JPH02116A - 肝炎ｂ型ウイルスワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は組換型ＤＮＡ技法を用いることによるＢ型肝炎
表面抗原をコードする遺伝子にて形質転換した酵母が産
生する抗原からの肝炎Ｂ型ウィルスワクチンの製造に関
する。

発明の背景 肝炎Ｂ型ウィルス（ＨＢＶ）による感染症は重く、広範
囲にわたる健康上の問題である。感染症は急性または慢
性の様相で発現する。米国における急性肝炎の症例数は
少なくとも１年につき１０万件であり、致死率が１〜２
％と見積られている。米国においては、健常成人中の慢
性保菌者の蔓延率は年令、社会的階級により、０．１〜
１％の間で変化している。南アメリカでは、慢性保菌者
の蔓延率は約１〜３％、ソ連および南ヨーロッパでは、
約３〜６％、アジアおよびアフリカでは１０％以上であ
る。

発達した国々では、血液を取扱う医療部署の患者および
要員、軍要員、慢性保菌者の配偶者、高ＨＢ　Ｖ風土地
域への旅行者、慢性保菌者の新生児、ホモセックスの人
、売春婦および麻薬常用者のようなウィルス接触の高い
危険性のある人々のためのワクチンの要求が存在する。

第三世界の国々においては大衆免疫付与のための安価な
ワクチンの要求が存在する。大衆免疫付与計画は急性肝
炎の発生や慢性保菌者が留ることに究極的に影響するば
かりでなく、慢性活性肝炎および肝細胞癌の罹病率およ
び死亡率も減少させることができる。

肝炎Ｂ型のピリオンであると考えられ、感染患者から単
離できるゾーン（Ｄ　ａｎｅ）粒子は約４２ｎｍの径を
有する。各々、肝炎Ｂ型表面抗原（ＨＢｓＡｇ）からな
る外皮、キャプシド（ＨＢｃＡｇ）、内生ポリメラーゼ
およびＤＮＡゲノムから構成されている。該ゲノムは環
状で、約２００の塩基からなる１本鎖域を有する２本鎖
である。該１本鎖域は１ｎｖｉｔｒｏで該内生ポリメラ
ーゼの作用によって詰込み（ｆｉｌｌ　　ｉｎ）を行な
うことができる。より長い鎖は約３２００の塩基を含有
する。

組織培養中でＨＢＶを増殖させるのが困難であることが
示されており、また、唯一公知の宿主がヒトであるため
、従来、ＨＢＶワクチンを製造することは困難であった
。感染したヒトから少量のＨＢＶ抗原標品が単離されて
いる。エフ・デイ・シイ・レポーツ（Ｆ　−Ｄ　−ＣＲ
ｅｐｏｒｔｓ、ｐｐ、　３〜４　。

Ｊｕｌｙ１９，１９８２）には最近開発されたＢ型肝炎
ワクチンの臨床研究の報文が掲載されている。

バレンツエラら［Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ　ｅｔ　ａｌ、
、Ｎａｔｕｒｅ。

Ｖｏｌ、２９８，３４７〜３５０（１９８２）］は表現
ベクターを用いた酵母におけるＨＢｓＡｇの合成を報告
しており、それでは該ＨＢｓＡｇコード付は配列が８３
５ｂｐのＴａｑｌ−Ｈｐａｌルミｌフラグメントロモー
ターが該酵母アルコール・デヒドロゲナーゼＩ、プロモ
ーターである。この文献より以前にいくつかの簡単な研
究報文がある。これらは、酵母アルコール・デヒドロゲ
ナーゼ・プロモーター域に結紮されているＨＢｓＡｇに
類似した蛋白をコードする配列を含むＤＮＡフラグメン
トの酵母における表現を報告しているバレンツエラらの
報文［Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ　ｅｔ　ａｌ、　、Ａｒｃ
ｈ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、Ｅｘｐ、（Ｃｈｉｌｅ）、Ｖｏ
ｌ、　１４（１）、２１〜２２（１９８１）］、ビイ・
バレンツエラおよびダブリユウ・ジエイ・ルック−（Ｐ
　、　Ｖ　ａｌｅｎｚｕｅｌａ　ａｎｄ　Ｗ、　Ｊ　、
　Ｒｕｔｔｅｒ）を含む米国の研究チームが酵母におけ
る「蛋白−被膜周囲肝炎Ｂ型ウィルス」の産生を発表し
たと報じているスフリップ中の報告［５ｃｒｉｐ　Ｎｏ
、　６１６　。

ｐ、＋　４（Ａｕｇ、１２．１９８１）］およびダブリ
ユウ・ジエイ・ルツター（Ｗ　、　Ｊ　、　Ｒｕｔｔｅ
ｒ）か酵母細胞におけるグリコジル化ＨＢｓＡｇの表現
を報告したと報じているツカ−マンの報文［Ｚ　ｕｃｋ
ｅｒｍａｎ。

Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、２９５．９８〜９９（］　９８
２）］である。

ＨＢｓＡｇのようなＨＢＶの抗原性成分は該抗原をコー
ドする遺伝子を含む組換型ＤＮＡ分子を挿入した細菌中
で製造されてきた。バージルら［Ｂｕｒｒｅｌｌ　ｅｔ
　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、　２７９　、Ｎｏ、
　５７０８．４３〜４７（１９７９）］はプラスミドＩ
）ＢＲ３２２中でクローンしたＨＢＶ　　ＤＮＡ配列の
イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＨＢ　１０１株における表
現を報告している。

ヨーロッパ特許出願第１３８２８号において、マレ−ら
（Ｍｕｒｒａｙ　　ｅｔ　　ａｔ、）は、イー・コリＨ
８１０１株において、ＨＢｓＡｇを含めて、ＨＢＶ抗原
をコードできる組換型ベクターの製造を開示している。

このベクターはゾーン粒子ＤＮＡおよびプラスミドｐＢ
Ｒ３２２から製造される。マレ−らは、有用な宿主には
他の細菌宿主、酵母および他の真菌、動物または植物細
胞およびその他の宿主が包含されうると述べているが、
示されている唯一の宿主はイー・コリである。

チャーネイら［Ｃｈａｒｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔ
ｕｒｅ、Ｖｏｌ。

２８６．８９３〜８９５（１９８０）］は］β−ガラク
トシダーゼ遺伝と該ｌ−ｌＢｓＡｇ構造遺伝子の融合物
を有するバクテリオファージの構造を報告している。該
バクテリオファージはＨＢｓＡｇおよびβガラクトシダ
ーゼ両方の抗原性決定子からなる融合蛋白の合成を命令
する。

英国特許出願第２０３４３２３号において、チオライス
ら（Ｔ　１ｏｌｌａｉｓ　ｅｔ　ａｌ）はＨＢＶ　　Ｄ
ＮＡを含有するコリファージの製造を開示している。

融合ファージ−ＨＢＶ　　ＤＮＡがイー・コリＣ６００
株中に形質転換されている。

最初にＰＣＴ出願ＷＯ３１１００５７７号として公開さ
れた英国特許出願第２０７０６２１号には、ＨＢｓＡｇ
遺伝子の一部、プロモーターおよびラクトース・オペロ
ンのＺ遺伝子からなり、イー・コリ中でクローンできる
プラスミドが開示されている。

ヨーロッパ特許出願第２０２５１号においてルッターら
（Ｒｕｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｔ）はプラスミドｐＢＲ３２
２およびＨＢＶ　　ＤＮＡのＢａｍＨＩフラグメントか
らなり、イー・コリの形質転換に使用できる組換型ベク
ターを包含する組換型ベクターを開示している。ＨＢＶ
　　ＤＮＡのＢａｍＨＩフラグメントおよびトリプトフ
ァン・オペロンの一部からなる他のベクターがイー・コ
リＨＢ　ｌ　０１株における表現を得るために使用され
た。

エドマンら［Ｅｄｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ
、Ｖｏｌ、　２９１、Ｎｏ、５８１５．５０．３〜５０
６（１９８１）］はトリプトファン・オペロン調節域の
調節の下、イー・コリにおいてＨＢｃＡｇおよびβ−ラ
クタマーゼーＨＢｓＡｇ融合蛋白の合成を命令するプラ
スミドの構造を記載している。

ＨＢＶ　　ＤＮＡの細菌中への挿入を開示した他の文献
にはチャーネーらの文献［Ｃｈａｒｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ
、。

Ｐｒｏｇ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、、Ｖｏｌ、２７　、８
８〜９２（１９８１）］、マツケイらの文献［Ｍａｃｋ
ａｙ　　ｅｔ　　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、、Ｖ
ｏｌ、７８　、Ｎ。

７　４５１０〜４５１４（１９８１）］、フリツチェら
［Ｆｒ１ｔｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃ，Ｒ，Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、、Ｖｏｌ、　２８７、Ｎｏ、１６，１４５３（
１９７８）］、英国特許明細書第２０３４３２３号（Ｄ
　ｅｒｗｅｎｔ　　Ｎｏ、　４６８７４　Ｃ）およびパ
セクらの文献［Ｐａ５ｅｋ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、２８２．Ｎｏ、６．５７５（１
９７９）］が包含される。

