JPH08317796A - 肝炎b型ウイルスワクチン - Google Patents

肝炎b型ウイルスワクチン

Info

Publication number
JPH08317796A
JPH08317796A JP7247478A JP24747895A JPH08317796A JP H08317796 A JPH08317796 A JP H08317796A JP 7247478 A JP7247478 A JP 7247478A JP 24747895 A JP24747895 A JP 24747895A JP H08317796 A JPH08317796 A JP H08317796A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
hbsag
dna
polypeptide
region
strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP7247478A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2702899B2 (ja
Inventor
Theresa Cabezon
キャベゾン・テレサ
Marjolene Crabeel
クラベール・マリオレン
Wilde Michel De
ドゥ・ビルド・ミシェル
Nigel Harford
ハーフォード・ニジェル
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Original Assignee
GlaxoSmithKline Biologicals SA
SmithKline Beecham Biologicals SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GlaxoSmithKline Biologicals SA, SmithKline Beecham Biologicals SA filed Critical GlaxoSmithKline Biologicals SA
Publication of JPH08317796A publication Critical patent/JPH08317796A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2702899B2 publication Critical patent/JP2702899B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00Preparation of peptides or proteins
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011Details
    • C12N2730/10011Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ある種のプラスミドで形質転換された酵母を
培養することによる、HBVワクチンの製法の提供。 【解決手段】 HBsAgをコードするヌクレオチド配列
および酵母において転写を行うことのできる調節域から
なり、該配列がHBsAgの免疫原性を保持し、HBsAg
の226個のアミノ酸からなるポリペプチドと、そのN
−末端におけるポリペプチド延長部とからなるポリペプ
チドをコードし、該延長部は、一部がHBsAgのプレ-
S領域より由来し、一部がHBsAgのプレ-S領域より
由来しないポリペプチドであって、該プレ-S領域より
由来の部分がHBsAgの226個のアミノ酸に天然に先
行する該N−末端アミノ酸を含めて42個までのアミノ
酸により形成されている組換型DNA分子を含むプラス
ミドで形質転換された酵母を培養し、産生されたポリペ
プチドを収集することを特徴とするポリペプチドの製
法。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は組換型DNA技法を
用いることによる酵母におけるB型肝炎表面抗原をコー
ドする遺伝子のクローニングおよび該酵母が産生する抗
原からの肝炎B型ウイルスワクチンの製造に関する。
【0002】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】肝炎
B型ウイルス(HBV)による感染症は重く、広範囲にわ
たる健康上の問題である。感染症は急性または慢性の様
相で発現する。米国における急性肝炎の症例数は少なく
とも1年につき10万件であり、致死率が1〜2%と見
積られている。米国においては、健常成人中の慢性保菌
者の蔓延率は年令、社会的階級により、0.1〜1%の
間で変化している。南アメリカでは、慢性保菌者の蔓延
率は約1〜3%、ソ連および南ヨーロッパでは、約3〜
6%、アジアおよびアフリカでは10%以上である。発
達した国々では、血液を取扱う医療部署の患者および要
員、軍要員、慢性保菌者の配偶者、高HBV風土地域へ
の旅行者、慢性保菌者の新生児、ホモセックスの人、売
春婦および麻薬常用者のようなウイルス接触の高い危険
性のある人々のためのワクチンの要求が存在する。第三
世界の国々においては大衆免疫付与のための安価なワク
チンの要求が存在する。大衆免疫付与計画は急性肝炎の
発生や慢性保菌者が留ることに究極的に影響するばかり
でなく、慢性活性肝炎および肝細胞癌の罹病率および死
亡率も減少させることができる。
【0003】肝炎B型のビリオンであると考えられ、感
染患者から単離できるデーン(Dane)粒子は約42nmの
径を有する。各々、肝炎B型表面抗原(HBsAg)からな
る外皮、キャプシド(HBcAg)、内生ポリメラーゼおよ
びDNAゲノムから構成されている。該ゲノムは環状
で、約200の塩基からなる1本鎖域を有する2本鎖で
ある。該1本鎖域はinvitroで該内生ポリメラーゼの作
用によって詰込み(fill in)を行なうことができる。よ
り長い鎖は約3200の塩基を含有する。組織培養中で
HBVを増殖させるのが困難であることが示されてお
り、また、唯一公知の宿主がヒトであるため、従来、H
BVワクチンを製造することは困難であった。感染した
ヒトから少量のHBV抗原標品が単離されている。エフ
・デイ・シイ・レポーツ(F−D−C Reports.pp.3〜
4,July19,1982)には最近開発されたB型肝炎ワ
クチンの臨床研究の報文が掲載されている。
【0004】バレンツエラら〔Valenzuela et al.,Na
ture,Vol.298,347〜350(1982)〕は表現
ベクターを用いた酵母におけるHBsAgの合成を報告し
ており、それでは該HBsAgコード付け配列が835bp
のTaql−Hpalフラグメントで、プロモーターが該酵母
アルコール・デヒドロゲナーゼI.プロモーターであ
る。この文献より以前にいくつかの簡単な研究報文があ
る。これらは、酵母アルコール・デヒドロゲナーゼ・プ
ロモーター域に結紮されているHBsAgに類似した蛋白
をコードする配列を含むDNAフラグメントの酵母にお
ける表現を報告しているバレンツエラらの報文〔Valen
zuela et al.,Arch.Biol.Med.Exp.(Chile),V
ol.14(1),21〜22(1981)〕、ピイ・バレンツ
エラおよびダブリュウ・ジェイ・ルッター(P.Valenzu
ela and W.J.Rutter)を含む米国の研究チームが酵
母における「蛋白−被膜周囲肝炎B型ウイルス」の産生を
発表したと報じているスクリップ中の報告〔Scrip N
o.616,p.14(Aug.12,1981)〕およびダブリ
ュウ・ジェイ・ルッター(W.J.Rutter)が酵母細胞
におけるグリコシル化HBsAgの表現を報告したと報じ
ているツカーマンの報文〔Zuckerman, Nature,Vol.
295、98〜99(1982)〕である。
【0005】HBsAgのようなHBVの抗原性成分は該
抗原をコードする遺伝子を含む組換型DNA分子を挿入
した細菌中で製造されてきた。バーレルら〔Burrell e
t al.,Nature,Vol.279,No.5708,43〜47
(1979)〕はプラスミドpBR322中でクローンし
たHBV DNA配列のイー・コリ(E.coli)HB10
1株における表現を報告している。ヨーロッパ特許出願
第13828号において、マレーら(Murray et al.)
は、イー・コリHB101株において、HBsAgを含め
て、HBV抗原をコードできる組換型ベクターの製造を
開示している。このベクターはデーン粒子DNAおよび
プラスミドpBR322から製造される。マレーらは、
有用な宿主には他の細菌宿主、酵母および他の真菌、動
物または植物細胞およびその他の宿主が包含されうると
述べているが、示されている唯一の宿主はイー・コリで
ある。チャーネイら〔Charney et al.,Nature,Vol.
286,893〜895(1980)〕はβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子と該HBsAg構造遺伝子の融合物を有する
バクテリオファージの構造を報告している。該バクテリ
オファージはHBsAgおよびβ−ガラクトシダーゼ両方
の抗原性決定子からなる融合蛋白の合成を命令する。
【0006】英国特許出願第2034323号におい
て、チオライスら(Tiollais et al)はHBV DNA
を含有するコリファージの製造を開示している。融合フ
ァージ−HBV DNAがイー・コリC600株中に形
質転換されている。最初にPCT出願WO81/005
77号として公開された英国特許出願第2070621
号には、HBsAg遺伝子の一部、プロモーターおよびラ
クトース・オペロンのZ遺伝子からなり、イー・コリ中
でクローンできるプラスミドが開示されている。ヨーロ
ッパ特許出願第20251号においてルッターら(Rutt
er et al)はプラスミドpBR322およびHBV DN
AのBamHIフラグメントからなり、イー・コリの形質
転換に使用できる組換型ベクターを包含する組換型ベク
ターを開示している。HBV DNAのBamHIフラグ
