 7 mM MgC 1. , 50 mM NaC 1, 7 mM 2-mercaptoethanol] at 37 ° C for 3 hours, and using a 1.0 agarose slab gel under the conditions described in Reference Example 1. It was subjected to electrophoresis. After the electrophoresis, a 1.4 kb DNA fragment was separated from the gel by the method described in Reference Example 1 (see FIG. 6). '
2μ9 のプラス ミ ド pBR322 DNAに各 2ユニッ トの制限酵素 Bam 2 μ9 of plasmid pBR322 DNA and 2 units of restriction enzyme Bam
HIと CI al (New England BioLabs 社製：）とを 2 0 の反応液 〔 1 0 mM Tr is^ICl ( ρΗ 8.0 ) ， 7 mM MgCl 2 , l 0 0 mM NaCl , 2 mM 2—メルカプトエタノール〕中で 3 7 °C， 2時間反応さ せた後、 0.8 %ァガロース · スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件 下で電気泳動にかけた。 泳動後、 4.0 1 kb DNA断片を参考例 1に記 載の方法によつてゲルから分取した。 Reaction of HI with CI al (New England BioLabs :) in 20 reaction solutions [10 mM Tris ^ ICl (ρΗ8.0), 7 mM MgCl 2 , 100 mM NaCl, 2 mM 2-mercaptoethanol] The mixture was reacted at 37 ° C for 2 hours in an incubator, and then subjected to electrophoresis using 0.8% agarose-slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After the electrophoresis, a 4.0 1 kb DNA fragment was fractionated from the gel by the method described in Reference Example 1.
500 ngの前記 4.0 1 kb DNA断片 , 50 Ongの前記 1. kb DNA. 断片および参考例 1で記載の方法によって 5'末端がリン酸化された合成 マ つ。 A ( 5'CGATACAATGCAGTGG3' Λ Σ N N _ ダフタ一 d 、 3, TATGTTACGTCACCTTAA5' 5 0 ng とを参考例 1に記載の条件下で T4DNAリガーゼの作用によつて結合さ 差換え せた。 なお、 上記アダプタ一はト リエステル法〔 Crea, R. ら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7^ , 5765 ( 1978 )〕を用いて化学合成 された。 この反応液を用いて大腸菌 2 9 4株を形質転換させ、 アンピシ リン耐性の形質転換体から前記 3種の DNAが結合したプラス ミ ド pHBr P 3 1 DNAが得られた（第 6図参照）。 500 ng of the 4.0 1 kb DNA fragment, 50 Ong of the 1. kb DNA fragment. A synthetic fragment whose 5 ′ end has been phosphorylated by the method described in Reference Example 1. A ( 5'CGATACAATGCAGTGG3 'Λ NN NN _ Dafta- d , 3 , TATGTTACGTCACCTTAA 5 ' 50 ng Recombined by the action of T4 DNA ligase under the conditions described in Reference Example 1. I let you. The above adapter was chemically synthesized using a triester method [Crea, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7 ^, 5765 (1978)]. Using this reaction solution, Escherichia coli 294 was transformed, and a plasmid pHBr P31 DNA having the three types of DNA bound thereto was obtained from an ampicillin-resistant transformant (see FIG. 6). .
1 /^のプラス ミ ド pHBrP 3 1 DNAに 2ュニッ 卜の制限酵素 BamHI を 2 0 ί の反応液〔 1 0 mM Tris-HCl ( ρΗδ.0 )，.7mM MgCl2, 1 0 0 mM NaC 1 , 2 mM 2 メルカプトエタノール 〕中で 3 7 °C , 2時間作用させた後、 フエノールで除蛋白し、 冷エタノールを加えて D NAを沈殿させた（BamHI消化pHB rP 3 1 )。 1 / ^ plasmid pHBrP31 1 DNA with 2 units of restriction enzyme BamHI in 20ί reaction mixture [10 mM Tris-HCl (ρΗδ.0), 0.7 mM MgCl 2 , 100 mM NaC 1 , 2 mM 2 mercaptoethanol] at 37 ° C. for 2 hours, deproteinized with phenol, and added cold ethanol to precipitate DNA (BamHI digested pHB rP 31).
5 0 ongの Ba mHI消ィ匕 pHBrP 3 1に DNAポリ メラーゼ I ラ ージ · フラグメントを、 参考例 1に記載の条件下で作用させて、 接着末 端を平滑末端にした後、 フエノールで除蛋白し、 冷エタノー-ルで DNA を沈殿させた。 該 DNA断片 30 Ongと、 参考例 1に記載の方法で 5'末 端がリン酸化された Pstl リンカ一〔 5'— P -d ( GCTGCAGC ) 〕 (New England BioLabs社製） 5 Ongとを参考例 1 で記載の条件下 で T4DNA リガーゼの作用により結合させた。 該反応液を用いて大腸 菌 2 9 4株を形質転換させ、 形質転換体を参考例 1に記載の方法によつ て調べ、 プラスミ ド pHBrP 3 1の BamHI部位が Pstj;¾¾iに変換し たプラス ミ ド pHBrP 3 1 — 1 7を分離した（第 6図参照）。  The DNA polymerase I large fragment was allowed to act on 50 ong of BamHI plasmid pHBrP31 under the conditions described in Reference Example 1 to make the adhesive end blunt, and then removed with phenol. The protein was precipitated and the DNA was precipitated with cold ethanol. Refer to 30 Ong of the DNA fragment and 5 Ong of Pstl linker [5'-P-d (GCTGCAGC)] (New England BioLabs) phosphorylated at the 5 'end by the method described in Reference Example 1. Ligation was carried out by the action of T4 DNA ligase under the conditions described in Example 1. The reaction solution was used to transform E. coli 294 strain, and the transformant was examined by the method described in Reference Example 1, and the BamHI site of the plasmid pHBrP31 was converted to Pstj; The plasmid pHBrP 31-17 was separated (see Figure 6).
該 pHBrP 3 1 - 1 7 50 ^に各 2 0ユニッ トの制限酵素 Clalと Pstl 〔宝酒造㈱製〕 とを 1 0 0 の反応液！： 20mM Tris-HCl ( pH 7.5 ) , 1 0 mM MgCl 2 , 5 0 mM (NH4) 2SO4〕中で 37°C， 3時間作用させた後、 反応液を 1.0 ァガロース ·スラブゲルを用いて 参考例 1に記載の条件下で電気泳動にかけた。 泳動後、 1.42 kbDNA ん 断片を参考例 1に記載の方法でゲルから分取した。 A reaction solution of 100 units of the pHBrP 31-1750 ^ with 20 units of each of the restriction enzyme Clal and Pstl (Takara Shuzo)! After reacting for 3 hours at 37 ° C in 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 50 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ], the reaction solution was purified using 1.0 agarose-slab gel. Electrophoresis was performed under the conditions described in Reference Example 1. After electrophoresis, 1.42 kb DNA The fragment was separated from the gel by the method described in Reference Example 1.
