PT891982E

PT891982E - Péptidos de hiv

Info

Publication number: PT891982E
Application number: PT98202777T
Authority: PT
Inventors: Robert J De Leys
Original assignee: Innogenetics Nv
Priority date: 1992-03-06
Filing date: 1993-03-08
Publication date: 2007-07-27
Also published as: ES2133392T5; WO1993018054A2; KR20030096423A; DE69334148D1; DE69324751T3; WO1993018054A3; ES2133392T3; EP0589004B1; DK0891982T3; DK0589004T4; CA2102301C; US6210903B1; KR100257941B1; DK0589004T3; EP0891982B1; NZ299048A; DE69324751T2; DE69334148T2; ATE179716T1; EP0891982A3

Description

DESCRIÇÃO "PÉPTIDOS DE HIV" 0 problema técnico subjacente à presente invenção é proporcionar péptidos correspondentes a epitopos imunologicamente importantes em proteínas virais, assim como a utilização dos referidos péptidos em composições imunogénicas ou de diagnóstico.

Diferentes pedidos de patentes abordam o problema de encontrar epitopos do vírus da imunodificiência humana (HIV) úteis para diagnóstico. Uma região importante imunodominante contendo cíclico.

Os péptidos HIV-1 e HIV-2 foram encontrados no pedido de patente EP-A-0 326 490. No documento EP-A-0 379 949, esta região foi considerada como sendo ainda mais reactiva com anticorpos específicos para HIV no caso de uma molécula de biotina ser acoplada a estes péptidos de HIV cíclicos. O documento SU-A-1612264 descreve também a utilização de um péptido biotinilado num imunoensaio de fase sólida para a detecção de anticorpos contra HIV.

Outros pedidos procuraram epitopos HIV úteis na região hipervariável da ansa V3 de gpl20 (tal como nos documentos EP-A-0448095 e EP-A-0438332). O objectivo da presente invenção é proporcionar composições contendo péptidos determinados para corresponder a epitopos 1 imunologicamente importantes em proteínas para propósitos de diagnóstico.

Outro objectivo da presente invenção é também proporcionar composições contendo péptidos determinados para corresponder a epitopos imunologicamente importantes em proteínas para objectivos de vacina.

De acordo com a presente invenção, foram identificados uma série de péptidos representando regiões imunologicamente importantes de proteínas virais e preparados por síntese péptidica em fase sólida. Estes péptidos foram identificados como sendo muito úteis para a detecção de anticorpos contra HIV. Em alguns arranjos preferidos, verificou-se ou, pelo menos, esperou-se, que estes péptidos eram úteis na estimulação da produção de anticorpos contra HIV, em animais saudáveis tais como murganhos BALB/C, e numa composição de vacina para evitar a infecção de HIV. A presente invenção refere-se também a fragmentos de qualquer uma das sequências de péptidos dadas abaixo, mantendo os referidos fragmentos substancialmente toda a sensibilidade imunológica das referidas sequências de péptidos das quais foram derivadas. A síntese dos péptidos pode ser realizada em solução ou num suporte sólido. Os protocolos de síntese empregam geralmente aminoácidos activados protegidos com t-butiloxicarbonilo ou 9-fluorenilmetoxicarbonilo. Os processos para efectuar a síntese, as técnicas de activação de aminoácidos, os tipos de produção de cadeias laterais, e os processos de clivagem utilizados estão amplamente descritos em, por exemplo, Stewart and Young, Solid 2

Phase Peptide Synthesis, 2a Edição, Pierce Chemical Company, 1984; e Atherton e Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press, 1989. A presente invenção refere-se a péptidos como mencionados abaixo, que são biotinilados. A presente invenção refere-se a péptidos da seguinte fórmula: (A)-(B)-(X)-Y-(aminoácidos)-Y-(X)-Z em que (aminoácidos) pretende designar Leu-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Val-Cys (SEQ ID N° 1, gp41, isolado Ant70) ou

Gln-Ile-Asp-Ile-Gln-Glu-Met-Arg-Ile-Gly-Pro-Met-Ala-Trp-Tyr-Ser-Met-Gly-Ile-Gly-Gly (SEQ ID N° 2. sequência parcial de ansa V3 Ant 70), e em que os aminoácidos são seleccionados selectivamente para serem epitopos imunodominantes que são reconhecidos por uma larga percentagem de soros verdadeiros positivos ou são capazes de complementar outros antigénios no teste para aumentar a taxa de detecção e B interage com os aminoácidos seleccionados para produzir um composto com maior sensibilidade de diagnóstico. A, quando presente como indicado por parênteses, representa (um) aminoácido(s), um grupo amino, ou uma modificação química do terminal amino da cadeia péptidica; 3 Z representa (um) aminoácido(s) , um grupo OH-, um grupo NH2-, ou uma ligação envolvendo qualquer destes dois grupos químicos. B representa biotina; X representa um composto biotinilado que é incorporado durante o processo de síntese; Y representa uma ligação covalente ou uma ou mais entidades químicas que, isolados ou em conjunto formam um braço ligante separando os aminoácidos do verdadeiro péptido da unidade biotinilada B ou X, cuja função é minimizar o impedimento estéreo que pode interferir com a ligação da unidade biotinilada B ou X com a avidina ou estreptavidina, em que Y não é uma ligação covalente, é, vantajosamente, pelo menos, uma entidade química e pode consistir até 30 entidades químicas mas consistirá mais frequentemente de 1 a 10 entidades químicas, que podem ser idênticas ou diferentes, de modo mais preferido de glicina, β-alanina, ácido 4-aminobutírico, ácido 5-aminovalérico, ou ácido 6-amino-hexanóico; B e X entre parêntesis indicam que a presença de biotina ou um composto biotinilado nestas posições é opcional, sendo a única estipulação que B ou X estejam presentes em pelo menos uma das posições apresentadas. O processo da invenção permite aumentar a antigenicidade destes péptidos de HIV, que podem, contudo, ser ligados a um suporte, mesmo quando não estão biotinilados. A presente invenção refere-se também a um processo para a determinação in vitro de anticorpos utilizando os péptidos acima definidos. 4 A presente invenção refere-se também a um processo para a determinação in vitro de anticorpos utilizando os péptidos biotinilados acima definidos, em que os referidos péptidos biotinilados são, de um modo preferido, na forma de complexos de estreptavidina - péptidos biotinilados ou complexos de avidina-péptidos biotinilados.