メントおよびトリプトファン・オペロンの一部からなる
他のベクターがイー・コリHB101株における表現を
得るために使用された。エドマンら〔Edman et al.,
Nature,Vol.291,No.5815,503〜506(1
981)〕はトリプトファン・オペロン調節域の調節の
下、イー・コリにおいてHBcAgおよびβ−ラクタマー
ゼ−HBsAg融合蛋白の合成を命令するプラスミドの構
造を記載している。
【0007】HBV DNAの細菌中への挿入を開示し
た他の文献にはチャーネーらの文献〔Charnay et al.,
Prog.Med.Virol.,Vol.27,88〜92(198
1)〕、マツケイらの文献〔Mackay et al.,Proc.N
atl.Acad.Sci.U.S.,Vol.78,No.7,4510
〜4514(1981)〕、フリッチエら〔Fritsch eta
l.,C.R.Acad.Sci.,Vol.287,No.16,14
53(1978)〕、英国特許明細書第2034323号
(Derwent No.46874C)およびパセクらの文献
〔Paseket al.,Nature,Vol.282,No.6,575
(1979)〕が包含される。HBV DNAは哺乳動物
細胞中でもクローンされている。これらには、ヒト、マ
ウスおよびヒト肝癌細胞系が包含される。例えばデュボ
イスら〔Dubois etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.,Vol.77,No.8,4549〜4553(198
0)〕はマウス細胞のHBVゲノム含有プラスミドによ
る形質転換およびHBsAgの表現を報告している。ヒル
シュマンら〔Hirschman et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.U.S.,Vol.77,No.9,5507〜551
1(1980)〕はHBV DNAで形質転換させたHe
La細胞によるHBV様粒子の産生を報告している。
【0008】ヒト血液からのHBsAgを用いるHBVワ
クチンの製造法がフナコシら〔Funakashi et al., Pr
og.Med.Virol.,Vol.27,163〜167(198
1)〕およびマウパスら〔Maupas et al.,Prog.Me
d.Virol.,Vol.27,185〜201(1981)〕に
より報告されている。フナコシらによって製造されたワ
クチンは40μgの精製したホルマリン処理HBsAg、
リン酸塩、塩化ナトリウム、20mgのマンニトールお
よびアジュバントとして0.1%の水酸化アルミニウム
を含有する。後者の報文において、マウパスらはワクチ
ンの1投与量が2〜10μg/mlの蛋白〔ローリー(Lo
wry)法〕および0.1%の水酸化アルミニウムを含有す
る精製したホルマリン処理HBsAg1mlであると報告
している。マウパスらによって報告された研究で用いた
方法では1ケ月間隔で3回注射し、1年後に1回ブース
ターを要求しており、マウパスらは3ケ月間隔で2回濃
HBsAgの注射を提案している。HBVワクチン製造に
ついての他の文献にはヘパチテイスBワクチンINSE
RMシンポジウム(Hepatitis B Vaccine INSER
M Symposium No.18,edit.by Maupas and Gu
esry,1981,Elsevier/North−HollandBiomedic
al Press)の、各々、3、37および57頁のマウパ
スら、アダモビツツら(Adamowiczet al)およびフナコシ
らのものが包含される。酵母は他のある種のDNA配列
の宿主生物として使用されている。例えば、英国特許出
願第2068969号において、フレーザーら(Fraser
et al)は酵母におけるニワトリ・オバルブミンの製造
を開示している。スクリップ640号〔ScripNo.64
0,P11(Nov.4,1981)〕はあるタイプのインタ
ーフエロンが酵母中で製造される旨の報告を包含してい
る。ヨーロッパ特許第11562号(Derwent No.38
762C)では、2μプラスミド中にura3+酵母遺伝子
を含有するハイブリッド酵母プラスミドが報告されてい
る。
【0009】
【課題を解決するための手段】本発明は、HBsAgをコ
ードできるヌクレオチド配列および酵母、サッカロミセ
ス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)におい
て該HBsAg配列の転写を行なうことのできる酵母arg
3遺伝子から誘導された調節域からなる組換型DNA分
子の製法に関する。該分子は該HBsAg配列および該調
節域が挿入されたベクターを含有し、該ベクターは酵母
ベクターの製造または該HBsAgおよび調節域の保存に
使用できる。本明細書においては、該プラスミドで形質
転換された微生物のような該組換型DNA分子を含有す
る微生物も記載する。本発明はまた、HBsAg配列のよ
うなコード付け配列挿入のためのarg3調節域およびそ
れに隣接する制限部位を有し、該コード付け配列の表現
によって合成された蛋白が異質アミノ酸残基を欠くよう
になるプラスミドも包含する。また、本発明には、本発
明によって製造されたHBsAgのワクチン有効量および
適当な担体からなるヒトにおけるHBV感染に対する保
護惹起用のワクチンも包含される。さらに、本発明は、
該組換型DNA分子および該分子を含有する微生物の製
法ならびにHBsAgおよびHBsAg含有ワクチンの製法
も包含する。
【0010】
【発明の実施の態様】添付図面中、図1はpRIT10
601の制限エンドヌクレアーゼ開裂地図である。図2
はpRIT10606の制限エンドヌクレアーゼ開裂地
図である。図3はpMC200の制限エンドヌクレアー
ゼ開裂地図である。図4はpMC200における330
0bp HindIII酵母DNA挿入物の一部分のヌクレオチ
ド配列で、この部分にはHincII、BglIIおよびEcoRI
部位が含まれている。図5はpRIT10671およびp
RIT10673の製造を示すフローシートである。図
6はpRIT10749の製造を示すフローシートであ
る。図7はpRIT10761およびpRIT10764
の製造を示すフローシートである。
【0011】本発明の組換型DNA分子は、HBsAg用
の構造遺伝子を含むヌクレオチド配列を、酵母において
該HBsAg配列の転写を命令でき、それにより、その表
現が行なうことのできる酵母arg3調節域と融合させる
ことにより製造される。本明細書において、「組換型D
NA分子」なる語は該HBsAgコード付け配列および該
調節域を含有するDNAフラグメントならびにプラスミ
ドまたはファージ・ベクターのような該フラグメントを
含む他のDNA分子を意味する。「調節域」なる語はプロ
モーター域および転写に必要な他の配列を含む配列を意
味する。該酵母arg3調節域は、それがHBsAgコード
付け配列表現用の強力なプロモーターとなることができ
るので、特に有利である。「HBsAg」なる語は構造的に
HBsAg標品と同じであるか、HBsAg標品と実質的に
同じ抗原性決定子を有する蛋白、すなわち、HBsAg標
品を特異的に認識し、それと反応する抗体の生成を惹起
することができるか、抗HBsAg抗体によって特異的に
認識される蛋白を意味する。
【0012】該HBsAgコード付け配列は、感染したヒ
ト血清中のデーン粒子より抽出したDNAから、DNA
ポリメラーゼ、好ましくは、内生ポリメラーゼで1本鎖
域に詰込み、ついで、制限エンドヌクレアーゼで消化す
ることにより単離できる。エンドヌクレアーゼの選択
は、部分的に、実際に用いるデーン粒子に依存する。例
えば、後記の実施例で示すように、adw抗原型のある種
のデーン粒子のHBVDNAのHBsAgコード付け配列
は単一のBamHIフラグメント上で単離でき、ayw抗原型
のある種のデーン粒子のHBV DNAのHBsAgコー
ド付け配列はHhaIフラグメント上で単離できる。同じ
抗原型のデーン粒子のHBV DNAが制限部位の異な
ったパターンを示すこともある。本発明で用いるDNA
フラグメントを製造するためのDNAの制限、本発明で
用いる組換型DNA分子製造のためのかかるフラグメン
トの結紮および微生物への挿入は前記の、また、後記す
る文献に開示されている技法のような、公知の技法によ
って行なわれる。条件はDNAおよび酵素の変性をさけ
るように選択する。例えば、pHは約7.0〜11.0に
保持するように緩衝され、温度は約60℃以下に保つ。
好ましくは、制限は約30〜40℃で行ない、結紮は約
0〜10℃で行なう。本発明の実施に用いる制限酵素お
よびリガーゼは商業的に入手でき、それに付されている
指示に従って使用すべきである。T4 DNAリガーゼ
が好ましいリガーゼである。
【0013】調節域へのHBsAg配列の融合は後記の実
施例に示すような中間ベクターの使用によって行なうこ
とができる。別法として、HBsAg配列は、調節域を含
むベクター中に直接挿入することができる。ベクターは
本発明のDNAフラグメントを担持し、保持できるDN
Aで、例えば、ファージやプラスミドを包含する。ファ
ージ中でDNAフラグメントをクローンする技法は、例
えば、チャーネーら〔Charnay et al.,Nature,Vol.
286,893〜895(1980)〕および英国特許出
願第2034323号(Tiollais)によって開示されて
いる。好ましくは、HBsAg配列は調節域に対して、H
BsAg配列の表現によって合成されたHBsAgが異質ア
ミノ酸残基を持たないように位置させる。特に有用であ
ることが判明している調節域は、オルニチン・カルバモ
イルトランスフェラーゼ(OCT)をコードする酵母arg
3遺伝子から由来するものである。このarg3調節域の
使用は、その作用が特異的および一般的調節機構の両方
に支配されるので有利である。クラビールら〔Crabeel
etal., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., Vo
l.78,5026(1981)〕によって報告されている
ように、これはプラスミドpYe ura3arg3上で、イー