特開昭 5 8— 2 0 1 7 9 6号公報および Nucleic Acids Res., 1 1. 35 8 1 ( 1 9 8 3 )に記載の発現用ベクター P TRP 771 50 ^に制 限酵素 Clalと Pstlとを前記 100μ£の反応液中で同一条件下で反応 させた後、 反応液を 1.0 ァガロース - スラブゲルを用いて参考例 1に 記載の条件下で電気泳動にかけた。 泳動後、 3· 3 kbDNA断片を参考例 1に記載の方法でゲルから分取した。 . The expression vectors P TRP 771 50 ^ described in JP-A-58-2101976 and Nucleic Acids Res., 11.3581 (19983) are restricted to the restriction enzymes Clal and Pstl. Was reacted under the same conditions in the 100 μl reaction solution, and the reaction solution was subjected to electrophoresis using 1.0 agarose-slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After electrophoresis, the fractionated from the gel by the method described in Reference Example 1 to 3 · 3 kb DNA fragment. .
2 0 0 ng の該 1.4 2 kbDNA ( P 3 1をコードする DNA )と 500 ng の 3.3 kbDNAとを参考例 1に記載の条件下で T4DNA .リガ—ゼ の作用によって結合させた。 該反応液を用いて大腸菌 2 9 4株を形質転 換させ、 参考例 1の方法に従って該 P 3 1をコードする DNAが発現用 ベクターに挿入されたプラス ミ ド pT'RP P 3 1一： を保持する大腸 菌株（ 2 9 4 /PTRP P3 1一 R )を分離した（第 6図参照）。  200 ng of the 1.42 kb DNA (DNA encoding P31) and 500 ng of 3.3 kb DNA were bound by the action of T4 DNA ligase under the conditions described in Reference Example 1. The reaction solution was used to transform Escherichia coli 294, and plasmid pT'RP P31 in which the DNA encoding P31 was inserted into an expression vector according to the method of Reference Example 1. A colony strain (294 / PTRP P31-I R) carrying E. coli was isolated (see FIG. 6).
なお、 当該菌株（ Escherichia coli 294/pTRP P31-R)は 財団法人発酵研究所に I FO— 1 4 3 5 5として寄託され、 また、 昭和 5 9年 7月 1 0日から工業技術院微生物工業技術研究所（F R I )に受 託番号 F ERM P— 7 7 0 9として寄託されている。  The strain (Escherichia coli 294 / pTRP P31-R) was deposited with the Fermentation Research Institute as IFO-144355, and from July 10, 1984, Deposited with the Technical Research Institute (FRI) under the accession number F ERM P—77009.
実施例 2 adw型 B型肝炎ウィルス表面抗原 P 3 1遺伝子を発現する組 み換え D N A分子の構築および該 D N A分子による大腸菌の 特開昭 5 8— 1 9 4 8 9 7号公報，特開昭 5 8— 2 0 1 7 9 6号公報 および Nucleic Acids Res, , 11 , 1 7 47 ( 1 9 83 )に記載されて いるプラスミ ド pBR— EcoRI/HBV933 DNA ( pHBV 933と略 す）は、 特開昭 5 8 -2 01 79 6号^に記載されている参考例 1の方 法によって調製した。 2 ^の該プラスミ ドに 2ュニッ トの制限酵素 Hpa Example 2 Construction of recombinant DNA molecule expressing adw-type hepatitis B virus surface antigen P31 gene and Escherichia coli using the DNA molecule The plasmid pBR—EcoRI / HBV933 DNA (abbreviated as pHBV933) described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 58200/1976 and Nucleic Acids Res ,, 11, 17747 (1983) is a special feature. It was prepared by the method of Reference Example 1 described in No. 5 -2 01 796 6 ^. 2 ^ Add 2 units of restriction enzyme Hpa to the plasmid
¾換え O PI I 〔宝酒造㈱製〕を 2 0 ^の反応液!： 1 OmM Tris— HC1 ( pH 7.5 ), 7mM MgCl 2 , 10 OmM KC 1 7mM 2—メルカプトエタノール〕 中で 3 7°C 2時間作用させた後、 フエノールで除蛋白し、 冷エタノ ー ルで DNAを沈殿させた。 該 DNA 30 Ongと リン酸化された Pstl リ ンカー〔 5 '— P— (GCTGCAGC) J 5 Ong とを、 実施例 1で記載さ れた条件下で結合させた後、 該反応液を用いて大腸菌 2 9 4株を形質転 換させ、 形質転換体を参考例 1に記載の方法によって調べ、 プラス ミ ド PHBV933の Hpalサイ 卜が Pstlサイ トに変換したプラスミ ド pHBV 933— 5を得た（第 7図参照）。 Exchange O PI I [Takara Shuzo Co., Ltd.] reaction in 20 ^ !: 1 OmM Tris-HC1 (pH 7.5), 7 mM MgCl 2, 10 OmM KC 17 mM 2-Mercaptoethanol] at 37 ° C for 2 hours Thereafter, the protein was removed with phenol, and the DNA was precipitated with cold ethanol. After the DNA 30 Ong and the phosphorylated Pstl linker [5′-P— (GCTGCAGC) J5 Ong were bound under the conditions described in Example 1, E. coli was The 294 strain was transformed, and the transformant was examined by the method described in Reference Example 1 to obtain a plasmid pHBV933-5 in which the Hpal site of the plasmid PHBV933 was converted to a Pstl site (No. 1). See Figure 7).
5 0 0
Figure imgf000029_0001
の該プラス ミ ド pHBVg 33— 5 DNAに 5 0 0ュニッ トの 制限酵素 Pstlを 8 0 0 ^ の反応液！： 2 O mM Tris-HCl (pH7.5), 1 OmM MgCl2, 50mM(NH4)2SO4〕 中で 3 7 °C 2 0分間作甩 させた後、 直ちにフエノールで除蛋白した。 該反応液を 1.0 %ァガロー ス ·スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気泳動にかけた。 泳動後、 Pstlによる部分分解物 1.7 kbDNA 断片を参考例 1に記載 の方法によつてゲルから分取した（第 7図参照）。 5 0 0
Figure imgf000029_0001
A reaction solution of 800 ^ ^ of the plasmid pHBVg 33-5 DNA and 500 units of restriction enzyme Pstl! : 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 OmM MgCl 2 , 50 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ] at 37 ° C. for 20 minutes, and immediately deproteinized with phenol. The reaction solution was subjected to electrophoresis using 1.0% agarose slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After the electrophoresis, a 1.7 kb DNA fragment partially digested with Pstl was fractionated from the gel by the method described in Reference Example 1 (see FIG. 7).
