KR20030096423A

KR20030096423A - 면역학적으로 중요한 에피토프에 상응하는 펩티드의 측정방법 및 면역학적으로 중요한 에피토프에 상응하는 항체또는 비오티닐화된 펩티드의 측정 방법에 상기 펩티드를사용하는 방법, 상기 펩티드의 제조방법 및 상기 펩티드를함유하는 조성물

Info

Publication number: KR20030096423A
Application number: KR10-1999-7012596A
Authority: KR
Inventors: 드레이즈로버트
Original assignee: 엔. 브이. 이노제네틱스 소시에떼아노님
Priority date: 1992-03-06
Filing date: 1993-03-08
Publication date: 2003-12-31
Also published as: EP0891982A2; NZ249838A; DK0891982T3; ATE364621T1; AU3746393A; AU671623B2; CA2102301C; EP0589004B2; DK0589004T3; US6165730A; JP3443809B2; KR100259223B1; EP0589004B1; ES2133392T5; DE69324751D1; GR3030595T3; JPH06505806A; SG77551A1; ES2287969T3; DE69334148D1

Abstract

본 발명의 기본적인 기술적 문제는 박테리아 단백질 및 비루스 단백질상의 면역학적으로 중요한 에피토프에 상응하는 펩티드, 또한 진단 조성물 또는 면역원성 조성물에 상기 펩티드를 이용하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 항체의 시험관내 측정 방법에 관한 것인데, 사용된 펩티드는 비오티닐화된 것이며, 구체적으로는 스트렙타비딘-비오티닐화된 펩티드 복합체 또는 아비딘-비오티닐화된 펩티드 복합체의 형태인 것이다.

Description

면역학적으로 중요한 에피토프에 상응하는 펩티드의 측정 방법 및 면역학적으로 중요한 에피토프에 상응하는 항체 또는 비오티닐화된 펩티드의 측정 방법에 상기 펩티드를 사용하는 방법, 상기 펩티드의 제조 방법 및 상기 펩티드를 함유하는 조성물{PROCESS FOR THE DETERMINATION OF PEPTIDES CORRESPONDING TO IMMUNOLOGICALLY IMPORTANT EPITOPES AND THEIR USE IN A PROCESS FOR DETERMINATION OF ANTIBODIES OR BIOTINYLATED PEPTIDES CORRESPONDING TO IMMUNOLOGICALLY IMPORTANT EPITOPES, A PROCESS FOR PREPARING THEM AND COMPOSITIONS CONTAINING THEM}

본 발명의 기본적인 기술적 문제는 박테리아 단백질 및 비루스 단백질상의 면역학적으로 중요한 에피토프에 상응하는 펩티드와, 이 펩티드를 진단 조성물 또는 면역원성 조성물에 이용하는 방법을 제공하는 것이다.

고체상 펩티드 합성 화학 뿐만 아니라 유전공학에 있어서의 최근의 발전으로 인하여 생화학 및 면역학에서 합성 펩티드의 사용이 크게 광범위해졌다. 분자 클로닝 기법의 결과로서 이용가능하게된 펩티드 서열들은 구조, 기능 및 면역학적 연구를 위해 대량으로 화학 합성될 수 있다. 비루스 단백질 및 박테리아 단백질상에서 발견되는 면역학적으로 중요한 에피토프에 상응하는 펩티드들은 또한 항체 검출 및 감염의 진단에 사용될 수 있는 고도로 특이성이 있는 시약으로 입증되었다.

합성 펩티드가 제공하는 많은 장점에도 불구하고, 그 사용과 관련된 많은 단점이 있다. 그들의 상대적으로 짧은 크기(보통 50 이하의 아미노산의 길이)로 인하여, 그 구조는 전체 길이의 단백질에 존재하는 분자내 상호 작용의 안정화 영향의 부재하에서 많은 상이한 모양으로 변동될 수 있다. 게다가, 상기 펩티드의 작은 크기는 그들의 화학적 성질 및 용해도가 빈번히 전체 길이의 단백질의 그것과 매우 상이하며, 펩티드의 전체 화학적 성질을 결정하는데 있어 펩티드 서열내 각 아미노산의 역할이 큰 비율을 차지함을 의미한다.

많은 면연학적 분석은 항체 검출에 사용되는 항원이 고체 지지체상에 고정화될 것을 요한다. 대부분의 효소 결합 면역 흡착 검사(ELISA)는 고체상으로 폴리스티렌을 이용한다. 많은 단백질이 고체상에 안정하게 흡착될 수 있고, 항체와의 후속 상호 작용에 이용될 수 있는 서열들을 제공할 수 있다. 그 작은 크기로 인하여, 고체상에의 펩티드의 직접 흡착은 빈번히 많은 이유중의 어느 것에 의해 불만족스런 결과를 일으킨다.

우선, 펩티드는 펩티드를 고체상에 결합시킬 수 있는 정확한 전체 전하 또는 아미노산 조성을 갖지 않을 수도 있다. 둘째로, 고체상에 결합시키는데 필요한 동일한 아미노산 잔기가 또한 항체 인지에 있어 필요하고, 따라서 항체 결합에 이용될 수 없을 수도 있다. 셋째, 펩티드는 고체상에 결합될 때 항체 분자를 인지할수 없는 바람직하지 못한 모양으로 고정될 수 있다. 많은 경우에, 이들 가능성을 구별하는 것은 가능하지도 필요하지도 않다. 펩티드를 큰 담체 분자에 먼저 결합시키므로써, 고체상에의 결합을 증가시킬 수 있고, 그 결합이 펩티드의 특이화학적 성질에 덜 민감하도록 할 수 있다. 통상적으로, 담체 분자는 단백질이다.

간접적이긴 해도 고체상에 결합된 펩티드의 양은 일부 경우에 상기 방법에 의해 증가될 수 있는 반면에, 이 방법은 펩티드와 담체 단백질 사이의 연결이 빈번히 항체에 의한 인지에 필수적일 수 있는 내부의 3 가 작용성 아미노산의 측쇄를 필요로 한다는 사실로부터 문제가 생긴다. 내부에서 변형된 펩티드에 대한 항혈청의 결합 활성은 빈번히 변형되지 않은 펩티드 또는 천연 단백질에 비해 상대적으로 매우 많이 감소된다.

합성 펩티드에 대한 항혈청의 생산은 또한 대부분의 경우 펩티드가 담체에 결합될 것을 요한다. 역시, 펩티드의 내부 3 가 작용성 아미노산과 담체 사이의 결합 반응이 펩티드의 면역원성을 변화시킬 수도 있다.

결합 반응을 이행하는 많은 방법들이 존재하며, 현재 사용되는 대부분의 절차들은 밴 레겔모르텔, M.H.V., 브라이언드, J.P., 뮬러, S., 및 플라우에, S. 등의 문헌[생화학과 분자 생물학의 실험 기술 제19권 항원으로서의 합성 폴리펩티드, 엘세비어 프레스, 암스테르담, 뉴욕, 옥스포드, 1988]에 상세히 논의되어 있다. 이들 절차외에도, 보호되지 않은 펩티드는 또한 상업적으로 입수 가능한 시약, 예를 들어 N-히드록시숙신이미도비오틴 또는 비오틴아미도 카프로에이트 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 사용하여 비오티닐화될 수 있다. 이들 시약중 다수가 빌링슬리, M.N., 페니패커, K.R., 후버, C.G. 및 킨케이드, R.L. 등의 생물기법 (1987) 5(1):22-31에 논의되어 있다. 비오티닐화된 펩티드는 단백질 스트렙타비딘 및 아비딘에 의해 결합될 수 있으며, 이들 두 단백질은 비오틴에 대해 극도로 높은 결합 친화성을 나타낸다.

특정 경우에, 비오틴을 보호되지 않은 펩티드에, 또는 보호되지 않은 펩티드를 담체에 선택적으로 결합시키는 것이 가능하다. 이것은 결합 반응에 참가할 수 있는 말단중의 하나에 첨가된 부가 3 가 작용성 아미노산을 가진 펩티드를 합성하므로써 수행될 수 있다. 그러나, 이 방법은 상기 아미노산이 관심의 면역원 서열에서 중요한 잔기가 아닐 때만, 그리고 선택된 결합제가 충분히 선택적일 때만 성공적일 것이다. 그 아미노산 조성과 무관하게 모든 보호되지 않은 펩티드에 작용 가능한 단일 기술은 아직 없다.

비-A 형, 비-B 형 간염의 원인이 되는 병인체가 동정되었으며, C 형 간염 비루스(hepatitis C virus:HCV)로 명명되었다. 특허 출원 EP-A-0 318 216호에는 비루스 게놈의 약 80% 에 상응하는 서열들이 개시되어 있다. 이 서열들을 이용할 수 있게 됨에 따라 암호 서열의 나머지 부분, 특히 게놈의 5' 말단에 위치한 서열을 급속히 해명할 수 있게 되었다(오가모토: J. Exp. Med. 60, 167-177, 1990). HCV 게놈은 길이 약 9400 누클레오티드의 선형의 + 가닥 RNA 분자이다. 말단의 다소 짧은 비해독 영역은 예외로 하고, 그 게놈은 약 3000 아미노산의 다수종 단백질을 암호화하는 하나의 큰 비간섭 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로 구성된다. 상기 다수종 단백질은 해독되면서 절단되어 각각의 비루스 구조 및비구조(NS) 영역으로 나뉘는 것으로 밝혀졌다. 구조 단백질 영역은 추가로 캡시드(코어) 및 외피(E1 및 E2) 단백질로 나누어진다. NS 영역은 NS-1 내지 NS-5 영역으로 나누어진다.

많은 별개의 특허 출원이 진단학적으로 중요한 아미노산 서열의 위치를 측정하기 위해 다양한 방법을 이용하였으며, 이들 연구중의 다수가 HCV 다수종 단백질의 유사한 영역들을 동정할 수 있게 하였다.

NS4 영역은 주로 EP-A-0 318 216호, EP-A-0 442 394호, US-5, 106, 726호, EP-A-0 489 986호, EP-A-0 484 787호 및 EP-A-0 445 801호에 연구되어 있다. 불행히도, 단지 70%의 HCV-감염 개체만이 NS4에 대한 항체를 생산하며, 이 영역으로부터 유래한 서열을 함유하는 합성 단백질 또는 재조합 단백질 어느 것도 모든 감염된 혈청 샘플을 동정하는 데는 불충분하다. 누클레오캡시드 또는 코어 영역은 특허 출원 EP-A-0 442 394호, US-5, 106, 726호, EP-A-0 489 986호, EP-A-0 445 801호, EP-A-0 451 891호 및 EP-A-0 479 376호에 연구되어 있다. 종종 혼합물로 사용되는 상기 펩티드는 만성적으로 감염된 개체의 혈청내 항체(85-90%)에 의해 NS4로부터 유래한 펩티드보다 빈번히 인지된다는 것을 연구하였다. NS5 영역은 특허 출원 EP-A-0 489 986호 및 EP-A-0 468 527호에 연구되어 있다. 사용된 혈청 패널에 따라, 60% 이상의 NANB형 간염이 상기 펩티드에 대한 항체를 함유하는 것을 알 수 있다. NS3 영역 역시 특허 출원 EP-A-0 468 527호에 연구되어 있다. 모든 이용 가능한 증거는 NS3 의 가장 우성인 에피토프가 본래 불연속적이며, 합성 펩티드에 의해 적절히 나타낼 수 없다는 것을 제시한다. 비루스 입자들의 외부 표면에서 유래한 영역으로 흥미를 끌 수 있는 E1 영역(가능한 면역원성 에피토프)은 특허 출원 EP-A-0 468 527호 및 EP-A-0 507 615호에 연구되어 있다. E2/NS1 영역이 E1과 동일한 이유로 연구되었다. 상이한 HCV 변형체들로부터의 이 영역의 비교로부터 이 단백질이 gp120 외피 단백질 HIV V3 루프 영역을 생각나게 하는 가변 영역을 함유한다는 것이 해명되었다. EP-A-0 468 527호에서 4개의 펩티드가 발견되었는데, 상대적으로 덜 빈번히 인지되는 에피토프를 함유하는 것으로 나타나 있다. 마지막으로, HCV의 NS2 영역은 EP-A-0 486 527호에 분석되어 있다. 그러나, 이 영역의 진단학적 가치는 아직 명확하지 않다. 항체 검출을 위한 진단학적으로 유용한 합성 펩티드에 관한 거의 모든 출원이 펩티드들의 바람직한 조합을 기술하고 있다. 어떤 경우에는, NS5(EP-A-0 489 968호 및 EP-A-0 468 527호) 및 E1 과 E2/NS1으로부터의 펩티드들이 포함된다(EP-A-0 507 615호 및 EO-A-0 468 527호).

상이한 특허 출원들이 인간 면역결핍증 비루스(HIV)의 진단학적으로 유용한 에피토프를 찾는 문제에 대해 언급하고 있다. 고리형 HIV-1 및 HIV-2 펩티드를 함유하는 중요한 면역우세 영역이 특허 출원 EP-A-0 326 490호에서 발견되어 있다. EP-A-0 379 949호에서, 이 영역은 비오틴 분자가 상기 고리형 HIV 펩티드에 결합되는 경우 HIV-특이 항체와의 반응성이 훨씬 더 큰 것으로 언급되어 있다. SU-A-161 22 64호에 또한 HIV 항체의 검출을 위한 고체상 면역 분석법에서 비오티닐화된 펩티드의 사용을 기술하고 있다.

기타 출원들이 gp120의 초가변성 V3 루프 영역에서 유용한 HIV 에피토프를 탐사해 왔다(예를 들면, EP-A-0 448 095호 및 EP-A-0 438 332호).

미국 특허 제4,833,071호는 HTLV I 항체의 검출을 위한 펩티드 조성물을 제공한다.

에피토프가 진단학적으로 유용한가 아닌가를 결정하는 것이 항상 간단한 일은 아니며, 그것이 관계된 테스트의 특이적 형상에 어느 정도 의존한다. 이상적인 면역 우세 에피토프는 큰 비율의 진정한 양성 혈청에 의해 인지되거나 또는 테스트에서 검출 비율을 증가시키기 위해 기타 항원을 보완할 수 있어야 한다. 빈번히 인지되지는 않는 에피토프가 그들이 진정한 양성 혈청내 항체의 검출 비율을 증가시키는 역할 및 이들 에피토프의 혼입이 다른 더 강력한 에피토프의 희석에 기인하여 테스트의 민감도에 악영향을 끼치는 정도에 따라 진단학적으로 유용할 수도 그렇지 않을 수도 있다.

따라서 펩티드는 감염 또는 면역화의 결과로서 생산된 항체에 의해 특이적으로 인지되는 단백질의 영역을 동정하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 따를 수 있는 2가지 전략이 있다. 이들 전략중 하나가 가이센, H.M., 멜로엔, R.H. 및 바텔링, S.J.의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984) 81: 3998-4002에 기술되어 있다. 이 방법은 비절단성 링커로 유도시킨 폴리에틸렌 막대상에 짧은 중첩 펩티드의 큰 연속체를 합성하여 관심의 단백질 또는 단백질 단편의 전체 길이가 나타나도록 하는 것이다.

상기 막대를 항혈청과 항온 처리하고, 항-면역글로불린: 효소 복합체를 사용하여 항체 결합을 검출한다. 양성 반응은 즉시 단백질 서열에 존재하는 에피토프의 위치 및 서열을 동정한다. 이 방법은 모든 펩티드가 그 카르복시-말단을 통해고체 지지체에 균일하게 연결된다는 장점을 가진다. 이 방법은 선형 에피토프의 매우 정확한 지도 작성을 허용하지만, 막대상에서 쉽게 합성될 수 있는 펩티드의 길이는 제한된다. 이것은 때때로 에피토프의 길이가 합성되는 펩티드의 길이를 초과하는 경우 문제를 일으킬 수 있다.

에피토프 지도 작성을 위한 두 번째 방법은 분석할 단백질 서열을 따라 길이가 보통 15 개 내지 30 개 아미노산으로 이루어진 보다 큰 펩티드의 합성을 필요로 한다. 연속적인 펩티드가 인접할 수 있으나 중첩되는 것이 바람직하다. 절단후, 각 펩티드에 대한 항체 결합의 평가를 사정하고, 에피토프의 대략적인 위치를 동정할 수 있다. 이 방법의 실례가 뉴라쓰, A.R., 스트릭, N. 및 리, E.S.Y.의 J. Gen. Virol. (1990) 71:85-95에 제시되어 있다. 이 방법은 천연 단백질내 상동 서열과 보다 많이 유사하고 항체 결합에 대한 보다 양호한 표적을 제공하는 보다 긴 펩티드를 합성할 수 있다는 장점을 가진다. 이 방법의 단점은 각각의 펩티드가 화학적으로 유일하고, 면역학적 평가를 위해 고체상 상에 최적 코팅될 수 있는 조건이 pH, 이온 강도 및 완충액 조성과 같은 요소들의 관점에서 매우 다양할 수 있다는 것이다. 고체상 상에 흡착될 수 있는 펩티드의 양 또한 각 펩티드에 유일한 비조절성 요소이다.

본 발명의 주목적은 면역학적으로 유용한 에피토프에 상응하며 변형되지 않은 펩티드 보다 면역학적 특성이 우수한 변형된 펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 고전적 에피토프 지도작성 기술을 통해서는 동정될 수 없었던 면역학적으로 유용한 에피토프에 상응하는 변형된 펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적중의 하나는 상기 펩티드를 사용한, 항체의 시험관내 측정 방법을 제공하는 것인데, 이 방법은 표준화를 수행하기가 용이하고 표준화에 적합한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 박테리아 및 비루스 단백질상의 면역학적으로 중요한 에피토프에 상응하는 펩티드의 측정 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법들중 어느 것에 사용된 단백질 서열을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 단백질의 에피토프의 측정 방법에 또는 항체의 시험관내 측정 방법에 사용될 수 있는 단백질 서열의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 언급한 방법에 사용되는 펩티드의 제조에 유용한 중간 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 진단 목적으로 단백질상의 면역학적으로 중요한 에피토프에 상응하는 것으로 측정되는 펩티드를 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 백신 목적으로 단백질상의 면역학적으로 중요한 에피토프에 상응하는 것으로 측정되는 펩티드를 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.