・コリ中でクローンされている。好ましい宿主は、アル
ギニン生合成経路が抑制解除されたサッカロミセス・セ
レビシアエ株、例えば、1c1697d株である。かかる
菌株の使用は、実施例で用いた他の菌株、DC5株と比
較して、arg3プロモーターからの表現増加をもたらせ
る。
【0014】融合DNAフラグメントを酵母中にクロー
ンするための好ましいベクターはプロモーターYEp1
3で、これはイー・コリおよびサッカロミセス・セレビ
シアエの両方において複製、維持することができ、それ
故、シャトル・ベクターとして知られている。数種の他
の酵母ベクターが知られており、利用できる。HBsAg
および調節域は、順次あるいは、後記の実施例に示すよ
うに同時に酵母中に挿入できる。プラスミド・ベクター
による形質転換は、通常、本発明のDNA分子をプラス
ミドとして取込むこととなる。しかし組換現象のような
他の反応では該DNA分子の染色体DNA中への取込み
とすることもできる。本発明による酵母によって製造さ
れたHBsAgと、適当な担体からなるヒトにおけるHB
V感染に対する保護を惹起するワクチンは公知の技法に
よって製造することができる。水酸化アルミニウムのよ
うなアジュバントを使用することが望ましい。また、得
られたHBsAgを他の免疫原と組合せて複合ワクチンを
製造することもできる。該HBVまたは複合ワクチン
は、例えば、皮下、静脈内または筋肉内経路で投与でき
る。本発明のDNAフラグメントおよびそれによって製
造されたHBsAgはまた、DNAハイブリッド形成技法
および種々のイムノアッセイによる生物試料中のHBV
検出用の探針としても用いることができる。つぎに実施
例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。実施例中、
%は、特に断らない限り重量%を意味する。
【0015】
【実施例】
実施例1 HBV DNAをpBR322と組合わせることによる
中間プラスミドpRIT10601の調製 ayw抗原型のHBsAg陽性血清に、0.28%の最終濃度
になるようにCaCl2を加えて脱繊維化し、SW27ロ
ーター中、10mMトロメタミン−HCl、1MNaClお
よび1mM EDTAを含む緩衝液(pH7.5)中で調製
した10〜20%ショ糖グレジエント上、27000r.
p.mで2時間で遠心分離する。デーン粒子を含む透明な
ペレットを同じ緩衝液中に再懸濁させ、65%ショ糖ク
ッションに重層させた緩衝20%ショ糖上で遠心分離す
る。該クッション界面での乳白光バンドを回収し、同様
な20〜65%グレジエント上、200000×Gで4
時間遠心分離し、デーン粒子をペレット化する。
【0016】A.該デーン粒子を、50mMトロメタミ
ン−HCl、10mM MgCl2、500mM NaCl、0.
5mMジチオトライトール、各50mMのdATP、dCT
PおよびdGTPならびに8μM32P−dTTP(350
Ci/mmole)を含有する反応混合液(pH8.0)に再懸濁
させ、該再懸濁粒子を37℃で5時間イキュベートする
ことにより内生DNAポリメラーゼを用いてデーン粒子
内のHBVゲノムの1本鎖域を修復する。該再懸濁液を
10mMトロメタミン−HCl、10mM EDTA、10
0mM NaClおよび0.02%ドデシル硫酸ナトリウム
を含有する緩衝液(pH7.5)で希釈してpH7.5とし、
37℃にて1時間プロナーゼ0.5mg/mlと共にイン
キュベートし、ついで、フェノール抽出およびエタノー
ル沈澱を行なう。BamHI制限エンドヌクレアーゼによ
る該DNAの消化は、アガロースゲル電気泳動および該
ゲルのオートラジオグラフィーによって判定されるよう
に、約1450bpおよび1600bpのサイズを有する放
射活性フラグメントを産生する。
【0017】B.デーン粒子DNA約30ngを、標識し
ていないdTTPの存在下、内生DNAポリメラーゼを
用いて修復し、前記と同様にして抽出、回収する。該D
NAを、あらかじめBamHI制限エンドヌクレアーゼで
消化し、アルカリ性ホスファターゼで処理した100ng
のプラスミドpBR322と混合する。プラスミドpBR
322は組換型DNA法に通常用いられるもので、入手
の制限なしにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション(American Type Culture Collection)に寄託
番号37017として寄託されている。該混合液をフェ
ノールで抽出し、エタノールで沈澱させ、遠心分離し、
乾燥させて、50mMトロメタミン−HCl、1mMAT
P、10mMMgCl2、10mMジチオトライトール、5
0μg/mlゼラチンおよび2単位/mlT4DNAリガ
ーゼを含有する混合液12μl(pH7.5)に再懸濁させ
る。該懸濁液を10℃で4時間インキュベートし、つい
で氷上で18時間保持する。結紮したDNA混合物は、
コーヘンら〔Cohenet al., Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S., Vol.69,2110,(1972)〕の方法に
従って調製したイー・コリK12株C600のコンピテ
ント細胞を形質転換するのに用いられる。形質転換体を
アンピシリン200μg/mlを含有する固体培地上で選
択する。単離したコロニーについて、pBR322のBa
mHI部位への異種DNAフラグメント挿入を示すテトラ
サイクリン耐性の欠失をスクリーニングする。このよう
な形質転換体クローンの1つがプラスミドpRIT10
601を含有することが判明し、これはBamHIエンド
ヌクレアーゼによる消化によって4.60bpのpBR32
2フラグメントならびに1600bpおよび1450bpの
HBV DNAフラグメントを与えることが判明した。
イー・コリK12株C600(pRIT10601)培養
物は欧州特許条約(EPC)およびブダペスト条約に従
い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
(アメリカ合衆国メリイランド州、ロックビル)に198
2年6月2日付で寄託番号ATCC39132として寄
託されている。プラスミドpRIT10601の制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂地図を図1に示す。
【0018】C.種々の制限酵素によるデーン粒子DN
AおよびpRIT10601の消化によって生じるフラ
グメントのサイズをつぎのとおり比較した。デーン粒子
DNA、すなわち、HBV DNAを前記の内生ポリメ
ラーゼ反応により、または精製DNAをイー・コリ由来
のDNAポリメラーゼIで処理することによって32Pで
標識する。標識されたHBV DNAをpRIT106
01と混合し、該混合物を制限エンドヌクレアーゼで処
理し、アガロースゲル上で電気泳動にかける。該ゲルを
臭化エチジウムで染色し、紫外線光下で写真撮影してD
NAフラグメントの位置づけをし、ついで、乾燥してオ
ートラジオグラフィーにかけ、放射活性HBV DNA
フラグメントの位置づけをする。つぎの標識されたHB
VフラグメントがpRIT10601フラグメントのサ
イズに正確に一致することが判明した:1450および
1600bp BamHIフラグメント;1330bp HpaI
フラグメント;および1130bp BamHI−XhoIフラ
グメント。標識されたデーン粒子DNAはまた、サザー
ン〔Southern.J.Mol.Biol., Vol.98,503
(1975)〕の技法により、アガロースゲルからニトロ
セルロース・フイルター上に移した後、pRIT106
01のBamHI消化によって遊離される1450および
1600bpの両方にフラグメントと特異的にハイブリッ
ド形成する。これらの結果は、pRIT10601上の
クローンされたDNA挿入物がHBVゲノムに相当し、
pRIT10601上での2つのBamHIフラグメントの
相対的な方向が該ビリオンにおけると同じであることを
示している。pRIT10601は後記の実施例10に
おいてpRIT10671を調製するのに使われる。
【0019】実施例2 HBV DNAをpACYC184と組合わせることに
よる中間プラスミド、pRIT10616の調製 デーン粒子を前記と同様にadw抗原型のHBsAg陽性血
清から単離する。32Pで標識されたHBV DNAの制
限エンドヌクレアーゼ分析は該DNAが1つのEcoRI
部位を含んでいることを示した。標識されていないヌク
レオチドと用いる内生ポリメラーゼ反応によって詰込ん
だHBV DNAをEcoRIで消化する。この制限DN
AをあらかじめEcoRIで消化し、アルカリ性ホスファ
ターゼで処理したプラスミドpACYC184と混合す
る。プラスミドpACYC184は、入手の制限なしに
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託
番号37033として寄託されている。該混合物をT4
DNAリガーゼで結紮する。この結紮DNA混合物をイ
ー・コリK12株 C600のコンピテント細胞を形質
転換するのに用いる。形質転換体をテトラサイクリン
(15μg/ml)寒天培地上で選択し、pACYC184
のEcoRIの部位における挿入を示すクロラムフェニコ
ール耐性の欠失についてスクリーニングする。形質転換
コロニーは、該HBV DNAからなる3200bp挿入
物をEcoRI部位に有するpACYC184からなるプ
ラスミドpRIT10616を含有することが判明し
た。pRIT10616の制限地図を図2に示す。イー
・コリK12株C600(pRIT10616)はヨーロ
ッパ特許条約およびブタペスト条約に従いアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションに1982年6月2
日付で寄託番号ATCC39131として寄託されてい
る。
【0020】実施例3 pRIT10616をpBR313と組合わせることによ
る、HBsAgをコードするヌクレオチド配列を含有する
中間プラスミド、pRIT10640の調製 pRIT10616をカーンら〔Kahn et al.,Methods
in Enzymology,Vol.68,268,(1979)〕の記