ＨＢＶ　　ＤＮＡは哺乳動物細胞中でもクローンされて
いる。これらには、ヒト、マウスおよびヒト肝癌細胞系
が包含される。例えば、デュボイスら［Ｄｕｂｏｉｓ　
ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＵＳ、、Ｖｏｌ、７７、Ｎｏ、８．４５４９〜４５５
３（１９８０）］はマウス細胞のＨＢ　Ｖゲノム含有プ
ラスミドによる形質転換およびＨＢｓＡｇの表現を報告
している。ヒルシュマンら［Ｈｉｒｓｃｈｍａｎ　　ｅ
ｔ、ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、、Ｖ
ｏｌ、７７　、Ｎｏ、９　５５０７〜５５１１（１９８
０）］はＨＢＶ　　ＤＮＡで形質転換させたＨｅＬａ細
胞によるＨＢＶ様粒子の産生を報告している。

ヒト血液からのＨＢｓＡｇを用いるＨ　Ｂ　Ｖワクチン
の製造法がフナコシら［Ｆｕｎａｋａｓｈ、ｉ　　ｅｔ
　ａｌ、。

Ｐｒｏｇ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、、Ｖｏｌ、２７　、１
６３〜１６７（１９８１）］およびママウスら［Ｍａｕ
ｐａｓ　　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｇ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、Ｖｏｌ、　２７　、１
８５〜２０１　（１９８１）］により報告されている。

フナコシらによって製造されたワクチンは４０μ９の精
製したホルマリン処理ＨＢｓＡｇ、リン酸塩、塩化ナト
リウム、２０Ｊ！ｇのマンニトールおよびアジュバント
として０．１％の水酸化アルミニウムを含有する。後者
の報文において、マウパスらはワクチンの１投与量が２
〜１０μ９／肩Ｑの蛋白［ローリ−（Ｌｏｗｒｙ）法］
および０．１％の水酸化アルミニウムを含有する精製し
たホルマリン処理ＨＢｓＡｇｌ＋Ｑであると報告してい
る。マウパスらによって報告された研究で用いた方法で
は１ケ月間隔で３回注射し、１年後に１回ブースターを
要求しており、マウパスらは３ケ月間隔で２回層ＨＢｓ
Ａｇの注射を提案している。

ＨＢＶワクチン製造についての他の文献にはへパチテイ
スＢワクチンＩＮＳＥＲＭシンボノウム（Ｈｅｐａｔｉ
ｔｉｓ　Ｂ　　Ｖａｃｃｉｎｅ　　Ｉ　ＮＳＥＲＭＳｙ
ｍｐｏｓｉｕｍ　　Ｎｏ、　１８　、ｅｄｉｔ、ｂｙ　
　Ｍａｕｐａｓ　ａｎｄＧ　ｕｅｓｒｙ、　１９８１　
、　Ｅ　１ｓｅｖｉｅｒ／　Ｎｏｒｔｈ　−Ｈｏ１ｌａ
ｎｄＢ　ｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐ　ｒｅｓｓ、）の、各
々、３．３７および５７頁のマウパスら、アダモビツツ
ら（７！、ｄＨｌｏｗｉｃｘｅｔ　　ａｌ）およびフナ
コシらのものが包含される。

酵母は他のある種のＤＮＡ配列の宿主生物として使用さ
れている。例えば、英国特許出願第２０６８９６９号に
おいて、フレーザーら（Ｆ　ｒａｓｅｒｅｔ　　ａｌ）
は酵母におけるニワトリ・オバルブミンの製造を開示し
ている。スクリップ６４０号［５ｃｒｉｐ　Ｎｏ、６４
０．ｐｉ　１（Ｎｏｖ、４．１９８１）］はあるタイプ
のインターフェロンが酵母中で製造される旨の報告を包
含している。ヨーロッパ特許第１１５６２号（Ｄｅｒｗ
ｅｎｔ　Ｎｏ、　３８７６２　Ｇ）では、２μプラスミ
ド中にｕｒａ３”酵母遺伝子を含有するハイブリッド酵
母プラスミドが報告されている。

発明の概要 本発明は、ＨＢｓＡｇをコードできるヌクレオチド配列
および酵母、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ　ａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にお
いて該ＨＢｓＡｇ配列の転写を行なうことのできる酵母
ａｒｇ　３遺伝子から誘導された調節域からなる組換型
ＤＮＡ分子を有する酵母から産生されたＨＢｓＡｇのワ
クチン有効量および適当な担体からなるヒトにおけるＨ
ＢＶ感染に対する保護惹起用のワクチンに関する。該Ｄ
ＮＡ分子は該ＨＢｓＡｇ配列および該調節域が挿入され
たベクターを含有し、該ベクターは酵母ベクターの製造
または該ＨＢｓＡｇおよび調節域の保存に使用できる。

さらに、本発明は、ＨＢｓＡｇ含有ワクチンの製法も包
含する。

図面の概要 添付図面中、第１図はｐＲＩ　Ｔ　１０６０１の制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂地図である。

第２図はｐＲＩＴ１０６０６の制限エンドヌクレアーゼ
開裂地図である。

第３図はｐＭｃ２００の制限エンドヌクレアーゼ開裂地
図である。

第４図はｐＭｃ２００における３３００ｂｐＨ４ｎｄＩ
Ｉ［酵母ＤＮＡ挿入物の一部分のヌクレオチド配列で、
この部分にはＨｉｎｃＩＩ、ＢｇｌｌｌおよびＥｃ。

Ｒ１部位が含まれている。

第５図はｐＲＩＴ１０６７１およびｐＲＩ　Ｔ　１０６
７３の製造を示すフローシートである。

第６図はｐＲＩ　Ｔ　１０７４９の製造を示すフローシ
ートである。

第７図はｐＲＩＴ１０７６１およびｐＲＩ　Ｔ　Ｉ　０
７６４の製造を示すフローシートである。

発明の詳細 な説明で用いる組換盤ＤＮＡ分子は、ＨＢｓＡｇ用の構
造遺伝子を含むヌクレオチド配列を、酵母において該Ｈ
ＢｓＡｇ配列の転写を命令でき、それにより、その表現
が行なうことのできる酵母ａｒｇ３調節域と融合させる
ことにより製造される。本明細書において、「組換型Ｄ
ＮＡ分子」なる語は該ＨＢｓＡｇコード付は配列および
該調節域を含有するＤＮＡフラグメントならびにプラス
ミドまたはファージ・ベクターのような該フラグメント
を含む他のＤＮＡ分子を意味する。

「調節域」なる語はプロモーター域および転写に必要な
他の配列を含む配列を意味する。該酵母ａｒｇ３ｇ節域
は、それがＨＢｓＡｇコード付は配列表現用の強力なプ
ロモーターとなることができるので、特に有利である。

ｒＨＢｓＡｇＪなる語は構造的にＨＢｓＡｇ標品と同じ
であるか、ＨＢｓＡｇ標品と実質的に同じ抗原性決定子
を有する蛋白、すなわち、ＨＢｓＡｇ標品を特異的に認
識し、それと反応する抗体の生成を惹起することができ
るか、抗ＨＢｓＡｇ抗体によって特異的に認識される蛋
白を意味する。

該ＨＢｓＡｇコード付は配列は、感染したヒト血清中の
ゾーン粒子より抽出したＤＮＡから、ＤＮＡポリメラー
ゼ、好ましくは、内生ポリメラーゼで１本鎖域に詰込み
、ついで、制限エンドヌクレアーゼで消化することによ
り単離できる。エンドヌクレアーゼの選択は、部分的に
、実際に用いるゾーン粒子に依存する。例えば、後記の
実施例で示すように、ａｄｗ抗原型のある種のゾーン粒
子のＨＢ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　ＡのＨＢｓＡｇコード付は配
列は単一のＢａｍＨＩフラグメント上で単離でき、ａｙ
ｗ抗原型のある種のゾーン粒子のＨＢＶ　　ＤＮＡのＨ
ＢｓＡｇコード付は配列はＨｈａＩフラグメント上で単
離できる。同じ抗原型のゾーン粒子のＨＢＶ　　ＤＮＡ
が制限部位の異なったパターンを示すこともある。

本発明で用いるＤＮＡフラグメントを製造するためのＤ
ＮＡの制限、本発明で用いる組換型ＤＮＡ分子製造のた
めのかかるフラグメントの結紮および微生物への挿入は
前記の、また、後記する文献に開示されている技法のよ
うな、公知の技法によって行なわれる。条件はＤＮＡお
よび酵素の変性をさけるように選択する。例えば、ｐＨ
は約７゜０〜１１．０に保持するように緩衝され、温度
は約６０℃以下に保つ。好ましくは、制限は約３０〜４
０℃で行ない、結紮は約０〜ｌＯ℃で行なう。

本発明の実施に用いる制限酵素およびリガーゼは商業的
に入手でき、それに付されている指示に従って使用すべ
きである。Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼが好ましいりガーゼ
である。

