RU1825424C - Способ обнаружени антител к ВИЧ-2 - Google Patents

Abstract

Использование: вирусологи . Сущность изобретени : получают антигенный пептид формулы X-Asp-Gln-Ala-Arg-Leu-Asn-Ser- Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg- Gln-Val-Cys-Hls- Thr-Thr-Va.l-Pro-Trp-Val-Asn-Y-Z, соответствующий области глюкопротеида gp41, кодированной геном оболочки ВИЧ-2. Пептид  вл етс  иммунологически реакци- онноспособным со специфическими антителами ВИЧ-2 и используетс  дл  обнаружени  заражени  ВИЧ-2 или его воздействи  и в композици х дл  стимулировани  получени  антител против ВИЧ-2 у животных и человека. 1 табл.

Description

Ё

Изобретение относитс  к синтетическому пептидному- антигену, последовательность которого соответствует фрагменту иммунологически важного протеина вируса ВИЧ-2. Этот пептид полезен как диагностик дл  определени  присутстви  антител к вирусу ВИЧ-2. Этот пептид может быть также полезен как иммуноген в композици х, служащих дл  определени  выработки антител против ВИЧ-2 у животных, включа  человека . Синдром приобретенного иммунодефицита /СПИД/  вл етс  самой важной проблемой всемирного здравоохранени . Этиологический агент СПИДа назвали ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), название , которое относитс  к группе очень близких вирусов, которые раньше называли HTLV - III, LAV и ARC (теперь общее название ВИЧ-1).

Относ щиес  к СПИДу комплексы из Северной Америки, Западной Европы и Центральной Африки обычно имеют одинаковые биологические свойства и антигенно перекрестно-реагирующие протеины. Однако генетические исследовани  показали различи  в нуклеотидной последовательности геномов изол тов североамериканского и африканского ВИЧ. Кроме того, описаны небольшие различи  в нуклеотидных последовательност х в изол тах различных ВИЧ из Америки.

Недавно выделены несколько вирусов, генетически и структурно относ щихс  к ВИЧ. Эти вирусы, которые генетически и иммунологически напоминают ВИЧ. выделили из макак резус /Масаса mucatta/. которые болели СПИДом, подобным заболеванию здоровых диких африканских зеленых мартышек /Cercoplthecus sp./. Ви00

ю ел ю

Јь

со

русы, которые раньше назвали как STVV- IIIAGH изол т африканских зеленых мартышек и STW-IIIMAC /изол т макаки/, теперь известны как ВИО /вирус иммунодефицита обезь ны/.

Новый вирус человека, названный HTLV-IV, выделили у кажущихс  здоровыми людей в Западной Африке. Этот вирус, который вырабатывает в инфицированных клетках частицы типа ретровируса, имеет характеристики роста, основные вирусные протеины, аналогичные этим параметрам у HTLV-III/LAV и STLV. Серологические данные показывают, что HTLV-IV имеет больше сходства с STLV-IIIACM, чем с прототипом HTLV-III/LAV, выделенным из больных в Европе и США.

Африканские больные.

Несмотр  на то, что у пациентов наблюдаютс  классические симптомы СПИДа, в их сыворотке нельз  обнаружить заметные титры антител к известным антигенам ВИЧ. Однако ретровирус, первоначально названный LAV-2 и структурно и биологически относ щийс  к ВИЧ, выделили у пациентов в Западной Африке. Западноафриканский вирус , который в насто щее врем  выделен у р да больных СПИДом, АРС и не имеющих симптомов какого-либо заболевани , теперь известен как ВИЧ-2 дл  того, чтобы отличить его от ВИЧ /теперь ВИЧ-1 /, ранее индентифицированного как этиологический агент СПИДа в Европе. Сеперной Америке и Центральной Америке.

Также как HTLV-IV ВИЧ-2 ближе к ВИО. чем к ВИЧ-1. Однако ВИЧ-2 и HTLV-IV не  вл ютс  одним и тем же вирусом, поскольку ВИЧ-2 убивает Т-хелперы человека, зараженные in vitro, a HTLV-IV - нет.

