JP2004002379A - 免疫学的に重要なエピトープに相当するペプチドの決定方法、及び免疫学的に重要なエピトープに相当するビオチニル化ペプチド又は抗体の決定のための方法におけるその利用、その調製方法及びそれを含む組成物 - Google Patents

免疫学的に重要なエピトープに相当するペプチドの決定方法、及び免疫学的に重要なエピトープに相当するビオチニル化ペプチド又は抗体の決定のための方法におけるその利用、その調製方法及びそれを含む組成物 Download PDF

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Abstract

本発明の基礎にある技術的問題は、細菌及びウイルス性タンパク質上の免疫学的に重要なエピトープに相当するペプチド、及び診断用又は免疫原性組成物における該ペプチドの用途を提供することにある。本発明は、抗体のインビトロ決定方法であって、用いられるペプチドが、ビオチニル化されたペプチド、特にストレプトアビジン−ビオチニル化ペプチド又はアビジン−ビオチニル化ペプチドの複合体の形態であることを特徴とする方法に関する。
【選択図】　　　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明の基礎にある技術的問題は、細菌及びウイルス性タンパク質上の免疫学的に重要なエピトープに相当するペプチド、及び診断用又は免疫原性組成物における該ペプチドの用途を提供することにある。
【０００２】
【従来の技術】
本発明の基礎にある技術的問題は、細菌及びウイルス性タンパク質上の免疫学的に重要なエピトープに相当するペプチド、及び診断用又は免疫原性組成物における該ペプチドの用途を提供することにある。
【０００３】
遺伝子工学ならびに固相ペプチド合成化学における最近の発達により、生化学及び免疫学において合成ペプチドが増々広く用いられるに至った。分子クローニング技術の結果として利用可能になったタンパク質配列を、構造、機能及び免疫学的研究のために化学的に大量に合成することが可能である。ウイルス及び細菌のタンパク質上に見られる免疫学的に重要なエピトープに相当するペプチドも同様に、抗体の検出及び感染の診断のために用いることができる、きわめて特異的な試薬であることが立証されてきた。
【０００４】
合成ペプチドが提供する数多くの利点にもかかわらず、その使用に関連した欠点も多く存在する。その比較的短いサイズのため（一般に、長さがアミノ酸５０個未満）、その構造は、全長タンパク質に存在する分子内相互作用の安定化の影響が無い状態で、数多くの異なるコンホーメーションの間で変動しうる。その上、これらのペプチドの小さなサイズは、すなわち、その化学特性及び可溶性が往々にしてその全長タンパク質のものとかなり異なるものであり、
ペプチドの全体的化学特性を決定するに向けてのペプチド配列内の個々のアミノ酸の貢献は、それに比例して大きくなるということを意味している。
【０００５】
多くの免疫検定では、抗体検出のために用いられる抗原を固体支持体上に固定化することを必要としている。ほとんどの酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）は、固相としてポリスチレンを使用している。多くのタンパク質が固相に安定した形で吸着され得、抗体との次に続く相互作用のためにアクセス可能である配列を呈する。そのサイズが小さいため、固相に対するペプチドの直接的吸着は、往々にして数多くの理由のうちのいずれかのために不充分な結果を生み出す。
【０００６】
第１に、ペプチドは、それが固相に結合できるようにする適正な全体的電荷又はアミノ酸組成を有しない可能性がある。第２に、固相への結合に必要とされるのと同じアミノ酸残基が抗体認識のためにも必要とされる可能性があり、従って抗体結合のためには利用できない。第３に、ペプチドは、固相への結合時点で不利なコンホメーションで固定された状態となり、かくして抗体分子にとって認識不可能となる可能性がある。数多くの場合において、これらの可能性を区別することは可能でもないし、また必要でもない。まず最初にペプチドを大きな担体分子に結合させることにより、固相に対する結合を増大させ、ペプチドの特異的化学特性に対する感受性を低くすることが可能である。標準的には、担体分子はタンパク質である。
【０００７】
固相に結合するペプチドの量は、たとえ間接的にであれ、ある種のケースにおいてこの方法によって増大され得るが、このアプローチは、ペプチドと担体分子の間のリンケージには、往々にして抗体による認識にとってその完全性が必要不可欠である内部三官能性アミノ酸の側鎖が関与しているという事実に悩まされている。内部的に修飾されたペプチドに対する抗血清の結合活性は、往々にして非修飾ペプチド又は未変性タンパク質と比較してかなり減少している。
【０００８】
合成ペプチドに対する抗血清の生成にもまた、大部分の場合において、ペプチドが担体にカップリングされることが必要である。ここでも又、ペプチドの内部三官能性アミノ酸と担体との間のカップリング反応は、ペプチドの免疫原性を変える可能性がある。
【０００９】
カップリング反応を行なうには数多くの方法が存在し、現在使用されている手順の大部分が、Ｖａｎ　Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ，　Ｍ．Ｈ．Ｖ．　Ｂｒｉａｎｄ，　Ｊ．Ｐ．，　Ｍｕｌｌｅｒ，　Ｓ．，　及びＰｌａｕｅ，　Ｓ．；生化学及び分子生物学における実験室技術、第１９巻、抗原としての合成ポリペプチド、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｐｒｅｓｓ，　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８年に詳述されている。これらの手順に加えて、未保護ペプチドは、同様にＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン又はカプロン酸ビオチンアミドＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのような市販の試薬を用いてビオチニル化することができる。これらの試薬の多くは、Ｂｉｌｌｉｎｇｓｌｅｙ，　Ｍ．Ｌ．，　Ｐｅｎｎｙｐａｃｋｅｒ，　Ｋ．Ｒ．，　Ｈｏｏｖｅｒ，　Ｃ．Ｇ．及びＫｉｎｃａｉｄ，　Ｒ．Ｌ．，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　（１９８７）　５　（１）：　２２−３１に論述されている。ビオチニル化されたペプチドは、ビオチンに対して並外れて高い親和性結合を示す２つのタンパク質であるストレプトアビジン及びアビジンによって結合される能力をもつ。
【００１０】
ある種の例においては、ビオチンを未保護のペプチドに又は未保護のペプチドを担体に、選択的にカップリングすることが可能である。このことは、カップリング反応に参加することのできる一方の端部に加えられた付加的な三官能性アミノ酸を有するペプチドを合成することによって達成できる。しかしながら、このアプローチは、このアミノ酸が問題の免疫原性配列内の重要な残基でないかぎりにおいて、そして選択されたカップリング剤が充分な選択性をもつかぎりにおいてのみ成功する。そのアミノ酸組成の如何に関わらず、未保護の全てのペプチドに適用可能な単一の技術は存在しない。
【００１１】
非Ａ非Ｂ型肝炎の原因である病因学的作用物質が同定され、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と名付けられた。特許出願明細書ＥＰ−　Ａ−０　３１８　２１６は、このウイルスゲノムの約８０％に相当する配列を開示している。これらの配列が利用可能になったことにより、残りのコーディング配列、特にゲノムの５′末端に位置するものが迅速に解明されるに至った（Ｏｋａｍｏｔｏ；　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　６０，　１６７−１７７，　１９９０）。ＨＣＶゲノムは、約９，４００ヌクレオチドの長さをもつ線状プラス鎖ＲＮＡ分子である。末端におけるやや短い非翻訳領域を除いて、ゲノムは、約３，０００アミノ酸のポリタンパク質をコードする、大きくしかも中断されていない１つのオープンリーディングフレームで構成されている。このポリタンパク質は、翻訳と同時に個々のウイルス構造領域及び非構造（ＮＳ）領域へと切断されることが立証されている。この構造タンパク質領域は、さらにカプシド（コア）及びエンベロープ（Ｅ１及びＥ２）タンパク質へと分割される。ＮＳ領域は、ＮＳ−１〜ＮＳ−５の領域に分割される。
【００１２】
数多くの個別の特許出願明細書が、診断上重要なアミノ酸配列の位置を決定するためにさまざまな戦略を利用してきており、多くのこれらの研究により、ＨＣＶポリタンパク質の類似の領域が同定されるに至った。
【００１３】
ＮＳ４領域は、主としてＥＰ−Ａ−０　３１８　２１６、ＥＰ−Ａ−０　４４２　３９４、ＵＳ−５，１０６，７２６、ＥＰ−Ａ−０　４８９　９８６、ＥＰ−Ａ−０　４８４　７８７及びＥＰ−　Ａ−０　４４５　８０１において検討されている。残念なことに、ＨＣＶに感染した患者の７０％だけがＮＳ４に対する抗体を産生し、この領域からの配列を含む合成又は組換え型のいずれのタンパク質も全ての感染した血清試料を同定するには適していない。ヌクレオカプシド又はコア領域については、特許出願明細書ＥＰ−Ａ−０　４４２　３９４、ＵＳ−５，１０６，７２６、ＥＰ−Ａ−０　４８９　９８６、ＥＰ−Ａ−０　４４５　８０１、ＥＰ−Ａ−０　４５１　８９１及びＥＰ−Ａ−０　４７９　３７６において検討されている。往々にして混合物として用いられるこれらのペプチドは、ＮＳ４から誘導されたペプチドに比べさらに頻繁に、慢性的に感染した患者からの血清中の抗体によって認識される（８５〜　９０％）ということがわかった。ＮＳ５領域については、特許出願明細書ＥＰ−Ａ−０　４８９　９８６及びＥＰ−Ａ−０　４６８　５２７において検討されている。使用される血清パネルに応じて、６０％を超えるＮＡＮＢ（非Ａ非Ｂ）肝炎がこれらのペプチドに対して向けられた抗体を含むことを立証することができる。ＮＳ３領域も同様に特許出願明細書ＥＰ−Ａ−０　４６８　５２７において検討されている。全ての利用可能な証拠は、ＮＳ３の最も優勢なエピトープは元来不連続的なものであり、合成ペプチドによって適切に表わすことができない、ということを示唆している。ウイルス粒子の外表面（考えられる免疫原性エピトープ）からの一領域として潜在的に興味深いＥ１領域については、ＥＰ−Ａ−０　４６８　５２７及びＥＰ−Ａ−０　５０７　６１５の両特許出願明細書中で検討されている。Ｅ１と同じ理由で、Ｅ２／ＮＳ１領域が検討された。異なるＨＣＶ変異体からのこの領域を比較することによって、このタンパク質が、ｇｐ１２０エンベロープタンパク質のＨＩＶ　Ｖ３ループ領域を想起させるさまざまな領域を含んでいるということが解明された。ＥＰ−Ａ−０　４６８　５２７では、比較的低頻度で認識されるエピトープを含むことがわかっている４つのペプチドが見い出された。最後に、ＨＣＶのＮＳ２領域は、ＥＰ−Ａ−　０　４８６　５２７において分析された。しかしながら、この領域の診断上の価値はまだ明確ではない。抗体検出のための診断上有用な合成ペプチドに関するほぼ全ての特許出願明細書が、ペプチドの好ましい組合せについて記載している。これらの大部分は、ＨＣＶコアタンパク質及びＮＳ４からのペプチドを含んでいる。いくつかのケースでは、ＮＳ５からのペプチド（ＥＰ−Ａ−０　４８９　９６８及びＥＰ−Ａ−０　４６８　５２７）、及びＥ１とＥ２／　ＮＳ１が含まれている（ＥＰ−Ａ−０　５０７　６１５及びＥＰ−Ａ−０　４６８　５２７）。
【００１４】
さまざまな特許出願明細書が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の診断上有用なエピトープを発見するという問題に取り組んでいる。環状ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２ペプチドを含む重要な免疫優性領域は、特許出願明細書ＥＰ−Ａ−０　３２６　４９０において見出された。ＥＰ−Ａ−０　３７９　９４９では、この領域は、ビオチン分子がこれらの環状ＨＩＶペプチドにカップリングされた場合に、ＨＩＶ特異抗体との反応性がさらに高いことが明らかにされた。ＳＵ−Ａ−１６１　２２　６４も同様に、ＨＩＶ抗体の検出のため固相免疫検定においてビオチニル化されたペプチドを使用することを記載している。
【００１５】
その他の出願は、ｇｐ１２０の超可変性Ｖ３ループ領域における有用なＨＩＶエピトープを探し求めている（例えばＥＰ−Ａ−０　４４８　０９５及びＥＰ−Ａ−０　４３８　３３２）。
【００１６】
米国特許第４，８３３，０７１号は、ＨＴＬＶ−Ｉ抗体の検出のためのペプチド組成物を提供している。
【００１７】
１つのエピトープが診断上有用であるか否かを決定することは、
必ずしも容易ではなく、ある程度は、それが取り入られる試験の具体的な形態によって左右される。それは、理想的には、高いパーセンテージの真性陽性血清により認識される免疫優性エピトープであるべきであり、あるいは試験においてその他の抗原を補うことができ、検出率を増大させなくてはならない。頻繁に認識されないエピトープは、真性陽性血清中の抗体の検出率を増大させることに向けてそれらが果たす貢献度、及びその他のさらに強いエピトープの希釈により試験の感度に対してこれらのエピトープの取り入れが及ぼす不利な影響の程度に応じて、診断上有用であることもできるし、又役に立たない場合もある。
【００１８】
かくして、感染又は免疫の結果として産生された抗体によって特異的に認識されるタンパク質の領域を同定するために、ペプチドを利用することが可能である。一般に、従うことのできる戦略としては２つある。これらの戦略のうちの１つは、Ｇｅｙｓｅｎ，　Ｈ．Ｍ．，　Ｍｅｌｏｅｎ，　Ｒ．Ｈ．及びＢａｒｔｅｌｉｎｇ，　Ｓ．Ｊ．；　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　（１９８４），　８１：　３９９８−４００２　に記載されている。このアプローチは、問題のタンパク質又はタンパク質フラグメントの全長が表わされるように、開裂不可能なリンカーで誘導されたポリエチレンロッド上に大きな一連の短い重複ペプチドを合成することに係わっている。
【００１９】
ロッドを、抗血清と共にインキュベートし、抗体結合を抗免疫グロブリン−酵素コンジュゲートを用いて検出する。陽性反応が、タンパク質配列内に存在するエピトープの位置及び配列を直ちに同定する。この技術は、全てのペプチドがそのカルボキシ末端を介して固体支持体に均等に連結されるという利点をもつ。この方法は、線状エピトープのきわめて精確なマッピングを可能にするものの、ロッド上に高い信頼性で合成できるペプチドの長さは制限されている。このことは、エピトープの長さが合成されたペプチドの長さを上回る場合に、時として問題をひき起す可能性がある。
【００２０】
エピトープマッピングに対する第２のアプローチには、一般に長さがアミノ酸１５個〜３０個である、分析すべきタンパク質の配列に沿ったより大きいペプチドの合成が係わっている。連続するペプチドは隣接していてもよいが、好ましくは重複している。切断に続いて、個々のペプチドに対する抗体結合の評価を行ない、エピトープのおおよその位置を同定することができる。このアプローチの一例は、Ｎｅｕｒａｔｈ，　Ａ．Ｒ．，　Ｓｔｒｉｃｋ，　Ｎ．，及びＬｅｅ，　Ｅ．Ｓ．Ｙ．；　Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．　（１９９０）　７１：　８５−９５に示されている。このアプローチは、未変性タンパク質の相同な配列とおそらくより密接に類似し、抗体結合のためのより優れたターゲットを提供する、さらに長いペプチドを合成することが可能であるという利点を有している。このアプローチの欠点は、各々のペプチドが化学的に固有の（ユニークな）ものであり、免疫学的評価のため各ペプチドを固相上に最適にコーティングできる条件が、ｐＨ、イオン強度及び緩衝液組成といった要因について大幅に変動しうるということにある。固相上に吸着できるペプチドの量も、各ペプチドに固有で、制御されない要因である。
【００２１】
本発明の主要な目的は、その非修飾バージョンに比べて優れた免疫学的特性をもつ状態で、免疫学的に有用なエピトープに相当する修飾されたペプチドを提供することにある。
【００２２】
本発明のもう１つの目的は、従来のエピトープマッピング技術を用いて同定することのできなかった免疫学的に有用なエピトープに相当する修飾されたペプチドを提供することにある。
【００２３】
本発明のもう１つの目的は、実施しやすくかつ標準化に導きうる、前記ペプチドを用いる抗体のインビトロ決定のための方法を提供することにある。
本発明のもう１つの目的は、細菌及びウイルス性タンパク質上の免疫学的に重要なエピトープに相当するペプチドを決定するための方法を提供することにある。
【００２４】
本発明のもう１つの目的は、前記方法のいずれかにおいて用いられるタンパク質配列を調製する方法を提供することにある。
【００２５】
本発明のもう１つの目的は、そのエピトープを決定するための方法又は抗体をインビトロで決定するための方法において用いることのできるタンパク質配列を調製する方法を提供することにある。
【００２６】
本発明のもう１つの目的は、上述の方法において用いられるペプチドの調製に有用な中間化合物を提供することにある。
【００２７】
本発明のもう１つの目的は同様に、診断用としてタンパク質上の免疫学的に重要なエピトープに相当すると決定されたペプチドを含む組成物を提供することにもある。
【００２８】
本発明のもう１つの目的は、ワクチン用としてタンパク質上の免疫学的に重要なエピトープに相当すると決定されたペプチドを含む組成物を提供することにある。
【００２９】
本発明に従うと、ウイルスタンパク質の免疫学的に重要な領域を表わすビオチニル化された一連のペプチドが同定され、固相ペプチド合成によって調製される。これらのペプチドは、（ｉ）ＨＣＶ及び／又はＨＩＶ及び／又はＨＴＬＶ−ＩもしくはＩＩに対する抗体の検出にとって、きわめて有用であるものとして同定されている。いくつかの好ましい態様においては、これらのペプチドは、ＢＡＬＢ／Ｃマウスなどの健康な動物におけるＨＣＶ及び／又はＨＩＶ及び／又はＨＴＬＶ−ＩもしくはＩＩに対する抗体の産生を刺激する上で、ならびにＨＣＶ及び／又はＨＩＶ及び／又はＨＴＬＶ−ＩもしくはＩＩの感染予防のためのワクチン組成物において、有用であるということが発見されているか、或は少なくとも予想されている。
【００３０】
本発明の実施例の節で実証されているように、ビオチニル化ペプチドを用いることによって、予め決定されたタンパク質配列内の免疫学的に重要なエピトープの決定が可能になる。固相に対し共有結合的にカップリングされた非ビオチニル化ペプチドを用いる免疫学的に重要なエピトープの決定は、往々にしてこれらのエピトープを局在化できない。特に構造エピトープの局在化の場合、ビオチニル化ペプチドの使用はかなり成功すると思われる。
【００３１】
（１）本発明に従うと、ＨＣＶ及び／又はＨＩＶ及び／又はＨＴＬＶ−ＩもしくはＩＩに対する抗体の検出のために有用なペプチド組成物は、次のような構造をもつ免疫学的に重要なエピトープに相当するペプチドを含んでいる：
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−〔アミノ酸〕ｎ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
式中、
−　〔アミノ酸〕ｎは、ｎを約４〜約５０、好ましくは約３５未満、
さらに好ましくは約３０未満、そして有利には約４〜約２５の整数である残基の数として、ペプチド鎖の長さを示し；
−　Ｂは、ビオチンを表わし；
−　Ｘは、合成プロセス中に取り込まれるビオチニル化された化合　物を表わし；
−　Ｙは、ビオチニル部分Ｂ又はＸからペプチド自体のアミノ酸を分離するリンカーアームを単独で又は一緒になって形成し、しかもアビジン又はストレプトアビジンに対するビオチニル部分Ｂ又はＸの結合と干渉しうる立体障害を最小限にするという機能をもつ単数又は複数の化学的単位又は共有結合を表わし、Ｙが共有結合でない場合、有利には少なくとも１つの化学的単位であり、３０個もの化学的単位から構成されていてよいが、最も頻繁には１〜１０個の同一の又は異なっていてもよい化学的単位、より好ましくはグリシン残基、β−アラニン、４−アミノブチル酸、５−アミノ吉草酸、６−アミノヘキサン酸（カプロン酸）で構成されることになり；
−　Ｂ及びＸは、カッコ内に囲まれていて、これはこれらの位置でのビオチン又はビオチニル化された化合物の存在が任意のものであり、唯一の規定要件はＢ又はＸが示された位置のうち少なくとも１つにおいて存在していることであることを表わしており；
−　Ａは、カッコで表わされているように存在する場合、アミノ酸（単数又は複数）、アミノ基又はペプチド鎖のアミノ末端の化学的修飾を表わし；
−　Ｚは、単数又は複数のアミノ酸、１つのＯＨ基、１つのＮＨ２−基又はこれら２つの化学基のいずれかが関与するリンケージを表わし、ここで該アミノ酸は、大きな割合の真性陽性血清によって認識されるか又は試験においてその他の抗原を補って検出率を増大させることのできる免疫優性エピトープとなるべく選択的に選ばれ、Ｂは選択されたアミノ酸と相互作用して、より大きい診断上の感度をもつ化合物を生成する。
【００３２】
このペプチド組成物は、少なくとも１つ、及び好ましくは２つ、３つ、４つ又はそれ以上の、以下の配列から選ばれたビオチニル化ペプチドの組合せを含んでいる：
１．ヒト免疫不全ウイルス１型エンベロープペプチド：
ａ．　ｇｐ４１
１．　ｇｐ４１、分離株ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
２．
（Ａ）−（Ｂ）−Ｘ）−Ｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−　Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
３．
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
４．
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
５．　ｇｐ４１、分離株Ａｎｔ７０
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
６．　ｇｐ４１、分離株ＥＬＩ
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ｂ．　ｇｐ１２０
１．　部分的Ｖ３ループ配列、コンセンサス
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
１．ａ．　完全Ｖ３ループ配列、コンセンサス
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
２．　部分Ｖ３ループ配列、分離株ＨＩＶ−１　ＳＦ２
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
３．　部分Ｖ３ループ配列、分離株ＨＩＶ−１　ＳＣ
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
４．　部分Ｖ３ループ配列、分離株ＨＩＶ−１　ＭＮ
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
