NO833198L - Fremstilling av hepatit-b-virus vaksine - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører kloning av et gen som koder for hepatitt-B-overflateantigen hos gjær ved bruk av rekombinant DNA-teknikker og fremstilling av en hepatitt-B-virusvaksine fra antigen fremstilt av gjæren.

Infeksjon med hepatitt-B-virus (HBV) er et alvorlig utbredd helseproblem. Infeksjonen kan manifestere seg i akutte eller kroniske faser. Antall tilfeller av akutt hepatitt i USA anslås å være minst 100.000 pr. år med et dødelighets-forhold på 1 til 2 %. I USA varierer forekomst av kroniske bærere av HBV blant friske voksne mellom 0.1 og 1 % avhen-gig av alder og sosial klasse. I Syd-Amerika er forekomst av kroniske bærere ca. 1 til 3 %; i USSR og Syd-Europa ca.

3 til 6 %; og i Asia og Afrika mer enn 10 %.

-'I utviklede land foreligger et behov for en vaksine for folk med stor risiko for utsettelse såsom pasienter og per-sonale på medisinske sentere hvor blod behandles, militær-personell, ektefeller av kroniske bærere, reisende til områder med meget HBV, nyfødte av kroniske bærere, homo-seksuelle, prostituerte og medikamentmisbrukere. I den tredje verden foreligger et behov for en billig vaksine for masse-immunisering. Masseimmuniseringsprogrammer kan i siste in-stans ikke bare påvirke hyppigheten av hepatitt hos voksne og samlingen av kroniske bærere, men også redusere virkningen og dødeligheten ved kronisk aktiv hepatitt og hepatocellu-lært karcinom. " Dane-partikler som antas å være hepatitt-B-virioner og som kan isoleres fra infiserte pasienter, har en diameter på ca. 42 nm. Hver består av en kapsel omfattende hepåtitt-B-overflateantigen (HBsAg), et kapsid (HBcAg), en endogen polymerase og et DNA genom. Genomet er ringformet og dobbeltkjedet med et en-bånds-område bestående av ca. 200 baser. En-bånds-området kan innfylles in vitro ved på-virkning av endogen polymerase. Den lengste kjede inneholder ca. 3.200 baser.

Det har vært vanskelig å fremstille HBV-vaksiner fordi det ' har vist seg vanskelig å dyrke virus i vevskultur og fordi den eneste kjente vert er menneske. Små mengder autentisk HBV-antigener er blitt isolert fra infiserte mennesker. F- D- C Reports, s. 3-4, 19. Juli 1982 inneholder en rapport av kliniske studier av en nylig utviklet hepatitt-B-vaksine.

Valenzuela et al., Nature, bind 298, 347-350 (1982), beskriver syntese av HBsAg i gjær ved bruk av en ekspresjons-vektor hvor HBsAg kode-sekvensen er et 835 bp Taql-Hpal-fragment og promotoren er gjæralkohol-dehydrogenase I promotor. Flere tidligere korte rapporter beskriver forsk-ning forut for dette litteratursitat. Disse er Valenzuela et al., Arch. Biol. Med. Exp. ( Chile), bind 14(1), 21-22

(1981) som rapporterer ekspresjon hos gjær av en DNA-freg-ment inneholdende en frekvens som koder for et lignende protein til HBsAg ligert til et gjæralkohol-dehydrogenase-promotorområde; en rapport i Scrip nr. 616, s. 14 (12. august 19 81), som angir at en gruppe amerikanske forskere innbefattet P. Valenzuela og W.J. Rutter har beskrevet produksjon i gjær av "the protein-coating surrounding hepatitis B virus"; og Zuckerman,. Nature, bind 295, 98-99 (19 82) som rapporterer at W.J. Rutter har rapportert ekspresjon av glycosylert HBsAg i gjærceller.

Antigen-komponenter av HBV såsom HBsAg er blitt fremstilt

i bakterier etter innsettning av et rekombinant DNA-molekyl inneholdende et gen som koder for antigenet. Burrell et al., Nature, bind 279, nr. 5708, 43-47 (1979), rapporterer ekspresjon i E. coli-stamme HB101 av HBV DNA-sekvenser klonet i plasmid pBR322.

Murray et al., Europeisk. patentansøkning 13.828, beskriver fremstilling av en rekombinant vektor som kan kode for HBV-antigener inneholdende HBsAg i E.coli-stamme HB101. Vektoren fremstilles av Dane-partikkel DNA og plasmid pBR322. Forfåtterene angir at anvendelige verter kan være bakterieverter, gjær eller andre sopper, dyr eller plante-) celler og andre verter, selv om den eneste viste vert er E. coli. Charnay et al., Nature, bind 286, 893-895 (1980) rapporterer konstruksjon av en bakteriofag som bærer en fusjon av 0-galaktosidasegenet og HBsAg strukturgenet. Bakteriofagen forårsaker syntese av et fusjonsprotein omfattende anti-gendeterminanter for både HBsAg og 3-galaktosidase.

Tiollais et al., Britisk patentansøkning nr. 2.034.323, beskriver fremstilling av en colifag inneholdende HBV DNA. Sammenkoblet fag-HBV DNA transformeres til E. coli-stamme C600.

I Britisk patentansøkning nr. 2.070.621, først publisert som PCT-ansøkning WO81/00577, beskrives et plasmid som omfatter en del av HBsAg-genet og promotoren og Z-genet til lactose-operonet og som kan klones i E. coli.

Rutter et al., Europeisk patentansøkning nr. 20.251, beskriver rekombinantvektorer innbefattet en rekombinant-vektor omfattende pBR322 og BamHI-fragmenter av HBV DNA, som kan brukes for å transformere E. coli. En annen vektor omfattende et BamHI-fragment av HBV DNA og en del av trypto-fanoperonet, ble brukt for å oppnå ekspresjon i E. coli-stamme HB101.

Edman et al., Nature, bind 291, nr. 5815, 503-506 (1981), beskriver konstruksjon av plasmider som dirigerer syntese av HBcAg og et 3-lactamase-HBsAg-fusjonsprotein under kontroll av tryptofanoperonreguleringsområdet i E. coli.

Annen litteratur beskriver innsetting av HBV DNA i bakterier innbefattet Charnay et al., Prog. Ited. Virol., bind 27, 88-92 (1981); MacKay et al, Proe. Nati. Acad. Sei. U. S., bind 78, nr. 7, 4510-4514 (1981); Fritsch et al., CR. Acad. Sei, bind 287, nr. 16, 1453 (1978); U.K. patent-beskrivelse 2.034.323 (Derwent nr. 46874C); og Pasek et al. Nature, bind 282 nr. 6. 575 (1979).

HBV DNA er også klonet i pattedyrceller. Disse innbefatter mennesker, mus, og menneske-heptoma-cellelinjer. F. eks'. rapporterer Dubois et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U. S., bind 77, nr. 8, 4549-4553 (1980), transformasjon av muse-celler med et plasmid inneholdende HBV-genomet og ekspresjon av HBsAg; Hirschman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U. S., bind 77, nr. 9, 5507-5511 (1980) rapporterer produksjon av HBV-lignende partikler ved HeLa-celler transformert med HBV DNA.