調節域へのＨＢｓＡｇ配列の融合は後記の実施例に示す
ような中間ベクターの使用によって行なうことができる
。別法として、ＨＢｓＡｇ配列は、調節域を含むベクタ
ー中に直接挿入することができる。ベクターは本発明で
用いるＤＮＡフラグメントを担持し、保持できるＤＮＡ
で、例えば、ファージやプラスミドを包含する。ファー
ジ中でＤＮＡフラグメントをクローンする技法は、例え
ば、チャーネーら［Ｃｈａｒｎａｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎ
ａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ。

２８６．８９３〜８９５（１９８０）コおよび英国特許
出願第２０３４３２３号（Ｔ　１ｏｌｌａｉｓ）によっ
て開示されている。好ましくは、ＨＢｓＡｇ配列は調節
域に対して、ＨＢｓＡｇ配列の表現によって合成された
ＨＢｓＡｇが異質アミノ酸残基を持たないように位置さ
せる。

特に有用であることが判明している調節域は、オルニチ
ン・カルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＣＴ）をコー
ドする酵母ａｒｇ　３遺伝子から由来するものである。

このａｒｇ　３調節域の使用は、その作用が特異的およ
び一般的調節機構の両方に支配されるので有利である。

クラビールら［Ｃｒａｂｅｅｌ　ｅｔａｌ、、Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、Ｖｏｌ
、　７８．５０２６（１９８１）コによって報告されて
いるように、これはプラスミドｐＹｅ　ｕｒａ３ａｒｇ
３上で、イー・コリ中でクローンされている。好ましい
宿主は、アルギニン生合成経路が抑制解除されたサッカ
ロミセス・セレビシアエ株、例えば、１ｃ１６９７ｄ株
である。かかる菌株の使用は、実施例で用いた他の菌株
、ＤＣ５株と比較して、ａｒｇ　３プロモーターからの
表現増加をもたらせる。

融合ＤＮＡフラグメン゛トを酵母中にクローンするため
の好ましいベクターはプラスミドＹＥｐ１３で、これは
イー・コリおよびサッカロミセス・セレビシアエの両方
において複製、推持することができ、それ故、シャトル
・ベクターとして知られている。数種の他の酵母ベクタ
ーが知られており、利用できる。ＨＢｓＡｇおよび調節
域は、順次あるいは、後記の実施例に示すように同時に
酵母中に挿入できる。プラスミド・ベクターによる形質
転換は、通常、本発明で用いるＤＮＡ分子をプラスミド
として取込むこととなる。しかし、組換現象のような他
の反応では該ＤＮＡ分子の染色体ＤＮＡ中への取込みと
することもできる。

本発明に従って、酵母によって製造されたＨＢｓＡｇと
、適当な担体からなるヒトにおけるＨＢＶ感染に対する
保護を惹起する本発明のワクチンは公知の技法によって
製造することができる。水酸化アルミニウムのようなア
ジュバントを使用することが望ましい。また、得られた
ＨＢｓＡｇを他の免疫原と組合せて複合ワクチンを製造
することもできる。該ＨＢＶまたは複合ワクチンは、例
えば、皮下、静脈内または筋肉内径路で投与できる。本
発明のＤＮＡフラグメントおよびそれによって製造され
たＨＢｓＡｇはまた、ＤＮＡハイブリッド形成技法およ
び種々のイムノアッセイによる生物試料中のＨＢＶ検出
用の探針としても用いることができる。

つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例中、％は、特に断らない限り重量％を意味する。

実施例１ ＨＢＶ　　ＤＮＡをｐＢＲ３２２と組合わせることによ
る中間プラスミドｐＲＩ　Ｔ　Ｉ　Ｏ６０１の調製 ａｙｗ抗原型のＨＢｓＡｇ陽性血清に、０．２８％の最
終濃度になるようにＣａＣ１ｔを加えて脱繊維化し、Ｓ
Ｗ２７　ローター中、１０ｍＭトロメタミンＨＣｌ５　
ＩＭＮａＣｌおよび１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む緩衝液（
ｐＨ７，５）中で調製したｌＯ〜２０％シヨ糖ダレジェ
ント上、２７００　Ｏｒ、ｐ、ｍで２時間で遠心分離す
る。ゾーン粒子を含む透明なベレットを同じ緩衝液中に
再懸濁させ、６５％ショ糖クツションに重層させた緩衝
２０％ショ糖上で遠心分離する。該クツション界面での
乳白光バンドを回収し、同様な２０〜６５％グレジエン
ト上、２０００００ＸＧで４時間遠心分離し、ゾーン粒
子をペレット化する。

Ａ、該ゾーン粒子を、５０ｍＭ）ロメタミンーＨＣＬ　
　１０　ｍＭ　　ＭｇＣｌｘ、５００ｎ＋Ｍ　　ＮａＣ
１゜０．５ｍＭジチオトライトール、各５０ｍＭのｄＡ
ＴＰＳｄＣＴＰおよびｄＧＴＰならびに８μＭ　３　ｔ
　ｐｄＴ　Ｔ　Ｐ　（３５０Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）を含有
する反応混合液（ｐＨ８、０）に再懸濁させ、該再懸濁
粒子を３７００で５時間インキュベートすることにより
内生ＤＮＡポリメラーゼを用いてゾーン粒子内のＨＢＶ
ゲノムの１本鎖域を修復する。該再懸濁液を１０ｍＭト
ロメタミンーＨＣＬ　　１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ。

１００ｍＭ　　ＮａＣ１および０．０２％ドデシル硫酸
ナトリウムを含有する緩衝液（ｐＨ７、５）で希釈して
ｐＨ７，５とし、３７℃にて１時間プロナーゼ０゜５ｕ
／ｘ１２と共にインキュベートし、ついで、フェノール
抽出およびエタノール沈澱を行なう。

ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼによる該ＤＮＡの消
化は、アガロースゲル電気泳動および該ゲルのオートラ
ジオグラフィーによって判定されるように、約１４５０
ｂｐおよび１６００ｂｐのサイズを有する放射活性フラ
グメントを産生する。

Ｂ、ゾーン粒子ＤＮＡ的３０ｎｇを、標識していないｄ
ＴＴＰの存在下、内生ＤＮＡポリメラーゼを用いて修復
し、前記と同様にして抽出、回収する。該ＤＮＡを、あ
らかじめＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、
アルカリ性ホスファターゼで処理したｌｏｏｎｇのプラ
スミドｐＢＲ３２２と混合する。プラスミドｐＢＲ３２
２は組換型ＤＮＡ法に通常用いられるもので、入手の制
限なしにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託番号３７０１７とし
て寄託されている。該混合液をフェノールで抽出し、エ
タノールで沈澱させ、遠心分離し、乾燥させて、５０ｍ
Ｍトロメタミンー〇〇Ｉ、１ｍＭＡＴＰ、ｌ　ＯｍＭ　
ＭｇＣ１，，１０ｍＭジチオトライトール、５０μ９／
ｘｉ２ゼラチンおよび２単位／ｍＱＴ４ＤＮＡリガーゼ
を含有する混合液１２μ１２（ｐＨ７，５）に再懸濁さ
せる。該懸濁液をｌＯｏＣで４時間インキュベートし、
ついで水上で１８時間保持する。

結紮したＤＮＡ混合物は、コーヘンら［Ｃｏｈｅｎｅｔ
　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
、Ｓ、、Ｖｏｌ。

６９　２１１０、（１９７２）］の方法に従って調製し
たイー・コリＫ１２株Ｃ６００のコンピテント細胞を形
質転換するのに用いられる。形質転換体をアンピシリン
２００μ９／村を含有する固体培地上で選択する。単離
したコロニーについて、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１部位
への異種ＤＮＡフラグメント挿入を示すテトラサイクリ
ン耐性の欠失をスクリーニングする。このような形質転
換体クローンの１つがプラスミドｐＲＩ　Ｔ　１０６０
１を含有することが判明し、これはＢａｍＨＩエンドヌ
クレアーゼによる消化によって４３６０ｂｐのｐＢＲ３
２２フラグメントならびに１６００ｂｐおよび１４５０
ｂｐのＨＢＶ　　ＤＮＡフラグメントを与えることが判
明した。イー・コリに１２株Ｃ６００（ｐＲＩＴ１０６
０１）培養物は欧州特許条約（ＥＰＣ）およびブダペス
ト条約に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（アメリカ合衆国メリイランド州、ロックビル
）に１９８２年６月２日付で寄託番号ＡＴＣＣ３９１３
２として寄託されている。プラスミドｐＲＩ　Ｔ　ｌ　
０６０１の制限エンドヌクレアーゼ開裂地図を第１図に
示す。