５．　部分Ｖ３ループ配列、分離株ＨＩＶ−１　ＲＦ
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
６．　部分Ｖ３ループ配列、分離株ＨＩＶ−１　ｍａｌ
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
７．　部分Ｖ３ループ配列、分離株ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
８．　部分Ｖ３ループ配列、分離株ＨＩＶ−１　ＥＬＩ
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
９．　部分Ｖ３ループ配列、分離株ＡＮＴ７０
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
１０．部分Ｖ３ループ配列、ブラジル分離株、ペプチドＶ３−３６８
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
１１．カルボキシ末端、ＨＩＶ−１　ｇｐ１２０
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
２．ヒト免疫不全ウイルス２型エンベロープペプチド
ａ．　ｇｐ４１、分離株ＨＩＶ−２　ｒｏｄ
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ｂ．
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ｃ．　ｇｐ１２０、分離株ＨＩＶ−２　ＮＩＨＺ
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ｄ．　部分Ｖ３ループ配列、ペプチドＶ３−ＧＢ１２
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ｅ．　部分Ｖ３ループ配列、ペプチドＶ３−２３９
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　３．チンパンジー免疫不全ウイルス
ａ．　ｇｐ４１
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
４．サル免疫不全ウイルス
ａ．　膜貫通タンパク質、分離株ＳＩＶａｇｍ（ＴＹ０１）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ．
ｂ．　膜貫通タンパク質、分離株ＳＩＶｍｎｄ
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
５．ＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩウィルス
ペプチドＩ−ｇｐ４６−３
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＩ−ｇｐ４６−５
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＩ−ｇｐ４６−４
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＩ−ｇｐ４６−６
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＩ−ｐ２１−２
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＩ−ｐ１９
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＩＩ−ｇｐ５２−１
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＩＩ−ｇｐ５２−２
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＩＩ−ｇｐ５２−３：
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＩＩ−ｐ１９
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
【００３３】
これらの上述のビオチニル化ペプチドは、合成され、感染を受けたヒト又は霊長類からの抗血清によって特異的に認識されることがわかっており、特に有利であると考えられている。これらの上述のペプチドは全て新しいものである。
【００３４】
本発明の方法は、これらのＨＩＶペプチドの抗原性を増大させることを可能にし、これらのペプチドはたとえビオチニル化されていない場合でさえ支持体に結合することができる。
【００３５】
次に続くＨＣＶペプチド配列は、感染を受けたヒト又は霊長類からの抗血清により特異的に認識されることがわかっており、それらは特に有利であると考えられている。非ビオチニル化アミノ酸配列は、従来の方法に従って合成可能である。
【００３６】
問題のペプチドは、ＨＣＶによりコードされるタンパク質又はそのドメインを、免疫学的に擬態するように意図されている。ＨＣＶに関して配列可変性が観察されたため、異なる株のエピトープをより良く擬態するように単数又は複数のアミノ酸を変えることが望ましい可能性もある。対象となる化合物がＨＣＶの少なくとも１つの株との免疫学的競合を提供することができるかぎりにおいて、記載したペプチドがいずれかの特定のＨＣＶ配列と同一である必要はないということも理解すべきである。従ってペプチドは、その使用においてある種の利点を提供する可能性がある場合に、挿入、欠失、ならびに保存的及び非保存的アミノ酸置換といった変更の対象となる可能性がある。これらのペプチドは、好ましくは、より大きな配列の感度を全て維持しながらも、可能なかぎり短いものであろう。ある種のケースにおいては、２つ以上のペプチドを単一の構造の形に合体させることが望ましい可能性がある。このような複合物の形成には、共有結合的又は非共有結合的リンケージが関与する可能性がある。
【００３７】
特に興味の対象となるのは、ペプチドの環化に使用することのできるメルカプト基を提供する目的で、システイン、チオグリコール酸又はその他のチオール含有化合物をペプチド鎖中に取り込んだＨＣＶのビオチニル化されたペプチドである。
【００３８】
ＨＣＶのコア領域からの以下のペプチドは、免疫学的に重要なエピトープに相当するものとして決定された。
１．ペプチドＩ又はコアＩ〔アミノ酸（ａａ）１−２０〕は以下のアミノ酸配列を有する：
（Ｉ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　２．ペプチドＩＩ又はコア２（ａａ７−２６）は次のアミノ酸配列を有する：
（ＩＩ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　特に興味深いのはオリゴペプチドＩＩＡ（ａａ８−１８）である。
（ＩＩＡ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ．３．ペプチドＩＩＩ又はコア３（ａａ１３−３２）は以下の配列を有する：
（ＩＩＩ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　４．ペプチドＩＶ又はコア７（ａａ３７−５６）は以下の配列を有する：
（ＩＶ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　特に興味深いのはオリゴペプチドＩＶａ又はコア６（ａａ３１−　５０）である。
（ＩＶａ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　５．ペプチドＶ又はコア９（ａａ４９−６８）は以下の配列を有する：
（Ｖ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　特に興味深いのはオリゴペプチドＶａ（ａａ５５−７４）である：
（Ｖａ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　６．ペプチドＶＩ又はコア１１（ａａ６１−８０）は以下の配列を有する：
（ＶＩ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
７．ペプチドＶＩＩ（ａａ７３−９２）又はコア１３は次の配列を有する：
（ＶＩＩ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
８．ペプチドコア１２３（ａａ１−３２）：
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
９．ペプチドコア７９１０（ａａ３７−８０）：
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ＨＣＶのＮＳ４領域からの以下のペプチドは、免疫学的に重要なエピトープに対応することがわかった。
ペプチドＶＩＩＩ又はＮＳ４−１又はＨＣＶ１（ａａ１６８８−１７０７）は次の配列を有する：
（ＶＩＩＩ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　ペプチドＩＸ又はＨＣＶ２（ａａ１６９４−１７１３）は次の配列を有する：
（ＩＸ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＨＣＶ３
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ　−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸ又はＨＣＶ４（ａａ１７０６−１７２５）は次の配列を有する：
（Ｘ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
１１．　ペプチドＸＩ又はＮＳ４−５又はＨＣＶ５（ａａ１７１２−１７３１）は次の配列を有する：
（ＸＩ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
１２．　ペプチドＸＩＩ又はＨＣＶ６（ａａ１７１８−１７３７）は次の配列を有する：
（ＸＩＩ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　１３．　ペプチドＸＩＩＩ又はＮＳ４−７又はＨＣＶ７（ａａ１７２４−　１７４３）は次の配列を有する：
（ＸＩＩＩ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
１４．　ペプチドＸＩＶ又はＨＣＶ８（ａａ１７３０−１７４９）は次の配列を有する：
（ＸＩＶ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　１５．　ペプチドＮＳ４−２７又はＨＣＶ９（ａａ１７１２−１７４３）：
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
１６．　ペプチドＮＳ４ｅ：
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ＨＣＶのＮＳ５領域の以下のペプチドは、免疫学的に重要なエピトープに対応することがわかった。
ペプチドＸＶ又はＮＳ５−２５（ａａ２２６３−２２８２）は次の配列を有する：
（ＸＶ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＶＩ　又はＮＳ５−２７（ａａ２２７５−２２９４）は次の配列を有する：
（ＸＶＩ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　ペプチドＸＶＩＩ又はＮＳ５−２９（ａａ２２８７−２３０６）は次の配列を有する：
（ＸＶＩＩ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　ペプチドＸＶＩＩＩはＮＳ５−３１（ａａ２２９９−２３１８）は次の配列を有する：
（ＸＶＩＩＩ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　ペプチドＸＩＸ　又はＮＳ５−３３（ａａ２３１１−２３３０）は次の配列を有する：
（ＸＩＸ）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＮＳ５−２５２７（ａａ２２６３−２２９４）：
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ＨＣＶのＥ２／ＮＳ１領域のＮ末端領域からの以下のペプチド　は、免疫学的に重要なエピトープに対応することがわかった。
ペプチドＸＸａ　（ａａ１８３−４１６）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸａ−１　（ａａ３８３−４０４）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸａ−２　（ａａ３９３−４１６）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸｂ　（ａａ３８３−４１６）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸｂ−１　（ａａ３８３−４０４）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸｂ−２　（ａａ３９３−４１６）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸｃ　（ａａ３８３−４１６）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸｃ−１　（ａａ３８３−４０４）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸｃ−２　（ａａ３９３−４１６）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸｄ　（ａａ３８３−４１６）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸｄ−１　（ａａ３８３−４０４）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸｄ−２　（ａａ３９３−４１６）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　　　　　ペプチドＸＸｅ　（ａａ３８３−４１６）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸｅ−１　（ａａ３８３−４０４）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸｅ−２　（ａａ３９３−４１６）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸｆ　（ａａ３８３−４１６）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸｆ−１　（ａａ３８３−４０４）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸｆ−２　（ａａ３９３−４１６）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸｇ　（ａａ３８３−４１６）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸｇ−１　（ａａ３８３−４０４）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸｇ−２　（ａａ３９３−４１６）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸｈ　（ａａ３８３−４１６）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸｈ−１　（ａａ３８３−４０４）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸｈ−２　（ａａ３９３−４１６）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
【００３９】
上述の配列は、ＨＣＶ１型分離株ＨＣＶ−１（Ｃｈｏｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　８８，　２４５１−２４５５，　１９９１）及びＨＣ−Ｊ１（Ｏｋａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊａｐ．　Ｊ．　Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．　６０，　１６７−１７７，　１９９０）配列上に局在化されたエピトープに対応する。しかしながら、上述の免疫学的に重要な領域に対応するその他の１型ＨＣＶ分離株配列からのペプチドも、同様に本発明に従った組成物中に含まれうるということも理解しなくてはならない。同様に本発明の範囲内に入る変異体ＨＣＶ配列の一例を、ＨＣＶ−Ｊ分離株から誘導することができる（Ｋａｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　８７，　９５２４−９５２８）。
【００４０】
以下のペプチドは、２型ＨＣＶ配列からの上述のペプチド領域と同じ領域に由来したものである。
ペプチドＸＸ／２
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸ／２−１
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＸ／２−２
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＶＩＩＩ−２又はＮＳ４−１（２）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＩＸ−２
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸ−２
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＩ−２又はＮＳ４−５（２）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＩＩ−２
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＩＩＩ−２又はＮＳ４−７（２）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＩＶ−２
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＶ−２
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−（Ｘ）−Ｙ−Ｚ
ペプチドＸＶＩ−２
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＶＩＩ−２
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＶＩＩＩ−２
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチドＸＩＸ−２
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
【００４１】
上述の配列は、ＨＣＶ２型分離株ＨＣ−Ｊ６配列上に局在化されたエピトープに対応する（Ｏｋａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　７２，　２６９７−２７０４，　１９９１）。しかしながら、上述の免疫学的に重要な領域に対応するその他の２型ＨＣＶ分離株配列からのペプチドも、同様に本発明に従った組成物中に含まれうるということも理解されるべきである。本発明の範囲内に入る変異株配列の例を、ＨＣＶ分離株ＨＣ−Ｊ８から誘導することが可能である（Ｏｋａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１８８，　３３１−３４１，　１９９２）。
【００４２】
ＨＣＶ３型のＮＳ４領域からの以下のペプチドも、同様に本発明に従った好ましいペプチドである：
ペプチド　ＮＳ４−１（３）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチド　ＮＳ４−５（３）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
ペプチド　ＮＳ４−７（３）
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
【００４３】
ＨＣＶ１型及び２型について決定されたような免疫学的に重要な領域に対応するＨＣＶ３型分離株配列に対応するその他のペプチドも、同様に本発明に従った組成物中に含まれうるということも理解されるべきである。
【００４４】
本発明に従った組成物は同様に、Ｇｌｙ及び／又はＳｅｒ残基により分離されるＨＣＶコア（表９）、ＨＣＶ　ＮＳ４（表１０）又はＨＣＶ　ＮＳ５（表１１）領域のコアエピトープの組合せから成るハイブリッドＨＣＶペプチド配列、そして好ましくは以下のハイブリッドＨＣＶ配列をも含みうる：
【００４５】
Ｅｐｉ−１５２
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
Ｅｐｉ−３３Ｂ３Ａ
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
Ｅｐｉ−４Ｂ２Ａ６
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ
【００４６】
本発明に従った組成物は、同様に、上述の免疫学的に重要な領域のいずれかから誘導された状態にあって、しかも天然の分離株に見られる全てのアミノ酸を各位置に含んだペプチドから成るいわゆるビオチニル化されたミクソトープ（ｍｉｘｏｔｏｐｅ）配列をも含みうる（図１４参照）。
【００４７】
（２）Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイスル１型及びヒト免疫不全ウイルス２型を検出し、及び／又はこれに対して免疫するためのビオチニル化ペプチドの好ましい混合物は、以下のものから成る：
Ａ．ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶａ、Ｖａ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩＩ、１ａ．３、１ａ．４、１ａ．ｂ、１ｂ．１ａ、２ｂ、２ｄ、
Ｂ．ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶａ、Ｖａ、ＩＸ、ＩＸ−２、ＸＩ、ＸＩ−２、ＸＩＩＩ、ＸＩＩＩ−２、ＸＶ、ＸＶ−２、ＸＶＩ、ＸＶＩ−２、ＸＶＩＩＩ、ＸＶＩＩＩ−２、１ａ．３、１ａ．４、１ａ．ｂ、１ｂ．１ａ、２ｂ、２ｄ。
【００４８】
（３）ヒト免疫不全ウイルス１型及び２型、及びヒトリンパ球栄養性ウイルスＩ型及びＩＩ型を検出し、及び／又はこれに対して免疫するためのビオチニル化ペプチドの好ましい混合物は、以下のものから成る：