載に実質的に従いCsCl−臭化エチジウム密度グレジエ
ント遠心分離法により精製する。該DNAをBamHIエ
ンドヌクレアーゼで消化し、プラスミドpBR313の
BamHI消化、アルカリ性ホスファターゼ処理DNAと
混合し、結紮し、実施例1の記載と実質的に同様にして
イー・コリK12株C600のコンピテント細胞を形質
転換するのに用いる。プラスミドpBR313は、入手
の制限なしにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託番号37018として寄託されている。形
質転換体をアンピシリン含有寒天培地上で選択し、pB
R313のBamHI部位における挿入を示すテトラサイ
クリン耐性の欠失についてスクリーニングする。形質転
換コロニーは、BamHI部位に1350bp挿入物を有す
るpBR313からなるプラスミド、pRIT10640
を含むことが判明した。該挿入物は、HBsAgをコード
できるヌクレオチド配列である。該挿入物は推定的HB
sAg前駆体蛋白部分および完全表面抗原をコードし、ま
た、565bpの3'非コード付け配列を含有する。
【0021】実施例4 酵母arg3遺伝子をpBR322と組合わせることによ
る、arg3調節域を含有する中間プラスミド、pMC20
0の調製 arg3遺伝子を特定する3300bp酵母DNAフラグメ
ントを、pYeura3arg3をHindIIIで消化することによ
り得る。プラスミドpYeura3arg3については、クラビ
ールら〔Crabeel et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.,Vol.78,5026,(1981)〕によって
記載されている。該3300bpフラグメントをpBR3
22のHindIII部位中にクローンし、実質的に前記と同
様にしてイー・コリK12株MM294中に形質転換さ
せる。形質転換体をアンピシリン培地上で選択し、テト
ラサイクリン耐性についてスクリーニングする。形質転
換コロニーは、HindIII部位に挿入物を有するpBR3
22からなるプラスミドpMC200を含有することが
判明した。このプラスミドは、以下の実施例に記載する
ように酵母細胞においてHBsAgヌクレオチド配列の転
写を行なうことのできるarg3調節域を含んでいる。イ
ー・コリK12株MM294(pMC200)はヨーロッ
パ特許条約およびブダペスト条約に従いアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションに1982年6月2日
付で寄託番号ATCC39130として寄託されてい
る。
【0022】オルニチンカルバモイルトランスフェラー
ゼ(OCT)のためのN−末端コード付け配列部分および
5'−非翻訳先端域の部分を含め、arg3遺伝子の一部の
ヌクレオチド配列は、ヒュイゲンら( Huyghen et a
l., Arch.Intl.Physical.Biochem.,Vol.89,
B172,(1981)〕によって決定されている。図4
にこの公知の配列の210bpフラグメントを示す。該2
10bpフラグメントはpMC200中の3300bpHind
III酵母DNA挿入物上に独特なHincII、BglIIおよび
EcoRI部位を含有し、該OCT蛋白コード付け配列の
ための開始コードンは図4中の四角で囲んだATGコー
ドンと考えられる。HBsAg単独またはHBsAg前駆体
とクローンしたHBV DNA由来のHBsAgをコード
する配列の酵母DNAのHincII、BglIIまたはEcoR
I部位への導入は遺伝子融合をもたらし、該遺伝子融合
が融合部位を越えて翻訳を継続させるための正しい方向
にある場合には、該arg3調節域から転写、翻訳された
ハイブリッド蛋白を産生するものと考えられる。
【0023】実施例5 pRIT10640をpMC200と組合わせることによ
る、HBsAgおよび調節域を含む中間プラスミド、pR
IT10671およびpRIT10672の調製 pMC200 5μgをBglII6.4単位で37℃にて2.
5時間消化し、0.1Mグリシン、0.01MMgCl2・6
2Oおよび0.01mMZnCl2を含有する等容量の緩衝
液(pH10.5)で希釈し、ウシ腸アルカリ性ホスファタ
ーゼ0.5単位と共に37℃にて30分間インキュベー
トし、5'末端リン酸塩残基を除去する。該混合液を緩
衝液−飽和フェノールで2回、エーテルで3回抽出す
る。DNAをエタノールで沈澱させ、0.01Mトロメ
タミン緩衝液(pH7.5)に溶解する。pRIT1064
0 25μgをBamHIで消化し、HBV DNAの13
50bp BamHIフラグメントを切除する。該1350b
pフラグメントを調製アガロースゲル電気泳動および電
気溶出により精製する。溶出DNAをエタノール沈澱に
より回収、濃縮し、0.01Mトロメタミン緩衝液( pH
7.0)20μl中に溶解する。HBsAgコード付け配列
を含むBamHIフラグメント0.3μgをBglII消化pMC
200 0.5μgと混合し、該混合物をT4DNAリガ
ーゼと共にインキュベーションして結紮する。
【0024】該結紮DNAをイー・コリK12株MM2
94のコンピテント細胞を形質転換するのに用いる。形
質転換体を200μg/mlアンピシリン含有寒天平板上
で選択する。アンピシリン寒天培地上で連続継代して1
2個の耐性コロニーを単離し、ビルンボイムら〔Birnb
oim et al.,Nucl.Acid.Res.,Vol.7,1513(1
979)〕により記載された方法によってプラスミドを
単離する。アガロースゲル電気泳動による分析は、すべ
てのプラスミドがHpaIによって制限され、BamHIフラ
グメントの挿入を示し、また、挿入フラグメントの両方
の方向が12個の形質転換コロニー中にあることを示し
ている。該プラスミドはCsCl−臭化エチジウム密度グ
レジエント遠心分離法によって単離される。1つのプラ
スミド、pRIT10671は、HBsAgコード付け配
列の転写のための正しい方向でBglII部位に融合された
BamHIフラグメントを含み、OCTの18個のN−末
端アミノ酸、推定的HBsAg前駆体蛋白の42個のアミ
ノ酸およびHBsAgの226個のアミノ酸からなる28
6個のアミノ酸融合蛋白を生じる。該融合蛋白は以下の
実施例8で示されるHBsAgである。pRIT1067
1を含有する形質転換体を、イー・コリK12株MM2
94(pRIT10671)と命名する。pRIT1067
1を図5に示す。中間プラスミドとしてのpRIT10
640の使用は必須ではない。例えば、該BamHIフラ
グメントはpRIT10616から切り出すことができ
る。もう1つのプラスミド、pRIT10672は、H
BsAgコード付け配列の転写のための正しくない方向に
あるBamHIフラグメントを含んでいる。このプラスミ
ドを含む形質転換体をイー・コリK12株MM294(p
RIT10672)と命名する。
【0025】実施例6 pRIT10671およびpRIT10672をシャトル
ベクターYEp13と組合わせることによるプラスミ
ド、pRIT10673およびpRIT10674シャト
ルベクターの調製 ベクターYEp13はイー・コリ・サッカロミセス・セ
レビシアエ・シャトルベクターである。ベクターYEp
13はブローチら〔Broach et al.,Gene,Vol.8,1
21,(1979)〕に記載されており、ジエイ・ヒック
ス(J.Hicks,Cold.Spring Harbor Laboratories
New York,U.S.A)によって供給された。小さいHi
ndIIIフラグメントを、HindIIIによる消化でプラスミ
ドから切除し、該プラスミドを再結紮して、単一のHin
dIII部位を含む誘導プラスミド、YEp13HindIIIを
調製する。精製YEp13HindIIIをHindIIIで消化
し、アルカリ性ホスファターゼで処理して再結紮を抑制
する。該DNAをフェノール抽出およびエタノール沈澱
によって回収する。
【0026】精製pRIT10671およびpRIT10
672をBamHIで消化し、アルカリ性ホスファターゼ
で処理してpBR322部分の再形成を抑制する。該処
理DNAをさらにHindIIIで消化して調節域−HBsAg
遺伝子融合を含む4650bpHindIIIフラグメントを遊
離させ、ついで、その試料をフェノールで抽出し、エタ
ノールで沈澱させる。pRIT10671およびpRIT
10672から誘導したDNA調製物各0.4μgを、別
々に、HindIII消化YEp13HindIII0.4μgと混合
し、該混合物をT4DNAリガーゼと共にインキュベー
トする。各結紮混合物の一部分をイー・コリK12株M
M294のコンピテント細胞を形質転換するのに用い
る。形質転換体をアンピシリン寒天培地上で選択する。
形質転換体コロニーを単離し、ビルンボイムら〔Birnb
oim et al., Nucl.Acid.Res.,Vol.7,1513
(1979)〕によって記載された方法により、それらの
プラスミドの内容を調べた。形質転換体コロニーの1
つ、イー・コリK12株MM294(pRIT1067
3)は第 図に示すような正しい方向で、YEp13Hin
dIII上に挿入されたpRIT10671からのHindIII
フラグメントを含むプラスミド、pRIT10673を
含有する。もう1つの形質転換体コロニー、イー・コリ
K12株MM294(pRIT10674)は、YEp13
HindIII上に正しくない方向で挿入されたpRIT10
672からのHindIIIフラグメントを含むプラスミド、
pRIT10674を含有している。
【0027】実施例7 pRIT10673およびpRIT10674による酵母
の形質転換 プラスミドpRIT10673およびpRIT10674
を、イー・コリK12株MM294(pRIT1067
3)およびMM294(pRIT10674)の清澄な溶解
質よりCsCl−臭化エチジウム密度グレジエント遠心分
離法によって単離する。
【0028】A.サッカロミセス・セレビシアエ株DC
5ブローチら〔Broach et al.,Gene,Vol.8,121,
(1979)〕によって記載されている。サッカロミセス