ｃ、１々の制限酵素によるゾーン粒子ＤＮＡおよびｐＲ
ＩＴ１０６０１の消化によって生じるフラグメントのサ
イズをつぎのとおり比較した。ゾーン粒子ＤＮＡ、すな
わち、ＨＢＶ　　ＤＮＡを前記の内生ポリメラーゼ反応
により、または精製ＤＮＡをイー・コリ由来のＤＮＡポ
リメラーゼＩで処理することによって３１ｐで標識する
。標識されたＨＢＶ　　ＤＮＡをｐＲＩ　Ｔ　１０６０
１と混合し、該混合物を制限エンドヌクレアーゼで処理
し、アガロースゲル上で電気泳動にかける。該ゲルを臭
化エチジウムで染色し、紫外線光下で写真撮影してＤＮ
Ａフラグメントの位置づけをし、ついで、乾燥してオー
トラジオグラフィーにかけ、放射活性１−Ｉ　Ｂ　Ｖ　
　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントの位置づけをする。

つぎの標識されたＨＢＶフラグメントがｌ）ＲＩ　Ｔ１
０６０１フラグメントのサイズに正確に一致することが
判明した：１４５０および１６００ｂｐＢａｍＨＩフラ
グメント；１３３０ｂｐ　　Ｈｐａｌルミｌフラグメン
トび１１３０ｂｐ　　ＢａｍＨＩ　−ＸｈｏＩフラグメ
ント。標識されたゾーン粒子ＤＮＡはまた、サザーン［
Ｓ　ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ　、　Ｍｏ１．　Ｂ　ｉｏｌ
、　、　Ｖ　ｏｆ　。

９８．５０３（１９７５）］の技法により、アガロース
ゲルからニトロセルロース・フィルター上に移した後、
ｐＲＩＴ１０６０１のＢａｍＨＩ消化によって遊離され
る１４５０および１６００ｂｐの両方のフラグメントと
特異的にハイブリッド形成する。

これらの結果は、ｐＲＩ　Ｔ　１０６０１上のクローン
されたＤＮＡ挿入物がＨＢＶゲノムに相当し、ｐＲＩＴ
１０６０１上での２つのＢａｍＨＩフラグメントの相対
的な方向が該ピリオンにおけると同じであることを示し
ている。ｐＲＩ　Ｔ　ｌ　０６０１は後記の実施例１０
においてｐＲＩＴＩ０６７１を調製するのに使われる。

実施例２ ＨＢＶ　　ＤＮＡをｐＡｃＹｃ１８４と組合わせること
による中間プラスミド、ｐＲＩ　Ｔ　Ｉ　０６１６の調
製 ゾーン粒子を前記と同様にａｄｗ抗原型のＨＢｓＡｇ陽
性血清から単離する。３″Ｐで標識されたＨＢＶ　　Ｄ
ＮＡの制限エンドヌクレアーゼ分析は該ＤＮＡが１つの
ＥｃｏＲＩ部位を含んでいることを示した。

標識されていないヌクレオチドと用いる内生ポリメラー
ゼ反応によって詰込んだＨＢＶ　　ＤＮＡをＥｃｏＲＩ
で消化する。この制限ＤＮＡを、あらかじめＥｃｏＲＩ
で消化し、アルカリ性ホスファターゼで処理したプラス
ミドｐＡｃＹｃ１８４と混合する。プラスミドｐＡｃＹ
ｃ１８４は、人手の制限なしにアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションに寄託番号３７０３３として寄
託されている。該混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼで結紮す
る。

この結紮ＤＮＡ混合物をイー・コリに１２株Ｃ６００の
コンピテント細胞を形質転換するのに用いる。形質転換
体をテトラサイクリン（１５μ９／ＩＩＱ）寒天培地上
で選択し、ｐＡｃＹｃ１８４のＥｃ。

Ｒ【部位における挿入を示すクロラムフェニコール耐性
の欠失についてスクリーニングする。形質転換コロニー
は、該ＨＢＶ　　ＤＮＡからなる３２００ｂｐ挿入物を
ＥｃｏＲＩ部位に有するｐＡ　ＣＹ　Ｃ１８４からなる
プラスミドｐＲＩＴ１０６１６を含有することが判明し
た。ｐＲＩＴ１０６１６の制限地図を第２図に示す。イ
ー・コリに１２株Ｃ６００（ｐＲＩＴ１０６１６）はヨ
ーロッパ特許条約およびブダペスト条約に従いアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９８２年６
月２日付で寄託番号ＡＴＣＣ３９１３１として寄託され
ている。

実施例３ ｐＲＩＴ１０６１６をｐＢＲ３１３と組合わせることに
よる、ＨＢｓＡｇをコードするヌクレオチド配列を含有
する中間プラスミド、ｐＲＩ　Ｔ　１０６４０の調製 ｐＲＩＴ１０６１６をカーノら［Ｋａｈｎ　ｅｔ　ａｌ
、。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖ
ｏｌ、　　６８　、２６８　。

（１９７９）］の記載に実質的に従いＣｓＣ１−臭化エ
チジウム密度グレジエント遠心分離法により精製する。

該ＤＮＡをＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼで消化し、プ
ラスミドｐＢＲ３１３のＢａｍＨＩ消化、アルカリ性ホ
スファターゼ処理ＤＮＡと混合し、結紮し、実施例１の
記載と実質的に同様にしてイー・コリＫ１２株Ｃ６００
のコンピテント細胞を形質転換するのに用いる。プラス
ミドｐＢＲ３１３は、入手の制限なしにアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションに寄託番号３７０１８
として寄託されている。

形質転換体をアンピシリン含有寒天培地上で選択し、ｐ
ＢＲ３１３のＢａｍＨＩ部位における挿入を示すテトラ
サイクリン耐性の欠失についてスクリーニングする。形
質転換コロニーは、Ｂａｍ８１部位に１３５０ｂｐ挿入
物を有するｐＢＲ３１３からなるプラスミド、ｐＲＩ　
Ｔ　１０６４０を含むことが判明した。該挿入物は、Ｈ
ＢｓＡｇをコードできるヌクレオチド配列である。該挿
入物は推定的ｌ−ｌＢｓＡｇ前駆体蛋白部分および完全
表面抗原をコードし、また、５６５ｂｐの３′非コード
付は配列を含有する。

実施例４ 酵母ａｒｇ　３遺伝子をｐＢＲ３２２と組合わせること
による、ａｒｇ　３１４節域を含有する中間プラスミド
、ｐＭｃ２００の調製 ａｒｇ　３遺伝子を特定する３３００ｂｐ酵母ＤＮＡフ
ラグメントを、ｐＹｅｕｒａ３ａｒｇ３をＨｉｎｄｌＩ
［で消化することにより得る。プラスミドｐ　Ｙ　ｅｕ
ｒａ　３　ａｒｇ３については、クラビールら［Ｃｒａ
ｂｅｅｌ　ｅｔ　ａｌ、。

ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、、Ｖ
ｏｌ、７８　、５０２６、（１９８１）］によって記載
されている。該３ａｏｏｂｐフラグメントをｐＢＲ３２
２のＨｉｎｄＩＩ［部位中にクローンし、実質的に面記
と同様にしてイー・コリＫ１２株ＭＭ２９４中に形質転
換させる。

形質転換体をアンピシリン培地上で選択し、テトラサイ
クリン耐性についてスクリーニングする。

形質転換コロニーは、ＨｉｎｄＩＩ［部位に挿入物を有
するｐＢＲ３２２からなるプラスミドｐＭｃ２００を含
有することが判明した。このプラスミドは、以下の実施
例に記載するように酵母細胞においてＨＢｓＡｇヌクレ
オチド配列の転写を行なうことのできるａｒｇ３調節域
を含んでいる。イー・コリに１２株ＭＭ２９４　（ｐＭ
Ｃ２００）はヨーロッパ特許条約およびブダペスト条約
に従いアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
に１９８２年６月２日付で寄託番号ＡＴＣＣ３９１３０
として寄託されている。

オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＣＴ）
のためのＮ−末端コード付は配列部分および５°−非翻
訳先端域の部分を含め、ａｒｇ　３遺伝子の一部のヌク
レオチド配列は、ヒュイゲンら（Ｈｕｙｇｈｅｎ　　ｅ
ｔ　ａｌ、、　Ａｒｃｈ、　　Ｉｎｔｌ、　Ｐｈｙｓｉ
ｃａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、Ｖｏｌ、８９　、Ｂ　ｌ　７２　、
（１９８１）］によって決定されている。第４図にこの
公知の配列の２１０ｂｐフラグメントを示゛す。該２１
０ｂｐフラグメントはｐＭｃ２００中の３３００ｂｐ　
　ＨｉｎｄＩＩ［酵母ＤＮＡ挿入物上に独特なＨｉｎｃ
　ＩＩ、ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲ１部位を含有し、該
ＯＣＴ蛋白コード付は配列のための開始コードンは第４
図中の四角で囲んだＡＴＧコードンと考えられる。ＨＢ
ｓＡｇ単独またはＨＢｓＡｇ前駆体とクローンしたＨＢ
Ｖ　　ＤＮＡ由来のＨＢｓＡｇをコードする配列の酵母
ＤＮＡのＨｉｎｃＩＩ、ＢｇｌＩ［またはＥｃｏＲＩ部
位への導入は遺伝子融合をもたらし、該遺伝子融合が融
合部位を越えて翻訳を継続させるための正しい方向にあ
る場合には、該ａｒｇ３調節域から転写、翻訳されたハ
イブリッド蛋白を産生ずるものと考えられる。