No complexo de estreptavidina-péptidos biotinilados ou avidina-péptidos biotinilados, os péptidos podem ser biotinilados no terminal N, terminal C ou internamente.

Esta abordagem da determinação de anticorpos não é limitada em relação ao comprimento do péptido e evita as dificuldades inerentes nos péptidos de revestimento directamente na fase sólida para avaliação imunológica. A utilização de péptidos biotinilados, no processo da invenção, efectua a ancoragem de péptidos a um suporte sólido de modo a deixar os seus aminoácidos essenciais livres para serem reconhecidos pelos anticorpos. A expressão péptido de ancoragem a um suporte sólido significa a ligação do péptido a um suporte através de ligações covalentes ou interacções não covalentes de modo que o péptido fica imobilizado. 0 suporte sólido pode ser nitrocelulose, poliestireno, nylon ou qualquer outro polímero natural ou sintético. A expressão "os seus aminoácidos essenciais são deixados livres para serem reconhecidos por anticorpos" significa que as 5 cadeias laterais de aminoácidos do verdadeiro péptido não são nem quimicamente modificadas de alguma forma, nem estão envolvidas na interacção entre o péptido e a fase sólida. A utilização de péptidos biotinilados no processo da invenção permite que os referidos péptidos biotinilados fiquem livres para assumir uma variedade de conformações, entre as quais pelo menos uma é apropriada para a ligação de anticorpos aos referidos péptidos biotinilados.

Qualquer dos péptidos biotinilados reivindicados pode ser seleccionado para ser utilizado no processo da invenção. Contudo, alguns deles são capazes de ser ancorados num suporte sólido e reagir com anticorpos que reconhecem especificamente o epitopo neste mesmo sem serem biotinilados e sem estarem envolvidos num complexo de avidina ou estreptavidina. Neste caso, a utilização de péptidos biotinilados resulta num aumento de antigenicidade aparente dos péptidos em relação à antigenicidade observada quando os péptidos não são biotinilados. A expressão "aparente" pretende indicar uma alteração observada obtida em condições de teste semelhantes sem ter em conta a causa absoluta da alteração observada.

Por "antigenicidade" entende-se a propriedade de um péptido se ligar a um anticorpo.

Por "aumento da antigenicidade" entende-se que um sinal positivo é obtido para uma diluição que é, pelo menos, duas vezes a diluição dos péptidos não biotinilados. 0 referido sinal positivo é da mesma magnitude do obtido para os péptidos não biotinilados. 6

Por outras palavras, a obtenção de um sinal positivo pode ser obtida para uma quantidade menor de péptido biotinilado, comparado com a quantidade de péptido não biotinilado. A presente invenção refere-se também a um processo para a determinação in vitro de anticorpos contra HIV ou diagnóstico de infecção por HIV utilizando uma composição de péptido como acima definido num processo de imunoensaio e, em que os péptidos biotinilados utilizados estão na forma de complexos de estreptavidina-péptidos biotinilados ou avidina-péptidos biotinilados.

Um método preferido para efectuar a determinação in vitro de anticorpos é através de um ensaio de imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA). Este ensaio emprega uma fase sólida que é geralmente uma placa de microtitulação de poliestireno, ou esfera. A fase sólida pode, no entanto, ser qualquer material que seja capaz de ligar proteína, seja quimicamente através de uma ligação covalente ou por adsorção passiva. Nesta perspectiva, membranas à base de nylon são também consideradas como particularmente vantajosas. A fase sólida é revestida com estreptavidina ou avidina e após um período adequado, o excesso de proteína não ligada é removido por lavagem. Qualquer sítio de ligação não ocupado na fase sólida é então bloqueado com uma proteína irrelevante como a albumina de soro bovino ou caseína.

Uma solução contendo a mistura ou selecção de péptidos (biotinilados) da invenção é subsequentemente colocada em contacto com a superfície (revestida com estreptavidina ou avidina) e é deixada a ligar. 0 péptido não ligado é removido por lavagem. Alternativamente, os péptidos biotinilados são deixados a formar complexos com avidina ou estreptavidina. Os 7 complexos resultantes são utilizados para revestir a fase sólida. Após um período de incubação adequado, o complexo não ligado é removido por lavagem. Uma diluição apropriada de um anti-soro ou outro fluido corporal é posto em contacto com a fase sólida a que o péptido foi ligado. A incubação decorre durante o tempo necessário para deixar a reacção de ligação ocorrer. Subsequentemente, os componentes não ligados são removidos por lavagem da fase sólida. A detecção de complexos imunes é conseguida utilizando anticorpos heterólogos que se ligam especificamente aos anticorpos presentes no soro teste e que foram conjugados com uma enzima, de um modo preferido, mas não se limitando a, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, ou β- galactosidase, que é capaz de converter um substrato incolor ou praticamente incolor ou co-substrato, num produto altamente colorido ou produto capaz de formar um complexo colorido com um cromogéneo que pode ser detectado visualmente ou medido espectrofotometricamente.

Outros sistemas de detecção conhecidos na técnica podem, no entanto, ser empregues e incluem aqueles em que a quantidade de produto formado é medido electroquimicamente ou luminometricamente. 0 sistema de detecção pode também empregar anticorpos radioactivamente marcados, caso em que a quantidade de imunocomplexo é quantificada por contagem de cintilações ou contagem. Em princípio qualquer tipo de teste imunológico para a detecção de anticorpos pode ser utilizado, desde que o teste faça utilização do complexo entre a estreptavidina ou avidina e péptido (s) biotinilado (s) sintetizados como descrito.

Também estão incluídos ensaios de competição em que os complexos em solução péptido biotinilado-estreptavidina ou avidina podem competir com o antigénio ligado à fase sólida para ligação do anticorpo ou ensaios em que o péptido livre em solução pode competir com complexos biotinilados de estreptavidina ou avidina ligada à fase sólida. Na forma de exemplo, os muitos tipos de ensaios imunológicos para a detecção e quantificação de anticorpos e antigénios são discutidos em detalhe (Tijssen, P., Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Elsevier Press, Amsterdão, Oxford, Nova Iorque, 1985).

