JPH09508473A - 金属キレート標識ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、金属キレート標識ペプチド抗原の製造方法、該方法により得られる該ペプチド、および免疫学的検出方法における該ペプチドの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 金属キレート標識ペプチド 本発明は、金属キレートで標識したペプチドの製造方法、この方法により得ら れる金属キレート標識ペプチド、および免疫学的検出法における該ペプチドの使 用に関する。 体液特にヒト血清中に含まれる免疫グロブリンの検出は、微生物、特にＨＩＶ 、肝炎ウイルスなどのウイルス、による感染を診断するために用いられている。 通常、検査試料中の特定の免疫グロブリンの存在は、その特定の免疫グロブリン と反応する１以上の抗原との反応により検出される。液体試料中の特定の免疫グ ロブリンを測定する方法は感度がよく、信頼でき、簡便でかつ迅速でなければな らない。 近年、検査試料中の被検体（例えば、特定の抗体）の存在を光学的（例えば、 発光または蛍光）、NMR-作動または金属- 沈殿検出系を用いて測定できる、非放 射性マーカー基に基づく検出系がますます開発されてきている。 EP-A-0 307 149は抗体の免疫学的試験を開示しており、この試験では抗原とし て２種類の組換えポリペプチドを用いるが、一方のポリペプチドは固相に固定さ れており、他方はマーカー基を有している。そして、この試験の特異性を高める ために、これらの両組換え抗原は別々の生物において発現される。 EP-A-0 366 673は試料中の抗体の検出方法を開示しており、この方法では精製 した標識抗原および固相に結合させた同一の精製抗原と反応させて抗体を検出す る。例えば、抗原としてヒトＩｇＧが記載されている。 EP-A-0 386 713は２つの固相支持体を用いてＨＩＶに対する抗体を検出する方 法を開示しており、そこでは種々のＨＩＶ抗原が２つの固相支持体に固定されて いて、それぞれを試料のアリコートおよび標識ＨＩＶ抗原と接触させる。抗体の 存在は少なくとも１つの試験における陽性反応により検出される。ＨＩＶ抗原と して、組換え法により産生されたポリペプチドが記載されている。 EP-A-0 507 586は特定の免疫グロブリンの免疫学的試験を実施する方法を記載 しており、この方法では試料を該免疫グロブリンと結合することができる２つの 抗原と接触させるが、第１の抗原は固相支持体に結合させるのに適した基を有し 、第２の抗原はマーカー基を有する。マーカー基は酵素、色素原、金属粒子など の直接マーカー基であってよく、また、間接マーカー基、すなわち抗原に結合し たマーカー基が該マーカー基の受容体（あとでシグナル発生基を担う）と反応し 得るもの、であってもよい。こうした間接マーカー基の例としてフルオレセイン 誘導体が挙げられており、その受容体は抗体であって、あとで該抗体は酵素に結 合される。肝炎Ｂ型表面抗原のようなポリペプチドが抗原として記述されている 。該フルオレセインを結合させるために用いるＳＨ基が誘導体化によりこの抗原 に導入される。 EP-A-0 507 587はＩｇＭ抗体の検出に適した特異的方法を開示しており、この 方法では検出すべき抗体に対する標識抗原および検出すべき抗体にやはり特異的 で、固相に結合することができる第２抗体と試料をインキュベートする。 EP-A-0 199 804およびEP-A-0 580 979は、発光金属キレート基、特にルテニウ ムおよびオスミウムキレート基で標識した抗原を用いる免疫学的検出法を開示し ている。活性化金属錯体との反応により統計的に標識された免疫グロブリンが抗 原として用いられる。 EP-A-0 178 450は、免疫学的に活性な物質（例えば、抗体）を結合させること ができる金属キレート、特にルテニウム錯体を開示している。この結合は免疫学 的に反応性の物質と金属キレートとの統計的反応により達成される。 EP-A-0 255 534は、金属キレートを結合させた抗原または抗体を用いる発光イ ムノアッセイを開示している。この結合は例えば金属キレートの活性エステル誘 導体と抗体との統計的反応により達成される。 WO 90/05301 は、(i)添加した被検体、(ii)被検体の結合相手または(iii)(i) もしくは(ii)に結合し得る反応性成分、に結合された発光金属キレートを用いる 電気化学的発光による被検体の検出および定量方法を開示している。発光は金属 キレートを活性化（場合により磁性）微粒子に結合させた後で測定される。 従来技術より知られた抗体の免疫学的検出法では、通常、組換えＤＮＡ法でふ つうに製造されたポリペプチド抗原が用いられている。しかし、このようなポリ ペプチド抗原を用いるときにはいくつかの問題が生じる。すなわち、組換えポリ ペプチドはしばしば融合体ポリペプチドの形でのみ製造され、その場合に融合部 分が試験において偽陽性の結果をまねくことがある。さらに、組換え発現により 製造されたポリペプチドはしばしば液体試料中での安定性がきわめて低く、凝集 する傾向がある。更なる問題点は、この種のポリペプチドにマーカー基を選択的 かつ再現可能に導入することがしばしば不可能なことである。 その上、組換えポリペプチド抗原の製造にはかなりの費用がかかり、しかも、 組換えポリペプチド抗原のロットごとに免疫反応性が非常にばらつくことがある 。 したがって、本発明の目的は、免疫学的試験用の抗原を簡便かつ効率的に製造 できる方法を提供することであり、この方法では従来技術より知られた抗原の欠 点が少なくとも部分的に排除される。さらに、この方法は該抗原へのマーカー基 の選択的かつ再現可能な導入を可能にするものである。 