도 1a 및 도 1b는 N-α-Fmoc-라이신(N-ε-비오틴)의 합성 전략을 나타낸다.

도 2는 상기에 규정한 중간 생성물의 제조에 관계된 전구체, 및 중간 화합물의 역상 크로마토그래피에서 수득된 그림이다.

도 3a는 HCV 펩티드 II에의 항체 결합을 나타낸다(ELISA에서).

도 3b는 HCV 펩티드 XI 에의 항체 결합을 나타낸다(ELISA에서).

도 3c는 HCV 펩티드 XVI에의 항체 결합을 나타낸다(ELISA에서).

도 4는 직접 코팅된 비오티닐화된 펩티드의 검출에 해당한다(ELISA에서).

도 5는 HIV-1의 횡단막(TM) 단백질에서 기원한, N-말단이 비오티닐화된 HIV-1 펩티드 및 C-말단이 비오티닐화된 HIV-1 펩티드(상기에서 1a.1로 규정함)의 구조를 나타낸다.

도 6a는 중첩 9-머를 사용한, HCV의 코어 영역에서 코어 에피토프의 검출을 나타낸다.

도 6b는 중첩 9-머를 사용한, HCV의 NS4 영역에서 코어 에피토프의 검출을 나타낸다(ELISA에서).

도 6c는 중첩 9-머를 사용한, HCV의 NS5 영역에서 코어 에피토프의 검출을 나타낸다(ELISA에서).

도 7a는 중첩 9-머와 관련하여 비오티닐화된 20-머의 위치에 해당한다(ELISA에서).

도 7b는 중첩 9-머와 관련하여 비오티닐화된 20-머의 위치에 해당한다(ELISA에서).

제 7c는 중첩 9-머와 관련하여 비오티닐화된 20-머의 위치에 해당한다(ELISA에서).

도 8은 비오티닐화된 HCV 펩티드 및 비오티닐화되지 않은 HCV 펩티드의 항체 인지의 선 면역분석(LIA)에 의한 비교를 나타낸다.

도 9는 비오티닐화된 코어 펩티드의 항체 인지의 선 면역분석(LIA)에 의한 비교를 나타낸다.

도 10은 선 면역분석(LIA)에 의한 타입-특이성 HCV NS4 펩티드의 평가를 나타낸다.

도 11은 펩티드 NS4-a 내지 NS4-e의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 12는 혼성체 HCV 펩티드의 조성을 나타낸다.

도 13은 혼성체 HCV 펩티드의 항체 인지를 나타낸다.

도 14는 HCV 타입 1의 E2/NS1의 N-말단의 믹소토프 펩티드에 대한 제조 도식을 나타낸다.

도 15는 믹소토프 합성 전략을 나타낸다.

도 16은 다수 항원 펩티드(multiple antigen peptides:MAPs)의 합성을 나타낸다.

도 17은 E2/NS1 "b" 펩티드 MAPs로 면역화시킨 토끼의 혈청에 의한 E2/NS1 펩티드의 인지를 나타낸다.

도 18은 LIA 스트립내로 혼입된 다수의 비오티닐화된 HTLV-1 및 HTLV-II 펩티드에 의한 상업적으로 입수 가능한 혈철 패널의 인지를 나타낸다.

(1) 본 발명에 따라, HCV, HIV, HTLV-I 또는 HTLV-II, 또는 이들의 조합에 대한 항체의 검출에 유용한 펩티드 조성물은 (A)-(B)-(X)-Y[아미노산]n-Y-(X)-Z의 구조를 가지며 면역학적으로 중요한 에피토프에 상응하는 펩티드를 포함한다. 상기 구조에서, [아미노산]n은 펩티드쇄의 길이를 의미하는데, n은 잔기수로서, 약 4 내지 약 50의 정수이며, 바람직하게는 약 35 이하의 정수이며, 보다 바람직하게는 약 30 이하의 정수이며, 유리하게는 약 4 내지 약 25의 정수이고;

B는 비오틴을 나타내고;

X는 합성 공정 동안 결합되는 비오티닐화된 화합물을 나타내고;

Y는 공유 결합을 나타내거나 또는 비오티닐 부위 B 또는 X로부터 적합한 펩티드의 아미노산을 분리하는 링커 아암을 단독으로 또는 함께 형성하는 하나 이상의 화학적 실체를 나타내며, 이것의 기능은 비오티닐 부위 B 또는 X가 아비딘 또는 스트렙타비딘에 결합하는 것을 간섭할 수 있는 입체적 방해 작용을 최소화하는 것이며, Y가 공유 결합이 아닌 경우, 그것은 하나 이상의 화학적 실체인 것이 유리하며, 30개 만큼의 화학적 실체로 구성될 수도 있으나, 가장 빈번하게는 1 내지 10개의 화학적 실체로 구성될 수 있는데, 이들은 동일하거나 상이할 수 있는 것으로서 보다 바람직하게는 글리신 잔기, β-알라닌, 4-아미노부티르산, 5-아미노 발레리안산, 또는 6-아미노헥산산이고;

괄호를 친 B 및 X는 이 위치에서 비오틴 또는 비오티닐화된 화합물의 존재가 임의적임을 나타내며, 유일한 조건은 B 또는 X가 표시된 위치들중 적어도 하나에 존재한다는 것이고;

괄호로 나타낸 A는 그것이 존재한다면, 아미노산, 아미노기, 또는 펩티드쇄의 아미노 말단의 화학적 변형체를 나타내며;

Z는 아미노산, OH-기, NH₂-기, 또는 이들 두 화학기중 어느 하나에 관련된 연결체를 나타내며, 여기서 아미노산은 큰 비율의 진정한 양성 혈청에 의해 인지되거나 또는 테스트에서 다른 항원을 보충하여 검출률을 증가시키는 면역 우세 에피토프인 것이 선택되며, B는 선택된 아미노산과 상호 작용하여 보다 큰 진단 감도를 가진 화합물을 생산한다.

펩티드 조성물은 하기의 서열들로부터 선택되는 하나 이상의 비오티닐화된 펩티드를 포함하며, 바람직하게는 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 비오티닐화된 펩티드의 조합을 포함한다.

1.인간 면역결핍증 비루스 타입 1 외피 펩티드

이들 상기 언급한 비오티닐화된 펩티드가 합성되었고, 이들은 감염된 인간 또는 영장류의 항혈청에 의해 특이적으로 인지되는 것으로 밝혀졌고, 특히 유리한 것으로 생각된다. 이들 상기 언급한 모든 펩티드는 신규한 것이다.

본 발명의 방법은 상기 HIV 펩티드의 항원성을 증가시킬 수 있으며, 그러나, 상기 펩티드는 그들이 비오티닐화되지 않을 때조차도 지지체에 결합될 수 있다.

후속 HCV 펩티드 서열은 특히 유리한 것으로 생각되는 것으로서, 감염된 인간 또는 영장류의 항혈청에 의해 특이적으로 인지되는 것으로 밝혀졌다. 비오티닐화되지 않은 아미노산 서열은 고전적인 방법에 따라 합성할 수 있다.

관심의 펩티드는 HCV가 암호화하는 단백질 또는 단백질 영역을 면역학적으로 모방할 것으로 의도한다. 서열 가변성이 HCV에 대해 관찰되었기 때문에, 상이한균주의 에피토프를 보다 잘 모방하도록 하나 이상의 아미노산을 변화시키는 것이 바람직하다. 문제의 화합물이 하나 이상의 HCV 균주와의 면역학적 경쟁력을 제공할 수 있는 한, 상술한 펩티드가 어떤 특정 HCV 서열과 동일할 필요는 없다는 것을 이해하여야 한다. 그러므로 펩티드는 삽입, 결실 및 보존적 아미노산 치환 또는 비보존적 아미노산 치환에 적용시킬 수 있으며, 상기 변화는 그 이용에 특별한 이점을 제공할 수 있다. 펩티드는 가능한한 짧지만, 보다 큰 서열의 민감도를 여전히 전부 유지하는 것이 바람직하다. 어떤 경우에는, 2 이상의 펩티드를 함께 하나의 구조속으로 결합시키는 것이 바람직할 것이다. 그러한 복합체의 형성은 공유적 연결 또는 비공유적 연결을 요한다.

특히 관심을 끄는 것은 펩티드의 고리화에 사용될 수 있는 메르캡토기를 제공할 목적으로 시스테인, 티오글리콜산 또는 기타 티올-함유 화합물이 펩티드 쇄속에 혼입된 HCV의 비오티닐화된 펩티드이다.

HCV의 코어 영역의 하기 펩티드가 면역학적으로 중요한 에피토프에 상응하는 것으로 측정되었다.

1.펩티드 I 또는 코어 1(아미노산 1-20개)은 하기 아미노산 서열을 가진다:

HCV의 NS4 영역의 하기 펩티드들이 면역학적으로 중요한 에피토프에 상으하는 것으로 밝혀졌다.

펩티드 VIII 또는 NS4-1 또는 HCV1(아미노산 1688-1707)은 하기 서열을 가진다.

상기 언급한 서열들은 HCV 타입-1 분리체 HCV-1(츄등의 Proc; Natl. Acad. Sci. 88, 2451-2455, 1991) 및 HC-J1(오카모토등의 Jap. J. Exp. Med. 60, 167-177, 1990)에 위치한 에피토프에 상응한다. 그러나, 상기 언급한 면역학적으로 중요한 영역에 상응하는 다른 타입-1 HCV 분리체 서열로부터 유래한 펩티드 역시 본 발명에 따른 조성물에 포함될 수 있음을 이해하여야 한다. 또한 본 발명의 범위내에 속하는 변형체 HCV 서열의 실례가 HCV-J 분리체로부터 유래될 수 있다(카토 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 9524-9528).

하기 펩티드들이 타입 2 HCV 서열로부터 상기 인용된 펩티드 영역과 동일한 영역으로부터 유도된다.

상기 언급한 서열들은 HCV 타입-2 분리체 HC-J6 서열(오카모토 등의 J. Gen. Virology 72, 2697-2704, 1991)에 위치한 에피토프에 상응한다. 그러나, 상기 언급한 면역학적으로 중요한 영역에 상응하는 다른 타입-2 HCV 분리체 서열로부터 유래한 펩티드 역시 본 발명에 따른 조성물에 포함될 수 있음을 이해하여야 한다. 또한 본 발명의 범위내에 속하는 변형체 서열의 실례가 HCV 분리체 HC-J8로부터 유도될 수 있다(오카모토 등의 Virology 188, 331-341, 1992).

HCV 타입 3의 NS4 영역에서 유래한 하기 펩티드들 역시 본 발명에 따른 바람직한 펩티드이다:

HCV 타입-1 및 타입-2에 대해 측정되는 것과 같이 면역학적으로 중요한 영역에 상응하는 HCV 타입-3 분리체 서열에 상응하는 기타 펩티드 역시 본 발명에 따른 조성물에 포함될 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명에 따른 조성물은 또한 Gly 잔기, Ser 잔기 또는 그 둘다에 의해 분리된 HCV 코어(표 9) 영역 또는 HCV NS4 (표 10) 영역 또는 HCV NS5 (표 11) 영역의 코어 에피토프들의 조합으로 구성되는 혼성체 HCV 펩티드 서열을 포함할 수도있으며, 바람직하게는 하기의 혼성체 HCV 서열을 포함할 수 있다:

본 발명에 따른 조성물은 또한 자연 발생 분리체에서 발견되는 모든 아미노산을 각 위치에 함유하는 펩티드들로 구성되는 소위 비오티닐화된 믹소토프 서열을 포함할 수 있으며, 상기 펩티드는 상기 언급한 면역학적으로 중요한 영역의 어느 것으로부터 유래된다(도 14 참조).

(2) C형 간염 비루스, 인간 면역결핍증 비루스 타입 1 및 인간 면역결핍증 비루스 타입 2를 검출하거나 그들에 대해 면역화하거나 또는 그 둘다를 위한 비오티닐화된 펩티드의 바람직한 혼합물은 하기 A 및 B로 구성된다:

(3) 인간 면역결핍증 비루스 타입 1과 2 및 인간 림프친화성 비루스 타입 I과 II를 검출하거나 그들에 대해 면역화하거나 또는 그 둘다를 위한 비오티닐화된 펩티드의 바람직한 혼합물은 하기 펩티드들로 구성된다:

(4) C형 간염 비루스, 인간 면역결핍증 비루스 타입 1과 2 및 인간 림프친화성 비루스 타입 I과 II를 검출하거나 그들에 대해 면역화하거나 또는 그 둘다를 위한 비오티닐화된 또 다른 바람직한 혼합물은 하기 펩티드들로 구성된다:

(5) 본 발명은 또한 C형 간염 비루스에 대한 면역원의 목적과 진단 목적으로, 특히 유리한 것으로 생각되는 비오티닐화된 펩티드의 조성물에 관한 것이며, 유리하게는 하기 혼합물이 있다:

(6) 본 발명은 또한 인간 면역결핍증 비루스에 대한 면역원의 목적과 진단 목적으로, 특히 유리한 것으로 생각되는 비오티닐화된 펩티드의 조성물에 관한 것이며, 하기 혼합물로부터 선택되는 것이 유리하다:

타입 2에 대해서는:

A.2b, 2c, 2d, 2e.

타입 1 및 2에 대해서는:

A.1a.3, 1a.4, 1b.1, 2b, 2c, 2d,

B.1a.3, 1a.4, 1b.1a, 2b, 2d.

(7) 본 발명은 또한 인간 T-세포 림프 친화성 비루스에 대한 면역원 목적과 진단 목적으로, 특히 유리한 것으로 생각되는 비오티닐화된 펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 하기 혼합물로부터 선택되는 것이 유리하다:

인간 T-림프 친화성 비루스 타입 I에 대해서는:

펩티드I-gp46-3, I-gp46-4, I-gp46-5,

I-gp46-6, I-p21-2, I-p19

인간 T-림프 친화성 비루스 타입 II에 대해서는:

펩티드 II-gp52-1, II-gp52-2, II-gp52-3,

I-gp46-4, II-p19, I-p21-2.

인간 림프 친화성 비루스 타입 I 및 II에 대해서는:

펩티드 I-gp46-3, I-gp46-4, I-gp46-5, I-gp46-6,

II-gp52-1, II-gp52-2, II-gp52-3, I-p21-2,

I-p19, II-p19.

펩티드 합성은 용액내에서 또는 고체 지지체상에서 달성될 수 있다. 합성 프로토콜은 일반적으로 t-부틸옥시카르보닐-보호된 활성화된 아미노산 또는 9-플루오레닐메톡시카르보닐-보호된 활성화된 아미노산을 이용한다. 합성을 실시하는 절차, 아미노산 활성화 기술, 측쇄 생산 유형 및 사용된 절단 절차는 예를 들면 스튜어트 및 영의 문헌[고체상 펩티드 합성, 제2판, 피어스 케미칼 컴퍼니, 1984]; 및 아더톤 및 쉐퍼드의 문헌[고체상 펩티드 합성, IRl 프레스, 1989]에 광범위하게 기술되어 있다.

(8) 본 발명은 또한 상기에 정의된 비오티닐화된 펩티드를 사용한, 항체의 시험관내 측정 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 비오티닐화된 펩티드는 스트렙타비딘-비오티닐화된 펩티드 복합체 또는 아비딘-비오티닐화된 펩티드 복합체의 형태인 것이 바람직하다.

스트렙타비딘-비오티닐화된 펩티드 또는 아비딘-비오티닐화된 펩티드의 복합체에서, 펩티드는 N-말단, C-말단 또는 내부에서 비오티닐화될 수 있다.

항체 측정을 위한 상기 방법은 펩티드 길이와 관련하여 제한되지는 않으며, 면역학적 평가를 위해 고체상상에 펩티드를 직접 코팅할 때 고유한 난점을 피한다.

본 발명의 방법에서 비오티닐화된 펩티드의 사용은 펩티드를 고체 지지체에 결합시켜 지지체가 상기 펩티드의 필수 아미노산을 항체에 의해 인지되도록 유리 상태로 유지되게 한다.

펩티드를 고체 지지체에 결합시킨다는 표현은 펩티드가 고정되도록 공유 결합 또는 비공유 상호 작용을 통해 펩티드를 지지체에 부착시킴을 의미한다.

고체 지지체는 니트로셀룰로우즈, 폴리스티렌, 나일론 또는 임의의 다른 천연 또는 합성 중합체일 수 있다.

"상기 펩티드의 필수 아미노산이 항체에 의해 인지되도록 유리 상태로 유지된다"는 표현은 적합한 펩티드의 아미노산 측쇄가 어떤 식으로든 화학적으로 변형되지도 않고, 펩티드와 고체상 사이의 상호 작용에 관계하지도 않는다는 것을 의미한다.

본 발명의 방법에 비오티닐화된 펩티드의 사용은 상기 비오티닐화된 펩티드가 다양한 범위의 모양을 취하여 그 중 적어도 하나의 모양이 상기 비오티닐화된 펩티드에 항체가 결합하기 적합하도록 상기 펩티드를 유리 상태로 만들 수 있다.

본 발명의 방법에 사용하기 위하여 임의의 비오티닐화된 펩티드를 선택할 수 있다. 그러나, 이들 중 일부는 고체 지지체에 결합될 수 있으며, 비오티닐화 되지 않고 스트렙타비딘의 아비딘 복합체에 관계되지 않은 상기 펩티드내 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체와 반응할 수 있다. 이 경우, 비오티닐화된 펩티드의 사용은 펩티드가 비오티닐화되지 않을 때 관찰된 항원성과 관련하여 펩티드의 항원성의 외관상 증가를 초래한다. "외관상"이란 표현은 관찰된 변화의 절대적인 원인과 관계없이 유사한 테스트 조건하에서 얻어진 관찰된 변화를 의미한다.

"항원성"이란 펩티드가 항체와 결합하는 성질을 의미한다.

"항원성의 증가"란 비오티닐화되지 않은 펩티드의 2배 이상의 희석률의 희석에 대해 양성 신호가 얻어짐을 의미한다. 상기 양성 신호는 비오티닐화되지 않은 펩티드에 대해 얻어지는 것과 동일한 크기이다.