Os ensaios imunológicos podem ser restritos a péptidos (biotinilados) únicos. De um modo preferido, no entanto, é utilizada uma mistura de péptidos (biotinilados) que inclui mais de um epitopo derivado do(s) agente(s) infeccioso(s) cuja presença de anticorpos específicos é para ser medida.

Outro método preferido da invenção para efectuar a determinação in vitro da detecção de anticorpos é o imunoensaio em linha (LIA).

Este método de detecção de anticorpo consiste essencialmente nos passos seguintes: os antigénios, possivelmente na forma de péptido biotinilado: complexos de estreptavidina ou avidina a ser testados ou utilizados, são aplicados como linhas paralelas numa membrana que é capaz de ligar, covalentemente ou não covalentemente, o antigénio a ser testado, os sítios de ligação à membrana não ocupados são bloqueados com uma proteína irrelevante tal como a caseína ou albumina de soro bovino, 9 a membrana é cortada em tiras numa direcção perpendicular à direcção em que as linhas do antigénio (péptido biotinilado) são aplicadas, uma diluição apropriada de um anti-soro ou outro fluido corporal (contendo os anticorpos a ser detectados) é posta em contacto com uma tira a que os antigénios estão ligados e é deixada a incubar durante um período de tempo suficiente para permitir que ocorra a reacção de ligação, os componentes não ligados são removidos por lavagem da tira, a detecção dos complexos imunes é conseguida por incubação da tira com anticorpos heterólogos que ligam especificamente anticorpos no soro teste e que foram conjugados com uma enzima tal como a peroxidade de rábano, a incubação é efectuada durante o período suficiente para permitir que a ligação ocorra, a presença do conjugado ligado é detectada pela adição do substrato requerido ou co-substratos que são convertidos num produto colorido pela acção da enzima, as reacções são detectadas visualmente ou podem ser quantificadas por densitometria.

Como demonstrado na secção dos Exemplos, a presente invenção refere-se também á utilização de uma composição de péptidos como acima definido, para imunização contra a infecção com HIV. A presente invenção refere-se também a um método para preparação de péptidos biotinilados utilizados na invenção que envolve a utilização de Ν-α-Fmoc-X(N-y-biotina) ou um derivado de Ν-α-Fmoc-X(N-y-biotina), em que X representa: 10

ΝΗ - CaH - COOH (CH2) n

I

NH

Quando n é pelo menos 1 mas menos do que 10 e está, de um modo preferido, entre 2 e 6, estando um grupo amino ligado ao átomo de Ca enquanto o outro está ligado ao carbono Cy, que é o mais distante carbono da cadeia lateral; ou seus ésteres obtidos com o álcool ROH e mais particularmente éster pentafluorofenilco, y representando a posição do referido carbono mais distante em relação ao átomo de carbono que transporta o grupo COOH no radical.

Este derivado da biotina será chamado produto intermediário, e os acima definidos produtos intermediários são novos compostos determinados de acordo com o processo da invenção.

Num método vantajoso para preparar os compostos da invenção, o produto intermediário pode ser representado por um da seguinte fórmula: Ν-α-Fmoc-(N-y-biotina) é N-a-Fmoc-lisina(ε-biotina) ou N-a-Fmoc-ornitina (Ν-β-biotina)

Os péptidos biotinilados no terminal N podem ser preparados de acordo com o método que compreende os seguintes passos: 11 adição dos sucessivos aminoácidos devidamente protegidos na resina para produzir: Fmoc-AAn......AAi - resina, desprotecção do terminal NH2, por exemplo através da piperidina, adição do produto intermediário: (B)

I

Fmoc - L através do seu COOH no terminal NH2 para obter: (B)

Fmoc - L - AAn...AAi - resina desprotecção do grupo terminal NH2 do composto obtido, clivagem da resina, extracção e purificação do péptido obtido, biotinilado na sua extremidade amino, sendo os passos de desprotecção da cadeia lateral e clivagem do péptido passíveis de serem efectuados simultaneamente ou separadamente, e particularmente desprotecção do grupo terminal NH2 do grupo intermediário, por exemplo por meio da piperidina, clivagem da resina, por exemplo com um ácido, tal como ácido trifluoroacético, na presença de extractores como etanoditiol, ou tioanisol, ou anisol, extracção do péptido com um solvente tal como dietiléter para remoção da maior parte do ácido e dos extractores, purificação, como por HPLC para obter: (B) 12 ΝΗ2 - L - ΑΑη. . .ΑΑι A biotina pode ser convenientemente acoplada à extremidade amino livre de uma cadeia peptidica totalmente protegida de outro modo, utilizando também processos convencionais de activação. Uma vez que a biotina possui um grupo carboxilico e nenhum grupo amino, a biotina funciona essencialmente como um terminador de cadeia. Agentes de activação preferidos para activação in situ incluem, mas não estão limitados a hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxitripirrolidinofosfónio (PyBOP) , hexa-fluorofosfato de O-benzotriazol-l-il-Ν,Ν,Ν',N'-tetrametil-urónio (HBTU), e tetrafluoroborato de o-(lH-benzotriazol-l-il)-Ν,Ν,Ν' ,N'-tetrametilurónio (TBTU) . Os processos de activação empregando estes e compostos relacionados são conhecidos pelos especialistas na técnica se síntese péptidica em fase sólida e o acoplamento da biotina não implica um afastamento significativo dos protocolos padrão de acoplamento. A biotina numa forma pré-activada pode também ser utilizada. Quer N-hidroxissuccinimidobiotina quer éster de N-hidroxissuccinimida biotinamidocaproato são convenientemente empregues e estão ambos comercialmente disponíveis. Este método de acoplamento foi descrito por Lobl, T.J., Deibel, M.R., e Yem, A.W., Anal. Biochem. (1988) 170(2):502-511. Após a adição da biotina no terminal N, o péptido é clivado da resina na presença de extractores, cuja escolha dependerá das considerações usuais da composição em aminoácidos do péptido e da natureza dos grupos de protecção utilizados

Os péptidos biotinilados no terminal carboxilico envolvidos no processo da invenção podem ser preparados de acordo com um método que compreende: 13 acoplamento de uma forma de carboxilo activado do produto intermediário, como definido acima, a um ligante clivável ligado à resina, por exemplo para obter o seguinte composto: (B)