・セレビシアエ株DC5(leu2〜3、leu2〜113、h
is3、can1〜11)は、ジエイ・ヒックス(J.Hicks,
Cold Spring Harbor Laboratories New York,U.
S.A)から得られ、ヨーロッパ特許条約およびブダペス
ト条約にしたがってアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション(アメリカ合衆国メリイランド州、ロック
ビル)に1982年6月2日に寄託番号20630とし
て寄託されている。プロトプラスト化をβ−グルコウロ
ニダーゼ(0.24単位/ml最終濃度)およびアリールス
ルファターゼ(1.2単位/ml最終濃度)の混合物を用い
て0.8Mソルビトール、0.03Mβ−メルカプトエタ
ノールおよび0.1Mリン酸カルシウム緩衝液(pH7.
5)中で行なう以外は、ハイネンら〔Hinnen et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,Vol.75,1
929(1978)〕によって記載された方法によってD
C5株の細胞を増殖させ、形質転換用に調製する。酵母
プロトプラストを、別々に、pRIT10673 10
μgおよびpRIT10674 10μgと共にインキュ
ベートし、形質転換体をロイシン欠損再生寒天培地中で
選択する。再生寒天培地中で増殖したコロニーを回収
し、0.675%アミノ酸欠損酵母窒素基本培地、2%
グルコース2%寒天および80μg/mlヒスチジンを含
有する固体培地上に画線塗抹し、30℃で増殖させる。
DC5株の1コロニーはpRIT10673で形質転換
され、これをサッカロミセス・セレビシアエ株DC5(p
RIT10673)と命名する。もう1つのコロニーはp
RIT10674で形質転換され、これをサッカロミセ
ス・セレビシアエ株DC5(pRIT10674)と命名
する。
【0029】DC5(pRIT10673)株およびDC
5(pRIT10674)株の培養物を80μg/mlヒス
チジン加酵母窒素基本培地中で、620μmにおいて0.
33〜1.0の光学密度が得られるまで増殖させる。D
C5(pRIT10674)株は調節域に対して正しくな
い方向で融合されたHBsAgコード付け配列を含んでい
るので陰性対照として有用である。細胞を遠心分離によ
り回収し、リン酸塩緩衝食塩水(PBS)で洗浄し、1m
Mフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)加PBS
5ml中に20〜160倍濃度で再懸濁させる。細胞
を、フレンチ・プレッシャーセル( French Pressure
Cell)に12000psi(83MPa)で2回通過させて破
壊し、溶解質を7700×Gで15分間、ついで300
00×Gで30分間遠心分離する。上澄液を回収し、マイ
レックス(Millex)GVメンブラン上で濾過する。上澄
液における特異抗−HBsAg抗体と反応する蛋白の存在
を、Ausria(登録商標)ラジオイムノアッセイ法によ
りテストする。このようにして調製されたサッカロミセ
ス・セレビシアエ株DC5(pRIT10673)の清澄
細胞抽出物はPBSで16〜256倍に希釈してテスト
した場合でも陽性反応を与え、一方、DC5(pRIT1
0674)株抽出物は、抗−HBsAg抗体と反応する蛋
白の存在に関するこの分析では陰性であった。
【0030】B.サッカロミセス・セレビシアエ株1c
1697d サッカロミセス・セレビシアエ株1c1697dはヨーロ
ッパ特許条約およびブダベスト条約に従ってアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに1982年6月
2日に寄託番号ATCC20631として寄託されてい
る。前記の方法を用い、アルギニン栄養緩徐株1c16
97d(argJ±、leu2〜1)をpRIT10673およびp
RIT10674で形質転換させる。該栄養緩徐株のロ
イシン非依存性コロニーの1つをpRIT10673で
形質転換させ、サッカロミセス・セレビシアエ株1c1
697d(pRIT10673)と命名する。もう1つのロ
イシン非依存性コロニーを、pRIT10674で形質
転換させサッカロミセス・セレビシアエ株1c1697d
(pRIT10674)と命名する。1c1697d(pRI
T10673)株および1c1697d(pRIT1067
4)株の培養物を20μg/mlアルギニン補足酵母窒素
基本培地中で増殖させる。細胞を回収し、細胞抽出物を
前記と同様にして調製する。1c1697d(pRIT10
673)株の清澄細胞抽出物は、1/2048まで希釈
してもAusria(登録商標)ラジオイムノアッセイにお
いて陽性の結果を示すが、1c1697d(pRIT106
74)株の抽出物では、この分析において一様に陰性で
あった。これらの結果から、DC5株およびpRIT10
673で形質転換された1c1697d株の酵母細胞は、
HBsAg決定子を有する融合蛋白の形態でHBsAgを特
異的に合成すると結論づけられる。
【0031】実施例8 サッカロミセス・セレビシアエ株1c1697d(pRIT
10673)からのHBsAgによるウサギの免疫法 サッカロミセス・セレビシアエ株1c1697d(pRIT
10673)を620μmにおける光学密度が0.60と
なるまで増殖させ、遠心分離によって採集する。細胞を
1mM PMSF加PBS中に40倍濃度で再懸濁す
る。清澄細胞抽出物を実施例7に記載の方法に従って調
製する。同様にして、1c1697d(pRIT1067
4)株の清澄細胞抽出物を調製する。これらの抽出物を
ウサギの免疫付与に用いる。6匹のウサギからなる第1
群には、フロインド完全アジュバント1mlと混合した
1c1697d(pRIT10673)株抽出物1mlを非経
口的注入で第0、9、15、30および37日目に与え
る。3匹のウサギからなる第2群には、フロインド完全
アジュバント1mlと混合した1c1697d(pRIT1
0674)株抽出物1ml非経口的注入で同じ日に与え
る。両群から第0(免疫付与前)、23、51、および6
5日目に、また、第1群からは第44日目にも血清を採
取し、Ausab(登録商標)ラジオイムノアッセイを用い
て抗−HBsAg抗体の存在をテストした。これらの結果
を第1表に示す。これらの結果は、1c1697d(pRI
T10673)株からの抽出物の注入を受けた6匹のウ
サギのうち4匹がHBsAgに対する抗体を生じたことを
示している。1c1697d(pRIT10674)株から
の抽出物の注入を受けた3匹の対照のウサギはいずれも
抗−HBsAg抗体産生の形跡を示していない。これらの
結果から、1c1697d(pRIT10673)株抽出物
はHBsAgを含み、重篤な副作用なしにヒトにおけるH
BV感染に対する保護を惹起するためのワクチンに用い
ることができると結論される。
【0032】
【表1】
【0033】実施例9 arg3調節域を含有するpMC200からのプラスミド、
pRIT10749の調製 精製pMC200をHincIIで消化し、10%アクリルア
ミドゲル上で電気泳動にかける。arg3調節域を含有す
る1940bpフラグメントを電気溶出およびエタノール
沈澱によって該ゲルより回収する。該フラグメント約4
μgを12.5mM MgCl2、12.5mM CaCl2、2
00mM NaCl、1mM EDTAおよび200mMト
ロメタミン−HClを含有する緩衝液(pH8.0)100
μl中でBal31エキソヌクレアーゼ0.2単位と共に
30℃にて1〜3秒間インキュベートする。該処理DN
Aをフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させる。そ
の1μgをデオキシヌクレオチド三リン酸塩の存在下で
T4DNAポリメラーゼと共にインキュベートしていず
れもの1本鎖端部を修復し、ついで、EcoRIエンドヌ
クレアーゼで消化する。この方法で、Bal31による切
除により種々の長さのDNAフラグメントが産生され
る。各フラグメントは一端に固定したEcoRI延長部を
有し、もう一つの端部は元のHincII部位およびOCT
蛋白開始コードンからいくらかの距離を置いて位置した
鈍化端(blunt end)となっている。arg3調節域を含有す
る約1480bpのフラグメントを7.5%アクリルアミ
ドゲル上で電気泳動、ついで、電気溶出およびエタノー
ル沈澱に付して単離する。このカットバック調節域は、
以下の実施例10に記載されるように、OCTアミノ酸
配列を欠く蛋白合成に先立つ転写をプロモートすること
ができるので好ましい。
【0034】第2の一連の反応では、pMC200をXb
aIで消化し、5'−1本鎖端部をT4DNAポリメラー
ゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸塩と共にインキ
ュベートして詰込むか、鈍化端とする。このDNAをE
coRIで消化し、3'からXbaI部位までに位置する酵母
DNA配列と、pBR322を含む約5700bpの大き
なEcoRI−T4/XbaIフラグメントを電気泳動、電
気溶出およびエタノール沈澱によって精製する。このフ
ラグメントを該1480bpプロモーター含有フラグメン
トと混合し、これに結紮する。該結紮混合物をイー・コ
リK12株MM294のコンピテント細胞を形質転換す
るのに用いる。形質転換体をアンピシリン寒天培地上で
選択する。プラスミドDNAをビルンボイム〔Birnboi
m etal.,Nucl.Acid.Res.,Vol.7,1513、(19
79)〕の記載した方法によって形質転換体コロニーよ
り単離し、XbaIでの消化によってXbaI部位の存在につ
いてスクリーニングする。XbaI部位は、第2の一連の
反応からのフラグメント上の詰込まれたXbaI部位が、
XbaI認識配列であるTCTAGAを新しい位置で復元
させるように、3'T残基で終わる第1の一連の反応か
らのもう1つのフラグメントに結紮しているプラスミド
にのみ存在している。XbaI部位を有するプラスミドをp
RIT10749と命名した。これらの操作を示すフロ
ーシートを図6に示す。イー・コリK12株MM294