달리 말하면, 비오티닐화되지 않은 펩티드의 양과 비교하여 보다 소량의 비오티닐화된 펩티드에 대해 양성 신호를 얻을 수 있다.

본 발명은 또한 단백질 서열내 에피토프의 동정 방법을 예시하며, 그 방법은 하기 단계를 포함한다:

- 분석할 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열의 일부에 해당하는 펩티드의 제조 단계에서, 상기 펩티드들은 인접한 것이거나 또는 바람직하게는 서로 중첩된 것이며, 중첩의 양은 3개 이상의 아미노산, 그리고 바람직하게는 약 6 내지 약 12개의 아미노산이며, 펩티드의 길이는 약 5 이상이고 50 이하의 아미노산, 바람직하게는 약 40 이하의 아미노산 및 보다 바람직하게는 9 내지 약 30개 아미노산이며, 상기 펩티드는 비오티닐화된 것이 특징인 단계;

- 비오티닐기와 스트렙타비딘 또는 아비딘 사이의 상호 작용을 통해 고체상에 펩티드를 결합시키고, 고전적 방법을 사용하여 개개의 펩티드에 대한 항체 결합을 측정하는 단계;

(9) 본 발명은 또한 면역 분석 절차에서 상기에 규정된 펩티드 조성물을 사용한, HIV에 대한 항체의 시험관내 측정 방법 또는 HIV 감염의 진단 방법에 관한 것이며, 여기서 사용된 비오티닐화된 펩티드는 스트렙타비딘-비오티닐화된 펩티드의 복합체 형태 또는 아비딘-비오티닐화된 펩티드의 복합체 형태이다.

(10) 본 발명은 또한 면역 분석 절차에서 상기에 규정된 펩티드 조성물을 사용한 HCV에 대한 항체의 시험관내 측정 방법 또는 HCV 감염의 진단 방법에 관한 것이며, 여기서 사용된 비오티닐화된 펩티드는 스트렙타비딘-비오티닐화된 펩티드의 복합체 형태 또는 아비딘-비오티닐화된 펩티드의 복합체 형태이다.

(11) 본 발명은 또한 면역 분석 절차에서 상기에 규정된 펩티드 조성물을 사용한 HTLV I 또는 II에 대한 항체의 시험관내 측정 방법 또는 HTLV I 또는 II 감염의 진단 방법에 관한 것이며, 여기서 사용된 비오티닐화된 펩티드는 스트렙타비딘-비오티닐화된 펩티드의 복합체 형태 또는 아비딘-비오티닐화된 펩티드의 복합체 형태이다.

항체의 시험관내 측정을 실시하는 바람직한 방법은 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)이다. 이 분석은 통상 폴리스티렌 미세적정 판 또는 비이드인 고체상을 이용한다. 그러나, 고체상은 공유적 연결을 통해 화학적으로 또는 수동 흡착에 의해 단백질을 결합시킬 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 이 점에서, 나일론계 막이 또한 특히 유리한 것으로 생각된다. 고체상을 스트렙타비딘 또는 아비딘으로 코팅하고, 적절한 시간 후에, 과량의 결합되지 않은 단백질을 세척에 의해 제거한다. 고체 지지체상의 점유되지 않은 결합 부위는 소 혈청 알부민 또는 카제인과 같은 무관한 단백질로 차단한다.

비오티닐화된 펩티드의 혼합물 또는 선별체를 함유하는 용액을 계속해서 스트렙타비딘 코팅된 표면 또는 아비딘 코팅된 표면과 접촉시켜 결합하게 한다. 결합되지 않은 펩티드를 세척에 의해 제거한다. 대안적으로는, 비오티닐화된 펩티드가 아비딘 또는 스트렙타비딘과 복합체를 형성하도록 한다. 생성된 복합체를 고체상을코팅하는데 사용한다. 적절한 항온처리 기간 후, 결합되지 않은 복합체를 세척에 의해 제거한다. 항혈청 또는 기타 체액의 적절한 희석액을 펩티드가 결합된 고체상과 접촉시킨다. 결합 반응이 일어나게 하는 데 필요한 시간 동안 항온처리를 수행한다. 이어서, 결합되지 않은 성분을 고체상을 세척하므로써 제거한다. 테스트 혈청에 존재하는 항체에 특이적으로 결합하고, 효소와 복합체를 형성한 이종 항체를 사용하여 면역 복합체의 검출을 수행하는데, 상기 효소로 바람직한 것은 양고추냉이 퍼록시다제, 알칼리 포스파타제, 또는 β-갈락토시다제인 데, 이들에 제한되는 것은 아니며, 상기 효소는 무색 또는 거의 무색의 기질 또는 공기질을 시각적으로 감지되거나 분광계로 측정될 수 있는 색원체와 유색 복합체를 형성할 수 있는 생성물 또는 고 유색성 생성물로 전환시킬 수 있다.

그러나 당 분야에서 공지된 기타 검출 시스템을 이용할 수 있으며, 형성된 생성물의 양을 전기화학적으로 또는 광도계로 측정할 수 있는 시스템이 있다. 검출 시스템은 또한 방사성 표지된 항체를 이용할 수 있는데, 이 경우 면역 복합체의 양은 섬광 계수법 또는 계수법에 의해 정량 분석된다. 원칙적으로, 항체의 검출을 위한 어떠한 유형의 면역학적 테스트도 사용할 수 있는데, 스트렙타비딘 또는 아비딘과 상술한 대로 합성된 비오티닐화된 펩티드 사이의 복합체를 이용하는 경우에 그러하다.

또한 용액내 스트렙타비딘- 또는 아비딘- 비오티닐화된 펩티드 복합체가 항체 결합에 대해 고체상 결합된 항원과 경쟁하도록 하는 경쟁 분석법이 있으며, 또는 용액내 유리 펩티드가 고체상-결합된 스트렙타비딘 또는 아비딘:비오티닐화된펩티드 복합체와 경쟁하도록 하는 분석법이 있다. 실례로, 항체 및 항원의 검출 및 정량 분석을 위한 면역학적 분석의 많은 유형이 상세히 논의되어 있다(티젠, P. 의 효소 면역 분석의 이론과 실제, 엘세비어 프레스, 암스테르담, 옥스퍼드 뉴욕, 1985).

면역학적 분석은 단일의 비오티닐화된 펩티드에 한정될 수 있다. 그러나, 비오티닐화된 펩티드의 혼합물을 사용하는 것이 바람직한데, 이 혼합물은 특이 항체의 존재를 측정할 감염원에서 유래한 하나 이상의 에피토프를 포함한다.

항체 검출의 시험관내 측정을 수행하는 또 다른 바람직한 방법은 선 면역 분석(line immunoassay:LIA) 이다.

이 항체 검출 방법은 본질적으로 하기 단계로 구성된다:

- 테스트하거나 사용할 비오티닐화된 펩티드: 스트렙타비딘 또는 아비딘 복합체 형태의 항원을, 테스트할 항원에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합할 수 있는 막상에 평행선으로 적용하는 단계,

- 막상의 점유되지 않은 결합 부위를 카제인 또는 소 혈청 알부민과 같은 무관한 단백질로 차단하는 단계,

- 항원(비오티닐화된 펩티드)의 선이 적용되는 방향과 수직 방향으로 막을 스트립으로 절단하는 단계,

- 항혈청 또는 기타 체액(검출할 항체를 함유함)의 적절한 희석액을 항원이 결합된 스트립과 접촉시켜 결합 반응이 일어나기에 충분한 시간 동안 항온처리하는 단계,

- 스트립을 세척하므로써 결합되지 않은 성분을 제거하는 단계,

- 테스트 혈청내 항체에 특이적으로 결합하고, 양고추냉이 퍼록시다제와 같은 효소와 복합체를 형성한 이종 항체와 함께 상기 스트립을 항온처리하므로써 면역 복합체의 검출을 수행하는 단계,

- 결합이 일어나기에 충분한 시간 동안 항온처리를 수행하는 단계,

- 상기 효소의 작용에 의해 유색 생성물로 전환되는 필요한 기질 또는 공기질의 첨가에 의해 결합된 복합체의 존재를 검출하는 단계,

- 반응을 시각적으로 확인하거나 또는 밀도계로 정량 분석하는 단계.

(12) 실시예 부분에서 입증되는 바와 같이, 본 발명은 또한 상기에 규정한 펩티드 조성물을 HIV, HCV, HTLV I 또는 HTLV II, 또는 이들의 조합 감염에 대해 면역화하는데에 사용하는 방법에 관한 것이다.

(13) 본 발명은 또한 본 발명에 사용된 비오티닐화된 펩티드의 제조 방법에 관한 것으로서, N-α-Fmoc-X(N-y-비오틴) 또는 N-α-Fmoc-X(N-y-비오틴) 유도체; 또는 알코올 ROH로 얻어진 그들의 에스테르 및 보다 구체적으로는 펜타플루오로페닐 에스테르의 사용을 요한다. 이때, X는 하기 식으로 표시된다:

상기 식에서,

n은 1 이상 10 이하이며, 2 내지 6이 바람직하고, 하나의 아미노기가 C_α원자에 부착되고, 다른 하나의 아미노기는 측쇄의 최말단 탄소인 Cy탄소에 부착되며;

- y는 라디칼내 COOH 기를 보유하는 탄소 원자와 관련하여 위치 y를 나타낸다.

이 비오틴 유도체는 중간 생성물로 불릴 수 있으며, 상기에 규정한 중간 생성물은 본 발명의 방법에 따라 측정되는 신규 화합물이다.

(14) 본 발명의 화합물을 제조하는 데 유용한 방법에서, 중간 생성물은 하기 식중 하나로 나타낼 수 있다:

N-α-Fmoc-X(N-y-비오틴)은 N-α-Fmoc-라이신(ε-비오틴) 또는 N-α-Fmoc-오르니틴(N-δ-비오틴)이다.

(15) N-말단이 비오티닐화된 펩티드는 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 제조될 수 있다.:

- 수지상에 적당히 보호시킨 연속적인 아미노산을 첨가하여 Fmoc-AA_n… AA₁- 수지를 제공하는 단계,

- 예를 들면 피페리딘에 의해 NH₂-말단을 탈보호시키는 단계,

- 중간 생성물을 그 COOH를 통해 NH₂-말단에 첨가하여수지를 제공하는 단계,

- 수득된 화합물의 NH₂-말단기를 탈보호시키는 단계, 수지로부터 절단하는 단계, 추출하는 단계, 그 아미노 말단에 비오티닐화된 수득된 펩티드를 정제하는단계,

측쇄 탈보호 및 펩티드 절단 단계들은 동시에 또는 따로따로 실행할 수 있으며, 구체적으로

- 예를 들면 피페리딘에 의해 중간 물질기의 NH₂-말단기를 탈보호시키는 단계,

- 에탄디티올, 티오아니솔 또는 아니솔 같은 스캐빈저의 존재하에 예를 들면, 트리플루오로아세트산과 같은 산으로 수지로부터 절단하는 단계,

- 디에틸에테르 같은 용매로 펩티드를 추출하여 대부분의 상기 산 및 스캐빈저를 제거하는 단계,

- 예를 들어 HPLC로 정제하여을 수득하는 단계.

비오틴은 역시 통상의 활성화 방법을 사용하여 다른 쪽의 완전히 보호된 펩티드쇄의 유리 아미노 말단에 편리하게 결합시킬 수 있다. 비오틴은 하나의 카르복실을 보유하며 아미노기는 없기 때문에, 비오틴은 본질적으로 쇄 종결인자로 기능한다. 인 시추 활성화를 위한 바람직한 활성화제로는 벤조 트리아졸-1-일-옥시-트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP), O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU) 및 O-(1H-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 테트라플루오로 보레이트(TBTU)가 있으며, 이들에 국한되는 것은 아니다. 이들 및 관련 화합물을 이용한 활성화 절차가 고체상 합성 분야에 숙달된 사람들에게는 공지되어 있으며,비오틴의 결합이 표준 결합 프로토콜로부터 상당한 이탈을 가져오지는 않는다.

비오틴은 또한 사전-활성화된 형태로 사용될 수 있다. N-히드록시 숙신이미도비오틴 또는 비오틴아미도카프로에이트 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 이용하는 것이 편리하며, 둘다 상업적으로 입수 가능하다. 이 결합 방법은 로블, T.J.,다이벨, M.R., 및 옘, A.W.의 Anal.Biochem.(1988) 170(2):502-511에 기술되어 있다. N-말단 비오틴의 첨가후, 펩티드를 스캐빈저의 존재하에 수지로부터 절단하는데, 스캐빈저의 선택은 펩티드 아미노산 조성 및 사용된 보호기의 성질에 관한 통상의 고찰에 의존된다.

(16) 본 발명의 방법에 관련된 카르복시 말단 비오티닐화된 펩티드는 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 제조할 수 있다.

- 상기에 규정한 중간 생성물의 카르복시-활성화된 형태를 수지에 부착된 절단 가능한 링커에 결합시켜 예를 들어 화합물수지를 수득하는 단계,

- 중간 화합물의 α아미노기를 예를 들어 피페리딘에 의해 탈보호시켜수지를 수득하는 단계,

- 적절히 보호된 연속 아미노산 AA₁…AAn을수지상에 계속 첨가하여를 수득하는 단계,

- NH₂-말단을 예를 들어 피페리딘에 의해 탈보호시키는 단계,

- 수득된 화합물을 탈보호시키는 단계, 수지로부터 절단하는 단계, 추출하는 단계 및 그 카르복시 말단에 비오티닐화된 수득된 펩티드를 정제하는 단계,

-NH₂-말단을 예를 들어 피페리딘에 의해 탈보호시키는 단계,

- 에탄디티올, 티오아니솔 또는 아니솔 같은 스캐빈저의 존재하에 예를 들어 트리플루오로아세트산으로 수지로부터 절단하는 단계,

- 디에틸에테르와 같은 용매로 펩티드를 추출하여 대부분의 상기 산 및 스캐빈저를 제거하는 단계,

- 예를 들어 HPLC로 정제하여를 수득하는 단계.

(17) 내부에서 비오티닐화된 펩티드를 하기 단계들을 포함하는 방법에 따라 제조할 수 있다:

- 적절히 보호된 연속 아미노산을 수지상에 첨가하여 Fmoc-AA_n…AA₁-수지를 제공하는 단계,

- NH₂- 말단을 탈보호시키는 단계,

- 중간 생성물을 그 COOH를 통해 NH₂- 말단상에 첨가하여수지를 수득하는 단계,

- 중간 화합물의 α 아미노기를 예를 들어 피페리딘에 의해 탈보호시켜수지를 수득하는 단계,

-적절히 보호된 연속 아미노산을 상기 수지상에 첨가하여수지를 수득하는 단계,

- 수득된 화합물의 NH₂- 말단기를 탈보호시키는 단계, 수지로부터 절단하는 단계, 추출하는 단계 및 그 아미노 말단에 비오티닐화된 수득된 펩티드를 정제하는 단계,

- NH₂- 말단을 예를 들어 피페리딘에 의해 탈보호시키는 단계,

- 예를 들어 HPLC로 정제하여을 수득하는 단계.

특정 상황하에서는, 펩티드를 내부에서 또는 그 카르복시-말단에서 비오티닐화할 수 있는 것이 특히 유용할 수 있다. 그러한 예는 펩티드의 아미노산 서열이 단백질의 아미노-말단 서열에 상응하는 경우에 생긴다. 비오틴을 상기 펩티드의 아미노 말단에 부착시키면, 천연 단백질에서 발견되는 것과 상당히 다른 구조가 되며, 결과로서 펩티드의 생화학적 성질중의 결합 성질에 악영향을 줄 수 있는 구조가 유발된다. 내부 단백질 서열에 상응하는 펩티드에 대해서조차 결합 단백질 또는 면역 글로불린에 의한 상기 펩티드의 인지가 펩티드의 말단 및 결합에 제공되는 방식에 의존될 수 있다. 펩티드 배향의 중요성은 디어버그, T. 및 올드스톤, M.B.A.의 J.Exp.Med.(1986) 164:1344-1349에 기술되어 있다.

비오티닐 부위를 펩티드 속으로 임의의 위치에 그리고 서열 비의존적 방식으로 혼입시키기 위하여, 종래의 절차를 사용하여 결합시킬 수 있는 적합한 시약을 합성하기 위한 노력이 만들어졌다. C-말단 또는 내부 비오티닐화를 위한 편리한 시약은 N-ε-비오티닐-라이신이다. 상기 화합물의 α-아미노기가 적절히 보호되면(Fmoc 및 tBoc), 상기 시약이 펩티드 쇄내 어딘가에, 예를 들어 아미노 말단에 고체상 펩티드 합성에서 사용되는 표준 절차에 의해 비오틴을 도입하는 데 사용될 수 있다. t-Boc-보호된 유도체의 합성은 문헌(보댄스키, M. 및 페이건, DT.의 J.Am.Chem.Soc.(1977) 99:235-239)에 기술되어 있으며, 특정 트랜스카르복실라제의 효소 활성의 연구에 사용되는 짧은 펩티드를 합성하는데 사용되었다.

t-Boc 유도체와 달리, N-α-Fmoc-Lys(N-ε-비오틴)의 합성은 문헌에 기술되어 있지 않으며, Fmoc계 합성 전략에의 관심이 증가하였으며, 이 화합물이 특히 유용한 것으로 생각된다.

원하는 Fmoc-보호된 화합물에 이르기 위해 취할 수 있는 다수의 가능한 경로가 있다. 첫 번째 방법에서는, 상업적으로 입수 가능한 N-α-Fmoc-Lys(N-ε-tBoc)가 출발 물질로 사용될 수 있다. N-ε-tBoc 보호는 트리플루오로 아세트산, 및 물과 같은 스캐빈저를 사용하여 제거된다. 그렇게 얻어진 다소 몰 과량의 N-α-Fmoc-Lys을 카르복시-활성화된 비오틴과 반응시킨다. 생성된 생성물은 선택적 추출 및 표준 크로마토그래피 기법에 의해 쉽게 정제할 수 있다. 또 다른 방법에서는, N-α-Fmoc-Lys(N-ε-비오틴)이 상업적으로 입수 가능한 N-ε-비오티닐 라이신(비오시틴)으로부터 플루오레닐메틸숙신이미딜 카르보네이트와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 지침으로 사용될 수 있는 이들 반응의 수많은 실례는 아더톤 및 쉐퍼드의 고체상 펩티드 합성(IRL 프레스, 1989)에 제시되어 있다.

