CN1114106C - 金属螯合物标记的肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及金属螯合物标记的肽抗原的制备方法，用此法制得的肽和它用于免疫鉴别的用途。

Description

金属螯合物标记的肽及其制备方法
本发明涉及金属螯合物标记的肽的制备方法、用此法制得的金属螯合物标记的肽，以及这些肽用于免疫检查方法的用途。
人体液、特别是人血清中免疫球蛋白的鉴别可用于诊断微生物感染，尤其是病毒如HIV，肝炎病毒等感染。鉴别在检样中特异免疫球蛋白的存在，常规的方法是与一种或多种抗原反应，该抗原与特异的免疫球蛋白反应。在检液中特异的免疫球蛋白的测定方法应灵敏、可靠、简便和快速。
近年来，基于非放射性标记基团的鉴别系统的研制日益增多，该标记基团存在于检样如特异的抗体中，可经光学(例如发光或荧光)、NMR或金属沉淀等检测系统测定之。
EP-A-0307149公开了抗体的免疫试验，是用两个重组的多肽作为抗原，其中一个肽键固定在固相上，另一肽键带有标记基团，两个重组的抗原于不同的有机体上实验，以提高鉴别的特异性。
EP-A-0 366 673公布了鉴别检样中抗体的方法。是抗体与纯化的、标记的抗原反应和在固相上结合的同样纯化的抗原反应来鉴定的。抗原例如是人的IgG。
EP-A-0 386 713叙述了鉴别HIV抗体的方法，是用两个固体载体，各种HIV抗原被免疫在两个固体载体上，每个检样的等分液与标记的HIV抗体接触，若存在抗体，则因在至少一个检样上的阳性反应而可检出。该专利公布了用重组法制备的多肽作为HIV-抗原。
EP-A-0 507 586叙述了对特异免疫球蛋白的免疫学检查方法。此时检样与具有能与免疫球蛋白结合的两个抗原相接触，第一个抗原带有结合于固体载体上的适宜的基团，另一抗原带有标记基团。标记基团可以是直接标记基团，例如酶，生色团，金属粒子，或是间接的标记基团，即在抗原上连接的标记基团可与该标记基团的受体反应，而该标记基团又带有产生信号的基团。这类间接的标记基团的实例可提及萤光衍生物，其受体是一抗体，该抗体又与一酶偶联。作为抗原公布的是多肽，如乙肝表面抗原。该抗原经使SH基衍生化，与萤光素相偶联。
EP-A-0 507 587公布了鉴别IgM抗体的适宜的方法，检样与标记抗原进行温育，该抗原指向要检出的抗体，第二个抗体也指向要鉴别的抗体，它固定在固相上。
EP-A-0 199 804和EP-A-0 580 979公布了免疫鉴别方法，所用的抗原是用萤光性的金属螯合基团，尤其是用钌和锇螯合基进行标记。作为抗原用的是免疫球蛋白，它通过与活化的金属配合物反应而被标记。
EP-A-0 178 450公布了金属螯合剂，特别是钌配合物，它可偶联在免疫活性物质如抗体上。该偶联反应是通过免疫活性物质与金属螯合剂的反应而进行的。
EP-A-0 255 534公布了发光免疫测定法，它是用金属整合物偶联的抗原或抗体。该偶联反应例如用金属螯合物-活化酯衍生物与抗体反应而成。
WO 90/05301公布了定量测定和鉴别的方法，是用电化学发光法，使用发光的金属螯合物，后者可偶联于(i)加入的检样上；(ii)检样的结合对应物上或(iii)活性成分上，该活性成分与(i)或(ii)相连接。该发光测定是根据金属螯合物结合在活化的和任选的磁性微粒上进行的。
本领域已知的免疫鉴别方法检查抗体时，常规用多肽-抗原，大多由重组DNA方法产生。在加入这类多肽-抗原时，又可遇到问题。重组多肽通常只是以融合多肽形式而产生，该融合部分在检测时可导致假阳性结果。而且重组表达生成的多肽在检样液中稳定性很差，易于聚集。另一缺点是，这样的多肽上的标记基团的引入常常无选择性和再现性。
此外，制备重组的多肽抗原价格很高，而且各种批号的重组多肽的免疫反应性能有很大的波动性。
基于这些问题，本发明提供了一种方法，是用一种简便的有效的方法制备用于免疫测定的抗原，此时，本领域已知的抗原的缺点至少部分地被克服了。此外，本方法也可以将标记基团选择性地和再现性地引入到抗原上。
该问题的解决是制题备出金属螯合物标记的肽，其特征是，在固相上合成所需的氨基酸序列，其中，(a)合成后，将活化的发光的金属整合物偶联在肽的N-端伯氨基上，或/和(b)在合成当中，在肽的至少一个位置上引入这样的氨基酸衍生物，它与一发光的金属螯合物-标主基团经共价键偶联。
本发明制备的肽优选为最长有50个氨基酸，尤其优选为最多30个氨基酸，特别适宜于免疫鉴别，尤其是测定特异的免疫球蛋白。令人意外的发现是，本发明制备的肽类尽管存在有庞大的金属螯合物-标记基团，但对于鉴别免疫球蛋白仍有很高的亲和性和特异性。
本发明方法可以选择性地引入金属螯合物-标记基团，无论在定位上，或是在数目上均有选择性。本发明合成的肽有可能通过选择性地建造金属螯合物-标记的氨基酸衍生物，而有目的地选择在肽中的位置，在该位置上进行标记。用这种方法，免疫试验有较好的再现性和灵敏度。
本发明方法的另一个优点是，通过使用肽-抗原，可以知道所有的抗体如IgG，IgM，IgE和IgA。用确定的小的、稳定的、不易聚集的抗原进行测定，出错率也是很小的。
用本发明方法偶联于肽上的金属螯合物是发光的金属螯合物，即产生可以检查到的发光反应的金属螯合物。检查这样的发光反应，例如可通过荧光测定或电化学发光测定而进行。这类金属螯合物的金属例如是过渡金属或稀土金属，优选的金属是钌、锇、铼、铱、铑、铂、铟、钯、钼、锝、铜、铬、钨。尤其优选的是钌、铱、铼和锇，最优选的是钌。
与金属结合成金属螯合物的配体常规是多齿配体，即具有多个配基的配体。多齿配体包括例如芳香性和脂肪性配体。适宜的芳香族多齿配体有芳香族杂环配体。优选的芳香族杂环配体是含氮的多杂环，如二吡啶、二吡唑、三联吡啶和菲咯啉。这些配体可以包含有代表性的取代基，例如烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、羧根、羧基醛基、羧酰胺基、氰基、氨基、羟基、亚胺基、羟羰基、胺基羰基、脒基、胍基、脲基、含硫基团，含磷基团(以及：N-羟基丁二酰亚胺的羧酸酯。该螯合物也可含有一个或多个单齿配体，例如单齿配体包括一氧化碳，氰化物，异氰化物，卤化物，脂肪族、芳香族和杂环的膦、胺、和胂化物。