3 μ9の該 1.7 kb DNAを 6ユニッ トの制限酵素 EcoRIと 2 0 の 反応液〔 1 0 0 mM Tris-HCl ( ρΗγ.5 ) 7mM MgCl2 , 5 OmM NaCl 7mM 2 メルカプトエタノール J中で 3 7 °C , 1時間反応さ せた後、 1.0 アガロース · スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件 下で電気泳動にかけた。 泳動後、 0.9 7 kbDNA断片を参考例 1に記載 の方法によってゲルから分取した（第 7図参照）。 3 μ9 of the 1.7 kb DNA was reacted with 6 units of a restriction enzyme EcoRI and 20 reaction solution (100 mM Tris-HCl (ρΗγ.5) 7 mM MgCl 2 , 5 OmM NaCl 7 mM 2 in mercaptoethanol J 37 After reacting at ° C for 1 hour, the mixture was subjected to electrophoresis using 1.0 agarose slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After the electrophoresis, a 0.97 kb DNA fragment was separated from the gel by the method described in Reference Example 1 (see FIG. 7).
50 0 ngの該 0.9 7 kb DNA断片 , 50 0 ngの実施例 1に記載の 3.3 kb DNA C pTRP 771の Cl al— Ps 11消ィ匕物）および 5.0 ngの 実施例 1に記載のリソ酸化ァダプタ d 差お ίえ ( S'CGATACAATGCAGTGG^' > 失老 i 广ョ P 久 0 TATGTTACGTCACCTTAA5' とを参考例 1《—口ヒ載の条 件下で T4DNA リガーゼの作用によって結合させた。 該反応液を用い て大腸菌 2 9 4株と形質転換させ、 テトラサイク リン耐性の形質転換体 から参考例 1に記載された方法を用いて前記 3種の D N Aが結合したプ ラスミ ド pTRP P31— W を分離した。 該プラス ミ ドの Clal部位に、 特開昭 5 8— 2 0 1 7 9 6号公報に記載のプラス ミ ド P T RP 6 0 1を Clalと Hpan 〔宝酒造㈱製〕で消化して得られた約 3 30 bpの trpプ 口モーターを含む断片を挿入して、 プラスミ ド pTRP P 31 -W2 (第 7図参照）を完成した。 500 ng of the 0.97 kb DNA fragment, 500 ng of 3.3 kb DNA C pTRP771 described in Example 1 (Cl al-Ps11 plasmid) and 5.0 ng of the lysooxidation described in Example 1 Adapter d (S'CGATACAATGCAGTGG ^ '> Lost age i Hiroyo P kyu 0 TATGTTACGTCACCTTAA 5 ' was bound by the action of T4 DNA ligase under the conditions of Reference Example 1 << The plasmid pTRP P31-W bound with the three DNAs was isolated from the tetracycline-resistant transformant using the method described in Reference Example 1. Approximately 330 bp obtained by digesting plasmid PT RP601 described in JP-A-58-210796 with Clal and Hpan (Takara Shuzo Co., Ltd.) By inserting a fragment containing the trp-opening motor of E. coli, plasmid pTRP P 31 -W2 (see FIG. 7) was completed.
なお、 該プラス ミ ド pTRP P31一 W2を保持する大腸菌株（Esche— richia coli 294/pTRP P 31-W2：)は財団法人発酵研究所に I F 0 - 1 4 3 5 6として寄託され、 また、 昭和 5 9年 7月 1 0日から工業 技術院微生物工業技術研究所（ F R I ) に受託番号 F ERM P- 7 7 1 0として寄託されている。 ·  The Escherichia coli strain (Esche-richia coli 294 / pTRP P31-W2 :) carrying the plasmid pTRP P31-W2 was deposited with the Fermentation Research Institute as IF0-144356. It was deposited with the Research Institute of Microbial Industry and Technology (FRI) on July 10, 1980 under the accession number F ERM P-770. ·
実施例 3 adr型 B型肝炎ウィルスの表面抗原 P 3 1遺伝子を発現する 酵母用組み換え D N A分子の構築および該 D N A分子による 酵母の形質転換 Example 3 Construction of a recombinant DNA molecule for yeast expressing the adr-type hepatitis B virus surface antigen P31 gene and transformation of yeast with the DNA molecule
① 実施例 1に記載されたプラス ミ ド pHBrP31 DNA, 50 ^に各 2 0ュニッ トの制限酵素 Clalと BamHIとを 1 0 0 の反応液!： 100 mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 7 mM MgCl2 , 1 0 0 mM NaCl， 2mM 2—メルカプトエタノ ール：！中で 3 7 °C , 3時間作用させた後、 反応液を 1.0 %ァガロース ' スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件 下で電気泳動にかけた。 泳動後、 1.4 2 kb DNA断片を参考例 1に記 載の方法でゲルから分取した。 (1) A reaction mixture of the plasmid pHBrP31 DNA described in Example 1, 50 units with 100 units of each of the restriction enzymes Clal and BamHI !: 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 7 mM MgCl 2 , 100 mM NaCl, 2 mM 2—Mercaptoethanol:! After the reaction at 37 ° C. for 3 hours in the medium, the reaction solution was subjected to electrophoresis using 1.0% agarose 'slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After the electrophoresis, a 1.42 kb DNA fragment was fractionated from the gel by the method described in Reference Example 1.
2μ9 の該 1.4 2 kb DNA断片に DNAポリメラーゼ I ラ一ジ . 差換え ントを参考例 1に記載の条件下で作用させて接着末端を平滑末 端にした後、 フエノールで除蛋白し、 冷エタノ ールで DNAを沈殿させ た。 該 DNA 1.5 と参考例 1に記載のリン酸化 Sail リ ンカ一 ， 5 0 ng とを参考例 1に記載の条件下で T 4 DNAリガーゼの作用により 結合させた。 該反応液に 1 0ュニッ トの制限酵素 Sailを添加し、 3 7 °C , 3時間作用させて接着末端を生成させた。 反応後、 フエノ ールで除 蛋白し、 試料を参考例 2の①に記載された条件下でセファローズ 4B · カラムにかけ、 void volume 付近に溶出されてくる 1.4 3 k b DNA 断片（ adr型 P 3 1をコードする D N A )を含む画分を集め、 冷ェタノ —ルで該 DN Aを沈殿させた（第 8図参照）。 2μ9 of the 1.4 2 kb DNA fragment was replaced with DNA polymerase I radio. After making the cohesive end blunt-ended by the action of the enzyme under the conditions described in Reference Example 1, the protein was removed with phenol, and the DNA was precipitated with cold ethanol. The DNA 1.5 and 50 ng of the phosphorylated Sail linker described in Reference Example 1 were bound by the action of T4 DNA ligase under the conditions described in Reference Example 1. To the reaction solution was added 10 units of the restriction enzyme Sail, and the mixture was allowed to act at 37 ° C. for 3 hours to form cohesive ends. After the reaction, the protein was removed with phenol, and the sample was applied to a Sepharose 4B column under the conditions described in (1) of Reference Example 2, and a 1.43 kb DNA fragment (adr-type P3 Fractions containing DNA encoding 1) were collected and the DNA was precipitated with cold ethanol (see FIG. 8).