Fremgangsmåter for fremstilling av HBV-vaksine ved bruk av HBsAg fra menneskeblod er beskrevet av Funakoshi et al., Prog. Med. Virol. bind 27, 163-167 (1981), og Maupas et al. Prog. Med. Virol. bind 27, 185-201 (1981). Vaksinen fremstilt av Funakoshi et al. inneholder 40 ug renset, formalin-behandled HBsAg, forsfatnatriumklorid, 20 mg mannitol; og 0,1 % aluminiumhydroksyd som hjelpestoff. I sistnevte publikasjon rapporterer Maupas et al. at en dose vaksine "var 1 ml renset, formalinbehandlet HBsAg inneholdende

2-10 ug/ml protein (Lowry's metode) og 0,1 % aluminiumhydroksyd. Forskriften som ble brukt i undersøkelsen "rapportert av Maupas et al. krevet tre injeksjoner med en måneds intervaller med en booster-dose etter ett år; og for-fatterene foreslår en forskrift bestående av to injeksjoner konsentrert HBsAg med tre måneders mellomrom.

Ytterligere referanser for fremstilling av HBV-vaksiner er Maupas et al., Adamowicz et al., og Funakoshi et al. ved sidene 3, 37 og 57, av hepatitt-B-vaksine INSERM symposium nr. 18, edit. ved Maupas og Guesry, 1981, Elserier/North-Holland Biomedical Press.

Gjær er blitt brukt som vertsorganismer for visse andre DNA-sekvenser. F.eks. beskriver Fraser et al., Britisk patentansøkning nr. 2.068.969 fremstilling av kylling-ovalbumin i gjær; Scrip nr. 640, s.ll (4. november 1981) inneholder en rapport om at en type interferon fremstilles i gjær. I Europeisk patent nr. 11.562 (Derwent nr. 38762C) rap<p>orteres hybride gjærplasmider inneholdende ura^-gjær-gen i 2 u plasmidet. Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstillingen av et rekombinant DNA-molekyl omfattende en nukleotidsekvens som kan kode for HBsAg og et reguleringsområde avledet fra gjær arg 3 genet som kan bevirke transkripsjon av HBsAg-sekvensen i gjæren, Saccharomyces cerevisiae. Molekylet inneholder vektorer hvori HBsAg-sekvensen og reguleringsområdet er blitt innsatt, hvilke vektorer kan brukes for å fremstille en gjærvektor eller for å opprettholde HBsAg

og reguleringsområdene. Mikroorganismer inneholdende rekombinant DNA-molekylet, såsom mikroorganismer transformert med plasmider ifølge oppfinnelsen, inngår i oppfinnelsen. Oppfinnelsen inneholder også et plasmid med arg_3 reguleringsområde og et restriksjonspunkt nær dette for innsettning av en kode-sekvens såsom en HBsAg-sekvens,

slik at proteinet som syntetiseres ved ekspresjon av kodesekvensen mangler fremmede aminosyrerester.

Oppfinnelsen innbefatter også fremstilling av en vaksine for å stimulere beskyttelse mot HBV-infeksjon hos mennesker omfattende en vaksinemengde av HBsAg fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse og en egnet bærer.

Videre omfatter oppfinnelsen fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant DNA-molekyler og mikroorganismer som inneholder molekylene samt fremgangsmåte for fremstilling av HBsAg og HBsAg-holdig vaksine.

Figur 1 viser et restriksjonsendonukleasespaltningskart for

PRIT10601.

Figur 2 er et restriksjonsendonukleasespaltningskart for

pRIT10616.

Figur 3 er et restriksjonsendonukleasespaltningskart for

pMC2 00.

Figur 4 er nukleotidsekvensen for en del av 3.300 bp HindIII-gjær-DNA-insatsen i pMC200, hvilken del inneholder HincII, Bglll og EcoRI punkter. Figur 5 er et flytediagram som illustrerer fremstillingen

av pRITlO.6 71 og pRITl0673.

Figur 6 er et flytediagram som illustrerer fremstillingen

av pRIT10749.

Figur 7 er et flytediagram som illustrerer fremstillingen

av pRIT10761 og pRIT10764.

Rekombinant DNA-molekylet fremstilles ved å sammensmelte

en nukleotid-sekvens som inneholder et strukturelt gen for HBsAg med gjær arg3 reguleringsområde, hvilket reguleringsområde kan dirigere transkripsjon av HBsAg-sekvensen i gjær, og derved bevirke ekspresjon av denne. Med "rekombinant DNA-moleky1" menes et DNA-fragment inneholdende HBsAg-kodesekvensen og reguleringsområdet samt andre DNA-molekyler "inneholdende fragmentet såsom plasmid eller fagvektorer.

Med "reguleringsområde" menes en sekvens som inneholder et promotorområde og andre sekvenser som er nødvendig for transkripsjon. Gjær arg3-reguleringsområdet er spesielt fordelaktig fordi det kan være en sterk promotor for ekspresjon av en HBsAg-kodesekvens.

Med "HBsAg" menes et protein som er strukturelt identisk med autentisk HGsAg eller har i det vesentlige samme anti-gendeterminanter som autentisk HBsAg, dvs. er i stand til å stimulere produksjon av antistoffer som spesifikt erkjenner og reagerer med autentisk HBsAg eller spesifikt erkjennes av anti-HBsAg-antistoffer.

HBsAg-kodesekvensen kan isoleres fra DNA ekstrahert fra Dane-partikler i infisert menneskeserum ved å fylle ett-båndsområdet med en DNA-polymerase, fortrinnsvis den endo-gene polymerase, etterfulgt av bryting med en restriksjonsendonuklease. Valget av endonuklease vil delvis avhenge av de foreliggende Dane-partikler. F.eks. kan, som illustrert i eksemplene nedenunder, HBsAg-kodesekvensen til HBV DNA i| Visse Dane-partikler av adw-serotypen isoleres på et enkelt! BamHI-fragment, og HBsAg-kodesekvensen til HBV DNA i visse Dane-partikler av ayw-serotypen kan isoleres på et Hhal-fragment. HBV DNA i Dane-partikler av den samme serotype kan altså vise forskjellige mønstere for restriksjons-punkter.

Restriksjon av DNA for å fremstille DNA-fragmenter brukt i oppfinnelsen, ligering av slike fragmenter for å fremstille rekombinant DNA-molekyler brukt i oppfinnelsen og innføring i mikroorganismer utføres ved kjente teknikker såsom de teknikker som er beskrevet i de forut og etterfølgende angitte litteratursteder. Betingelsene velges slik at man unngår denaturering av DNA-et og enzymene. F.eks. pufferes pH til å bli på ca. 7,0 til 11,0 og temperaturen holdes under ca. 60°C. Fortrinnsvis utføres restriksjon ved en temperatur på ca. 30 til 40°C og ligering utføres ved ca. 0-10°C. Restriksjonsenzymer og ligaser som brukes i ut-førelsen av oppfinnelsen kan kjøpes og bør brukes i henhold til medfølgende instruksjoner. T4 DNA-ligase er den foretrukne ligase.

Sammensmelting av HBsAg-sekvensen til det regulerende område kan utføres ved å bruke mellomproduktvektorer som illustrert i eksemplene nedenunder. Alternativt kan HBsAg-sekvensen innsettes direkte i vektoren som inneholder reguleringsområdet. En vektor er DNA som kan bære og bi-beholde DNA-fragmentet i oppfinnelsen inbefattet f.eks. fager og plasmider. Teknikker for kloning av DNA-fragmenter i fager er beskrevet f.eks. av Charnay et al. Nature, bind 286, 893-895 (1980) og Tiollais, Britisk patentansøkning 2,0 34.32 3. Fortrinnsvis plasseres HBsAg-sekvensen slik i forhold til reguleringsområdet at det HBsAg som syntetiseres ved ekspresjon av HBsAg-sekvensen mangler fremmede aminosyrerester.