特别优选的发光金属螯合物是选自联吡啶和菲咯啉配体的金属螯合物，例如适宜的金属螯合物及其制法叙述于EP-A-0178 450，EP-A-0 255 534，EP-A-0 580 979和WO 90/05301。在此声明，有关内容并入本发明。最为优选的金属螯合物是钌-(联吡啶)3-螯合物。该螯合物以活性酯衍生物形式可以买到，例如在Igen公司(美国Rockville，MD)。
按照本发明方法(a)，在合成了所需的氨基酸序列后，经肽的N-端伯氨基上与一种活化的金属螯合物如金属螯合物-活化酯衍生物的选择性反应，将金属螯合物标记基团引入到肽上。该活化的金属螯合剂的偶联反应优选发生在肽从固相上脱离之前和在肽合成中所用氨基酸活泼侧键上的保护基去掉之前。
本发明的(b)法是，在固相合成时引入已用共价键偶联上发光的金属螯合物-标记基团的氨基酸衍生物。金属螯合物-标记的基团优选偶联在氨基上，尤其是氨基酸衍生物的伯氨基上。在合成中，若标记基团要引入到肽序列的氨基末端时，则金属螯合物可偶联在N-末端氨基酸的游离氨基上。若标记基团要引入到序列的中间，则金属螯合物最好偶联在某个氨基酸如赖氨酸或鸟氨酸的伯氨侧基上。制备氨基酸-金属合物-衍生物例如可将活化的金属螯合物如金属螯合物活泼酯衍生物偶联在必要时部分被保护的氨基酸衍生物的游离伯氨基上。图1是优选的金属螯合物偶联的赖氨酸衍生物。
本发明的“活泼酯”一词包括活化酯基，它在这样反应条件下可以与肽的游离氨基反应，而不致于与肽的其它有反应活性的基团发生干扰的副反应。作为活泼酯衍生物优选的实例是N-羟基丁二酰亚胺酯。除此之外，也可用对硝基苯基-、五氟苯基-、咪唑基-或N-羟基苯并三唑-酯。
本发明方法具有所希望有的、氨基酸序列的肽是用固相、最好在市售的肽合成仪(例如A431或A433仪，Applied Biosystems公司)上制备。该合成是按照已知方法进行，优选用氨基酸衍生物始自肽的羧基端。最好加入这样的氨基酸衍生物，其在偶联时所需的末端氨基被芴甲氧羰基-(Fmac)-基衍生化。加入的氨基酸的有反应活性的侧键有保护基，该保护基在肽合成完毕后不必再行裂解。优选的保护基有如三苯甲基(Trt)，叔丁醚(tBu)，叔丁酯(OtBu)，叔丁氧羰基(Boc)或2，2，5，7，8-五甲基-苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)。
赖氨酸残基的氨基酸侧链或其它氨基酸衍生物的伯氨基侧链-它出现在肽链上，且在其上应引入一个标记基团-可按照方法(b)经共价键将金属螯合物偶联。
除20个天然氨基酸外，肽也可含有非天然氨基酸，如β-丙氨酸，γ-氨基丁酸，ε-氨基已酸，正亮氨酸、或鸟氨酸。非天然氨基酸在合成中用类似于天然氨基酸方法，以被保护的形式使用。
按本发明方法(a)，在合成完毕后，金属螯合物标记基的引入这样进行，将优选固相结合的肽与所希望的活化金属螯合物进行反应。该螯合物与肽的N-末端氨基酸的游离伯氨基反应。活泼酯的加入量是每当量游离伯氨基用1.5-4当量。然后根据需要，将反应产物自固相上裂解并将保护基裂解掉，再纯化，优选用HPLC法。
若肽中仍含已用第二个保护基如苯乙酰基衍生化了的氨基，则在最后一步除去该保护基。苯乙酰基保护基的除去方法例如可用酶法、用固定化的或溶解性的青霉素G酰氨酶在室温下，于带有机溶剂含量的水溶液中进行。
本发明制备的肽若含有分子内二硫桥键，则在合成完毕后、但在N-末端氨基酸残基的Fmoc-保护基裂解之前，肽序列可用例如碘、于六氟异丙醇/二氯甲烷中、在固相上氧化(Kamber和HisKey于E.Gross和J.Meienhofer编，肽，学术出版社(The Deptide，Academie Press)，N.Y.1981，p.145～147)，然后再将N-端Fmoc-保护基裂解掉。
所合成的肽优选含有免疫学反应活性的抗原决定基部分，即与抗体结合的肽序列，以及间隔基部分。在这种情况下，优选至少一个金属螯合物-标记基团偶联在间隔基部分上。在在其间隔基部位连结有标记基团的肽通常具有较好的免疫试验灵敏性。
优选具有1-10个氨基酸长度的间隔基，其作用是起稳定化和赋予溶解性的作用，因为它含有电荷和/或可形成氢键。此外，间隔基还可使多个例如高分子受体键合于金属螯合物-标记的肽的位阻上的过程从立体上变得容易。间隔基的氨基酸最好选自甘氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸、赖氨酸以及结构式为NH2-[(CH2)nO]x-CH2-CH2COOH的化合物，式中n为2或3，X为1-10。此外，间隔基中至少部分地含有非天然性氨基酸是优选的。间隔基优选处于肽的氨基端和/或羧基端。
优选用本发明方法合成这样的肽，它们含有的抗原决定部分来自病原有机体中，如细菌，病毒，原虫或自家免疫抗原。免疫活性抗原决定部分最好来自病毒抗原，如HIV-I、HIV-II、HIV-O亚型或丙肝病毒(HCV)。
HIV-I、HIV-II或HIV-O亚型抗原决定基最好选自gp32、gp41和gp120区域。HCV抗原决定基最好选自NS3，NS4或NS5的核/Env-区域或非结构蛋白区域。
HIV-I、HIV-II或HIV-O亚型的氨基酰序裂尤其优选自如下序列：
NNTRKSISIG    PGRAFYT                 (I)
NTTRSISIGP    GRAFYT                  (II)
IDIQEERRMR    IGPGMAWYS               (III)
QARILAVERY    LKDQQLLGIW    GASG      (IV)