１ａ．３、１ａ．４、１ｂ．１、２ｂ、２ｃ、２ｄ、Ｉ−ｇｐ４６−３、Ｉ−ｇｐ４６−４、Ｉ−ｇｐ４６−５、Ｉ−ｇｐ４６−６、ＩＩ−ｇｐ５２−２、ＩＩ−ｇｐ５２−３、Ｉ−ｐ２１−２、Ｉ−ｐ１９、ＩＩ−ｐ１９。
【００４９】
（４）Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型及び２型、
及びヒトリンパ球栄養性ウイルスＩ型及びＩＩ型を検出し、及び／又はこれに対して免疫するためのビオチニル化ペプチドのもう１つの好ましい混合物は、以下のものから成る：
１ａ．３、１ａ．４、１ａ．６、１ｂ．１ａ、２ｄ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶａ、Ｖａ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩＩ、ＸＸａ−２、ＸＸｃ−２、ＸＸｇ−２、ＸＸｈ−２、Ｉ−ｇｐ４６−３、Ｉ−ｇｐ４６−４、Ｉ−ｇｐ４６−５、Ｉ−ｇｐ４６−６、ＩＩ−ｇｐ５２−３、Ｉ−ｐ２１−２、Ｉ−ｐ１９、ＩＩ−ｐ１９。
【００５０】
（５）本発明は、同様に、Ｃ型肝炎ウイルスに対する診断用ならびに免疫原としての目的のために特に有利であり、かつ次のような混合物を有利に含む、ビオチニル化ペプチドの組成物にも関する：
Ａ．Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶａ、Ｖａ、
Ｂ．ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶａ、Ｖａ、
Ｃ．ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩＩ、
Ｄ．ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩＩ、ＸＩＸ、
Ｅ．ＸＸｃ−２、ＸＸａ−１、ＸＸａ−２、ＸＸｈ−１、ＸＸｈ−２、ＸＸｇ−２、ＸＸ／２−２、
Ｆ．ＩＸ−２、ＸＩ−２、ＸＩＩＩ−２、
Ｇ．ＸＶ−２、ＸＶＩ−２、ＸＶＩＩＩ−２、ＸＩＸ−２、
Ｈ．ＩＸ、ＩＸ−２、ＸＩ、ＸＩ−２、ＸＩＩＩ、ＸＩＩＩ−２、
Ｉ．ＸＶ、ＸＶ−２、ＸＶＩ、ＸＶＩ−２、ＸＶＩＩＩ、ＸＶＩＩＩ−２、ＸＩＸ、ＸＩＸ−２、
Ｊ．ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶａ、Ｖａ、ＩＸ、ＩＸ−２、ＸＩ、ＸＩ−２、ＸＩＩＩ、ＸＩＩＩ−２、ＸＶ、ＸＶ−２、ＸＶＩ、ＸＶＩ−２、ＸＶＩＩＩ、ＸＶＩＩＩ−２、
Ｋ．ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶａ、Ｖａ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩＩ、
Ｌ．ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩＩ、
Ｍ．ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶａ、Ｖａ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩＩ、ＸＸａ−２、ＸＸｃ−２、ＸＸｇ−２、ＸＸｈ−２。
【００５１】
（６）本発明は、同様に、ヒト免疫不全ウイルスに対する診断用ならびに免疫原としての目的のために特に有利であると考えられ、
しかも以下の混合物の中から有利に選択されるビオチニル化ペプチドの組成物にも関する：
１型について：
Ａ．１ａ．３、１ａ．４、１ａ．５、１ａ．ｂ
Ｂ．１ａ．３、１ａ．４、１ｂ．１、１ｂ．３、１ｂ．６、１ｂ．１０、
Ｃ．１ｂ．１、１ｂ．２、１ｂ．３、１ｂ．４、１ｂ．５、１ｂ．６、１ｂ．７、１ｂ．８、１ｂ．９、１ｂ．１０
Ｄ．１ｂ．１、１ｂ．２、１ｂ．３、１ｂ．４、１ｂ．６、１ｂ．１０、
Ｅ．１ａ．３、１ａ．４、１ａ．５、１ａ．ｂ、１ｂ．１ａ。
２型について：
Ａ．２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ。
１型及び２型について：
Ａ．１ａ．３、１ａ．４、１ｂ．１、２ｂ、２ｃ、２ｄ、
Ｂ．１ａ．３、１ａ．４、１ｂ．１ａ、２ｂ、２ｄ。
【００５２】
（７）本発明は、同様に、ヒトＴリンパ球栄養性ウイルスに対する診断用ならびに免疫原としての目的のために特に有利であると考えられ、しかも以下の混合物の中から有利に選択されるビオチニル化ペプチドの組成物にも関する：
ヒトＴリンパ球栄養性ウイルスＩ型について：
ペプチドＩ−ｇｐ４６−３、Ｉ−ｇｐ４６−４、Ｉ−ｇｐ４６−５、Ｉ−ｇｐ４６−６、Ｉ−ｐ２１−２、Ｉ−ｐ１９。
ヒトＴリンパ球栄養性ウイルスＩＩ型について：
ペプチドＩＩ−ｇｐ５２−１、ＩＩ−ｇｐ５２−２、ＩＩ−ｇｐ５２−３、Ｉ−ｇｐ４６−４、ＩＩ−ｐ１９、Ｉ−ｐ２１−２。
ヒトリンパ球栄養性ウイルスＩ型及びＩＩ型について：
ペプチドＩ−ｇｐ４６−３、Ｉ−ｇｐ４６−４、Ｉ−ｇｐ４６−５、Ｉ−ｇｐ４６−６、ＩＩ−ｇｐ５２−１、ＩＩ−ｇｐ５２−２、ＩＩ−ｇｐ５２−３、Ｉ−ｐ２１−２、Ｉ−ｐ１９、ＩＩ−ｐ１９。
【００５３】
ペプチドの合成は、溶液中又は固体支持体上で達成することができる。合成プロトコールは、一般にｔ−ブチルオキシカルボニル又は９−フルオレニルメトキシカルボニルで保護された活性化アミノ酸を利用する。合成を行なうための手順、アミノ酸活性化技術、側鎖保護タイプ及び使用される開裂手順は、例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ，固相ペプチド合成、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，　１９８４　；及びＡｔｈｅｒｔｏｎ　ａｎｄ　Ｓｈｅｐｐａｒｄ，　固相ペプチド合成、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９　の中に充分に記載されている。
【００５４】
（８）本発明は、同様に、上述のビオチニル化ペプチドを用いる抗体のインビトロ決定のための方法において、前記ビオチニル化されたペプチドが、好ましくはストレプトアビジン−ビオチニル化ペプチド複合体又はアビジン−ビオチニル化ペプチド複合体の形態である方法にも関する。
【００５５】
ストレプトアビジン−ビオチニル化ペプチド又はアビジン−ビオチニル化ペプチド複合体において、ペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端又は内部のいずれがビオチニル化されていてもよい。
【００５６】
抗体の決定のためのこのアプローチは、ペプチドの長さに関して制限されておらず、免疫学的評価のために固相上に直接ペプチドをコーティングする場合の固有の問題点が回避される。
【００５７】
本発明の方法においてビオチニル化ペプチドを使用することによって、固体支持体に対するペプチドの固定は、その必須のアミノ酸を抗体により自由に認識されうる状態にするものとなる。
【００５８】
固体支持体にペプチドを固定するという表現は、ペプチドが固定化された状態となるような共有結合又は非共有結合的相互作用を介しての支持体に対するペプチドの付着を意味する。
【００５９】
固体支持体は、ニトロセルロース、ポリスチレン、ナイロン又はその他のいかなる天然もしくは合成ポリマーであってもよい。
【００６０】
「その必須のアミノ酸が抗体により自由に認識されうる状態にされる」という表現は、ペプチド自体のアミノ酸側鎖が、いかなる形であれ化学的に修飾されておらず、又ペプチドと固相との間の相互作用にも関与しないということを意味する。
【００６１】
本発明におけるビオチニル化ペプチドの使用は、このビオチニル化ペプチドが、それに対する抗体の結合に適しているものを少なくとも１つ含む広範囲のコンホーメーションを自由にとることを可能にする。
【００６２】
本発明の方法で使用するのに、いかなるビオチニル化ペプチドを選択することもできる。しかしながら、そのうちのいくつかは、ビオチニル化されず、ストレプトアビジン又はアビジン複合体に関与していなくても、固体支持体上に固定され、このペプチド内のエピトープを特異的に認識する抗体と反応することができる。この場合、ビオチニル化ペプチドの使用は、ペプチドがビオチニル化されてない場合に観察される抗原性との関係において、ペプチドの見かけ上の抗原性の増大という結果をもたらす。「見かけ上の」という語は、観察された変化の絶対的原因の如何に関わらず、類似の試験条件下で得られる観察された変化を表わすためのものである。
【００６３】
「抗原性」というのは、抗体によって結合されるというペプチドの特性のことを意味する。
「抗原性の増大」というのは、非ビオチニル化ペプチドの希釈の少なくとも２倍の希釈に対し、陽性シグナルが得られることを意味する。この陽性シグナルは、非ビオチニル化ペプチドについて得られるものと同じ絶対値（大きさ）のものである。
換言すると、陽性シグナルの獲得は、非ビオチニル化ペプチドの量と比べて少ない量のビオチニル化ペプチドについて得ることができる。
【００６４】
本発明は、同様に、以下の工程を含むタンパク質配列内のエピトープの同定方法をも示している：
−　分析すべきタンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列の部分に対応するペプチドを調製する工程、なお、このペプチドは隣接しているか又は好ましくは互いに重複しており、重複の量は少なくともアミノ酸３個、好ましくは約６個〜１２個であり、ペプチドの長さは少なくともアミノ酸約５個であって約５０個未満、好ましくはアミノ酸約４０個未満、より好ましくは９個〜約３０個であり、このペプチドはビオチニル化されていることを特徴とする：
−　ビオチニル基とストレプトアビジン又はアビジンとの間の相互　作用を通して固相にペプチドを結合し、従来の方法を用いて個々のペプチドに結合する抗体を測定する工程。
【００６５】
（９）本発明は、同様に、上述のようなペプチド組成物を免疫検定手順において使用することによる、ＨＩＶに対する抗体のインビトロ決定又はＨＩＶ感染の診断のための方法において、使用されるビオチニル化ペプチドが、ストレプトアビジン−ビオチニル化ペプチド又はアビジン−ビオチニル化ペプチドの複合体の形態である方法にも関する。
【００６６】
（１０）本発明は、同様に、上述のようなペプチド組成物を免疫検定手順において使用することによる、ＨＣＶに対する抗体のインビトロ決定又はＨＣＶ感染の診断のための方法において、使用されるビオチニル化ペプチドが、ストレプトアビジン−ビオチニル化ペプチド又はアビジン−ビオチニル化ペプチドの複合体の形態である方法にも関する。
【００６７】
（１１）本発明は、同様に、上述のようなペプチド組成物を免疫検定手順において使用することによる、ＨＴＬＶ−Ｉ又はＩＩに対する抗体のインビトロ決定又はＨＴＬＶ−又はＩＩ感染の診断のための方法において、使用されるビオチニル化ペプチドが、ストレプトアビジン−ビオチニル化ペプチド又はアビジン−ビオチニル化ペプチドの複合体の形態である方法にも関する。
【００６８】
抗体のインビトロ決定を行なうための好ましい方法は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いるものである。この検定法　は、一般にポリスチレンマイクロタイタープレート又はビーズである固相を利用する。しかしながら、固相は、共有結合を介して化学的に又は受動吸着によってタンパク質を結合することのできるあらゆる材料であってよい。この点において、ナイロンベースの膜も特に有利であるものとみなされる。固相は、ストレプトアビジン又はアビジンによりコーティングされ、適当な時間の後、余分な未結合タンパク質は洗浄により除去される。固相上の占有されていない結合部位があれば、それはこのときウシ血清アルブミン又はカゼインといった無関連タンパク質でブロッキングされる。
【００６９】
ビオチニル化ペプチドの混合物又は選択物を含む溶液を、その後ストレプトアビジン又はアビジンでコーティングされた表面と接触させ、結合させる。未結合のペプチドは、洗浄によって除去する。代替的には、アビジン又はストレプトアビジンのいずれかとビオチニル化ペプチドとに、複合体を形成させる。結果として得られた複合体を、固相をコーティングするのに用いる。適当なインキュベーション時間の後、未結合の複合体を洗浄によって除去する。抗血清又はその他の体液の適当な希釈溶液を、ペプチドが結合されている固相と接触させる。結合反応を起こさせるのに必要な時間、インキュベーションを行なう。その後、固相を洗浄して未結合成分を除去する。免疫複合体の検出は、供試血清の中に存在する抗体に対して特異的に結合し、かつ、目で検出できるか又は分光光度分析法で測定できる色原体との有色複合体を形成することのできる生成物又は高度に着色された生成物の形に、無色の又はほとんど無色の基質又は補基質を変換することのできる酵素、好ましくは（ただしこれに制限されるわけではない）西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はβ−ガラクトシダーゼのいずれかとコンジュゲートされた異種抗体を用いることによって達成される。
【００７０】
しかしながら、当該技術分野において知られているその他の検出システムも利用することができ、それには、形成された生成物の量を電気化学的又はルミノメトリーによって測定するシステムが含まれる。検出システムは、放射能標識された抗体を利用してもよく、この場合、免疫複合体の量は、シンチレーション計数又は計数によって定量される。原理的には、試験がストレプトアビジン又はアビジンと上述のとおりに合成されたビオチニル化ペプチドとの間の複合体を利用するかぎりにおいて、抗体の検出のためのあらゆるタイプの免疫学的試験を用いることができる。
【００７１】
同様に、溶液中のストレプトアビジン又はアビジン−ビオチニル化ペプチド複合体を抗体結合に関して固相結合抗体と競合させる競合検定、又は溶液中の遊離ペプチドを、固相結合されたストレプトアビジン又はアビジン−ビオチニル化ペプチド複合体と競合させる検定も含まれる。一例を挙げると、抗体及び抗原の検出及び定量のための数多くの免疫検定が詳細に論述されている（Ｔｉｊｓｓｅｎ，　Ｐ．，酵素免疫検定の実践と理論、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｐｒｅｓｓ，　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，　Ｏｘｆｏｒｄ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９８５）。
【００７２】
免疫学的検定は、単一のビオチニル化ペプチドに制限されうる。しかしながら、好ましくは、特異的抗体の存在を測定すべき対象である感染因子から誘導された複数のエピトープを含むビオチニル化ペプチドの混合物が使用される。
【００７３】
抗体検出のインビトロ決定を行なうためのもう１つの好ましい方法は、直線免疫検定法（ＬＩＡ）である。
この抗体検出方法は、基本的に以下の工程から成る：
−　試験すべき又は使用されるビオチニル化ペプチド−ストレプト　　アビジン又はアビジン複合体の形態の抗原を、試験すべき抗原を共有結合により又は非共有結合により結合することのできる膜上に平行線として適用する、
−　膜上の占有されていない結合部位を、カゼイン又はウシ血清ア　ルブミンのような非関連タンパク質でブロッキングする、
−　抗原（ビオチニル化ペプチド）の線が適用されている方向に対　して垂直方向に、ストリップ状に膜を切断する、
−　（検出すべき抗体を含む）血清又はその他の体液の適当な希釈　溶液を、抗原が結合されたストリップと接触させ、結合反応が起こるのに充分な時間インキュベートする、
−　ストリップを洗浄することによって未結合成分を除去する、
−　供試血清中の抗体と特異的に結合し、西洋ワサビペルオキシ　　　ダーゼなどの酵素にコンジュゲートされた異種抗体と共にスト　リップをインキュベートすることによって、免疫複合体の検出を達成する、
−　結合を起こさせるのに充分な期間インキュベーションを行な　　う、
−　酵素の作用によって有色生成物に変換される必要な基質又は　　補基質の添加により、結合したコンジュゲートの存在を検出す　る、
−　反応を、視覚により検出するか、又はデンシトメトリーにより　定量する。
【００７４】
（１２）実施例の節で実証されるように、本発明は、同様に、ＨＩＶ、及び／又はＨＣＶ、及び／又はＨＴＬＶ−ＩもしくはＩＩ感染に対する免疫のための上述のとおりのペプチド組成物の使用にも関する。
【００７５】
（１３）本発明は、同様に、本発明で用いられるビオチニル化ペプチドの調製方法において、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｘ（Ｎ−ｙ−ビオチン）又はＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｘ（Ｎ−ｙ−ビオチン）誘導体の使用が関与し、ここでＸは、
【００７６】
【化１６】
Figure 2004002379
【００７７】
を表わし、ｎは、１以上１０未満、好ましくは２〜６の間であり、
Ｃα原子に１つのアミノ基が付着している一方、その他のアミノ基は側鎖中で最も遠くの炭素である炭素Ｃｙに付着しているか；又はアルコールＲＯＨを用いて得られるそのエステル、より特定的にはペンタフルオロフェニルエステルであり；
ｙは、ラジカル内でＣＯＯＨ基を担持する炭素原子との関係におけるｙの位置を表わす調製方法にも関する。
このビオチン誘導体は、中間生成物と呼ばれ、上述の中間生成物は本発明の方法に従って決定された新しい化合物である。
【００７８】
（１４）本発明の化合物を調製するための有利な方法において、
中間生成物は以下の式のうちの１つによって表わすことができる：
Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−（Ｎ−ｙ−ビオチン）は、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−リジン（ε−ビオチン）又はＮ−α−Ｆｍｏｃ−オルニチン（Ｎ−δ−ビオチン）である。
【００７９】
（１５）Ｎ−末端ビオチニル化ペプチドは、以下の工程を含む方法に従って調製することができる：
−　適切に保護された連続したアミノ酸を樹脂に付加して、
Ｆｍｏｃ−ＡＡｎ……ＡＡ１−樹脂を得る工程；
−　例えばピペリジンを用いて、ＮＨ２　−末端を脱保護する工程；
−　中間生成物：
【００８０】
【化１７】
Figure 2004002379
を、そのＣＯＯＨを通してＮＨ２　−末端に付加して、
【００８１】
【化１８】
Figure 2004002379
を得る工程；
【００８２】
−　得られた化合物のＮＨ２　−末端基を脱保護し、樹脂から開裂させ、そのアミノ末端でビオチニル化された得られたペプチドを抽出及び精製し、側鎖脱保護及びペプチド開裂工程が同時又は別々に行なわれる可能性もある工程；特に
−　例えばピペリジンを用いて、中間基のＮＨ２　末端基を脱保護する工程；
−　エタンジチオール、チオアニソール又はアニソールのようなスカベンジャー（掃去剤）の存在下で、例えばトリフルオロ酢酸などの酸を用いて樹脂から開裂させる工程；
−　酸及びスカベンジャーの大部分を除去するためにジエチルエーテルのような溶剤でペプチドを抽出する工程；
−　ＨＰＬＣなどを用いて精製して、
【００８３】
【化１９】
Figure 2004002379
を得る工程。
【００８４】
ビオチンは、そうでなければ完全に保護されているペプチド鎖の自由アミノ末端に対して、同様に従来の活性化手順を用いて便利にカップリングされ得る。ビオチンは１つのカルボキシ基を有し、アミノ基を全く有さないことから、ビオチンは基本的に鎖ターミネーターとして機能する。インシチュ（ｉｎ　ｓｉｔｕ）活性化のための好ましい活性化剤としては、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）及びＯ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）が挙げられるが、これらに制限されない。これらの及び関連する化合物を利用する活性化手順は、固相ペプチド合成の当業者にとっては周知のことであり、ビオチンのカップリングは、標準的カップリングプロトコールからの大きな逸脱をもたらすものではない。
【００８５】
予め活性化された形態のビオチンも、同様に使用可能である。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン又はビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのいずれでも便利に利用され、両方共市販されている。このカップリング方法は、Ｌｏｂｌ，　Ｔ．Ｊ．，　Ｄｅｉｂｅｌ，　Ｍ．Ｒ．，　及びＹｅｍ，　Ａ．Ｗ．，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　（１９８８），　１７０（２）：　５０２−５１１　により記載されている。Ｎ末端ビオチンの付加の後、ペプチドをスカベンジャーの存在下で樹脂から開裂させるが、スカベンジャーの選択は、ペプチドアミノ酸組成及び使用される保護基の性質の通常の考慮事項によって左右される。
【００８６】
（１６）本発明の方法に関与するカルボキシ末端ビオチニル化ペプチドは、次の工程を含む方法に従って調製できる：
−　樹脂に付着した開裂可能なリンカーに対してカルボキシ活性化形態の上述の中間生成物をカップリングし、例えば以下の化合物：
【００８７】
【化２０】
Figure 2004002379
を得る工程；
【００８８】
−　例えばピペリジンを用いて、中間化合物のαアミノ基を脱保護して、
【００８９】
【化２１】
Figure 2004002379
を得る工程；
【００９０】
【化２２】
Figure 2004002379
上に、適切に保護された次に続くアミノ酸ＡＡ１…ＡＡｎを連続的に付加して、
【００９１】
【化２３】
Figure 2004002379
を得る工程；
【００９２】
−　例えばピペリジンを用いて、ＮＨ２　−末端を脱保護する工程、
−　得られた化合物を脱保護し、樹脂から開裂させ、そのカルボキシ末端でビオチニル化された得られたペプチドを抽出及び精製し、側鎖脱保護及びペプチド開裂工程が同時又は別々に行なわれる可能性がある工程；そして特に
−　例えばピペリジンを用いて、ＮＨ２　末端を脱保護する工程；
−　エタンジチオール、チオアニソール又はアニソールのようなスカベンジャーの存在下で、例えばトリフルオロ酢酸を用いて樹脂から開裂させる工程；
−　酸及びスカベンジャーの大部分を除去するためにジエチルエー　テルのような溶剤でペプチドを抽出する工程；
−　ＨＰＬＣなどを用いて精製して、
【００９３】
【化２４】
Figure 2004002379
を得る工程。
【００９４】
（１７）内部的にビオチニル化されたペプチドは、以下の工程を含む方法に従って調製することができる：
−　適切に保護された連続したアミノ酸を樹脂に付加して、
Ｆｍｏｃ−ＡＡｎ…ＡＡ１−樹脂を得る工程、
−　ＮＨ２　−末端を脱保護する工程、
−　中間生成物：
【００９５】
【化２５】
Figure 2004002379
【００９６】
を、そのＣＯＯＨを通してＮＨ２　−末端に付加して、
【００９７】
【化２６】
Figure 2004002379
を得る工程、
【００９８】
−　例えばピペリジンを用いて、中間化合物のαアミノ基を脱保護して、
【００９９】
【化２７】
Figure 2004002379
を得る工程、
【０１００】
−　適切に保護された次に続くアミノ酸を樹脂に付加して、
【０１０１】
【化２８】