この目的は、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを固相上で合成し、その際 、(a)ペプチドの合成後に、活性化した発光金属キレートを該ペプチドのＮ末端 の第一級アミノ基に結合させる、および／または、(b)ペプチドの合成中に、発 光金属キレートマーカー基に共有結合させたアミノ酸誘導体を該ペプチドの少な くとも１つの位置に導入する、ことを特徴とする金属キレート標識ペプチドの製 造方法により達成される。 本発明の方法により製造されるペプチドは、好ましくは最長５０アミノ酸、特 に好ましくは多くても３０アミノ酸を有し、免疫学的検出法、とりわけ特定の免 疫グロブリンの定量に非常に適している。驚いたことに、本発明の方法により製 造されるペプチドは、かさ高の金属キレートマーカー基の存在にもかかわらず、 検出すべき免疫グロブリンに対して高い親和性および特異性を示すことが判明し た。 本発明による方法は、金属キレートマーカー基を、それらの位置に関してばか りか、それらの数に関しても、選択的に導入することを可能にする。すなわち、 本発明のペプチド合成においては、金属キレート標識アミノ酸誘導体の選択的取 り込みにより、標識を導入しようとするペプチドの位置を特定的に選択すること が可能である。このようにして、本発明により製造されたペプチドを用いる免疫 学的試験の再現性および感度が向上する。 本発明による方法の更なる利点は、ペプチド抗原の使用によりＩｇＧ、ＩｇＭ 、ＩｇＥ、ＩｇＡなどの全ての抗体クラスを認識できる点である。また、凝集す る傾向のない、特定された、小型で安定した抗原を用いることにより、免疫学的 試験が干渉を受けにくくなる。 本発明の方法によりペプチドに結合される金属キレートは発光金属キレート、 すなわち検出可能な発光反応を生じる金属キレートである。この発光反応は例え ば蛍光により、または電気化学的発光の測定により検出できる。こうした金属キ レートの金属は例えば遷移金属または稀土類金属である。金属としては、ルテニ ウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジウム、パラ ジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、クロムまたはタングステンが好ましい 。ルテニウム、イリジウム、レニウムおよびオスミウムが特に好適である。最適 なものはルテニウムである。 金属と一緒になって金属キレートを形成する配位子は通常、多座配位子、すな わち配位する位置がいくつかある配位子である。多座配位子は例えば芳香族およ び脂肪族配位子からなる。適当な芳香族多座配位子としては芳香族複素環式配位 子が挙げられる。好ましい芳香族複素環式配位子は窒素含有ポリ複素環、例えば ビピリジル、ビピラジル、ターピリジル、フェナントロリルなどである。これら の配位子は例えばアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキ ル、カルボキシレート、カルボキシアルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミ ノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニル、アミジン 、グアニジニウム、ウレイド、イオウ含有基、リン含有基、N-ヒドロキシスクシ ンイミドのカルボキシレートエステルなどの置換基を含むことができる。キレー トはまた、１個または数個の一座配位子を含むこともできる。一座配位子の例と しては、一酸化炭素、シアン化物、イソシアン化物、ハロゲン化物、脂肪族、芳 香族および複素環式ホスフィン、アミン、スチルベン、ヒ化水素などがある。 発光金属キレートは特にビピリジルまたはフェナントロリル配位子をもつ金属 キレートから選ぶことが好ましい。適当な金属キレートの例およびその製法は、 EP-A-0 178 450、EP-A-0 255 534、EP-A-0 580 979およびWO 90/05301 に記載さ れている。これらの開示内容を参照されたい。最適な金属キレートはルテニウム -(ビピリジル)₃-キレートである。こうしたキレートは活性エステル誘導体の形 で、例えばIgen Inc．(Rockville，MD，USA)から、販売されている。 本発明の方法(a)によると、金属キレート標識は、所望のアミノ酸配列の合成 後に、ペプチドのＮ末端第一級アミノ基と活性型金属キレート（例えば、金属キ レートの活性エステル誘導体）との選択的反応により、該ペプチドに導入される 。好ましくは、ペプチドを固相から切り離す前で、かつペプチド合成に用いたア ミノ酸誘導体の反応性側鎖上の保護基を除去する前に、活性型金属キレートを結 合させる。 本発明の方法(b)では、発光金属キレートマーカー基に共有結合させたアミノ 酸誘導体が固相合成中に導入される。好ましくは、アミノ酸誘導体のアミノ基、 特に第一級アミノ基に金属キレートマーカー基を結合させる。合成中に、マーカ ー基をペプチド配列のアミノ末端に導入するつもりであるならば、金属キレート をＮ末端アミノ酸の遊離アミノ基に結合させることができる。マーカー基をペプ チド配列の内部に導入するつもりであるならば、金属キレートをリシンやオルニ チンなどのアミノ酸の第一級アミノ側基に結合させることが好ましい。アミノ酸 −金属キレート誘導体を製造するには、例えば、活性型金属キレート（例えば、 金属キレートの活性エステル誘導体）を、場合により部分的に保護されていても よいアミノ酸誘導体の遊離の第一級アミノ基に結合させる。好適な金属キレート 結合リシン誘導体を図１に示す。 本発明の意図する「活性エステル」とは、ペプチドの他の反応性基との干渉副 反応を起こさない条件下で、ペプチドの遊離アミノ基と反応することができる活 性化されたエステル基をいう。活性エステル誘導体としてはN-ヒドロキシスクシ ンイミドエステルを用いることが好ましい。