Полна  нуклеотидна  последовательность ВИЧ-2, котора  была недавно опубликована , показывает гомологию генетической последовательности с ВИЧ-1 только42%. Значительные различи  имеютс  в большинстве вирусных белков, но наиболее выражены в глюкопротеидах, кодированных генами оболочки ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Фактически, по-видимому, глюкоп- ротеиды оболочки ВИЧ-2 более тесно св заны с глюкопротеидами ВИО, чем с ВИЧ-1.

Исследование отсутстви  серологической перекрестной реактивности между ВИЧ-1 и ВИЧ-2 имеет очень большое значение при разработке диагностических тестов на заражение ВИЧ-2 и вакцин против ВИЧ- 2. Исследовани  показали, что больные, зараженные ВИЧ-2. не вы вл ютс  с помощь тррологических тестов, определ 0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

ющих ВИЧ-1. Любые перекрестные реакции , которые наблюдали между этими двум  вирусами, обычно осуществл ютс  за счет антител, которые вступают в реакцию с общими эпитопами на основных протеинах  дра , Р25 и Р26. кодированных геном gag этих двух вирусов. Антитела к глюкопротеидам вирусной оболочки Р120 и Р41 и их предшественнику Р160 не вступают в перекрестную реакцию с глюкопротеидами оболочки ВИЧ- 2.

Имеющиес  в насто щее врем  тесты дл  обнаружени  ВИЧ-1, которые, в основном , основаны на обнаружении антител к глюкопротеидам ВИЧ-1, например др160, др120 и др41 и их част м, нельз  использовать дл  обнаружени  антител к ВИЧ-2 в пробах дл  целей диагноза и скрининга. Таким образом, специфичные антигены ВИЧ-2 должны включатьс  с антигенами ВИЧ-1 в реагенты дл  эффективного диагностического и терапевтического применени .

Разработанные дл  обнаружени  заражени  ВИЧ-2 способы в общем случае измер ют воздействие на вирус обнаружением и количественной оценкой антител к антигенам ВИЧ-2 в крови, сыворотке и полученных из крови продуктах. Такие тесты можно использовать дл  диагностики СПИДа и АРС /СПИД-св занный комплекс/ и дл  скрининга крови и препаратов крови дл  предыдущего воздействи  вируса ВИЧ-2.

Существующие попытки диагностировать заражение ВИЧ-2 и фильтровать кровь дл  воздействи  ВИЧ-2 включают методы иммунной пробы, св занной с ферментом /ELISA/. предназначенные дл  определени  присутстви  антител к иммуногенным компонентам ВИЧ-2 в контрольной пробе. Другие способы могут использовать методы с фильтровальной бумагой Вестерна, предназначенные дл  определени  специфических антител ВИЧ-2 в контрольных пробах. В общем случае, можно применить почти все известные иммунопробы, такие как ра- диоиммунопробы. использу  специальные реагенты дл  обнаружени  ВИЧ-2 и антител к нему.

Источники антигенов дл  этих испытаний могут включать Inter alia протеины ВИЧ- 1, полученные из линии Т-клеток, зараженных ВИЧ-2, и антигены, полученные методом рекомбинантной ДНК. Однако использование антигенов, полученных из этих источников, имеет значительные недостатки .

Получение самого ВИЧ-2 в непрерывных лини х клеток должно осуществл тьс 

в лаборатори х повышенного риска /загр знение РЗ/ из-за опасности дл  исследователей , которые могут подвергнутьс  воздействию этого вируса; кроме того, поскольку сообщаетс  о ложных положительных и отрицательных результатах при тестах ELISA при использовании антигенов ВИЧ-1 целого вируса, полученных из линий клеток, веро тно, такие недостоверные результаты будут получатьс  с полученными с клетки ВИЧ-2 антигенами. Анализ п тен Вестерна дл  обнаружени  ВИЧ-2 с применением электрофильтруемых целых вирусных антигенов, может обеспечить большую специфичность , но  вл етс  более трудоемким и длительным,чем тесты ELISA. Более того, поскольку вырабатывающие ВИЧ-2 клетки имеют человеческое происхождение, препарат вирусного антигена, полученного из этих линий клеток, если не подвергаетс  очень тщательной очистке, может загр зн тьс  обычными клеточными антигенами, такими как антигены , что может вызвать ложные положительные реакции в тесте ELISA.