Ιμ9 の参考例 1に記載された発現用ベクター pPHOl 7—1 DNA に 2ュニッ 卜の制限酵素 Sailを 20 の反応液〔 6πιΜ Tris-HCl- " ( ρΗ 7.5 ) , 6 mM MgCl2 , l 5 0 mM NaCl , 6 mM 2—メルカ ブトエタノール 〕中で 3 7 °C , 2時間作用させ、 次に 0.1ュニッ トのァ ルカリ性ホスファターゼを添加して 6 5 °C , 3 0分間反応を続けた。 反 応後、 フエノールで除蛋白し、 冷エタノールを加えて DNAを沈殿させ た（ Sail消化 PPH017 - 1 )。 9μ9, the expression vector pPHOl 7-1 DNA described in Reference Example 1 and 2 units of the restriction enzyme Sail were added to a reaction solution of 20 [6πιΜ Tris-HCl- “(ρΗ7.5), 6 mM MgCl 2 , l 50 mM NaCl, 6 mM 2-mercaptoethanol] at 37 ° C for 2 hours, and then 0.1 unit of alkaline phosphatase was added, and the reaction was continued at 65 ° C for 30 minutes. After the reaction, the protein was deproteinized with phenol, and cold ethanol was added to precipitate the DNA (Sail digestion PPH017-1).
次に、 20 0 ngの前記 1.4 3 kbDNA断片と 2 0 0 ngの Sail 消 化 pPHO l 7— 1とを、 参考例 1に記載の条件下で T 4 DN A リガーゼ の作用により結合させた。 該反応液を用いて大腸菌 2 9 4株を形質転換 させ、 形質転換体を参考例 1に記載された方法によって調べ、 adr型 P 3 1をコ—ドする DN Aを含む 1.4 3 kb DNA断片がPHO 5 プロ モーターと順方向に揷入されたプラスミ ド pPHO P 3 1— Rを保持 する菌株（Escherichia coli 294/pPHO P 3 1一 R )を分離した。 この形質転換体よりアル力リ抽出法によって分離された該プラスミ ド pPHO P a 1— Rを用レ、て酵母宿主 Saccharomyces cerevisiae Next, 200 ng of the 1.43 kb DNA fragment and 200 ng of Sail-excluded pPHOl7-1 were bound by the action of T4DNA ligase under the conditions described in Reference Example 1. The reaction solution was used to transform Escherichia coli 294, and the transformant was examined by the method described in Reference Example 1. A 1.43-kb DNA fragment containing DNA encoding adr-type P31 was transformed. Isolated a strain (Escherichia coli 294 / pPHOP31R) carrying the plasmid pPHOP31-R inserted in the forward direction with the PHO5 promoter. The plasmid isolated from this transformant by the extraction method Use pPHO P a 1—R, yeast host Saccharomyces cerevisiae
AH22R一を前述の Hinnenらの方法で形質転換させ、 該プラスミ ドを AH22R-1 was transformed by the method of Hinnen et al.
保持する酵母形質転換体（AH22Rーノ pPHOPa 1— R )を分離した The yeast transformant (AH22R-no pPHOPa 1- R) that was retained was isolated.
(第 8図参照）。  (See Figure 8).
なお、 当該菌株 ( Saccharomyces cecevisiae AH 22 Rフ pPHO  The strain (Saccharomyces cecevisiae AH22R pPHO
P 3 1一 R)は財団法人発酵研究所に I FO— 1 0 1 3 5として寄託され、 また、 昭和 5 9年 9月 4日から工業技術院微生物工業技術研究所（ F R  P311-R) was deposited with the Fermentation Research Institute as IFO-1013, and from September 4, 1984, the Institute of Microbial Industry and Technology (F R
I：)に受託番号 FERM P— 7 8 2 5として寄託されている。  Deposit No. FERM P—7 825 in I :).
② 参考例 2の③に記載された発現用ベクター p PKT 700-1 DNA ,  ② Expression vector p PKT 700-1 DNA described in ③ of Reference Example 2,
1 ^ に 2ユニッ トの制限酵素 Sailを 3 7 °Cで 2時間作用させ、 つづ  1 unit was treated with 2 units of restriction enzyme Sail at 37 ° C for 2 hours, followed by
いて 0.1ュニッ トのアル力！；性ホスファタ一ゼを実施例 3の①に記載さ 0.1 units of power! The sex phosphatase was described in
れた条件下で作用させた後、 冷ェタノ —ルで DN Aを沈殿させる（Sail 消ィ匕 PPKT 700— 1 )。 After working under the conditions described above, the DNA is precipitated with cold ethanol (Sail Kaiyi PPKT 700-1).
次に、 実施例 3の①に記載の 1.43 kbDNA 断片 2 0 0 ngと Sail 消化 PPKT 700— 1 20 Ong とを参考例 1に記載の条件下で T 4 D  Next, 200 ng of the 1.43 kb DNA fragment described in (1) of Example 3 and Sail-digested PPKT 700-120 Ong were combined with T4D under the conditions described in Reference Example 1.
NAリガーゼの作用により結合させる。 該反応液を用いて、 実施例 3の It is bound by the action of NA ligase. Using the reaction solution,
①に記載した方法によって、 adr型 P 3 1をコードする DN Aを含む Including DNA encoding adr-type P31 by the method described in ①
1.4 3 kb DNA断片が P GKプロモータ—と順方向に挿入されたプラ  1.4 Plasmid with 3 kb DNA fragment inserted in front with PGK promoter
ス ミ ド PPKTP31-Rを保持する菌株（ 294/PP TP 31— R ) を Strain PPKTP31-R-bearing strain (294 / PPTP31-R)
分離し、 該プラスミ ドで酵母宿主 K 33-8Dを形質転換し、 酵母形質転 Isolate and transform the yeast host K33-8D with the plasmid.
換体（K33— 8DZpPKT P31— R)を取得する（第 8図参照）。 Obtain the recombinant (K33-8DZpPKT P31-R) (see Fig. 8).
③ 参考例 3の③に記載さ た発現用ベクター pGLD906— 1DNA,  ③ Expression vector pGLD906—1DNA, described in 3) of Reference Example 3
1 に 2ュニッ トの制限酵素 Sailを 3 7 °Cで 2時間作用させ、 つづ  Apply 1 to 2 units of the restriction enzyme Sail at 37 ° C for 2 hours.