N-ヒドロキシスクシンイミドエステ ルのほかに、同様のp-ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、イミダゾリル またはN-ヒドロキシベンゾトリアゾリルエステルを使用することも可能である。 本発明の方法では、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを固相上で、好まし くは市販のペプチド合成機（例えば、Applied Biosystemsからの装置 A 431また は A 433）を使って、合成する。合成は公知の方法にしたがって、好ましくはア ミノ酸誘導体を用いてペプチドのカルボキシル末端から出発して、実施する。ア ミノ酸誘導体としては、結合に必要とされるアミノ末端基がフルオレニルメチル オキシカルボニル(Fmoc)基で誘導体化されているものを用いることが好ましい。 用いるアミノ酸の反応性側基は、ペプチド合成の完了後に容易に切断可能な保護 基を含む。その好適な例はトリフェニルメチル(Trt)、t-ブチルエーテル(tBu)、 t-ブチルエステル(0 tBu)、t-ブトキシカルボニル(Boc)または2,2,5,7,8-ペンタ - メチルクロマン-6- スルホニル(Pmc)のような保護基である。 標識を導入しようとするペプチド位置に配置されるリシン残基のアミノ側鎖、 または第一級アミノ側基を有する他のアミノ酸誘導体のアミノ側鎖は、方法(b) にしたがって金属キレートと共有結合させる。 ２０種類の天然アミノ酸に加えて、ペプチドはβ−アラニン、γ−アミノ酪酸 、ε−アミノカプロン酸、ノルロイシンまたはオルニチンのような人工アミノ酸 を含んでいてもよい。これらの人工アミノ酸を合成に用いるには、天然アミノ酸 と同様に保護された形にする。 本発明の方法(a)にしたがって金属キレート標識を導入するには、合成の完了 後に、好ましくは固相に結合したペプチドを、該ペプチドのＮ末端アミノ酸の遊 離の第一級アミノ基と反応する、それぞれの場合に望ましい活性型金属キレート と反応させる。遊離の第一級アミノ基につき1.5 〜4当量の活性エステルを用い るのが好ましい。続いて、必要であれば、反応生成物を固相および保護基から切 り離し、その後好ましくはＨＰＬＣで精製する。 ペプチドがフェニルアセチルのような第２保護基で誘導体化されているアミノ 基をまだ含むのであれば、これらの保護基を最後の工程で除去する。フェニルア セチル保護基は、例えば、有機溶媒を含む水性溶液中で固定化されたまたは可溶 性のペニシリンＧアミダーゼを用いて、室温で酵素的に除去することができる。 本発明の方法により製造されるペプチドが分子内ジスルフィド橋を含む場合は 、合成の完了後であって最後のアミノ酸のＮ末端Fmoc保護基を切断する前に、そ のペプチド配列を固相上で、例えばヘキサフルオロイソプロパノール／ジクロロ メタン中のヨウ素を用いて酸化し（Kamber and Hiskey in Gross E．and Meienh ofer J.，The Peptides，Academic Press，New York，1981，pp．145- 147）、その後にＮ末端Fmoc保護基を切断する。 ペプチドとしては、免疫学的に反応性のエピトープ領域、すなわち抗体結合性 のペプチド配列、とスペーサー領域を含むペプチドを合成することが好ましい。 その場合、有利には、少なくとも１つの金属キレート標識をスペーサー領域に結 合させる。標識がスペーサー領域にあるペプチドは、免疫学的試験において良好 な感度を有することが多い。 スペーサー領域は１〜１０アミノ酸の鎖長であることが好ましいが、電荷を有 しかつ／また水素橋を形成し得るので安定化および可溶化効果を有する。さらに 、それは金属キレート標識ペプチドへの数個の、例えば高分子の受容体の、結合 を立体的に促進し得る。スペーサー領域のアミノ酸はグリシン、β−アラニン、 γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸、リシンおよび構造式NH₂-[(CH₂)_nO]_x-C H₂-CH₂-COOH（式中、n は２または３であり、x は１〜１０である）を有する化 合物を含む群から選ぶことが好ましい。さらに、スペーサー領域は少なくともい くつかの人工アミノ酸誘導体を含むことが好ましい。有利には、スペーサー領域 をペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端に位置づける。 本発明の方法により、病原性の生物（例えば、細菌、ウイルス、原生動物）由 来の、または自己免疫抗原由来のエピトープ領域を含むペプチドを合成すること が好ましい。免疫学的に反応性のエピトープ領域はウイルス抗原、例えばHIV I 、HIV II、HIV サブタイプＯまたは肝炎Ｃ型ウイルス(HCV)のアミノ酸配列に由 来するものが好適である。 好ましくは、HIV I、HIV IIおよびHIV サブタイプＯのエピトープは領域gp32 、gp41およびgp120から選ばれる。HCVエピトープは非構造タンパク質領域 NS3、 NS4またはNS5のコア／Env領域から選ぶことが好適である。 特に、HIV I、HIV IIまたはHIV サブタイプＯアミノ酸配列のエピトープ領域 は次のアミノ酸配列： または少なくとも６アミノ酸の、好ましくは少なくとも８アミノ酸の鎖長を有す るその部分配列の群から選ぶことが好ましい。 アミノ酸配列Ｉ〜III はHIV I のgp120領域に由来するものであり、アミノ酸 配列IV-IXはHIV I のgp41領域に由来するものであり、そしてアミノ酸配列ＸはH IV IIのgp32領域に由来するものである。アミノ酸配列Ｉ〜Ｘは配列表の配列番 号１から配列番号１０にも示してある。配列Ｖ、VIIIおよびＸのそれぞれは２個 のシステインを含んでおり、ジスルフィド橋の形で存在することが好ましい。