LGIWGCSGKL    ICTTAVPWNA    SWS       (V)
KDQQLLGIWG    SSGKL                   (VI)
ALETLLQNQQ    LLSLW                   (VII)
LSLWGCKGKL    VCYTS                   (VIII)
WGIRQLRARL    LALETLLQN               (IX)
QAQLNSWGCA    FRQVCHTTVP    WPNDSLT   (X)或者它们的部分序列，但至少有6个、并最好至少有8个氨基酸的长度。
氨基酸序列I-III来自HIV-I的gp120一区，序列IV-IX来自HIV-I的gp-41区，序列X来自HIV-II的gp-32区。氨基酸序列I-X还可是序列原型SEQ ID No.1-SEQ ID No.10。序列V、VIII和X各含2个半脱氨酸，优选以二硫化物桥键形式存在。该序列最好含于N-或/和C-末端的间隔基，如上面所定义的那样，该间隔基携带有金属螯合物-标记基。在抗原决定基区内部还可任选地有以标记3的形式存在的赖氨酸残基。
HCV氨基酸序列的抗原决定基区优选选自如下序列：
SRRFAQALPV    WARPD                   (XI)
PQDVKFPGGG    QIVGGV                  (XII)
EEASQHLPYI    EQ                      (XIII)
QKALGLLQT                             (XIV)
SRGNHVSPTH    YVPESDAA                (XV)
PQRKNKRNTN    RRPQDVKFPG
GGQIVGGV                              (XVI)
AWYELTPAET    TVRLRAYMNT    PGLPV     (XVII)或它们的部分序列，长度是至少6个、优选至少8个氨基酸。序列XI来自HIV的NS5-区，序列XII和XVI来自核区，序列XIII、XIV和XV来自NS4区，序列XVII来自NS3区。氨基酸序列XI-XVII是序列原型SEQ ID No11到SEQ ID No.17。具有上述抗原决定基的肽优选还含有携带金属螯合物标记基的间隔基部分。
本发明的另一内容是金属螯合物标记的肽，其长度最大为50个氨基酸，优选最大为30个，在氨基末端或/和氨基侧键基上至少有1个发光的金属螯合物，优选是金属螯合物-活泼酯衍生物，发光的金属螯合物优选为钌螯合物。
本发明肽最好包含有免疫活性的抗原决定基区，它可与抗体如人血清反应；还含有免疫非活性的间隔基区，其上至少带有一个金属螯合物标记基。该间隔基最好连在末端氨基上，长度为1-10个氨基酸。抗原决定区域最好来自HIV-I或HIV-II并包括其变异体的氨基酸序列，例如其亚型HIV0亚型的序列，并是氨基酸序列I-XVII或其部分序列中的一个。
本发明还涉及金属螯合物标记的肽的用途，用作用于免疫法测定检液中特异抗体的抗原。优选确定的抗体是指示微生物感染，如某种细菌、病毒或原虫感染的抗体。尤其优选的是针对病毒的抗体，例如HIV或肝炎病毒的抗体。检液优选为血清，尤其是人血清。此外优选的是，本发明金属螯合物标记的肽于免疫法中用于试剂盒。
此外，本发明还涉及对检液中特异抗体的免疫测定方法，其特征是，将检液与针对欲测定的抗体的第一个标记的抗原和如上面定义的金属螯合物标记的肽混和并温育，抗体经与肽键合而鉴定出。作为第一抗原优选用具有钌、铼、铱或锇螯合物标记的肽。
本发明的免疫测定方法可按照已知的试剂盒进行，例如在均相的、具有单反应相的免疫试验中、或在非均相的、具有多于一个反应相的免疫试验中进行。非均相的试剂盒优选使用于固相存在下鉴别抗体的存在。该试剂盒的实施形式是所谓双抗原-试剂盒。此时，检液在固相存在下与第一和第二抗原温育，第二抗原是针对所要测定的抗体，并且(a)与固相连接或(b)以可与固相结合的形式存在。检液中待测定的抗体是经测定固相中或/和液相中的标记基团而鉴定的。第二个抗原优选用生物素标记，并可与固相结合，后者用抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白覆盖。第二抗原优选用生物素标记的肽。
试验方法优选是将检液和第一抗原和固相上的第二抗原混合，以得到由第一抗原、抗体和固相连接的第二抗原构成的、标记的固定配合物。与其他的试剂盒不同，本发明的试剂盒用于鉴别抗体时既提高了灵敏度，即所有的球蛋白家族如IgG、IgM、IgA和IgE均可鉴别出，也改善了特异性，即减少了非特异性反应。
双抗原试剂盒的另一优点是加入了固相结合的金属螯合物标记的肽作为抗原，可以减少抗体具有高滴度检样的假阴性危险，是因为钩效应和提高了每个肽的标记基团的数目，优选是2-10个标记基团。增加金属螯合物-标记基的数目导致了对受体的信号的放大作用，相对于用可直接检出标记基团，改善了试验方法的钩-灵敏性。
最好是用电化学发光法鉴别发光的金属螯合物，经电化学作用，在电极的表面产生发光物质。该发光作用可用定性法或(和)定量方法检查。例如在EP-A-0 580 797，WO 90/05301，WO 90/11511和WO92/14138中叙述了发光试验法。那里公开的发光分析法及装置在此声明并入本发明。电化学发光分析法的固相最好是由微粒、尤其是磁性微粒组成，它构成一层覆盖层，它与固相上的第二个抗体相互作用。优选的微粒是用抗生蛋白链菌素覆盖。
电化学发光测定最好是在有对金属配合物是还原剂的物质例如胺存在下进行，优选的是脂族胺，尤其是伯、仲、叔脂族胺，其烷基可有1-3个碳原子。尤其优选的是三丙胺。还可以是芳胺，如苯胺或是杂环胺。
此外，可任选有作为增强剂的非离子性表面活性剂，如乙氧基化苯酚。这样的物质例如可买到，名称为Triton X100或Triton N-401。