도 1a의 방법 A에 도시된 전략은 또한 상업적으로 입수 가능한 N-α-Fmoc-오르니틴(N-δ-tBoc)으로부터 N-α-Fmoc-오르니틴(N-δ-비오틴)을 합성하는데 적용될 수 있다. 오르니틴 유도체는 측쇄 길이에서만 라이신 유도체와 상이한데, 그 길이는 탄소원자 하나만큼 더 짧다. N-α-Fmoc-Lys은 유리 비오틴에 대해 기술한 인 시추 활성화에 대한 것과 동일한 시약을 사용하여 펩티드 쇄내로 편리하게 혼입시킬 수 있다.

한편, N-α-Fmoc-Lys(N-ε-비오틴)-O-펜타플루오로페닐 에스테르는 N-α-Fmoc-Lys(N-ε-비오틴) 및 펜타플루오로페닐트리플루오로아세테이트로부터, 아미노산의 O-펜타플루오로페닐 에스테르의 제조에 대해 그린, M. 및 버어먼, J. 의 Tetrahedron Lett(1990) 31:5851-5852에 기술되어 있는 염기-촉매 에스테르 전이 반응을 사용하여 편리하게 합성될 수 있다. 이 활성 에스테르는 N-α-Fmoc-Lys(N-ε-비오틴)을 펩티드 쇄내로 혼입시키는데 직접 사용될 수 있다. 상기에 규정한 중간 생성물의 부류를 하기 단계들을 포함하는 방법에 따라 제조할 수 있다:

- pH가 주의깊게 조절되는 조건하에서, 전술한 디아미노카르복실산 또는 모노카르복실산을 플루오레닐메틸숙신이미딜카르보네이트 또는 플루오레닐 메틸 클로로포르메이트와 반응시켜 단일 보호된 N-α-Fmoc 유도체를 제공하는 단계,

- 또는 선택적으로 측쇄 아미노기에 α-아미노기를 보호하는데 사용된 Fmoc 기와 상이한 보호기를 제공하고, 측쇄 아미노기의 보호가 N-α-Fmoc 기를 원래대로 유지하는 조건하에서 선택적으로 제거될 수 있는 경우에, 상업적으로 입수가능한 N-α-Fmoc-보호된 디아미노-모노카르복실산을 이용하는 단계,

- 선택적 추출 및 크로마토그래피에 의해 모노-보호된 N-α-Fmoc-디아미노-모노카르복실산을 정제하는 단계,

- 수득된 유도체를 N-히드록시숙신이미드 비오틴 같은, 비오틴의 카르복시-활성화된 유도체와 반응시켜 원하는 중간 생성물인 N-α-Fmoc-(N-y-비오틴)유도체를 수득하는 단계,

- 선택적 추출, 침전 또는 크로마토그래피에 의해 중간 생성물을 정제하는 단계.

본 발명의 방법에서 사용되는 비오티닐화된 펩티드에 링커 아암을 제공하려 할 때, 이들 화학적 실체는 표준 결합 프로토콜을 사용하여 고체상 합성 동안 펩티드 서열의 N-말단 또는 C-말단에 편리하게 부착될 수 있는데, 이들 화합물의 아미노기에 적합한 일시적 아미노기 보호가 제공되는 한 그러하다.

이들 모든 특히 비오티닐화된 펩티드는 신규하다.

도면 및 표에서 언급된 모든 샘플 및 혈청은 무작위적으로 선택된 샘플 및 혈청이며, 비루스에 의한 자연 발생 감염의 결과로 생산된 항체를 포함한다.

도 1a 및 도 1b는 N-α-Fmoc-Lys(N-ε-비오틴)의 합성 전략을 나타낸다.

보다 구체적으로:

방법 A는 N-α-Fmoc-Lys(N-ε-tBoc)로부터 N-α-Fmoc-Lys(N-ε-비오틴)의 합성에 관한 것이며, 방법 B는 N-ε-비오티닐 라이신으로부터 N-α-Fmoc-Lys(N-ε-비오틴)의 합성에 관한 것이다.

역상 크로마토그래피는 하기 조건에서 실시되었다.

- 구배 특성:

완충액 A: H₂O 내 0.1% TFA

완충액 B: 아세토니트릴내 0.1% TFA

컬럼: C2/C18 역상(파마시아, Pep-S)

검출 파장: 255 나노미터;

- 구배:

0분에서 1분까지 0% B,

1분에서 60분까지 0% B에서 100% B,

60분에서 70분까지 0% B

첫 번째 그림은 방법 A(도 1 참조)에 해당하고, 두 번째 그림은 방법 B(도1참조)에 해당한다.

도 3a는 HCV 펩티드 II에의 항체 결합을 나타낸다(ELISA에서).

위쪽 좌측 곡선은 샘플 8320에 해당한다.

위쪽 우측 곡선은 샘플 8242에 해당한다.

아래쪽 좌측 곡선은 샘플 8243에 해당한다.

아래쪽 우측 곡선은 샘플 8318에 해당한다.

이들 샘플 각각에서, 광학적 밀도(450nm에서의)는 ㎍/ml로 표현되는 코팅 농도에 대해 도시된 것이다.

+를 가진 곡선은 비오티닐화되지 않은 HCV 펩티드 II에 해당하고, 점을 가진 곡선은 비오티닐화된 HCV 펩티드 II에 해당한다.

도 3b는 HCV 펩티드 XI에의 항체 결합을 나타낸다(ELISA에서).

위쪽 좌측 곡선은 샘플 8320에 해당한다.

위쪽 우측 곡선은 샘플 8326에 해당한다.

아래쪽 좌측 곡선은 샘플 8242에 해당한다.

아래쪽 우측 곡선은 샘플 8243에 해당한다.

+를 가진 곡선은 비오티닐화되지 않은 HCV 펩티드 XI에 해당하고, 점을 가진 곡선은 비오티닐화된 HCV 펩티드 XI에 해당한다.

도 3c는 HCV 펩티드 XVI에의 항체 결합을 나타낸다(ELISA에서).

위쪽 좌측 곡선은 샘플 8326에 해당한다.

위쪽 우측 곡선은 샘플 8242에 해당한다.

아래쪽 좌측 곡선은 샘플 8243에 해당한다.

아래쪽 우측 곡선은 샘플 8318에 해당한다.

이들 샘플 각각에서, 광학적 밀도(450 nm에서의)는 ㎍/ml로 표현되는 코팅 농도에 대해 도시된 것이다.

+를 가진 곡선은 비오티닐화되지 않은 HCV 펩티드 XVI에 해당하고, 점을 가진 곡선은 비오티닐화된 HCV 펩티드 XVI에 해당한다.

첫 번째 곡선은 비오티닐화된 HCV 펩티드 II에 해당하며, 두 번째 곡선은 비오티닐화된 HCV 펩티드 XI에 해당하며, 세 번째 곡선은 비오티닐화된 HCV 펩티드 XVI에 해당한다.

도 5는 HIV-1의 횡단막(TM) 단백질에서 기원한 N-말단이 비오티닐화된 HIV-1 펩티드 및 C-말단이 비오티닐화된 HIV-1 펩티드(상기에서 1a.1로 규정함)의 구조를 나타낸다.

사용된 혈청은 각 그림 위쪽에 나타내었다.

종좌표는 450nm에서의 광학적 밀도에 해당한다.

횡좌표는 에피토프의 위치를 측정할 단백질의 서열에 해당한다. 그래프로 나타내기 위해, 광학적 밀도는 각각의 9-머 서열의 첫 번째 아미노산에 지정되었다.

사용된 혈청은 각각의 그림 위쪽에 나타내었다.

종좌표는 450nm에서의 광학적 밀도에 해당한다.

횡좌표는 에피토프의 위치를 결정할 단백질의 서열에 해당한다. 그래프로 나타내기 위해, 광학적 밀도는 각각의 9-머 서열의 첫 번째 아미노산에 지정되었다.

사용된 혈청은 각각의 그림 위쪽에 나타내었다.

종좌표는 450nm에서의 광학적 밀도에 해당한다.

횡좌표는 에피토프를 결정할 단백질의 서열에 해당한다.

도 7c는 중첩 9-머와 관련하여 비오티닐화된 20-머의 위치에 해당한다(ELISA에서).

횡좌표는 에피토프를 결정할 단백질의 서열에 해당한다.

보다 짧은 펩티드와 보다 긴 펩티드를 비교한다.

도 11은 펩티드 NS4-a 내지 NS4-e의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 12는 혼성체 HCV 펩티드의 조성을 나타낸다.

도 13은 혼성체 HCV 펩티드의 항체 인지를 나타낸다.

도 15는 믹소토프 합성 전략을 나타낸다.

도 17은 E2/NS1 "b" 펩티드 MAPs로 면역화시킨 토끼의 혈청에 의한 E2/NS1펩티드의 인지를 나타낸다.

도 18은 LIA 스트립내로 혼입된 다수의 비오티닐화된 HTLV-I 및 HTLV-II 펩티드에 의한 상업적으로 입수 가능한 혈청 패널의 인지를 나타낸다.

표 1은 ELISA에서 비오티닐화되지 않은 HIV-1 및 HIV-2 펩티드(TM-HIV-1 및 TM-HIV-2로 명명)와 비오티닐화된 HIV-1 및 HIV-2 펩티드(상기에서 1a.1 및 2a 로 언급함, 또한 TM-HIV-1 Bio 및 TM-HIV-2 Bio로 명명)의 항체 인지도를 나타낸다.

표 2는 ELISA에서 분리체 HIV-1 mn(1b.4로도 언급됨)의 V3 서열로부터 비오티닐화되지 않은 펩티드 및 비오티닐화된 펩티드의 항체 인지도의 비교를 나타낸다.

표 3은 ELISA에서 스트렙타비딘 및 아비딘에 결합된 비오티닐화된 V3-mn 펩티드(1b.4로 언급됨)의 항체 인지도의 비교를 나타낸다.

표 4a 내지 표 4g는 ELISA에서 비오티닐화된 HCV 펩티드 및 비오티닐화되지 않은 HCV 펩티드의 항체 인지도의 비교를 나타낸다.

보다 구체적으로:

표 4a는 HCV 펩티드 XI에의 항체 결합에 해당한다.

표 4b는 HCV 펩티드 XVI에의 항체 결합에 해당한다.

표 4c는 HCV 펩티드 II에의 항체 결합에 해당한다.

표 4d는 HCV 펩티드 III에의 항체 결합에 해당한다.

표 4e는 HCV 펩티드 V에의 항체 결합에 해당한다.

표 4f는 HCV 펩티드 IX에의 항체 결합에 해당한다.

표 4g는 HCV 펩티드 XVIII에의 항체 결합에 해당한다.

표 5는 ELISA에서 상이한 펩티드 코팅 농도에서 비오티닐화된 펩티드 및 비오티닐화되지 않은 펩티드에의 항체 결합의 비교를 나타낸다.

표 6은 ELISA에서 N-말단 및 C-말단이 비오티닐화된 TM-HIV-1 펩티드(1a.1로 언급함)의 비교를 나타낸다.

표 7은 비오티닐화되지 않은 HCV 펩티드 I 및 카르복시-비오티닐화된 HCV 펩티드 I의 항체 인지도의 비교를 나타낸다.

표 8은 ELISA에서 항체 검출을 위한 비오티닐화된 HIV 및 HCV 펩티드의 혼합물의 사용을 나타낸다.

표 9는 HCV 코어 단백질의 코어 에피토프의 서열을 나타낸다.

표 10은 HCV NS4 단백질의 코어 에피토프의 서열을 나타낸다.

표 11은 HCV NS5 단백질의 코어 에피토프의 서열을 나타낸다.

표 12는 10개 테스트 혈청에 의한 다양한 코어, NS4 및 NS5 비오티닐화된 20-머의 항체 결합을 나타낸다.

표 13은 개개의 ES/NS1 펩티드의 항체 인지도(양성 반응을 제공하는 모든 혈청의 %)를 나타낸다.

표 14는 HIV V3-루프 펩티드의 전체 인지도를 나타낸다.

표 15는 지리학적 지역에 따른 HIV 펩티드의 인지도를 나타낸다.

표 16은 HIV-1 V3-루프 펩티드 V3-con 및 V3-368에 대한 유럽, 아프리카 및 브라질의 HIV-1-양성 혈청의 인지도를 나타낸다.

표 17은 2개의 HIV-2 V3 루프 펩티드에 대한 HIV-2 양성 혈청의 인지도를 나타낸다.

표 18은 혼성 펩티드의 항체 인지도를 나타낸다.

표 19는 혼합된 HTLV I 및 II 펩티드의 항체 인지도를 나타낸다.

모든 아미노산 서열은 관습적으로 그리고 보편적으로 허용되는 3-문자 코드로 주어지고, 어떤 경우 1-문자 코드로 나타내었다. 펩티드 서열은 관습적으로 아미노 말단에서 카르복시 말단으로의 방향인 왼쪽에서 오른쪽으로 주어져 있다.

다수의 비관습적인 코드 역시 화학기 또는 변형을 나타내는데 사용되며, 하기와 같이 규정된다:

기 코드

Ac 아세틸

Bio D-비오티닐

Fmoc 9-플루오레닐메톡시카르보닐

tBoc 3차 부틸옥시카르보닐

실시예 1: 펩티드 합성

절단시 펩티드 카르복시-말단 아미드가 산출되도록 산-불안정성 링커 4-(α-Fmoc-아미노-2',4'-디메톡시벤질)페녹시아세트산(Rink, Tetrahedron Lett.(1987) 28:3787)과 공중합 작용화된 폴리스티렌-폴리옥시에틸렌 그래프트인 텐타젤(TentaGel) S-RAM(Rapp Polymere, Tubingen, 독일연방공화국)상에 전술한 모든 펩티드를 합성하였다. t-부틸-계의 측쇄 보호와 Fmoc-α-아미노- 보호를 이용하였다. 아르기닌의 구아니딘기는 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐 부위로 보호하였다. 히스티딘의 이미다졸기는 t-Boc 또는 트리틸로 보호하고 시스테인의 설프히드릴기는 트리틸기로 보호하였다. 사전 형성한 O-펜타플루오로페닐 에스테르를 사용하여 결합을 수행하는데, 단 아르기닌의 경우는 1.5 당량의 염기 N-메틸모르폴린의 존재하에서 활성화제로 TBTU를 사용하였다. 종종, 글루타민과 아스파라긴은 또한 TBTU 활성화를 이용하여 결합시켰다. 이 경우, 이들 아미노산의 트리틸-보호된 유도체를 사용하였다. 비오틴은 TBTU 또는 HBTU를 사용하여 결합시켰다. 모든 합성 과정은 연속적인 작업 과정에 의해 밀리겐(Milligen) 9050 펩신디사이져(PepSynthesizer, Novato, California)로 수행하였다. 스캐빈져의 존재하에서 트리플루오로아세트산으로 절단하고 디에틸에테르로 추출한 후, C18-역상 크로마토그래피에 의해 모든 펩티드를 분석하였다.

실시예 2: N-α-Fmoc-Lys(N-ε-비오틴)의 합성

A. 방법 A

시판 N-α-Fmoc-L-Lys(N-ε-tBoc)(1.5g)을 실온에서 2시간동안 20ml의 95% 트리플루오로아세트산과 5% H₂O로 처리하였다. 그후, 대부분의 산을 질소 기류하에서 증발시켰다. 10ml의 물을 첨가하고 용액을 디에틸에테르로 3회 추출하였다. 그후, 수성상을 진공하에서 오산화 인으로 증발 건조시켰다. 수득된 (N-α-Fmoc-L-라이신) 분말을 역상 크로마토그래피로 분석한 결과, 예상대로 출발 물질보다 더욱 친수성인 균질 생성물임이 밝혀졌다.

N-α-Fmoc-L-라이신(190mg, 0.49mmol)을 8ml의 0.1M 보레이트 완충액, pH 8.7중에 용해시켰다. N-히드록시숙신이미도비오틴(162mg, 0.47mmol)을 4ml의 디메틸포름아미드중에 용해시키고 N-α-Fmoc-L-라이신 용액에 첨가하였다. pH를 모니터하고 NaOH로 필요에 따라 적정하였다. 2시간 후, 용액의 pH를 HCl을 사용해서 2로 산성화시켰으며, 이때 백색 침전물이 수득되었다.

에틸아세테이트로 추출하고 원심 분리한 후, 백색 침전물이 H₂O:에틸아세테이트 계면에서 발견되었다. 상 둘다를 제거하고 침전물을 10mM HCl로 2회, 에틸아세테이트로 1회 추출한 후, 디에틸에테르로 2회 추출하였다. 침전물을 DMF중에 용해시키고 디에틸에테르를 첨가하여 침전시켰다. 그후, 결정질 분말을 진공하에서 오산화 인으로 건조시켰다. 수득된 생성물을 역상 크로마토그래피에 의해 분석한 결과, 예상대로 주 피크가 N-α-Fmoc-Lys보다 늦게 용출됨이 밝혀졌다. N-α-Fmoc-Lys의 극히 작은 피크도 또한 관찰되었다(도 2a).

B. 방법 B

시판 N-ε-비오티닐 라이신(비오시틴, Sigma, 249mg, 0.67mmol)을 8ml의 1M Na₂CO₃중에 용해시키고 빙상에서 냉각시켰다. 플루오레닐메틸숙신이미딜 카르보네이트(222mg, 0.66mmol)를 2ml의 아세톤중에 용해시키고 격렬히 교반하면서 30분에 걸쳐 비오티닐 라이신 용액에 첨가하였다. 실온에서 5시간동안 계속 교반하였다. 1M Na₂CO₃를 필요한 만큼 첨가하여 pH를 8 내지 9로 유지시켰다. 아세톤을 진공하에서 증발 제거한 후, 용액의 pH가 대략 2로 될 때까지 1.0M HCl을 첨가하였다. 용액 산성화시에, 백색 침전물이 나타났으며 이를 10mM HCl로 2회, 에틸 아세테이트로 2회 및 디에틸에테르로 2회 세척하였다. 침전물을 DMF중에 용해시키고 디에틸에테르를 첨가하여 침전시켰다. 그후 결정질 분말을 진공하에서 오산화인으로 철저히 건조시켰다. 수득된 생성물을 역상 크로마토그래피에 의해 분석한 결과, 주 피크가 방법 1을 이용하여 수득한 생성물과 동일한 체류 시간(30.5분)으로 용출됨이 밝혀졌다(도 2b).