Et reguleringsområde som er funnet å være spesielt an-vendelig stammer fra gjær arg_3-genet som koder for ornitin-karbamoyltransferase (OCT). Bruk av arg3 reguleringsområde i er fordelaktig foi^di dets aktivitet er gjenstand for ba0ide _ spesifike og generelle kontrollmekanismer. Det har vært klonet i E. coli på plasmid. pYe ura3 arg3 som angitt av Crabeel et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A., bind 78,

5026 (1981). Foretrukne verter er S. cerevisiae-stammer hvori arginin-biosyntese-forløpet er derepressert, slik som stamme lcl697d. Bruk av slike stammer fører til øket ekspresjon fra arg3-promotoren sammenlignet med den andre stamme som ble brukt i eksemplene, stamme DC5.

Den foretrukne vektor for kloning av det sammensmeltede DNA-fragment i gjær er plasmidet YEpl3, som har evne til replisering og eksistens i både E. coli og S. cerevisiae og derfor er kjent som en pendelvektor. Flere andre gjær-vektorer er kjente og tilgjengelige. HBsAg og reguleringsområdene kan innsettes i en gjærvektor i rekkefølge eller, som illustrert i eksemplene nedenunder, samtidig. Transformasjon med plasmidvektorer vil normalt føre til innsettning av DNA-molekylet ifølge oppfinnelsen som et plasmid. Imidler-tid kan andre reaksjoner såsom rekombinasjoner føre til inn-føring av DNA-molekylet i kromosomalt DNA.

Vaksiner for å stimulere beskyttelse mot HBV-infeksjon hos mennesker omfattende HBsAg fremstilt av gjær ifølge oppfinnelsen og en egnet bærer kan fremstilles ved kjente teknikker. Bruk av et hjelpestoff såsom aluminiumhydroksyd er ønskelig. Således fremstilt HBsAg kan også kombineres med andre immunogener til kombinasjonsvaksiner. HBV eller kombinasjonsvaksiner kan f.eks. gis ved subkutan, intra-venøs eller intramuskulær vei. DNA-fragmentet ifølge oppfinnelsen og HBsAg fremstilt ved denne kan også brukes som en sonde for påvisning av HBV i biologiske prøver ved DNA-hydridiseringsteknikker og forskjellige immunologiske målinger.

I de følgende eksempler på oppfinnelsen som er illustrer-ende og ikke begrensende, er alle prosentdeler vektdeler og alle temperaturer i °C.

Eksempel 1

Fremstilling av mellomproduktplasmid, pRIT10601, ved kombi-nasjo n av HBV DNA med pBR322.

HBsAg positivt serum av ayw-serotype ble defibrinert ved tilsétning av CaCl2til en sluttkonsentrasjon på 0,28 %

og sentrifugert i 2 timer ved 27.000 opm i en SW 27 rotor på 10-20 % sucrosegradienter laget i en puffer (pH 7,5) inneholdende 10 mM trometamin-HCl, IM NaCl og ImM EDTA.

En transparent klump inneholdende Dane-partikler ble resuspendert i samme puffer og sentrifugert oå pufferet 20 % sucrose sjiktet på en 65 % sucrosepute. Et opalescent bånd på pute-mellomsjiktet ble tatt ut og sentrifugert på en lignende 20-65 % gradient ved 200.000 x Gi 4 timer for å pelletere Dane-partiklene.

A. Enkeltbåndområder av HBV-genomet i Dane-partiklene ble reparert ved å bruke endogen DNA-polymerase ved å resus-pendere Dane-partiklene i en reaksjonsblanding (pH 8,0) inneholdende 50 mM trometamin-HCl, 10 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 0,5 mM ditiotreitol, 5 0 mM hver av dATP, dCTP og

32

dGTP og 8 uM P-dTTP (350 Ci/mmol) og inkubere de resus-penderte partikler i 5 timer ved 37°C. Resuspensjonen ble fortynnet til pH 7,5 med en puffer inneholdende 10 mM trometamid-HCl, 10 mM EDTA, 100 mM NaCl og 0,02 % natrium-dodecylsulfat (pH7,5) og inkubert med 0,5 mg/ml pronase i 1 time ved 37°C etterfulgt av fenolekstraksjon og etanol-utf elling .-

Brytning av DNA-et med BamHI-restriksjonsendonuklease ga

to radioaktive fragmenter med størrelser ca. 1.450 bp og 1.600 bp bestemt ved agarosegelelektroforese og autoradio-grafi av gelen.

B. Ca. 30 mg Dane-partikkel DNA ble reparert med endogen-DNA-polymerase i nærvær av ikke-markert dTTP, og ble ekstrahert og tatt ut som beskrevet ovenfor. DNA-et ble blandet med 100 ng plasmid pBR322 som tidligere var brutt med BamHI-restriksjonsendonuklease og behandlet med alkalisk fosfatase. Plasmid pBR322 brukes normalt i rekombinant DNA-metoder og er deponert uten restriksjon på tilgjengeligheten i American Type Culture Collection under nr. 37017. Blandingen ble ekstrahert med fenol, utfelt med etanol, sentrifugert, tørket, resuspendert i 12 ul av en blanding (pH

7,5) inneholdende 50 mM trometamin-HCl, 1 mM ATP, 10 mM MgCl2 t 10 mM ditiotreitol, 50 ug/ml gelatin og 2 enheter/ ml T4 DNA-ligase. Suspensjonen ble inkubert i 4 timer ved 10°C og deretter holdt på is i 18 timer.

Den ligerte DNA-blanding ble brukt for å transformere kompetente celler av E. coli K12-stamme C600 fremstilt ifølge metoden til Cohen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U. S., bind 69, 2110 (1972). Transformanter ble utvalgt

på et fast medium inneholdende ampicilin (200 pg/ml). Isolerte kolonier ble undersøkt for tap av tetracyklinresistens, hvilket indikerer insats av et fremmed DNA-fragment i BamHI-punktet til pBR322 . En slik trans formant-klon ble funnet å inneholde et plasmid, pRIT10601, som etter brytning med BamHI-endonuklease ga et pBR322-fragment på 4.36 0 bp og HBV DNA-fragmenter på 1.600 bp og 1.450 bp. En kultur av E. coli K12-stamme C600(pRIT10601) ble deponert i henhold til bestemmelsene i Europeisk

Patentkonvensjon (EPC) og Budapest Treaty i American

Type Culture Collection, Rockville, Maryland U.S.A. den

2. juni 1982 under ti lgjengelighetsnummer ATCC 39132 . Et restriksjonsendonukleasespaltningskart for plasmid pRIT10601 er vist i figur 1.

C. Størrelsene av fragmentene som dannes ved brytning av Dane-partikkel DNA og pRIT10601 med forskjellige restriksjonsenzymer ble sammenlignet som følger. Dane-partikkel

32

DNA, dvs. HBV DNA, ble markert med P ved endogenpolymer-asereaksjon beskrevet ovenfor eller ved å behandle renset DNA med DNA-polymerase I fra E. coli. Det markerte HBV DNA ble blandet med pRIT10601 og blandingen ble behandlet med en restriksjonsendonuklease og elektroforese på agarosegel. Gelen ble farget med etidiumbromid og fotografert under UV-lys for å lokalisere DNA-fragmentene og ble deretter!

i tørket og autoradiografert for å lokalisere de radioaktive ' HBV DNA-fragmenter. De følgende markerte HBV-fragmenter ble funnet 'å passe nøyaktig på størrelsen av pRITl0601-fragmenter: 1.450 og 1.600 bp BamHI-fragmenter; et 1.330 bp Hpal-fragment; og et 1.130 bp BamHI-XhoI-fragment. Markert Dane-partikkel DNA hydridiserte også spesifikt til både

m

1.450 og 1.600 bp fragmentene frigjort ved BamHI-brytning av pRITl0601 etter overføring av disse fragmenter fra en agarosegel på et nitrocellulosefilter ved teknikken til Southern, J. Mol.Biol., bind 98, 503 (1975).