いて 0.1ュニッ 卜のアルカ リ性ホスファタ一ゼを実施例 3の①に記載の. 0.1 units of alkaline phosphatase was described in Example 3①.
条件下で作用させた後、 冷エタノールで DNAを沈殿させる（Xhol消 After working under the conditions, precipitate the DNA with cold ethanol (Xhol
差換え  Replacement
、 ，'"リ , ィ匕 pGLD 906— 1 )。 ,, '"Li, 匕 dani pGLD 906—1).
次に、 実施例 3の①に記載の 1.4 3 kbDNA断片 2 0 0 ngと Sail 消化 pGLD 906— 1とを参考例 1に記載の条件下で T 4 DNAリガー ゼの作用により結合させる。 該反応液を用いて、 実施例 3の①に記載し た方法によって、 adr型 P 3 1をコードする DNAを含む 1.4 3 kb D  Next, 200 ng of the 1.43 kb DNA fragment described in (1) of Example 3 and the Sail digested pGLD906-1 are ligated under the conditions described in Reference Example 1 by the action of T4 DNA ligase. Using the reaction solution, 1.43 kb DNA containing adr-type P31-encoding DNA
N A断片が GLDプロモーターと順万向に挿入されたプラスミ ド pGLD Plasmid pGLD in which the NA fragment is inserted into the GLD promoter
P.31— R を保持する菌株（ 294ZPGLD P3丄ー^を分離し 該プ ラスミ ドで酵母宿主 K33— 7Bを形質転換し、 酵母形質転換体（K33— P.31—R-strain (294ZPGLD P3 ^^ was isolated, yeast plasmid K33-7B was transformed with the plasmid, and a yeast transformant (K33—
7B/pGLD P31-R) を取得する（第 8図参照）。  7B / pGLD P31-R) (see Figure 8).
これら形質転換体を通常の方法で培養して、 目的とする P 3 1を得る ことができる。  These transformants can be cultured by a usual method to obtain the desired P31.
実施例 4 adw型 B型肝炎ウイルスの表面抗原 P 3 1遺伝子を発現する- 酵母用組み換え DN A分子の構築および該 DN A分子による 酵母の形寳転換 . ' . ① 実施例 2に記載されたプラス ミ ド PHBV 9 33 DNA， 2 ^ に 2 . Example 4 adw-type hepatitis B virus surface antigen P31 gene is expressed-construction of recombinant DNA molecule for yeast and transformation of yeast by said DNA molecule. '. ① described in Example 2 Plasmid PHBV 933 DNA, 2 ^ 2.
ュニッ トの制限酵素 Hpa Iを 2 0 の反応液〔 1 0 mM Tris -HC1 Reaction kit (20 mM Tris-HC1)
( pH 7.5 ) ， 7 mM MgCl2 , l 00 mM KCl , 2—メルカプトエタ ノ ール〕中で 3 7 ， 2時間作用させた後、 フエノールで除蛋白し、 冷 エタノールで DNAを沈殿させた。 該 DNA 3 0 0 ngと、 参考例 1に 記載されたリン酸化 Sail リ ンカ一 5 0 ng とを混合し、 参考例 1に記 載された条件下で T 4 DNAリガーゼの作用によつて結合させた。 該反 応液を用いて大腸菌 2 9 4株を形質転換させ、 アンピシ リ ン耐性の形質 転換体の中からプラスミ ド pHBVg 33の Hpa I部位力； Sal I 部位に 変換したプラスミ ド PHBV 9 33— 8を得た（第 9図参照）。 (pH 7.5), 7 mM MgCl 2 , 100 mM KCl, 2-mercaptoethanol] for 37 to 2 hours, followed by deproteinization with phenol and DNA precipitation with cold ethanol. 300 ng of the DNA and 50 ng of the phosphorylated Sail linker described in Reference Example 1 were mixed, and bound by the action of T4 DNA ligase under the conditions described in Reference Example 1. I let it. The reaction solution was used to transform Escherichia coli 294, and among the transformants resistant to ampicillin, the ability of the plasmid pHBVg33 at the HpaI site; the plasmid PHBV933- converted to the SalI site 8 (see Figure 9).
100 の該プラス ミ ド pHBV 933—8 DN Aに、各 1 0 0ュニ  100 units of pHBV 933-8 DNA were added to each 100 units.
差換え 、 ッ トの制限酵素； EcoRIと Sal Iを 2 0 0 ^の反応液 〔 1 0 0 mM Tris-HCl ( pH 7.5 ) , 7 mM MgCl2 , 5 OmM NaCl , 7mM 2 一メルカプトエタノール〕中で 3 7。C , 2時間作用させた後、 反応液をReplacement, Tsu City of restriction enzymes; the EcoRI and Sal I 2 0 0 ^ of reaction solution [1 0 0 mM Tris-HCl ( pH 7.5), 7 mM MgCl 2, 5 OmM NaCl, 7mM 2 one-mercaptoethanol] 3 7 in . C, After reacting for 2 hours,
1.2 %ァガロース · スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気 泳動にかけた。 泳動後、 adw型 P 3 1をコードする DN A断片を含む Electrophoresis was performed using 1.2% agarose slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After electrophoresis, contains DNA fragment encoding adw-type P31
0.9 6 kb DN A断片を参考例 1に記載の万法によってゲルから分 ¾ ^し た（第 9.図参照 )。 .  The 0.96 kb DNA fragment was separated from the gel by the universal method described in Reference Example 1 (see FIG. 9). .
2 0 のプラス ミ ド PBR 32 2DNAに、 各 2 0ュニッ トの制限酵 素 Clalと Sai Iとを 1 0 μίの反応液〔 6 mM Tris-HCl ( pH  Twenty units of the restriction enzyme Clal and Sai I were added to 20 μl of PBR322 DNA in a 10 μί reaction solution (6 mM Tris-HCl (pH
7.9 ) , 1 5 0 mM NaCl , 6 mM MgCl„ , 6 mM 2—メルカプト ェタノ ール〕中で 3 73C , 2時間反応させた後、 1.0 アガロース ' ス ラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気泳動にかけた。 泳動後、 3.7 4 kbDNA断片を参考例 1に記載の方法によってゲルから分取した。 該 3.7 4 kbDNA断片 5 0 0 ng、前記 0.9 6 kbDNA断片 5 0 0 ng および実施例 1に記載のリン酸化アダプタ一 d 7.9), 150 mM NaCl, 6 mM MgCl „, 6 mM 2-mercaptoethanol), after reacting for 3 hours at 37 C, described in Reference Example 1 using 1.0 agarose 'slab gel. After electrophoresis, a 3.74 kb DNA fragment was separated from the gel by the method described in Reference Example 1. 500 ng of the 3.74 kb DNA fragment and 500 ng of the 0.96 kb DNA fragment. And the phosphorylated adapter described in Example 1
f 5'C GAT AC AATGC AGT GG 3' _ Λ n o. レ 弁 f 5'C GAT AC AATGC AGT GG 3'_ Λ no .