Исчерпывающа  очистка вирусных антигенов из линий клеток может также разрушить иммуногенность иммунологически важных протеинов или иначе неактивных антигенов, вырабатыва  тем самым реагенты , которые привод т к ложным отрицатель- ным реакци м. Кроме того, ложные отрицательные реакции, использующие антигены , полученные из живого вируса, могут иметь место из-за стерического преп тстви , в результате которого антитела не могут реагировать с их специфическими антигенами, так как реакци  блокируетс  наличием других антигенов и антител в реакционной смеси.

Тесты ELISA дл  обнаружени  ВИЧ-2 могут также использовать иммунологически важные вирусные протеины, полученные клонированием частей генома ВИЧ-2 в бактерии . В насто щее врем  известна полна  нуклеотидна  последовательность ВИЧ-2 с кодированием генов дл  различных ВИЧ-2 протеинов, определ емым сравнением с гомологичными ВИЧ-1 генами. Глюкопротеи- ды вирусной оболочки и протеины  дра соответственно, кодированные env- и gag- генами ВИЧ-2, по-видимому  вл ютс  антигенами , распознаваемыми антителами а сыворотке больных, зараженных ВИЧ-2.

Иммунологически важные антигены ВИЧ-2, такие как др160 и его продукты расщеплени  др120 и др41, которые присутствуют в вирусной оболочке, можно получить

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

клонированием частей генома ВИЧ-2 в различных системах экспрессии, таких как бактери , дрожжи или вирусы вакцины. Такие рекомбинантные антигены можно использовать дл  диагноза и как потенциальные вакцинные композиции, как было сделано дл  протеинов ВИЧ-1 /1,2/. Однако антигены ВИЧ-2, полученные методами рекомби- нантной ДНК, все еще требуют опустошающей очистки во избежание ложных положительных реакций в ELISA из-за реактивности любого антитела к антигенам в системе экспрессии, которые могут загр зн ть препарат антигена ВИЧ-2..Также, денатураци  антигенов ВИЧ-2 во врем  очистки может разрушать важную антигенную активность.

Хот  антигены ВИЧ-2, полученные ре- комбинантными методами, могут быть улучшением по сравнению с антигенами, полученными из зараженных вирусом клеточных культур, рекомбинантные протеины могут все еще обеспечивать реагенты, которые позвол ют как можно более точно определ ть диагноз. Из-за характера болезни и необходимости точных результатов необходимо разработать другие реагенты дл  достижени  100% точности при диагнозе ВИЧ-2.

Протеиновые антигены содержат р д эпитопов или антигенных детерминант, которые  вл ютс  област ми протеинов, которые включают сайты св зи дл  специфических антител. В общем случае. протеиновые антигены содержат 5-10 эпи- топ. кажда  из которых содержит последовательность 6-8 аминокислот. Эпитопы могут быть непрерывными, в которых 6-8 аминокислот присутствуют в линейной последовательности , или прерывистыми, в которых аминокислоты, которые образуют эпитоп, сведены вместе трехмерной укладкой протеина. Даже когда эпитоп состоит только из относительно небольшого числа аминокислот, его реактивность с антителом подвергаетс  воздействию аминокислот в протеине, который окружает эпитоп.

Исследовани м, целью которых было вычерчивание антигенных сайтов или эпитопов протеинов, помогло применение синтетических пептидов, соответствующих различным област м представл ющих интерес протеинов.