実施例５ ｐＲＩ　Ｔ　１０６４０をｐＭｃ２００と組合わせるこ
とによる、ＨＢｓＡｇおよび調節域を含む中間プラスミ
ド、ｐＲＩＴ１０６７１およびｐＲＩＴＩＯ６７２の調
製 ｐＭｃ２００　５μ９をＢｇｌＩ［６，４単位で３７℃
にて２．５時間消化し、０．１Ｍグリシン、０．０１Ｍ
ＭｇＣ１＊　・６ＨｔＯおよび０．０１ｍＭＺｎＣ１ｔ
を含有する等容量の緩衝液（ｐＨ１０，５）で希釈し、
ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ０．５単位と共に３７
℃にて３０分間インキュベートし、５゛末端リン酸塩残
基を除去する。該混合液を緩衝液−飽和フェノールで２
回、エーテルで３回抽出する。

ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、０．０１Ｍトロメタミ
ン緩衝液（ｐＨ７、５）に溶解する。

ｐＲＩＴ１０６４０　２５ｕ９をＢａｍＨＩでｔ肖化し
、ＨＢＶ　　ＤＮＡの１３５０ｂｐ　　ＢａｍＨＩフラ
グメントを切除する。該１３５０ｂｐフラグメントを調
製アガロースゲル電気泳動および電気溶出により精製す
る。溶出ＤＮＡをエタノール沈澱により回収、濃縮し、
０．０１Ｍトロメタミン緩衝液（ｐＨ７，０）２　ＯＢ
Ｑ中に溶解する。ＨＢｓＡｇコード付は配列を含むＢａ
ａＨＩフラグメント０．３μ９をＢｇｌｌｌ消化ｐＭｃ
２００　０．５μこと混合し、該混合物をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼと共にインキュベーションして結紮する。

該結紮ＤＮＡをイーパコリＫ１２株ＭＭ２９４のコンピ
テント細胞を形質転換するのに用いる。

形質転換体を２００μ９ＩＲＱアンピシリン含有寒天平
板上で選択する。アンピシリン寒天培地上で連続継代し
て１２個の耐性コロニーを単離し、ビルンボイムら［Ｂ
ｉｒｎｂｏｉｍ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ
。

Ｒｅｓ、、Ｖｏｌ、７，１５１３（１９７９）］により
記載された方法によってプラスミドを単離する。アガロ
ースゲル電気泳動による分析は、すべてのプラスミドが
Ｈｐａｌによって制限され、ＢａｍＨＩフラグメントの
挿入を示し、また、挿入フラグメントの両方の方向り月
２個の形質転換コロニー中にあることを示している。該
プラスミドはＣｓＣ１−臭化エチジウム密度グレジエン
ト遠心分離法によって単離される。１つのプラスミド、
ｐＲＩＴ１０６７１は、ＨＢｓＡｇコード付は配列の転
写のための正しい方向でＢｇｌＩ［部位に融合されたＢ
ａｍＨＩフラグメントを含み、ＯＣＴの１８個のＮ−末
端アミノ酸、推定的ＨＢｓＡｇ前駆体蛋白の４２個のア
ミノ酸お上びＨＢｓＡｇの２２６個のアミノ酸からなる
２８６個のアミノ酸融合蛋白を生じる。該融合蛋白は以
下の実施例８で示されるＨＢｓＡｇである。ｐＲＩＴ１
０６７１を含有する形質転換体を、イー・コリに１２株
ＭＭ２９４（ｐＲＩＴ１０６７１）と命名する。ｐＲＩ
Ｔ１０６７１を第５図に示す。

中間プラスミドとしてのｐＲＩ　Ｔ　１０６４０の使用
は必須ではない、例えば、該ＢａｍＨＩフラグメントは
ｐＲＩＴ１０６１６から切り出すことができる。

もう１つのプラスミド、ｐＲＩ　Ｔ　１０６７２は、Ｈ
ＢｓＡｇコード付は配列の転写のための正しくない方向
にあるＢａｍＨＩフラグメントを含んでいる。

このプラスミドを含む形質転換体をイー・コリＫ１２株
ＭＭ２９４（ｐＲＩＴｌ　０６７２）と命名する。

実施例６ ｐＲＩ　Ｔ　ｌ　０６７１およびｐＲＩ　Ｔ　ｌ　０６
７２をシャトルベクターＹＥｐ１３と組合わせることに
よるプラスミド、ｐＲＩ　Ｔ　１０６７３およびｐＲＩ
Ｔ１０６７４シャトルベクターの調製 ベクターＹＥｐ１３はイー・コリー・サッカロミセス・
セレビシアエ・シャトルベクターである。

ベクター’ｙＥｐｔ　３はブローチら［Ｂｒｏａｃｈ　
ｅｔ　ａｔ、。

Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ、８，１２１．（１９７９月に記載さ
れており、ジエイ・ヒックス（Ｊ　、Ｈｉｃｋｓ、Ｃｏ
１ｄ、ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｕ、Ｓ、Ａ）によって供給
された。小さいＨｉｎｄＩＩ［フラグメントを、Ｈｉｎ
ｄｌｌＩによる消化でプラスミドから切除し、該プラス
ミドを再結紮して、単一のＨｉｎｄＩ［［部位を含む誘
導プラスミド、ＹＥｐｌ　３　ＨｉｎｄＩ［Ｉを調製す
る。精製ＹＥｐ１３ＨｉｎｄＩ［をＨｉｎｄＩＩＩで消
化し、アルカリ性ホスファターゼで処理して再結紮を抑
制する。該ＤＮＡをフェノール抽出およびエタノール沈
澱によって回収する。

精製ｐＲＩＴ１０６７１およびｐＲＩ　Ｔ　ｌ　０６７
２をＢａｍＨＩで消化し、アルカリ性ホスファターゼで
処理してｐＢＲ３２２部分の再形成を抑制する。該処理
ＤＮＡをさらにＨｉｎｄＩＩＩで消化して調節域−ＨＢ
ｓＡｇ遺伝子融合を含む４６５０ｂｐ　Ｈｉｎｄｌｌｒ
フラグメントを遊離させ、ついで、その試料をフェノー
ルで抽出し、エタノールで沈澱させる。ｐＲＩＴ１０６
７１およびｐＲＩＴ１０６７２から誘導したＤＮＡ調製
物各０．４μ９を、別々に、Ｈｉｎｄｌｌ［消化ＹＥｐ
１３ＨｉｎｄｌｌＩＯ，４μ９と混合し、該混合物をＴ
４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートする。

各結紮混合物の一部分をイー・コリＫ１２株ＭＭ２９４
のコンピテント細胞を形質転換するのに用いる。形質転
換体をアンピシリン寒天培地上で選択する。形質転換体
コロニーを単離し、ビルンボイムら［Ｂｉｒｎｂｏｉｍ
　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、。

Ｖｏｌ、７．１５１３（１９７９）］によって記載され
た方法により、それらのプラスミドの内容を調べた。形
質転換体コロニーの１つ、イー・コリＫ１２株ＭＭ２９
４（ｐＲＩＴ１０６７３）は第５図に示すような正しい
方向で、ＹＥｐｌ　３　ＨｉｎｄＩＩＩ上に挿入された
ｐＲＩ　Ｔ　Ｉ　０６７１からのＨｉｎｄｌＩ［フラグ
メントを含むプラスミド、ｐＲＩＴ１０６７３を含有す
る。もう１つの形質転換体コロニー、イー・コリに１２
株ＭＭ２９４（ｐＲＩ　Ｔ　１０６７４）は、ＹＥｐｌ
　３　Ｈ４ｎｄｌＩｌ上に正しくない方向で挿入された
ｐＲＩＴＩ０６７２からのＨｉｎｄＩ［Ｉフラグメント
を含むプラスミド、ｐＲＩＴ１０６７４を含有している
。

実施例７ ｐＲＩ　Ｔ　１０６７３およびｐＲＩ　Ｔ　１０６７４
による酵母の形質転換 プラスミドｐＲＩ　Ｔ　１０６７３およびｌ）ＲＩ　Ｔ
　１０６７４を、イー・コリＫ１２株ＭＭ２９４（ｐＲ
ＩＴ１０６７３）およびＭＭ２９４（ｐＲＩＴ１０６７
４）の清澄な溶解質よりＣｓＣ１−臭化エチジウム密度
ダレジエント遠心分離法によって単離する。