(pRIT10749)は、ヨーロッパ特許条約およびブ
ダペスト条約に従ってアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション(アメリカ合衆国メリイランド州、ロッ
クビル)に、1982年6月2日付で寄託番号ATCC
39133として寄託されている。
【0035】pRIT10749の試料をBstEIIおよ
びXbaIの組合せで消化する。切除されたarg3調節域の
サイズは、BstEIIおよびXbaIで同様に消化されたpM
C200との比較により、また、フックら〔Fuchs et
al.,Gene,Vol.4,1(1978)〕によって記載されて
いるファージφx174DNAフラグメントの公知の分
子量を参照することにより約210bpと算定された。p
RIT10749のBstEII−XbaIフラグメントのD
NA配列を決定するため、プラスミドDNAをBstEII
で消化し、交換キネーションによってγ−32P−ATP
で標識し、ついで、BamHIエンドヌクレアーゼで消化
して2000bpフラグメントを遊離させ、電気溶出およ
びエタノール沈澱によって精製する。標識フラグメント
のDNA配列化はマキサムら〔Maxam et al., Metho
ds in Enzymology,Vol.65,499,(1980)〕に
よって記載された化学的修飾法に従って行なわれる。こ
の配列の1部分は、 CCCATCAACTTGTACACTCGTCTAGA と決定された。アンダーラインを施したヌクレオチド
は、5700bp EcoRI−T4/XbaIフラグメント
から誘導される。図4に示すDNA配列の相当区域と比
較すると、修復されたXbaI部位が、pMC200酵母D
NA挿入物における元のHincII部位のヌクレオチド9
個上流の5'非翻訳先端域中に位置することがわかる。
【0036】実施例10 pRIT10749をpRIT10601と組合わせるこ
とによる、HBsAgおよび調節域を含有するプラスミ
ド、pRIT10759およびpRIT10761の調製 pRIT10601をHhaIエンドヌクレアーゼで消化
し、7.5%アクリルアミドゲル上で電気泳動に付す。
1100bpフラグメントを電気溶出およびエタノール沈
澱によって回収する。このフラグメントの一部のDNA
配列は、ピーターソンら〔Peterson et al.,Viral H
epatitis,G.N.Vyas,S.N.Cohen andR.Schmid.E
ds.,Franklin Institute Press,Philadelphia,U.
S.A.(1978,P569)によって記載されているよ
うな、ayw抗原型HBsAgの公知のN−末端アミノ酸配
列に対応する配列を含有する。該フラグメントは、5'
〜HBsAg開始コードンに位置する6個のヌクレオチ
ド、完全なHBsAgコード付け配列および約390個の
3'非翻訳ヌクレオチドを含有する。プラスミドpRIT
10749のDNAをXbaIで消化し、該DNA約40
0ngを精製HhaIフラグメント約280ngと混合する。
該混合物を20mMトロメタミン−HCl、10mM Mg
Cl2,1mMジチオトレイトールならびにdATP、dCT
P、dGTPおよびdTTP各33mMを含有する緩衝液
(pH7.5)20μl中で37℃にて30分間T4DNA
ポリメラーゼ0.5単位と共にインキュベートする。該
反応混合液に1mMATP2.5μl,10mM EDTA
2.5μlおよびT4DNAリガーゼ2μl(2単位)を
加え、該混合液を15℃にて16時間インキュベートす
る。
【0037】該結紮混合物をイー・コリK12株MM2
94のコンピテント細胞を形質転換するのに用い、アン
ピシリン耐性形質転換体を選択する。プラスミド調製物
をいくつかのこれらの形質転換体より作り、制限エンド
ヌクレアーゼ消化およびゲル電気泳動により分析した。
その結果は鈍化端HBVフラグメントがXbaI消化pRI
T10749中に両方の可能な方向で挿入されているこ
とを示している。このようなプラスミドの1つ、pRI
T10761はarg3プロモーターからHBsAg配列を
転写するための正しい方向の1100bp挿入物を含み、
BstEIIおよびXbaIによる連続的消化により271bp
フラグメントを生ずる。このpRIT10761を図7
に示す。第2のプラスミド、pRIT10759は正し
くない方向で挿入物を包含し、BstEIIおよびXbaIエ
ンドヌクレアーゼの組合わせで消化すると、1175bp
と算定されるフラグメントを生ずる。pRIT1076
1について、arg3調節域−HBsAg挿入接合部におけ
るヌクレオチドの配列を、γ−32P−ATPによるXba
I末端の交換キネーション標識付けの後、マキサムら
〔Maxam et al., Methods in Enzymology,Vol.6
5,499(1980)〕の化学的修飾法を用いて271b
p BstEII−XbaIフラグメントを配列化することによ
り決定する。arg3調節域−HBsAg接合部に対して決
定された配列はTACACTCGTCTACTGAAC
ATGである。XbaI制限部位がT4DNAポリメラー
ゼによって完全には修復されず、グアニン残基1つを欠
失していることがわかる。該arg3非翻訳先端部にはH
BV起源の6個のヌクレオチド、CTGAACが直接続
き、さらにHBsAg開始コードン、ATGおよびHBs
Ag構造遺伝子のコード付け配列が続いている。HBsA
g開始コードンはarg3プロモーターの下流にある最初の
開始コードンである。そのため、該DNAから転写され
たmRNAの翻訳はそのコードンで開始され、合成され
たHBsAgは異質アミノ残基を欠失することになる。合
成されたHBsAgは融合蛋白ではなく、HBsAg標品と
構造的に本質的に同じものである。
【0038】実施例11 pRIT10761をYEp13HindIIIと組合わせるこ
とによるプラスミドpRIT10764およびpRIT1
0765の調製 pRIT10761およびpRIT10759を別々にP
stIおよびBamHIで消化してpBR322レプリコン部
分を破壊し、ついでHindIIIで消化して挿入されたHB
V DNAおよび調節域を担持するDNAフラグメント
を遊離させる。該DNAをフェノールで抽出し、エタノ
ールで沈澱させ、0.01Mトロメタミン−HClおよび
0.001M EDTAを含有する緩衝液(pH7.5)に
溶解する。各DNA調製物の0.6μgを前記と同様な方
法で調製されるYEp13HindIIIのHindIII消化、ア
ルカリ性ホスファターゼ処理DNA0.3μgと混合し、
該混合物を結紮する。該結紮混合物をイー・コリK12
株MM294のコンピテント細胞の形質転換に用い、ア
ンピシリン耐性形質転換体を選択する。1つの形質転換
体は、pRIT10761由来のHindIIIフラグメント
をYEp13HindIII上に挿入してなるプラスミドpRI
T10764を含有することが示された。また、別の形
質転換体はpRIT10759由来HindIIIフラグメン
トをYEp13HindIII上に挿入してなるプラスミドpR
IT10759を含有することが示された。pRIT1
0761およびpRIT10764の調製フローシート
を図7に示す。
【0039】実施例12 pRIT10764およびpRIT10765による酵母
の形質転換 pRIT10764およびpRIT10765を実施例1
1で調製された形質転換体の培養物よりCsCl−臭化エ
チジウム密度グレジエント遠心分離法によって単離し、
各10μgを実施例7に記載の方法により酵母株1c16
97dの細胞を形質転換するのに用い、再生寒天培地上
でロイシン−非依存性形質転換体を選択する。これらの
形質転換から生ずるロイシン−非依存性コロニーを菌株
1c1697d(pRIT10764)と命名する。もう1
つの形質転換体をサッカロミセス・セレビシアエ株1c
1697d(pRIT10765)と命名する。これらの菌
株の培養物を2%グルコースおよび20μg/mlアルギ
ニン補足酵母窒素基本培地中で620μmにおける光学
密度が0.80〜0.88となるまで増殖させる。細胞を
集め、細胞不含抽出液を調製し、実施例7に記載される
ようにAusria(登録商標)ラジオイムノアッセイによ
りHBsAgについて分析する。1c1697d(pRIT1
0764)の抽出物は、PBSによる希釈度が1/10
24まででもこの分析において陽性の結果を示すが、1
c1697d(pRIT10765)株は非希釈抽出物でも
この分析において一様に陰性であった。遺伝学およびラ
ジオイムノアッセイの結果より、サッカロミセス・セレ
ビシアエ株1c1697d(pRIT10674)の細胞
は、ヒトにおけるHBV感染に対する保護を重篤な副作
用なしで惹起するためのワクチンに使用できるHBsAg
を合成すると結論される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 pRIT10601の制限エンドヌクレアー
ゼ開裂地図を示す図面。
【図2】 pRIT10606の制限ヌクレアーゼ開裂
地図を示す図面。
【図3】 pMC200の制限エンドヌクレアーゼ開裂
地図を示す図面。
【図4】 pMC200における3300bp HindIII
酵母DNA挿入物の一部分のヌクレオチド配列を示す図
面。
【図5】 pRIT10671およびpRIT10673
の製造を示すフローシート。
【図6】 pRIT10749の製造を示すフローシー
ト。
【図7】 pRIT10761およびpRIT10764
の製造を示すフローシート。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 // C12N 1/19 9162−4B C12N 15/00 ZNAA (C12P 21/02 C12R 1:865) (C12N 1/19 C12R 1:865) (72)発明者 クラベール・マリオレン ベルギー国ベー−1630リンケベーク、ドゥ エルスボス32番 (72)発明者 ドゥ・ビルド・ミシェル ベルギー国ベー−1320ジェンバル、アベニ ュー・ジュバール136番 (72)発明者 ハーフォード・ニジェル ベルギー国ベー−1900オベリージュ、ジェ フ・ランボーラン9番