В дополнение к их полезности в исследовани х вычерченных эпитопов, синтетические пептиды, если включают большинство антигенных детерминант протеина , имеют потенциал как иммуногенные

композиции, включа  вакцины, и диагностические реагенты. Антигены синтетического пептида имеют несколько достоинств по отношению к получению специфического антитела и реактивности. Точную последовательность синтезированного пептида можно выбрать из последовательности аминокислот, фактически определенной из аминокислотной последовательности протеина или предсказанной из кодировани  ДНК-последовательности дл  протеина. Использование специфических синтетических пептидов исключает необходимость применени  протеина полной длины в получении специфических антител или в их испытани х . Далее, методы синтеза твердофазного пептида Меррифельда и его сотрудников позвол ют химически получить, по существу неограниченные количества представл ющего интерес синтетического пептида. Дополнительные преимущества такого способа заключаютс  в доступности автоматических синтезаторов пептида.

Синтетические пептидные антигены, соответствующие област ми иммунологиче- ски важных протеинов ВИЧ-2, найдут немедленное применение в диагностических методах, а.также в качестве возможных вакцин дл  ВИЧ-2.

В соответствии с изобретением получают новый синтетический пептид, соответствующий антигенному ВИЧ-2 протеину, полезный в выбранных диагностических методах дл  обнаружени  заражений ВИЧ-2.

Новый синтетический пептидный антиген , соответствующий части глюкопротеида др41, кодированной env-геном ВИЧ-2, обнаружен в насто щее врем . Этот пептид полезен дл  диагностики СПИДа, вызванного заражением ВИЧ-2 у подозреваемых лиц и в методах скрининга дл  воздействи  ВИЧ- 2 в крови и полученных из крови препаратах с высокой степенью надежности и специфичности .

Этот пептид можно использовать в способах обнаружени  антител к ВИЧ-2 в пробах . Этиспособы включают контактирование пробы с пептидными антигенами при услови х, которые позвол ют иммунологическому комплексу образовыватьс  между пептидом и любыми специфичными к ВИЧ-2 антителами, которые могут присутствовать в данной пробе, Измерение формировани  комплекса, если таковое имеет место, при помощи подход щих детекторов, указывает наличие или отсутствие антител к ВИЧ-2 в пробе.

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Новый пептид может также быть полезен как иммуноген в вакцинных компози.ци:  х дл  иммунизации против заражений ВИЧ-2 или дл  получени  в животных ВИЧ-2 специфических антител против антигенов ВИЧ-2.

Изобретение описывает пептид, соответствующий области глюкопротеида трансмембранной оболочки др41 ВИЧ-2, который синтезирован и проверен на иммуно- реактивность к ВИЧ-2 позитивным сывороточным пробам. Новый пептид полезен в испытани х дл  диагностики заражени  ВИЧ-2 или дл  предварительного воздействи  на вирус и как иммуноген в композици х дл  стимулировани  получени  антител против ВИЧ-2 в животных, включа  человека. Этот охватываемый изобретением пептид включает аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей один непрерывный /линейный/ эпитоп, реактивный со специфическими антителами ВИЧ-2.

Таким образом, изобретение охватывает иммунологически реактивный пептид и его функционально эквивалентные варианты , которые не вли ют в заметной степени на антигенные свойства пептида, соответствующего области др41, кодированной env- геном ВИЧ-2. Пептид был синтезирован известными методами синтеза твердофазного пептида.

Этот синтез также позвол ет одной или двум аминокислотам, не соответствующим последовательности исходного протеина, присоедин тьс  к амино- или карбоксильным окончани м пептида. Такие дополнительные аминокислоты полезны дл  св зи пептида с другим пептидом, с большим протеином носител  или с носителем. Аминокислоты , полезные дл  этих целей, включают тирозин, лизин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, цистеин и их производные. Можно использовать дополнительные способы модификации протеина , например NHj - ацетилирование и-ли амидирование СООН-конца дл  обеспечени  дополнительных средств св зи пептида с другой молекулой протеина или пептида или с носителем.

Последовательность нового пептида описана ниже.

Н2-41А5.

X-Asp-Gln-Ala-Arg-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly -Cys-Ala- Phe-Arg-Gla-Val-Cys-His-Thr-Thr- Val-Pro-Trp-Val-Asn-Y-Z r где X - водород аминоконцевой МНз-группы пептида или дополнительна  аминокислота.