Ａ、サッカロミセス・セレビシアエ株ＤＣ５ブローチら
［Ｂｒｏａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ、　
８　、１２１、（１９７９）］によって記載されている
サッカロミセス・セレビシアエ株Ｄ　Ｃ５（ｌｅｕ２〜
３．１ｅｕ２〜ｌ１３、ｈｉｓ３、ｃａｎｌ　〜１１）
は、ジエイ・ヒックス（Ｊ、Ｈｉｃｋｓ、　Ｃｏ１ｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｕ、Ｓ、Ａ）から得られ、ヨー
ロッパ特許条約およびブダペスト条約に従ってアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（アリメカ合衆
国メリイランド州、ロックビル）に１９８２年６月２日
に寄託番号２０６３０として寄託されている。プロトプ
ラスト化をβ−グルコウロニダーゼ（０，２４単位／ｍ
ｆ２最終濃度）およびアリールスルファターゼ（１，２
単位／ａ＋（ｌ最終感度）の混合物を用いて０．８Ｍソ
ルビトール、００３Ｍβ−メルカプトエタノールおよび
０．１Ｍリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７，５）中で行
なう以外は、ハイホンら［Ｈｉｎｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ、
、Ｐｒｏｃ、ＮａｔｌＡｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、
Ｖｏｌ、　７５　、１９２９　（１９７８）コによって
記載された方法によってＤＣ５株の細胞を増殖させ、形
質転換用に調製する。酵母プロトプラストを、別々に、
ｐＲＩ　Ｔ　Ｉ　Ｏ６７３１Ｏμ９およびｐＲＩＴ１０
６７４　　ｔｏμ９と共にインキュベートし、形質転換
体をロイシン欠損再生寒天培地中で選択する。再生寒天
培地中で増殖したコロニーを回収し、０６７５％アミノ
酸欠損酵母窒素基本培地、２％グルコース２％寒天およ
び８０μ９／ｍ（ｌヒスチジンを含有する固体培地上に
画線塗抹し、３０℃で増殖させる。ＤＣ５株の１コロニ
ーはｐＲＩ　Ｔ　１０６７３で形質転換され、これをサ
ッカロミセス・セレビシアエ株ＤＣ５（ｐＲＩＴ　１０
６７３）と命名する。もう１つのコロニーはｐＲＩ　Ｔ
　Ｉ　０６７４で形質転換され、これをサッカロミセス
・セレビシアエ株ＤＣ５（１）ｒ（ＩＴ１０６７４）と
命名する。

ＤＣ５（ｐＲＩＴ１０６７３）株およびＤ　Ｃ５（１）
ＲＩＴ１０６７４）株の培養物を８０ｔｔｇ／ｍＱヒス
チジン加酵母窒素基本培地中で、６２０μｍにおいて０
，３３〜１．０の光学密度が得られるまで増殖させる。

ＤＣ５（ｐＲＩＴ１０６７４）株は調節域に対して正し
くない方向で融合されたＨＢｓＡｇコード付は配列を含
んでいるので陰性対照として有用である。細胞を遠心分
離により回収し、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗滌
し、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ
）加ＰＢ９５１１２中に２０〜１６０倍濃度で再懸濁さ
せる。細胞を、フレンチ・プレッシャーセル（Ｆｒｅｎ
ｃｈＰ　ｒｅｓｓｕｒｅ　　Ｃｅｌｌ）に１２０００ｐ
ｓｉ（８３ＭＰａ）で２回通過させて破壊し、溶解質を
７７００ＸＧで１５分間、ついで３００００ｘＧで３０
分間遠心分離する。上澄液を回収し、マイレックス（Ｍ
ｉｌｌｅｘ）ＧＶメンプラン上で濾過する。

上澄液における特異流−ＨＢｓＡｇ抗体と反応する蛋白
の存在を、Ａｕ５ｒｉａｏラジオイムノアツセイ法によ
りテストする。このようにして調製されたサッカロミセ
ス・セレビシアエ株ＤＣ５（ｐＲ［Ｔ１０６７３）の清
澄細胞抽出物はＰＢＳで１６〜２５６倍に希釈してテス
トした場合でも陽性反応を与え、一方、ＤＣ５（ｐＲＩ
ＴＩ　０６７４）採油出物は、抗−ＨＢｓＡｇ抗体と反
応する蛋白の存在に関するこの分析では陰性であった。

Ｂ、サッカロミセス・セレビシアエ味１ｃ１６７ｄ サッカロミセス・セレビシアエ株１ｃ１６９７ｄはヨー
ロッパ特許条約およびブダペスト条約に従ってアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９８２年６
月２日′に寄託番号ＡＴＣ０２０６３１として寄託され
ている。前記の方法を用い、アルギニン栄養緩徐味１ｃ
ｌ　６９７ｄ（ａｒｇＪ　　、１ｅｕ２〜ｌ）をｐＲＩ
　Ｔ　１０６７３およびｐＲＩ　Ｔ　Ｉ　０６７４で形
質転換させる。該栄養緩徐味のロイシン非依存性コロニ
ーの１つをｐＲＩ　Ｔ　Ｉ　０６７３で形質転換させ、
サッカロミセス・セレビシアエ株１ｃ１６９７ｄ（ｐＲ
ＩＴ１０６７３）と命名する。

もう１つのロイシン非依存性コロニーを、Ｉ）ＲＩＴ１
０６７４で形質転換させサッカロミセス・セレビシアエ
株１ｃ１６９７ｄ（ｐＲＩＴ１０６７４）と命名する。

ｌｃｌ　６９７ｄ（ｐＲＩＴｌ　０６７３）株および１
ｃ１６９７ｄ（ｐＲＩＴ１０６７４）株の培養物を２０
μ９／ｍＱアルギニン補足酵母窒素基本培地中で増殖さ
せる。細胞を回収し、細胞抽出物を前記と同様にして調
製する。ｌｃｌ　６９７ｄ（ｐＲＩＴ１０６７３）株の
清澄細胞抽出物は、ｌ／２０４Ｂまで希釈してもＡｕ５
ｒｉａｏラジオイムノアツセイにおいて陽性の結果を示
すが、１ｃ１６９７ｄ（ｐＲＩＴ１０６７４）株の抽出
物では、この分析において一様に陰性であった。

これらの結果から、ＤＣ５株およびｐＲＩ　Ｔ　１０６
７３で形質転換された１ｃ１６９７ｄ株の酵母細胞は、
ＨＢｓＡｇ決定子を有する融合蛋白の形態でＨＢｓＡｇ
を特異的に合成すると結論づけられる。

実施例８ サッカロミセス・セレビシアエ株１ｃｌ　６９７ｄ（ｐ
ＲＩＴ１０６７３）からのＨＢｓＡｇによるウサギの免
疫法 サッカロミセス・セレビシアエ株１ｃｌ　６９７ｄ（１
）ＲＩＴＩ０６７３）を６２０μｍにおける光学密度が
０．６０となるまで増殖させ、遠心分離によって採集す
る。細胞をｉｎ＋Ｍ　　ＰＭＳＦ加ＰＢＳ中に４０倍濃
度で再懸濁する。清澄細胞抽出物を実施例７に記載の方
法に従って調製する。同様にして、ｌｃｌ　６９７ｄ（
ｐＲＩＴ１０６７４）株の清澄細胞抽出物を調製する。

これらの抽出物をウサギの免疫付与に用いる。６匹のウ
サギからなる第１群には、フロイント完全アジュバント
１ｒｔｔＱと混合したＩｃｌ　６９７ｄ（ｐＲ１，Ｔ　
１０６７３）採油出物１ｍＱを非経口的注入で第０．９
．１５．３０および３７日目に与える。３匹のウサギか
らなる第２群には、フロイント完全アジュバントｌｘＱ
と混合したｌｃｌ　６９７ｄ（ｐＲＩＴ１０６７４）採
油出物１ｍＱを非経口的注入で同じ日に与える。両群か
ら第０（免疫付与前）、２３．５１、および６５日目に
、また、第１群からは第４４日目にも血清を採取し、Ａ
　ｕｓａｂｏラジオイムノアッセイを用いて抗ＨＢｓＡ
ｇ抗体の存在をテストした。これらの結果を第１表に示
す。これらの結果は、ｌｃｌ　６９７ｄ（ｐＲＩＴ１０
６７３）株からの抽出物の注入を受けた６匹のウサギの
うち４匹がＨＢｓＡｇに対する抗体を生じたことを示し
ている。１ｃ１６９７ｄ（ｐＲＩＴ１０６７４）株から
の抽出物の注入を受けた３匹の対照のウサギはいずれも
抗−ＨＢｓＡｇ抗体産生の形跡を示していない。これら
の結果から、ｌｃｌ　６９７ｄ（ｐＲＩＴ１０６７３）
採油出物はＨＢｓＡｇを含み、重篤な副作用なしにヒト
におけるＨＢＶ感染に対する保護を惹起するためのワク
チンに用いることができると結論される。

実施例９ ａｒｇ３ｇ節域を含有するｐＭｃ２００からのプラスミ
ド、ｐＲＴ　Ｔ　１０７４９の調製精製ｐＭｃ２００を
ＨｉｎｃＩ［で消化し、１０％アクリルアミドゲル上で
電気泳動にかける。ａｒｇ３調節域を含有する１９４０
ｂｐフラグメントを電気溶出およびエタノール沈澱によ
って該ゲルより回収する。該フラグメント約４μ９を１
２．５ｍＭＭｇＣＩ！、１２．５ｍＭ　　ＣａＣＬ、２
００ｍＭ　　ＮａＣｌ５１ｍＭ　　ＥＤＴＡおよび２０
０ｍＭトロメタミンーＨＣ１を含有する緩衝液（ｐ）１
８．０）１００μσ中でＢａ１３１エキソヌクレアーゼ
０．２単位と共に３０℃にて１〜３秒間インキュベート
する。

