CN100479859C - 一种针对靶的空间变构现象筛选可抑制和/或激活所述靶生物活性的物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种使存在受调控空间变构之特定靶产生变构的方法，和用该现象筛选可抑制和/或激活该靶生物活性的物质，特别是筛选药物如抗病毒药物靶点的方法，和由该方法筛选所得用于抑制和/或激活该靶生物活性的物质，以及筛选所得物质用于制备治疗与该靶的空间变构相关的疾病的药物之用途。还涉及已变构的靶物质，和用于预防感染该靶物质之疫苗，其含仅具免疫原性的发生了空间变构的相应靶物质或其片段，还涉及一种针对该变构的靶物质的抗体。
Description
发明领域
本发明涉及一种模拟或引发存在受调控的空间变构之特定靶产生空间变构现象的方法，以及利用该现象筛选可抑制和/或激活所述靶生物活性的物质的方法，特别是提供了一种筛选药物靶点的方法，尤其是筛选抗病毒药物靶点的方法，该靶点可作为药物和/或治疗、预防性抗体的作用位点。本发明的另一方面涉及已经发生了空间变构的靶物质。本发明的又一方面涉及一种用于预防和/或治疗受试者感染前述靶物质之疫苗，其中包含仅具有免疫原性的发生了空间变构的相应靶物质，或其具有同样的免疫原性的片段，以及任选的药学可接受的载体。本发明还涉及一种针对前述的发生了空间变构的靶物质的抗体，优选为人源化抗体。此外，本发明还涉及由所述方法筛选得到的用于抑制和/或激活所述靶生物活性的物质，以及所述筛选得到的物质用于制备治疗与所述靶的空间变构相关的生物活性的疾病的药物之的用途。
发明背景
在生命活动中，无论是生物内部的各种生命活动过程，还是病原体与宿主之间的相互作用，绝大多数均涉及生命活动参与分子之间的相互作用，以及作用后引起的靶空间构型的改变，这种靶空间构型的改变往往是激活下游事件的必要条件，因此这种改变了的分子构型可能成为筛选抑制和/或激活所述靶生物活性的药物的有效作用靶点。但这种在体内发生的靶空间构型的改变通常是短暂的。因此，如果可以体外模拟所述靶的空间变构现象，从而获得有效的足够量的相对稳定的这种变构了的分子，就会大大方便针对所述靶空间变构现象的药物靶的鉴定，从而进一步筛选针对所述靶的相应的调节所述靶生物活性的物质。令人遗憾的是，迄今未见有比较通用的这类方法的报道。为解决上述问题，更有效地获得新型药物筛选模型，本发明人在此公开了一种体外模拟特定靶的空间变构的方法，以及利用所得空间变构模型进一步筛选针对所述靶的抑制和/或激活所述靶活性的物质。并在此基础上，进一步得到了预防和/或治疗与该靶物质相关的疾病的疫苗和抗体。
发明概述
本发明的一个方面，涉及一种模拟或引发存在受调控的空间变构现象的特定靶产生空间变构的方法，其中所述空间变构现象为该特定靶的生物学活性相关，所述方法包括将所述靶与第一种待测定的物质在适于发生空间变构的相互作用之条件下接触一段时间的步骤，从而使该靶发生类似于生理状态下的变构。
本发明另一方面涉及由上述方法制备的发生了空间变构的靶物质，其中所述靶物质可任选地与使其发生空间变构的物质相结合。
本发明另一方面，涉及一种用于预防和/或治疗受试者感染前述靶物质之疫苗，其中包含了仅具有免疫原性的前述发生了空间变构的相应靶物质，或其具有同样的免疫原性的片段，以及任选的药学可接受的载体。
本发明还涉及一种针对前述的发生了空间变构的靶物质的抗体，优选为人源化抗体。