I

Fmoc - L - resina, desprotecção do grupo amino α do composto intermediário, por exemplo, por meio da piperidina para obter: (B)

I H2N - L - resina, adição sucessiva dos aminoácidos subsequentes AAi...AAn devidamente protegidos a: (B) H2N - L - resina, para obter: (B)

I

Fmoc - AAn...AAi - L- resina desprotecção do terminal NH2, por exemplo, por meio da piperidina, 14 desprotecção do composto obtido, clivagem da resina, extracção e purificação do péptido obtido, biotinilado na sua extremidade carboxilica, sendo os passos de desprotecção da cadeia lateral e clivagem do péptido passíveis de serem efectuados simultaneamente ou separadamente, e particularmente desprotecção do terminal NH2, por exemplo, por meio da piperidina, clivagem da resina, por exemplo, com ácido trifluoroacético, na presença de extractores como etanoditiol, ou tioanisol, ou anisol, extracção do péptido com um solvente tal como dietiléter para remoção da maior parte do ácido e extractores, purificação, como por HPLC para obter: (B)

AAn . . . AAi — L

Os péptidos biotinilados internamente podem ser preparados de acordo com um método que compreende os seguintes passos: adição à resina dos sucessivos aminoácidos devidamente protegidos para dar:

Fmoc - AAi...AAn - resina, desprotecção do NH2 terminal, adição do produto intermediário: 15 (Β)

Fmoc - L através do seu COOH na extremidade -NH2 para obter: (B)

I

Fmoc - L -AAn...AAi - resina, desprotecção do grupo amino α do composto intermediário, por exemplo por meio da piperidina para obter: (B)

I L -AAn...AAi -resina, adição dos aminoácidos subsequentes devidamente protegidos na resina para dar: (B)

I

Fmoc - AAn...AAi - L - AAn. . .AAi - resina, desprotecção do grupo terminal NH2 do composto obtido, clivagem da resina, extracção e purificação do péptido obtido, biotinilado no seu terminal amino, sendo os passos de desprotecção da cadeia lateral e clivagem do péptido passíveis de serem efectuados simultaneamente ou separadamente, e particularmente, desprotecção do grupo terminal NH2 do grupo intermediário, por exemplo, por meio da piperidina, 16 clivagem da resina, por exemplo, com ácido trifluoroacético, na presença de extractores como etanoditiol, ou tioanisol, ou anisol, extracção do péptido com um solvente tal como dietiléter para remoção da maior parte do ácido e extractores, purificação, como por HPLC para obter: (B) AAn . . . AAi — L — AAn. . . AA^

Sob certas circunstâncias, pode se tornar particularmente vantajoso ser capaz de biotinilar um péptido internamente ou na sua extremidade carboxilica. Tais circunstâncias acontecem, por exemplo, quando a sequência de aminoácidos de um péptido corresponde à sequência do terminal amino de uma proteína. A ligação de uma biotina à extremidade amino de tal péptido resulta numa estrutura que é significativamente diferente da encontrada na proteína nativa e pode, como consequência, afectar adversamente as propriedades de ligação das propriedades bioquímicas do péptido. É também possível que mesmo para péptidos correspondentes a sequências internas da proteína, o seu reconhecimento por proteínas de ligação ou imunoglobulinas possa depender da extremidade do péptido e da maneira como se apresenta para a ligação. A importância da orientação do péptido foi descrita por Dyrberg, T. e Oldstone, M.B.A., J. Exp. Med. (1986) 164:1344-1349.

De modo a conseguir incorporar uma unidade biotinilo num péptido, numa posição e de uma forma independente da sequência foram feitos esforços para sintetizar um reagente adequado que possa ser acoplado utilizando processos convencionais. Um 17 reagente conveniente para a biotinilização do terminal C ou internamente é o Ν-ε-biotinil-lisina. Desde que o grupo α amino deste composto esteja convenientemente protegido (Fmoc e tBoc), este reagente pode ser utilizado para introduzir uma biotina em qualquer lugar da cadeia peptidica, incluindo a extremidade amino, pelos processos padrão utilizados na síntese péptidica em fase sólida. A síntese do derivado protegido por t- Boc foi descrito (Bodansky, M., e Fagan, D.T., J. Am. Chem. Soc. (1977) 99: 235-239) e foi utilizado para sintetizar péptidos curtos para utilização em estudos de actividade enzimática de certas transcarboxilases.

Contrariamente ao derivado t-Boc, a síntese de N-a-Fmoc-Lys(Ν-ε-biotina) não foi descrita, e considerando o crescente interesse em estratégias de síntese baseadas em Fmoc, este composto é considerado particularmente vantajoso.

Existe um número de vias possíveis que podem ser tomadas para chegar ao desejado composto protegido com Fmoc. Estes são apresentados na Figura 1. Na primeira abordagem, pode ser utilizado N-a-Fmoc-Lys(Ν-ε-tBoc) disponível comercialmente como o material de partida. A protecção Ν-ε-tBoc é removida utilizando ácido trifluoroacético e um extractor como a água. Um leve excesso molar de Ν-α-Fmoc-lisina assim obtido é então feito reagir com biotina carboxi-activada. 0 produto resultante pode ser imediatamente purificado por extracções selectivas e técnicas cromatográficas padrão. Numa abordagem alternativa, N-a-Fmoc-Lys(Ν-ε-biotina) pode ser produzida a partir de Ν-ε-biotinil lisina (biocitina) por reacção com carbonato de fluorenilmetilsuccinimidilo. Numerosos exemplos destas reacções que podem ser utilizadas como orientação são dadas em Atherton e

Sheppard, Solid Phase peptide Synthesis, IRL Press, 1989. 18 A estratégia apresentada na Figura 1 (método A) pode também ser aplicada para sintetizar N-a-Fmoc-ornitina(Ν-β-biotina) a partir de N-a-Fmoc-ornitina(Ν-β-tBoc) disponível comercialmente. 0 derivado de ornitina difere do derivado de lisina apenas no comprimento da cadeia lateral que, para o derivado de ornitina, é mais curta em um átomo de carbono. 0 Ν-α-Fmoc-Lys pode ser convenientemente incorporado na cadeia peptidica utilizando os mesmos reagentes do que para a activação in situ descrita para a biotina livre.