Disse resultater viste at den klonede DNA-innsats på pRITl0601 representerer HBV-genomet og at en relativ orientering av de to BamHI-fragmenter på pRITl0601 er den samme som i virionet. pRIT10601 ble brukt for å fremstille pRIT10671 i eksempel 10 nedenunder.

EksemDel 2

, .fa

Fremstilling av mellomproduktplasmid, pRIT10616 ved å kombinere HBV DNA med pACYC184.

Dane-partikler ble isolert fra HBsAg positivt serum av adw-serotype som ovenfor beskrevet. Restriksjonsendonuklease-analyse av<32>P-markert HBV DNA tydet på at DNA-et inneholdt et EcoRI-punkt.

HBV DNA innfylt ved endogen polymerasereaksjon ved bruk av ikke-markerte nukleotider ble brutt med EcoRI. Det spaltede DNA ble blandet med plasmid pACYC184 som forut var brutt med EcoRI og behandled med alkalisk fosfatase. Plasmid pACYCl84 er deponert uten restriksjoner for tilgjengelighet i American Type Culture Collection under tilgjengelighetsnummer 37033. Blandingen ble ligert med T4 DNA-ligase.

Den ligerte DNA-blanding ble brukt for å transformere kompetente celler av E. coli K12-stamme C600. Transformanter ble selektert på tetracyklin (15 ug/ml) agar medium og undersøkt for tap av kloramfenicolresistens hvilket er en indikasjon på innsettning i EcoRI-punktet til pACYCl'84.. En transformert koloni ble funnet å inneholde et plasmid,PRIT10616, som inneholdt pACYC184 med en 3.200 bp innsats omfattende HBV DNA på EcoRI-punktet. Et restriksjonskart for pRITl0616 er vist i figur 2. E. coli K12-stamme C600 (pRIT10616) ble deponert ifølge EPC-bestemmelsene og Budapest Treaty i American Type Culture Collection av 2. juni 1982 under tilgjengelighetsnummer ATCC39131.

Eksempel 3

Fremstilling av mellomproduktplasmid, pRIT10640 inneholdende en nukleotidsekvens som kode for HBsAg ved kombinasjon avPRIT10616 med pBR313.

pRIT10616 ble renset ved CsCl-etidiumbromid-densitetsgradi-entsentrifugering, i det vesetlige som beskrevet av Kahn et al, Methods in Enzymology, bind 68, 268 (1979).

DNA-et ble brutt med BamHI-endonuklease, blandet med BamHI-brutt, alkalisk fosfatasebehandlet DNA fra plasmid pBR313, ligert og brukt for å transformere kompetente celler av E. coli Kl2-stamme C600 hovedsakelig som beskrevet i eksempel 1. Plasmid pBR313 er deponert uten restriksjoner på tilgjengelighet i American Type Culture Collection under ti lgjengelighetsnummer 37018.

Transformanter ble utvalgt på ampicillinholdig agar og undersøkt for tap av tetracyklinresistens, hvilket indikerer innsetning på BamHI-punktet av pBR313. En transformert koloni ble funnet å inneholde et plasmid pRITl0640,

som består av pBR313 med en 1.350 bp innsats i BamHI-punktet. Innsatsen er en nukleotidsekvens som kan kode for HBsAg.

Det koder for en del av et antatt HBsAg forstadiumprotein og hele overflateantigenet og inneholder 565 bp av 3' ikke-kodende sekvenser.

Eksempel 4

Fremstilling av mellomproduktplasmid, pMC200, inneholdende arg3- reguleringsområde, ved kombinasjon av gjær arg3- gen med pBR322.

Et 3.300 bp gjær DNA-fragment spesifikt for arg3-genet fremstiltes ved brytning av pYe ura3 arg3 med Hindlll. Plasmidet pYe ura3 arg3 er blitt beskrevet av Grabeel et al., Proe. Nati. Aca. Sei. U. S., bind 78, 5026 (1981). 3.300 bp-fragmentet ble klonet i Hindlll-punktet til pBR322 og transformert til E. coli K12-stamme MM294, hovedsakelig som ovenfor beskrevet. Trans formanter ble utvalgt på ampicillin-medium og undersøkt for tetracyklinresistens. Y, n transformert koloni ble funnet å inneholde plasmid, pMC200, som består av pBR322 med en innsats på Hindlll-punktet. Dette plasmid inneholder arg3-reguleringsområdet som kan bevirke transkripsjon av en HBsAg-nukleotidsekvens i gjærceller som beskrevet i følgende eksempler. E. coli K12-stamme MM294 (pMC200) ble deponert ifølge EPC-bestemmelsene og Budapest Treaty hos American Type Culture Collection av 2. juni 1982 under tilgjengelighetsnummer ATCC39130.

Nukleotidsekvensen til del av arg3-genet inneholdende en del av de N-terminale kode-sekvenser for ornitinkarbamoy1-transferase (OCT) og del av det 5<1>ikke-oversatte leder-området her bestemt av Huyghen et al., Arch. Intl. Physical. Biochem., bind 89, B172 (1981). Figur 4 illustrerer et 210 bp-fragment med kjent sekvens. 210 bp-fragmentet inneholder bare HincII, Bglll og EcoRI-punkter på 3.300 bp Hindlll-gjær-DNA-innsats i pMC200; begynnelseskodonet for OCT-proteinkodesekvensen antas å være det boksede ATG-kodon. Innføring i HincII, Bglll eller EcoRI-punktene i gjær-

DNA for kodesekvenser for HBsAg alene eller HBsAg-forstadium pluss HBsAg avledet fra klonet HBV DNA forventes å resultere i en genefusjon og fremstilling av et hybridprotein trans-kribert og translatert fra arg3-reguleringsområdet forutsatt at genefusjonen har korrekt orientering for fortsatt translasjon forbi fusjonspunktet. Eksempel 5 Fremstilling av mellomproduktplasmider, pRIT10671 og pRIT-106 72, inneholdende HBsAg og reguleringsområder ved kombinasjon av pRITl0641 med pMC200.

pMC200, 5 ug ble brutt med 6,4 enheter Bglll i 2,5 timer ved 37°C, fortynnet med samme volum av en puffer (pH 10,5) inneholdende 0,1 M glycin, 0,01 M MgCl26H20 og 0,1 mM ZnCl2, og inkubert med 0,5 enheter kalveinnvollsalkalisk fosfatase i 30 minutter ved 37°C for å fjerne 5' terminale fosfatrester.Blandingen ble ekstrahert to ganger med puffer-mettet fenol og tre ganger med eter. DNA-et ble utfelt med etanol og oppløst i 0,01 M trometaminpuffer (pH 7,5).

pRIT10640, 25 pg, ble brutt med BamHI for å skjære ut 1.350 bp BamHI-fragmentet av HBV DNA. 1.350 bp-fragmentet ble renset ved preparativ agarosegelelektroforese og elektroeluering. Det eluerte DNA ble fjernet og konsentrert ved etanolutfelling og oppløst i 20 pl 0,01 M trometaminpuffer (pH 7,0). En 0,3 pg alikvot av BamHI-fragmentet, som inneholder HBsAg-kodesekvensen ble blandet med 0,5 pg Bglll-brutt pMC200 og blandingen ble ligert ved inkubering med T4 DNA-ligase.