こ れらの配列は金属キレート標識を担持する上記のようなＮ末端および／またはＣ 末端スペーサーを含むことが有利である。エピトープ領域内に存在するリシン残 基が、場合によっては標識された形で存在してもよい。 HCVアミノ酸配列のエピトープ領域は次のアミノ酸配列： または少なくとも６アミノ酸の、好ましくは少なくとも８アミノ酸の鎖長を有す るその部分配列の群から選ぶことが好ましい。配列XIはNS5領域に由来するもの であり、配列XIIおよびXVIはコア領域に、配列XIII、XIVおよびXVはNS4領域に、 そして配列XVIIはHCVのNS3領域に由来するものである。アミノ酸配列XI〜 XVIIは配列表の配列番号１１から配列番号１７にも示してある。上記のエピトー プを含むペプチドは金属キレート標識を担持する追加のスペーサー領域を含むこ とが好ましい。 本発明の更なる主題は、最大鎖長が５０アミノ酸、好ましくは３０アミノ酸で あり、そのアミノ末端および／またはアミノ側基が少なくとも１つの発光金属キ レート好ましくは金属キレート活性エステル誘導体、と結合している金属キレー ト標識ペプチドである。発光金属キレートをルテニウムキレートとすることが好 ましい。 本発明によるペプチドは、例えばヒト血清由来の抗体と反応することができる 免疫学的に反応性のエピトープ領域と免疫学的に非反応性のスペーサー領域を含 み、該スペーサー領域が少なくとも１つの金属キレート標識を担持することが好 ましい。スペーサー領域はペプチドのアミノ末端に位置づけることが好適であり 、その鎖長は１〜１０アミノ酸である。エピトープ領域はHIV I またはHIV IIま たはその変異体、例えばそのサブタイプ（例：HIV サブタイプＯ）、のアミノ酸 配列に由来するものであることが好ましく、アミノ酸配列Ｉ〜XVIIのうちの一つ またはその部分配列である。 本発明はまた、液体試料中の特異的抗体の免疫学的測定方法における抗原とし ての金属キレート標識ペプチドの使用に関する。測定する抗体は細菌、ウイルス 、原生動物などの微生物による感染を顕示するものが好ましい。特に、ウイルス に対して特異的な抗体、例えばＨＩＶや肝炎ウイルスに対する抗体が測定される 。液体試料は好ましくは血清であり、特に好ましくはヒト血清である。さらに、 本発明による金属キレート標識ペプチドは架橋試験フォーマットでの免疫学的方 法において使用することが好適である。 本発明はまた、液体試料を、上記の金属キレート標識ペプチドからなる測定す べき抗体に特異的な標識第１抗原とインキュベートし、該ペプチドへの結合によ り該抗体を検出することを特徴とする、液体試料中の特異的抗体の免疫学的測定 方法に関する。第１抗原としては、ルテニウム、レニウム、イリジウムまたはオ スミウムキレートで標識したペプチドを用いることが好ましい。 本発明による免疫学的測定方法は、実際、公知のいずれの試験フォーマットで 行ってもよく、例えば１つの反応相を用いる均一系イムノアッセイまたは２以上 の反応相を用いる不均一系イムノアッセイで実施することができる。抗体の存在 が固相の存在下で検出される不均一系の試験フォーマットを用いることが好まし い。この試験フォーマットの一つの態様がいわゆる二重抗原架橋試験のフォーマ ットである。この場合には、液体試料を、固相の存在下で上記の第１抗原および 、測定すべき抗体に特異的で、(a)固相に結合しているか、または(b)固相に結合 可能な形態で存在する第２抗原とともにインキュベートする。液体試料中に含ま れる測定すべき抗体は、固相上のおよび／または液相中の標識を測定することで 検出される。好ましくは、第２抗原をビオチンで標識して、ストレプトアビジン またはアビジンを被覆した固相に結合可能とする。ビオチンで標識したペプチド を第２抗原として用いることが好適である。 試験手順は、好ましくは、液体試料を第１抗原および固相上の第２抗原と混合 して、第１抗原と抗体と固相結合第２抗原からなる標識された固定化複合体を形 成させることを含む。抗体検出用の他の試験フォーマットと比べて、この架橋試 験フォーマットは感度の向上（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥなど の全ての免疫グロブリンクラスを認識する）ならびに特異性の向上（すなわち、 非特異的反応が減少する）をもたらす。 固相結合ペプチドおよび金属キレート標識ペプチドを抗原として用いる二重抗 原架橋試験フォーマットの更なる利点は、高力価の測定抗体を含む試料の偽陰性 評価の危険性を、フック効果(Hook effect)の結果として、すなわちペプチドあ たりのマーカー基の数を（好ましくは２〜１０個のマーカー基に）増やすことに より、低減させることが可能であることである。金属キレートマーカー基の数を 増加させると、受容体による信号増幅の結果として、直接検出可能なマーカー基 を用いる試験法と比べて、フック感度が向上する。 発光金属キレート基は、好ましくは、発光化学種を電極の表面上に電気化学的 に発生させる電気化学的発光により検出される。発光は定性的および／または定 量的に検出することができる。発光アッセイを実施する例は EP-A-0 580 979、W O 90/05301、WO 90/11511 および WO 92/14138に見いだせる。これらの文献に開 示された発光アッセイ法およびその装置を参照されたい。電気化学的発光アッ セイで用いる固相は微粒子からなることが好ましく、特に固相上で第２抗原と相 互に作用する被覆を付与された磁性微粒子とすることが有利である。微粒子にス トレプトアビジンを被覆することが好ましい。 電気化学的発光の測定は、好ましくは金属錯体用の還元剤（例えば、アミン） の存在下で行う。脂肪族アミン、特に第一級、第二級および第三級アルキルアミ ン（アルキル基がそれぞれ１〜３個の炭素原子をもつ）が好適である。トリプロ ピルアミンが特に好適である。