Alternativamente, o éster N-a-Fmoc-Lys(Ν-ε-biotina)-0-pentafluorofenílco pode ser convenientemente sintetizado a partir de N-a-Fmoc-Lys (Ν-ε-biotina) e trifluoroacetato de pentafluorofenilo utilizando a reacção de transesterificação catalizada por base descrita por Green, M. e Berman, J., Tetrahedron Lett. (1990) 31: 5851-5852, para a preparação de ésteres o-pentafluorofenílicos de aminoácidos. Este éster activo pode ser utilizado directamente para incorporar Ν-α-Fmoc-Lys(N-ε-biotina) na cadeia peptidica. A classe dos produtos intermediários acima definidos pode ser preparada de acordo com um método que compreende os seguintes passos: reacção de um ácido di-amino monocarboxílico, previamente descrito, com carbonato de fluorenilmetilsuccinimidilo ou cloroformato de fluorenilmetilo em condições de pH cuidadosamente controlado para produzir o derivado protegido único N-a-Fmoc, ou alternativamente, utilização de ácidos diamino- monocarboxílicos protegidos com Ν-α-Fmoc comercialmente disponíveis quando o grupo amina da cadeia lateral é fornecido com um grupo de protecção que é diferente do 19 grupo Fmoc utilizado para proteger o grupo amina a, sendo o grupo amina da cadeia lateral passível de ser selectivamente removido sob condições que deixem o grupo Να- Fmoc intacto, purificação do derivado do ácido N-a-Fmoc-diamino-monocarboxílico mono-protegido, por extracções selectivas e cromatografia, reacção do derivado obtido com um derivado da biotina carboxi-activado, tal como biotina N-hidroxissuccinimida, para obter o derivado (Ν-α-Fmoc)-N-y-biotina)que é o produto intermediário desejado, purificação do produto intermediário por extracções selectivas, precipitações ou cromatografia.

Quando os péptidos biotinilados utilizados no processo da invenção são para ser fornecidos com braços de ligação, estas entidades químicas podem ser convenientemente ligadas a qualquer extremidade N ou C de uma sequência peptídica durante a síntese em fase sólida utilizando protocolos padrão de acoplamento, desde que os grupos amino destes compostos estejam protegidos temporariamente com os grupos de protecção apropriados para o grupo amino. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS E DAS TABELAS:

Todas as amostras e soros mencionados nas figuras e tabelas são amostras e soros escolhidos aleatoriamente, contendo anticorpos produzidos como resultado de uma infecção por um agente virai, naturalmente decorrente. 20 A Figura 1 representa as estratégias para a síntese de N-a-Fmoc-lisina (Ν-ε-biotina).

Mais particularmente: 0 Método A corresponde à síntese de N-a-Fmoc-Lys(Ν-ε-biotina) a partir de N-a-Fmoc-Lys(Ν-ε-tBoc) e o Método B corresponde à síntese de N-a-Fmoc-Lys(Ν-ε-biotina) a partir de Ν-ε-biotinil lisina. A Figura 2 representa o diagrama obtido em cromatografia de fase reversa para os precursores envolvidos na preparação dos produtos intermediários definidos acima, e dos compostos intermediários. A cromatografia de fase reversa foi efectuada nas seguintes condições: -especificações do gradiente: tampão A: TFA a 0,1% em H20 tampão B: TFA a 0,1% em acetonitrilo coluna: fase reversa C2/C18 (Pharmacia, Pep-S) comprimento de onda de detecção: 255 nanometros; - gradiente: 0% de B de 0 a 1 minuto, 0% de B a 100% de B de 1 a 60 minutos, 0% de B de 60 a 70 minutos. 21 0 primeiro diagrama corresponde ao método A (ver Figura 1) e o segundo diagrama corresponde ao método B (ver Figura 1). A Tabela 1 representa o reconhecimento geral dos péptidos da ansa V3 de HIV. A Tabela 2 representa o reconhecimento dos péptidos de HIV de acordo com a região geográfica.

Todas as sequências de aminoácidos são apresentadas no código de três letras convencional e universalmente aceite e, quando indicado, no código de letra única. As sequências de péptidos são apresentadas da esquerda para a direita que, por convenção, é a direcção da extremidade amino para a extremidade carboxílica.

Um número de códigos não convencionais são também utilizado para representar grupos químicos ou modificações e são definidos como se segue:

Grupo Código Ac acetilo Bio D-biotinilo Fmoc 9-fluorenilmetoxicarbonilo tBoc butiloxicarbonilo terciário

EXEMPLO 1: SÍNTESE DE PÉPTIDOS

Todos os péptidos descritos foram sintetizados em TentaGel S-RAM (Rapp Polymere, Túbigen, Alemanha), um enxerto de com o poliestireno-polioxietileno copolimero-funcionalizado 22 ácido lábil ligante ácido 4-(a-Fmoc-amino-2', 4' -dimetoxibenzil)fenoxiacético (Rink, Tetrahedron Lett. (1987) 28:3787) de modo a produzir amidas no terminal carboxilica do péptido após clivagem. Foi utilizada protecção da cadeia lateral baseada em t-butilo e protecção com Fmoc-a-amino. 0 grupo guanidina da arginina foi protegido com a unidade 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo. 0 grupo imidazol da histidina foi protegido com t-Boc ou tritilo e o grupo sulfidrilo da cisteína foi protegido com um grupo tritilo. Os acoplamentos foram efectuados utilizando ésteres de O-pentafluorofenilo pré-formados, excepto no caso da arginina em que o TBTU foi utilizado como o agente de activação na presença de 1,5 equivalentes da base N-metilmorfolina. Ocasionalmente, glutamina e asparagina foram também acopladas utilizando activação com TBTU. Nestes casos, foram empregues os derivados destes aminoácidos protegidos com tritilo. A biotina foi acoplada utilizando TBTU ou HBTU. Todas as sínteses foram efectuadas num Milligen 9050 PepSynthesizer (Novato, Califórnia) utilizando processos de fluxo continuo. Após clivagem com ácido trifluoacético na presença de extractores e extracção com dietiléter, todos os péptidos foram analisados por cromatografia de fase reversa em C18. EXEMPLO 2: SÍNTESE DE N-a-Fmoc-Lys(Ν-ε-biotina)

