SU1612264A1

SU1612264A1 - Способ твердофазного иммуноферментного определени антител к вирусу иммунодефицита человека и меченный биотином синтетический пептид дл его осуществлени

Info

Publication number: SU1612264A1
Application number: SU894653296A
Authority: SU
Inventors: Вадим Сергеевич Иванов; Зоя Константиновна Суворова; Леонид Дмитриевич Чикин; Александр Тимофеевич Кожич
Original assignee: Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина; Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии
Priority date: 1989-03-01
Filing date: 1989-03-01
Publication date: 1990-12-07

Abstract

Изобретение относитс к вирусологии и иммунологии, а точнее к способам определени антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) с помощью твердофазного иммуноферментного метода анализа с использованием синтетического пептида в качестве антигена и синтеза реагентов дл этого. Целью изобретени вл етс повышение чувствительности способа определени антител к ВИЧ без уменьшени специфичности. Дл этого используют в качестве антигена новый синтезированный пептид формулы биотин - GLY GLY TRP GLY CYS SER GLY LYS LEN ILE CYS THR THR ALA VAL PRO TRP-ASN-он, который нанос т на предварительно сорбированный белок авидин или стрептавидин. 2 с.п. ф-лы, 4 табл.

Description

. Изобретение относитс к вирусологии и иммунологии, точнее к способам определени антител к вирусу иммунодефицита чело- века с помощью твердофазного иммуноферментного метода анализа с использованием синтетического пептида в качестве антигена и синтеза реагентов дл этого.

Целью изобретени вл етс повышение чувствительности способа определени антител и ВИЧ без уменьшени специфичности .

Пример 1. Синтез пептида формулы биотин-GlyGlyTrpGlyCysSecGlyLysLeulleCys ThrThrAlaValProTrpAsn- ОН (1) осуществл ют твердофазным методом пептидного синтеза на синтезаторе Beckmam-990. США ступенчатым наращиванием пептидной цепи. В качестве носител используют сополимер

полистирола с 1% дивинилбензола производства BiO-Rad Laboratories. США.

Дл защиты боковых функциональных групп используют следующие г|эуппировки: бензильную (Вг1) - дл гидроксильных групп серина и треонина. 4-метилбензильную (MeBzl) - дл сульфгидрильной группы цис- теина, 2-хлорбензилоксикарбонильную (CIZ) -дл е-аминогруппы лизина. В качестве временной защиты а-аминогрупп аминокислот- используют трет-бутилоксикарбонильную (Вое) группу.

Аминометилполимеру (1,8 г. 1 ммоль) дают набухнуть в 30 мл в течение 30 мин. затем присоедин ют Boc-Asn- ОСН2СбН4СН2СООН (1,1 г, 2,9 моль) с помощью ,Ы-дициклогексилкарбодиимида СДЦГК) (0.7 г, 2.9 ммоль) в 20 мл СНС1з в течение2 ч. После промывки СНС1зЗх20 мл, аминоацилполимер обрабатывают 20 мл

ю ю

ON 1

смеси диизопропилэтиламин (ДИПЭА): уксусный ангидрид 2:1 в течение 30 мин дл блокировани непрореагировавших аминогрупп полимера. Количество аминогрупп согласно нингидриновому тесту 0,95 ммоль (95%).

Все аминокислоты присоедин ют по следующей общей методике в виде оксибен- зотриазоловых эфиров: 2 ммоль аминокислоты и 2 ммоль оксибензотриазола раствор ют в 10 мл СНС1з, охлаждают до 0°С и добавл ют раствор 2 ммоль ДЦГК в 10 мл СНС1з, после перемешивани втечение . 10 мин при к смеси добавл ют 10 мл ДМФА и приливают ее к пептидилполиме- ру, перемешивают 1 ч при 30°С; затем промывают пептидилполимер ДМФА 3x20 мл, СНС1зЗх20мл.

Молекулу биотина присоедин ют по следующей методике: пептидилполимер промывают диметилсульфоксидом (ДМСО) ЗХ 20 мл, 3 ммоль биотина и 3 ммоль оксибензотриазола раствор ют в 10 мл ДМСО и добавл ют 3 ммоль ДЦГК, после перемешивани при комнатной температуре в течение 10 мин смесь добавл ют к пептидилполимеру, перемешивают 1,5 ч при 30°С и промывают ДМСО 3x20 мл, CHCfa Зх 20 мл.

Дл удалени временной защитной группы Вое используют смесь трифторук- сусна кислота СГФУ):СНС1з 1:1, содержащую 0,2% индола дл предотвращени побочных реакций по триптофановому остатку .