本发明的另一方面，涉及一种利用上述所得的变构靶筛选可抑制和/或激活所述靶的生物活性之物质的方法，包括将发生了空间变构的靶与第二种待测定的物质在适于发生相互作用的条件下接触一段时间；测定经上述处理的所述靶的生物活性，并与对照靶相比较；确定能够引起所述靶生物活性的改变量超过预定阈值的物质。
本发明的又一方面，涉及利用上述方法获得的物质用于制备治疗与所述靶的空间变构相关的疾病的药物之的用途。
发明详述
随着分子免疫学、分子生物学等方面的研究不断发展，人们越来越多地发现，参与多种病理或生理过程的某些分子之间的相互作用过程中存在特殊的空间立体变构现象，这种空间变构往往是激活下游事件的前提。典型地，病原体与宿主细胞，尤其是病毒与其靶细胞之间相互作用的病毒和/或细胞表面的特定分子，在病毒进入该靶细胞之前往往经历瞬时的空间变构，以暴露出最为有利于相互作用的位点，从而进一步实现对靶细胞的侵入和攻击。
本发明的一个方面，涉及一种模拟或引发存在受调控的空间变构之特定靶产生空间变构的方法，其包括将所述靶与第一种待测定的物质在适于发生空间变构的相互作用之条件下接触一段时间的步骤，从而使该靶发生类似于生理状态下的变构。其中，所述受调控的空间变构的出现是该特定靶对相应宿主发挥生物学作用的前提和必经途径。本发明中所述生物学作用包括靶物质对宿主的结合、入侵、感染、等。
本发明中所述的靶，包括但不限于，与特定疾病相关联的细胞因子、疾病引发或产生途径中具有关键作用的酶、或其生物活性片段，以及病毒、辅助病毒，优选为甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒，艾滋病病毒；或是，所述病毒衣壳蛋白中的特定生物活性位点；或是该病毒所针对的特定靶细胞表面的受体分子。在本发明中，所述用于体外模拟该靶的空间变构的第一种待测定的物质包括但不限于，针对该靶的单克隆抗体、酶、多肽或其具有结合活性的片段，可与该靶相互作用的小分子化合物。本领域技术人员知晓，只要可以使得所述靶体外足够稳定地形成类似生理条件下的变构形态，任何物质都可以使用。本发明人甚至还构思了对该靶的体外处理方法，例如特定频率的光谱照射、加热或冷冻、改变环境溶液中的pH值、离子强度等，使得该靶呈期望的变构形式。
在本发明的一个实施方案中，其中所述靶为戊型肝炎病毒表面蛋白的一个表位NE2(参见中国专利申请CN00130634.0和国际申请PCT/CN01/01469)，第一种待测定的物质选自针对该特定位点的单克隆抗体。在本发明的一个实施方案中，所述的针对该特定位点的单克隆抗体为8C11。在本发明的一个实施方案中，通过将所述靶戊型肝炎病毒表面蛋白表位NE2与特定单克隆抗体8C11结合，得到了产生明显的变构作用的NE2蛋白-8C11复合物，该变构了的复合物上与针对原NE2表位之单克隆抗体8H3结合的表位暴露的更为充分，而其上与针对原NE2表位之单克隆抗体2C9结合的表位丧失。具体地，在表达戊型肝炎病毒(HEV)第二开放读玛框架(ORF2)的一个片段NE2(ORF2a.a.394～603)时，发现其在溶液中表现为二聚体到十二聚体的多种聚合形式，实验表明具有良好的免疫反应性、免疫原性及免疫保护性。在本发明的一个实施方案中，用NE2免疫Balb/c小鼠，筛选出了多株抗NE2的单抗，其中三株识别构相性表位的单抗(8H3、8C11、13D8，分别于2001年11月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，武汉，武汉大学(CCTCC)，保藏号分别为为：C200117、C200116、C200114)能在免疫捕获PCR实验中捕获天然HEV病毒颗粒。