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 HBsAgをコードするヌクレオチド配列
    および酵母において転写を行うことのできる調節域から
    なり、該配列がHBsAgの免疫原性を保持し、HBsAg
    の226個のアミノ酸からなるポリペプチドと、そのN
    −末端におけるポリペプチド延長部とからなるポリペプ
    チドをコードし、該延長部は、一部がHBsAgのプレ-
    S領域より由来し、一部がHBsAgのプレ-S領域より
    由来しないポリペプチドであって、該プレ-S領域より
    由来の部分がHBsAgの226個のアミノ酸に天然に先
    行する該N−末端アミノ酸を含めて42個までのアミノ
    酸により形成されている組換型DNA分子を含むプラス
    ミドで形質転換された酵母を培養し、産生されたポリペ
    プチドを収集することを特徴とするポリペプチドの製
    法。
  2. 【請求項2】 HBsAgの226個のアミノ酸からなる
    ポリペプチドとそのN−末端におけるポリペプチド延長
    部からなるHBsAgの免疫原性誘導体であって、該延長
    部は、一部がHBsAgのプレ-S領域より由来し、一部
    がHBsAgのプレ-S領域より由来しないポリペプチド
    からなり、該プレ-S領域より由来の部分がHBsAgの
    226ポリペプチドに天然に先行する該N−末端アミノ
    酸を含めて42個までのアミノ酸によって形成されてい
    ることを特徴とするHBsAg免疫原性誘導体。
  3. 【請求項3】 プレ-S領域より由来の延長部がHBsA
    gポリペプチドの226番目のアミノ酸に天然に先行す
    る42個のアミノ酸によって形成されている請求項2記
    載のHBsAg免疫原性誘導体。
  4. 【請求項4】 プレ-S領域より由来しない延長部がオ
    ルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼのN−末端
    の18個のアミノ酸により形成されている請求項3記載
    のHBsAg免疫原性誘導体。
  5. 【請求項5】 HBsAgの226個のアミノ酸からなる
    ポリペプチドとそのN−末端におけるポリペプチド延長
    部からなるHBsAgの免疫原性誘導体であって、該延長
    部は、一部がHBsAgのプレ-S領域より由来し、一部
    がHBsAgのプレ-S領域より由来しないポリペプチド
    からなり、該プレ-S領域より由来の部分がHBsAgの
    226ポリペプチドに天然に先行する該N−末端アミノ
    酸を含めて42個までのアミノ酸によって形成されてい
    るHBsAg免疫原性誘導体と、医薬上許容される担体ま
    たは賦形剤とを組み合わせてなることを特徴とするワク
    チン。
JP7247478A 1982-09-08 1995-09-26 肝炎b型ウイルスワクチン Expired - Lifetime JP2702899B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41578982A 1982-09-08 1982-09-08
US415789 1987-09-08