실시예 3: 특이 항체를 이용하여 효소-결합 면역 흡착 분석법(ELISA)으로 면역학적으로 중요한 에피토프에 상응하는 펩티드를 측정하는 방법

펩티드를 직접 코팅시키는 경우, 펩티드의 원액을 탄산 나트륨 완충액, pH9.6 중에 희석시키고 이를 사용해서 37℃에서 1시간동안 2 내지 5㎍/ml의 펩티드 농도로 폴리스티렌 미세적정 평판을 코팅시켰다.

비오티닐화된 펩티드를 평가하는 경우, 우선 평판을 37℃에서 1시간동안 3㎍/ml의 농도로 탄산 나트륨 완충액, pH9.6중의 스트렙타비딘으로 코팅하였다. 그후 평판을 세척해서 과량의 미결합 단백질을 제거했다. 탄산 나트륨 완충액중의 비오티닐화된 펩티드(1㎍/ml)의 작업 용액을 미량 적정 평판의 웰에 첨가한 후, 37℃에서 1시간동안 항온처리했다.

일단 평판을 항원으로 코팅시키고, 플라스틱상에 남아있는 자유 결합 부위를 카제인으로 차단시켰다. 세척후, 적절한 항혈청 희석액(보통 1:100)을 평판의 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다.

세척에 의해 미결합 물질을 제거한 후, 평판을 양고추냉이 퍼록시다제 효소에 결합된 염소 항-인체 면역글로블린 항체와 함께-항온처리하여 특이적 항체 결합을 검출하였다. 세척에 의해 미결합 복합체를 제거한 후, H₂O 및 3,3',5,5' -테트라메틸벤지딘을 포함하는 용액을 첨가했다.

황산을 첨가하여 적절한 간격후, 반응을 중단시켰다. 양성 반응은 황색으로 발색되며 통상의 미량적정 평판 판독기를 이용하여 이를 정량하였다. 흡광도 측정은 450 nm의 파장에서 수행되었으며, 모든 자료는 이 파장에서의 광학적 밀도치로 표시한다.

실시예 4: HIV-특이 항체의 검출에 비오티닐화된 HIV 펩티드를 사용하는 방법

HIV-1 및 HIV-2의 횡단막 단백질내에 함유된 다른 것들에 상응하는 10 아미노산-길이의 N-아세틸화된 단형 펩티드의 항체 인지도를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 미량적정 평판의 웰내에 이들 펩티드를 직접 코팅하고, ELISA로 항체 결합을 평가했을 때 극히 저조한 결과를 나타냈다. 펩티드는 폴리스티렌 고체상에 잘 결합하지 않는 것으로 추정되므로 펩티드를 동일한 방식으로 재합성하는데 단, 예외적으로, 비오틴은 펩티드의 아미노 말단부에 부착하고, 링커 아암을 제공하는 작용을 하는 3개의 글라이신 잔기에 의해 데카머 펩티드 서열로부터 분리하였다.

비교용으로 사용된 펩티드는 다음과 같다:

비오티닐화된 펩티드를 스트렙타비딘으로 코팅시킨 미량적정 평판상에 적재하였다. 이들 펩티드에 대한 항체 결합을 미량적정 평판상에 직접 코팅시킨 비오티닐화되지 않은 펩티드에 대한 항체 결합과 비교하였다. 그 결과는 표1에 제시되어 있다. 스트렙타비딘에 결합된 HIV-1 또는 HIV-2 횡단막 단백질로부터의 비오티닐화된 펩티드가 각각 HIV-1 또는 HIV-2 감염된 사람으로부터의 항혈청에 의해 아주 잘 인지됨이 명백하다. 이 결과는 폴리스티렌 평판상에 직접 코팅된 이들 펩티드의 비오티닐화되지 않은 변형체와 대비된다. 비오티닐화된 펩티드와 비오티닐화되지 않은 펩티드 양자를 미량적정 평판상에 직접 코팅하였을 때 이들 펩티드의 항체 인지에 있어 차이점이 없으므로, 추가 대조 실험에 의해, 항체 결합의 증가는 비오티닐화된 펩티드와 스트렙타비딘간의 특이적 상호 작용의 결과임이 밝혀졌다.

일부 펩티드, 특히 길이가 15 아미노산 또는 그 이상인 펩티드는 펩티드 서열내에 존재하는 에피토프(들)을 인지하는 특이 항체를 검출하도록 충분히 고체상에 결합한다.

비오티닐화가 또한 보다 긴 펩티드의 항체 인지를 증진시키는 지의 여부를 확인하기 위해 HIV-1 mn 분리체의 부분 V3 루프 서열의 비오티닐화 변형체 및 비오티닐화되지 않은 변형체 양자를 합성하였다. 양 펩티드의 서열 및 합성 방법은 아미노 말단부만 제외하고는 동일하다. 비오티닐화되지 않은 펩티드는 간단히 아세틸화되는 반면, 비오티닐화된 변형체에서는, 두 글라이신 잔기를 링커 아암으로서 첨가하여 비오티닐 부위로부터 펩티드를 분리하였다.

사용된 두 펩티드의 서열은 다음과 같다:

비오티닐화되지 않은 펩티드를 폴리스티렌 미량적정 평판의 웰상에 직접 코팅시키며 반면, 비오티닐화된 펩티드는 스트렙타비딘으로 사전 코팅한 웰에 결합시켰다. 표2에 제시된 결과는, 비오티닐화된 펩티드에 대한 항체 결합이 플라스틱 상에 직접 코팅된 펩티드에 대한 항체 결합보다 우세함을 입증한다.

실시예 5: 항체 검출에 비오티닐화된 펩티드-아비딘 복합체를 사용하는 방법

상기 펩티드의 항체 인식이 펩티드가 비오티닐화되고 스트렙타비딘에 결합되었을 때 증진됨을 입증하기 위한 목적으로, 스트렙타비딘이 아비딘에 의해 치환될 수 있는지의 여부를 결정하는 추가의 시험을 수행하였다. 표 3의 결과에 따르면, 이것이 사실이며, 아비딘에 결합된 비오티닐화된 펩티드가 특이 항체에 의해 극히 효율적으로 인지됨을 알 수 있다.

실시예 6: HCV 특이 항체의 검출에 비오티닐화된 HCV 펩티드를 사용하는 방법

비오티닐화된 펩티드의 항체 인지 증진이 일반적인 현상인지의 여부를 결정하기 위해서, C 형 간염 비루스(HCV) 다종 단백질로부터 유래된 서열에 상응하는 부가적인 20 아미노산-길이의 다수 펩티드를 합성하였다.

평가된 아미노산 서열은 다음과 같다:

각 경우에 있어, 두 펩티드 변형체를 합성하였다. 비오티닐화되지 않은 변형체에서 펩티드의 아미노 말단부를 아세틸화시켰다. 비오티닐화된 변형체는 모두 N-말단이 비오티닐화된 것이다. 두 글라이신 잔기로 구성된 링커 아암이 HCV 서열을 포함하는 아미노산으로부터 비오티닐 부위를 분리시켰다.

비오티닐화되지 않은 펩티드를 3 μg/ml 의 농도로 폴리스티렌 미량적정 평판의 웰상에 흡착시켰다.

비오티닐화된 펩티드를 1μg/ml의 농도로 스트렙타비딘-코팅시킨 미량적정 평판에 결합시켰다. 이들 펩티드에 대한 항체를 포함하는 것으로 공지된 혈청을 평가에 사용하여 20 - 배 희석율로 시험하였다. 이들의 비교 결과는 표 4a 내지 표 4g에 제시되어 있다.

이들 결과에 따르면, 스트렙타비딘에 결합된 비오티닐화된 펩티드의 항체 인지가 미량적정 평판의 웰상에 직접 코팅된 펩티드에 비해 증진됨을 명백히 알 수 다.

실시예 7:항체 검출에 미치는 코팅 농도의 영향

플라스틱 상에 직접 흡착시킨 경우와 비교하여 스트렙타비딘 또는 아비딘에 결합된 비오티닐화된 HCV 펩티드의 항체 인지 증진에 대해 더욱 연구하기 위한 목적으로, 펩티드 코팅 농도의 영향을 조사하였다. 3 종의 펩티드(HCV 펩티드, II, XI 및 XVI)를 미량적정 평판 웰당 200μl의 용적에 대해 10 ng/ml 내지 3 μg/ml 범위의 농도로 코팅하였다. 직접 코팅에는 상기 펩티드의 비오티닐화되지 않은 변형체를 사용하였다. 이들 펩티드의 비오티닐화된 변형체를 사용하여, 사전에 스트렙타비딘으로 흡착시킨 웰을 코팅시켰다. 이들 펩티드에 대한 항체를 포함하는 것으로 공지된 혈청을 1 내지 100배 희석율로 사용하여 항체 결합 정도를 평가하였다.

이 실험 결과의 수치 결과는 표 5에 제시되어 있으며 도 3a 내지 도 3c에 그래프로 도시되어 있다.

일부 예외의 경우도 있지만, 비오티닐화된 펩티드는 시험된 최저 농도(10ng/ml, 2ng/웰)에서도 매우 잘 인지됨이 명백하다. 많은 경우에 있어, 수득 가능한 최대치에 근사한 광학적 밀도치는 30 ng/ml(6 ng/웰)의 펩티드 농도에서만 관측되었다. 그러나, 이와는 달리, 플라스틱상에 직접 흡착된 비오티닐화되지 않은 펩티드는 항체에 의해 결합된다 하더라도 저조하다.

실시예 8: 고체상상에 펩티드를 효율적으로 코팅시키는 것에 미치는 펩티드 비오티닐화의 영향

펩티드를 직접 코팅시켰을 때, 신호의 부재가 펩티드 흡착성의 부족에 기인한 것임을 결정하기 위한 목적으로, 추가의 실험을 수행하였다. 이 경우, 펩티드의 비오티닐화된 변형체를 비오티닐화되지 않은 변형체에 대한 상기 실험에서 사용된 바와 동일한 농도로 플라스틱상에 직접 코팅시켰다. 비오틴-표지시킨 펩티드가 결합되었는지의 여부를 확인하기 위해, 미량적정 평판을 스트렙타비딘: 양고추냉이 퍼록시다제 복합체와 함께 항온 처리하였다. 각 펩티드는 단일 비오티닐기를 포함하므로, 결합된 펩티드의 절대량은 알려지지 않지만, 수득된 광학적 밀도치는 결합된 펩티드량의 척도가 된다. 도 4에 그래프로 제시된 결과는 플라스틱-결합된 펩티드가 검출될 수 있음을 입증한다. 예상대로, 곡선은 각 펩티드에 대해 상이하며, 그 화학적 특성을 반영한다. 두 펩티드, HCV 펩티드 XI 및 XVI는 폴리스티렌 미량적정 평판의 웰에 단지 미약하게 결합하는 것으로 보이며, 이러한 미약한 결합은 ELISA 결과 낮은 광학적 밀도값으로 반영된다. 스트렙타비딘-코팅한 웰에 대한 비오티닐화된 펩티드의 결합에 의해 극히 우수한 항체 인지도가 얻어지므로, 비오틴과 스트렙타비딘 간의 상호작용을 이용하는 경우 고체상에 대한 펩티드의 미약한 결합이 제한적 조건이 되지는 않음이 명백하다.

반면, 1종의 펩티드, HCV II 는 특히 높은 코팅 농도에서 고체상에 대해 상당한 정도의 결합을 나타낸다. 그러나, 펩티드를 직접 코팅했을 때 수득한 신호가 비오티닐화된 펩티드를 스트렙타비딘에 결합시켜 얻어진 신호와 동등하게 되는 코팅 농도는 없었다. 최저 시험 농도에서도, 상기 펩티드의 스트렙타비딘-결합된 비오티닐화된 변형체는 시험 항혈청에서 양성 신호를 제공하므로, 그 결과는 상기 펩티드의 직접 결합이 이례적으로 비효율적이거나, 고체상에 대한 펩티드의 단순 결합외에 다른 요인이 중요함을 나타내는 것 같다.

정량 분석하기가 어렵지만, 요인중 하나는 펩티드가 결합되고 항체 결합에 이용되는 방법을 포함함이 확실하다. 고체상상에 직접 코팅된 펩티드의 경우에, 펩티드 분자의 일부가 항체 인지에 필수적인 아미노산 측쇄를 통해 고체상과 상호 작용할 것이 실제로 불가피하다. 따라서 이들 펩티드 분자는 항체와의 결합 반응에 관여할 수 없을 것이다. 이 문제는 비오틴과 고체상-결합된 스트렙타비딘간의 상호 작용을 통해 고체상에 모두 결합한 비오티닐화된 펩티드의 경우에는 해당하지않는다.

실시예 9: 특이 항체 인지에 C- 말단 비오티닐화된 HIV 펩티드의 사용 방법

카르복시-말단부가 비오티닐화된 펩티드가 또한 항체 인지도를 증진시키는지의 여부를 결정하기 위한 목적으로, TM-HIV-1 펩티드의 카르복시-비오티닐화된 변형체를 합성하였다. 20% 피페리딘으로 링커-결합된 Fmoc 기를 제거한 후, 산 불안정성 링커 4-(α-Fmoc-아미노-2',4'-디메톡시벤질) 페녹시아세트산으로 작용화된 수지에 전술한 방법 A에 의해 제조한 N-α-Fmoc-Lys(N-ε-비오틴)을 직접 연결하였다. 수지 작용기 대비 3 배 몰과량의 N-α-Fmoc-Lys(N-ε-비오틴)을 사용하여 결합을 수행하였다. 카르복실기 활성화는 1 당량의 HBTU, 1당량의 1-히드록시벤조트리아졸 및 1.5 당량이 N-메틸 모르폴린을 사용하여 카르복실기를 활성화시켰다. N-메틸모르폴린은 40% 디메틸 설폭사이드를 포함하는 디메틸포름아미드중의 0.6M 용액으로 제조하는데, 이는 N-α-Fmoc-Lys(N-ε-비오틴)을 완전히 용해시는데 필요하다. N-α-Fmoc-Lys(N-α-비오틴)의 결합 후 Fmoc 탈보호 피크 결과는 결합이 원할하고 효율적으로 진행되었음을 나타낸다.

2개의 글라이신 잔기를 결합시켜 TM-HIV-1 아미노산 서열로부터 비오티닐라이신을 분리하였다. 펩티드 합성 이후, 아미노 말단부를 아세트산 무수물로 아세틸화시켰다. 수득된 카르복시-비오티닐화된 펩티드의 구조는 아미노 말단부가 비오티닐화된 펩티드와 상당히 상이하다. 이들 구조의 비교는 도 5에 제시되어 있다.

이들 두 펩티드의 항체 인지도를 평가하기 위해, 펩티드를 개별적으로 스트렙타비딘-코팅한 미량적정 평판에 결합시키고 HIV-1 혈청 양성 공여자로부터의 항혈청의 패널을 사용하여 시험하였다. 이 비교 결과는 표 6에 제시되어 있다. C- 말단 비오티닐화된 펩티드의 항체 인지도는 N-말단 비오티닐화된 펩티드의 경우와 비교하여 매우 양호하다. 이들 결과로 또한 카르복시-말단 비오티닐화에 대한 시약 N-α-Fmoc-Lys(N-ε-비오틴)의 유용성이 확인된다.

실시예 10:직접 코팅되거나(비오티닐화되지 않거나) 스트렙타비딘-코팅된 평판(카르복시-말단 비오티닐화)에 결합한 HCV 펩티드 I의 항체 인지도에 대한 비교

카르복시-비오티닐화된 펩티드 형태가 비오티닐화되지 않은 펩티드 형태에 비해 우수한 항체 인지도를 나타내는지의 여부를 결정하기 위해, 폴리스티렌 ELISA 평판에 비교적 잘 결합하는 펩티드를 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. 선택한 펩티드는 HCV 펩티드 I 이었으며, 이는 다음 변형체로 합성되었다.

두 개의 글라이신 잔기로 이루어진 스페이서(spacer)를 카르복시-말단부에 첨가하여 Lys(N-ε-Bio)로부터 적절한 펩티드의 HCV부를 물리적으로 분리하였다.절단시 카르복시-말단 아미드를 산출하기 위하여, 4-(α-Fmoc-아미노-2',4'-디메톡벤질)페녹시아세트산 링커로 작용화한 수지상에서 합성을 수행하였다. 링커에 N-α-Fmoc-Lys(N-ε-비오틴)을 결합시키는 것은 링커 대비 3 몰 과량의 중간 생성물을 사용하여 수행하였다. 1 당량의 TBTU, 1 당량의 1-히드록시 벤조트리아졸 및 1.5 당량의 N-메틸모르폴린을 사용하여 N-α-Fmoc-Lys(N-ε-비오틴)을 활성화시켰다. 다른 모든 아미노산의 결합은 통상의 프로토콜에 따라 수행하였다. 적합한 스캐빈져의 존재하에 트리플루오로아세트산에서 펩티드를 절단한 후, 펩티드가 침전되며, 이를 디에틸에테르로 추출하였다.

비오티닐화되지 않은 HCV 펩티드 I을 탄산 나트륨 완충액, pH 9.6에서 3㎍/ml의 농도로 폴리스티렌 ELISA 평판의 웰상에 직접 코팅하였다. 비오티닐화된 HCV 펩티드 I은 1 ㎍/ml의 농도로 펩티드를 포함하는 원액을 사용하여 스트렙타비딘-코팅한 웰에 결합시켰다. 그 후, HCV- 혈청 양성 공여자로부터의 혈청의 패널과 평행으로 수득된 평판을 항온 처리하였다. 이러한 비교 결과는 표 7에 제시되어 있다. 비오티닐화된 펩티드는 동일한 서열의 비오티닐화되지 않은 변형체에 비해 월등한 결과를 나타낸다. 두 혈청(8326 및 8244)은 비오티닐화되지 않은 변형체에 비해 상기 펩티드의 비오티닐화된 변형체를 훨씬 더 잘 인지한다. 항체 반응의 특이성은 미감염된 공여자로부터의 5 종의 혈청 샘플(F88, F89, F76, F136 및 F6)에 대해 수득된 낮은 광학적 밀도치로 반영된다.