A. Método A N-a-Fmoc-L-lisina(Ν-ε-tBoc) (1,5 g) comercialmente disponível, foi tratado com 20 mililitros de ácido trifluoroacético a 95%, H20 a 5% durante 2 horas à temperatura ambiente. A maior parte do ácido foi então evaporado sob um 23 fluxo de azoto. Foram adicionados dez mililitros de água e a solução foi extraida 3 vezes com dietiléter. A fase aquosa foi então evaporada até à secura em vácuo sobre pentóxido de fósforo. 0 pó resultante (Ν-α-Fmoc-L-lisina) foi analisado por cromatografia de fase reversa e revelou um produto homogéneo que era, como esperado, mais hidrofílico do que o material de partida. N-a-Fmoc-lisina (190 mg, 0,49 mmol) foi dissolvido em 8 mililitros de tampão borato a 0,1 M, pH 8,7. N-hidroxissuccinimidobiotina (162 mg, 0,47 mmol) foi dissolvida em 4 mililitros de dimetilformamida e adicionada à solução de Ν-α-Fmoc-lisina. O pH foi monitorizado e titulado conforme necessário, com NaOH. Após 2 horas, a solução foi acidificada com HC1 a pH 2,0, altura em que foi obtido um precipitado branco.

Após extracção com acetato de etilo e centrifugação, o precipitado branco foi encontrado na interface H20: acetato de etilo. Ambas as fases foram removidas e o precipitado extraído duas vezes com HC1 a 10 mM, uma vez com acetato de etilo, seguido de duas extracções com dietiléter. O precipitado foi dissolvido em DMF e precipitado por adição de dietiléter. O pó cristalino foi então seco em vácuo com pentóxido de fósforo. O produto resultante foi analisado por cromatografia de fase reversa e revelou um pico maior que, como esperado, eluiu mais tarde do que Ν-α-Fmoc-Lys. Um pico muito pequeno de N-a-Fmoc-Lys foi também observado (Figura 2a). 24 B. Método Β Ν-ε-biotinil lisina comercialmente disponível (biocitina, Sigma, 249 mg, 0,67 mmol) foi dissolvida em 8 mililitros de Na2C03 a 1 M e arrefecido em gelo. Foi dissolvido carbonato de fluorenilmetilsuccinimidilo (222 mg, 0,66 mmol) em 2 mililitros de acetona e foi adicionado à solução de biotinil lisina durante um período de 30 minutos com agitação vigorosa. A agitação continuou durante 5 horas à temperatura ambiente. 0 PH foi mantido entre 8 e 9 por adição de Na2C03 a 1 M sempre que necessário . A acetona foi então evaporada sob vácuo, e foi adicionado HC1 a 1,0 M até o pH da solução ser de aproximadamente 2. Após acidificação da solução, apareceu um precipitado branco que foi lavado duas vezes com HC1 a 10 mM, duas vezes com acetato de etilo e duas vezes com dietiléter. O precipitado foi dissolvido em DMF e precipitado pela adição de dietiléter. O pó cristalino foi então completamente seco sob vácuo sobre pentóxido de fósforo. O produto resultante foi analisado por cromatografia de fase reversa e revelou um pico maior que eluiu com o mesmo tempo de retenção (30,5 minutos) do produto obtido utilizando o método 1 (Figura 2b).

EXEMPLO 3: MÉTODOS PARA A DETERMINAÇÃO DE PÉPTIDOS CORRESPONDENTES A EPITOPOS IMUNOLOGICAMENTE IMPORTANTES NUM ENSAIO DE IMUNOABSORVENTE LIGADO A ENZIMA (ELISA) UTILIZANDO ANTICORPOS ESPECÍFICOS

Quando os péptidos estavam a ser directamente revestidos, as soluções stock dos péptidos foram diluídas em tampão de carbonato de sódio, pH 9,6 e utilizadas para revestir placas de 25 microtitulação de poliestireno a uma concentração de péptido de 2 a 5 microgramas por mililitro, durante 1 hora a 37 °C.

Nos casos em que estavam a ser avaliados péptidos biotinilados, as placas foram primeiro revestidas com estreptavidina em tampão carbonato de sódio, pH 9,6 a uma concentração de 3 microgramas por mililitro durante 1 hora a 37 °C. As placas foram então lavadas para remover o excesso de proteina não ligada. Uma solução de trabalho do péptido biotinilado a 1 micrograma por mililitro em tampão carbonato de sódio foi então adicionada aos poços da placa de microtitulação e incubou-se durante 1 hora a 37 °C.

Estando as placas revestidas com o antigénio, qualquer local de ligação ao plástico que tenha ficado livre foi bloqueado com caseína. Após lavagem, uma diluição apropriada do anti-soro, usualmente 1:100, foi adicionada aos poços das placas e incubada durante 1 hora a 37 °C.

Após lavagem para remover material não ligado, a ligação específica do anticorpo foi detectada incubando as placas com anticorpos de cabra anti-imunoglobulinas humanas conjugados com a enzima peroxidase de rábano. Após remoção do conjugado não ligado por lavagem, foi adicionada uma solução contendo H202 e 3, 3', 5, 5' -tetrametilbenzidina.

As reacções foram interrompidas após um intervalo adequado por adição de ácido sulfúrico. As reacções positivas deram origem a uma cor amarela que foi quantificada utilizando um leitor convencional de placas de microtitulação. As medidas de absorvência foram feitas a um comprimento de onda de 450 26 nanometros e todos os dados estão expressos como um valor de densidade óptica a este comprimento de onda.

Todos estes péptidos foram fornecidos com espaçadores Gly-Gly e uma biotina na extremidade amino. Os péptidos foram avaliados numa experiência de imunoensaio em linha (LIA) e comparados com os péptidos de núcleo mais curtos. Os resultados são apresentados na Figura 9. Os péptidos de núcleo mais compridos são comparados muito favoravelmente com os péptidos mais curtos e dão consistentemente uma reacçâo mais intensa. Isto pode ser explicado se (i) os péptidos mais compridos incorporam dois ou mais epitopos que foram previamente espalhados sobre dois péptidos separados e/ou (2) existe uma contribuição conformacional que pode ser mais proeminente nos péptidos mais compridos.