しかし、このアミンはアニリンのような芳香族ア ミンまたは複素環式アミンであってもよい。 さらに、非イオン性界面活性剤（例えば、エトキシル化フェノール）を増幅剤 として存在させてもよい。こうした物質は例えばトリトンＸ100 またはトリトン N-401 の名称で市販されている。 一方、発光金属キレート基は蛍光によっても検出でき、この場合は、金属キレ ートを適当な波長の光で励起して、発生した蛍光を測定する。蛍光アッセイを実 施する例は EP-A-0 178 450 および EP-A-0 255 534 に見いだせる。これらの文 献の開示内容を参照されたい。 本発明の更なる主題は、測定すべき抗体と反応する本発明による金属キレート 標識ペプチドを少なくとも１種含んでなる、特異的抗体の免疫学的測定用の試薬 である。この試薬を二重抗原架橋試験において使用するのであれば、それは、(a )金属キレート標識ペプチド、および(b)固相に結合しているかまたは固相に結合 できる形態で存在する、測定すべき抗体と反応する抗原を含むことが好ましい。 最後に、本発明は一般式(Ia)または(Ib)： 〔式中、 Ｒ¹は水素またはカチオン性基（例：アルカリ金属またはアンモニウムイオン ）であり、 Ｒ²は水素または固相ペプチド合成用のアミノ保護基であり、 Ｒ³はC₁-C₅アルキレン基であり、 Ｙは任意のアミノ酸の側鎖であり、そして ＭＸn は金属Ｍがｎ個の同一のまたは異なる配位子Ｘでキレート化されている 発光金属キレート基である〕 で表されるアミノ酸誘導体に関する。 一般式(Ia)のアミノ酸誘導体において、金属キレート基ＭＸn はリシンやオル ニチンのようなアミノ酸の第一級アミノ側基に結合している。一般式(Ib)のアミ ノ酸誘導体では、金属キレート基が任意のアミノ酸（例えば、保護基を有してい てもよい天然アミノ酸または人工アミノ酸）のα−アミノ基に結合している。一 般式(Ia)のアミノ酸誘導体はペプチド配列の内部または両末端部に導入すること ができる。一般式(Ib)のアミノ酸誘導体は、それらが残基Ｙ中に第一級アミノ基 を含まないという条件下で、ペプチド配列のＮ末端にのみ導入できる。 金属キレート基ＭＸn は好ましくは構造ＭＬ₁Ｌ₂Ｌ₃を有し、ここでＬ₁、Ｌ₂ 、Ｌ₃は同一でも異なっていてもよく、それぞれが少なくとも２つのＮ含有複素 環を有する配位子（例えば、ビピリジルまたはフェナントロリル）を表し、これ らの配位子の１つがアミノ酸のアミノ基にスペーサー基を介して結合していても よい。 本発明によるリシン−ルテニウムキレート(Fmoc-Lys(BPRu)-OH）の例を図１に 示してある。 本発明は下記の実施例、配列表および図面により更に説明される。 配列番号１はHIV I のgp120 領域からのエピトープのアミノ酸配列を示す。 配列番号２はHIV I のgp120領域からの更に別のエピトープのアミノ酸配列を示 す。 配列番号３はHIV I、サブタイプ０のgp120 領域からの更に別のエピトープのア ミノ酸配列を示す。 配列番号４はHIV I のgp41領域からのエピトープのアミノ酸配列を示す。 配列番号５はHIV I のgp41領域からの更に別のエピトープのアミノ酸配列を示す 。 配列番号６はHIV I のgp41領域からの更に別のエピトープのアミノ酸配列を示す 。 配列番号７はHIV I、サブタイプ０のgp41領域からのエピトープのアミノ酸配列 を示す。 配列番号８はHIV I、サブタイプ０のgp41領域からの更に別のエピトープのアミ ノ酸配列を示す。 配列番号９はHIV I、サブタイプ０のgp41領域からの更に別のエピトープのアミ ノ酸配列を示す。 配列番号10はHIV IIのgp32領域からのエピトープのアミノ酸配列を示す。 配列番号11はHCV のNS5 領域からのエピトープのアミノ酸配列を示す。 配列番号12はHCV のコア領域からのエピトープのアミノ酸配列を示す。 配列番号13はHCV のNS4 領域からのエピトープのアミノ酸配列を示す。 配列番号14はHCV のNS4 領域からの更に別のエピトープのアミノ酸配列を示す。 配列番号15はHCV のNS4 領域からの更に別のエピトープのアミノ酸配列を示す。 配列番号16はHCV のコア領域からの更に別のエピトープのアミノ酸配列を示し、 及び 配列番号17はHCV のNS3 領域からのエピトープのアミノ酸配列を示す。 図１はα−アミノ基が保護され、かつルテニウム（ビピリジル）₃に結合してい るリシン誘導体を示す。 実施例１ 金属キレート標識ペプチドの製造 金属キレート標識ペプチドを、例えば、Applied Biosystems A431 またはA433 からのバッチペプチド合成装置で、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc) 固相ペプチド合成により合成した。このために、それぞれ4.0 当量の表１に示さ れたアミノ酸誘導体を使用した。 別法(a)−固相合成の完結後の標識の導入−では、活性化BPRu-COOH をペプチ ドのＮ末端アミノ酸に結合した。リシン誘導体K1をスペーサー領域のために使用 し、またリシン誘導体K2をエピトープ領域のために使用した。 別法(b)に従って、金属キレート基を金属キレート結合アミノ酸誘導体の直接 のとり込みにより、例えば、その配列内で金属キレート活性エステル（例えば、 リシン誘導体K3（図１））でε−誘導体化されたリシン残基を介して、またはα −誘導体化されたアミノ酸残基をＮ末端で使用することにより、ペプチド配列に 導入する。 アミノ酸またはアミノ酸誘導体をＮ−メチルピロリドンに溶解した。ペプチド を0.4-0.7 mmol/g の充填材(JACS 95(1973)，1328)を用いて400-500mg の4-(2', 4'- ジメトキシフェニル-Fmoc-アミノメチル)-フェノキシ樹脂(Tetrahedron Let ters 28(1987)，2107)で合成した。