( 3,TATGTTACGTCACCTTAA5,ノ 50 ngとを参考例 し 5G 載の条件下で T 4DNAリガーゼの作用によつて結合させた。 該反応液 を用いて大腸菌 2 9 4株を形質転換させ、 アンピシ リ ン耐性の形質転換 体から前記 3種の DN Aが結合したプラスミ ド pHBV P 31 DNAが 得られた（第 9図参照）。 (3, TATGTTACGTCACCTTAA 5, was transformed into E. coli 2 9 4 strains with was by connexion coupled to the action of T 4 DNA ligase under the conditions of the Roh 50 ng Reference Example and 5G mounting. The reaction solution ampicillin Li A plasmid pHBVP31 DNA to which the above three types of DNA were bound was obtained from the transformant having resistance to the enzyme (see FIG. 9).
5 0 の該プラス ミ ド pHBV P 31 DNAに各 2 0ユニッ トの制 限酵素 Sal Iと Clalとを 1 0 0 ^の反応液!： 1 0 mM Tris-HCl ( pH 7.5 ) ， 7 mM MgCls ， 175mM NaCl , 0.2 mM EDTA, 7 mM 2—メルカプトエタノ ール〕中で3 7 °C , 3時間作用させた後、 反応液を 1.0 ァガロース ' スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件 . 差換！ 下で電気泳動にかけた。 泳動後、 0.9 8 kbDNA 断片を参考例 1に記 載の方法でゲルから分取した（第 9図参照）。 A reaction mixture of 50 ^ of the plasmid pHBV P31 DNA with 20 units of each of the restriction enzymes SalI and Clal in 100 ^ !: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl s, 175mM NaCl, 0.2 mM EDTA , 7 mM 2- mercaptoethanol] after act 3 7 ° C, 3 hours in the conditions described the reaction in reference example 1 using 1.0 Agarosu 'slab gel. Replacement! Electrophoresed underneath. After the electrophoresis, a 0.98 kb DNA fragment was fractionated from the gel by the method described in Reference Example 1 (see FIG. 9).
2 ^の該 0.9 8 kb DNA断片に DNAポリ メラーゼ I ラージ ' フ ラグメン トを参考例 1に記載の条件下で作用させて接着末端を平滑末端 にした後、 フエノールで除蛋白し、 冷エタノールで DNAを沈殿させた。 実施例 3の①に記載の方法によつて、 該 0.9 8 kbDNA断片に Sal Iリ ンカーに 5'— P— d ( CGTCGACG：) , ベセスダ · リサーチ社〕を結 合させ、 Sail処理によって接着末端を生成させ、 セファローズ 4 B力 ラムを用いて 0.9 9 kb DNA断片（ adw型 P 31をコードする DNA ) を含む画分を集め、 冷エタノ ールで該 DN Aを沈殿させた（第 9図参照） c 実施例 3の①に記載の Sal I消ィ匕 pPHO 17— 1， 200 ngと上言己 0.9 9 kbDNA断片 2 0 0 ng とを参考例 1に記載の条件下で T 4D NAリガーゼの作用により結合させた。 該反応液を用いて大腸菌 2 9 4 株を形質転換させ、 形質転換体を参考例 1に記載された方法によつて調 ベ、 adw型 P 31をコードする DNAを含む 0.9 9 kbDNA断片が PHO 5プロモーターと順方向に挿入されたプラスミ ド pPHO P31— Wを 保持する菌株（Escherichia coli 294/pPHO P 31— W)を分離し た。 該形質転換体よりアルカ リ抽出法によって分離された該プラスミ ド PPHO P31— Wを用いて酵母宿主 AH22 R一を前述の Hinnenらの方 法で形質転換させ、 該プラスミ ドを保持する酵母形質転換体（Saccha— romyces cerevisiae AH 22R~/pPHO P31-W)を分離した (第 9図参照）。 ' The DNA polymerase I large 'fragment was allowed to act on the 0.98 kb DNA fragment of 2 ^ under the conditions described in Reference Example 1 to make the cohesive ends blunt, followed by deproteinization with phenol and cold ethanol. DNA was precipitated. According to the method described in (3) of Example 3, the 0.98 kb DNA fragment was ligated with 5'-P-d (CGTCGACG :), Bethesda Research Co., Ltd. The fraction containing the 0.99 kb DNA fragment (DNA encoding adw-type P31) was collected using Sepharose 4B column, and the DNA was precipitated with cold ethanol (No. 9). (See figure.) C T4D NA under the conditions described in Reference Example 1 was obtained by combining 200 ng of SalI Kouyida pPHO 17-1, 200 ng described in Example 3, and 200 ng of the above-mentioned 0.99 kb DNA fragment. It was bound by the action of ligase. Using the reaction solution, E. coli 294 strain was transformed. The transformant was prepared by the method described in Reference Example 1, and a 0.99 kb DNA fragment containing DNA encoding adw-type P31 was transformed into PHO. A strain (Escherichia coli 294 / pPHO P31-W) carrying 5 promoters and the plasmid pPHO P31-W inserted in the forward direction was isolated. Using the plasmid PPHO P31-W isolated from the transformant by the alkaline extraction method, the yeast host AH22R-1 is transformed by the method of Hinnen et al., And the yeast transformation retaining the plasmid is performed. (Saccha-romyces cerevisiae AH22R ~ / pPHOP31-W) was isolated (see Fig. 9). '
なお、 当該菌株（ Saccharomyces cerevisiae AH 22 R—/pPHO P 31— W)は財団法人発酵研究所に I FO— 1 0 1 3 6として寄託され、 また、 昭和5 9年9月 4日から工業技術院微生物工業技術研究所（ F R 差換 1 )に受託番号？£1{]^ P— 7 8 2 6として寄託されている。 In addition, the strains (Saccharomyces cerevisiae AH 22 R- / pPHO P 31- W) has been deposited as I FO- 1 0 1 3 6 in the Institute for Fermentation, also, industrial technology from September 4, 1984 year Institute of Microbiological Technology (FR replacement) 1) Accession number? £ 1 {] ^ P — deposited as 7 8 2 6
また、 adw型 P 3 1をコードする DNAと P GKプロモーターまたは GLDプロモーターを含有するプラスミ ドも上記の方法に従って構築す ることができる。  In addition, a plasmid containing DNA encoding adw-type P31 and a PGK promoter or a GLD promoter can also be constructed according to the above method.