另一方面，也可用荧光的方法检出发光的金属螯合基，此时金属螯合物用适当波长的光照射，从而测定生成的荧光。例如在EP-A-0178450和EP-A-0255534中叙述了荧光测定。有关内容在此声明本发明。
本发明的另一内容是用于免疫测定特异抗体的试剂，它含有至少一种用本发明的金属螯合物标记的、能与待测定抗体反应的肽。若该试剂用于双抗原试剂盒，则它最好含有(a)螯合物标记的肽，和(b)另一种与待测定的抗体反应的抗原，它连接于一种固相上或处于可同固相结合的形式。
本发明还涉及通式(Ia)或(Ib)的氨基酸衍生物。
Figure C9519432100141
式中，R1为氢或阳离子基团，例如一个碱金属离子或铵离子，R2为氢或用于固相-肽合成的氨基保护基，R3为C1-C5烷基，Y为一种任意氨基酸的侧链，MXn为发光的金属螯合基，其中M被n个相同或不相同的配位体X螯合。
通式Ia的氨基酸衍生物中，金属螯合基MXn偶联在氨基酸如赖氨酸或鸟氨酸的伯氨基上。在通式(Ib)的氨基酸衍生物中，金属螯合基偶联在一种任意的氨基酸如天然氨基酸或非天然氨基酸的α-氨基上，这些氨基任选带有保护基。通式Ia的氨基酸衍生物可以引入到肽序列的内部或末端。通式Ib的氨基酸衍生物中，只要基团Y中不含有伯氨基，则该氨基酸仅引入到肽序列的N端上。
金属螯合基MXn优选为结构ML1L2L3，L1、L2和L3相同或不相同，每一个为含至少两个含N杂环的配位体如联吡啶或菲咯啉，该配位体之一任选经间隔基偶联于氨基酸的一个氨基上。
本发明的一个实例是赖氨酸-钌螯合物(Fmoc-Lys(BPRu)-OH)，列于图1。
此外，本发明用如下的实施例、序列类型和图加以说明。其中
SEQ ID NO.1：自HIV-I的gp-120部分的抗原决定簇的氨基酸序列，SEQ ID NO.2：自HIV-I的gp-120部分的另一个抗原决定簇的氨基酸序
         列，SEQ ID NO.3：自HIV-I，O亚类的gp-120部分的另一个抗原决定簇的氨基
         酸序列，SEQ ID NO.4：自HIV-I的gp-41部分的抗原决定簇的氨基酸序列，SEQ ID NO.5：自HIV-I的gp-41部分的另一个抗原决定簇的氨基酸序
         列，SEQ ID NO.6：自HIV-I的gp-41部分的再另一个抗原决定簇的氨基酸序
         列，SEQ ID NO.7：自HIV-I、O亚类的gp-41部分的抗原决定簇的氨基酸序
         列，SEQ ID NO.8：自HIV-I，O亚类的gp-41部分的另一个抗原决定簇的氨基
         酸序列，SEQ ID NO.9：自HIV-I，O亚类的gp-41部分的再另外一个抗原决定簇的
         氨基酸序列，SEQ ID NO.10：自HIV-II的gp-32部分的一个抗原决定簇的氨基酸序
          列，SEQ ID NO.11：自HCV的NS5-部分的一个抗原决定簇的氨基酸序列，SEQ ID NO.12：自HCV的核心部分的一个抗原决定簇的氨基酸序列，SEQ ID NO.13：自HCV的NS4-部分的一个抗原决定簇的氨基酸序列，SEQ ID NO.14：自HCV的NS4-部分的另一个抗原决定簇的氨基酸序列，SEQ ID NO.15：自HCV的NS4-部分的再另外一个抗原决定簇的氨基酸序
          列，SEQ ID NO.16：自HCV的核心部分的另一个抗原决定簇的氨基酸序列，和SEQ ID NO.17：自HCV的NS3-部分的抗原决定簇的氨基酸序列。
图1：钌-(联吡啶)3-偶联的、并在α-氨基上保护的赖氨酸衍生物
实施例1金属螯合物标记肽的制备
金属整合物标记肽是在例如Applied Biosy tems A431或A433批处理式肽合成仪上借助芴甲氧羰基-(Fmoc)-固相肽合成而制备的。每4.0当量在表1中所示的氨基酸衍生物使用于制备：表1
 A  Fmoc-Ala-OH
 C  Fmoc-Cys(Trt)-OH
D Fmoc-Asp(OtBu)-OH
 E  Fmoc-Glu(OtBu)-OH
 F  Fmoc-Phe-OH
 G  Fmoc-Gly-OH
 H  Fmoc-His(Trt)-OH
 I  Fmoc-Ile-OH
 K1  Fmoc-Lys(Boc)-OH
 K2  Boc-Lys(Fmoc)-OH
 K3  Fmoc-Lys(BPRu)-OH
 L  Fmoc-Leu-OH
 M  Fmoc-Met-OH
 N  Fmoc-Asn(Trt)-OH
 P  Fmoc-Pro-OH
 Q  Fmoc-Gln(Trt)-OH
 R  Fmoc-Arg(Pmc)-OH
 S  Fmoc-Ser(tBu)-OH
 T  Fmoc-Thr(tBu)-OH
 U  Fmoc-BAlanin-OH
 V  Fmoc-Val-OH
 W  Fmoc-Trp-OH
 Y  Fmoc-Tyr(tBu)-OH
 Z  Fmoc-ε-氨基己酸-OH
 Nle  Fmoc-ε-正亮氨酸-OH
 Abu  Fmoc-γ-氨基丁酸-OH
在方法(a)-在固相合成完毕后引入标记基-中，在肽的N-端偶联活化的BPRu-COOH。用赖氨酸衍生物K1为间隔部分，赖氨酸衍生物K2为抗原决定部分。
按方法(b)，通过直接建造金属螯合物偶联的氨基酸衍生物，将金属螯合物基团引入到肽序列中。例如在序列内部经用金属螯合物-活性酯ε-衍生化的赖氨酸残基如赖氨酸衍生物K3(图1)，或在N-末端用α-衍生化的氨基酸残基来偶联。