Det ligerte DNA ble brukt til å transformere kompetente celler av E. coli K12-stamme MM294 . Trans formanter ble utvalgt på agarplater inneholdende 200 pg/ml ampicillin. Tolv resistente kolonier ble isolert ved passasje i serie på ampicillinagar og plasmider ble isolert ved den fremgangsmåte som er beskrevet av Birnboim et al., Nucl. Acid. Res., bind 7, 1513 (1979). Analyse ved agarosegelelektroforese viste at alle plasmidene ble kappet av Hpal, en indikasjon på innsettning av BamHI-fragmentet og at begge orienteringer av det fragment forelå blant tolv transformerte kolonier. Plasmidene ble isolert ved CsCl-etidiumbromid-densitets-gradientsentrifugering. Et plasmid pRITl0671 inneholdt BamHI-fragmentet sammensmeltet på Bglll-punktet i korrekt orientering for transkripsjon av HBsAg -kodesekvensen som gir et 386 aminosyrefusjonsprotein bestående av 18 N- ! terminale aminosyrer av OCT, 42 aminosyrer av det antatte<1>HBsAg-forstadiumsprotein og de 226 aminosyrene av HBsAg. Fusjonsproteinet er HBsAg som vist i eksempel 8 nedenunder. Transformanter inneholdende pRIT106 71 kalles E. coli Kl2-stamme MM294(pRITl0671). pRIT10671 er illustrert i figur 5.

Bruk av pRIT106 40 som et mellomproduktplasmid er ikke vesentlig. F.eks. kunne BamHI-fragmentet være skåret ut fra pRIT10616.

Et annet plasmid, pRIT10672, inneholdt BamHI-fragmentet i feilaktig orientering for transkripsjon av HBsAg-kode-sekvensen. Trans formanter inneholdende dette plasmid kalles E. coli K12-stamme MM294(pRIT10672).

Eksempel 6

Fremstilling av plasmider, pRIT10673 og pRIT10674 pendel-vekto rer, ved å kombinere pRIT10671 og pRIT10672 med pendelvektor YEpl3.

Vektor YEpl3 er en E. coli- S. cerevisiae pendelvektor. Den er beskrevet av Broach et al, Gene, bind 8, 121 (1979).

Den ble levert av J. Hicks, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, U.S.A. Et lite HindIII-fragment ble skåret ut fra plasmidet ved brytning med Hindlll og plasmidet ble re-ligert for å fremstille et avledet plasmid, YEpl3 Hindlll som inneholder ett enkelt Hindlll-punkt. Renset YEpl3 Hindlll ble brutt med Hindlll og behandlet med alkalisk fosfatase for å inhibere religering. DNA ble gjenvunnet ved fenolekstråksjon og etanolutfelling.

Renset pRIT10671 og pRITl0672 ble brutt med BamHI og behandlet med alkalisk fosfatase for å inhibere ny dannelse av pBR322-resten. Det behandlede DNA ble videre brutt med Hindlll for å frigjøre et 4.650 bp HindIII-fragment, som inneholder reguleringsområde-HBsAg-genfusjonen, og prøver ble ekstrahert med fenol og utfelt med etanol. DNA-prepa-'ratene som stammet fra pRIT106 71 og pRIT106 72 , 0 ,4 ug av hver, ble separat blandet med 0,4 ug Hindlll-brutt YEpl3 Hindlll og blandingene ble inkubert med T4 DNA-ligase.

En del av hver av de ligerte blandinger ble brukt for å transformere kompetente celler av E. coli K12-stamme MM2 94. Transformanter ble utvalgt på amficillinagar. Transfor-mantkolonier ble isolert og undersøkt med hensyn til plas-midinnhold ved fremgangsmåten beskrevet av Birnboim et al., Nucl. Acid. Res., bind 7, 1513 (1979). En trans formant-koloni, E. coli K12-stamme MM294(pRITi10673), inneholdt et plasmid, pRIT10673, som inneholder HindIII-fragmentet fra pRIT106 71 innsatt på YEpl3 Hindlll, i korrekt orientering som illustrert i figur 6. En annen transformantkoloni, E. coli K12-stamme MM294 (pRIT10674), inneholdt et plasmid pRIT10674 som inneholder HindIII-fragmentet fra pRIT10672 innsatt på YEpl3 Hindlll i feilaktig orientering.

Eksempel 7

Transformering av gjær med pRIT10673 og pRIT10674.

Plasmider pRIT10673 og pRIT10674 ble isolert fra klarede lysater av E. coli K12-stamme MM294(pRIT10673) og MM294 (pRITl06 74) med CsCl-etidiumbromid-densitetsgradient-sentrifugering.

A. S. cerevisiae-stammen DC5.

S. cerevisiaestammen DC5 ( leu 2-3, leu 2-112, his 3, can 1-11) beskrevet av Broach et al., Gene, bind 8, 121 (1979) erholdtes fra J. Hicks, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, U.S.A. og ble deponert ifølge EPC-bestemmelsene og Budapest Treat hos American Type Culture Collection i Rockville, Maryland, U.S.A. 2. juni 1982 under tilgjengelighetsnummer ATCC 206 30. Celler av stammen DC5 ble dyrket og klargjort for transformasjon ved metodene beskrevet av Hinnen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A., bind 75,

1929 (1978) bortsett fra at protoplastering ble foretatt i 0,8 M sorbitol, 0,03 M (3-merkaptoe tanol, og 0,1 M kalium-fosfatpuffer (pH 7,5) ved bruk av en blanding av (3-gluco-

uronidase (0,24 enheter/ml sluttkonsentrasjon) og aryl-sulfatase (1,2 enheter/ml sluttkonsentrasjon). Gjærproto-plaster ble inkubert separat med 10 ug pRITl0673 og 10 ug pRIT106 74 og transformanter ble utvalgt i regenererings-

agar som manglet leucin. Kolonier som grodde i regenerer-ingsagaren ble isolert og streket på fast medium inneholdende 0,6 75 % gjærnitrogenbasemedium manglende aminosyrer, 2 % glucose, 2 % agar og 80 ug/ml histidin og ble dyrket ved 30°C. En koloni av stammen DC5 hadde blitt transformert med pRIT106 73 og kalles S. cerevisiae stamme DC5 (pRIT10673). En annen koloni var blitt transformert med pRITl0674 og kalles S. cerevisiae stamme DC5(pRITl0674).

Kulturer av stammene DC5(pRITl0673) og DC5(pRIT10674) ble dyrket i gjærnitrogenbasemdium pluss 80 ug/ml histidin opptil optiske densiteter på 0,33 til 1,0 ved 620 pm. Sistnevnte stamme kan brukes som en negativ kontroll fordi den inneholder HBsAg-kodesekvensen sammensmeltet i feilaktig orientering til reguleringsområdet. Celler ble isolert ved sentrifugering, vasket med fosfatpufferet saltvann (PBS) og suspendert igjen i 5 ml PBS pluss ImM fenylmetyl-sulfonylfluorid (PMSF) ved 20 til 160 gangers konsentrasjoner. Celler ble brutt ved to passasjer gjennom en French trykk-celle ved 83 MPa og lysatet sentrifugert ved 7.700 x G i 15 minutter og deretter i 30 minutter ved 30.000 x G. Supernatantene ble isolert og filtrert over en Millex GV membran.