실시예 11:비오티닐화된 HIV 및 HCV 펩티드 혼합물의 사용 방법

많은 경우에 목적하는 결과를 얻기 위해서는 펩티드 혼합물을 사용해야 한다. 단일 비루스의 1 종 이상의 단백질에 대한 항체를 검출하거나 단일 시험에서 수종의 비루스의 단백질에 대한 항체를 검출하기 위해서 펩티드 혼합물을 사용할 수도 있다. 이러한 시험은 형질 융합에 사용하기에 적합하고 혈액 산물의 공급원으로서 적합한 혈액 공여자를 검색하기에 특히 유리하다. 이러한 경우에, 적합한 펩티드 혼합물로 코팅한 ELISA 평판 또는 기타 고체 지지체는 샘플을 사용하기에 부적합하게 만드는 1 종 이상의 감염원에 대한 항체의 존재에 대해 샘플을 검색하는데 사용될 수도 있다. 특이적 감염원을 진단하는 경우, 정확한 측정치를 얻기 위해서는 적합한 펩티드 혼합물이 필요하다. 1 종 이상의 감염원으로부터 유래된 각 비루스 항원에 대한 항체는 개별적으로 검출되거나, 개별 반응이 관찰되어 평가될 수 있도록 각 펩티드 또는 펩티드 혼합물이 고체상에 결합되어 그러나 그 자체로서 물리적으로 분리되는 시험 시스템, 예를 들면 선 면역 분석법을 사용할 때 동시에 동정될 수 있다. 이러한 시험은 목적하는 결과를 얻기 위해 적합한 조합의 펩티드 혼합물의 사용을 필요로 한다.

진행중 또는 진행후의 감염의 진단에는 단일 펩티드보다 펩티드 혼합물을 사용하는 것이 종종 바람직하다. 단일 에피토프에 대한 개별 반응은 상당히 다양할 수 있으므로, 더욱 믿을 만한 결과는 항체 시험에 면역학적으로 중요한 여러개의 에피토프가 존재할 때 종종 얻어진다. 그러나, 각 펩티드는 화학적으로 독특하므로, 특히 펩티드가 고체상에 직접 코팅할 때 목적하는 펩티드를 한 실험에 모두 참여시키는 것이 종종 어렵다. 모든 펩티드가 고체상에 결합할 수 있는 것은 아니며, 혼합물중의 펩티드는 pH, 이온 강도 및 완충액 조성면에서 매우 상이한 최적코팅 조건을 나타낼 수 있다.

스트렙타비딘-또는 아비딘-코팅된 평판에 결합시, 비오티닐화된 펩티드가 혼합물중에서 얼마나 잘 작용하는지의 여부를 결정하기 위해, HIV-1 펩티드 TM-HIV-1(상기에서 1a.1로 지칭) 및 V3-mn(상기에서 1b.4로 지칭), HIV-2 펩티드 TM-HIV-2(상기에서 2a로 지칭) 및 C 형 간염 비루스 펩티드 II, IX 및 XVIII의 N-말단 비오티닐화된 변형체로 두 혼합물을 제조하였다. 혼합물 A는 각각 1 ㎍/ml(전체, 6 ㎍/ml 펩티드) 농도의 6개 비오티닐화된 펩티드를 포함하며, 반면 혼합물 B의 경우, 각 펩티드는 0.1 ㎍/ml(전체 0.6 ㎍/ml 펩티드)의 농도로 존재한다. 각 펩티드는 1 ㎍/ml 이 농도로 코팅하였다. 비교용으로, 혼합물 A 및 B는 미량적정 평판의 웰상에 직접 코팅하였다. HIV-1, HIV-2 및 HCV-양성 혈청형의 공여자로부터의 샘플을 시험하고 음성 혈청형 혈액 공여자로부터의 혈청과 비교하였다. 0.250 의 컷-오프 흡광도 값을 이용하여, 반응의 양성 또는 음성 여부를 결정하였다. 0.250 이상의 흡광도 값은 양성으로 간주하며 반면에 상기 값 이하의 흡광도 값은 음성으로 간주한다. 상기 실험 결과는 표 8에 제시되어 있다.

각 펩티드에 대한 반응에 의거하면, HCV 혈청 샘플 모두는 HIV-1 또는 HIV-2에 대한 항체에 대해 음성이었다. 한 HIV-2 샘플(140 번)은 HCV 펩티드 XVIII에 대한 항체를 가지고 있었다. 시험 HIV 샘플 중, 교차 반응성을 나타내는 것은 없었으며 각 펩티드에 대한 ELISA는 특이성이 있었다.

혼합물 A 및 B 양자는 아비딘-코팅한 미량적정 평판에 결합시켰을 때 우수한 결과를 나타냈다. 예상 대로, 이들 혼합물은 HIV-1, HIV-2 및 HIV-양성 혈청에 의해서는 인지되었으나, 음성 혈청형 혈액 공여자로부터의 혈청에 의해서는 인식되지 않았다. 대조적으로, 이들 혼합물을 미량적정 평판상에 직접 코팅한 경우, 그 결과는 그리 만족스럽지 못했는데, 많은 샘플이 적용된 컷-오프 값 이하로 떨어지는 반응을 나타냈다. 이러한 결과는 고체상 상에 직접 코팅한 펩티드와 비교하여 아비딘에 결합한 비오티닐화된 펩티드의 면역학적 인지도의 개선 뿐 아니라, 다수의 항체 검출에 펩티드 혼합물을 사용하는 것이 유리함을 상당히 설득력 있게 입증해준다.

실시예 12: HCV의 진단학적으로 유용한 부위내에서 에피토프의 지도작성에 비오티닐화된 펩티드를 사용하는 방법

실시예 6에서, 코어, NS4 및 N55와 같이 HCV 다종단백질의 진단학적으로 중요한 여러 부위를 중첩 20-머 비오티닐화된 펩티드를 사용하여 동정할 수 있다는 것이 입증되었다. 전체적인 혈청 시험에 의해 비오티닐화된 펩티드를 이용한 선면역 분석법을 발전시키는 가장 유용한 20-머 비오티닐화된 티드를 동정하였다.

그러나, 상기 20 아미노산-길이 서열내에 에피토프의 위치를 보다 정확히 아는 것이 바람직하다. 그 한지 이유는 짧은 서열이 동정되는 경우, 펩티드를 불필요하게 길게 만들지 않고서도 2 또는 3개의 에피토프를 포함하는 합성 펩티드를 만드는 것이 가능하기 때문이다.

추정 HCV 단백질의 위치내에 존재하는 에피토프는 가이센, H.M., 멜로엔 R.H., 및 바르텔링 S.J.의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984) 81: 3998-4002에 최초 공지된 방법을 이용하여 지도화하였다. 8개 아미노산 중첩부를 지닌 9개 길이 아미노산의 연속 펩티드를 비-절단성 링커로 유도된 폴리에틸렌 핀상에서 합성하였다. 이 펩티드 길이는 일반적으로 길이 5 내지 7의 아미노산인 통상의 선형 에피토프 크기 보다 커서 선택되었다. 9-머를 합성함으로써, 에피토프 누락의 가능성을 최소화하였다.

스캐닝한 HCV 다종단백질내 부위는 코어 서열(아미노산 1 내지 80), NS4(아미노산 1688 내지 1755) 및 NS5(아미노산 2191 내지 2330)를 포함한다. 이들 부위는 사전 결정한 20-머; 펩티드 I 내지 VII(코어 1 내지 13), 펩티드 VIII 내지 XIV(NS4-1 내지 9) 및 펩티드 XV 내지 XIX(NS5-13 내지 33)에 상응한다.

합성 이후, 아미노 말단부에 비천연 양전하를 제거하기 위해서 측쇄 탈보호 이전에 모든 펩티드를 N-아세틸화시켰다.

그후, HCV 양성 혈청형 공여자로부터의 혈청내에 존재하는 항체에 의해 인식될 수 있는 능력에 대해 펩티드를 분석하였다. 이러한 실험 결과는 도 6a 내지 도 6c에 제시되어 있다. 제시된 광학적 밀도치는 2회 측정치의 평균이며 9머 서열의 첫 번째 아미노산에 대한 것이다.

10 개의 상이한 HCV 혈청에 대한 항체 결합 특징은 도 6a에 제시되어 있다. HCV의 코어 단백질은 합성 펩티드에 의해 용이하게 자극되는 잘 규정된 선형 에피토프를 제공함이 명백하다. 최소한 표면적으로, 대부분의 혈청은 매우 유사한 형태를 나타내는 것으로 보인다. 그러나 보다 정밀한 검사 결과, 개별적인 차이가 있음이 밝혀졌다. 항체에 의해 인지되는 HCV 코어 단백질의 다양한 부위는 에피토프 자체라기 보다는 에피토프 집합체로 지칭하는 것이 더욱 적절한 것으로 보이는 데 그 이유는 각 부위가, 불가능하지는 않지만 다클론 혈청을 사용하여 구별하는것이 어려운 여러개의 중첩 에피토프로 구성되어 있음이 확실하기 때문이다. 각 에피토프 집합체내 코어 에피토프를 규명하기 위한 시도가 이루어졌다. 상기에서 사용된 용어 "코어"는 항체에 의해 인지될 수 있는 최소 아미노산 서열을 지칭한다. 그러나, 코어 서열외의 아미노산이 다클론 혈청의 경우에 특히 반응성을 개선시킬 수 있음이 강조되어야 한다. 에피토프 분석은 표 9에 제시되어 있다. 각종 혈청의 반응을 비교함으로써 에피토프 집합체의 서브도메인을 규명할 수 있었다. 몇몇 혈청은 주로 한 서브도메인과 반응하고 다른 것들과는 반응하지 않으며, 반면 다른 혈청은 모든 서브도메인을 인지하지만, 여전히 서브도메인을 구별하게 하는 데, 그 이유는 각각이 특정 에피토프 집합체를 규정하는 큰 피크에서 견부를 형성한다. 표 9 및 도 7a는 20-머의 서열에 있어서 코어 에피토프의 위치를 나타낸다.

20-머 코어 펩티드 각각에 상응하는 9-머의 연속체는 시험된 항혈청중 하나에 대한 항체 인지 특징과 관련하여 이들 서열 각각의 위치와 함께 도 7a에 제시되어 있다.

10개 혈청으로 수득된 NS4 단백질에 대한 항원 특징은 도 6b에 제시되어 있다. 일반적으로, 이들 혈청과 9-머의 반응은 코어 단백질로부터의 펩티드와의 바응보다 뚜렷하지 않다. 그럼에도 불구하고, 비루스성 NS4 단백질의 N-말단 서열내 에피토프성 부위를 규명하는 것이 가능했다. 이들 에피토프의 코어 서열은 표 10에 분석되어 있으며, 이는 이 부위에서 진단에 중용한 20-머 합성 펩티드와의 관련성을 나타낸다. 상이한 20-머에 상응하는 9-머는 항원 특징의 일례와 관련한 위치와 함께 도 7b에 제시되어 있다. 20-머는 상기 부위내 에피토프와 상당히 상응함을 알 수 있다.

스캐닝된 NS5 단백질의 부위는 20-머 펩티드 13 내지 33에 의해 차지되는 부위에 상응한다. 이 부위에서 얻어진 항원 특징은 도 6c에 제시되어 있다. 재차, 코어 에피토프를 동정하기 위한 시도를 수행하였으며 이는 표 11에 제시하고 있다. 이 서열의 아미노 말단부에서 항체 결합은 거의 관찰되지 않았다. 도 7c에서, 20-머 펩티드 NS5-21 내지 NS5-31에 상응하는 9-머를 제시하고 있으며, 그 위치는 항원 특징중의 하나에 상대적으로 나타냈다.

특히, HCV 펩티드 XVI(NS5-27)로 나타낸 서열의 중요성은 중첩 9-머로 얻어진 결과에 의거하여 지나치게 과소 평가되었다. 이 서열의 중요성은, 비오티닐화되지 않은 HCV 펩티드 XVI(NS5-27)으로 미량적정 평판상에 직접 코팅후 ELISA로 평가하는 경우도 또한 과소 평가된다(표 4b 참조). 그러나, 이 펩티드의 비오티닐화된 변형체는 스트렙타비딘-EH는 아비딘-코팅한 평판에 결합시 진단적 가치면에서 매우 중요한 에피토프의 존재를 나타낸다.

9-머로 관측된 미약한 결합과 대조적으로, 20-머와의 결합은 종종 상당히 강력하였다.( 표 12 참조). 몇몇 경우, 그 차이가 현저했다. 예컨대, 혈청 8241은 임의의 9-머를 인지하지 않으나, 반면 펩티드 HCV2(펩티드 IX) 및 HCV5(펩티드 XI)에 대한 결합은 매우 강력하다. 중간 정도의 결합은 펩티드 HCV7(펩티드 XIII)에서 관측되었다. 이는, 20-머에는 존재하지만 9-머에는 부재한 에피토프에 중요한 구조적 성분이 존재함을 나타낸다.

실시예 13 : HCV 선 면역 분석법의 NS1 부위의 N-말단부내 에피토프의 동정에 비오티닐화된 펩티드를 사용하는 방법

선 면역 분석법(LIA)을 이용하여 에피토프를 동정할 수도 있다. 일반적으로, 비오티닐화되지 않은 펩티드는 폴리스티렌 ELISA 평판보다는 나일론 막에 더욱 잘 결합한다. 그럼에도 불구하고, 스트렙타비딘 또는 아비딘과의 비오티닐화된 펩티드의 복합체는 막에 직접 결합된 비오티닐화되지 않은 대응부보다 선 면역 분석법에서 탁월한 결과를 나타낸다. 이를 입증하기 위해, HCV 펩티드 XXg-1 및 XXg-2의 비오티닐화되지 않은 변형체와 N-말단에 비오티닐화된 변형체를 합성했다. 비오티닐화되지 않은 펩티드는 100 ㎍/㎖ 펩티드를 포함하는 원액으로서 막에 적용시키는 반면, 비오티닐화된 펩티드는 스트렙타비딘에 결합시켜 100 ㎍/㎖ 복합체의 원액으로 적용시켰다. 따라서 원액중 비오티닐화된 펩티드의 양은 대략 10 ㎍/㎖였다. 3개의 인체 IgG 대조군 선을 확실한 반응 강도 평가를 위해 스트립에 적용시켰다. 항원 선 적용후, 막상의 과다 결합 부위를 포스페이트-완충 식염수중의 카제인으로 치단시켰다. 계속해서 항원 선을 적용시킨 방향과 수직으로 막을 절단하여 스트립을 만들고 이 수득된 스트립을 HCV-양성 혈청형 공여자로부터의 혈청 패널과 함께 항원처리하였다. 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트와 니트로블루 테트라졸륨을 첨가한 후, 알칼린 포스파타제 효소에 결합시킨 염소 항-인체 IgG 항체를 사용하여 결합된 항체를 시각적으로 확인하였다. 그 결과는 도 8에 제시되어 있다.

반응의 특이성은 HCV-음성 혈청형 공여자로부터 수득한 세 혈청(33, 34 및 35)에 의해 임의의 HCV 펩티드에 대한 검출 가능한 항체 결합의 부재에 의해 입증된다. 혈청 1 내지 32와 비오티닐화되지 않은 HCV 펩티드 XX-1 및 XX-2의 반응은 일반적으로 부재하거나 지나치게 미약하다. 대조적으로, 시험된 다수의 혈청은 스트렙타비딘과 복합체 형성시 이들 펩티드의 비오티닐화된 변형체를 인지하였다. 비오티닐화된 펩티드에 대한 항체 반응은 비오티닐화되지 않은 펩티드의 원액중에 존재하는 양에 비해 상기 원액중에 펩티드 양의 약 1/10 만이 존재한다는 사실에도 불구하고 상당히 강력하다. 비오티닐화된 펩티드를 사용하여 얻은 결과는 펩티드의 비오티닐화되지 않은 변형체 사용시 드러나지 않은, 이들 펩티드 서열내 진단에 유용한 에피토프의 존재를 입증한다.

상이한 HCV 분리체의 HCV E2-NS1 부위의 고가변성 N-말단부(HCV 다종단백질의 아미노산 383 내지 416)에 걸친 8 서열 전체를 추가 평가를 위해 선택하였다. 이러한 배열된 서열(1-문자 암호)은 다음과 같다:

이들 서열은 다음 문헌에 공지된 분리물로부터 유리된다 :

(1) Hijikata 등, Biochem. Biohys. Res. Comm. 175: 220-228, 1991.

(2) 미발표 결과

(3) Hijikata 등, Biochem. Biohys. Res. Comm. 175:229-228, 1991.

(4) Kato 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 1105-1113, 1991.

(5) Takamizawa 등, J.Virology 65: 1105-1113, 1991.

(6) Weiner 등, Virology 180 : 842-848, 1991.

(7) Okamoto 등, Japan. J. Exptl. Med. 60: 167-1177, 1990.

(8) Kremsdorfl 등, Abstract V64, Third International Symposium on HCV, Strasbourg, France, 1991년 9월.

서열이 다소 길고 2차 구조-관련된 어려움이 합성중에 야기될 것으로 예상되므로, 서열을 두 중첩부("a"=HCV 다종단백질의 아미노산 383 내지 404 및 "b"=아미노산 393 내지 416)로 분할하기로 결정하였다. 서열을 소분할 함으로써 에피토프의 위치를 더욱 정확히 규정할 수 있다.

모든 펩티드의 N-말단을 비오티닐화시키고 스트렙타비딘과 복합체 형성하여 LIA-스트립 제조에 사용하였다(자료는 미제시).