氨基酸或氨基酸衍生物溶解于N-甲基吡咯烷酮中，在400-500mg4-(2’，4’-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧树脂(TetrahedronLetters，28，(1987)2107)上构建肽，载量为0.4-0.7mmol/g(JACS，95(1973)，1328)。偶联反应是用二甲基甲酰胺为反应介质、20分钟内，以Fmoc-氨基酸衍生物与4当量二环己基碳二亚胺和4当量N-羟基苯并三唑进行的。每个合成步骤之后，Fmoc-基团用含20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液于20分钟内进行裂解。
肽序列中若存在半胱氨酸残基时，合成完毕后，用碘在六氟异丙醇/二氯甲烷中直接在固相上进行氧化。
自载体上将肽游离下来、并裂解下酸敏感的保护基，是在室温下40分钟内于20ml三氟乙酸、0.5ml乙二硫醇、1ml硫代茴香醚、1.5g苯酚和1ml水中进行。然后将反应液与300ml冷二异丙基醚混合，保持于0℃40分钟，使肽完全沉出。滤集沉淀，用二异丙醚洗涤，溶解于50％醋酸后，冻干。得到的粗品用制备型HPLC于Delta-PAK RP C18-填充料(柱50×300mm，100，15μ)，梯度洗脱，洗脱液A：水、0.1％三氟乙酸；洗脱液B：乙腈，0.1％三氟乙酸，纯化时间大约120分钟。洗脱物质的鉴别采用离子喷射质谱法。
按照方法(a)引入金属螯合物标记基时，是将相应的活性酯衍生物偶联在与载体连结的肽的N-末端氨基上。为此，将每1当量伯氨基4当量的BPRu-COOH用N-羟基苯并三唑/二环己基碳二亚胺活化，并于少量DMSO中溶解，于室温下搅拌。反应用分析型HPLC跟踪。裂解掉载体后，产物用制备型HPLC纯化。洗脱的产物用离子喷射质谱鉴定。
也可用方法(a)和(b)的组合法制备肽，即将金属螯合物偶联的氨基酸衍生物构建到肽序列之中，裂解掉N-末端Fmoc-基，使游离的N-末端氨基与金属螯合物-活性酯衍生物反应。
按照方法(b)，在固相合成期间，唯一地直接建造金属螯合物偶联的氨基酸衍生物，就不再必要再加入金属螯合物-活化酯了。
表2列出了由HIV-1或HIV-Il的gp120，gp41和gp32区域制备的肽化合物。表2：钌化的线型肽：
gp120  BPRu-UZU-NNTRKSISIGPGRAFYTBPRu-UZ-NTTRSISIGPGRAFYBPRu(ethylenglykol)-UZ-NTTRSISIGPGRAFYNNTRKSISIGPGRAFYT-K(BPRu)BPRu-UZU-IDIQEERRMRIGPGMAWYS
gp41/1  BPRu-UZU-AVERYLKDQQLLGIWBPRu-UGGG-QARILAVERYLKDQQLLGIWGASGBPRu-GGGG-QARILAVERYLKDQQLLGIWGASGBPRu-UZU-WGIRQLRARLLALETLLQN
gp41/2  BPRu-UZU-LGIWGCSGKLICTTAVBPRu-UGGG-GCSGKLICTTAVPWNASWS(GCSGKLICTTAVPWNASWS)K-(BPRu)
gp41/3  BPRu-UZU-KDQQLLGIWGSSGKL
gp41/4  BPRu-UZU-ALETLLQNQQLLSLW
gp32  BPRu-UZU-NSWGCAFRQVCHTTBPRu-GGG-QAQLNSWGCAFRQVCHTTVPWPNDSLT
表3列出了由HCV的NS5、NS4和核心部分制备出的肽。表3：钌化的线型肽：
 Core1  BPRu-GGGG-KNKRNTNRR
 Core1+2  BPRu-UZU-KNKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGV
 NS4/1+2  BPRu-UZ-SQHLPYIEQG-NleNle-LAEQFKQQALGLLQT
 NS4/3m  BPRu-UZ-SRGNHVSPTHYVPESDAA
 NS5/1  BPRu-UZ-SRRFAQALPVWARPD
 Core1+2+3  BPRu-UZ-KNKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVLLPRR
 Core1m  BPRu-UZ-NPKPQKKNKRNTNRR
 Core3m  BPRu-UZ-GQIVGGVYLLPRRGPRLG
 Core2m  BPRu-UZ-PQDVKFPGGGQIVGGV
 NS4/3m-I  BPRu-UZU-SRGNHVSPTHYVPESDAA
 NS4/1  BPRu-UZU-SQHLPYIEQ
生物素标记的肽的制备或是在树脂上N-末端的衍生物(生物素-活化酯)，或经过生物素活泼酯-ε-衍生化的赖氨酸残基(Fmoc-Lys(生物素)-OH)引入到序列中。实施例2
用双抗原测定时，将本发明的肽抗原与重组的多肽抗原作比较。本发明实施例中，钌化的肽抗原gp 41/2(表2)与同样序列的生物素化的肽抗原加以组合进行测定。于比较实施例中，钌化的多肽-抗原重组gp41(Chang等，Science 228(1985)，93-96)与同样序列的生物素化的多肽抗原组合进行测定。
这些测定表明，重组的多肽抗原对阴性和阳性检样之间实际上没有区别，而肽抗原有非常良好的区别。
                       序列记录(1)一般信息：(i)申请人：
(A)名称：波林格曼海姆有限公司
(B)街道：散德菏非街116
(C)城市：曼海姆
(D)国家：德国
(E)邮编：68305(ii)登录标题：金属螯合物标记的肽(iii)序列数：17(iv)计算机读取形式
(A)数据载体：软盘
(B)计算机：IBM兼容机
(C)驱动系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPA)(2)SEQ ID NO：1的信息(i)序列特征：
(A)长度：17个氨基酸
(B)性质：氨基酸
(D)拓扑形状：线型(ii)分子性质：肽(iii)前提：无(vi)原始来源