Supernatanter ble undersøkt for nærvær av protein som reagerte med spesifike anti-HBsAg-antistoffer ved "Ausria" radioimmunologiske bestemmelsesmetoder. Klarede celle-ekstrakter fra S. cerevisiae stamme DC5(pRITl0673) fremstilt på denne måten ga positive reaksjoner i denne radio-logiske immunologiske bestemmelsen selv ved 16 til 256 gangers fortynninger i PBS. Derimot var ekstrakter av stammen DC5(pRIT10674) negative i denne målingen for nærvær av proteiner som reagerer med anti-HBsAg-antistoffer.

l

B. S. cerevisiae-stamme lcl6 9 7d

S. cerevisiaestamme lcl697d ble deponert ifølge EPC-bestemmelsene og Budapest Treaty hos American Type Culture Collection 2. juni 1982 under tilgjengelighetsnummer ATCC 2 06 3-1. Ved å bruke de ovenfor beskrevne metoder ble arginin bradytrof-stamme lcl69 7d ( argJ -, leu 2-1) transformert med pRITl0673 og pRIT10674. En leucin-uavhengig koloni av den bradytrofe stamme var blitt transformert med pRIT10673 og kalles S. cervisiaestamme lcl697d(pRIT-10673). En annen leucin-uavhengig koloni som var blitt transformert med pRIT106 74 kalles S. cerevisiaestamme lcl697d(pRITl0674).

Kulturer av stammene lcl697d(pRIT10673) og lcl697d(pRIT-106 74) ble dyrket i gjærnitrogenbasemedium tilsatt 20 ug/ml arginin. Cellene ble isolert og celle-ekstraktet fremstilt som beskrevet ovenfor. Klarede celle-ekstrakter av stamme lcl697d(pRIT10673) ga positive resultater i "Ausria" radioimmunologisk måling ved fortynninger opptil 1/2048, mens ekstrakter av stammen lcl697d(pRIT10674) var gjennomgående negative i denne måling.

Fra disse resultater kan man slutte at gjærceller av stammene DC5 og lcl697d transformert med pRIT10673 spesifikt syntetiserer HBsAg i form av et fusjonsprotein med HBsAg-determi-nanter.

Eksempel 8

Immunisering av kaniner med HBsAg fra S. cerevisiaestamme lc! 697d( pRITl0673).

S. cerevisiaestamme lcl697d(pRITl0673) ble dyrket opptil en optisk densitet ved 620 um på 0,60 og isolert ved sentrifugering. Cellene ble suspendert igjen ved en 40 gangers konsentrasjon i PBS pluss 1 mil PMSF. Et klaret celle-ekstrakt ble fremstilt som beskrevet i eksempel 7. Et klaret celle-ekstrakt av stamme lcl697d(pRITl0674) ble fremstilt på lignende måte. Disse ekstrakter ble brukt 'for å immunisere kaniner. En første gruppe på seks kaniner fikk parenteral injeksjoner med 1 ml ekstrakt fra stamme lcl697d (pRITl0673) blandet med 1 ml Freund's "complete adjuvant"

på dagene 0, 9, 15, 30 og 37. En andre gruppe på tre kaniner fikk parenteral injeksjoner av 1 ml ekstrakt fra stamme lcl697d(pRIT10674) blandet med 1 ml Freund's "complete adjuvant" på de samme dager. Sera erholdtes fra begge grupper på dagene 0 (pre-immun), 23, 51 og 65, og fra den første gruppe på dag 44, og undersøkt for nærvær av anti-HBsAg-antistoffer ved bruk av "Ausab" radioimmunologisk måling. Resultatene av disse målinger som er gitt i tabell 1 viser at 4 av 6 kaniner som får injeksjoner av ekstrakt fra stamme lcl697d(PRIT10673) produserte antistoffer rettet mot HBsAg. Ingen av de tre kontrollkaniner som fikk injeksjoner av ekstrakt fra stamme lcl697d(pRIT10674) viste tegn på produksjon av anti-HBsAg-antistoffer. Fra disse resultater kan man slutte at ekstrakter av stamme lcl697d(pRITl0673) inneholder HBsAg, hvilket kan brukes i en vaksine for å stimulere beskyttelse mot HBV-infeksjon hos mennesker uten alvorlige bivirkninger.

Eksempel 9 Fremstilling av plasmid, pRIT10749 inneholdende arg3 reguleringsområde fra pMC200.

Renset pMC2 00 ble brutt med HincII og elektroforesebe-handlet på en 10 % akrylamidgel. Et 1.940 bp-fragment inneholdende arg3-reguleringsområde ble isolert fra gelen ved elektroeluering og etanolutfelling. Ca. 4 ug av fragmentet ble inkubert med 0,2 enheter Bal31 eksonuklease i 1 til 3 sekunder ved 30°C i 100 ul puffer (pH 8,0) inneholdende 12,5 mM MgCl2, 12,5 mM CaCl2, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA og 200 mM trometamin-HCl. Det behandlede DNA ble ekstrahert med fenol og utfelt med etanol. En 1 ug alikvot ble inkubert med T4 DNA-polymerase i nærvær av deoksynukleotidtrifosfater for å reparere alle enkelt-båndsekstremiteter og ble så brutt med EcoRI-endonuklease. Denne fremgangsmåte ga DNA-fragmenter med varierende lengde som skyldtes reseksjon-ering med Bal31. Hvert fragment hadde en fast EcoRI-utstrekning på en ende idet den andre ekstremitet var avkuttet og befant seg med en viss avstand fra det opprinnelige HincII-punkt og OCT-proteininjiseringskodonet. Fragmenter på ca. 1.480 bp inneholdende arg3-reguleringsområde ble isolert ved elektroforese på en 7,5 % akrylamidgel fulgt av elektroeluering og etanolutfelling. Denne tilbakeskårende reguleringsregionen foretrekkes fordi den kan gi transkripsjon som fører til syntese av et protein uten OCT-aminosyresekvenser som beskrevet i eksempel 10 nedenunder.

I en andre reaksjonsserie ble pMC200 brutt med Xbal og

5' enkelt-båndekstremitetene ble oppfylt eller latt være avkuttet, ved inkubering med T4 DNA-polymerase og deoksy-nukleotidtrif osf ater . Dette DNA ble brutt med EcoRI og et stort EcoRi-T4/Xbal-fragment på ca. 5.700 bp inneholdende gjær-DNA-sekvenser som befant seg 3' til Xbal-punktet, pluss pBR322-sekvenser, ble renset ved elektroforese, elektroeluering og etanolutfelling. Dette fragment ble blandet med og ligert til 1.480 bp-promotorholdige fragmenter. I

Ligeringsblandingen ble brukt til å transformere kompetente celler av E. coli K12-stamme MM294 . Trans formanter ble utvalgt på ampicillinagar. Plasmid DNA ble isolert fra trans-formantkolonier ved den metode som er beskrevet av Birnboim et al., Nucl. Acid. Res., bind 7, 1513, (1979) og man under-søkte om et Xbal-punkt forelå ved brytning med Xbal. Et

Xbal-punkt forelå bare i slike plasmider hvor det innfylte Xbal-punkt på et fragment fra de andre serier av reaksjoner var ligert til et annet fragment fra de første serier som sluttet i en 3' T-rest for å restaurere en Xbal-gjenkjennelsessekvens, TCTAGA, i en ny stilling. Et plasmid med et Xbal-punkt ble identifisert som pRIT10749. Et flytediagram som illustrerer disse manipulasjoner finnes på figur 6. E. coli Kl2-stamme MM2 9 4 (pRIT10749) ble deponert ifølge EPC-bestemmelsene og Budapest Treaty hos American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A. av 2. juni 1982 under tilgjengelighetsnummer ATCC 39133.