Figure 2004002379
を得る工程、
【０１０２】
−　得られた化合物のＮＨ２　末端基を脱保護し、樹脂から開裂させ、そのアミノ末端でビオチニル化された得られたペプチドを抽出及び精製し、側鎖脱保護及びペプチド開裂工程が同時又は別々に行なわれる可能性がある工程；特に
−　例えばピペリジンを用いて、ＮＨ２　−末端を脱保護する工程；
−　エタンジチオール、チオアニソール又はアニソールのようなスカベンジャーの存在下で、例えばトリフルオロ酢酸などの酸を用いて樹脂から開裂させる工程；
−　酸及びスカベンジャーの大部分を除去するためにジエチルエー　テルのような溶剤でペプチドを抽出する工程、
−　ＨＰＬＣなどを用いて精製して、
【０１０３】
【化２９】
Figure 2004002379
を得る工程。
【０１０４】
ある種の状況の下では、内部的に又はそのカルボキシ末端でペプチドをビオチニル化できることが特に有利であることがわかるかもしれない。このようなケースは、例えばペプチドのアミノ酸配列がタンパク質のアミノ末端配列に対応する場合に生じる。このようなペプチドのアミノ末端に対するビオチンの付着は、結果として、未変性タンパク質の中に見られるものとはかなり異なる構造をもたらし、その結果として、ペプチドの生化学的特性の結合特性に悪影響を及ぼしうる。内部タンパク質配列に対応するペプチドについてさえ、結合タンパク質又は免疫グロブリンによるそれらの認識は、ペプチドのどの末端にどのような要領でそれが結合のために提示されるかによって左右される可能性がある。ペプチド配向（オリエンテーション）の重要性については、Ｄｙｒｂｅｒｇ，　Ｔ．　及びＯｌｄｓｔｏｎｅ，　Ｍ．Ｂ．Ａ，　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　（１９８６）　１６４：　１３４４−１３４９　に記載されている。
【０１０５】
ビオチニル部分を、位置及び配列に無関係な形でペプチド内に取り込ませることができるようにするために、従来の手順を用いてカップリングできる好適な試薬を合成するべく努力が払われた。Ｃ末端又は内部ビオチニル化のための便利な１つの試薬は、Ｎ−ε−ビオチニル−リジンである。この化合物のα−アミノ基が好適に保護されていれば（Ｆｍｏｃ及びｔＢｏｃ）、この試薬は、固相ペプチド合成において使用される標準的手順により、アミノ酸末端を含むペプチド鎖内のどこにでもビオチンを導入するのに用いることができる。ｔ−Ｂｏｃで保護された誘導体の合成は、すでに記載されており〔Ｂｏｄａｎｓｋｙ，　Ｍ．及びＦａｇａｎ，　Ｄ．Ｔ．，　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　（１９７７）　９９：　２３５−２３９　〕、ある種のトランスカルボキシラーゼの酵素活性を研究する上で使用するための短いペプチドを合成するのに用いられた。
【０１０６】
ｔ−Ｂｏｃ誘導体とは異なり、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ビオチン）の合成については記載されておらず、Ｆｍｏｃ−ベースの合成戦略に対する関心が高まってきていることから、この化合物は特に有利なものとみなされている。
【０１０７】
Ｆｍｏｃで保護された望ましい化合物に到達するためにとることのできる可能なルートは数多く存在する。これらを図１に示す。第１のアプローチにおいては、市販のＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ｔＢｏｃ）を出発材料として用いることができる。Ｎ−ε−ｔＢｏｃ保護は、トリフルオロ酢酸、及び水などのスカベンジャーを用いて除去される。わずかにモル過剰のこのようにして得られたＮ−α−Ｆｍｏｃ−リジンを、次にカルボキシ活性化ビオチンと反応させる。結果として得られた生成物は、選択的抽出及び標準的クロマトグラフィ技術により、容易に精製することができる。代替的な１つのアプローチにおいては、フルオレニルメチルスクシンイミジルカーボネートとの反応により、市販のＮ−ε−ビオチニルリジン（ビオシチン）からＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ビオシチン）を生成することができる。指針として用いることのできるこれらの反応の数多くの例が、Ａｔｈｅｒｔｏｎ及びＳｈｅｐｐａｒｄ、固相ペプチド合成、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　、１９８８年に示されている。
【０１０８】
図１に示されている戦略（方法Ａ）も同様に、市販のＮ−α−Ｆｍｏｃ−オルニチン（Ｎ−δ−ｔＢｏｃ）からＮ−α−Ｆｍｏｃ−オルニチン（Ｎ−δ−ビオチン）を合成するために適用することができる。オルニチン誘導体は、オルニチン誘導体に関しては１つの炭素原子分だけ短い側鎖の長さの点でのみ、リジン誘導体と異なっている。Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓは、遊離ビオチンについて記載されているインシチュ活性化用のものと同じ試薬を用いて、ペプチド鎖の中に便利に取り込ませうる。
【０１０９】
代替的には、アミノ酸のＯ−ペンタフルオロフェニルエステルの調製についてＧｒｅｅｎ，　Ｍ．　及びＢｅｒｍａｎ，　Ｊ．，　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．　（１９９０）　３１：　５８５１−５８５２に記載されている塩基触媒のエステル交換反応を用いて、Ｎ−α−ＦｍｏｃーＬｙｓ（Ｎ−ε−ビオチン）及びトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニルから、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ビオチン）−Ｏ−ペンタフルオロフェニルエステルを便利に合成することができる。この活性エステルは、ペプチド鎖中にＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ビオチン）を取り込ませるために直接使用できる。上述の中間生成物のクラスは、以下の工程を含む方法に従って調製できる：
−　前述のジアミノ−、モノカルボン酸を、入念に制御されたｐＨ条件下でフルオレニルメチルスクシンイミジルカーボネート又はフルオレニルメチルクロロホルメートと反応させて、単独で保護されたＮ−α−Ｆｍｏｃ誘導体を得る工程、
−　又は代替的には、αアミノ基を保護するのに使用されたＦｍｏｃ基とは異なる保護基を側鎖アミノ基が有している場合、市販のＮ−α−Ｆｍｏｃで保護されたジアミノ−モノカルボン酸を使用する工程、なお、この側鎖アミノ基保護は、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ基を無傷の状態に残す条件下で選択的に除去されやすい；
−　選択的抽出及びクロマトグラフィによりモノ保護Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−ジアミノ−モノカルボン酸誘導体を精製する工程；
−　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンのようなビオチンのカルボキシ活性化誘導体と、得られた誘導体とを反応させて、望ましい中間生成物である（Ｎ−α−Ｆｍｏｃ）−（Ｎ−ｙ−ビオチン）を得る工程；
−　選択的抽出、沈殿又はクロマトグラフィにより中間生成物を精　製する工程。
【０１１０】
本発明の方法において使用されるビオチニル化ペプチドに、リンカーアームを備えつける場合、これらの化学的単位は、これらの化合物のアミノ基に適切な一時的アミノ基保護を有しているかぎりにおいて、標準的カップリングプロトコールを用いて固相合成の間にペプチド配列のＮ末端又はＣ末端のいずれかに便利に付着されうる。
これらの具体的なビオチニル化ペプチドは、全て新しいものである。
【０１１１】
表１は、ＥＬＩＳＡにおける非ビオチニル化ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２ペプチド（ＴＭ−ＨＩＶ−１及びＴＭ−ＨＩＶ−２と呼称されている）、ならびにビオチニル化ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２ペプチド（上記で１ａ．１及び２ａと呼び、ＴＭ−ＨＩＶ−１Ｂｉｏ及びＴＭ−ＨＩＶ−２Ｂｉｏとも呼称されている）の抗体認識を表わす。
表２は、ＥＬＩＳＡにおける分離株ＨＩＶ−１ｍｎのＶ３配列からの非ビオチニル化及びビオチニル化ペプチド（１ｂ．４とも呼　ぶ）の抗体認識の比較を表わす。
表３は、ＥＬＩＳＡにおけるストレプトアビジン及びアビジンに結合したビオチニル化Ｖ３−ｍｎペプチド（１ｂ．４と呼ぶ）の抗体認識の比較を表わす。
表４は、ＥＬＩＳＡにおけるビオチニル化及び非ビオチニル化　ＨＣＶペプチドの抗体認識の比較を表わす。
より特定的には、
表４Ａは、ＨＣＶペプチドＸＩに対する抗体結合に対応する。
表４Ｂは、ＨＣＶペプチドＸＶＩに対する抗体結合に対応する。
表４Ｃは、ＨＣＶペプチドＩＩに対する抗体結合に対応する。
表４Ｄは、ＨＣＶペプチドＩＩＩに対する抗体結合に対応する。
表４Ｅは、ＨＣＶペプチドＶに対する抗体結合に対応する。
表４Ｆは、ＨＣＶペプチドＩＸに対する抗体結合に対応する。
表４Ｇは、ＨＣＶペプチドＸＶＩＩＩに対する抗体結合に対応する。
表５は、ＥＬＩＳＡにおける異なるペプチドコーティング濃度でのビオチニル化ペプチド及び非ビオチニル化ペプチドに対する抗体結合の比較を表わす。
表６は、ＥＬＩＳＡにおけるＮ末端及びＣ末端ビオチニル化　　ＴＭ−ＨＩＶ−１ペプチド（１ａ．１と呼ぶ）の比較を表わす。
表７は、非ビオチニル化及びカルボキシビオチニル化ＨＣＶペプチドＩの抗体認識の比較を表わす。
表８は、ＥＬＩＳＡにおける抗体検出のためのビオチニル化　　ＨＩＶペプチド及びＨＣＶペプチドの混合物の使用を表わす。
表９は、ＨＣＶコアタンパク質のコアエピトープの配列を表わ　す。
表１０は、ＨＣＶ　ＮＳ４タンパク質のコアエピトープの配列を表わす。
表１１は、ＨＣＶ　ＮＳ５タンパク質のコアエピトープの配列を表わす。
表１２は、１０の供試血清によるさまざまなコア、ＮＳ４及び　ＮＳ５ビオチニル化２０−ｍｅｒｓの抗体結合を表わす。
表１３は、個々のＥ２／ＮＳ１ペプチドの抗体認識（陽性反応を与える全ての血清のパーセンテージ）を表わす。
表１４は、ＨＩＶ　Ｖ３ループペプチドの全体的認識を表わ　　す。
表１５は、地理学的地域によるＨＩＶペプチドの認識を表わ　　す。
表１６は、ＨＩＶ−Ｉ　Ｖ３ループペプチドであるＶ３−ｃｏｎ及びＶ３−３６８に対するヨーロッパ産、アフリカ産及びブラジル産ＨＩＶ−１陽性血清の認識を表わす。
表１７は、２つのＨＩＶ−２　Ｖ３ループペプチドに対する　　ＨＩＶ−２陽性血清の認識を表わす。
表１８は、ハイブリッドペプチドの抗体認識を表わす。
表１９は、混合ＨＴＬＶ−Ｉ及びＩＩペプチドの抗体認識を表わ　す。
全てのアミノ酸配列は、世界的に受入れられた慣用的な三文字　コードで、又表示のある場合には一文字コードで示されている。　ペプチド配列は、慣用上アミノ末端からカルボキシ末端への方向である左から右に示されている。
【０１１２】
いくつかの非慣用的コードも、化学基又は修飾を表わすのに用いられ、以下のように定義づけられる：
（基）　　　　　　（コード）
Ａｃ　　　　　　　アセチル
Ｂｉｏ　　　　　　Ｄ−ビオチニル
Ｆｍｏｃ　　　　　９−フルオレニルメトキシカルボニル
ｔＢｏｃ　　　　　第３ブチルオキシカルボニル
【０１１３】
例１：ペプチド合成
記載される全てのペプチドは、開裂時点でペプチドカルボキシ末端アミドを生成させるために、酸不安定性リンカー、４−（α−Ｆｍｏｃ−アミノ−２′，４′−ジメトキシベンジル）フェノキシ酢酸〔Ｒｉｎｋ，　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．　（１９８７）　２８：　３７８７　〕で共重合体官能化されたポリスチレン−ポリオキシエチレングラフトであるＴｅｎｔａ　Ｇｅｌ　Ｓ−ＲＡＭ　（Ｒａｐｐ　Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，　Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，　ドイツ）上で合成した。ｔ−ブチルベースの側鎖保護及びＦｍｏｃ−α−アミノ保護を用いた。アルギニンのグアニジン基は、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル部分で保護した。ヒスチジンのイミダゾール基は、ｔ−Ｂｏｃ又はトリチルで保護し、システインのスルフヒドリル基は、トリチル基で保護した。１．５当量の塩基Ｎ−メチルモルフォリンの存在下で活性化剤としてＴＢＴＵを用いたアルギニンの場合を除いて、予備形成されたＯ−ペンタフルオロフェニルエステルを用いてカップリングを行なった。場合によっては、グルタミン及びアスパラギンも、同様に、ＴＢＴＵ活性化を用いてカップリングした。これらの場合には、これらのアミノ酸のトリチルで保護された誘導体を利用した。ＴＢＴＵ又はＨＢＴＵのいずれかを用いて、ビオチンをカップリングした。全ての合成は、連続フロー手順を用いてＭｉｌｌｉｇｅｎ　９０５０　ＰｅｐＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ　（Ｎｏｖａｔｏ、カリフォルニア）上で行なった。スカベンジャーの存在下でのトリフルオロ酢酸での開裂及びジエチルエーテルでの抽出の後、全てのペプチドを、Ｃ１８−逆相クロマトグラフィにより分析した。
【０１１４】
例２：Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ビオチン）の合成
Ａ．方法Ａ
市販のＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リジン（Ｎ−ε−ｔＢｏｃ）（１．５ｇ）を、２０ミリリットルの９５％トリフルオロ酢酸、５％Ｈ２　Ｏで、室温で２時間処理した。その後、大部分の酸を窒素流の下で蒸発させた。１０ミリリットルの水を添加し、ジエチルエーテルで３回、溶液を抽出した。次に、五酸化リン上、真空中で、乾燥に至るまで水相を蒸発させた。結果として得られた粉末（Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リジン）を逆相クロマトグラフィで分析し、これは予想通り出発物質よりもさらに親水性の均質な生成物であることがわかった。
８ミリリットルの０．１Ｍ　硼酸塩緩衝液、ｐＨ８．７中に、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−リジン（１９０ｍｇ、０．４９ｍｍｏ　）を溶解した。４ミリリットルのジメチルホルムアミド中に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン（１６２ｍｇ、０．４７ｍｍｏ　）を溶解し、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−リジンの溶液に添加した。ｐＨを監視し、必要に応じてＮａＯＨで滴定した。２時間後、溶液をＨＣｌでｐＨ２．０になるまで酸性化し、この時点で白色沈殿物が得られた。
酢酸エチルでの抽出及び遠心分離の後、白色沈殿物はＨ２　Ｏ：酢酸エチルの界面に見出された。両方の相を除去し、１０ｍＭＨＣｌで２回、酢酸エチルで１回、そしてその後ジエチルエーテルで２回、沈殿物を抽出した。ＤＭＦ中に沈殿物を溶解し、ジエチルエーテルを添加することによって沈殿させた。その後、五酸化リン上、真空中で結晶性粉末を乾燥した。結果として得られた生成物を逆相クロマトグラフィで分析したところ、予想通りＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓよりも遅く溶出される主要なピークが明らかになった。Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓの非常に小さいピークも同様に観察された（図２ａ）。
【０１１５】
Ｂ．方法Ｂ
市販のＮ−ε−ビオチニルリジン（ビオシチン、Ｓｉｇｍａ　、２４９ｍｇ、０．６７ｍｍｏ　）を、８ミリリットルの１ＭＮａ２ＣＯ３中に溶解させ、氷上で冷却した。２ミリリットルのアセトン中にフルオレニルメチルスクシンイジミルカーボネート（２２２ｍｇ、０．６６ｍｍｏ　）を溶解し、激しく撹拌しながら３０分間にわたってビオチニルリジン溶液に添加した。撹拌は室温で５時間続けた。ｐＨは、必要に応じて１Ｍ　Ｎａ２ＣＯ３を添加することにより８〜９に維持した。その後、真空下でアセトンを蒸発させ、溶液のｐＨが約２となるまで１．０Ｍ　ＨＣｌを添加した。溶液の酸性化の時点で、白色沈殿物が現われ、これを１０ｍＭＨＣｌで２回、酢酸エチルで２回、ジエチルエーテルで２回洗浄した。沈殿物をＤＭＦ中に溶解し、ジエチルエーテルを添加することによって沈殿させた。次に、結晶性粉末を五酸化リン上、真空中で充分に乾燥した。逆相クロマトグラフィによって、結果として得られた生成物を分析し、方法１（図２ｂ）を用いて得られた生成物と同じ保持時間（３０．５分）で溶出される主要なピークが明らかになった。
【０１１６】
例３：特異的抗体を用いる酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）
において免疫学的に重要なエピトープに相当するペプチドを決定する方法
ペプチドを直接コーティングする場合、ペプチドの原液を炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６で希釈し、１ミリリットル当り２〜５マイクログラムのペプチド濃度で、ポリスチレンマイクロタイタープレートを３７℃で一時間コーティングするのに使用した。
ビオチニル化されたペプチドを評価する場合には、プレートを、
まず、炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中、１ミリリットル当り　３マイクログラムの濃度のストレプトアビジンを用いて、３７℃で１時間コーティングした。その後、プレートを洗浄して余分の未結合タンパク質を除去した。次に、マイクロタイタープレートのウェルに、炭酸ナトリウム緩衝液中、１ミリリットル当り１マイクログラムのビオチニル化ペプチドの作用溶液を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
プレートをひとたび抗原でコーティングし、プラスチック上のあらゆる残りの占有されていない結合部位をカゼインでブロッキングした。洗浄の後、適切な抗血清の希釈液（通常１：１００）をプレートのウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
非結合物質を除去するため洗浄を行なった後、酵素西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされたヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体と共にプレートをインキュベートすることにより、特異的抗体結合を検出した。洗浄による非結合コンジュゲートの除去の後、Ｈ２　Ｏ２　及び３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジンを含む溶液を添加した。
好適な間隔をおいた後、硫酸の添加により反応を停止させた。陽性反応は黄色を呈し、これを従来のマイクロタイタープレートリーダーを用いて定量した。４５０ナノメートルの波長で吸光度測定を行ない、全てのデータをこの波長での光学密度値として表わした。
【０１１７】
例４：ＨＩＶ特異的抗体の検出のためのビオチニル化されたＨＩＶペプチドの使用
ＨＩＶ−２及びＨＩＶ−２の膜貫通タンパク質に含まれているその他のものに相当する、１０アミノ酸の長さの短いＮ−アセチル化ペプチドの抗体認識を評価するために、実験を行なった。マイクロタイタープレートのウェル中のこれらのペプチドの直接的コーティングは、ＥＬＩＳＡにおいて抗体結合を評価した場合、きわめて貧弱な結果を与えた。ペプチドがポリスチレン固相に充分結合しなかったことが疑われたため、リンカーアームとして役立つことを役目とする３つのグリシン残基によりデカマーペプチド配列から分離した状態で、ペプチドのアミノ末端にビオチンを付着した点を除き、同じ要領でペプチドを再合成した。比較のために使用したペプチドは、以下のとおりであった。
ＴＭ−ＨＩＶ−１：
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−ＮＨ２
ＴＭ−ＨＩＶ−１　Ｂｉｏ
Ｂｉｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−ＮＨ２　ＴＭ−ＨＩＶ−２
Ａｃ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−ＮＨ２
ＴＭ−ＨＩＶ−２　Ｂｉｏ
Ｂｉｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−ＮＨ２
【０１１８】
ビオチニル化ペプチドを、ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレート上にロードした。これらのペプチドに対する抗体結合を、マイクロタイタプレート上に直接コーティングされた非ビオチニル化ペプチドに対する抗体結合と比較した。結果を表１に示す。ストレプトアビジンに結合したＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２膜貫通タンパク質からのビオチニル化ペプチドが、それぞれＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２に感染した人物からの抗血清により非常に良く認識されるということは明らかである。これは、ポリスチレンプレート上に直接コーティングされたこれらのペプチドの非ビオチニル化バージョンとは対照的である。さらなる対照実験は、共にマイクロタイタープレート上に直接コーティングした場合には、ビオチニル化ペプチド又は非ビオチニル化ペプチドの抗体認識に全く差がなかったことから、抗体結合の増加がビオチニル化ペプチドとストレプトアビジンとの間の特異的相互作用の結果であることを示した。
【０１１９】
いくつかのペプチド、特に長さが１５アミノ酸以上であるペプチドは、充分に固相に結合して、ペプチド配列内に存在するエピトープを認識する特異的抗体の検出を可能にする。
【０１２０】
ビオチニル化がより長いペプチドの抗体認識をも改善するか否かを確認するため、分離株ＨＩＶ−１ｍｎの部分的Ｖ３ループ配列のビオチニル化及び非ビオチニル化の両バージョンを合成した。両方のペプチドの配列及び合成方法は、アミノ末端において以外、同一であった。非ビオチニル化ペプチドは、単にアセチル化されただけであるが、一方ビオチニル化されたバージョンにおいては、ビオチニル部分からペプチドを分離するためのリンカーアームとして、２つのグリシン残基が付加された。
【０１２１】
使用された２つのペプチドの配列は以下のとおりである：
−　非ビオチニル化Ｖ３ｍｎペプチド
Ａｃ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−　Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２，
−　ビオチニル化Ｖ３ｍｎペプチド（ペプチド１ｂ．４）
Ｂｉｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２　。
【０１２２】
非ビオチニル化ペプチドは、ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェル上に直接コーティングしたが、一方、ビオチニル化ペプチドは、予めストレプトアビジンでコーティングしたウェルに結合させた。表２に示す結果は、ビオチニル化ペプチドに対する抗体結合が、プラスチック上に直接コーティングされたペプチドに対する抗体結合よりも優れているということを実証している。
【０１２３】
例５：抗体検出のためのビオチニル化ペプチド−アビジン複合体の使用
ペプチドをビオチニル化し、ストレプトアビジンに結合させた場合、このペプチドの抗体認識が改善されることを実証した後、ストレプトアビジンをアビジンで置換できるか否かを決定するためさらに実験を行なった。表３に示す結果は、それが事実であり、アビジンに結合されたビオチニル化ペプチドが特異的抗体によってきわめて効率良く認識されることを表わしている。
【０１２４】
例６：ＨＣＶ特異抗体の検出のためのビオチニル化ＨＣＶペプチドの使用
ビオチニル化ペプチドの強化された抗体認識が一般的な現象であるか否かを決定するために、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ポリタンパク質から誘導された配列に相当する付加的な２０アミノ酸の長さのペプチドを多数合成した。評価したアミノ酸配列は以下のとおりであった：
ａ．　　　　ＨＣＶペプチドＸＩ
Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ
ｂ．　　　　ＨＣＶペプチドＸＶＩ
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ
ｃ．　　　　ＨＣＶペプチドＩＩ
Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
ｄ．　　　　ＨＣＶペプチドＩＩＩ
Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ
ｅ．　　　　ＨＣＶペプチドＶ
Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ
ｆ．　　　　ＨＣＶペプチドＩＸ
Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ
ｇ．　　　　ＨＣＶペプチドＸＶＩＩＩ
Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
【０１２５】
各々のケースにおいて、２つのバージョンのペプチドを合成した。非ビオチニル化バージョンは、ペプチドをアミノ末端でアセチル化した。ビオチニル化バージョンは、全てＮ末端ビオチニル化した。２つのグリシン残基から成るリンカーアームにより、ビオチニル部分を、ＨＣＶ配列を含むアミノ酸から離した。
【０１２６】
非ビオチニル化ペプチドは、１ミリリットル当り３マイクログラムの濃度でポリスチレンマイクロタイターのウェル上に吸着させた。
【０１２７】
ビオチニル化ペプチドは、１ミリリットル当り１マイクログラムの濃度で、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレートに結合させた。これらのペプチドに対する抗体を含むことが知られている血清を、評価のために使用し、２０倍の希釈でテストした。これらの比較の結果を、表４ａ〜ｇに示す。
【０１２８】
これらの結果は、ストレプトアビジンに結合したビオチニル化ペプチドの抗体認識が、マイクロタイタープレートのウェル上に直接コーティングされたペプチドのものに比べ、高められていることを明らかに示している。
【０１２９】
例７：抗体検出に対するコーティング濃度の影響
プラスチック上の直接吸着に比べて高められたストレプトアビジン又はアビジンに結合したビオチニル化ＨＣＶペプチドの抗体認識について、さらに調べるため、ペプチドコーティング濃度の影響を調べた。マイクロタイタープレートのウェル１つ当り２００マイクロリットルの容積で、１ミリリットルにつき１０ナノグラム〜３マイクログラムまでの濃度で、３つのペプチド（ＨＣＶペプチドＩＩ、ＸＩ及びＸＶＩ）をコーティングした。直接コーティングのためには、これらのペプチドの非ビオチニル化バージョンを用いた。予めストレプトアビジンを吸着させたウェルをコーティングするために、これらのペプチドのビオチニル化バージョンを使用した。これらのペプチドに対する抗体を含むことが知られている血清を、１〜１００の希釈で使用して、抗体結合の程度を評価した。
この実験の数値的結果は、表５に示され、図３、ａ〜ｃではグラフに表わされている。
わずかな例外を除いて、テストされた最低の濃度（１ミリリットル当り１０ナノグラム、１ウェル当り２ナノグラム）においてさえ、ビオチニル化ペプチドが非常に良く認識されるということは明白である。数多くのケースにおいて、１ミリリットルにつきわずか３０ナノグラムのペプチド濃度（１ウェル当り６ナノグラム）で、到達可能な最大値に近い光学密度値が観察される。しかしながら、それとは対照的に、プラスチック上に直接吸着された非ビオチニル化ペプチドは、全くないとまでは言わないもののわずかしか抗体によって結合されない。
【０１３０】
例８：固相上でのペプチドのコーティング効率に対するペプチドのビオチニル化の影響
ペプチドを直接コーティングした場合のシグナルの欠如が、ペプチド吸着の欠如によるものか否かを決定するため、さらに実験を行なった。この場合、ペプチドのビオチニル化バージョンは、非ビオチニル化バージョンについての前の実験で用いられたものと同じ濃度でプラスチック上に直接コーティングした。ビオチン標識されたペプチドが結合したか否かを確かめるために、マイクロタイタープレートを、ストレプトアビジン：西洋ワサビペルオキシダーゼのコンシュゲートと共にインキュベートした。各ペプチドは単一のビオチニル基を含んでいることから、結果として得られる光学密度は、結合したペプチドの絶対量はわからないものの、結合したペプチドの量の１つの尺度である。図４にグラフで表わされている結果は、プラスチックに結合したペプチドを検出することができることを立証している。予想通り、曲線は各ペプチドについて異なっており、これはその化学的独自性を反映するものである。ペプチドのうちの２つ、すなわちＨＣＶペプチドＸＩとＸＶＩは、ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルに弱く結合するにすぎないように思われ、この弱い結合は、ＥＬＩＳＡにおいて得られた低い光度密度値に反映されている。ストレプトアビジンでコーティングされたウェルに対するビオチニル化ペプチドの結合は、非常に優れた抗体認識という結果をもたらすことから、ビオチンとストレプトアビジンとの間の相互作用を使用する場合には、固相に対するペプチドの貧弱な結合が、制限条件とはならないことは明白である。
【０１３１】
一方、ペプチドのうちの１つ、すなわちＨＣＶペプチドＩＩは、特に高い方のコーティング濃度において、固相に対して非常に有意な結合を示す。しかしながら、どんなコーティング濃度においてであれ、ペプチドを直接コーティングした場合に得られるシグナルが、ビオチニル化ペプチドをストレプトアビジンに結合させた場合に得られるシグナルと等しくなることはなかった。試験した最低濃度においてさえ、このペプチドのストレプトアビジンと結合したビオチニル化バージョンは、試験した抗血清で陽性シグナルを明らかに与えることから、結果は、このペプチドの直接コーティングが異常に効率が悪いか、又は固相に対するペプチドの単純な結合に加えてその他の要因が重要であることのいずれかを表わしていると思われる。
【０１３２】
定量するのは難しいものの、これらの要因の１つは、ペプチドが結合し、抗体結合に利用可能となる方法にほぼ確実に関与している。固相上に直接コーティングされるペプチドの場合、いくらかの割合のペプチド分子が、抗体認識にとっても必須のアミノ酸側鎖を通して固相と相互作用するであろうということは、事実上避けられない。従って、これらのペプチド分子は抗体との結合反応に参加することができないであろう。この問題は、ビオチンと、固相に結合したストレプトアビジンとの間の相互作用を通して、全て固相に結合されているビオチニル化ペプチドの場合には見られないものである。
【０１３３】
例９：特異的抗体認識のためのＣ末端ビオチニル化ＨＩＶペプチドの使用
そのカルボキシ末端でビオチニル化されたペプチドも、強化された抗体認識に使用できるか否かを決定するために、ＴＭ−ＨＩＶ−１ペプチドのカルボキシ−ビオチニル化バージョンを合成した。２０％ピペリジンでリンカー結合Ｆｍｏｃ基を除去した後、酸不安定性リンカー、４−（α−Ｆｍｏｃ−アミノ−２′，４′−ジメトキシベンジル）フェノキシ酢酸で官能化した樹脂に、上述のような方法Ａによって調製されたＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ビオチン）を、直接カップリンングした。樹脂官能基と比べて３倍モル過剰のＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ビオチン）を用いることにより、カップリングを行なった。カルボキシル基の活性化を、ＨＢＴＵ１当量、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１当量及びＮ−メチルモルフォリン１．５当量を用いて達成した。Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ビオチン）の完全な溶解を達成するために必要な４０パーセントのジメチルスルホキシドを含むジメチルホルムアミド中、０．６Ｍ　溶液としてＮ−メチルモルフォリンを施した。Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ビオチン）のカップリングに続いてＦｍｏｃ脱保護ピークを検査すると、カップリングがスムーズにかつ効率良く進んだことがわかった。ＴＭ−ＨＩＶ−１アミノ酸配列からビオチニルリジンを分離させるため、２つのグリシン残基をカップリングした。ペプチド合成に続いて、無水酢酸を用いてアミノ末端をアセチル化した。結果として得られたカルボキシビオチニル化ペプチドの構造は、アミノ末端でビオチニル化されたペプチドとはかなり異なっている。これらの構造の比較を図５に示す。
【０１３４】
これら２つのペプチドの抗体認識を評価するため、ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレートにペプチドを個別に結合させ、ＨＩＶ−１血清陽性ドナーからの抗血清パネルを用いて試験した。この比較の結果を表６に示す。明らかに、Ｃ末端でビオチニル化されたペプチドの抗体認識は、Ｎ−末端でビオチニル化されたペプチドの抗体認識と比べ、まさるとも劣らないものである。これらの結果は、同様に、カルボキシ末端ビオチニル化についての試薬Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ビオチン）の有用性をも確認している。
【０１３５】
例１０：直接コーティングされた（非ビオチニル化）又はストレプトアビジンでコーティングしたプレートに結合された（カルボキシ末端ビオチニル化）ＨＣＶペプチドＩの抗体認識の比較
カルボキシ−ビオチニル化形態のペプチドが、非ビオチニル化形態のペプチドに比べ、結果として優れた抗体認識をもたらすか否かを決定するため、ポリスチレンＥＬＩＳＡプレートに比較的よく結合するペプチドを用いて、類似の実験を行なった。選択されたペプチドはＨＣＶペプチドＩであり、これを以下のバージョンで合成した：
【０１３６】
ａ．非ビオチニル化バージョン：
Ｈ２Ｎ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−
Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−ＣＯＮＨ２
ｂ．カルボキシ−ビオチニル化バージョン
Ｈ２Ｎ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−
Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｉｏ）−ＣＯＮＨ２
Ｌｙｓ（Ｎ−ε−Ｂｉｏ）からペプチド自体のＨＣＶ部分を物理的に分離するため、カルボキシ末端に２つのグリシン残基から成るスペーサーを付加した。開裂時にカルボキシ末端アミドを生成させるため、４−（α−Ｆｍｏｃ−アミノ−２′，４′−ジメトキシベンジル）フェノキシ酢酸リンカーで官能化した樹脂上で合成を行なった。リンカーに対するＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ビオチン）のカップリングは、リンカーと比べ３倍モル過剰の中間生成物を用いて行なった。Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ビオチン）の活性化は、ＴＢＴＵ１当量、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１当量及びＮ−メチルモルフォリン１．５当量を用いて達成した。その他の全てのアミノ酸のカップリングは、従来のプロトコールに従って行なった。適切なスカベンジャーの存在下、トリフルオロ酢酸中でのペプチドの開裂に続いて、ペプチドを沈殿させ、ジエチルエーテルで抽出した。
【０１３７】
非ビオチニル化ＨＣＶペプチドＩは、炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中、１ミリリットル当り３マイクログラムの濃度で、ポリスチレンＥＬＩＳＡプレートのウェル上に直接コーティングした。ビオチニル化ＨＣＶペプチドＩは、１ミリリットルにつき１マイクログラムの濃度でペプチドを含む原液を用いて、ストレプトアビ　ジンでコーティングしたウェルに結合させた。次に、結果として得られたプレートを、平行して、ＨＣＶ−血清陽性ドナーからの血清のパネルと共にインキュベートした。この比較の結果を表７に示す。ビオチニル化されたペプチドは、明らかに、同じ配列の非ビオチニル化バージョンと比べて優れた結果を与えている。２つの血清（８３２６及び８２４４）は、非ビオチニル化バージョンに比べてはるかに良くこのペプチドのビオチニル化バージョンを認識している。抗体反応の特異性は、同様に、非感染ドナーからの５つの血清試料（Ｆ８８、Ｆ８９、Ｆ７６、Ｆ１３６及びＦ６）について得られた低い光学密度によっても反映されている。
【０１３８】
例１１：ビオチニル化ＨＩＶ及びＨＣＶペプチドの混合物の使用
数多くのケースにおいて、望ましい結果を得るために、ペプチド混合物の使用が必要となる。ペプチド混合物は、単一のウイルスの単数又は複数のタンパク質に対して向けられた抗体を検出するため、又は単一の試験において複数のウイルスのタンパク質に対して向けられた抗体を検出するために使用することができる。このような試験は、輸血のため及び血液製剤の供給源として使用する上での適性について献血をスクリーニングするために、特に有利であると考えられる。このような場合、好適なペプチド混合物でコーティングされたＥＬＩＳＡプレート又はその他の固体支持体を用いて、その存在が試料を使用に適さないものにしてしまう単数又は複数の感染性因子に対する抗体の存在について、試料をスクリーニングすることができる。特定の感染性因子の診断には、精確な決定を得るためにペプチドの適切な混合物が必要とされる。個々のペプチド又はペプチド混合物が、固相に結合されており、しかし、個々の反応を観察及び評価できるように、例えば直線免疫検定の場合のように物理的に分離されている試験システムを使用すれば、単数又は複数の感染性因子から誘導された個々のウイルス性抗原に対する抗体を、個々に検出し、同時に同定することが可能である。このような試験は、望ましい結果を達成するためには、ペプチド混合物の適切な組合せの使用を必要とする。
【０１３９】
往々にして、進行中の又は過去の感染の診断のために、単一のペプチドではなくむしろ複数のペプチドの混合物を使用することが好ましい。単一のエピトープに対する個々の応答はかなり可変的でありうるので、抗体試験においていくつかの免疫学的に重要なエピトープが存在する場合に、より信頼性の高い結果が往々にして得られる。しかしながら、各ペプチドは化学的に独特のものであるので、１つの試験の中に望ましいペプチドの全てを取込むことは、特にペプチドを固相上に直接コーティングしようとする場合に、往々にして困難である。全てのペプチドが固相に結合できるわけではなく、混合物中のペプチドは、ｐＨ、イオン強度及び緩衝液組成に関して非常に異なる最適コーティング条件を示しうる。
【０１４０】
ストレプトアビジン又はアビジンでコーティングしたプレートに結合させた場合に、混合物中でビオチニル化ペプチドがいかにうまく機能するかを決定するため、ＨＣＶ−１ペプチドＴＭ−ＨＣＶ−１（前記では１ａ．１と呼んでいる）及びＶ３−ｍｎ（前記では　１ｂ．４と呼んでいる）、ＨＩＶ−２ペプチドＴＭ−ＨＩＶ−２　（前記では２ａと呼んでいる）、ならびにＣ型肝炎ウイルスペプチドＩＩ、ＩＸ及びＸＶＩＩＩのＮ末端ビオチニル化バージョンの２つの混合物を作った。混合物Ａは、１ミリリットル当り１マイクログラム（合計で１ミリリットルにつきペプチド６マイクログラム）の濃度で６つのビオチニル化ペプチドの各々を含んでおり、一方、混合物Ｂには、１ミリリットル当り０．１マイクログラム（合計で１ミリリットル当りペプチド０．６マイクログラム）の濃度で各ペプチドが存在していた。個々のペプチドを、１ミリリットルにつき１マイクログラムの濃度でコーティングした。比較のために、混合物Ａ及びＢを、マイクロタイタープレートのウェル上に直接コーティングもした。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＨＣＶ−血清陽性ドナーからの試料を試験し、血清陰性血液ドナーからの血清と比較した。反応が陽性か陰性かを決定するため、０．２５０をカットオフ吸光度値とした。０．２５０以上の吸光度値を陽性とみなし、一方、この値より下の吸光度値は陰性とみなした。この実験の結果を表８に示す。
【０１４１】
個々のペプチドに対する反応に基づくと、ＨＣＶ血清試料は全て、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２のいずれかに対する抗体について陰性であった。１つのＨＩＶ−２試料（Ｎｏ．１４００）は、ＨＣＶペプチドＸＶＩＩＩに対する抗体を有していた。試験したＨＩＶ試料のうち、交叉反応性を示すものは全く存在せず、個々のペプチドに基づくＥＬＩＳＡは特異的である。
【０１４２】
混合物Ａ及びＢは、両方共、アビジンでコーティングしたマイクロタイタープレートに結合させた場合、優れた結果を与えた。予想通り、これらの混合物は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＨＣＶ陽性の血清によっては認識されたが、血清陰性血液ドナーからの血液によっては認識されなかった。これとは対照的に、これらの混合物をマイクロタイタープレート上に直接コーティングした場合、結果はかなり満足度の低いものであり、数多くの試料が、適用したカットオフ値よりも下に入る反応を与えた。これらの結果は、直接固相上にコーティングされたペプチドに比較して高められたアビジンに結合したビオチニル化ペプチドの免疫学的認識、ならびに複数の抗体検出のためにペプチド混合物を用いることの利点を、かなり説得力のある形で例示するのに役立つ。
【０１４３】
例１２：ＨＣＶの診断上有用な領域におけるエピトープのマッピングのためのビオチニル化ペプチドの使用
例６において、コア、ＮＳ４及びＮＳ５のようなＨＣＶポリタンパク質の診断上重要ないくつかの領域を、重複する２０−ｍｅｒ　の　ビオチニル化ペプチドを用いて同定できることが立証された。さらに広範に血清学的試験を行なうことにより、これらのビオチニル化ペプチドを利用した直線免疫検定の開発を可能にした最も有用な２０−ｍｅｒ　ビオチニル化ペプチドが同定された。しかしながら、これら２０アミノ酸の長さの配列中のどこにエピトープが位置しているかをより正確に知ることが望ましい。その理由の１つは、より短い配列が同定できた場合、ペプチドが極端に長くなることなく２つ又は３つのエピトープを含む合成ペプチドを作ることが可能になるという点にある。
【０１４４】
推定ＨＣＶタンパク質の１つの位置に存在するエピトープは、Ｇｅｙｓｅｎ，　Ｈ．Ｍ．，　Ｍｅｌｏｅｎ，　Ｒ．Ｈ．及びＢａｒｔｅｌｉｎｇ，　Ｓ．Ｊ．；　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　（１９８４）　８１：　３９９８−４００２によって初めて記載された方法を用いてマッピングされた。８アミノ酸の重複を伴う９アミノ酸の長さの連続的なペプチドを、開裂不可能なリンカーで誘導されたポリエチレンピン上で合成した。このペプチドの長さが選ばれたのは、それが、一般に５〜７アミノ酸の長さである標準的な線状エピトープのサイズよりも大きいためである。９−ｍｅｒｓを合成することにより、エピトープが見逃がされる確率は最小限におさえられることになる。
【０１４５】
ＨＣＶポリタンパク質の走査された領域は、コア配列（ａａ１〜８０）、ＮＳ４（ａａ１６８８〜１７５５）、及びＮＳ５（ａａ２１９１〜２３３０）を含んでいる。これらの領域は、予め決定された２０−ｍｅｒｓ、すなわちペプチドＩ〜ＶＩＩ（コア１〜１３）、ペプチドＶＩＩＩ〜ＸＩＶ（ＮＳ４−１〜９）及びペプチドＸＶ〜ＸＩＸ（ＮＳ５−１３〜３３）に相当する。
【０１４６】
合成の後、アミノ末端の天然でない正の電荷を除去するため、側鎖脱保護に先立って、全てのペプチドをＮ−アセチル化した。
その後、ペプチドを、ＨＣＶ血液陽性ドナーからの血清中に存在する抗体によって認識されるその能力について検定した。これらの実験の結果を図６ａ〜６ｃに示す。図示されている光学密度値は、重複した測定値の平均であり、９−ｍｅｒ　配列の最初のアミノ酸に割り当てられている。
【０１４７】
１０個の異なるＨＣＶ血清の抗体結合プロフィールを図６ａに示す。ＨＣＶのコアタンパク質が、合成ペプチドにより容易に刺激される明確な線状エピトープを呈するということは明らかである。少なくとも表面的には、ほとんどの血清はきわめて類似したパターンを示すように見える。しかしながら、より密に検査すると、個別の相違があることが明らかになる。抗体により認識されたＨＣＶコアタンパク質のさまざまな領域は、まちがいなく、各領域がポリクローナル血清を用いて区別することが不可能でなければ困難であるいくつかの重複するエピトープから構成されているので、恐らくそのままのエピトープというよりもむしろエピトープ性クラスターと呼ぶ方が適切であると思われる。これらのエピトープ性クラスターの各々におけるコアエピトープを同定するための試みを行なった。この意味で、「コア」という語は、抗体によって認識可能な最小限のアミノ酸配列のことを言う。しかしながら、コア配列に加えてアミノ酸が、特にポリクローナル血清の場合において反応性を改善しうるということを強調しておくべきであろう。エピトープの分析を表９に示す。さまざまな血清の反応を比較することにより、エピトープ性クラスターのサブドメインを同定することができた。いくつかの血清は１つのサブドメインと優先的に反応するが他のサブドメインとは反応せず、一方、その他の血清は全てのサブドメインを認識するものの、各々がその特定のエピトープ性クラスターを構成する大きいピークにおいて肩部を形成することから、なおもサブドメインの区別を許す。表９及び図７ａは、２０−ｍｅｒｓの配列との関係におけるコアエピトープの場所を示している。