(A)有机物：人免疫缺陷病毒I型(viii)基因组位置：   (A)染色体/片段：gp120(xi)序列表示：SEQ ID NO：1：Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr1               5                  10                  15(2)SEQ ID NO：2的信息(i)序列特征：(A)长度：16个氨基酸(B)性质：氨基酸(D)拓扑形状：线型(ii)分子性质：肽(iii)前提：无(vi)原始来源：(A)有机物：人免疫缺陷病毒I型(viii)基因组位置：(A)染色体/片段：gp120(xi)序列表示：SEQ ID NO：2：Asn Thr Thr Arg Ser Ile Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr1               5                      10                  15(2)SEQ ID NO：3的信息(i)序列特征：(A)长度：19个氨基酸(B)性质：氨基酸(D)拓扑形状：线型(ii)分子性质：肽(iii)前提：无(vi)原始来源：(A)有机物：人免疫缺陷病毒I型   (B)来源：亚型O(viii)基因组位置：(A)染色体/片段：gp120(xi)序列表示：SEQ ID NO：3：Ile Asp Ile Gln Glu Glu Arg Arg Met Arg Ile Gly Pro Gly Met Ala Trp1               5                  10                      15Tyr Ser(2)SEQ ID NO：4的信息(i)序列特征：(A)长度：24个氨基酸(B)性质：氨基酸(D)拓扑形状：线型(ii)分子性质：肽(iii)前提：无(vi)原始来源：(A)有机物：人免疫缺陷病毒I型(viii)基因组位置：(A)染色体/片段：gp41(xi)序列表示：SEQ ID NO：4：Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu1               5                  10                  15Gly Ile Trp Gly Ala Ser Gly
     20(2)SEQ ID NO：5的信息(i)序列特征：(A)长度：23个氨基酸(B)性质：氨基酸   (C)拓扑形状：线型(ii)分子性质：肽(iii)前提：无(vi)原始来源：(A)有机物：人体免疫缺陷病毒I型(viii)基因组位置：(A)染色体/片段：gp41(xi)序列表示：SEQ ID NO：5：Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp1               5                  10                  15Asn Ala Ser Trp Ser
 20(2)SEQ ID NO：6的信息(i)序列特征：(A)长度：15个氨基酸(B)性质：氨基酸(D)拓扑形状：线型(ii)分子性质：肽(iii)前提：无(vi)原始来源：(A)有机物：人体免疫缺陷病毒I型(viii)基因组位置：(A)染色体/片段：gp41(xi)序列表示：SEQ ID NO：6：Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Ser Ser Gly Lys Leu1               5                  10                  15(2)SEQ ID NO：7的信息 (i)序列特征：(A)长度：15个氨基酸(B)性质：氨基酸(C)拓扑形状：线型(ii)分子性质：肽(iii)前提：无(vi)原始来源：(A)有机物：人体免疫缺陷病毒I(B)来源：O亚型(viii)基因组位置：(A)染色体/片段：gp41(xi)序列表示：SEQ ID NO：7：Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Ser Leu Trp1               5                  10                  15(2)SEQ ID NO：8的信息(i)序列特征：(A)长度：15个氨基酸(B)性质：氨基酸(D)拓扑形状：线型(ii)分子性质：肽(iii)前提：无(vi)原始来源：(A)有机物：人体免疫缺陷病毒I型(B)来源：亚型O(viii)基因组位置：(A)染色体/片段：gp41(xi)序列表示：SEQ ID NO：8：Leu Ser Leu Trp Gly Cys Lys Gly Lys Leu Val Cys Tyr Thr Ser  1               5               10               15(2)SEQ ID NO：9的信息(i)序列特征：(A)长度：19个氨基酸(B)性质：氨基酸(D)拓扑形状：线型(ii)分子性质：肽(iii)前提：无(vi)原始来源：(A)有机物：人免疫缺陷病毒I型(B)来源：亚型O(viii)基因组位置：(A)染色体/片段：gp41(xi)序列表示：SEQ ID NO 9：Trp Gly Ile Arg Gln Leu Arg Ala Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Leu Leu1               5                  10                  15Gln Asn(2)SEQ ID NO：10的信息(i)序列特征：(A)长度：27个氨基酸(B)性质：氨基酸(C)拓扑形状：线型(ii)分子性质：肽(iii)前提：无(vi)原始来源：(A)有机物：人体免疫缺陷病毒II型(viii)基因组位置：   (A)染色体/片段：gp32(xi)序列表示：SEQ ID NO 10：Gln Ala Gln Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His Thr1               5                  10                  15Thr Val Pro Trp Pro Asn Asp Ser Leu Thr