利用酶联免疫吸附实验(ELISA)和生物传感器进行单抗间对NE2抗原的相互阻断实验时，发现8C11和13D8的相互阻断明显，8H3和2C9的相互阻断明显，可能识别共同或空间重叠的抗原表位；而出乎意料的是，当13D8对8H3和2C9均表现出一定的阻断效果的同时，8C11表现出对8H3与NE2结合的明显增强以及使8H3对NE2得结合从快速结合快速解离模式转变成快速结合缓慢解离得模式，同时对2C9的结合表现为明显阻断，提示8C11与NE2的结合导致了NE2蛋白的某种变构，使8H3的表位暴露得更为充分，同时导致了2C9表位的破坏。用大肠杆菌表达HEV ORF2的a.a.368～601片段(208蛋白)、a.a.368～602片段(209蛋白)、a.a.368～603片段(239蛋白)、a.a.356～603片段(251蛋白)、a.a.345～603片段(262蛋白)和a.a.368～660片段(292蛋白)，均可形成类病毒颗粒(VLP)，以这些VLP为抗原，均无一例外可以见到8C11单抗对8H3单抗的明显增强作用，提示8C11单抗对8H3对应表位区域的变构作用并非一种偶然现象。为验证这一变构作用是否也存在于天然HEV病毒，我们将不同单抗分别包被eppendorf管，取1份感染HEV 3周(抗体尚未阳转)的恒河猴排出的HEV RNA阳性粪便悬液进行免疫捕获RT-PCR实验，结果8C11包被可以捕获病毒，若将1:100 8C11单抗事先与病毒孵育，则可以阻断捕获，说明8C11单抗可与HEV病毒颗粒牢固结合；单以8H3单抗包被，以不同稀释度的8C11(从1:10到1:100 000)先与病毒孵育，则与1:10、1:100和1:1000单抗8C11孵育的病毒可被8H3捕获，而1:10 000和1:100 000单抗8C11孵育的病毒以及未经单抗8C11孵育的病毒仍不被捕获；以1:100单抗13D8孵育的病毒也不被8H3捕获；单抗2C9对有无经1:100单抗8C11孵育的病毒均不捕获。这些结果说明在天然HEV病毒中也存在着8C11单抗的结合导致的8H3单抗识别表位区域的明显变构作用，这一变构导致了8H3识别表位的良好暴露，而且并非所有单抗8C11表位区域的结合均会导致这一变构，因为识别同一区域的单抗13D8并未引起类似的变构。另外，在单克隆抗体对多份戊肝病人感染血清与NE2蛋白结合的阻断实验中，单抗8C11对恢复期血清的阻断效果较为明显，而单纯单抗8H3以及单抗2C9未见明显的阻断效果，但单8C11与8H3联合阻断时，阻断效果比单纯的8C11阻断还要明显得多；而8C11与2C9联用或13D8与8H3联用均仅相当于8C11或13D8单独使用时的阻断效果，说明在天然感染血清的抗HEV多抗中，也存在着大量类似于8H3的抗体，因此8H3识别表位区域的被诱导变构的现象很可能亦存在于HEV感染的天然进程中。
本发明另一方面涉及由上述方法制备的发生了空间变构的靶物质，其中所述靶物质可任选地与使其发生空间变构的物质相结合。本领域技术人员知晓，本发明所述引起存在受调控的变构现象的靶物质发生是在可发生空间变构的条件下由特定物质引发或诱导的，所述引发或诱导该靶物质的特定物质可以是针对该靶的单克隆抗体、酶、多肽或其具有结合活性的片段，可与该靶相互作用的小分子化合物。在靶物质产生了期望的空间变构后，诱导空间变构的物质可以与该靶物质结合或不结合，只要该变构的物质能在一段时间内保持稳定的构象。