Стандартна методика удале1 и Вое группы: промывка СНС1зЗх20 мл 5 мин, обработка смесью ТФУ:СНС|з (0,2% индола) 1:1 1x30 мл 20 мин, промывка СНС1зЗх20 мл 5 мин, нейтрализаци 7%-ным раствором в ДМФА 1x30 мл 10 мин, промывка ДМФА 3x20 мл 5 мин.

После сборки пептида получают 4,8 г пептидилполимера формулы биотин- GiyGlyTrpGlyCys(MeBre}-Ser(Bre)Gly-Lys(Clz) -Leu - lle-Cys(MeBrehThr(Bzl)-Thr(Bzl)Ala-Val- Рго-Тгр-А8п-ОСН2СбН4СН2СО-полимер.

Деблокирование пептида с полимера с одновременным сн тием всех защитных групп осуществл ют следующим образом, 1,2 г пептидилполимера помещают в реакционный сосуд прибора дл работы с фторо- водородом Sakaklbara, Япони , добавл ют 0,5 г п-крезола и 0,5 г п-тиокре- зола, после охлаждени сосуда жидким азотом и вакуумировани с помощью водоструйного насоса в сосуд перегон ют 10 мл безводного жидкого HF, Затем довод т температуру до 0°С и перемешивают пептидилполимер при этой температуре в

течение 1 ч, отсасывают HF на водоструй- ном насосе в течение 20 мин, промывают полимер на фильтре диэтиловым эфиром, содержащим 1 % меркаптоэтанола, дл 5 предотвращени окислени цистеинов. Пептид экстрагируют 20%-ной уксусной кислотой, содержащей 1 % меркаптоэтанола . После лиофилизации получают 328 мг неочищенного продукта.

0 Дл восстановлени сульфгидрильных групп цистеинов 60 мг пептида после деблокировани суспендируют в 2 мл смеси ДМФА:Н20 (рН 9) 1:1 и добавл ют 60 мг дитиотреитола, продувают аргоном и переме- 5 шивают при комнатной температуре сутки.

Дл выделени и очистки синтезированного пептида используют препаративную высокоэффективную жидкостную хроматографию на обращенной фазе на хроматогра- 0 фе Gllson, Франци .

Дл этого к суспензии пептида после восстановлени добавл ют 2 млТФУдл растворени осадка и раствор нанос т на колонку Uitrasphere Octyl 10x250 мм (Ди Pont, 5 США) и элюируют в системе 0,5% ТФУ в воде - СНзОН при скорости 4 мл/мин и изменении градиента СНзОН от 20 до 50% за 3 мин и от 50 до 70% за 15 мин. Собирают пик, выход щий на 17 мин при детекции на 280 нм. После лио- 0 филизации получают 7,6 мг чистого пептида.

Чистоту и индивидуальность пептида подтверждают аминокислотным анализом (табл,1), масс-спектрометрически (табл. № 2) и аналитической ВЭЖХ в услови х выделени пеп- 5 тида на колонке Ultra-Sphere Octyl 4,6x250 мм (ДиРот, США), врем выхода 17,2 мин. При этом, кроме предлагаемого пептида (1), используют другие синтетические пептиды из последовательности белка др41 вируса ВИЧ-1 формул 0608

HaN-TrpGlyCysSerGlyLysLeulleCysThr

623 ThrAiaValProTrpAsn-OH(II)

607 5 H2N-neTrpGlyCysSerGlyLysLeuneCysThr

625 ThrAlaValProTrpAsnAlaSer-OH(III)

605

H2N-LeuGlylleTrpGlyCysSerGlyLysLeu le 0 616

Cys-OH(IV)

591. H2N-ArglleLeuAIaValGluArgTyrLeuLysAsp

611

5 GtuGlnLeuLeuGlylleTrpGlyCysSer-OH (V) Пример 2. Анализ способности пептидов формул (I) - (V) селективно св зывать антитела против вируса иммунодефицита человека I типа методом твердофазного им- муноферментного анализа.

Дл анализа используют 105 сывороток, содержащих антитела к ВИЧ-1. от больных СПИД, СПИД-ассоциированным комплекс сом и бессимг томных вирусоносителей, 48 сывороток, не содержащих антител к ВИЧ- 1, но дающих положительную реакцию в иммуноферментной тест-системе Антиген , СССР, 100 сывороток от здоровых доноров крови. Наличие антител в сыворотках крови подтверждаетс в нескольких коммерческих тест-системах.