LIA-양성 샘플만을 고려할 때 E2/NS1 펩티드에 대한 검출율은 90% 수준인 것으로 밝혀졌다. 개개의 펩티드에 대한 등급 뿐 아니라 E2/NS1 펩티드의 인지도 및 LIA 반응성간의 상관 관계는 표 13에 제시되어 있다. 관찰된 반응을 통해, 이 서열의 1차 에피토프는 고가변부의 카르복시-말단부를 향해 위치함이 명백해졌다. 그러나, 이에 대한 예외가 있다. 각 혈청은 이 에피토프가 LIA에서 한 선으로서 포함된다면 상이한 서열의 혼합물을 사용하는 중요성을 강조한 인지 형태를 가지는 것으로 나타났다. 또한, 타입 1a와 타입 1b 서열 사이에는 상당 정도의 교차 반응성이 존재하거나 또는 대부분의 사람들은 두배로 감염되는 것으로 보인다. 한 서열에 결합하는 항체를 선택적으로 제거하고 다른 서열의 항체 인지에 어떠한 효과가 나타나는지 고찰함으로써 이들 두 가능성을 비교하는 것은 단순한 문제이다. 다수의 샘플이 하나 이상의 E2/NS1 펩티드에 다소 미약한 반응을 나타내나 이는 LIA 음성이다. 양성 가반응의 가능성이 가장 높지만, 이들 혈청은 사전 감염되었으나 감염이 치유된 사람으로부터 유래된 것일 수도 있다.

실시예 14 : LIA에 의한 항체 검출을 위해 HCV의 코어 영역으로부터의 결합된 HCV 펩티드를 사용하는 방법

HCV ELISA 또는 LIA에서 전체 펩티드 수를 줄이기 위해, 기타 면역학적으로 중요한 펩티드에 비오티닐화시킨 펩티드를 합성할 수 있다. HCV의 코어 단백질 NS3 부위로부터의 상기 "결합된" HCV 펩티드의 예는 이하 제시된 바와 같다.

이러한 펩티드 모두에는 Gly-Gly 스페이서 및 아미노 말단부에 비오틴이 제공되었다. 펩티드를 선 면역 분석 실험(LIA)로 평가하고 보다 짧은 코어 펩티드와 비교하였다. 그 결과는 도 9에 제시되어 있다. 보다 긴 코어 펩티드는 짧은 펩티드와 비교하여 매우 유리하며 일관되게 더욱 강렬한 반응을 제공한다.

(1) 긴 펩티드가 사전에 두 개의 별도 펩티드 전체에 분포된 2 이상의 에피토프를 포함하는 경우 또는 (2) 긴 펩티드에서 더욱 두드러진 입체적 기여가 있는 경우 또는 그 두 경우 모두 상기한 바가 설명될 수 있다.

실시예 15 : LIA에 의한 항체 검출을 위해 HCV의 NS4 및 NS5영역으로 부터의 결합된 HCV 펩티드를 사용하는 방법

다른 펩티드는 다음과 같은 NS4 및 NS5 내 서열을 결합시킨다.

긴 펩티드를 사용할 때의 일반적인 잇점은 ELISA 또는 LIA에 사용시 면역학적으로 중요한 에피토프를 보유한 다른 펩티드의 혼입을 위한 더욱 넓은 공간을 제공한다는데 있다.

실시예 16 : LIA에 의한 항체의 검출에 타입-특이적 HCV NS4 펩티드를 사용하는 방법

NS4내에 에피토프를 포함하는 것으로 밝혀진 타입 1 펩티드에 대응하는 HCV 타입 2 및 3 NS4 서열을 포함하는 등가의 펩티드를 합성하였다. 이들 펩티드의 서열을 비교를 위해 이하에 제시한다:

이들 9 펩티드를 사용하여 LIA 스트립을 제조하고 계속해서 상이한 혈청과 함께 항온처리하였다. 그 결과는 도 10에 제시하고 있다. 타입 1 NS4 펩티드에 대해 사전에 음성이었던 두 혈청은 타입 3 및 타입 2 펩티드에 대해 양성을 나타냈다. 이는 상기 펩티드를 사용하여 NS4 검출율을 증대시키는 것이 가능함을 나타낸다.

살시예 17 : HIV 항체 검출을 위해 선 면역 분석법에 상이한 HIV-1 분리체의 gp120의 V3 루프 부위로부터의 비오티닐화된 펩티드를 사용하는 방법

gp120의 V3 루프 부위의 일반적인 진단적 가치를 결정하기 위해, 상이한 9개 HIV-1 분리체의 상기 부위로부터 유래된 9개 펩티드를 합성하고 LIA에 사용하였다. 모든 9개 펩티드에 Gly-Gly 스페이서 및 N-말단부 비오틴이 제공되었다. 배열된 펩티드(1-문자 아미노산 암호) 서열은 다음과 같다:

펩티드를 비오틴 결합 부위에 걸쳐 약간의 몰 과량의 스트렙타비딘과 혼합하고 펩티드:스트렙타비딘 복합체를 세파덱스 G-25 상의 미결합된 물질로부터 분리하였다. 공극 부피에서 용출하는 물질을 LIA 제제로 사용했다.

다양한 지역에서 얻은 총 332 종의 혈청을 시험하였다. 유럽인 또는 북아메리카인에게서 분리한 비루스 균주는 아프리카인의 분리체보다 균주-대-균주 가변성이 적게 나타나는 것으로 알려져 있으므로, V3-루프 서열 인지에서의 지리적 차이가 예상되었다. 각종 선들의 반응을 양성(i) 또는 음성(o)으로서 평가하였다(자료는 미제시).

혈청의 완전 평가는 표 14에 제시되어 있다. 전체적으로, 332 종의 혈청중 307 종이 V3-루프 LIA에서 최소한 하나의 펩티드에 대해 반응을 나타내었다. V3-루프 LIA에서 임의 펩티드에 대해 반응을 나타내지 않는 혈청은 항-HIV-I 항체에 대해 양성인지의 여부를 결정하기 위해 웨스턴 블롯에 의해 시험하였다. 6종의 혈청이 실제 음성인 것으로 밝혀졌다. 따라서 시험관 양성 혈청의 총수는 326이다. 그러나 V3-루프 LIA의 어느 것에도 반응하지 않는 gp120에 대한 항체를 포함하고 19종의 혈청은 양성 반응을 보이는 혈청의 %는 전체적으로 94%였다. 그러나, 지리적으로 상당한 차이가 있었다. 그 차이는 표 15에 제시하고 있다.

최소 하나의 양성 반응을 보이는 상이한 지역으로부터 혈청의 전체 %는 다음과 같이 요약될 수 있다:

유럽인 100%

아프리카인 94%

브라질인 92%

유럽인 샘플에 대한 추가 평가에 따르면 상기 %는 실제 100% 보다 약간 이하임을 나타낸다. LIA에서 반응하지 않는 아프리카인 샘플은 다른 HIV 항체의 존재를 확인하기 위한 웨스턴 블롯 시험을 하지 않았다.

유럽인의 혈청이 높은 점수를 얻으리라는 것은 예상되었다. 아프리카인 혈청에서 얻은 낮은 점수도 또한 예상되었는데, 그 이유는 아프리카에서 더 많은 비루스 이종이 있는 것으로 알려져 있기 때문이다. 아프리카의 HIV 균주의 V3-루프 서열은 유럽이나 북아메리카의 균주처럼 전체적인 특성 규명이 이루어지지 않았기 때문에, 본 발명자들이 대표적인 서열을 찾지 못했고 또는 일치 서열면에서 아프리카의 균주의 특성을 규명하고자 하는 시도는 서열이 지나치게 다양하므로 실행이 불가능함이 명백하다. 브라질인의 혈청으로 수득한 결과는, 브라질에서 HIV 다양성에 관한 보고가 전혀 없었던 관계로 의외의 것이었다. 이들 결과부터 브라질의 상황은 아프리카의 상황과 상당히 밀접하게 유사하며 북아메리카나 유럽에서의 상황과는 상이한 것으로 보인다.

실시예 18 : 브라질인의 분리체로부터 유래된 V3 서열을 사용하여 브라질인의 혈청에서 HIV-1 항-V3 도메인 항체를 검출하는 개선된 방법

전술한 LIA 스트립상에 존재하는 HIV-1 V3 루프 서열을 인지하지 않으나 웨스텐 블롯에서 HIV-1 gp120 단백질을 인지하는 항체에 대해 양성인 브라질인의 혈청을 이후 연구용으로 선택하였다. 이들 샘플중 하나에서, 혈청 샘플에 존재하는 비루스의 V3 루프 서열은 고가변성 도메인 주변의 불변부로부터 유래된 프라이머를 사용하여 폴리머라제 쇄반응으로 증폭시킬 수 있다. 계속해서 생성된 DNA 단편을 클로닝시키고 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 이 단편에 의해 암호화된 추정 아미노산 서열에 상응하는 펩티드를 합성하고 다양한 HIV-1 항체-양성 혈청에 의해 인지될 수 있는 능력에 대해 시험하였다. 이 펩티드 서열은 다음과 같다:

펩티드 V3-368:

두 글라이신 잔기로 이루어진 스페이서를 아미노 말단부에 첨가하였다. 그 후, 수득된 N-말단 글라이신 잔기를 비오티닐화시켰다. 상기 펩티드를 인지할 수 있는 유럽인, 아프리카인 및 브라질인의 HIV-1 항체-양성 혈청의 능력을 조사하고 ELISA에서 일치 서열 펩티드를 인지할 수 있는 상기 동일 혈청의 능력과 비교하였다. 두 펩티드를 또한 혼합물로서 함께 평가하였다. 이들 결과는 표 16에 요약되어 있다. 이들 결과는, 유럽인 또는 아프리카인 기원의 혈청의 경우, V3-368 펩티드가 V3con 펩티드에서 관찰된 것보다 항-V3 루프 항체 검출 증대가 야기되지 않음을 입증한다. 이와 대조적으로, V3-368 펩티드 사용시 브라질인의 혈청의 경우 V3항체 검출이 현저히 개선되었다. 이 펩티드는 V3con 펩티드 보다 적은 빈도로 인지되지만, 두 펩티드는 서로를 보완하여 83.3%에서(V3con 펩티드 단독 사용시) 97.2%(두 펩티드 함께 사용시)로 검출율을 상승시킨다.

실시예 19 : HIV-2 V3 루프 서열의 항체 인지도

HIV-2의 외막 당단백질(gp120)은 그 조직면에서 HIV-1의 것과 유사하다. HIV-1의 gp120 단백질과 마찬가지로, HIV-2의 gp105 단백질은 비교적 보존된 아미노산 서열의 도메인 주변의 가변성 서열의 도메인으로 이루어져있다. 이 비루스에 의한 감염에 대한 응답 반응으로 생성된 HIV-2의 V3 도메인에 특이적인 항체를 검출하기 위해서, HIV-2/SIV 분리체 GB12 및 분리물 SIV mm 239의 V3 서열에 상응하는 비오티닐화된 펩티드를 합성하였다(Boeri, E., Giri, A., Lillo, F. 등; J. Virol. (1992) 66(7):4546-4550). 합성한 펩티드의 서열은 다음과 같다:

두 글라이신 잔기를 각 펩티드의 N-말단부에 첨가하여 스페이서로서 제공하고 수득된 N-말단 글라이신의 α-아미노기에 비오틴을 결합시켰다. 펩티드를 스트렙타비딘에 결합시키고 미량웰 평판의 웰내에 코팅하였다. HIV-2 항체-양성 혈청을 사용하여 ELISA로 상기 두 펩티드를 평가하였다. 이들 결과는 표 17에 요약되어 있다. 결과는 HIV-2 감염 진단에 있어 상기 두 펩티드 서열의 유용성을 명백히 입증한다.

실시예 20: 비오티닐화된 펩티드를 사용한, c-100의 카르복시 말단부에서의 에피토프의 위치 측정

C-100 단백질의 카르복시-말단부 방향으로 위치한 에피토프에 대한 여러 보고가 있어 왔다(EP-A-0 468 527, EP-A-0 484 797). 상기 에피토프에 대해서는 반응하지만 5-1-1 단편내에 위치한 에피토프에 대해서는 반응하지 않는 특정 혈청의 반응성은 이들 혈청이 C-100에 대해서는 양성 반응을 보이지만, 상기 실시예에서 전술한 펩티드에 대해서는 그렇지 않은 이유를 설명할 수 있다. 5개의 중첩 비오티닐화된 합성 펩티드 NS4-a, b, c, d 및 e는 도 11에 제시되어 있으며 마지막 3아미노산을 제외하고는 C-100의 카르복시-말단부를 포함한다. 이들 펩티드로 제조한 LIA 스트립을 일련의 HCV Ab-양성 및 음성 혈청을 사용하여 시험하였다. 그 시험 결과(자료는 미제시)는 이하 요약되어 있다.

펩티드반응 혈청의 번호%

NS4-a00%

NS4-b23%

NS4-c00%

NS4-d00%

NS4-e1627%

실시예 21: 상이한 HCV 단백질로부터의 에피토프를 포함하는 비오티닐화된 혼성체 펩티드의 사용

실시예 12에 기술된 바와 같이, 9-머를 사용하여 HCV 다종단백질의 면역학적으로 가장 중요한 부위의 에피토프를 세밀히 지도화하였다. 이 정보를 이용하여, 2개 아미노산-길이 스페이서로 분리된 HCV 서열의 3개의 9-머 신장부로 이루어진 3개의 펩티드 서열을 만들었다. 일반적으로, Gly-Gly, Gly-Ser 또는 Ser-Gly이 연쇄 유연성을 제공하는데 사용되었다. 합성한 3개의 혼성체 펩티드내 에피토프의 배열과 그 서열이 도 12에 제시되어 있다. 3 펩티드를 LIA 스트립으로 평가하였다. 1차 평가시, 에피토프 미세 지도화 실험에 최초 사용된 혈청을 사용하였는데, 그 이유는 이 혈청과 에피토프의 상호 작용은 정확히 알려져 있기 때문이다. 이들 결과는 도 13에 제시되어 있고 표 16에 요약되어 있다. 에피토프가 이들 세 혼성체 펩티드내로 혼입되는 순서는 임의적이다. 그러나, 개개의 9-머를 기본으로 시험을 진행시키기 보다는 한정된 수의 펩티드 쇄내에 에피토프를 함께 연결시키는 것이 유리하다. 별도의 9-머를 사용함으로써 평판상에 스트렙타비딘 결합 부위를 신속히 포화시키는 반면(1 비오틴 결합 부위 / 9-머), 이들 실험에서와 같이 한정된 수의 펩티드로 9-머를 혼입시킴으로써 그 3배 정도로 결합할 수 있다(1 비오틴 결합 부위 / 3개의 9-머).

실시예 22: E2/NS1 "b" 서열 믹소토프 펩티드

합성 펩티드를 사용한 결과(상기 실시예 참조)는 대부분의 HCV 양성 혈청형 혈청이 E2/NS1의 고가변성 N-말단부에 대한 항체를 포함함을 나타낸다. 그러나, 단백질의 이 부위의 고가변성 특성 때문에, 허용 가능하게 높은 %의 혈청에서 상기 항체를 검출하기 위해서는 다소 넓은 범위의 서열을 사용할 필요가 있다. 유용한 서열 분석 결과, 관측된 아미노산 치환은 완전히 무작위적인 것은 아니며 특정 아미노산이 서열내 특정 위치에서 우세함을 나타낸다. 고가변성 서열의 길이가 다소 길기 때문에, 이 서열을 두 중첩부("a" 및 "b")로 분할하면 생성물의 질이 향상되고 합성이 간편해진다. 이 부위를 소분할함으로써 또한, 항체에 의해 가장 빈번히 인지되는 E2/NS1 단백질의 N-말단 분절의 부위가 이들 서열의 "b" 변형체에 포함되는 부위에 위치함을 결정할 수 있다. 도 14에 제시된 서열 정보에 따라, 검사한 자연 발생적 분리체에서 발견된 모든 아미노산을 각 위치에 포함하는 "믹소토프"를 함성하였다. 믹소토프 합성에 따른 기술은 도 15에 도시되어 있다. 믹소토프 합성 기술은 문헌 "Gras-masse 등, Peptide Res. (1992) 5:211-216"에 보고되어 있다. 수지를 결합될 아미노산 수와 동일한 수의 부분으로 분할하였다. 각종 아미노산간의 결합 역학에서의 차이점으로 인해 야기되는 문제점을 회피하기 위해 결합 반응을 개별적으로 수행하였다. 결합 반응후, 수지부를 모아 철저히 혼합하였다. 이 23 아미노산-길이 서열로 수득된 변형체의 전체수는 +1.147×1010이었다. 카르복시-말단 또는 아미노-말단부로부터 측정한 쇄 길이와의 함수 관계로서 변형체의 증가수를 도 14에 제시하고 있다. 믹소토프 기술의 기본 원리는 에피토프가 항체 결합에 대한 기여도가 동등하지 않은 아미노산으로 구성되어 있다는 점이다. 항체는 특정 위치에서 비교적 많은 수의 치환(일반적으로 무작위가 아님)이 이루어졌을 지라도 에피토프를 인지할 수 있다. 이러한 관점에서, 믹소토프의 항원 복합성은 혼합물을 구성하는 변형체의 수보다 실질적으로 적어야 한다. 일례로, 평균 에피토프가 6 아미노산 길이라고 가정한다면 서열내 각각의 연속적인 6 아미노산 길이 분절에 대한 변형체 수를 계산하는 것이 가능하다. 서열내 위치의 함수로서 변형체수를 도 14에제시하고 있다. 작용성 변형체 서열의 실제 수는 에피토프의 각 위치에서 치환을 허용하거나 특정 치환이 허용되는 정도를 반영하도록 변형되는 경우의 수와 동등한 축소 요인에 의해 분할된, 에피토프에 상응하는 임의의 6 아미노산-길이 서열에 대한 제시된 수와 같다. 불행히도, 에피토프(들)의 정확한 위치(들)는 알려져 있지 않다. 이는 무작위 펩티드 라이브러리가 아닌 것으로 명백히 언급되어야 한다. 자연 발생적 분리체에서 아미노산 변형체의 부재에 의해 입증된 바와 같이 치환을 허용치 않는 전체 서열내 중요 위치는 보존된다. 이러한 합성 기술의 한가지 단점은 드물게 있는 아미노산 치환이 지나치게 드러나며 더욱 보편적으로 나타나는 아미노산을 감쇄시키는 경향이 있다는 점이다. 반면, 드물게 있는 치환이 과다하게 나타남은 더욱 빈번히 나타나는 아미노산으로 구성된 에피토프 서열로는 검출할 수 없는 항체의 검출을 가능하게 할 수 있다는 가능성이 있다. 믹소토프 합성 완결후, 모든 펩티드 쇄내에는 (Gly)₂스페이서와 비오틴을 제공하여 면역적 평가를 용이하게 하였다. 믹소토프의 다수 항원 펩티드(MAP) 변형체를 동시에 합성할 수도 있다.