本发明另一方面，涉及一种用于预防和/或治疗受试者感染前述靶物质之疫苗，其中包含了仅具有免疫原性的前述发生了空间变构的相应靶物质，或其具有同样的免疫原性的片段，以及任选的药学可接受的载体。在本发明中，所述疫苗中包含待预防的由特定靶物质引起的感染或疾病之发生了空间变构的靶物质。例如，如果预防针对艾滋病病毒引起的感染，则疫苗中含有发生了空间变构的艾滋病病毒衣壳蛋白，其中只要所述发生了空间变构的靶物质的片段具有免疫原性，就可使用。本领域技术人员知晓，疫苗中包含的药学可接受的载体取决于疫苗施用的途径、受试者类型以及疫苗中包含的具体靶物质的性质。只要与所使用的疫苗之目的相容的任何疫苗制备中常用的载体均可使用。
本发明还涉及一种针对前述的发生了空间变构的靶物质的抗体，优选为人源化抗体。本发明所述的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，以及嵌合抗体，单链抗体或其片段等。本发明中公开了针对所述发生了空间变构的靶物质的抗体，尤其是公开了针对在变构后暴露出特定表位或形成的特定表位的抗体。只要能够是产生空间变构的本发明的靶物质之构象稳定足够的一段时间，则本领域技术人员可按照共知的技术制备相应的抗体。
本发明的另一方面，涉及一种利用上述变构了的靶，筛选可抑制和/或激活所述靶生物活性的物质的方法，其中包括：
1)将发生了空间变构的靶与第二种待测定的物质在适于发生相互作用的条件下接触一段时间；
2)测定经上述处理的所述靶的生物活性，并与对照靶相比较；
3)确定能够引起所述靶生物活性的改变量超过预定阈值的物质。
本发明中，所述生物活性的改变包括活性增加和/或降低。本发明中所述的第二种待测定的物质可选自针对该变构了的靶的单克隆抗体、酶、多肽或其具有结合活性的片段，可与该变构了的靶相互作用的小分子化合物。其中所述的生物活性取决于靶。
本领域技术人员知晓，一旦该利用上述方法得到了该靶的变构形式，从而暴露出其激活下游事件的结构域，即可作为药物筛选的靶点，或制备该结构域的抗体作为其下游事件的拮抗剂，或作为疫苗使之诱导出有效的抗体。或筛选可模拟该结构域的药物分子，通过拮抗或模拟该结构域的作用进行疾病的治疗或预防。
在本发明的一个实施方案中，靶为戊肝病毒表面蛋白的表位NE2。经过如上述方法得到变构了的戊肝病毒表面蛋白NE2后，可以其进一步筛选中和该病毒的药物。具体地，在单克隆抗体中和HEV病毒对恒河猴的感染性的实验中，可以见到单抗8C11和13D8均可至少部分中和HEV病毒的感染性，提示其识别表位很可能是HEV的肝细胞受体结合部位。在病毒感染细胞的过程中，通常需要多个受体的协同作用，而继第一受体结合之后的第二受体结合产生的吸附增强作用，通常对于病毒成功侵入细胞内至关重要。由于HEV病毒存在8C11表位区域与单抗结合后引起的明显的结构改变，以及天然感染血清中大量类似于8H3单抗的抗体的存在，推测8C11单抗对应的表位区域可能为HEV感染宿主细胞的第一受体的结合部位，而8H3表位区域可能对应着第二受体的结合部位，使病毒牢固地吸附在宿主细胞表面，或者是这一区域的结构改变使某些蛋白酶切割位点暴露在外，使之可被宿主细胞的相应蛋白酶切割，导致病毒衣壳的裂解、病毒核酸释放入细胞浆中，进入病毒感染的下一进程，因此，能与8C11诱导变构后的8H3表位区域结合的分子，将很有可能可阻断HEV的感染进程，因此该区域可作为抗HEV病毒药物的良好靶点，而易于大量获得的8C11单抗与NE2蛋白及其类似蛋白的复合物则可作为足量及稳定的药物筛选靶标，使这类药物的筛选成为可能。