結合反応を20分間にわたって、反応媒体とし てのジメチルホルムアミド中で、Fmoc- アミノ酸誘導体に対し４当量のジシクロ ヘキシルカルボジイミドおよび４当量のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用 いて行った。Fmoc基を、それぞれの合成工程の後にジメチルホルムアミド中20％ のピペリジンを使用して20分で開裂した。 システイン残基がペプチド配列中に存在する場合、合成の完結の直後にヘキサ フルオロイソプロパノール／ジクロロメタン中のヨウ素を使用して固相の酸化を 行う。 支持体からのペプチドの放出および酸に不安定な保護基の開裂を、室温で40分 間、トリフルオロ酢酸20ml、エタンジチオール0.5 ml、チオアニソール１ml、フ ェノール1.5gおよび水１mlを用いて行った。続いて、その反応溶液を冷却したジ イソプロピルエーテル300 mlと混合し、40分間、０℃に保ってペプチドを完全に 沈殿させた。沈殿を濾過し、ジイソプロピルエーテルで再度洗浄し、少量の50％ の酢酸に溶解し、凍結乾燥した。得られた粗物質を、適当な勾配（溶離剤Ａ：水 、0.1 ％のトリフルオロ酢酸、溶離剤Ｂ：アセトニトリル、0.1 ％のトリフルオ ロ酢酸）を使用して、delta-PAK RP C18マテリアル（カラム50 x 300 mm、100 Å、15μ）による調製用HPLCにより約120 分間で精製した。溶離した物質の同一 性をイオンスプレー質量分析法により確認した。 金属キレート標識を、別法(a)に従って適当な活性エステル誘導体を用いて、 支持体結合ペプチドの遊離Ｎ末端アミノ基に導入した。このために、Ｎ−ヒドロ キシベンゾトリアゾール／ジシクロヘキシルカルボジイミドで活性化されるとと もに、少量のDMSOに溶解された遊離第一級アミノ基当たり４当量のBPRu-COOHを 滴下して添加し、室温で攪拌した。その反応を分析用HPLCを用いてモニターした 。支持体からの開裂後に、生成物を調製用HPLCにより精製した。溶離した物質の 同一性をイオンスプレー質量分析法により調べた。 また、ペプチドを別法(a)および(b)の組み合わせ、即ち、配列内の金属キレー ト結合アミノ酸誘導体のとり込み、Ｎ末端Fmoc基の開裂および金属キレート活性 エステル誘導体と遊離Ｎ末端アミノ基との反応により製造した。 別法(b)による固相合成中の金属キレート結合アミノ酸誘導体の専らの直接的 とり込みにおいて、その後に金属キレート活性エステルを導入することは最早必 要ではなかった。 表２に示されたペプチド化合物をHIV I およびHIV IIの領域gp120、gp41およ びgp32から調製した。 下記の表３に示されたペプチドをHCV のNS5 領域、NS4 領域およびコア領域か ら合成した。 ビオチン標識ペプチドを、樹脂（ビオチン活性エステル）での誘導体化による Ｎ末端合成、またはビオチン−活性エステルε−誘導体化リシン残基(Fmoc-Lys( ビオチン)-OH)を使用した配列中での合成により製造した。 実施例２ 本発明のペプチド抗原を二重抗原架橋試験において組換えポリペプチド抗原と 比較した。本発明の実施例では、ルテニル化ペプチド抗原gp41/2（表２）を同配 列のビオチニル化ペプチド抗原と組み合わせて試験した。比較例では、ルテニル 化ポリペプチド抗原rec.gp41(Chang ら，Science 228(1985)，93-96)を同配列の ビオチニル化ポリペプチド抗原と組み合わせて試験した。 この試験の結果により、陰性サンプルと陽性サンプルとの識別が組換えポリペ プチド抗原では殆ど可能ではないが、ペプチド抗原が非常に良好な識別を可能に することが示された。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年１０月７日 【補正内容】 18．最大鎖長が５０アミノ酸であり、アミノ末端および／またはアミノ側基の特 定的に選択した位置で少なくとも１つの発光金属キレートに結合している金属キ レート標識ペプチド。 25．請求項１〜17のいずれか１つに記載の方法により製造された金属キレート標 識ペプチドまたは請求項18〜24のいずれか１つに記載のペプチドであって、特定 的に選択した位置で標識されている該ペプチドの、液体試料中の特異的抗体の免 疫学的測定方法における抗原としての使用。 27．液体試料を、請求項１〜17のいずれか１つに記載の方法により製造された金 属キレート標識ペプチドまたは請求項18〜24のいずれか１つに記載のペプチドで あって、特定的に選択した位置で標識されている該ペプチドからなる、測定すべ き抗体に特異的な標識第１抗原とインキュベートし、該ペプチドへの結合により 該抗体を検出することを特徴とする、液体試料中の特異的抗体の免疫学的測定方 法。 33．請求項１〜17のいずれか１つに記載の方法により製造された、測定すべき抗 体と反応する金属キレート標識ペプチド、または請求項18〜24のいずれか１つに 記載の、測定すべき抗体と反応する金属キレート標識ペプチドであって、特定的 に選択した位置で標識されている該ペプチドを少なくとも１種含んでなる、特異 的抗体の免疫学的測定用の試薬。 【手続補正書】 【提出日】１９９７年１月２７日 【補正内容】 請求の範囲 １．所望のアミノ酸配列を有するペプチドを固相上で合成し、その際、 (a)ペプチドの合成後に、活性化した発光金属キレートを該ペプチドのＮ末 端の第一級アミノ基に結合させる、および／または (b)ペプチドの合成中に、発光金属キレートマーカー基に共有結合させたア ミノ酸誘導体を該ペプチドの少なくとも１つの位置に導入する、 ことを特徴とする金属キレート標識ペプチドの製造方法。 ２．発光金属キレートがルテニウム、レニウム、イリジウムおよびオスミウムキ レートよりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。 ３．金属キレートの配位子が芳香族複素環式多座配位子から選ばれる、請求項１ または２に記載の方法。 ４．免疫学的に反応性のエピトープ領域およびスペーサー領域を含むペプチドを 合成し、該スペーサー領域に少なくとも１つの金属キレート標識を結合させる、 請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。 ５．免疫学的に反応性のウイルスエピトープ領域を含むペプチドを合成する、請 求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。 ６．エピトープ領域が次のHIV I およびHIV IIアミノ酸配列： または少なくとも６アミノ酸の鎖長を有するその部分配列の群から選ばれる、 請求項５に記載の方法。 ７．エピトープ領域が次のHCV アミノ酸配列： または少なくとも６アミノ酸の鎖長を有するその部分配列の群から選ばれる、 請求項５に記載の方法。 ８．最大鎖長が５０アミノ酸であるペプチドであって、そのアミノ末端および／ またはアミノ側基で少なくとも１つの発光金属キレートに特定的に選択した位置 で結合している、金属キレート標識ペプチド。 ９．エピトープ領域が次のHIV I およびHIV IIアミノ酸配列： または少なくとも６アミノ酸の鎖長を有するその部分配列の群から選ばれる、 請求項８に記載のペプチド。 10．エピトープ領域が次のHCV アミノ酸配列： または少なくとも６アミノ酸の鎖長を有するその部分配列の群から選ばれる、 請求項８に記載のペプチド。 11．請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法により製造された金属キレート標 識ペプチドまたは請求項８〜10のいずれか１つに記載のペプチドであって、特定 的に選択した位置で標識されている該ペプチドの、液体試料中の特異的抗体の免 疫学的測定方法における抗原としての使用。 12．液体試料を、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法により製造された金 属キレート標識ペプチドまたは請求項８〜10のいずれか１つに記載のペプチドで あって、特定的に選択した位置で標識されている該ペプチドからなる、測定すべ き抗体に特異的な標識第１抗原とインキュベートし、該ペプチドへの結合により 該抗体を検出することを特徴とする、液体試料中の特異的抗体の免疫学的測定方 法。 13．液体試料を、固相の存在下で前記の第１抗原および測定すべき抗体に特異的 で、(a)固相に結合しているかまたは(b)固相に結合可能な形態で存在する第２抗 原とともにインキュベートし、そして固相上のおよび／または液相中の標識を測 定することにより該抗体を検出する、請求項12に記載の方法。 14．請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法により製造された、測定すべき抗 体と反応する金属キレート標識ペプチド、または請求項８〜10のいずれか１つに 記載の測定すべき抗体と反応する金属キレート標識ペプチドであって、特定的に 選択した位置で標識されている該ペプチドを少なくとも１種含んでなる、特異的 抗体の免疫学的測定用の試薬。 15．(a)測定すべき抗体と反応する金属キレート標識ペプチド、および (b)固相に結合しているかまたは固相に結合できる形態で存在する、測定す べき抗体と反応する抗原、 を含む、請求項14に記載の試薬。 16．一般式(Ia)または(Ib)： 〔式中、 Ｒ¹は水素またはカチオン性基であり、 Ｒ²は水素または固相ペプチド合成用のアミノ保護基であり、 Ｒ³はC₁-C₅アルキレン基であり、 Ｙは任意のアミノ酸の側鎖であり、そして ＭＸn は金属Ｍがｎ個の同一のまたは異なる配位子Ｘでキレート化されてい る発光金属キレート基である〕 で表されるアミノ酸誘導体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 1/13 ＺＮＡ 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 1/13 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/569 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＦＩ，Ｊ Ｐ，ＫＲ，ＮＯ，ＮＺ，ＵＳ (72)発明者 ヘス，エヴァ ドイツ連邦共和国 ディー−82319 スタ ムバーグ アム ミュールバーグ １エイ 番地

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．所望のアミノ酸配列を有するペプチドを固相上で合成し、その際、 (a)ペプチドの合成後に、活性化した発光金属キレートを該ペプチドのＮ末 端の第一級アミノ基に結合させる、および／または (b)ペプチドの合成中に、発光金属キレートマーカー基に共有結合させたア ミノ酸誘導体を該ペプチドの少なくとも１つの位置に導入する、 ことを特徴とする金属キレート標識ペプチドの製造方法。 ２．発光金属キレートがルテニウム、レニウム、イリジウムおよびオスミウムキ レートよりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。 ３．発光金属キレートがルテニウムキレートから選ばれる、請求項２に記載の方 法。 ４．金属キレートの配位子が芳香族複素環式多座配位子から選ばれる、請求項１ 〜３のいずれかに記載の方法。 ５．配位子がビピリジル、ビピラジル、ターピリジルおよびフェナントロリル配 位子から選ばれる、請求項４に記載の方法。 ６．発光金属キレートがルテニウム（ビピリジル）₃キレートから選ばれる、請 求項５に記載の方法。 ７．