En prøve av pRIT10749 ble brutt med en kombinasjon av BstEII og Xbal. Størrelsen av det deleterte arg 3 regluerings-område ble anslått til å være ca. 210 bp i sammenligning med pMC200 som ble brutt på lignende måte med BstEII og Xbal og ved referanse til de kjente molekylvekter av fragmenter av fag(£) xl74 DNA beskrevet av Fuchs et al. Gene, bind 4, 1,

(1978).

For å bestemme DNA-sekvensen av BstEII-Xbal-fragmentet av pRIT10749 ble plasmid DNA brukt med BstEII, markert med

3 2

Y- P-ATP ved utskiftning og brutt med Bam HI endonuklease for frigjøring av et 2000 bp-fragment som ble renset ved elektroeluering og etanolutfelling. DNA-sekvenstering av det markerte fragment ble utført ifølge den kjemiske modifika-sjonsmetode beskrevet av Maxam et al., Methods in Enzymology, bind 65, 499 (1980). En del av denne sekvens ble funnet å væ-re CCCATCAACTTGTACACTCGT CTAGA. De understrekete nukleotider stammet fra 5700 pb EcoRI-T4/Xbal-fragmentet. Sammenligning med det riktige område av DNA-sekvensen vist i fig. 4 indikerer at det restaurerte Xbal-punkt befinner seg i det 5'-ikke-translaterte førerområde ni nukleotider oppstrøms for det opprinnelige HincII-punkt i pMC200 Gjær-DNA-innsatsen.

EKSEMPEL 10.

Fremstilling av plasmider, pRIT10759 og pRIT10761, inneholdende BHsAg og reguleringsområder, ved å kombinere pRIT10749 med pRIT10601

pRIT10601 ble brutt med Hhal endonuklease og elictroforesebehand-let på en 7,5 % akrylamidgel. Et 1100 bp-fragment ble isolert ved elektroeluering og etanolutfelling. DNA-sekvensen til en del av dette fragment inneholder sekvenser tilsvarende den kjente N-terminal-aminosyresekvens av BHsAg av ayw-serotypen som beskrevet av Peterson et al., Viral Hepatitis, G. N. Vyas, S.N. Cohen and R. Schmid, Eds., Franklin Institute Press, Philadelphia, U.S.A., 1978, s. 569. Fragmentet inneholder 6 nukleotider som befinner seg 5' til BHsAg-påbegyn-nelseskodonet, den fullstendig HBsAg kode-sekvens og ca. 390 3' ikke-translaterte nukleotider....Ii

DNA av plasmid pRITI10749 ble brutt med Xbal og ca. 400 ng 1 av dette DNA ble blandet med ca. 280 ng av det rensete Hhal-fragment. Blandingen ble inkubert med 0,5 enheter T4 DNA-polymerase i 30 minutter ved 37°C i 20 ul puffer (pH 7,5) inneholdende 20 mM trometamin-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol og 3 3 mM av hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP. Denne reaksjonsblandingen ble tilsatt 2,5 jul av 1 mM ATP, 2,5 yul av 10 mM EDTA og 2 pl (2 enheter) av T4 DNA-ligase, og blandingen ble inkubert i 16 timer ved 15°C.

Den ligerte blanding ble brukt for å transformere kompetente celler av E_. coli K12 stamme MM294 idet seleksjon ble foretatt etter ampicillin-resistente transformanter. Plas-midpreparater ble laget fra flere av disse transformanter og analysert ved restriksjonsendonuklease-brytning og gelelek-troforese. Resultatene viste at HBV-fragment med avkappet ende var innsatt i begge mulige orienteringer i det Xbal-brut-te pRIT10749. Ett slikt plasmid, pRIT10761 inneholdt 1100 bp-innsatsen i riktig orientering for transkripsjon av HBsAg-sekvensen fra arg<3->promotoren og ga et 271 bp-fragment etter sekvens-brytning med BstEII og Xbal. Dette er illustrert i fig. 7. Et annet plasmid, pRIT10759 inneholdt innsatsen i feilaktig orientering og ga opphav til et anslagsvis 1175 bp-fragment etter brytning med en kombinasjon av BstEII og Ybal endonukleaser. Nukleotid-sekvensen ved arg 3 regulerxngsom-råde-HBsAg-innsatsforbindelsen ble undersøkt for pRIT10761 ved sekventering av 271 bp BstEII-Xbal-fragment under bruk av de kjemiske modifikasjonsmetoder til Maxam et al., Me-thod s in Enzymology, bind 65, 499 (1980), etter utskiftnings-markering av Xbal enden med y~ 32P-ATP. Den målte sekvens for arg 3-reguleringsområdet - HBsAg-forbindelsen er TACACTCGTCTACTGAAC ATG. Man kan se at Xbal-restriksjonspunktet ikke var fullstendig reparert ved T4-DNA-polymerasen og at en guanm-rest var tapt. Det arg 3-ikke-translaterte le-derområde etterfølges umiddelbart av 6 nukleotider av HBV-opprinnelse, CTGAAC, fulgt av HBsAg-initieringskodonet, ATG, og kodesekvensen for HBsAg-strukturgenet. HBsAg-initieringskodonet er det første initieringskodon man finner nedstrøms for arg 3 -promotoren. Derfor vil translasjon av mRNA-tranIs-_ skribert fra DNA begynne ved det kodon ogHBsAg som syntetiseres vil mangle utvendige aminosyrerester. HBsAg som syntetiseres er ikke et fusjonsprotein; det er i det vesentlige strukturelt identisk med autentisk HBsAg.

EKSEMPEL 11

Fremstilling av plasmid pRIT10764 og pRIT10765 ved kombinasjon av pRIT10761 med YEpl3 Hindlll.

PRIT10761 og pRIT10759 ble separat brutt med Pstl og BamHI

for å ødelegge pBR322-replikonresten og deretter med Hindlll for å frigjøre DNA-fragmentet med innsatt HBV DNA og reguleringsområdet. DNA'ene ble ekstrahert med fenyl, utfelt med etanol og oppløst i puffer (pH 7,5) inneholdende 0,01 M trometamin-HCl og 0,001 ff EDTA. En 0,6^g porsjon av hvert DNA-preparat ble adskilt blandet med 0,3^ug Hindlll-brutt, alkalisk fosfatase-behandlet DNA fra YEpl3 Hindlll fremstilt som beskrevet foran og blandingen ble ligert.

Den ligerte blanding ble brukt for å transformere kompetente celler av E± coli K12 stamme MM294 med seleksjon ble foretatt etter ampicillin-resistente transformanter. Én transformant ble vist å inneholde et plasmid, pRIT10764, bestående av HindIII-fragmentet fra pRIT10761 innsatt på YEpl3HindIII. En videre transformant ble vist å inneholde et plasmid, pRIT10765, bestående av HindIII-fragmentet fra pRIT10759 innsatt på YEp 13HindIII. Et flytediagram som illustrerer fremstillingen av pRIT10761 og pRIT10764 finnes i fig. 7.