病毒与受体结合后病毒颗粒表面发生的一系列变构现象已在多种病毒中被发现。例如，在研究脊髓灰质炎病毒时发现，病毒结构蛋白VP4在天然状态下是潜伏在毒粒内部的，并不突出于表面，当病毒与宿主细胞在近生理温度下，孵育一段时间后，即发现VP4蛋白成分突出到毒粒表面，并与细胞的某个特异性受体发生了结合，随后引发感染形成；用电子显微镜冷冻断裂法研究证明，副粘病毒在结合红细胞后，其主要结构发生了变化，仅在发生了形态改变的颗粒才能与红细胞膜融合；艾滋病毒(HIV)gp160由gp120和gp41非共价结合而成，gp120形成HIV的棘突，将带gp120结合位点的可溶性CD4结构加到HIV中，gp120可释放出来，通过测定单克隆抗体结构和蛋白酶敏感性的变化，表明包膜糖蛋白构型的变化是由可溶性CD4结合引起的；此外还发现，可溶性CD4的结合也强化了猴免疫缺陷病毒的感染，有人认为这种受体调节的病毒活化是由受体诱导病毒蛋白的构型变化所引起的，这种构型的变化对病毒的侵入是必需的。因此，根据本发明所述方法，首先筛选出可引起HIV gp120发生构型变化的单克隆抗体及识别gp120变构后形成的新的优势表位的单克隆抗体，由于gp120变构对于HIV成功感染的高度重要性，这一变构构型可能具有较高的保守性，因此利用所筛到的单抗与重组表达的gp120形成的变构gp120分子作为新型HIV疫苗，使体内产生针对这一变构表位的中和抗体起到阻断HIV感染的作用，有可能可回避HIV gp120高度变异造成的疫苗研制的困难，获得有效的保护性抗体；或者利用变构gp120分子作为抗HIV药物的新靶点，筛选能有效结合该变构构型从而阻断HIV感染的新药，或利用这一变构分子筛选出细胞上的相应结合蛋白，作为抗HIV药物设计的靶标。
类似地，也可对乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)的膜蛋白、核心蛋白筛选类似的单克隆抗体，发现可引起类似感染进程中变构构型的单抗，进而利用该单抗与相应抗原的复合物所暴露出的构型作为靶标进行抗HBV、抗HCV药物的设计与筛选。
本发明的另一方面，涉及利用上述方法获得的物质用于制备治疗与所述靶的空间变构相关的生物活性的疾病的药物之的用途。本发明中，与所述靶的空间变构相关的生物活性的疾病包括但不限于，甲、乙、丙、丁、戊型肝炎，艾滋病。同样，本发明所述方法应不限于鼠源单克隆抗体，优选为嵌合抗体，更优选为人源化抗体，还可适用基因工程抗体或其他易于大量制备的能与靶结合并引起其发生特定变构的其他分子。
附图说明
图1。几种单克隆抗体与所针对的NE2抗原的典型结合解离过程图。
图2。针对NE2抗原的数种单克隆抗体间的相互阻断曲线。
图3。单克隆抗体8C11对8H3结合天然HEV病毒能力的影响。A1～A4为8C11包被，A6～A12为无包被；B1～B12为8H3包被；C1～C2为8H3包被；B4～B7为2C9包被；C9为RNA提取阴性对照；C11为第二轮PCR阴性对照；A1～A2为直接加粪便悬液；A3～A4为粪便悬液事先与1:100单抗8C11孵育；A6为直接加粪便悬液；A7～A11依次为粪便悬液与1:10、1:100、1:1000、1:10000和1:100000单抗8C11孵育；A12为粪便悬液与1:100单抗13D8孵育；B1、B2为直接加粪便悬液；B3、B4为1:10单抗8C11孵育粪便；B5、B6为1:100单抗8C11孵育粪便；B7、B8为1:1000单抗8C11孵育粪便；B9、B10为1:10000单抗8C11孵育粪便；B11、B12为1:100 000单抗8C11孵育粪便；C1、C2为1:100单抗13D8孵育粪便；C4、C5为直接加粪便；C6、C7为1:100单抗8C11孵育粪便。