該処理ＤＮＡをフェノールで抽出し、エタノールで沈澱
させる。その１μ９をデオキシヌクレオチド三リン酸塩
の存在下でＴ４ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベー
トしていずれもの１本鎖端部を修復し、ついで、Ｅｃｏ
Ｒ■エンドヌクレアーゼで消化する。この方法で、Ｂａ
１３１による切除により種々の長さのＤＮＡフラグメン
トが産生される。各フラグメントは一端に固定したＥｃ
ｏＲＩ延長部を有し、もう一つの端部は元のＨｉｎｃ　
１１部位およびＯＣＴ蛋白開姶コードンからいくらかの
距離を置いて位置した鈍化端（ｂｌｕｎｔ　　ｅｎｄ）
となっている。ａｒｇ３ｉ節域を含有する約１４８０ｂ
ｐのフラグメントを７．５％アクリルアミドゲル上で電
気泳動、ついで、電気溶出およびエタノール沈澱に付し
て単離する。このカットバック調節域は、以下の実施例
１Ｏに記載されるように、ＯＣＴアミノ酸配列配列く蛋
白合成に先立つ転写をプロモートすることができるので
好ましい。

第２の一連の反応では、ｐＭｃ２００をＸｂａｌで消化
し、５°−１本鎖端部をＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよび
デオキシヌクレオチド三リン酸塩と共にインキュベート
して詰込むか、鈍化端とする。

このＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、３゛からＸｂａ１部
位までに位置する酵母ＤＮＡ配列と、ｐＢＲ３２２を含
む約５７００ｂｐの大きなＥｃｏＲＩ　−Ｔ　４／Ｘｂ
ａｌフラグメントを電気泳動、電気溶出およびエタノー
ル沈澱によって精製する。このフラグメントを該１４８
０ｂｐプロモーター含有フラグメントと混合し、これに
結紮する。

該結紮混合物をイー・コリに１２株ＭＭ２９４のコンピ
テント細胞を形質転換するのに用いる。

形質転換体をアンピシリン寒天培地上で選択する。

プラスミドＤＮＡをビルンボイムら［Ｂ　ｉｒｎｂｏｉ
ｍｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、、Ｖｏ
ｌ、　７　、１５１３、（１９７９）］の記載した方法
によって形質転換体コロニーより単離し、Ｘｂａｌでの
消化によってＸｂａ１部位の存在についてスクリーニン
グする。Ｘｂａ１部位は、第２の一連の反応からのフラ
グメント上の詰込まれたＸｂａＩ部位が、Ｘｂａｌ認識
配列であるＴＣＴＡＧＡを新しい位置で復元させるよう
に、３°Ｔ残基で終わる第１の一連の反応からのもう１
つのフラグメントに結紮しているプラスミドにのみ存在
している。Ｘｂａ１部位を有するプラスミドをｐＲＩ　
Ｔ　１０７４９と命名した。これらの操作を示すフロー
シートを第６図に示す。イー・コリに１２株ＭＭ２９４
（ｐＲＩＴ１０７４９）は、ヨーロッパ特許条約および
ブダペスト条約に従つてアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション（アメリカ合衆国メリイランド州、ロ
ックビル）に、１９８２年６月２日付で寄託番号ＡＴＣ
Ｃ３９１３３として寄託されている。

ｐＲＩ　Ｔ　１０７４９の試料をＢｓｔＥＩＩおよびｘ
ｂａｌの組合せで消化する。切除されたａｒｇ３調節域
のサイズは、ＢｓｔＥｎおよびＸｂａｌで同様に消化さ
れたｐＭｃ２００との比較により、また、フックら［Ｆ
ｕｃｈｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ、４　、　
Ｉ　（１９７８）］によって記載されているファージφ
ｘ１７４ＤＮＡフラグメントの公知の分子量を参照する
ことにより約２１０ｂｐと算定された。

ｐＲＩ　Ｔ　１０７４９のＢｓｔＥＩＩ−ＸｂａＩフラ
グメ、ントのＤＮＡ配列を決定するため、プラスミドＤ
ＮＡをＢｓｔＥＩＩで消化し、交換キネ−ジョンによっ
てγ−”Ｐ−ＡＴＰで標識し、ついで、ＢａｍＨｌエン
ドヌクレアーゼで消化して２０００ｂｐフラグメントを
遊離させ、電気溶出およびエタノール沈澱によって精製
する。標識フラグメントのＤＮＡ配列化はマキサムら［
Ｍａｘａｍ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ
、　６５　、４９９　、（１９８０）］によって記載さ
れた化学的修飾法に従って行なわれる。この配列の１部
分は、ＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＴＧＴＡＣＡＣＴＣＧＴＣ
ＴＡＧＡと決定された。アンダーラインを施したヌクレ
オチドは、５７００ｂｐ　　ＥｃｏＲＩ−Ｔ４／Ｘｂａ
ｌフラグメントから誘導される。第４図に示すＤＮＡ配
列の相当区域と比較すると、修復されたＸｂａＩ部位が
、ｐＭｃ２００酵母ＤＮＡ挿入物における元のＨｉｎｃ
１１部位のヌクレオチド９個上流の５°非翻訳先端域中
に位置することがわかる。

実施例１０ ｐＲＩ　Ｔ　１０７４９をｐＲＩ　Ｔ　１０６０１と組
合わせることによる、ＨＢｓＡｇおよび調節域を含有す
るプラスミド、ｐＲＩ　Ｔ　１０７５９およびｐＲＩＴ
１０７６１の調製 ｐＲＩ　Ｔ　１０６０１をＨｈａｒエンドヌクレアーゼ
で消化し、７．５％アクリルアミドゲル上で電気泳動に
付す。ｔｔｏｏｂｐフラグメントを電気溶出およびエタ
ノール沈澱によって回収する。このフラグメントの一部
のＤＮＡ配列は、ピーターソンら（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　
ｅｔ　ａｌ、、Ｖｉｒａｌ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ、Ｇ　
。

Ｎ、Ｖｙａｓ、Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ　ａｎｄ　Ｒ，Ｓｃ
ｂｍｉｄ、Ｅｄｓ、　。

Ｆ　ｒａｎｋｌｉｎ　Ｉ　ｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｐ　ｒｅ
ｓｓ、　Ｐ　ｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、　Ｕ　。

Ｓ、Ａ、（１９７８、ｐｓ　６９）によって記載されて
いるような、ａｙｗ抗原型ＨＢｓＡｇの公知のＮ−末端
アミノ酸配列に対応する配列を含有する。該フラグメン
トは、５°〜ＨＢｓＡｇ開始コードンに位置する６個の
ヌクレオチド、完全なＨＢｓＡｇコード付は配列および
約３９０個の３°非翻訳ヌクレオチドを含有する。

プラスミドｐＲＩＴ１０７４９のＤＮＡをＸｂａＩで消
化し、該ＤＮＡ約４００ｎｌＪを精製Ｈｈａｌフラグメ
ント約２８０ｎ９と混合する。該混合物を２０ｍＭ）ロ
メタミンーＨＣＬ　　１０　ｍＭ　　ＭｇＣＩｔ。

１ｍＭジチオトレイトールならびにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ
、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ各３３ｍＭを含有する緩衝液
（ｐＨ７，５）２０μＱ中で３７°Ｃにて３０分間Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼ０．５単位と共にインキュベートす
る。該反応混合液に１ｍＭＡＴＰ２．５．ｃｌ、１０ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ２．５μｉ２およびＴ４ＤＮＡリガーゼ
２μｍ２（２単泣）を加え、該混合液を１５℃にて１６
時間インキュベートする。

該結紮混合物をイー・コリに１２株ＭＭ２９４のコンピ
テント細胞を形質転換するのに用い、アンピシリン耐性
形質転換体を選択する。プラスミド調製物をいくつかの
これらの形質転換体より作り、制限エンドヌクレアーゼ
消化およびゲル電気泳動により分析した。その結果は鈍
化端ＨＢＶフラグメントがＸｂａｌ消化ｐＲＩ　Ｔ　１
０７４９中に両方の可能な方向で挿入されていることを
示している。このようなプラスミドの１つ、ｐＲＩ　Ｔ
　１０７６１はａｒｇ　３プロモーターからＨＢｓＡｇ
配列を転写するための正しい方向の１１００ｂｐ挿入物
を含み、ＢｓｔＥＩＩおよびＸ　ｂａ　Ｉにより連続的
消化により２７１　ｂｐフラグメントを生ずる。このｐ
ＲＩＴ１０７６１を第７図に示す。第２のプラスミド、
ｐＲＩＴＩＱ７５９は正しくない方向で挿入物を包含し
、ｌ３ｓｔＥＩＩおよびＸ　ｂａ　Ｉエンドヌクレアー
ゼの組合せで消化すると、１１７５ｂｐと算定されるフ
ラグメントを生ずる。ｐＲＩ　Ｔ　１０７６１について
、ａｒｇ　３調節域−ＨＢｓＡｇ挿入接合部におけるヌ
クレオチドの配列を、γ−”Ｐ−ＡＴＰによるＸｂａｌ
末端の交換キネ−ジョン標識付けの後、マキサムら［Ｍ
ａｘａｍ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、６５．４９９（１９８０）］
の化学的修飾法を用いて２７１ｂｐ　　ＢｓｔＥ！Ｉ−
ＸｂａＩフラグメントを配列化することにより決定する
。