Опыт провод т по следующей схеме. Дл пептидов II, III, IV, V пептид собирают на планшет дл ИфА (типа Со Star, США) из раствора 0,1 М фосфатного буфера рН 8,0 в концентрации 2 мкг/мл в течение ночи при +4 С. После этого лунки промывают четыре раза 0,01 М фосфатным буфером рН 7,2, содержащим 0,9% хлористого натри и 0,05% Твин-20 (ФСБ-Т). Дл пептида I на планшет дл ИФА (типа Со star, США) сорбируют стрептавидин из 0,1 М фосфатного буфера рН 8,0 в концентрации 2 мкг/мл в течение ночи при +4°С. После зтого лунки промывают четыре раза 0,01 М фосфатным буфером рН 7,2, содержащим 0,9% хлористого натри и 0,05% Твин-20 (ФСБ-Т). Дл рпептида 1 на планшет дл ИФА (типа Со star, США) сорбируют стрептавидин из 0,1 М фосфатного буфера рН 8,0 в концентрации 2 мкг/MJfi в течение ночи при . После этого лунки промывают четыре раза ФСБ-Т. Затем в лунки планшета внос т пептид I в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2, содержащем 4% хлористого натри , 2% бычьего сывороточного альбумина. 0,1% Твин-20 (ФСБ-Т-А) в концентрации 0.2 мкг/мл и инкубируют 30 мин при 37°С. После этого лунки промывают четыре раза.

Далее в лунки подготовленных планшетов внос т образцы сывороток крови, разведенных 1:100 в ФСБ-Т-А. в объеме 100 мкл и инкубируют 30 мин при 37 С. Затем лунки четырехкратно промывают ФСБ-Т. В отмытые лунки внос т по 100 мкл коньюгата протеина А золотИ Стого стафилококка с пероксидазой хрена в ФСБ-T-F в рабочем разведении. Планшет инкубируют 30 мин при 37оС. Затем лунки промывают четьфе раза ФСБ-Т. В лукки планшета внос т по 100 мкл субстрата: 0.04%-ный растворорто- фенилендиамина в 0,1 М цитратном буфере рН 5,0, содержащем 0,05% Н202 и инкубируют 15 мин при комнатной температуре в темном месте. Ферментативную реакцию останавливают добавление 2 н. раствора серной кислоты.

Величину оптической плотности измер ют при 492 нм на спектрофотометре Р

700 фирмы Dynatec, ФРГ. Величину контрольного уровн определ ют путем прибавлени 0,250 к среднему значению оптической плотности контрольной сыво- 5 ротки, не содержащей антител к ВИЧ-1,

Результаты опыта(табл. 3 и 4) показывают , что предлагаемый пептид I вы вл ет все 105 ВИЧ-1-положительных сывороток (чувствительность 100%) и не вы вл ет ни одной 10 ложноположительной сыворотки и сыворотки здоровых доноров, что говорит о высокой специфичности пептида I.

Среднее значение ОП492 здоровых доноров дл пептидов I-V соответственно: 15 0,048; 0,050; 0,049; 0,047; 0,051; величина контрольного уровн : 0,298; 0,300; 0,299; 0,297; 0,301; процент узнавани (чувствительность ): 105/105- 100%;74/105-70,5%; 74/105-70,5;57/105-54,3%,46/105-43,8%. 20 В таблице 3 приведены средние значени оптической плотности (ОП492) по трем повторным опытам.

Результаты определени специфично сти пептида I приведены в табл.4. 25 Таким образом, предлагаемое изобретение позвол ет повысить чувствительность способа определени антител к ВИЧ,в10 раз уменьшить количество пептидного антигена в опыте определени антител к ВИЧ мето- 30 дом ТФИФА. Предлагаемый способ позвол ет определ ть антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 при использовании соответствующих пептидных антигенов.

Claims

Предлагаемый способ и пептид I можно 35 использовать в исследовани х развити гуморального ответа на внедрение вируса ВИЧ и в цел х серодиагностики СПИД Формула изобретени 1. Способ твердофазного иммунофер- 0 ментного определени антител к вирусу им- мунодефицита человека, включающий взаимодействие антигена, представл ющего собой синтетический пептид, с антитела- м,и тестируемой сыворотки крови и 5 последующую регистрацию результатов указанного взаимодействи , о т л и ч а ю- щ и и с тем, что, с целью повышени чувствительности способа, в качестве пептидов используют меченный биотином син- 0 тетическийпептидформулы

GlyGlyTrpGlyCysSerGlyZysZeuTleCysThrThr AlaValProTrpAsn-OH, который нанос т на. белок авидин или стрептавидин.
2. Меченный биотином синтетиче- 5 ский пептид формулы биотин- GlyGlyTrpGlyCysSerGlyLysLeupeCysThrThrAla /alProTrpAsn-OH дл определени антител к вирусу иммунодефицита человека.

Та б,л и ца2

Таблица 3

Продолжение табл.З

Продолжение табл. 3