св занна  с аминоконцевой МН2-группой пептида, причем эта дополнительна  аминокислота выбираетс  дл  облегчени  св зи пептида с протеином носител ; Y - отсутствует или Cys; Z - ОН или NH2.

Пептид Н2-41А5 кодируетс  нуклеотид- ной последовательностью генома ВИЧ-2, охватывающей пары азотистых оснований /Ьр/ 7908-7978, котора  находитс  в области кодировани  генов оболочки дл  др41. Пептид Н2-41А5. где Х-Н: Y-Cys; Z-OH, предпочтителен.

Этот пептид можно использовать в способах обнаружени  антител к св занным с ВИЧ-2 или ВИЧ-2 антигенам. Предпочтительно , методы, которые используют пептид дл  обнаружени  наличи  специфических антител к ВИЧ-2 в пробе, включают контактирование пробы с пептидом при услови х, позвол ющих образование иммунологического комплекса между антигеном пептида и любыми антителами к ВИЧ-2. которые могут присутствовать в пробе. Формирование иммунологического комплекса, если таковой существует, показывает наличие антител к ВИЧ-2 в пробе и затем этот комплекс обнаруживаетс  и измер етс  пригодными средствами.

Такие методы включают, среди других, гомогенные и гетерогенные св занные им- мунопробы, такие как рздиоиммунопробы /РИП/, метод иммуной пробы, св занной с ферментом /ELISA/. и анализ п тен Вестерна . Далее, протоколы испытаний, иЈрЈну.|у- ющие новый пептид, позвол ют провести исследовани , сравнительные и контрольные св зи.

Пептид может быть меченым /генерирующим сигнал/ или немеченым в зависимости от типа используемой пробы. Метки, которые могут быть св заны с пептидами, относ тс  к разр ду известных в технике и включают, среди прочих ферменты, радиоизотопы , фторогенные или хромогенные вещества , коферменты, биотин/авидин, коллоидное золото и магнитные частицы. Модификаци  нового пептида позвол ет осуществл ть св зь известными средствами с протеинами или пептидами-носител ми , или с известными носител ми, например полистироловые или поливиниловые микротитровальные пластины,стекл н- ные трубки или стекл нна  дробь, и хроматографическими носител ми, такими как бумага, целлюлоза и производные целлюлозы и кремнезем.

Предпочтительными известными методами анализа, особенно дл  крупномэсш0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

табного клинического скрининга крови и полученных из крови препаратов, а также сыворотки,  вл ютс  методы ELISA и п тен Вестерна. В частности, предпочтительным  вл етс  метод ELISA. Испытани  ELISA, использующие пептид Н2-41А5. описанный выше, основаны на методах, используемых в насто щее врем  с полученными из клетки человека или из рекомбинантной ДНК ВИЧ- 1 протеинами или их част ми в качестве антигенов . Дл  использовани  в качестве реагентов в этих пробах пептид H2-4IA5 обычно св зывают с внутренней поверхностью мик- ротитровальной лунки. Пептид может быть пр мо св зан с микротитровальной лункой. Однако установлено, что максимальную св зь пептида с лунками можно получитьб предварительной обработкой лунок полили- зииом до добавлени  пептида.

Пептид Н2-41А5 может быть ковалент- но соединен известными методами с протеином-носителем , таким как альбумин бычьей сыворотки, используемым дл  покрыти  лунок. Обычно пептид используетс  в концентрации 10-100 мг/мл дл  покрыти .

Пробы, которые должны испытыватьс  на антитела к ВИЧ-2, затем ввод т в покрытые пептидом лунки, где образуетс  иммунологический комплекс, если в пробе присутствуют антитела к ВИЧ-2. Дл  того, чтобы помочь обнаружить образование комплекса , можно ввести средства генерировани  сигнала. Обнаруживаемый сигнал вырабатываетс , если в пробе имеютс  специфические антитела к ВИЧ-2,

Изобретение иллюстрируетс  следующими специальными примерами, которые ни о коем случае не ограничивают обьем защиты изобретени .