方法(a)において、ペプチドを固相から切り離す前で、かつペプチド合成に 用いたアミノ酸誘導体の反応性側基上の保護基を除去する前に、活性型金属キレ ートを結合させる、請求項１に記載の方法。 ８．方法(b)では、金属キレートマーカー基がアミノ酸誘導体の第一級アミノ基 に結合されている、請求項１に記載の方法。 ９．免疫学的に反応性のエピトープ領域およびスペーサー領域を含むペプチドを 合成し、該スペーサー領域に少なくとも１つの金属キレート標識を結合させる、 請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。 10．スペーサー領域の鎖長が１〜１０アミノ酸である、請求項９に記載の方法。 11．スペーサー領域がペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端に位 置づけられる、請求項９または10に記載の方法。 12．スペーサー領域が電荷を有しかつ／または水素橋を形成できるアミノ酸を含 む、請求項９〜11のいずれか１つに記載の方法。 13．スペーサー領域のアミノ酸がグリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、ε −アミノカプロン酸、リシン、および構造式： NH₂−[(CH₂)_n-O]_x-CH₂-CH₂-COOH （式中、n は２または３であり、x は１〜10である） を有する化合物よりなる群から選ばれる、請求項９〜12のいずれか１つに記載の 方法。 14．免疫学的に反応性のウイルスエピトープ領域を含むペプチドを合成する、請 求項１〜13のいずれか１つに記載の方法。 15．HIV I、HIV IIまたはHCV のアミノ酸配列に由来するエピトープ領域を含む ペプチドを合成する、請求項14に記載の方法。 16．エピトープ領域が次のHIV I およびHIV IIアミノ酸配列： または少なくとも６アミノ酸の鎖長を有するその部分配列の群から選ばれる、 請求項15に記載の方法。 17．エピトープ領域が次のHCV アミノ酸配列： または少なくとも６アミノ酸の鎖長を有するその部分配列の群から選ばれる、 請求項15に記載の方法。 18．最大鎖長が５０アミノ酸であり、アミノ末端および／またはアミノ側基で少 なくとも１つの発光金属キレートに結合している金属キレート標識ペプチド。 19．発光金属キレートがルテニウムキレートである、請求項18に記載のペプチド 。 20．前記のペプチドが免疫学的に反応性のエピトープ領域およびスペーサー領域 を含み、該スペーサー領域が少なくとも１つの金属キレート標識を担持している 、請求項18または19に記載のペプチド。 21．スペーサー領域がペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端に存 在する、請求項20に記載のペプチド。 22．エピトープ領域がHIV I、HIV IIまたはHCV のアミノ酸配列に由来するもの である、請求項18〜21のいずれか１つに記載のペプチド。 23．エピトープ領域が次のHIV I およびHIV IIアミノ酸配列： または少なくとも６アミノ酸の鎖長を有するその部分配列の群から選ばれる、 請求項22に記載のペプチド。 24．エピトープ領域が次のHCV アミノ酸配列： または少なくとも６アミノ酸の鎖長を有するその部分配列の群から選ばれる、 請求項22に記載のペプチド。 25．請求項１〜17のいずれか１つに記載の方法により製造された金属キレート標 識ペプチドの、または請求項18〜24のいずれか１つに記載のペプチドの、液体試 料中の特異的抗体の免疫学的測定方法における抗原としての使用。 26．架橋試験フォーマットでの免疫学的方法における請求項25に記載の使用。 27．液体試料を、請求項１〜17のいずれか１つに記載の方法により製造された金 属キレート標識ペプチドまたは請求項18〜24のいずれか１つに記載のペプチドか らなる、測定すべき抗体に特異的な標識第１抗原とインキュベートし、該ペプチ ドへの結合により該抗体を検出することを特徴とする、液体試料中の特異的抗体 の免疫学的測定方法。 28．第１抗原としてルテニウム、レニウム、イリジウムまたはオスミウムキレー トで標識したペプチドを用いる、請求項27に記載の方法。 29．液体試料を、固相の存在下で前記の第１抗原および測定すべき抗体に特異的 で、(a)固相に結合しているかまたは(b)固相に結合可能な形態で存在する第２抗 原とともにインキュベートし、そして固相上のおよび／または液相中の標識を測 定することにより該抗体を検出する、請求項27または28に記載の方法。 30．ビオチンで標識した抗原を第２抗原として使用し、かつストレプトアビジン またはアビジンを被覆した固相を使用する、請求項29に記載の方法。 31．ビオチンで標識したペプチドを第２抗原として使用する、請求項30に記載の 方法。 32．磁性粒子からなる固相を使用する、請求項29〜31のいずれか１つに記載の方 法。 33．請求項１〜17のいずれか１つに記載の方法により製造された、測定すべき抗 体と反応する金属キレート標識ペプチド、または請求項18〜24のいずれか１つに 記載の測定すべき抗体と反応する金属キレート標識ペプチドを少なくとも１種含 んでなる、特異的抗体の免疫学的測定用の試薬。 34．(a)測定すべき抗体と反応する金属キレート標識ペプチド、および (b)固相に結合しているかまたは固相に結合できる形態で存在する、測定す べき抗体と反応する抗原、 を含む、請求項33に記載の試薬。 35．一般式(Ia)または(Ib)： 〔式中、 Ｒ¹は水素またはカチオン性基であり、 Ｒ²は水素または固相ペプチド合成用のアミノ保護基であり、 Ｒ³はC₁-C₅アルキレン基であり、 Ｙは任意のアミノ酸の側鎖であり、そして ＭＸn は金属Ｍがｎ個の同一のまたは異なる配位子Ｘでキレート化されてい る発光金属キレート基である〕 で表されるアミノ酸誘導体。