下面结合附图和具体实施例对本发明进一步加以描述。为表述方便，特以戊型肝炎病毒为例说明，并不意在限制本发明所述的要求保护的范围仅为戊型肝炎病毒。
实施例：
实施例一
抗NE2单克隆抗体的相互阻断实验(ELISA)
先制备NE2包被的微孔板及标记HRP(辣根过氧化物酶)的8H3、8C11、13D8。NE2的包被：HPLC纯化的NE2抗原，溶解于0.05mol/L碳酸盐包被缓冲液(pH9.5)中，浓度为0.3μg/ml，100μl/孔包被96孔聚苯乙烯微量滴定板，37℃吸附2hr，4℃过夜；PBST洗涤液(pH7.4)洗涤1遍，200μl/孔封闭液(含2％明胶、0.2％酪蛋白和2％蔗糖的PBS，pH7.2)37℃封闭2hr，甩干、拍干后真空封闭，4℃保存备用。各单抗按改良过碘酸钠法标记：分别称取HRP、NaIO4各3mg，各用150μl超纯水溶解，迅速将二者混匀，置4℃静置避光氧化30min，再迅速加入3μl乙二醇并混匀，置室温静置避光终止氧化30min；分别取100μl活化好的HRP到已用pH9.50.05mol/L碳酸盐缓冲液透析好的1.6mg的三个单抗(8H3、8C11、13D8)中，混匀，用相同的碳酸盐缓冲液继续透析6hr，然后往每个透析袋中加入适量稀释的NaBH40.2mg，于4℃还原2hr，再用PBS(pH7.2)透析数小时后，收获标记好HRP的单抗于4℃保存。
单抗相互阻断程序：先于NE2板中加入100μl的第一抗体(阻断方，用含20mM pH7.2PBS，1％酪蛋白的样品稀释液1:50稀释)，并设置相应的空白孔(即加入不含第一抗体的样品稀释液100μl)，37℃反应30min；PBST洗涤5遍，扣干，于每孔中加入100μlHRP标记的第二抗体(被阻断方，用含20mM pH7.2PBS，0.5％酪蛋白的酶稀释液稀释到空白孔读值大致在1.0左右)，37℃反应30min；PBST洗涤5遍，扣干，每孔中各加入显色剂A、显色剂B(HRP显色底物，北京万泰生物药业公司提供)，37℃显色10min，然后用2M H2SO4终止，于TECAN公司的SUNriseTM酶标仪上读取OD450/620nm的读值。按1-样品孔读值/空白孔读值算得这三个单抗间的抑制率如下表(表一)：
表一 8H3、8C11、13D8三个单抗间的相互阻断率
*：8C11对8H3非但没有抑制，而且还有将读值提高将近一倍的作用。
从上表可以看出，8C11与NE2结合后，可以使NE2变构，使其更易于与8H3反应。
实施例二
抗NE2单抗间的相互阻断实验(生物传感器结合实验)
在生物传感器上，先加入第一抗体(阻断方，各抗体用pH7.2PBS1:100稀释)，同时加入不含抗体的PBS作为空白对照，在第一抗体与已包被在生物传感器反应皿上的NE2充分反应，待结合动力学曲线趋于平缓后，用PBST洗去未结合的一抗，然后再加入第二抗体(被阻断方，各抗体用pH7.2PBS1:100稀释)反应，取得前3分钟的结合量作为样品结合量及相应的空白对照结合量。按1-样品结合量/空白对照结合量算得这三个单抗间的抑制率如下表(表二)：
表二 8H3、8C11、13D8、2C9四个单抗间的相互影响(Biosensor NE2包被)
*此数据前的-号表示8C11对8H3非但没有抑制，如且还有将结合量提高将近一半的作用。
实施例三
8C11单抗对HEV类病毒颗粒的变构作用