【０１４８】
２０−ｍｅｒ　コアペプチドの各々に相当する一連の９−ｍｅｒｓを、試験した抗血清の１つに関する抗体認識プロフィールと関連させたこれらの配列の各々の位置づけと合わせて、図７ａに示す。
【０１４９】
１０の血清を用いて得られたＮＳ４に対する抗原プロフィールを、図６ｂに示す。一般に、９−ｍｅｒｓとこれらの血清との反応は、コアタンパク質からのペプチドとの反応に比べ、さほど強いものではなかった。それでもなお、ウイルス性ＮＳ４タンパク質のＮ末端配列内のエピトープ領域を同定することは可能であった。これらのエピトープのコア配列は表１０で分析されており、この領域において診断上重要な２０−ｍｅｒ　の合成ペプチドに対するその関係を示している。異なる２０−ｍｅｒｓに対応する９−ｍｅｒｓを、抗原プロフィールの一例と関連させたその位置づけと合わせて、図７ｂに示す。２０−ｍｅｒｓがこの領域内のエピトープにかなり良く対応していることがわかる。
【０１５０】
走査されたＮＳ５タンパク質の部分は、２０−ｍｅｒ　ペプチド１３〜３３により網羅される領域に相当する。この領域で得られた抗原プロフィールを図６ｃに示す。ここでも又、コアエピトープを定義づけする試みを行なった、これらを表１１に列挙する。この配列のアミノ末端部分には抗体結合はほとんど見られなかった。図７ｃには、２０−ｍｅｒ　ペプチドＮＳ５−２１〜ＮＳ５−３１に対応する９−ｍｅｒｓが列挙され、抗原プロフィールの１つと関連させたそれらの位置が示されている。
特に、ＨＣＶペプチドＸＶＩ（ＮＳ５−２７）によって表わされる配列の重要性は、重複する９−ｍｅｒｓを用いて得られた結果に基づくと著しく過小評価されたであろうということが明らかである。この配列の重要性は、同様に、マイクロタイタープレート上への直接コーティングに続くＥＬＩＳＡにおいて非ビオチニル化ＨＣＶペプチドＸＶＩ（ＮＳ５−２７）が評価された場合にも、過小評価されたであろう（表４Ｂ参照）。しかしながら、このペプチドのビオチニル化バージョンをストレプトアビジン又はアビジンでコーティングされたプレートに結合させた場合、診断上価値のある非常に重要なエピトープの存在が明らかになる。
【０１５１】
９−ｍｅｒｓの場合に見られる往々にして弱い結合とは対照的に、２０−ｍｅｒｓでの結合は、往々にして非常に強い（表１２参照）。いくつかのケースでは、相違は劇的である。例えば、血清８２４１はいずれの９−ｍｅｒｓも認識しないのに対し、ペプチドＨＣＶ２（ペプチドＩＸ）及びＨＣＶ５（ペプチドＸＩ）に対する結合は非常に強い。ペプチドＨＣＶ７（ペプチドＸＩＩＩ）に対する中程度の結合も観察された。このことは、２０−ｍｅｒｓには存在するが９−ｍｅｒｓには存在しないこれらのエピトープに対する重要な構造的成分が存在することを表わしていると思われる。
【０１５２】
例１３：ＨＣＶ直線免疫検定のＮＳ１領域のＮ末端におけるエピトープの同定のためのビオチニル化ペプチドの使用
エピトープは、直線免疫検定（ＬＩＡ）を用いても同定することができる。一般に、非ビオチニル化ペプチドは、ポリスチレンＥＬＩＳＡプレートに対してよりもナイロン膜に対してより良く結合する。それでもなお、ストレプトアビジン又はアビジンと複合体形成したビオチニル化ペプチドは、直線免疫検定において、膜に直接結合されたその非ビオチニル化対応物よりも優れた結果を与える。これを例示するため、ＨＣＶペプチドＸＸｇ−１及びＸＸｇ−２の非ビオチニル化及びＮ末端ビオチニル化バージョンを合成した。非ビオチニル化ペプチドは、１ミリリットル当り１００マイクログラムのペプチドを含む原液として膜に適用し、一方、ビオチニル化ペプチドは、ストレプトアビジンに結合させ、１ミリリットル当り１００マイクログラムの複合体の原液として適用した。従って、原液中のビオチニル化ペプチドの量は、１ミリリットル当り約１００マイクログラムであった。反応の強度を評価する上での助けとするため、３つのヒトＩｇＧ対照ラインをもストリップに適用した。抗原ラインの適用の後、膜上の余分な結合部位を、リン酸緩衝生理食塩水中のカゼインを用いてブロッキングした。その後、膜を、抗原ラインを適用した方向に対して垂直にストリップの形に裁断し、結果として得られたストリップを、ＨＣＶ血清陽性ドナーからの血清パネルと共にインキュベートした。結合した抗体を、酵素アルカリホスファターゼにコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートとニトロブルーテトラゾリウムを添加した後、視覚的に検出した。結果を図８に示す。
【０１５３】
反応の特異性は、ＨＣＶ血清陰性ドナーから得た３つの血清（３３、３４及び３５）によりＨＣＶペプチドのいずれかに対する検出可能な抗体結合の欠如によって実証される。非ビオチニル化ＨＣＶペプチドＸＸ−１及びＸＸ−２に対する血清１〜３２の反応は、一般に存在しないか又はきわめて弱い。これとは対照的に、試験した血清の多くは、ストレプトアビジンと複合体形成したこれらのペプチドのビオチニル化バージョンを認識した。ビオチニル化ペプチドに対する抗体反応は、非ビオチニル化ペプチドの原液中に存在する量に比較してこれらの原液中には約１０分の１の量のペプチドしか存在しなかったという事実にもかかわらず、有為に強いものである。ビオチニル化ペプチドを用いて得られた結果は、ペプチドの非ビオチニル化バージョンを用いた場合には明らかでないこれらのペプチド配列中の診断上有用なエピトープの存在を実証している。
【０１５４】
さらなる評価のため、異なるＨＣＶ分離株のＨＣＶ　Ｅ２−ＮＳ１領域の超可変性Ｎ末端にまたがる合計８つの配列（ＨＣＶポリタンパク質のａａ３８３〜４１６）を選択した。これらの整列させた配列（一文字コード）は以下のとおりである：
ＸＸａ　ＧＥＴＹＴＳＧＧＡＡＳＨＴＴＳＴＬＡＳＬＦＳＰＧＡＳＱＲＩＱＬＶＮＴ　（１）
ＸＸｂ　ＧＨＴＲＶＳＧＧＡＡＡＳＤＴＲＧＬＶＳＬＦＳＰＧＳＡＱＫＩＱＬＶＮＴ　（２）
ＸＸｃ　ＧＨＴＲＶＴＧＧＶＱＧＨＶＴＣＴＬＴＳＬＦＲＰＧＡＳＱＫＩＱＬＶＮＴ　（３）
ＸＸｄ　ＧＨＴＨＶＴＧＧＲＶＡＳＳＴＱＳＬＶＳＷＬＳＱＧＰＳＱＫＩＱＬＶＮＴ　（４）
ＸＸｅ　ＧＤＴＨＶＴＧＧＡＱＡＫＴＴＮＲＬＶＳＭＦＡＳＧＰＳＱＫＩＱＬＩＮＴ　（５）
ＸＸｆ　ＡＥＴＹＴＳＧＧＮＡＧＨＴＭＴＧＩＶＲＦＦＡＰＧＰＫＱＮＶＨＬＩＮＴ　（６）
ＸＸｇ　ＡＥＴＩＶＳＧＧＱＡＡＲＡＭＳＧＬＶＳＬＦＴＰＧＡＫＱＮＩＱＬＩＮＴ　（７）
ＸＸｈ　ＡＥＴＹＴＴＧＧＳＴＡＲＴＴＱＧＬＶＳＬＦＳＲＧＡＫＱＤＩＱＬＩＮＴ　（８）
【０１５５】
これらの配列は、以下のグループによって記載された分離株から誘導されている：
（１）　　Ｈｉｊｉｋａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍ．　１７５：２２０−２２８，　１９９１　。（２）　　結果未公開。
（３）　　Ｈｉｊｉｋａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍ．　１７５：２２０−２２８，　１９９１　。
（４）　Ｋａｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８７：９５２４−９５２８，　１９９０。
（５）　Ｔａｋａｍｉｚａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６５：１１０５−１１１３，　１９９１　。
（６）　Ｗｅｉｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１８０：８４２−８４８，　１９９１　。
（７）　Ｏｋａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊａｐａｎ．　Ｊ．　Ｅｘｐｔｌ．　Ｍｅｄ．６０：１６７−１７７，　１９９０。
（８）　Ｋｒｅｍｓｄｏｒｆｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｖ６４，ＨＣＶに関する第３回国際シンポジウム，　Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，　Ｆｒａｎｃｅ，　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，　１９９１　。
【０１５６】
配列がやや長く、合成中に二次構造に関連する問題点が発生することが予想されたことから、配列を、重複する２つの部分（「ａ」＝ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８３〜４０４、「ｂ」＝アミノ酸３９３〜４１６）に分割することが決定された。配列を細分割することによって、エピトープの位置がより正確に定義づけされ得ることにもなる。
【０１５７】
ペプチドは、全てＮ末端ビオチニル化し、ストレプトアビジンと複合体形成させ、ＬＩＡストリップの調製に使用した（データは示さず）。
【０１５８】
ＬＩＡ陽性試料のみを考慮した場合、Ｅ２／ＮＳ１ペプチドに関する検出率は、およそ９０パーセント台であることがわかった。Ｅ２／ＮＳ１ペプチドの認識とＬＩＡ反応性との間の相関関係ならびに個々のペプチドに対するスコアを、表１３に示す。観察された反応から、この配列中の一次エピトープが超可変領域のカルボキシ末端に向かって位置していることも同様に明らかであった。ただし、これには例外があった。各々の血清は、このエピトープがＬＩＡにおいて１本のラインとして含まれる場合、異なる配列の混合物を用いることの重要性を過小評価する独自の認識パターンをもつように思われた。同様に、タイプ１ａとタイプ１ｂの配列の間にはかなりの程度の交叉反応性が存在するか、又は大部分の人々が二重感染しているかのいずれかであるとも思われた。１つの配列に結合する抗体を選択的に除去し、その他の配列の抗体認識に対する効果がいかなるものであるかを見ることによって、これら２つの可能性を区別することは単純なことである。多くの試料が、１つ又はそれ以上のＥ２／ＮＳ１ペプチドに対してやや弱い反応を与えたものの、ＬＩＡ陰性であった。擬陽性反応である確率が最も高いものの、これらの血清は、以前に感染したものの感染を消滅させた人からのものである可能性もある。
【０１５９】
例１４：ＬＩＡによる抗体の検出のための、ＨＣＶのコア領域からの組合されたＨＣＶペプチドの使用
ＨＣＶのＥＬＩＳＡ又はＬＩＡにおけるペプチドの総数を減少させるため、その他の免疫学的に重要なペプチドにまたがるビオチニル化ペプチドを合成することができる。ＨＣＶのコアタンパク質ＮＳ３領域からのこのような「組合わされた」ＨＣＶペプチドの例を、以下に示す：
【０１６０】
【表２６】
Figure 2004002379
【０１６１】
これらのペプチド全てには、アミノ末端に１つのビオチンとＧｌｙ−Ｇｌｙスペーサーが備えられていた。ペプチドを、直線免疫検定実験（ＬＩＡ）において評価し、より短いコアペプチドと比較した。結果を図９に示す。より長いコアは、より短いペプチドに比べて好ましく、一貫してより強い反応を示す。これは、（ｉ）長い方のペプチドが、以前は２つの別々のペプチド上に広がっていた２つ以上のエピトープを取り込んでいる場合、及び／又は（２）長い方のペプチドにおいてさらに卓越したものでありうる何らかのコンフォーメーション上の貢献が存在する場合に、説明しうる。
【０１６２】
例１５：ＬＩＡによる抗体の検出のための、ＨＣＶのＮＳ４及びＮＳ５領域からの組合されたＨＣＶペプチドの使用
その他のペプチドにおいては、次のもののようなＮＳ４及びＮＳ５内の配列が組合わされている：
【０１６３】
【表２７】
Figure 2004002379
【０１６４】
より長いペプチドを使用することの一般的利点は、ＥＬＩＳＡ又はＬＩＡにおけるその使用が、免疫学的に重要なエピトープを担持するその他のペプチドを取り込むためのより多くのスペースを残すという事実にある。
【０１６５】
例１６：ＬＩＡによる抗体の検出のための、型特異的ＨＣＶＮＳ４ペプチドの使用
ＮＳ４のエピトープを含むことがわかった１型ペプチドに対応するＨＣＶ２型及び３型ＮＳ４配列を含む等価ペプチドを合成した。比較のために、これらのペプチドの配列を以下に示す：
【０１６６】
【表２８】
Figure 2004002379
【０１６７】
ＬＩＡストリップを、これらの９つのペプチドを用いて調製し、それを、その後、異なる血清を用いてインキュベートした。結果を図１０に示す。１型のＮＳ４ペプチドに関して以前陰性であった血清のうちの２つが、３型及び２型のペプチドに対して陽性の反応を示した。このことは、これらのペプチドを用いてＮＳ４検出率を増大することが可能であることを表わしている。
【０１６８】
例１７：ＨＩＶ抗体の検出のための直線免疫検定における、異なるＨＩＶ−１分離株のｇｐ１２０のＶ３ループ領域からのビオチニル化ペプチドの使用
ｇｐ１２０のＶ３ループ領域の一般的な診断上の価値を決定するために、９つの異なるＨＩＶ−１分離株のこの領域から誘導された９つのペプチドを合成し、ＬＩＡに用いた。９つのペプチドは全て、Ｇｌｙ−ＧｌｙスペーサーとＮ末端ビオチンを備えていた。整列させたペプチド（一文字アミノ酸コード）配列は、以下のとおりである：
ＣＯＮ　　　ＮＮＴＲＫＳＩＨＩ−−ＧＰＧＲＡＦＹＴＴＧＥＩＩＧ　　　２３
ＳＦ２　　ＮＮＴＲＫＳＩＹＩ−−ＧＰＧＲＡＦＨＴＴＧＲＩＩＧ　　　２３
ＳＣ　　　ＮＮＴＴＲＳＩＨＩ−−ＧＰＧＲＡＦＹＡＴＧＤＩＩＧ　　　２３
ＭＮ　　　ＹＮＫＲＫＲＩＨＩ−−ＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮＩＩＧ　　　２３
ＲＦ　　　ＮＮＴＲＫＳＩＴＫ−−ＧＰＧＲＶＩＹＡＴＧＱＩＩＧ　　　２３
ＭＡＬ　　ＮＮＴＲＲＧＩＨＦ−−ＧＰＧＱＡＬＹＴＴＧ−ＩＶＧ　　　２２
ＢＨ　　　ＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＩ−Ｇ　　　２４
ＥＬＩ　　ＱＮＴＲＱＲＴＰＩ−−ＧＬＧＱＳＬＹＴＴ−ＲＳＲＳ　　　２２
ＡＮＴ７０　ＱＩＤＩＱＥＭＲＩ−−ＧＰ−ＭＡＷＹＳＭＧ−ＩＧＧ　　　２１
【０１６９】
ペプチドを、ビオチン結合部位に対しわずかにモル過剰のストレプトアビジンと混合し、ペプチド：ストレプトアビジン複合体を、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５上で未結合の物質から分離した。ボイド容量中に溶出する材料を、ＬＩＡの調製に使用した。
【０１７０】
さまざまな地理的地域から得られた合計３３２の血清を試験した。ヨーロッパ又は北米で単離されたウイルス株が、アフリカの分離株と比べて低い株ごとの変動性を示すことがわかっているため、Ｖ３−ループ配列認識における地理的な差は予想されるものであった。さまざまなラインの反応を、陽性（ｉ）又は陰性（ｏ）として評価した（データは示さず）。
【０１７１】
血清の完全な評価を表１４に示す。合計で、３３２のうち３０７の血清が、Ｖ３−ループＬＩＡに関して少なくとも１つのペプチドに対する反応を示した。Ｖ３−ループＬＩＡでいかなるペプチドに対しても反応を示すことのなかった血清は、ウェスタンブロット法で試験して、その血清が本当に抗ＨＩＶ−Ｉ抗体について陽性であったか否かを決定した。６つの血清が実際には陰性であることがわかった。従って、試験した陽性血清の合計数は３２６であった。しかしながら、Ｖ３−ループＬＩＡのいずれとも反応しなかったｇｐ１２０に対する抗体を含む血清が１９あり、陽性反応を示す血清のパーセンテージは、包括的に言って９４％であった。しかしながら、著しい地理的差異が存在していた。これらの差異を表１５に示す。
【０１７２】
少なくとも１つの陽性反応を示す異なる地理的地域からの血清の合計パーセンテージは、以下のように要約できる：
ヨーロッパ　　　　１００％
アフリカ　　　　　　９４％
ブラジル　　　　　　９２％
ヨーロッパの試料を用いてさらに評価すると、このパーセンテージが実際には１００％より幾分か低いものであるということがわかる（データは示さず）。ＬＩＡにおいて反応を示さなかったアフリカの試料は、その他のＨＩＶ抗体の存在を確認するべくウェスタンブロット法によって試験されなかった。
【０１７３】
ヨーロッパの血清が優れたスコアを示すことは、予想されていた。アフリカの血清について得られたより低いスコアも、アフリカにはより高いウイルスの不均一性が存在することがわかっているため、全く予想外ではなかった。ＨＩＶのアフリカ株のＶ３−ループ配列はヨーロッパや北米の株ほど広範に特徴づけされていなかったため、我々が代表的配列をもっていないか、又はあまりにも配列多様性が大きすぎるので、コンセンサス配列に関してアフリカ株を特徴づけしようとすることは不可能であることが明白である。ブラジルの血清を用いて得られた結果は、ブラジルにおけるＨＩＶ変動性に関してこれまで何も報告されていなかったことから、予想できないものであった。これらの結果から、ブラジルにおける状況は、アフリカの状況とより密接に似通っており、北米又はヨーロッパの状況とは似通っていないと思われる。
【０１７４】
例１８：ブラジル分離株から誘導されたＶ３配列を用いたブラジルの血清中のＨＩＶ−１抗Ｖ３ドメイン抗体の改良型検出
前述のＬＩＡストリップ上に存在するどのＨＩＶ−１Ｖ３ループ配列も認識しなかったが、ウェスタンブロット上のＨＩＶ−１ｇｐ１２０タンパク質を認識する抗体については陽性であったブラジルの血清試料を、さらなる研究のために選択した。これらの試料のうちの１つにおいて、血清試料中に存在するウイルスのＶ３ループ配列を、超可変ドメインに隣接するより定常的な領域から誘導されたプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅することができた。結果として得られたＤＮＡフラグメントを、続いてクローニングし、ヌクレオチド配列を決定した。このフラグメントによりコードされる推定アミノ酸配列に相当するペプチドを合成し、さまざまなＨＩＶ−１抗体陽性血清によって認識されるその能力について試験した。このペプチドの配列は、以下のとおりであった：
ペプチドＶ３−３６８：
Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ
Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ
【０１７５】
２つのグリシン残基から成るスペーサーを、アミノ末端に付加した。その後、結果として得られたＮ末端グリシン残基をビオチニル化した。ヨーロッパ、アフリカ及びブラジルのＨＩＶ−１抗体陽性血清がこのペプチドを認識する能力を調べ、これら同じ血清のＥＬＩＳＡにおけるコンセンサス配列ペプチド認識能力と比較した。同様に、２つのペプチドを１つの混合物として一緒に評価した。これらの結果を表１６に要約する。これらの結果は、ヨーロッパ又はアフリカ産の血清を用いる場合、Ｖ３−３６８ペプチドが、Ｖ３ｃｏｎペプチドで見られるものに比べて増大した抗Ｖ３ループ抗体の検出という結果をもたらさないことを立証している。それとは対照的に、Ｖ３−３６８ペプチドの使用は、ブラジルの血清でのＶ３抗体検出において著しい改善をもたらす。このペプチドはＶ３ｃｏｎペプチドに比べて少ない頻度で認識されるが、２つのペプチドは互いに相補って、検出率を、Ｖ３ｃｏｎペプチドを単独で用いた場合の８３．３パーセントから２つのペプチドを一緒に用いた場合の９７．２パーセントまで上昇させる。
【０１７６】
例１９：ＨＩＶ−２Ｖ３ループ配列の抗体認識
ＨＩＶ−２の外膜糖タンパク質（ｇｐ１０５）は、その編成に関してＨＩＶ−１のそれと類似している。ＨＩＶ−１のｇｐ１２０タンパク質と同様に、ＨＩＶ−２のｇｐ１０５タンパク質は、比較的保存されたアミノ酸配列のドメインと隣接する可変的配列のドメインから成る。このウイルスによる感染に応答して産生されたＨＩＶ−２のＶ３ドメインに対して特異的な抗体を検出するため、ＨＩＶ−２／ＳＩＶ分離株ＧＢ１２及び分離株ＳＩＶｍｍ２３９のＶ３配列に対応するビオチニル化ペプチドを合成した（Ｂｏｅｒｉ，　Ｅ．，　Ｇｉｒｉ，　Ａ．，　Ｌｉｌｌｏ，　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ；　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．　（１９９２）　６６　（７）：　４５４６−４５５０）。合成されたペプチドの配列は、以下のとおりである：
Ｖ３−ＧＢ１２：
Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ
Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ
Ｖ３−２３９：
Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ
Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ａｓｐ
【０１７７】
スペーサーとして役立つよう各ペプチドのＮ末端に２つのグリシン残基を付加し、結果として得られたＮ末端グリシンのα−アミノ基にビオチンをカップリングした。ペプチドをストレプトアビジンに結合させ、マイクロウェルプレートのウェル内をコーティングした。ＥＬＩＳＡにおいてこれら２つのペプチドを評価するため、ＨＩＶ−２抗体陽性血清を使用した。これらの結果を表１７に要約する。これらの結果は、ＨＩＶ−２感染の診断に対するこれら２つのペプチド配列の有効性を明らかに立証している。
【０１７８】
例２０：ビオチニル化ペプチドを用いたＣ−１００のカルボキシ末端におけるエピトープの局在化
Ｃ−１００タンパク質のカルボキシ末端部分に向かって位置するエピトープについては、さまざまな報告書が存在してきた（ＥＰ−Ａ−０　４６８　５２７、ＥＰ−Ａ−０　４８４　７８７）。５−１−１フラグメント内に位置するエピトープに対してではなく、このエピトープに向かってのある種の血清の反応性によって、これらの血清が、何故Ｃ−１００に関しては陽性反応を示すが上述の例に記されている上述のペプチドに対しては示さないのかを説明することができた。合成された５つの重複するビオチニル化ペプチド、ＮＳ４−ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅを図１１に示す。これらは、最後の３つのアミノ酸を除いてＣ−１００のカルボキシ末端を網羅している。これらのペプチドを用いて調製したＬＩＡストリップを、一連のＨＣＶ抗体（Ａｂ）陽性及び陰性血清を用いて試験した。この実験の結果（データは示さず）を以下に要約する：
ペプチド　　　　　反応性血清の数　　　　パーセンテージ
ＮＳ４−ａ　　　　　　　０　　　　　　　　　０％
ＮＳ４−ｂ　　　　　　　２　　　　　　　　　３％
ＮＳ４−ｃ　　　　　　　０　　　　　　　　　０％
ＮＳ４−ｄ　　　　　　　０　　　　　　　　　０％
ＮＳ４−ｅ　　　　　　１６　　　　　　　　２７％
【０１７９】
例２１：異なるＨＣＶタンパク質からのエピトープを含むビオチニル化されたハイブリッドペプチドの使用