EKSEMPEL 12

Transformasjon av gjær med pRTI10764 og pRIT10765

pRIT10764 og pRIT10765 ble isolert fra kulterer av transformanter fremstilt i eksempel 11 ved CsCl-etidiumbromid-densi-tetsgradient-sentrifugering, og 10 ug av hver ble brukt for å transformere celler av gjærstamme lcl697d som beskrevet i

eksempel 7 idet seleksjon ble foretatt for leucin-uavhen-gige transformanter på regenereringsagar. Én leucin-uav-

hengig koloni som stammet fra disse transformanter kalles stamme lcl697d(pRIT10764). En annen transformant kalles S. cerevisiae stamme lcl697d(pRIT10765). Kulturer av disse stammer ble dyrket ved 30°C i gjærnitrogenbasemedium tilsatt 2% glukose og 20 pg/ml arginin til en optisk densitet ved 620 pm på 0,80 til 0,88. Celler ble høstet og celle-frie ekstrakter ble fremstilt og målt for HBsAg ved "Austria" radioimmunologisk bestemmelse som beskrevet i eksempel 7. Ekstrakter av lcl697d(pRIT10764) ga positive resultater

i denne målingen ved fortynninger i PBS på opp til 1/1024, mens ikke-fortynnete ekstrakter fra stamme lcl697d(pRIT10765) var gjennomgående negative i denne målingen. Fra det geneti-ske og radiomimmunologiske materiale slutter man at celler av S^cerevisiae stamme lcl697d(pRIT10764) syntetiserer HBsAg som kan brukes i en vaksine for å stimulere beskyttelse mot HBV-infeksjoner hos mennesker uten alvorlige bivirkninger.

Claims (30)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av et rekombinant DNA-molekyl inneholdende en nukleotidsekvens som kan kode for HBsAg og som kan uttrykkes i gjær, karakterisert ved at man forbinder en nukleotid-sekvens som kan kode for HBsAg med et reguleringsområde stammende fra 3 gjærens arg gen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at HBsAg-sekvensen forbindes i en posisjon i forhold til reguleringsområdet slik at HBsAg syntetiseres ved ekspresjon av HBsAg-sekvensen uten fremmede aminosyrerester.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at reguleringsområdet er dannet fra brytning av pYe ura3 arg3 med en restriksjonsendonuklease.

4.. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at reguleringsområdet er dannet fra brytning av pYE ura3 arg3 med Hindlll-restriksjonsendonuklease under fremstilling av et 3300 bp gjær DNA-fragment inneholdende arg3 genet.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man innsetter HBsAg-sekvensen og reguleringsområdet i en vektor.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man behandler HBV DNA med BamHI-restriksjonsendonuklease for å fremstille HBsAg-sekvensen.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at man innsetter et BamHI-fragment fra HBV i DNA ekstrahert fra Dane-partikler av adw-serotype i Bglill- punktet til et HindIII-fragment av reguleringsområdet før innsetning i en vektor.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at man innsetter et Hhal-fragment utledet fra et forbundet par av BamHI-fragmenter av HBV DNA ekstrahert fra Dane-partikler av ayw-serotype i Xbal-punktet til vektoren som er et 1480 bp-fragment av pMC200 inneholdende reguleringsområdet og med en EcoRI-utstrekning på én ende og en avslutning i en 3' T-rest på den andre ende som er avstumpet, forbundet med et 5700 bp Xbal-EcoRI-fragment av pMC200 etter DNA-polymerase-reperasjon av Xbal-punktet i 5700 bp-fragmentet.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at man forbinder et BamHI-fragment av HBV-DNA ekstrahert fra Dane-partikler av adw-serotype med reguleringsområdet .

10. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at man forbinder et Ilhal-f ragment utledet fra et forbundet par av BamHI-fragmenter av HBV DNA ekstrahert fra Dane-partikler av ayw-serotype med reguleringsområdet.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at HindIII-fragmentet forut innsettes i pBR322.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at man videre frigjør HindIII-fragment inneholdende HBsAg-innsatsen og reguleringsområdet ved behandling med Hindlll og innsetter HindIII-fragmentet i en gjærvektor.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at man behandler de forbundne 1480 bp-5700 ; ! bi p-fragmenter med Hindlll for å skjære ut et HindIII-fraig- ment som bærer HBsAg-sekvensen og reguleringsområdet og innsetter HindIII-fragmentet i en gjærvektor.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at man innsetter BamHI-fragmentet i Bglll-punktet til reguleringsområdet.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at man forbinder Hhal-fragmentet med reguleringsområdet på Xbal-punktet til et 1480 bp-fragment av pMC200 inneholdende reguleringsområdet og med en EcoRI-utstrekning på én ende og avsluttende i en 3 <1> T-rest på den andre ende forbundet til et 5700 bp Xbal-EcoRI-fragment av pMC200 etter polymerasereparasjon av Xbal-punktet i 5700 bp-fragmentet.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at man frigjør HindIII-fragmentet inneholdende HBsAg-sekvensen og reguleringsområdet ved behandling med Hindlll og innsetter HindIII-fragmentet i en gjærvektor.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at gjærvektoren er YEpl3 som forut er modifisert ved utskjæring av et HindIII-fragment.

18. i1' Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at det som gjærvektor anvendes YEpl3 som er forut modifisert ved utskjæring av et HindIII-fragment.

19. Fremgangsmåte ved fremstilling av HBsAg, karakterisert ved at man i gjærceller innsetter et rekombinant DNA-molekyl omfattende en nukleotidsekvens som kan kode for HBsAg og et reguleringsområde utledet fra gjær arg3-genet som kan bevirke transkripsjon av HBsAg-sekvensen i gjær, dyrker gjæren og isolerer HBsAg som pro-duseres .

20. Fremgangsmåte ved fremstilling HBsAg ifølge krav i 19, karakterisert ved at HBsAg-sekvkn-_ sen plasseres slik i forhold til reguleringsområdet at HBsAg syntetiseres ved ekspresjon av HBsAg-sekvensen i det vesentlige uten fremmede aminosyrerester.

21. Fremgangsmåte ved fremstilling av HBsAg ifølge krav 1, karakterisert ved at HBsAg-sekvensen er et BamHI-fragment av HBV DNA ekstrahert fra Dane-partikler av adw-serotype og innsatt i Bglll-punktet av gjærreguleringsområdet.

22. Fremgangsmåte ved fremstilling av HBsAg ifølge krav 1, karakterisert ved at som HBsAg anvendes et Hhal-fragment utledet fra et forbundet par av BamHI-fragmenter av HBV DNA ekstrahert fra Dane-partikler av ayw-serotype og innsatt i Xbal-punktet i et molekyl med 1480 bp-fragmentet forbundet med et 5700bp Xbal-EcoRI-fragment av pMC200 etter polymerasereparasjon av Xbal-punktet i 5700-bp-fragmentet, og hvor reguleringsområdet er et 1480 bp-fragment av pMC200 med en EcoRI-utstrekning på én ende og slutter i en 3 <1> T-rest på den andre ende som er avstumpet.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at det som gjær anvendes S.. cerevisiae stamme DC5 eller lcl697d.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 20, karakterisert ved at det som gjær anvendes J3. cerevisiae stamme DC5 eller lcl697d.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at det som gjær anvendes S. cerevisiae stamme DC5 eller lcl697d.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at argininbiosyntesegangen derepresseres i gjæren.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakter i- sert ved at argininbiosyntesegangen derepresseres i gjæren.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert ved at det som gjær anvendes S_. cerevisiae stamme lcl697d.

29. Fremgangsmåte ved fremstilling av en vektor omfattende gjær arg_3 reguleringsområdet og et restriksjonspunkt nær dette slik at et protein syntetisert ved ekspresjon av en kodesekvens innsatt i restriksjonspunktet mangler fremmede aminosyrerester, karakterisert ved at man setter sammen reguleringsområdet, som er et 148o bp-fragment av pMC200 med en EcoRI-utstrekning på én ende og slutter i en 3' T-rest på den andre ende som er avstumpet, med et 5700 bp Xbal-EcoRI-fragment av pMC200 etter polymerasereparasjon av Xbal-punktet til 5700 bp-fragmentet.

30. Fremgangsmåte ved fremstilling av en hepatitis B virus-vaksine, karakterisert ved at HBsAg fremstilles ved en fremgangsmåte ifølge kravene 19 - 29.