用大肠杆菌表达HEV ORF2的a.a.368～601片段(208蛋白)、a.a.368～602片段(209蛋白)、a.a.368～603片段(239蛋白)、a.a.356～603片段(251蛋白)、a.a.345～603片段(262蛋白)和a.a.368～660片段(292蛋白)，均可形成类病毒颗粒(VLP)，用其包被微孔板来研究8C11对8H3的影响。实验方案参照实施例一，其结果总结如表三，并以239为实例说明之(表四)。
表三 以不同的成颗粒重组蛋白为包被抗原所得到的8C11对8H3的增强效应
表四 以239C为实例说明8C11对8H3的增强效应*
*262C的包被浓度为0.3μg/ml。
说明：从上表可看出，对239而言，8C11改变239的构象后，大致可10倍增强8H3的与239的反应性。
实施例四
8C11单抗对8H3单抗捕获天然HEV病毒能力的增强作用
取1份感染HEV 3周(抗体尚未阳转)的恒河猴排出的HEV RNA阳性粪便悬液进行免疫捕获RT-PCR实验。程序：在1.5ml聚苯乙烯离心管中加入0.5ml用于捕获病毒的抗体(腹水用pH7.2 0.05M的磷酸盐包被缓冲液1∶500稀释)，同时只加包被缓冲液作为空白对照，37℃温育过夜，弃包被液，1.5ml/管封闭液(含2％明胶、0.2％酪蛋白和2％蔗糖的PBS，pH7.2)37℃封闭2hr，吸干封闭液，0.5ml/管10％的粪便悬液上清37℃反应2hr，然后用PBST洗涤6遍；将管子洗干净后，每管加入250μl超纯水后用TRIZOL试剂(GIBCO公司)按操作说明提取RNA；提取的RNA以配好的反转录体系溶成20μl，进行反转录，反转录引物A3(5’-ggctcaccggagtgtttcttc-3’)。取2μl反转录产物进行第一PCR扩增，反应体积20μl，引物为A5(5’-ctttgatgacaccgtcttctcg-3’)和A3，反应条件为：94℃预变性5min；94℃ 40sec，68℃ 40sec 35个循环；72℃延伸5min；取1μl第一轮PCR产物，在20μμl反应体积中进行第二轮PCR，引物为B5(5’-gccgcagcaaaggcatccatg-3’)和B3(5’-gtgtttcttccaaaaccctcgc-3’)，条件为94℃预变性5min；94℃ 40sec，56℃ 40sec，72℃ 80sec 35个循环；72℃延伸5min。
8C11对8H3的增强实验：在加入的粪便悬液中事先加入不同稀释度的8C11，检测其对8H3捕获HEV病毒能力的影响。结果如图3所示。
Claims (2)
1.一种模拟或引发存在受调控的空间变构现象之特定靶发生空间变构的方法，其包括将所述靶与针对该靶的单克隆抗体在适于发生空间变构的相互作用之条件下接触一段时间，从而使该靶发生类似于生理状态下的空间变构，
其中所述的靶选自病毒、辅助病毒；或所述病毒衣壳蛋白中的特定位点；或是该病毒靶细胞表面的受体分子。
2.权利要求1所述的方法，其中所述病毒选自甲、乙、丙、丁、戊、和/或庚型肝炎病毒以及艾滋病病毒。
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| 人神经生长因子的单克隆抗体制备及抗原决定簇的研究. 林梵等.大连大学学报，第22卷第2期. 2001 |
| 人神经生长因子的单克隆抗体制备及抗原决定簇的研究. 林梵等.大连大学学报，第22卷第2期. 2001 * |
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