９−ｍｅｒｓを用いたＨＣＶポリタンパク質の免疫学的に最も重要な領域におけるエピトープの詳細なマッピングを、例１２に示すとおりに行なった。この情報を用いて、２アミノ酸の長さのスペーサーで分離されたＨＣＶ配列の３つの９−ｍｅｒ　ストレッチから成る３つのペプチド配列が考案された。一般に、鎖の柔軟性を提供するため、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ又はＳｅｒ−Ｇｌｙスペーサーが用いられた。合成された３つのハイブリッドペプチド内のエピトープの配置及びその配列を、図１２に示す。ＬＩＡストリップ上で３つのペプチドを評価した。第１の評価では、エピトープの詳細マッピング実験で当初用いた血清がエピトープとの精確な相互作用が知られていることから、これらの血清を用いた。これらの結果を、図１３に示し、表１６に要約する。エピトープがこれら３つのハイブリッドペプチドに取り込まれる順序は任意であった。しかしながら、個々の９−ｍｅｒｓに基づく試験を開発しようとするよりは、むしろエピトープを合わせて、限られた数のペプチド鎖にリンケージさせることが有利である。別々の９−ｍｅｒｓを使用すると、プレート上のストレプトアビジン結合部位（１つの９−ｍｅｒｓ当り１つの　ビオチン結合部位）は急速に飽和し、一方、これらの実験において行なったように限られた数のペプチド内に９−ｍｅｒｓを取り込ませれば、１つが３倍の結合を行なうことが可能になる（３つの９−ｍｅｒｓにつき１つのビオチン結合部位）。
【０１８０】
例２２：Ｅ２／ＮＳ１「ｂ」配列ミクソトープペプチド
合成ペプチドを用いた結果（上記の例を参照）は、大部分のＨＣＶ血清陽性の血清がＥ２／ＮＳ１の超可変Ｎ末端に向けられた抗体を含んでいることを表わしていた。しかしながら、このタンパク質のこの領域の超可変性のため、許容可能なほど高いパーセン　テージの血清においてこれらの抗体を検出するには、かなり広範な配列スペクトルを使用することが必要である。利用可能な配列の分析は、観察されたアミノ酸置換が完全に無作為のものでなく、配列内のある位置にはあるアミノ酸が好まれるということを明らかにした。超可変配列はかなり長いものであるため、生成物の質を改善し合成を単純化するため、この配列を、重複する２つの部分（「ａ」及び「ｂ」）に分割した。この領域を細分割することにより、抗体により最も頻繁に認識されるＥ２／ＮＳ１タンパク質のこのＮ末端セグメントの部分が、これらの配列の「ｂ」バージョンに包含される領域の中に位置するということも、決定することができた。図１４に示す配列情報に基づいて、検査した天然の分離株に見られる全てのアミノ酸を各位置に含む「ミクソトープ」を合成した。　ミクソトープの合成において用いた戦略を、図１５に記す。ミクソトープを設計するための戦略は、Ｇｒａｓ−ｍａｓｓｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｒｅｓ．　（１９９２）５：２１１−２１６において総説されている。樹脂は、カップリングすべきアミノ酸の数に等しい数の部分に分割した。カップ　リング反応は、さまざまなアミノ酸の間でのカップリング動態の差により生じる問題を避けるため、個別に行なった。カップリング反応の後、樹脂部分をプールし、よく混合した。この２３アミノ酸の長さの配列について得られた変異体の合計数は、＋１．１４７×１，０１０であった。カルボキシ末端又はアミノ末端から測定した鎖の長さの関数としての増大する変異体数を、図１４に示す。ミクソトープアプローチの背後にある原理は、エピトープが、抗体結合に対する貢献度が等しくないアミノ酸で構成されているということである。抗体は、いくつかの位置において比較的多数の（一般に無作為でない）置換があったとしても、１つのエピトープを認識する可能性がある。この点に関して、ミクソトープの抗原的複雑性は、混合物を含む変異体の数よりも実質的に小さいはずである。例示を目的として、平均的エピトープの長さが６アミノ酸であると仮定したならば、配列内の連続した６つのアミノ酸という長さをもつセグメントの各々について変異体数を計算することが可能である。配列内の位置の一関数としての変異体数を、図１４に示す。機能的変異体配列の実際の数は、偶然１つのエピトープに相当する６アミノ酸の長さのあらゆる配列について示された数を、エピトープの各位置における許容される置換の数に等しい縮重係数で割り算した数に等しくなるが、しかし特定の置換が許容される度合を反映するべく修正された。残念なことに、エピトープの正確な位置はわかっていない。これが無作為のペプチドライブラリーでないということは明白に述べておくべきである。天然の分離株におけるアミノ酸変異の欠如によって明らかにされているように、合計配列中の置換を許容しない主要な位置が保存される。この合成アプローチに関する１つの欠点は、稀なアミノ酸置換が過度に代表され、より一般的に遭遇するアミノ酸を減殺する傾向をもつということにある。一方、稀な置換の過度の代表が、より頻繁に遭遇するアミノ酸を含むエピトープ配列で検出不可能な抗体の検出を許す可能性がある。ミクソトープの合成の完了後、免疫学的評価を容易にするため、全てのペプチド鎖に（Ｇｌｙ）２　スペーサー及びビオチンを備えさせた。ミクソトープの多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）も、平行して合成することができる。
【０１８１】
以前の研究の１つの結果は、ＨＣＶ陽性血清の約９０パーセントが、調査された１６の「ａ」及び「ｂ」配列を伴うＮ末端超可変領域に対して向けられた抗Ｅ２／ＮＳ１抗体を含むことが立証できたということにあった。残りの１０パーセントのＨＣＶ抗体陽性血清におけるこれらの抗体の見かけ上の欠如は、１）患者がＥ２／ＮＳ１のこの部分に対する抗体を産生しなかったか、又は２）これらの抗体を検出する正しい配列がまだ同定されていなかったという２つの要因によるものであることが考えられた。ＨＩＶ−１Ｖ３ループでの実験に基づくと、この後者の可能性は全く非現実ではないと思われる。ミクソトープに加えて以前に用いた８つの「ｂ」配列を含むＬＩＡストリップを調製した。８つの規定された配列のうち少なくとも１つについて以前陽性とスコアされた血清ならびに陰性とスコアされた血清を選択した。合計で６０の血清を試験し、そのうち５６は以前に陽性反応を示したものであり、４つは以前に陰性であることがわかったものであった。以前陽性とスコアされた５６の血清のうち、２１はストリップ上のペプチドのうちわずか　１つ又は２つと反応するか、又は非常に弱い反応を示した（データは示さず）。ミクソトープは、試験した全ての血清の約３分の１によって認識された。いくつかの血清のミクソトープに対する反応は驚くほど強かったが、ミクソトープの基礎となったＥ２／ＮＳ１配列の収集物は真に代表的なものではなかった可能性がある。ミクソトープＭＡＰは、Ｅ２／ＮＳ１のアミノ末端に対して向けられた特異性の広い抗血清の産生を惹起することが予想される。
【０１８２】
例２３：抗体を産生させるための、分岐状ＨＣＶ　Ｎ末端Ｅ２／ＮＳ１領域ペプチドの使用
Ｅ２／ＮＳ１のＮ末端からのいくつかの配列を、Ｔａｍ　（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８５：　５４０９−５４１３，　１９８８）により記載された技術を用いて多重抗原ペプチド（ＭＡＰ’ｓ）として合成するために選択した。分岐状ペプチドを合成するのに用いた戦略を、図１６に概略的に示す。初回注射をウサギ（各ＭＡＰにつき２匹）に施し、１回追加免疫（ブースト）してから、抗体産生の第１回目の評価のため採血した。合計１６のＥ２ペプチド（８つの１型分離株から誘導された配列の、各々の「ａ」及び「ｂ」バージョン）を含むＬＩＡストリップ上で抗血清を試験した。ＬＩＡストリップを検査したところ、ウサギの体内で産生させた抗体とストリップ上のさまざまなＥ２ペプチドとの間には著しい交叉反応が存在することがわかる（図１７）。異なる抗血清によって認識される「ａ」及び「ｂ」の両方のバージョンが見い出されうるという事実は、これら２つのバージョンが重複する領域内に少なくとも１つのエピトープが位置しているということを表わしている。
【０１８３】
例２４：ビオチニル化合成ペプチドを用いたＨＴＬＶ感染の診断
ＨＴＬＶ−Ｉ及びＩＩは、抗原的に関連する、発ガン性レトロウイルスのファミリーのメンバーである。ＨＴＬＶ−Ｉ感染は、２つの疾患症候群、すなわちＨＴＬＶ−Ｉ関連骨髄症／熱帯性痙性不全対麻痺（神経障害）及び成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）と関連していることが立証されている。これとは対照的に、ＨＴＬＶ−ＩＩは、既知のいかなる疾患症候群とも決定的に結びつけられていない。このウイルスは、元来ヘアリーセル白血病患者から分離されたものであるが、ＨＴＬＶ−ＩＩ感染と該疾患状態との間にはいかなる因果関係も確立されていない。ＨＴＬＶ−Ｉ感染が人間の病気をひき起こす可能性をもつことが決定的に実証されてきた一方で、ＨＴＬＶ−ＩＩ感染については実証されていないことから、これら２つの感染性因子を区別できることは、臨床学的に興味深い。これら２つのウイルスは、抗原的に高度の関連性を有することから、抗体検出のためにウイルス性又は組換え型抗原を用いる場合、ＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩを区別することは困難である。数多くのビオチニル化ペプチドを合成し、ＨＴＬＶ−Ｉ又はＨＴＬＶ−ＩＩによる感染に応答して産生された抗体を検出するその能力について評価した。これらのペプチドのうちいくつかは、それらがＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−ＩＩの間で高度に保存されているエピトープを含み、従ってウイルスタイプとは無関係にＨＴＬＶ感染を検出するための有効な試薬となるはずであることを理由として、選択された。さらにその他のペプチドは、それらがＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−ＩＩの感染を区別できるようにするはずのエピトープを含んでいることを理由として選ばれた。合成したペプチドは以下のとおりである。
【０１８４】
Ｉ−ｇｐ４６−３：
Ｂｉｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ
Ｉ−ｇｐ４６−５：
Ｂｉｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ
Ｉ−ｇｐ４６−４：
Ｂｉｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ
Ｉ−ｇｐ４６−６：
Ｂｉｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ
Ｉ−ｐ２１−２：
Ｂｉｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ
Ｉ−ｐ１９：
Ｂｉｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ
ＩＩ−ｇｐ５２−１：
Ｂｉｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ
ＩＩ−ｇｐ５２−２：
Ｂｉｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ
ＩＩ−ｇｐ５２−３：
Ｂｉｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ
ＩＩ−ｐ１９：
Ｂｉｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ
【０１８５】
多数のこれらのペプチドを用いて、ＨＴＬＶに対する抗体の検出のためのＬＩＡストリップを調製した。これらのペプチドのいくつか、例えばそれぞれＨＴＬＶ−Ｉ　ｐ１９ｇａｇタンパク質及びエンベロープ糖タンパク質の領域から誘導されたＩ−ｐ１９及びＩ−ｇｐ４６−４のようなペプチドが、２つのウイルスにおいてこれらの配列がきわめて相同性が高いことから、ＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩの両方の感染の結果として産生された抗体によって認識されると予想される。ＨＴＬＶ−ＩについてはＩ−ｇｐ４６−３、Ｉ−ｇｐ４６−６、そしてＨＴＬＶ−ＩＩについてはＩＩ−ｇｐ５２−１、ＩＩ−ｇｐ５２−２及びＩＩ−ｇｐ５２−３といったその他のペプチドは、抗体の検出ならびに区別に有用でありうる。ＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−ＩＩの配列の間には幾分かの相同性があることから、交叉反応が予想される。しかしながら、さまざまなペプチドに対する反応の強さは、抗体の産生された対象であるウイルスのアイデンティティを明らかにするはずである。
【０１８６】
多数のビオチニル化されたＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩペプチドを用いて調製したＬＩＡストリップの例を、図×××に示す。ＬＩＡストリップは、市販の血清パネル（Ｂｏｓｔｏｎ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ　Ｉｎｃ．，混合タイターパネル、ＰＲＰ２０３）を用いて評価した。テスト結果は、販売業者が提供した分析と完全に一致している。ＨＴＬＶ−Ｉに対してはわずか１つの試料（ｎｒ．９）のみが陽性であった。
試料ｎｒ．１２は、ペプチドＩ−ｐ１９に対する陽性反応のために陽性として検出されている。この試料は、これらのペプチドを用いて識別することができず、又、血清パネルの販売業者により用いられたその他のいかなる試験によっても識別できなかった。試料ｎｒ．１１は陰性であり、その他全ての試料はＨＴＬＶ−ＩＩに対して陽性であることがわかった。付加的な実験において、ビオチニル化されたＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩペプチドを１０個全て用いてＥＬＩＳＡを行なった。ペプチドをストレプトアビジンと個別に複合体形成させ、次にコーティングに先立って混合した。ＬＩＡストリップを評価するために用いたパネルからの試料のいくつかを用いて、ＥＬＩＳＡにおいてペプチドを評価した。これらの結果を表に示す。この形態でのＥＬＩＳＡは、ＨＴＬＶ−Ｉ及び−ＩＩ感染を区別するのに使用できないが、ウイルスタイプの如何にかかわらずＨＴＬＶ陽性試料全般を同定するはずである。この結果は、さらに、ＨＴＬＶ感染の診断のためのこれらのペプチドの有用性を立証している。
【図面の簡単な説明】
図及び表に記載の試料及び血清は全て、ウイルス性作用物質による自然に生じる感染の結果として産生される抗体を含む、無作為に選択された試料及び血清である。
【図１−１】Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−リジン（Ｎ−ε−ビオチン）の合成のための戦略を表わす。
より特定的には、方法Ａは、Ｎ−ε−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ｔＢｏｃ）からのＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ビオチン）の合成に対応し、方法Ｂは、Ｎ−ε−ビオチニルリジンからのＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ビオチン）の合成に対応する。
【図１−２】Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−リジン（Ｎ−ε−ビオチン）の合成のための戦略を表わす。
より特定的には、方法Ａは、Ｎ−ε−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ｔＢｏｃ）からのＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ビオチン）の合成に対応し、方法Ｂは、Ｎ−ε−ビオチニルリジンからのＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ビオチン）の合成に対応する。
【図２】上述の中間生成物及び中間化合物の調製に関与する前駆物質の逆相クロマトグラフィで得られたダイヤグラムを表わす。
逆相クロマトグラフィは、以下の条件下で行なった。
−　勾配仕様：
緩衝液Ａ：Ｈ２　Ｏ中、０．１％ＴＦＡ
緩衝液Ｂ：アセトニトリル中、０．１％ＴＦＡ
カラム：Ｃ２／Ｃ１８逆相（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，　Ｐｅｐ−Ｓ）、
検出波長：２５５ナノメートル；
−　勾配：
０〜１分　　　　　０％Ｂ
１分〜６０分　　　０％Ｂ〜１００％Ｂ
６０分〜７０分　　０％Ｂ
第１のダイヤグラムは、方法Ａに対応し（図１参照）、第２のダイヤグラムは方法Ｂに対応する（図１参照）。
【図３ａ】（ＥＬＩＳＡにおいて）ＨＣＶペプチドＩＩに結合する抗体を表わす。
上部左側の曲線は、試料８３２０に対応する。
上部右側の曲線は、試料８２４２に対応する。
下部左側の曲線は、試料８２４３に対応する。
下部右側の曲線は、試料８３１８に対応する。
これらの試料の各々において、光学密度（４５０ｎｍでの）は、μｇ／ｍｌ単位で表わしたコーティング濃度に対してプロットされている。
十字記号を付した曲線は、非ビオチニル化ＨＣＶペプチドＩＩに対応し、点を付した曲線はビオチニル化されたＨＣＶペプチドＩＩに対応する。
【図３ｂ】（ＥＬＩＳＡにおいて）ＨＣＶペプチドＸＩに結合する抗体を表わす。
上部左側曲線は、試料８３２０に対応する。
上部右側曲線は、試料８３２６に対応する。
下部左側曲線は、試料８２４２に対応する。
下部右側曲線は、試料８２４３に対応する。
これらの試料の各々において、光学密度（４５０ｎｍでの）は、μｇ／ｍｌ単位で表わしたコーティング濃度に対してプロットされている。
十字記号を付した曲線は、非ビオチニル化ＨＣＶペプチドＸＩに対応し、点を付した曲線はビオチニル化されたＨＣＶペプチドＸＩに対応する。
【図３ｃ】（ＥＬＩＳＡにおいて）ＨＣＶペプチドＸＶＩに結合する抗体を表わす。
上部左側曲線は、試料８３２６に対応する。
上部右側曲線は、試料８２４２に対応する。
下部左側曲線は、試料８２４３に対応する。
下部右側曲線は、試料８３１８に対応する。
これらの試料の各々において、光学密度（４５０ｎｍでの）は、μｇ／ｍｌ単位で表現されたコーティング濃度に対してプロットされている。
十字記号を付した曲線は、非ビオチニル化ＨＣＶペプチドＸＶＩに対応し、点を付した曲線はビオチニル化されたＨＣＶペプチドＸＶＩに対応する。
【図４】（ＥＬＩＳＡにおいて）直接コーティングされたビオチニル化ペプチドの検出に対応する。
第１の曲線は、ビオチニル化されたＨＣＶペプチドＩＩに対応し、第２の曲線はビオチニル化されたＨＣＶペプチドＸＩに対応し、第３の曲線はビオチニル化されたＨＣＶペプチドＸＶＩに対応する。
これらの試料の各々において、光学密度（４５０ｎｍでの）は、μｇ／ｍｌ単位で表われたコーティング濃度に対してプロットされている。
【図５】ＨＩＶ−１の膜貫通（ＴＭ）タンパク質を起源とするＮ末端及びＣ末端ビオチニル化ＨＩＶ−１ペプチド（前記１ａ．１と呼称されている）の構造を表わす。
【図６ａ−１】（ＥＬＩＳＡにおいて）重複する９−ｍｅｒｓを用いたＨＣＶのコア領域のコアエピトープの検出を表わす。
使用された血清は、各ダイヤグラムの上に表示されている。
縦座標は、４５０ｎｍでの光学密度に対応する。
横座標は、エピトープの場所を決定すべきタンパク質の配列に対応する。グラフ表示する目的で、光学密度はそれぞれの９−ｍｅｒ　配列における第１のアミノ酸に割り当てられている。
【図６ａ−２】（ＥＬＩＳＡにおいて）重複する９−ｍｅｒｓを用いたＨＣＶのコア領域のコアエピトープの検出を表わす。
使用された血清は、各ダイヤグラムの上に表示されている。
縦座標は、４５０ｎｍでの光学密度に対応する。
横座標は、エピトープの場所を決定すべきタンパク質の配列に対応する。グラフ表示する目的で、光学密度はそれぞれの９−ｍｅｒ　配列における第１のアミノ酸に割り当てられている。
【図６ｂ−１】（ＥＬＩＳＡにおいて）重複する９−ｍｅｒｓを用いた　ＨＣＶのＮＳ４領域のコアエピトープの検出を表わす。
使用された血清は、各ダイヤグラムの上に表示されている。
縦座標は、４５０ｎｍでの光学密度に対応する。
横座標は、エピトープの場所を決定すべきタンパク質の配列に対応する。グラフ表示する目的で、光学密度はそれぞれの９−ｍｅｒ　配列における第１のアミノ酸に割り当てられている。
【図６ｂ−２】（ＥＬＩＳＡにおいて）重複する９−ｍｅｒｓを用いた　ＨＣＶのＮＳ４領域のコアエピトープの検出を表わす。
使用された血清は、各ダイヤグラムの上に表示されている。
縦座標は、４５０ｎｍでの光学密度に対応する。
横座標は、エピトープの場所を決定すべきタンパク質の配列に対応する。グラフ表示する目的で、光学密度はそれぞれの９−ｍｅｒ　配列における第１のアミノ酸に割り当てられている。
【図６ｃ−１】（ＥＬＩＳＡにおいて）重複する９−ｍｅｒｓを用いた　ＨＣＶのＮＳ５領域のコアエピトープの検出を表わす。
使用された血清は、各ダイヤグラムの上に表示されている。
縦座標は、４５０ｎｍでの光学密度に対応する。
横座標は、エピトープの場所を決定すべきタンパク質の配列に対応する。グラフ表示する目的で、光学密度はそれぞれの９−ｍｅｒ　配列における第１のアミノ酸に割り当てられている。
【図６ｃ−２】（ＥＬＩＳＡにおいて）重複する９−ｍｅｒｓを用いた　ＨＣＶのＮＳ５領域のコアエピトープの検出を表わす。
使用された血清は、各ダイヤグラムの上に表示されている。
縦座標は、４５０ｎｍでの光学密度に対応する。
横座標は、エピトープの場所を決定すべきタンパク質の配列に対応する。グラフ表示する目的で、光学密度はそれぞれの９−ｍｅｒ　配列における第１のアミノ酸に割り当てられている。
【図７ａ】（ＥＬＩＳＡにおける）重複する９−ｍｅｒｓとの関係におけるビオチニル化された２０−ｍｅｒｓの位置に対応する。
縦座標は、エピトープを決定すべきタンパク質配列に対応する。
【図７ｂ】（ＥＬＩＳＡにおける）重複する９−ｍｅｒｓとの関係におけるビオチニル化された２０−ｍｅｒｓの位置に対応する。
縦座標は、エピトープを決定すべきタンパク質配列に対応する。
【図７ｃ】（ＥＬＩＳＡにおける）重複する９−ｍｅｒｓとの関係におけるビオチニル化された２０−ｍｅｒｓの位置に対応する。
縦座標は、エピトープを決定すべきタンパク質配列に対応する。
【図８】直線免疫検定（ＬＩＡ）によるビオチニル化及び非ビオチニル化ＨＣＶペプチドの抗体認識の比較を表わす。
【図９】直線免疫検定（ＬＩＡ）によるビオチニル化コアペプチドの抗体認識の比較を表わす。
短い方のペプチドと長い方のペプチドが比較されている。
【図１０】直線免疫検定（ＬＩＡ）による型特異的ＨＣＶＮＳ４ペプチドの評価を表わす。
【図１１】ペプチドＮＳ４−ａ〜ＮＳ４−ｅのアミノ酸配列を表わす。
【図１２】ハイブリッドＨＣＶペプチドの組成を表わす。
【図１３】ハイブリッドＨＣＶペプチドの抗体認識を表わす。
【図１４】ＨＣＶ１型のＥ２／ＮＳ１のＮ末端からのミクソトープペプチドについての構築模式図を表わす。
【図１５】ミクソトープ合成戦略を表わす。
【図１６】多重抗原ペプチド（ＭＡＰｓ）の合成を表わす。
【図１７】Ｅ２／ＮＳ１「ｂ」ペプチドＭＡＰｓで免疫したウサギからの血清によるＥ２／ＮＳ１ペプチドの認識を表わす。
【図１８】ＬＩＡストリップに取り込まれたある数のビオチニル化ＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩペプチドでの市販の血清パネルの認識を表わしている。

Claims (22)

  1. 免疫学的に重要なエピトープに相当するペプチドのインビトロ決定のための方法において、
    （ａ）隣接しているか又は好ましくは少なくともアミノ酸３個ずつ重複している、分析すべきタンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列の部分に相当するペプチドを調製する工程；