Пример 1. Дл  синтеза пептида Н2-41А5 использовали синтезатор пептида 430А фирмы Эпплайд биосистема. В синтезе использована п-метилбензилгидрила- миносмола на твердофазном носителе. Все аминокислоты дл  использовани  в синтезе содержали третбутилкарбонильные группы /t-Вос/, защищающие a-NH2-rpynny. Аминокислоты с реакционноспособными группами с боковой цепью содержали дополнительные защитные группы дл  предотвращени  нежелательны и ненужных реакций боковой цепи. Отдельные защищенные аминокислоты, использованные дл  синтеза пептида Н2-41А5, выбирались из следующих (Boc-Glu/OBZI/-OH. Вос-11е- ОН 1/2 НзО, Boc-Lys -/2-OZ/-OH (кристаллическа ), Boc-Met-OH и Бос-Туг

-/2-Br-Z/-OH, не использовались в синтезе пептида Н2-41А5):

Аминокислоты, используемые в синтезе пептида:

Вос-А1а-ОН Boc-Arg(Tos)-OH Boc-Asn-OH Boc-Asp(OBZI)-OH Boc-Cys-(pMeOBZI)-OH Boc-Glu(OBZI)-OH Boc-Glu-OH Boc-G y-OH Boc-His(Tos)-OH Boc-Fle-OH 1/2H20 Boc-Leu-OH H20

Boc-Lys(2-CI-Z)-OH /кристаллическа / Boc-Met-OH Boc-Phe-OH Boc-Pro-OH

Boc-Ser-{BZI)-OH DOHA Boc-Thr(BZI)-OH Bo:-Trp /формил/-ОН Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH - Boc-Val-OH

То5 тозил или р-толуолсульфокислота OBZI-бензилоксИ pMeOBZNn-метилбензилокси 2-CI-Z карбобензоксихлорид 2-Br-Z карбобензоксибромид

После завершени  синтеза защитные группы удалили из синтезированного пептида и пептид оущепили от смолы на твердом носителе обработкой при 0°С безводной плавиковой кислотой (HF). использу  в качестве удал ющих агентов совместно 10% анизола и 10% диметилсульфида. В качестве дополнительного удалител  добавили 2% тиокрезола, так как Н2-41А5  вл етс  содержащим цис- теин пептидом.

После отщеплени  HF в пробе промыли под струей N2 с удалением любой остаточной HF при помощи воздействи  на пробу вакуума при 0° С. Пептид экстрагировали из смолы обработкой трифторуксусной кислотой /TFA/. которую затем удалили испарением при комнатной температуре. После удалени  TFA пептид осадили и промыли безводным простым эфиром.

До использовани  в специальных пробах пептид можно дополнительно очистить, если необходимо, при помощи обращенно- фаэовой скоростной жидкостной хроматографии . Очень подход щей колонной дл  такой очистки служит обращеннофазова  колонна Vydek C-18. использующа  дл 

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

элюировани  пептида градиент вода /TFA/- ацетонитрил /TFA/,

П р и м е р 2. Пептид Н2-41А5, имеющий последовательность аминокислот Asp-Gln- Ala-Arg-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe- Arg-Gln-Val-Cys-Hls-Thr-Thr-Val-Pro-Trp-Val -Asn-Cys-OH, синтезировали как описано в примере 1 и использовали в испытании Е LISA дл  измерени  его иммунологической реактивности.

На микротитровальные пластины внесли полилиэин в концентрации 1 мг/мл и выращивали 30 мин. Полилизин затем удалили и в лунки пластин добавили пептид Н2-41А5 в концентрации 10-100 мг/мл дл  покрыти . После того.как пептид выращивали в лунке в течение времени, достаточного дл  св зи пептида с лункой, пептидный раствор удалили и 15 мин добавл ли раствор глутаральдегида. который стабилизует присоединение пептида к лункам. Затем раствор глутаральдегида удалили, лунки промыли буферным раствором и добавили смесь глицина и альбумина бычьей сыворотки , котора  служит дл  блокировки несв занных сайтов в лунках и минимизации неспецифическай св зи антител в течение самого испытани  ELISA. После последней операции промывки пластины были готовы к применению.