     20          25(2)SEQ ID NO：11的信息(i)序列特征：(A)长度：15个氨基酸(B)性质：氨基酸(D)拓扑形状：线型(ii)分子性质：肽(iii)前提：无(vi)原始来源：(A)有机物：肝炎C病毒(viii)基因组位置：(A)染色体/片段：NS5(xi)序列表示：SEQ ID NO：11：Ser Arg Arg Phe Ala Gln Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp1               5                  10                  15(2)SEQ ID NO：12的信息(i)序列特征：(A)长度：16个氨基酸(B)性质：氨基酸(D)拓扑形状：线型(ii)分子性质：肽(iii)前提：无 (vi)原始来源：(A)有机物：肝炎C病毒(viii)基因组位置：(A)染色体/片段：核心(xi)序列表示：SEQ ID NO：12：Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val1               5                  10                  15(2)SEQ ID NO：13的信息(i)序列特征：(A)长度：12个氨基酸(B)性质：氨基酸(D)拓扑形状：线型(ii)分子性质：肽(iii)前提：无(vi)原始来源：(A)有机物：肝炎C病毒(viii)基因组位置：(A)染色体/片段：NS4(xi)序列表示：SEQ ID NO：13：Glu Glu Ala Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln1               5                  10(2)SEQ ID NO：14的信息(i)序列特征：(A)长度：9个氨基酸(B)性质：氨基酸(D)拓扑形状：线型(ii)分子性质：肽 (iii)前提：无(vi)原始来源：(A)有机物：肝炎C病毒(viii)基因组位置：(A)染色体/片段：NS4(xi)序列表示：SEQ ID NO：14：Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr1               5(2)SEQ ID NO：15的信息(i)序列特征：(A)长度：18个氨基酸(B)性质：氨基酸(C)拓扑形状：线型(ii)分子性质：肽(iii)前提：无(vi)原始来源：(A)有机物：肝炎C病毒(viii)基因组位置：(A)染色体/片段：NS4(xi)序列表示：SEQ ID NO：15：Ser Arg Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu Ser Asp AlaAla1               5              10                  15(2)SEQ ID NO：16的信息(i)序列特征：(A)长度：28个氨基酸(B)性质：氨基酸   (C)拓扑形状：线型(ii)分子性质：肽(iii)前提：无(vi)原始来源：(A)有机物：肝炎C病毒(viii)基因组位置：(A)染色体/片段：核心(xi)序列表示：SEQ ID NO：16：Pro Gln Arg Lys Asn Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys1              5                   10                  15Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Val Val
     20                  25(2)SEQ ID NO：17的信息(i)序列特征：(A)长度：25个氨基酸(B)性质：氨基酸(C)拓扑形状：线型(ii)分子性质：肽(iii)前提：无(vi)原始来源：(A)有机物：肝炎C病毒(viii)基因组位置：(A)染色体/片段：NS3(xi)序列表示：SEQ ID NO：17：Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Arg Leu Arg Ala Tyr1               5                   10                  15Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val
     20                  25

Claims (15)

1.金属螯合物标记的肽的制备方法，其特征是，在固相上合成具有所希望有的氨基酸序列的肽，(a)在合成后，将活化了的、发光的金属螯合物偶联在肽的N端伯氨基上，或/和(b)在合成时，在肽链的至少一个位置上引入共价偶联了一个金属螯合物标记基团的氨基酸衍生物。
2.权利要求1的方法，其特征是，发光的金属螯合物选自钌、铼、铱和锇的螯合物。
3.权利要求1或2的方法，其特征是，金属螯合物的配位体选自芳香性杂环多齿配位体。
4.权利要求1的方法，其特征是，合成包含有一个免疫活性的抗原决定部分和间隔基部分的肽，其中在间隔基部分上至少偶联1个金属螯合物标记物。