ａｒｇ３Ｑ節域−ＨＢｓＡｇ接合部に対して決定された
配列はＴＡＣＡＣＴＣＧＴ（４’ＡＣＴＧＡＡＣＡＴＧ
である。ＸｂａＩ制限部位がＴ４ＤＮＡポリメラーゼに
よって完全には修復されず、グアニン残基１つを欠失し
ていることがわかる。該ａｒｇ　３非翻訳先端部にはＨ
ＢＶ起源の６個のヌクレオチド、ＣＴＧＡＡＣが直接続
き、さらにＨＢｓＡｇ開始コードン、ＡＴＧおよびＨＢ
ｓＡｇ構造遺伝子のコード付は配列が続いている。ＨＢ
ｓＡｇ開始コードンはａｒｇ３プロモーターの下流にあ
る最初の開始コードンである。そのため、該ＤＮＡから
転写されたｍＲＮＡの翻訳はそのコードンで開始され、
合成されたＨＢｓＡｇは異質アミノ残基を欠失すること
になる。合成されたＨＢｓＡｇは融合蛋白ではなく、Ｈ
ＢｓＡｇ標品と構造的に本質的に同じものである。

実施例１１ ｐＲＩＴ１０７６１をＹＥｐｌ　３　ＨｉｎｄｌＩ［と
組合わせることによるプラスミドｐＲＩＴ１０７６４お
よびｐＲＩ　Ｔ　ｌ　０７６５の調製ｐＲＩＴ１０７６
１およびｐＲＩ　Ｔ　１０７５９を別々にＰｓｔＩおよ
びＢａｍＨＩで消化してｐＢＲ３２２レプリコン部分を
破壊し、ついでＨｉｎｄ［［で消化して挿入されたＨＢ
Ｖ　　ＤＮＡおよび調節域を担持するＤＮＡフラグメン
トを遊離させる。該ＤＮＡをフェノールで抽出し、エタ
ノールで沈澱させ、０．０１ＭトロメタミンーＭＣＩお
よび０゜００１Ｍ　　ＥＤＴＡを含有する緩衝液（ｐＨ
７、５）に溶解する。各ＤＮＡ調製物の０．６μ９を前
記と同様な方法で調製されるＹＥｐｌ　３ＨｉｎｄｎＩ
のＨｉｎｄｌ消化、アルカリ性ホスファターゼ処理ＤＮ
Ａ０．３μ２と混合し、該混合物を結紮する。

該結紮混合物をイー・コリＫ１２株ＭＭ２９４のコンピ
テント細胞の形質転換に用い、アンピシリン耐性形質転
換体を選択する。１つの形質転換体は、ｐＲＩＴ１０７
６１由来のＨｉｎｄＩＩ［フラグメントをＹＥｐｌ　３
　Ｈｉｎｄｌ［Ｉ上に挿入してなるプラスミドｐＲＩ　
Ｔ　Ｉ　０７６４を含有することが示された。また、別
の形質転換体はｐＲＩ　Ｔ　ｌ　０７５９由来Ｈ４ｎｄ
ｎＩフラグメントをＹＥｐ１３ＨｉｎｄＩＩ［上に挿入
してなるプラスミドｐＲＩ　Ｔ　Ｉ　０７５９を含有す
ることが示された。ρＲＩＴ１０７６１およびｐＲＩ　
Ｔ　ｌ　０７６４の調製フローシートを第７図に示す。

実施例１２ ｐＲＩＴ１０７６４およびｐＲＩ　Ｔ　１０７６５によ
る酵母の形質転換 ｐＲＩＴ１０７６４およびｐＲＩ　Ｔ　１０７６５を実
施例１１で調製された形質転換体の培養物よりＣｓＣｌ
−臭化エチジウム密度グレジエント遠心分離法によって
単離し、各ｌＯμ７を実施例７に記載の方法により酵母
株１ｃ１６９７ｄの細胞を形質転換するのに用い、再生
寒天培地上でロイシン非依存性形質転換体を選択する。

これらの形質転換から生ずるロイシン−非依存性コロニ
ーを菌株１ｃ１６９７ｄ（ｐＲＩＴ１０７６４）と命名
する。

もう１つの形質転換体をサッカロミセス・セレビシアエ
株１ｃｌ　６９７ｄ（ｐＲＩＴｌ　０７６５）と命名す
る。これらの菌株の培養物を、２％グルコースおよび２
０μ９／雇アルギニン補足酵母窒素基本培地中で６２０
μｍにおける光学密度が０．８０〜０，８８となるまで
増殖させる。細胞を集め、細胞不含抽出液を調製し、実
施例７に記載されるようにＡｕ５ｒｉａＯラジオイムノ
アツセイによりＨＢｓＡｇについて分析する。ｌｃｌ　
６９７ｄ（ｐＲＩ　Ｔ１０７６４）の抽出物は、ＰＢＳ
による希釈度が１／＋０２４まででもこの分析において
陽性の結果を示すが、ｌｃｌ　６９７ｄ（ｐＲＩＴｌ　
０７６５）株は非希釈抽出物でもこの分析において一様
に陰性であった。遺伝学およびラジオイムノアッセイの
結果より、サツカロミセス・セレピシアエＫｌｃｌ　６
９７ｄ（ＰＲＩＴ１０６７４）の細胞は、ヒトにおける
Ｈ　Ｂ　Ｖ感染に対する保護を重篤な副作用なしで惹起
するためのワクチンに使用できるＨＢｓＡｇを合成する
と結論される。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＲｒＴ１０６０１の制限エンドヌクレアーゼ
開裂地図、第２図はｐＲＩ　Ｔ　１０６０６の制限エン
ドヌクレアーゼ開裂地図、第３図は９ＭＣ２００の制限
エンドヌクレアーゼ開裂地図、第４図はｐＭｃ２００に
おける３　３００ｂｐ　　Ｈｉｎｄ■酵母ＤＮＡ挿入物
の一部分のヌクレオチド配列、第５図はｐＲＩＴ１０６
’７１およびｐＲＩ　Ｔ　１０６７３の製造を示すフロ
ーシート、第６図は１）ＲＩＴ１０７４９の製造を示す
フローシート、第７図はｐＲＩ　Ｔ　１０７６１および
ｐＲＩＴ１０７６４の製造を示すフローシートである。 特許出願人　スミス・クライン−アール・アイ・ティ 代　理　人　弁理士　前出　葆　ほか２名図面の浄書 第２図 ｃｏＲ ■■■■ρＡＣＹＣ１８４ ０＝＝コＨＢＶ　ＤＮＡ １面の浄書 第１図 ｃｏＲ１ 図面の浄書 第３図 口＝＝コＨＢＶ　ＤＮＡ ■■■■Ｇ）ＥＩＲ３２２ ０＝＝コ、ガｊ３ ト ← ト ← ト ド く

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＨＢｓＡｇをコードできるヌクレオチド配列およ
   び酵母において該ＨＢｓＡｇ配列の転写を行なうことの
   できる、酵母ａｒｇ３遺伝子由来の調節域からなる組換
   型ＤＮＡ分子を含有するサッカロミセス・セレビシアエ
   によって産生されたワクチン有効量のＨＢｓＡｇと適当
   な担体からなることを特徴とする重篤な副作用なしにヒ
   トにおけるＨＢＶ感染に対する保護を惹起するためのワ
   クチン。
2. （２）該ＨＢｓＡｇ配列が調節域に関して、ＨＢｓＡｇ
   配列の表現によって合成されたＨＢｓＡｇが実質的に異
   質アミノ酸残基を欠くように位置した組換型ＤＮＡ分子
   を含有するサッカロミセス・セレビシアエによって産生
   されたワクチン有効量のＨＢｓＡｇと適当な担体からな
   る前記第（１）項のワクチン。
3. （３）サッカロミセス・セレビシアエＤＣ５株または１
   ｃ１６９７ｄ株によって産生されたワクチン有効量のＨ
   ＢｓＡｇと適当な担体からなる前記第（１）項のワクチ
   ン。
4. （４）サッカロミセス・セレビシアエＤＣ５株または１
   ｃ１６９７ｄ株によって産生されたワクチンの有効量の
   ＨＢｓＡｇと適当な担体からなる前記第（２）項のワク
   チン。
5. （５）ＨＢｓＡｇ前駆体蛋白の全部または一部と融合し
   たＨＢｓＡｇポリペプチドからなるワクチン有効量のＨ
   ＢｓＡｇと適当な担体からなることを特徴とする重篤な
   副作用なしにヒトにおけるＨＢＶ感染に対する保護を惹
   起するためのワクチン。