実施例 5 adw型 B型肝炎ゥィ ルス表面抗原 P 3 1遺伝子を発現する酵 母組み換え DN Aの構築および該 DN Aによる酵母の形質転 換 、 -Example 5 Construction of Enzyme-Recombinant DNA Expressing adw-Type Hepatitis B Virus Surface Antigen P31 Gene and Transformation of Yeast with the DNA,
5
Figure imgf000036_0001
の前記プラスミ ド pTRP P31-W2に 2 0ュニッ トの制限 酵素 Pstlを 1 0 0 の反応液〔 1 0 mM Tris-HCl ( pH 7.5 ) , 1 0 mM Μ g C 12， 5 0 mM NaCl , l mM ジチオスレィ ト ール〕中 で 3 7 °C， 2 0分間作用させ、 部分分解した後、 反応液を 0.8 %ァガロ ース ·スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気泳動にかける。' 泳動後、 Pstlでただ 1か所切断された 4.6 kb の線状 DNA分子を参 考例 1に記載の方法でゲルから分取する（第 1 0図参照）。 Five
Figure imgf000036_0001
The above plasmid pTRP P31-W2 was added with 20 units of the restriction enzyme Pstl to a reaction solution of 100 [10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM Μg C12, 50 mM NaCl, l After reacting at 37 ° C for 20 minutes in 37 mM dimethylthiothiol), the reaction solution is subjected to electrophoresis using 0.8% agarose-slab gel under the conditions described in Reference Example 1. . 'After electrophoresis, separate the 4.6 kb linear DNA molecule that has been cleaved at one site with Pstl from the gel by the method described in Reference Example 1 (see Fig. 10).
5 の該 4.6 kbDNA分子に 5ユニッ トの制限酵素 Clalを、 3 0 μί の反応液!： 1 O mM Tris-HCl ( pH 7.5 ) , 7 mM MgCl2 ， 1 O mM NaCl 〕中で、 3 7 °C， 3時間作用させた後、 反応液を 1.0 ァガローズ .'スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気泳動 にかける。 泳動後、 0.9 8 kb DNA断片を参考例 1に記載の方法でゲ ルから分取する。 5 of the 4.6 kb DNA molecules were added with 5 units of the restriction enzyme Clal in 30 μί of a reaction solution !: 1 OmM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl 2 , 1 OmM NaCl]. After operating at ° C for 3 hours, the reaction solution is subjected to electrophoresis using 1.0 agarose. 'Slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After the electrophoresis, a 0.98 kb DNA fragment is separated from the gel by the method described in Reference Example 1.
該 0.9 8 kb 01^ 断片0.8 μ9 を 2.5ュニッ トの Τ 4 DNAポリメ ラーゼ〔宝酒造㈱製〕を用いて、 2 0 の反応液〔 3 3 mM Tris- acetate ( H 7.9 ) , 6 6 mM酢酸力 リウム， 1 0 mM酢酸マグネシ ゥム ， 5 mMジチォスレイ ト一ル〕中、 3 7 で 1 5分間処理し、 接着 末端を平
Figure imgf000036_0002
Aを沈澱させる。 実施例 3の①に記載の方法によって、 該 0.9 8 kb D NA断片に Sailリ ンカ—を結合させ、 Sail処理によって接着末端を 生成させ、 セファロ一ズ 4Bカラムを用いて、 0.9 9 kb DNA断片 ( adw型 P 31をコードする DNA )を含む画分を集め、 冷ェタノ—ル で該 DNAを沈澱させる。 0.8 μ9 of the 0.98 kb 01 ^ fragment was ligated with 2.5 units of Τ4 DNA polymerase [manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.] to obtain a reaction solution of 20 [33 mM Tris-acetate (H7.9), 66 mM acetic acid In 10 mM magnesium acetate, 5 mM dithiothrate) for 15 minutes with 37.
Figure imgf000036_0002
Precipitate A. A Sail linker was bound to the 0.98 kb DNA fragment according to the method described in (1) of Example 3, a cohesive end was generated by Sail treatment, and a 0.99 kb DNA fragment was obtained using a Sepharose 4B column. Fractions containing (DNA encoding adw-type P31) are collected, and the DNA is precipitated with cold ethanol.
実施例 3の①に記載の Sail消化 p PHO 17 -1 200 ngと上記 0.9 9 kb DNA断片 200 ngとを参考例 lに記載の条件下で T 4 DN Aリガーゼの作用により結合させる。 該反応液を用いて大腸菌 29 4株 を形質転換させ、 形質転換体を参考例 1に記載された方法によつて調べ、 adw型； P 31をコ—ドする DNAを含む 0.9 9 kb DNA断片が； PHO 5プロモーターと順方向に挿入されたプラス ミ ド pPHO P 31一 Wを保 持する菌株（ 294/pPHO P31-W) を分離する。 該形質転換体よ- . りアル力リ抽出法によって分離された該プラスミ ド pPHO P31— Wを 用いて酵母宿主 AH22R一を前述の Hinnenらの方法で形質転換させ、 該プラスミ ト '一を保持する酵母形質転換体（AH22R—ノ pPHO P31— W)を分離する（第 1 0図参照 )。  200 ng of Sail-digested pPHO 17-1 described in Example 3① and 200 ng of the 0.99 kb DNA fragment described above are bound by the action of T4 DNA ligase under the conditions described in Reference Example 1. The reaction solution was used to transform Escherichia coli 294 strain, and the transformant was examined by the method described in Reference Example 1 to obtain a 0.99 kb DNA fragment containing adw-type; DNA encoding P31. However, a strain (294 / pPHOP31-W) carrying the PHO5 promoter and the plasmid pPHOP31-W inserted in the forward direction is isolated. The yeast host AH22R-1 was transformed by the method of Hinnen et al. Using the plasmid pPHO P31-W isolated from the transformant by a manual extraction method, and the plasmid was retained. A yeast transformant (AH22R-no pPHO P31-W) is isolated (see FIG. 10).
この形質転換体を通常の方法で培養して、 目的とする P 3 1を得るこ とができる。  This transformant can be cultured by a usual method to obtain the desired P31.