Обычна  вариаци  известных методов ELISA использовалась с приготовленными микротитровальными пластинами. Пробы сыворотки отдельных лиц, разбавленные 1:50 в PBS /фосфатно-буферный сол ной раствор/, содержащем 0,05% полиоксиэти- ленсорбитмонолауарата /Твин 20/ и 1 % альбумина бычьей сыворотки, вносили в каждую лунку и выращивали 90 мин при 37°С во влажной атмосфере. Разбавленные пробы сыворотки затем удалили из пластин и лунки промыли три раза PBS, содержащим 0.05% Твин 20. В лунки затем добавили коньюгированное античеловеческое 1 g антитело и выращивали 90 мин. Коньюгированное антитело получали в козле или кролике и специфицировали дл  человеческих IgG. IgM иммуноглобулиновых легких цепей или их комбинаций. Предпочтительно , в ELISA использовали св занный с щелочной фосфатазой античеловеческий IgG /из Dabopatts/, разбавленный 1:500 в PBS, содержащем 0,05% Твин 20 и 1 % альбумина бычьей сыворотки. После того, как конью- гант выращивали достаточно времени дл  реакции со св занными антителами человека , пластины промыли три раза. Дл  обнаружени  антител к ВИЧ-2 в человеческой

сыворотке, котора  реагирует с пептидом Н2-41А5, использованном как антиген /т.е. положительные реакции/, добавили хромо- генный щелочно-фосфэтэзный субстрат /таблетки N; 104 Sigma Cot/, растворенный в буфере карбонат натри  /MCI и подрегулированный до концентрации 1 мг/мл, который был отщеплен ферментом, присоединенным к античеловеческому IgG дл  получени  цветного продукта. Желтый- оранжевый - красно-коричневый цвет в каждой лунке, показывающий положительную реакцию, считали з спектрометре при 405 нм дл  количественной оценки реакции . Спектрометрические отсчеты подстроили дл  корректировки фоновых реакций.

Пептид Н2-41А5 использовали в параллельных ELISA относительно б сывороточных проб, положительных дл  антител к ВИЧ-2. 10 сывороточных проб, положительных дл  антител к ВИЧ-1,и 6 отрицательных к ВИЧ-1 /ВИЧ-2 сывороток. Как показано в таблице,6/б подтвержденных положительных ВИЧ-2 сывороточных проб /100%/ про- -реагировали с пептидом Н2-41А5. Таблица также показывает, что ни одна положительна  к ВИЧ-1 сывороточна  проба и ни одна

30

.

ИммунореактИвность пептида Н2-41А5 по отношению к ВИЧ-2, положительным ВИЧ-1-и положительным и отрицательным пробам сыворотки, определенна  при помощи метода

иммунопробы, св занной с ферментом

отрицательна  сыворотка не реагировала с Н2-41А5.

Из приведенных результатов очевидно, что новый синтетический пептид, описанный Н2-41А5. который соответствует области глокопротеида др41 ВИЧ-1, кодированной геном оболочки,  вно обеспе- чиваетуникальный реагент дл  чувствительного и избирательного анализа на присутствие антител к ВИЧ-2.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ обнаружени  антител к ВИЧ-2, включающий проведение иммунофермент- ного анализа исследуемой пробы с антигеном и последующую оценку образовавшегос  иммунного комплекса, о т личающийс  тем, что, с целью повышени  чувствительности, в качестве антигена используют полипептид X-Asp-Gln-Ala-Arg- Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Ary- Gln- Val-Cys-Hts-Thr-Thr-Val-Pro-Trp-Val-Asn-Y- Z, где X - водород аминоконцевой группы пептида или дополнительна  аминокислота, св занна  с аминоконцевой МН2-группой пептида; Y - Cys; Z - ОН.

   Прим е ч а н и е. Пептид Н2-41А5 покрывали при концентрации 10 мг/мл

   Продолжение таблицы