이전의 연구 결과는 HCV-양성 혈청의 약 90%가 조사한 16 "a" 및 "b" 서열을 지닌 N-말단 고가변부에 대한 항-E2/NS1 항체를 포함하는 것으로 밝혀질 수 있다는 것이다. HCV 항체-양성 혈청중 나머지 10%에서 이들 항체가 외관상 결핍되어 있다는 것은 다음 두 요인에 기인한 것일 수 있다: 1) 이들 환자는 E2/NS1의 부분에 대한 항체를 생성하지 못하거나 또는 2) 이들 항체를 검출하는 정확한 서열이 규명되지 못했다. HIV-1 V3 루프를 사용한 실험에 의거할 때, 후자의 가능성은 아주 비현실적으로 보이지 않는다. 믹소토프에 부가적으로 이전에 사용된 8 "b" 서열을 포함하는 LIA 스트립을 제조하였다. 음성으로 판정된 혈청 뿐 아니라, 8개의 규정 서열중 적어도 하나에 대해 사전에 양성으로 판정된 혈청을 선택하였다. 총 60종의 혈청을 시험하였는데, 그중 56 종은 사전에 양성 반응을 나타냈으며, 4종은 사전에 음성으로 밝혀졌다. 사전에 양성으로 판정된 56종의 혈청중 21종은 스트립에서 1 또는 2개의 펩티드와만 반응하거나 단지 극히 미약한 반응만을 나타냈다(자료는 미제시). 믹소토프는 시험 혈청 전체의 대략 1/3에 의해 인지되었다. 일부 혈청과 믹소토프의 반응은 놀랍게도 강력하였으며 그러나 믹소토프가 근거하고 있는 E2/NS1 서열의 집합이 실제로 나타나지 않는 것이 가능할 수 있다. 믹소토프 MAP가 E2/NS1의 아미노 말단부에 대한 광범위한 특이성의 항혈청의 행성을 유도할 것으로 예상된다.

실시예 23: 항체 생성에 분지형 HCV N-말단 E2/NS1 부위 펩티드를 사용하는 방법

E2/NS1의 N-말단부로부터의 일부 서열을 문헌 "Tam. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5409-5413, 1988"에 공지된 기술을 이용하여 다수 항원 펩티드(MAP)로서 합성하기 위해 선택하였다. 분지형 펩티드 합성에 사용된 기술은 도 16에 개략적으로 제시하고 있다. 토끼(각 MAP에 대해 두 마리 할당)에 최초 주사를 투여하고 항체 생성에 대한 1차 평가를 위해 채혈하기 전에 1회 추가 면역시켰다. 항혈청을 총 16개의 E2 펩티드(8개의 타입 1분리체로부터 유래된 서열 각각의 "a" 및 "b" 변형체)를 포함하는 LIA 스트립으로 시험하였다. LIA 스트립 검사 결과, 스트립상에서, 토끼로부터 생성된 항체와 각종 E2 펩티드간의 상당한 교차-반응이 있음이 밝혀졌다(도 17). 상이한 항혈청에 의해 인지된 "a" 및 "b" 변형체 양자가 발견될 수 있다는 사실은, 이들 두 변형체가 중첩되는 부위에 적어도 하나의 에피토프가 위치함을 나타낸다.

실시예 24: 비오티닐화된 합성 펩티드를 사용한 HTLV 감염 진단

HTLV-I 및 II는 종양성 레트로비루스와의 항원 관련 비르스이다. HTLV-1 감염은 두 질환 증후군: HTLV-1-관련 척수병/영양성 경련성 대부전 마비(신경 질환) 및 성인 T-세포 백혈병(ATL)과 관련 있는 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, HTLV-II는 공지의 질환증후군과 연관있는지는 확실치 않다. 이 비루스는 모(毛) 세포 백혈병 환자에게서 최초로 분리해냈으나, HTLV-II 감염과 질환 상태와의 인과 관계는 정립될 수 없었다. HTLV-1 감염은 인체 질환 유발 가능성을 가진 것으로 명확히 입증된 반면, HTLV-II 감염은 가능성을 가지지 않은 것으로 보이므로, 이들 두 감염원을 구분하는 것이 임상적으로 관심을 끌고 있다. 이들 두 비루스는 항원적으로 깊은 관련이 있으므로, 항체 검출에 비루스 항원 또는 재조합 항원을 사용할 때 HTLV-I과 HTLV-II 감염을 판별하는 것이 어렵다. 다수의 비오티닐화된 펩티드를 합성하여, HTLV-I 또는 HTLV-II에 의한 감염에 대한 응답 반응으로 생성된 항체를 검출할 수 있는 능력에 대해 평가하였다. 일부 펩티드는 HTLV-I 및 HTLV-II간에 고도로 보존된 에피토프를 포함하기 때문에 선택되었으며 따라서 비루스 유형에 관계 없이 HTLV 감염을 검출하는데 유용한 시약이다. 다른 펩티드는 HTLV-I 및 HTLV-II 감염을 구분하는 에피토프를 포함하기 때문에 선택되었다. 합성된 펩티드는 다음과 같다.

상기 다수의 펩티드를 사용하여 HTLV에 대한 항체의 검출용 LIA 스트립을 제조하였다. 각각 HTLV-I p19 gag 단백질과 외피 당단백질의 부위로부터 유래된 몇몇 펩티드, 예컨대 I-p19 및 I-gp46-4는 HTLV-I 및 HTLV-II 양자의 감염 결과로서 생성된 항체에 의해 인지될 것으로 예상되는데, 그 이유는 이들 서열이 두 비루스에서 상당히 상동적이기 때문이다. 기타, 예컨대 HTLV-1의 경우 I-gp46-3, I-gp46-6 및 HTLV-II의 경우 II-gp52-1, II-gp52-2 및 II-gp52-3은 항체의 판별뿐 아니라 검출에도 유용할 수 있다. HTLV-1과 HTLV-II 서열간에는 일부 상동성이 있으므로, 교차-반응이 예상된다. 그럼에도 불구하고, 각종 펩티드에 대한 반응의 강도는 항체 생성을 유발하는 비루스의 존재를 나타내야 한다.

다수의 비오티닐화된 HTLV-I 및 HTLV-II 펩티드를 사용하여 제조한 LIA 스트립의 예는 도 18에 제시되어 있다. 시판 혈청 패널(Boston Biomedica Inc., 혼합 적정 패널, PRP203)을 사용하여 LIA 스트립을 평가하였다. 시험 결과는 배급업자에 의해 제공된 분석과 완전히 일치한다. 단지 한 샘플(9번)만이 HTLV-I에 대해 양성이다. 12번 샘플은 펩티드 I-p19에 대해 양성 반응이므로 양성으로 검출된다. 이 샘플은 상기 펩티드를 사용하여 판별될 수도 없고 혈청 패널의 배급업자에 의해 이용된 다른 시험으로도 판별될 수 없다. 11번 샘플은 음성인 것으로 밝혀졌으며, 다른 모든 샘플은 HTLV-II에 대해 양성인 것으로 밝혀졌다. 추가 실험에서 비오티닐화된 HTLV-I 및 HTLV-II 펩티드를 이용하여 ELISA를 수행하였다. 펩티드를 스트렙타비딘과 개별적으로 착물 형성한 후 코팅 이전에 혼합하였다. LIA 스트립을 평가하는데 사용된 패널로부터의 몇몇 샘플을 사용하여 ELISA로 펩티드를 평가하였다. 이들 결과는 표에 제시되어 있다. 이러한 형태의 ELISA는 HTLV-I 및 HTLV-II 감염을 판별하는데 사용할 수는 없지만 일반적으로 비루스 유형과 관계 없이 HTLV-양성 샘플을 규명해야 한다. 그 결과는 HTLV 감염 진단에 있어 이들 펩티드의 유용성을 추가 입증한다.

본 발명에 따라, 비루스 단백질의 면역학적으로 중요한 영역을 나타내는 일련의 비오티닐화된 펩티드가 동정되었고, 고체상 펩티드 합성에 의해 제조되었다. 이들 펩티드를 HCV, HIV, HTLV-1 또는 II, 또는 이들의 조합에 대한 항체의 검출에매우 유용한 것으로 확인되었다. 일부 바람직한 예에서, 이들 펩티드는 BALB/C 생쥐와 같은 건강한 동물내 HCV, HIV, HTLV-1 또는 HTLV-II, 또는 이들의 조합 감염을 예방하는 백신 조성물에 유용한 것으로 발견되거나 또는 적어도 기대되었다.

본 발명의 실시예 부분에서 입증하는 바와 같이, 비오티닐화된 펩티드의 사용은 또한 사전에 결정된 단백질 서열내의 면역학적으로 중요한 에피토프의 측정을 가능하게 한다. 고체상에 공유 결합된 비오티닐화되지 않은 펩티드를 사용한 면역학적으로 중요한 에피토프의 측정은 종종 상기 에피토프를 찾아내지 못한다. 특히, 구조성 에피토프의 위치 측정의 경우, 비오티닐화된 펩티드의 사용이 매우 유용한 것 같다.

Claims

C형 간염 바이러스(HCV) 타입 3의 NS4 영역으로부터의 펩티드로서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 그 아미노산 서열에 포함하는 펩티드:
제1항에 있어서, HCV 타입 3의 NS4 영역의 아미노산 위치 1688 내지 1743 사이의 영역으로부터 선택된 펩티드.
제1항 또는 제2항중 어느 한 항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드:

또는 그들의 N-말단측에 아미노기, 또는 펩티드 쇄의 아미노 말단의 화학적 변형을 갖는 상기 펩티드;

또는 그들의 C-말단측에 OH-기, NH₂-기 또는 이들 두 기중의 하나와 관련된 결합을 갖는 상기 펩티드;

또는 변이 펩티드가 HCV 타입 3의 하나 이상의 균주에 대한 면역학적 능력을 제공할 수 있다면, 상기 아미노산 서열중 하나에 관한 비-보존적 및 보존적 아미노산 치환과 삽입, 결실을 나타내는, 상기 펩티드중 하나의 변이체;

또는 그들이 유도되는 상기 펩티드 서열의 모든 민감성을 유지하는, 상기 펩티드중 하나의 단편;

또는 이어지는 고리화 단계에서 이용될 메르캡토기를 제공하기 위한 티올-함유 화합물을 상기 아미노산 서열의 펩티드쇄내에 혼입시켜 얻어질 수 있는, 상기 펩티드중 하나의 고리형;

또는, 상기 펩티드중 하나의 측쇄 펩티드 형.
제1항 또는 제2항중 어느 한 항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드:
공유 또는 비공유로 연결되고, Gly 또는 Ser잔기인 스페이서(spacer) 잔기에 의해 분리된, 제1항에 따른 펩티드 서열 둘 이상의 조합을 그 아미노산 서열내에 포함하는 하이브리드(hybrid) 펩티드.
HCV 코어, E1 또는 NS5 에피토프 함유 서열과 제1항에 따른 HCV 타입 3 NS4 에피토프 함유 서열의 조합을 포함하는 펩티드.
제1항에 있어서, 상기 펩티드가 펩티드 합성동안 비오티닐화되고 N-말단, C-말단 또는 내부에서 비오티닐화되는 펩티드.
제7항에 있어서, 고체상에 결합된 스트렙타비딘 또는 아비딘에 결합된 펩티드.
제7항에 있어서, 상기 펩티드가 나일론막상에 존재하는 스트렙타비딘에 비오틴기를 통해 결합되는 펩티드.
제1항에 있어서, 상기 펩티드가 공유 또는 비공유 상호작용을 통해 고체 지지체에 고정되는 펩티드.
(i) HCV의 존재여부를 분석할, 인체를 제외한 생물학적 시료를 제1항에 따른 펩티드와 접촉시키는 단계,

(ii) 상기 펩티드와 항체사이에 형성된 면역 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 인체를 제외한 생물학적 시료에 존재하는 HCV에 대한 항체를 검출하는 방법.
(i) HCV의 존재여부를 분석할, 인체를 제외한 생물학적 시료를 제1항의 펩티드와 접촉시키는 단계,

(ii) 상기 펩티드와 항체사이에 형성된 면역 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 인체를 제외한 생물학적 시료에 존재하는 HCV의 타입을 결정하는 방법.
제12항에 있어서,

하기로부터 선택되는 HCV 타입 2 NS4 펩티드 하나 이상을 추가로 포함하는 방법:
제12항 또는 제13항에 있어서,

하기로부터 선택되는 HCV 타입 1 NS4 펩티드 하나 이상을 추가로 포함하는 방법:
제1항의 펩티드를 포함하는, HCV 항체 검출을 위한 진단 키트.
고체상에 부착된 제1항의 펩티드 또는 항원과 경쟁할 수 있는 제1항의 펩티드를 포함하는, HCV 항체 검출을 위한 진단 키트.
제15항에 있어서,

상기 펩티드가 평행선의 형태로 막에 부착된, HCV 항체 검출을 위한 진단 키트.
제1항에 따른 HCV 타입 3 NS4 펩티드를 포함하는 시료에서 상이한 HCV 유전형들에 대한 항체의 존재 여부를 동시에 검출하기 위한 진단 키트.
제18항에 있어서, 제13항에서 정의된 NS4 타입 2 펩티드를 추가로 포함하는 진단 키트.
제18항 또는 제19항중 어느 한 항에 있어서, 제14항에서 정의된 HCV NS4 타입 1 펩티드를 추가로 포함하는 진단 키트.
제1항의 HCV 타입 3의 타입-특이적 NS4 펩티드의 이용을 포함하는 HCV 종의 타입결정 방법.
N-α-Fmoc-X(N-y-비오틴) 또는 N-α-Fmoc-X(N-y-비오틴)유도체를 중간생성물로 사용하는, 제7항에 따른 비오티닐화된 펩티드 또는 그들의 에스테르를 제조하는 방법으로서, 이때 X는 하기 식으로 표시되고 Fmoc은 9-플루오레닐메톡시카르보닐을 나타내는 것인 방법:

상기 식에서,

n은 1이상 10이하이며, 3 내지 6이 바람직하고, 하나의 아미노기가 Cα원자에 부착되고 다른 하나의 아미노기는 측쇄의 최말단 탄소인 Cy탄소에 부착되며 y는 COOH기를 보유하는 탄소원자(Cα)와 관련하여 위치 y를 나타낸다.
제22항에 있어서, N-α-Fmoc-X(N-y-비오틴)이 N-α-Fmoc-Lys(N-ε-비오틴) 또는 N-α-Fmoc-오르니티닐(N-ε-비오틴)이고, 이때 Fmoc은 9-플루오레닐메톡시카르보닐인 방법.
제22항 또는 제23항에 따른 중간 생성물의 카르복시-활성화된 형태를 수지에 부착된 절단가능한 링커를 결합시켜수지를 얻는 단계(Fmoc은 9-플루오레닐메톡시카르보닐이며, L은 제22항에서 정의된 X를 나타내며, B는 비오틴을 나타낸다),

-상기 중간 화합물의 α아미노기를 탈보호시켜수지를 얻는 단계,

-보호된 연속적인 아미노산 AA₁…AA_m(m은 첨가되는 아미노산의 수)을H₂N--수지에 계속 첨가하여수지를 얻는 단계,

-얻어진 화합물의 NH₂-말단의 탈보호, 수지로부터의 절단(측쇄 탈보호 및 절단은 동시에 또는 따로 수행될 수 있음), 카르복시 말단에서 비오티닐화된, 수득된 펩티드의 추출 및 정제에 의해을 얻는 단계를 포함하는,

제7항에 따른 카르복시 말단 비오티닐화된 펩티드 제조방법.
보호된 연속적인 아미노산 AA₁…AA_m(m은 첨가되는 아미노산의 수)을 수지상에 첨가하여 Fmoc-AA_m…AA₁-수지를 얻는 단계(Fmoc은 9-플루오레닐메톡시카르보닐임),

-NH_2-말단의 탈보호 단계,

-인 중간 생성물을 그 COOH를 통해 NH₂말단에 첨가하여수지(L은 제22항에서 정의된 X를 나타내며 B는 비오틴을 나타냄)를 얻는 단계,

-수득된 화합물의 NH₂말단기의 탈보호, 수지로부터의 절단(측쇄 탈보호 및 절단은 동시에 또는 따로 수행될 수 있음), 아미노 말단에서 비오티닐화된, 수득된 펩티드의 추출 및 정제에 의해을 얻는 단계를 포함하는,

제7항에 따른 N-말단 비오티닐화된 펩티드 제조방법.
보호된 연속적인 아미노산 AA₁…AA_m(m은 첨가되는 아미노산의 수)을 수지상에 첨가하여 Fmoc-AA_m…AA₁-수지를 얻는 단계(Fmoc은 9-플루오레닐메톡시카르보닐임),

-NH_2-말단의 탈보호 단계,

-중간 생성물을 그 COOH를 통해 NH₂말단에 첨가하여수지(L은 제22항에서 정의된 X를 나타내며 B는 비오틴을 나타냄)를 얻는 단계,

-중간 생성물의 α아미노기를 탈보호하여수지를 얻는 단계,

-보호된 연속적인 아미노산 AA₁…AA_p(p는 첨가되는 아미노산의 수)을 수지상에 첨가하여수지를 얻는 단계,

-수득된 화합물의 NH₂말단기의 탈보호, 수지로부터의 절단(측쇄 탈보호 및 절단은 동시에 또는 따로 수행될 수 있음), 내부에서 비오티닐화된, 수득된 펩티드의 추출 및 정제에 의해을 얻는 단계를 포함하는,

제7항에 따른 N-말단 비오티닐화된 펩티드 제조방법.
제1항에 따른 펩티드를 포함하는, HCV 감염에 대한 면역을 위한 백신 조성물.
제1항에 따른 펩티드의 합성이 용액에서 또는 고체 지지체상에서 이루어지는 펩티드 제조 방법.