実施例 6 P 3 1遺伝子の大腸菌における発現 Example 6 Expression of P31 Gene in Escherichia coli
実施例 1と 2で得られた P 3 1遺伝子発現プラスミ ドを含む各形質転 換体を、 1.0 %グルコース ， 1.0 %カザミノ酸を含む M— 9培地で、 37 °C， 6時間培養した後、 菌体を集め、 緩衝液 (： 3 0 mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 5 0 mM Ν a C 1 , 5 mM EDTA：!で洗浄した。 菌体を 1 0 mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 5 mM EDT A , 1 mMフエ二 ルメチルスルホニルフルオラィ ド， 5 ノ リゾチームからなる溶菌液 差換え に懸濁し、 溶菌した。 該溶菌液に最終濃度5 Mになるように塩酸グァニ ジンを添加し、 3 7 °Cで 2時間イ ンキュベーションした。 溶菌液を室温 - 15,000 rpm, 1 5分間遠心分離にかけて上澄液を得た。 この上澄 液の P 3 1活性を、 前述の direct immunoassayによって測定した。 Each transformant containing the P31 gene expression plasmid obtained in Examples 1 and 2 was cultured in M-9 medium containing 1.0% glucose and 1.0% casamino acid at 37 ° C for 6 hours. The cells were collected and washed with a buffer (30 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM Νa C 1, 5 mM EDTA:!) The cells were washed with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0). Lysate consisting of 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride, and 5 lysozyme And lysed. Hydrochloric acid was added Guani gin to a final concentration of 5 M in solution bacterial solution was 2 hours Incubation at 3 7 ° C. The lysate was centrifuged at room temperature-15,000 rpm for 15 minutes to obtain a supernatant. The P31 activity of this supernatant was measured by the direct immunoassay described above.
その結果を第 2表に示すが、 P 3 1の生成量はブロス 1^あたりとして 計算された。 また、 この生成量は特開昭 5 8 - 2 0 1 7.9 6号公報記載 の表面抗原の産生量より高いことがわかった。 The results are shown in Table 2, where the amount of P31 produced was calculated per 1 ^ of broth. In addition, it was found that the production amount was higher than the surface antigen production amount described in JP-A-58-210.796.
^ 2,  ^ 2,
形 質 転 換 体 HBsAg (単 ブロス）  Transformant HBsAg (single broth)
Escherichia col i 294/pTRP Ρδ 1 -R 220 Escherichia col i 294 / pTRP Ρδ 1 -R 220
Escherichia col i 294/pTRP P31-W2 300 Escherichia col i 294 / pTRP P31-W2 300
HBsAg l単位は 1 ngの HBsAg小型粒子に結合するオースリア Π — 125キッ ト添付の125 I "^抗 HBsAg抗体のカウン ト数の値である。 実施例 6 P 3 1遺伝子の酵母における発現 - 実施例 3と 4で得られた P 3 1遺伝子発現プラスミ ドを含む各酵母形 質転換体を、 Burkholderおよびその低リン酸培地で、 3 0 °C , 2日間 培養した後、 菌体を集め、 生理食塩水で洗净した。 The HBsAgl unit is the number of counts of the anti-HBsAg antibody attached to 1 ng of HBsAg small particles Auslia Π—125 kit attached to 125 A. Example 6 Expression of P31 gene in yeast-Example Each yeast transformant containing the P31 gene expression plasmid obtained in Examples 3 and 4 was cultured in Burkholder and its low-phosphate medium at 30 ° C for 2 days, and the cells were collected. Washed with physiological saline.
Miyanohara, A. ら！：前出〕の方法に従って菌体を Zymo lyase 〔生 化学工業㈱製〕によってスフエロプラス トにした後、 スフエロプラス ト に 0.1 ト リ トン X— 1 0 0を添加して P 3 1を抽出した。 溶菌液を室 温で 15,000 rpm， 15分間遠心分離にかけて上澄液を得た。 この上澄 液の P 3 1活性をオースザィム H 〔アポッ ト㈱製〕を用いて測定した。 Miyanohara, A. La! The cells were converted into spheroplasts by Zymolyase (manufactured by Seikagaku Corporation) according to the method described above, and then 0.1% Triton X—100 was added to the spheroplasts to extract P31. The lysate was centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes at room temperature to obtain a supernatant. The P31 activity of this supernatant was measured using Ausim H (Apot II).
その結果を第 3表に示すが、 P 3 1の生成量はブロス 1 あたりとして 計算された。 差換え The results are shown in Table 3, where the amount of P31 produced was calculated per broth. Replacement
ひ、 Hi,
OMP1 酵 母 形 質 転 換 体 P31( /^ ブロス）OMP1 Yeast transformant P31 (/ ^ broth)
S accharomyces cerevisiae AH 22 R" VpPHO P31-R 1200 S accharomyces cerevisiae AH 22 R "VpPHO P31-R 1200
S accharomyces cerevisiae AH 22 R PPHO P3- 1-W 1 100  S accharomyces cerevisiae AH 22 R PPHO P3-1-W 1 100
P 3 1は、 HBsAg 粒子を標準品としてオースザィム ϋで測定した。 P31 was measured with Auszym II using HBsAg particles as a standard.
産業上の利用可能性 ' · 、 Industrial applicability '·,
本発明で提供される組み換え D Ν Α，該組み換え D N Aを含有する形 質転換体は HBsAg P 3 1の製造に有用であり、 本発明で提供される  The recombinant D D で provided by the present invention and the transformant containing the recombinant DNA are useful for producing HBsAg P31 and provided by the present invention.
HBsAg P 3 1は HBVの感染防止に有用なワクチンとして有用であ る。 HBsAg P31 is useful as a vaccine useful for preventing HBV infection.
差換え CiV-pi Replacement CiV-pi
、 ' Wlto 、 ソ , ' Wlt o, S

Claims

請 求 の 範 囲 The scope of the claims
(1) B型肝炎ウィルス表面抗原 P 3 1をコードする DNAをプロモータ —領域の 3'末端に挿入してなる組み換え DNA。  (1) Recombinant DNA obtained by inserting DNA encoding hepatitis B virus surface antigen P31 into the 3 'end of the promoter region.
(2) B型肝炎ウィルス表面抗原 P 3 1をコードする DNAをプロモータ 一領域の 3'末端に挿入してなる組み換え DNAを含有する形質転換体。(2) A transformant containing a recombinant DNA obtained by inserting DNA encoding hepatitis B virus surface antigen P31 into the 3 'end of one region of the promoter.
(3) B型肝炎ウィルス表面抗原 P 3 1をコ一ドする DNAをプロモータ 一領域の 3'末端に挿入してなる組み換え D N Aを含有する形質転換体を 培養し、 培養物中に B型肝炎ウィルス表面抗原 P 3 1を生成蓄積させ、 それを採取することを特徴とする B型肝炎ウィルス表面抗原： P 3 1の製 造法。 (3) A transformant containing the recombinant DNA obtained by inserting the DNA encoding the hepatitis B virus surface antigen P31 into the 3 'end of the promoter region is cultured, and the hepatitis B is added to the culture. A method for producing hepatitis B virus surface antigen: P31, which comprises producing, accumulating, and collecting virus surface antigen P31.
差換え Replacement
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JPS5980615A (en) * 1982-10-29 1984-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Dna and its use

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