EXEMPLO 4: UTILIZAÇÃO DE PÉPTIDOS BIOTINILADOS DA REGIÃO DA ANSA v3 DE GP120 DE DIFERENTES ISOLADOS DE HIV-1 NUM IMUNOENSAIO EM LINHA PARA A DETECÇÃO DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS PARA 0 HIV

De modo a avaliar o valor do diagnóstico geral da região da ansa V3 de gpl20, foram sintetizados nove péptidos derivados desta região de nove isolados de HIV-1 diferentes e incluídos num LIA.

Todos os nove péptidos foram proporcionados com um espaçador Gly-Gly e uma biotina no terminal N.

Todas as sequências de péptidos alinhadas (código de aminoácidos de uma letra) são como se segue: 27 COM NNTRKSIHI-GPGRAFYTTGEIIG 23 (SEQ ID N° 3) SF2 NNTRKSIYI-GPGRAFHTTGRIIG 23 (SEQ ID N° 4) SC NNTTRSIHI-GPGRAFYATGDIIG 23 (SEQ ID N° 5) MN YNIKRKRIHI-GPGRAFYTTIKNIIG 23 (SEQ ID N° 6) RF NNTRICSITK-GPGRVIYATGQIIG 23 (SEQ ID N° 7) MAL NNTRRGIHF-GPGQALYTTG-IVG 22 (SEQ ID N° 8) BH NNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKI-G 24 (SEQ ID N° 9) ELI QNTRQRTPI-GLGQSLYTT-RSRS 22 (SEQ ID N° 10 ANT70 QIDIQEMRI-GP-MAWYSMG-IGG 21 (SEQ ID N° 2)

Os péptidos foram misturados com estreptavidina num ligeiro excesso molar em relação aos sitios de ligação da biotina e os complexos péptido:estreptavidina foram separados do material não ligado através de Sephadex G-25. 0 material eluindo no volume vazio foi utilizado na preparação do LIA.

Foram testados um total de 332 soros que tinham sido obtidos de várias regiões geográficas. Uma vez que é conhecido que as estirpes de virus isoladas na Europa ou América do Norte apresentam menos variabilidade estirpe-para-estirpe do que os isolados Africanos, as diferenças geográficas no reconhecimento da sequência da ansa V3 eram esperadas. As reacções das várias linhas foram avaliadas como positivas (i) ou negativas (o) (resultados não apresentados). É apresentada uma avaliação completa dos soros na Tabela 1. No total, 307 dos 332 soros produziram uma reacção para pelo menos um péptido do LIA da ansa V3. Aqueles soros que não produziram nenhuma reacção com qualquer péptido no LIA da ansa V3 foram testados por transferência de Western para determinar 28 se os soros eram, na verdade, positivos para anticorpos anti-HIV-1. Verificou-se que 6 soros eram, de facto, negativos. 0 número total de soros positivos testados foi, por isso, de 326. Existiram, todavia, 10 soros que continham anticorpos para gpl20 que não reagiram com qualquer um dos LIA da ansa V3, a percentagem de soros que deram uma reacção positiva foi, em termos globais, 94%. Existiram, todavia, diferenças geográficas significativas. Estas diferenças são apresentadas na Tabela 2. A percentagem total de soros de diferentes regiões geográficas que apresentam pelo menos uma reacção positiva pode ser resumida como se segue:

Europeus 100% Africanos 94% Brasileiros 92%

Avaliações adicionais com amostras Europeias indicam que esta percentagem é, de facto, algo inferior a 100% (resultados não apresentados). As amostras Africanas que não produziram uma reacção na LIA não foram testadas por transferência de Western para confirmar a presença de outros anticorpos de HIV.

Era esperado que os soros Europeus se classificassem bem. As classificações mais baixas obtidas com os soros Africanos também não foram totalmente inesperadas, uma vez que é conhecido que existe uma maior heterogeneidade virai em África. Uma vez que as sequências das ansas de V3 das estirpes de HIV Africanas não foram tão exaustivamente caracterizadas como as estirpes Europeias ou Norte Americanas, é claro que ou não se possui uma sequência representativa, ou que a tentativa e caracterizar as estirpes Africanas em termos de uma sequência de consenso não é 29 possível, uma vez que existe demasiada divergência de sequências. Os resultados obtidos com os soros Brasileiros foram inesperados, uma vez que nunca nada foi relatado no que diz respeito à variabilidade de HIV no Brasil. A partir destes resultados, parece que a situação no Brasil se assemelha mais com a situação em África e não com a situação na América do Norte ou Europa.

Tabela 1 CON SC MN SF2 BH RF MAL ELI 70 SOMA Total 287 261 275 258 108 146 140 24 6 CONTAGEM 326 326 326 326 326 326 326 326 326 Gpl20 positivo 88 80 84 79 33 45 43 7 2 % reativo 287 261 275 258 108 146 140 24 6 SOMA Total 307 307 307 307 307 307 307 307 307 CONTAGEM HIV-V3 positivo 93 85 90 84 35 48 46 8 2 % reativo 30

Tabela 2 EUROPEU O 0 AFRICANO O O BRASILEIRO O O CONSENSO 98 CONSENSO 89 CONSENSO 82 HIV-1(SC) 98 HIV-1(MN) 85 HIV-1(MN) 78 HIV-1(SF2) 98 HIV-1(SF2) 79 HIV-1(SC) 75 HIV-1(MN) 97 HIV-1(SC) 73 HIV-1(SF2) 72 HIV-1(RF) 75 HIV-1(MAL) 60 HIV-1(RF) 38 HIV-1(MAL) 68 HIV-1(RF) 34 HIV-1(MAL) 30 HIV-1(IIIB) 61 HIV-1(IIIB) 27 HIV-1(IIIB) 26 HIV-1(ELI) 8 HIV-1(ELI) 13 HIV-1(ELI) 5 ANT 70 2 ANT 70 2 ANT 70 2 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE:

(A) NOME: INNOGENETICS NV (B) RUA: INDUSTRIEPARK ZWIJNAARDE NR 7, BOX 4

(C) CIDADE: GHENT

(E) PAÍS: BÉLGICA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): B9052 (G) TELEFONE: 32 9 241 07 11 (H) TELEFAX: 32 9 241 07 99

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: NOVOS PÉPTIDOS DE HIV (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 10 31 (iv) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Versão #1.30 (EPO) (v) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: PEDIDO NÚMERO: EP EP 98202777.3 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° : 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 1:

Leu Trp Gly Cye Ly& Gly Lys Leu Vai Cys 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 2

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos 32 (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 2:

Gin Ile Asp Ile Gin Glu Met Arg Ile Gly Pro Het Ala Trp Tyr Ser 1 5 10 15

Met Gly Ile Gly Gly 2 0 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 3

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 23 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 3:

Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Kis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr 1 5 10 15

Thr Thr Gly Glu He He Gly 20 33 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 4

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 4:

Asn Asn Thr Ar§ Lys Ser Ile Tyr Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe His 1 5 10 15

Thr Thr Gly Arg Ile Ile Gly (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 5

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO 34 (iv)

ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 5:

Asn Asn Thr Thr Arg Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr 15 10 15

Ala Thr Gly Asp Ile Ile Gly 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 6

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 6:

Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala phe Tyr 1 5 10 15

Thr Thr Lys Asn Ile Ile Gly 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 7

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA 35 (A) COMPRIMENTO: 23 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 7:

Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Thr Lys Gly Pro Glv Arg Vai Tle Tyr - 5 10 “ 15

Ala Thr Gly Gin Ile Ile Gly 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 8

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 8: 36

Asn Asn Thr Arg Arg Gly Ile Hi$ Phe Gly Pro GXy Gin Ala Leu Tyr 1 5 10 15

Thr Thr Gly Ile Vai Gly 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 9

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 24 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 9:

Asn. Asn Thr Arg Lys Ser Ile .Arg Ile Gin Arg Gly Pro Gly Arg Ala 1 5 10 15

Phe Vai Thr Ile Gly Lys Ile Gly 20 37 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 10

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 10:

Gin Asn Thr Arg Gin Arg Thr Pro Ile Giy Leu Gly Gin Ser Leu Tyr i 5 10 15

Thr Thr Arg Ser Arg Ser 2 0

Lisboa, 17 de Julho de 2007 38

Claims

REIVINDICAÇÕES Péptido possuindo uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em: (A)-(B)-(X)-Y-Leu-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Val-Cys-Y-(X)-Z (SEQ ID N° 1) e (A)-(B)-(X)-Y-Y-Gln-Ile-Asp-Ile-Gln-Glu-Met-Arg-Ile-Gly-Pro-Met-Ala-Trp-Tyr-Ser-Met-Gly-Ile-Gly-Gly-Y-(X) -Z (SEQ ID N° 2). em que A, quando presente, como indicado por parêntesis, representa (um) aminoácido(s), um grupo amino, ou uma modificação química do terminal amino da cadeia peptídica; - Z representa (um) aminoácido (s) , um grupo OH, um grupo NH2, ou uma ligação envolvendo qualquer destes dois grupos químicos; - B representa biotina; - X representa um composto biotinilado que é incorporado durante o processo de síntese; Y representa um ligação covalente ou uma ou mais entidades químicas que, isoladamente ou em conjunto, formam um braço ligante separando os aminoácidos do péptido próprio da unidade biotinilo B ou X, cuja função é minimizar o impedimento estérico que pode interferir com a ligação da unidade biotinilo B ou X a avidina ou estreptavidina, em que Y não é uma ligação covalente é, vantajosamente, pelo menos uma entidade química e pode consistir em tantas quanto 30 entidades químicas, mas consistirá, mais frequentemente, em 1 a 10 entidades químicas, que podem ser idênticas ou diferentes, de um modo preferido, resíduos de glicina, β-alanina, ácido 4-aminobutírico, ácido 5-aminovalérico ou ácido 6-amino-hexanóico; - sendo B e X inseridos entre parêntesis para indicar que a presença de biotina ou de um composto biotinilado nestas posições é opcional, sendo a única estipulação que B ou X estejam presentes em, pelo menos, uma das posições apresentadas; ou, fragmentos de qualquer um dos péptidos acima mencionados, com os referidos fragmentos reconhecendo anticorpos contra HIV com, substancialmente, a mesma sensibilidade que as sequências das quais são derivadas.
2. Péptido de acordo com a reivindicação 1, possuindo uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em: 2 Leu-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Val-Cys (SEQ ID N° 1) ou Gln-Ile-Asp-Ile-Gln-Glu-Met-Arg-Ile-Gly-Pro-Met-Ala-Trp-Tyr-Ser-Tyr-Ser-Mot Gly-Ile-Gly Gly (SEQ ID N°2).
3. Péptido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 2, sendo o referido péptido biotinilado, de um modo preferido, durante a síntese peptídica, sendo o referido péptido biotinilado no terminal N, no terminal C ou internamente.
4. Péptido de acordo com a reivindicação 3, que é acoplado a estreptavidina ou avidina, estando a referida estreptavidina ou avidina ela própria possivelmente acoplada a uma fase sólida.
5. Péptido de acordo com a reivindicação 3, em que o referido péptido é acoplado através do seu grupo biotina à estreptavidina presente numa membrana de nylon.
6. Péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, estando o referido péptido ancorado a um suporte sólido através de interacções covalentes ou não covalentes.
7. Método para a detecção de anticorpos contra HIV presentes numa amostra biológica, compreendendo: (i) contacto da amostra biológica a ser analisada para a presença de HIV com (um) péptido(s) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 3 (ii) detectar o imunocomplexo formado entre os referidos anticorpos e o(s) referido(s) péptido(s) .
8. Método para determinar o tipo de HIV presente numa amostra, compreendendo: (i) contacto da amostra biológica a ser analisada para a presença de HIV com um péptido(s) de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, (ii) detectar o imunocomplexo formado entre os referidos anticorpos e o(s) referido(s) péptido(s).
9. Ensaio imunológico para detectar anticorpos contra HIV empregando (um) péptido(s) de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6.
10. Ensaio de competição imunológico para detectar anticorpos contra HIV empregando um péptido de acordo as reivindicações 1 a 3, estando o referido péptido capaz de competir com um antigénio ou um péptido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 ligado a uma fase sólida.
11. Ensaio imunológico para detectar anticorpos contra HTV de acordo com as reivindicações 9 a 10, com os referidos péptidos ligados a uma membrana na forma de linhas paralelas.
12. Ensaio imunológico para detectar simultaneamente a presença ou ausência de anticorpos contra diferentes genotipos de HIV numa 4 amostra, empregando um péptido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6. Lisboa, 17 de Julho de 2007 5