5.权利要求1的方法，其特征是，合成这样的肽，它含有免疫学活性的病毒抗原决定部分。
6.权利要求5的方法，其特征是，抗原决定部分选自HIV-I和HIV-II的氨基酸序列
    NNTRKSISIG   PGRAFYT              (I)
    NTTRSISIGP   GRAFYT               (II)
    IDIQEERRMR   IGPGMAWYS            (III)
    QARILAVERY   LKDQQLLGIW   GASG    (IV)
    LGIWGCSGKL   ICTTAVPWNA   SWS     (V)
    KDQQLLGIWG   SSGKL                (VI)
    ALETLLQNQQ   LLSLW                (VII)
    LSLWGCKGKL   VCYTS                (VIII)
    WGIRQLRARL   LALETLLQN            (IX)
    QAQLNSWGCA   FRQVCHTTVP   WPNDSLT (X)或上述序列的部分序列，其长度至少有6个氨基酸。
7.权利要求5的方法，其特征是，抗原决定部分选自HCV的氨基酸序列
SRRFAQALPV    WARPD                     (XI)
PQDVKFPGGG    QIVGGV                    (XII)
EEASQHLPYI    EQ                        (XIII)
QKALGLLQT                               (XIV)
SRGNHVSPTH    YVPESDAA                  (XV)
PQRKNKRNTN    RRPQDVKFPG
GGQIVGGV                                (XVI)
AWYELTPAET    TVRLRAYMNT   PGLPV        (XVII)或上述序列的部分序列，其长度至少有6个氨基酸。
8.权利要求1的方法，其特征是，步骤(b)中的氨基酸衍生物具有通式Ia和Ib：
Figure C9519432100031
式中，R1为氢或一个阳离子基团，R2为氢或用于固相肽合成的氨基保护基，R3为C1-C5亚烷基，Y为一个任意氨基酸的侧链，MXn为发光的金属螯合基，其中M被n个相同或不相同的配位体X螯合。
9.金属螯合物标记的肽，其长度最多为50个氨基酸，在末端氨基或/和侧链氨基的选择位置上至少偶联了一个发光的金属螯合物。
10.权利要求9的肽，其特征是，抗原决定部分选自HIV-I和HIV-II的氨基酸序列
NNTRKSISIG    PGRAFYT                  (I)
NTTRSISIGP    GRAFYT                   (II)
IDIQEERRMR    IGPGMAWYS                (III)
QARILAVERY    LKDQQLLGIW    GASG       (IV)
LGIWGCSGKL    ICTTAVPWNA    SWS        (V)
KDQQLLGIWG    SSGKL                    (VI)
ALETLLQNQQ    LLSLW                    (VII)
LSLWGCKGKL    VCYTS                    (VIII)
WGIRQLRARL    LALETLLQN                (IX)
QAQLNSWGCA    FRQVCHTTVP    WPNDSLT    (X)或上述序列的部分序列，其长度至少有6个氨基酸。
11.权利要求9的肽，其特征是，抗原决定部分选自HCV的氨基酸序列
SRRFAQALPV    WARPD                    (XI)
PQDVKFPGGG    QIVGGV                   (XII)EEASQHLPYI    EQ                    (XIII)QKALGLLQT                           (XIV)SRGNHVSPTH    YVPESDAA              (XV)PQRKNKRNTN    RRPQDVKFPGGGQIVGGV                            (XVI)AWYELTPAET    TVRLRAYMNT   PGLPV    (XVII)或上述序列的部分序列，其长度至少有6个氨基酸。
12.用免疫方法测定检液中特异抗体的方法，其特征是，使带有针对待测定的抗体的第一标记的抗原的检液与按照权利要求1-7的方法制备的或按照权利要求8-10定义的金属螯合物标记的肽温育，抗体由于与肽结合而被检出，此处肽被标记在选定的目标位置上。
13.按照权利要求12的方法，其特征是，使检液在有固相的存在下，与第一抗原和第二抗原混合温育，该抗原是针对待测定的抗体的，并且(a)结合于固相上，或(b)以可与固相结合的形式存在，通过测定固相或/和液相中的标记物，检出待测定的抗体。
14.免疫法测定特异抗体的试剂，其特征是，它含有金属螯合物标记的、与待测定的抗体有反应性的肽，该肽是由权利要求1-7中的一个方法制备的，或是在权利要求8-10中定义的，该肽在选定的目标位置上已被标记。
15.权利要求14的试剂，其特征是，它含有(a)金属螯合物标记的、与待测定抗体有反应性的肽，和(b)另一种与待测定的抗体有反应性的抗原，它与固相结合或以能与固相结合的形式存在。
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