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63251725A Division JP2522825B2 (ja) 1982-09-08 1988-10-05 肝炎b型ウィルスワクチン用組換型dna分子

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH08317796A true JPH08317796A (ja) 1996-12-03
JP2702899B2 JP2702899B2 (ja) 1998-01-26

Family

ID=23647197

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP58165829A Pending JPS5971694A (ja) 1982-09-08 1983-09-07 肝炎b型ウイルスワクチン
JP63251725A Expired - Lifetime JP2522825B2 (ja) 1982-09-08 1988-10-05 肝炎b型ウィルスワクチン用組換型dna分子
JP63251724A Pending JPH02464A (ja) 1982-09-08 1988-10-05 酵母arg3調節域含有ベクター
JP63251723A Pending JPH02116A (ja) 1982-09-08 1988-10-05 肝炎b型ウイルスワクチン
JP7247478A Expired - Lifetime JP2702899B2 (ja) 1982-09-08 1995-09-26 肝炎b型ウイルスワクチン

Family Applications Before (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP58165829A Pending JPS5971694A (ja) 1982-09-08 1983-09-07 肝炎b型ウイルスワクチン
JP63251725A Expired - Lifetime JP2522825B2 (ja) 1982-09-08 1988-10-05 肝炎b型ウィルスワクチン用組換型dna分子
JP63251724A Pending JPH02464A (ja) 1982-09-08 1988-10-05 酵母arg3調節域含有ベクター
JP63251723A Pending JPH02116A (ja) 1982-09-08 1988-10-05 肝炎b型ウイルスワクチン

Country Status (22)

Country Link
EP (1) EP0106828B1 (ja)
JP (5) JPS5971694A (ja)
KR (1) KR840006014A (ja)
AT (1) ATE91718T1 (ja)
AU (4) AU584580B2 (ja)
CA (1) CA1222707A (ja)
CY (1) CY1932A (ja)
DE (1) DE3382704T2 (ja)
DK (1) DK406483A (ja)
ES (4) ES525439A0 (ja)
FI (1) FI833205A (ja)
GR (1) GR78982B (ja)
HK (1) HK1004570A1 (ja)
HU (1) HU196625B (ja)
IE (1) IE60387B1 (ja)
IL (1) IL69202A (ja)
MA (1) MA19895A1 (ja)
MY (1) MY102920A (ja)
NO (1) NO833198L (ja)
NZ (1) NZ204952A (ja)
PT (1) PT77265B (ja)
ZA (1) ZA836658B (ja)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5936699A (ja) * 1982-08-20 1984-02-28 Chemo Sero Therapeut Res Inst シヤトルベクタ−
JPS5931799A (ja) * 1982-08-16 1984-02-20 Science & Tech Agency B型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミド
WO1986001534A1 (en) * 1984-09-04 1986-03-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Recombinant dna and its use
WO1986003411A1 (en) * 1984-12-12 1986-06-19 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for preparing novel protein
WO1986007384A1 (en) * 1985-06-03 1986-12-18 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for preparing hapatitis b virus surface antigen p31
US4683294A (en) * 1985-04-03 1987-07-28 Smith Kline Rit, S.A. Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them
DE3677851D1 (de) * 1985-08-05 1991-04-11 Merck & Co Inc Verfahren zur steigerung der produktion von rekombinantem protein in hefearten der gattung saccharomyces.
US4895800A (en) * 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen
ZA88488B (en) * 1987-01-30 1988-10-26 Smith Kline Rit Hepatitis b virus surface antigens and hybrid antigens containing them
DE3883596T2 (de) * 1987-03-09 1994-02-17 Merck & Co Inc Reinigung von rekombiniertem Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen.
NZ229260A (en) * 1988-06-03 1994-02-25 Merck & Co Inc Hepatitis b virus, expression cassette for pre-s domain, host cells and
US4962656A (en) * 1989-06-30 1990-10-16 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Control and monitoring method and system for electromagnetic forming process
LT3988B (en) 1992-02-17 1996-06-25 Fermentas Biotech Inst Recombinant plasmides pfs19, pfps2-48 and pjlfds1 codingsynthesis of human hepatite b of surfice virus antigenes, methods fof producing thereof
TW340132B (en) * 1994-10-20 1998-09-11 Ibm Structure for use as an electrical interconnection means and process for preparing the same
JP4028850B2 (ja) * 2004-02-04 2007-12-26 株式会社名機製作所 ディスク基板の成形用金型

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES487106A0 (es) * 1978-12-22 1981-05-16 Biogen Nv Un metodo para producir al menos un polipeptido que muestra antigenicidad de hbv
NZ199722A (en) * 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
GR76274B (ja) * 1981-08-04 1984-08-04 Univ California
NZ201705A (en) * 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
GB2125047B (en) * 1982-08-09 1986-02-19 Ciba Geigy Ag Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PROC.NATL.ACAD.SCI.USA=1981 *

Also Published As

Publication number Publication date
ES8600938A1 (es) 1985-10-16
IE60387B1 (en) 1994-07-13
EP0106828A2 (fr) 1984-04-25
IL69202A (en) 1991-08-16
ES532730A0 (es) 1985-10-16
MY102920A (en) 1993-03-31
ES8600939A1 (es) 1985-10-16
DE3382704T2 (de) 1994-02-10
EP0106828B1 (fr) 1993-07-21
FI833205A0 (fi) 1983-09-07
DK406483D0 (da) 1983-09-07
ES532732A0 (es) 1985-10-16
AU9001491A (en) 1992-02-27
DK406483A (da) 1984-03-09
CA1222707A (en) 1987-06-09
JP2702899B2 (ja) 1998-01-26
EP0106828A3 (en) 1985-11-21
CY1932A (en) 1983-09-06
AU1569288A (en) 1988-07-28
PT77265A (en) 1983-09-01
AU1675083A (en) 1984-03-15
AU584580B2 (en) 1989-06-01
AU3131889A (en) 1989-07-20
JPH02231084A (ja) 1990-09-13
DE3382704D1 (de) 1993-08-26
KR840006014A (ko) 1984-11-21
ATE91718T1 (de) 1993-08-15
PT77265B (en) 1986-02-04
JPH02464A (ja) 1990-01-05
ES8506350A1 (es) 1985-07-01
HU196625B (en) 1988-12-28
NZ204952A (en) 1986-05-09
JP2522825B2 (ja) 1996-08-07
ZA836658B (en) 1984-06-27
ES525439A0 (es) 1985-07-01
HK1004570A1 (en) 1998-11-27
GR78982B (ja) 1984-10-02
IE832099L (en) 1984-03-08
JPS5971694A (ja) 1984-04-23
ES532731A0 (es) 1985-11-01
ES8602120A1 (es) 1985-11-01
NO833198L (no) 1984-03-09
MA19895A1 (fr) 1984-04-01
FI833205A (fi) 1984-03-09
JPH02116A (ja) 1990-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AP56A (en) Hepatitis B virus surface antigens and hybrid antigehs containing them.
JP3069907B2 (ja) 新規な抗原物質及びその製法
CA2025598C (en) Chimaeric hepadnavirus core antigen proteins
JP2511394B2 (ja) 酵母菌中でのb型肝炎表面抗原の製造
US6306625B1 (en) Method for obtaining expression of mixed polypeptide particles in yeast
US6099840A (en) Hepatitis B vaccine
JP2522825B2 (ja) 肝炎b型ウィルスワクチン用組換型dna分子
US4769238A (en) Synthesis of human virus antigens by yeast
JPH08198897A (ja) HBs抗原の免疫原特性を有し、HBs抗原により担持されたエピトープに対して外来の抗原部位を担持する粒子及びかかる粒子の産生法
US4820642A (en) Amplified expression vector
US5851823A (en) Hepatitis B vaccine
US6103519A (en) Antigens and methods therefor
US5989865A (en) Hepatitis B vaccine
Michel et al. Synthesis in CHO cells of hepatitis B surface antigen containing the pre-S2 region expression product
IE67139B1 (en) Synthesis of human virus antigens by yeast