    （ｂ）前記ペプチドをビオチニル化する工程；
    （ｃ）このビオチニル化されたペプチドを、ビオチニル化された基とストレプトアビジン又はアビジンとの相互作用により固相に結合させる工程；及び
    （ｄ）個々のペプチドに結合する抗体を測定する工程を含む方法。
  2. 前記アミノ酸が、約６個〜１２個のアミノ酸ずつ重複している、請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 以下の式：
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−〔アミノ酸〕ｎ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ式中、
    −　〔アミノ酸〕ｎは、ｎが、約４〜約５０、好ましくは約３５未満、さらに好ましくは約３０未満、そして有利には約４〜約２５の整数である残基の数である、ペプチド鎖の長さを示し；
    −　Ｂは、ビオチンを表わし；
    −　Ｘは、合成プロセス中に取り込まれるビオチニル化された化合　物を表わし；
    −　Ｙは、ビオチニル部分Ｂ又はＸからペプチド自体のアミノ酸を分離するリンカーアームを単独で又は一緒になって形成し、しかもアビジン又はストレプトアビジンに対するビオチニル部分Ｂ又はＸの結合と干渉しうる立体障害を最小限にするという機能をもつ単数又は複数の化学的単位又は共有結合を表わし、Ｙが共有結合でない場合、有利には少なくとも１つの化学的単位であり、３０個もの化学的単位から構成されていてよいが、最も頻繁には１〜１０個の同一の又は異なっていてもよい化学的単位、より好ましくはグリシン残基、β−アラニン、４−アミノブチル酸、５−アミノ吉草酸、６−アミノヘキサン酸（カプロン酸）で構成されており；
    −　Ｂ及びＸは、カッコ内に囲まれているのは、これらの位置でのビオチン又はビオチニル化された化合物の存在が任意のものであり、唯一の規定要件はＢ又はＸが示された位置のうち少なくとも１つにおいて存在していることであることを表わしており；
    −　Ａは、カッコで表わされているように存在する場合、アミノ酸（単数又は複数）、アミノ基又はペプチド鎖のアミノ末端の化学的修飾を表わし；
    −　Ｚは、単数又は複数のアミノ酸、１つのＯＨ基、１つＮＨ２−基又はこれら２つの基のいずれかが関与するリンケージを表わし、ここで該アミノ酸は、大きな割合の真性陽正血清に　よって認識されるか又は試験においてその他の抗原を補完して検出率を増大させることのできる免疫優性エピトープとなるべく選択的に選ばれ、Ｂは選択されたアミノ酸と相互作用して、より大きい診断上の感度をもつ化合物を生成する；
    で表すことができる物質の組成物。
  4. 以下のもの：
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（ｌａ．１）
    （Ａ）−（Ｂ）−Ｘ）−Ｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（ｌａ．２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（ｌａ．３）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（ｌａ．４）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（ｌａ．５）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（ｌａ．６）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｙ−　（Ｘ）−Ｚ　　（ｌｂ．１）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−　Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｙ−　（Ｘ）−Ｚ　（ｌｂ．１ａ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｙ−　（Ｘ）−Ｚ　　（ｌｂ．２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｙ−　（Ｘ）−Ｚ　　（ｌｂ．３）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｙ−　（Ｘ）−Ｚ　（ｌｂ．４）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（ｌｂ．５）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（ｌｂ．６）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ｌｂ．７）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ｌｂ．８）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ｌｂ．９）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ｌｂ．１０）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（ｌｂ．１１）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（２ａ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（２ｂ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（２ｃ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（２ｄ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（２ｅ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（３ａ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ．　（４ａ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（４ｂ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（Ｉ−ｇｐ４６−３）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（Ｉ−ｇｐ４６−５）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（Ｉ−ｇｐ４６−４）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（Ｉ−ｇｐ４６−６）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（Ｉ−ｐ２１−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（Ｉ−ｐ１９）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（ＩＩ−ｇｐ５２−１）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＩＩ−ｇｐ５２−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｙ−（Ｘ）　−Ｚ　（ＩＩ−ｇｐ５２−３）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＩＩ−ｐ１９）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（Ｉ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（ＩＩ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ．　（ＩＩａ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（ＩＩＩ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（ＩＶ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（ＩＶａ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（Ｖ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（Ｖａ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（ＶＩ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（ＶＩＩ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−
    Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（コア　１２３）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（コア　７９１０）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（ＶＩＩＩ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（ＩＸ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＨＣＶ３）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（Ｘ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＩ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＩＩ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　（ＸＩＩＩ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＩＶ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｇｅｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｅｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＮＳ４−２７）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＮＳ４−ｅ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＶ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＶＩ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＶＩＩ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＶＩＩＩ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＩＸ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＮＳ５−２５２７）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸａ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸａ−１）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸａ−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸｂ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸｂ−１）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸｂ−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸｃ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸｃ−１）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸｃ−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸｄ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸｄ−１）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸｄ−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸｅ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸｅ−１）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｇｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸｅ−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸｆ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸｆ−１）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸｆ−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸｇ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸｇ−１）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸｇ−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸｈ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸｈ−１）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸｈ−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸ／２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸ／２−１）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＸ／２−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＶＩＩＩ−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＩＸ−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（Ｘ−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＩ−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＩＩ−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＩＩＩ−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＩＶ−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−（Ｘ）−Ｙ−Ｚ　　（ＸＶ−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＶＩ−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＶＩＩ−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＶＩＩＩ−２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　（ＸＩＸ−２）
    から成るグループの中から選択される１アミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチド；
    又はＧｌｙ及び／又はＳｅｒ残基によって分離されるＨＣＶコア（表９）、ＨＣＶ　ＮＳ４（表１０）又はＨＣＶ　ＮＳ５（表１１）領域のコアエピトープの組合せから成るハイブリッドＨＣＶペプチド配列、
    そして好ましくは以下のハイブリッドＨＣＶ配列：
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　　　（Ｅｐｉ−１５２）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　　　（Ｅｐｉ−３３Ｂ３Ａ）
    （Ａ）−（Ｂ）−（Ｘ）−Ｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｙ−（Ｘ）−Ｚ　　　　（Ｅｐｉ−４Ｂ２Ａ６）；　又は上述の免疫学的に重要な領域のいずれかから誘導され、天然の分離株に見られる全てのアミノ酸を各位置に含むペプチドから成るビオチニル化された合成配列（図１４参照）、
    を含み、Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｙ及びＺが請求の範囲第３項に記載のとおりである、ペプチド組成物。
  5. Ａ．ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶａ、Ｖａ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩＩ、１ａ．３、１ａ．４、１ａ．ｂ、１ｂ．１ａ、２ｂ、２ｄ、
    Ｂ．ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶａ、Ｖａ、ＩＸ、ＩＸ−２、ＸＩ、ＸＩ−２、ＸＩＩＩ、ＸＩＩＩ−２、ＸＶ、ＸＶ−２、ＸＶＩ、ＸＶＩ−２、ＸＶＩＩＩ、ＸＶＩＩＩ−２、１ａ．３、１ａ．４、１ａ．ｂ、１ｂ．１ａ、２ｂ、２ｄ
    から選択されるビオチニル化されたペプチドの組合せから成る、請求の範囲第４項に記載のペプチド組成物。
  6. １ａ．３、１ａ．４、１ｂ．１、２ｂ、２ｃ、２ｄ、Ｉ−ｇｐ４６−３、Ｉ−ｇｐ４６−４、Ｉ−ｇｐ４６−５、Ｉ−ｇｐ４６−６、ＩＩ−ｇｐ５２−２、ＩＩ−ｇｐ５２−３、Ｉ−ｐ２１−２、Ｉ−ｐ１９、ＩＩ−ｐ１９を含むビオチニル化されたペプチドの組合せから成る、請求の範囲第４項に記載のペプチド組成物。
  7. １ａ．３、１ａ．４、１ａ．６、１ｂ．１ａ、２ｄ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶａ、Ｖａ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩＩ、ＸＸａ−２、ＸＸｃ−２、ＸＸｇ−２、ＸＸｈ−２、Ｉ−ｇｐ４６−３、Ｉ−ｇｐ４６−４、Ｉ−ｇｐ４６−５、Ｉ−ｇｐ４６−６、ＩＩ−ｇｐ５２−３、Ｉ−ｐ２１−２、Ｉ−ｐ１９、ＩＩ−ｐ１９を含むビオチニル化されたペプチドの組合せから成る、請求の範囲第４項に記載のペプチド組成物。
  8. ＨＣＶを検出するか又はＨＣＶに対して免疫するための請求の範囲第４項に記載のペプチド組成物であって、以下のグループ：
    Ａ．Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶａ、Ｖａ、
    Ｂ．ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶａ、Ｖａ、
    Ｃ．ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩＩ、
    Ｄ．ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩＩ、ＸＩＸ、
    Ｅ．ＸＸｃ−２、ＸＸａ−１、ＸＸａ−２、ＸＸｈ−１、ＸＸｈ−２、
    ＸＸｇ−２、ＸＸ／２−２、
    Ｆ．ＩＸ−２、ＸＩ−２、ＸＩＩＩ−２、
    Ｇ．ＸＶ−２、ＸＶＩ−２、ＸＶＩＩＩ−２、ＸＩＸ−２、
    Ｈ．ＩＸ、ＩＸ−２、ＸＩ、ＸＩ−２、ＸＩＩＩ、ＸＩＩＩ−２、
    Ｉ．ＸＶ、ＸＶ−２、ＸＶＩ、ＸＶＩ−２、ＸＶＩＩＩ、ＸＶＩＩＩ−２、ＸＩＸ、ＸＩＸ−２、
    Ｊ．ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶａ、Ｖａ、ＩＸ、ＩＸ−２、ＸＩ、ＸＩ−２、ＸＩＩＩ、ＸＩＩＩ−２、ＸＶ、
    ＸＶ−２、ＸＶＩ、ＸＶＩ−２、ＸＶＩＩＩ、ＸＶＩＩＩ−２、
    Ｋ．ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶａ、Ｖａ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩＩ、
    Ｌ．ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩＩ、
    Ｍ．ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶａ、Ｖａ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩＩ、ＸＸａ−２、
    ＸＸｃ−２、ＸＸｇ−２、ＸＸｈ−２、
    Ｎ．Ｅｐｉ−１５２、Ｅｐｉ−３３Ｂ３Ａ、Ｅｐｉ−４Ｂ２Ａ６から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドを含む組成物。
  9. ＨＩＶを検出するか又はＨＩＶに対して免疫するための請求の範囲第４項に記載のペプチド組成物であって、
    １型については：
    Ａ．１ａ．３、１ａ．４、１ａ．５、１ａ．ｂ
    Ｂ．１ａ．３、１ａ．４、１ｂ．１、１ｂ．３、１ｂ．６、１ｂ．１０、
    Ｃ．１ｂ．１、１ｂ．２、１ｂ．３、１ｂ．４、１ｂ．５、１ｂ．６、
    １ｂ．７、１ｂ．８、１ｂ．９、１ｂ．１０
    Ｄ．１ｂ．１、１ｂ．２、１ｂ．３、１ｂ．４、１ｂ．６、１ｂ．１０、
    Ｅ．１ａ．３、１ａ．４、１ａ．５、１ａ．ｂ、１ｂ．１ａ
    ２型については：
    Ａ．２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ
    １型及び２型については：
    Ａ．１ａ．３、１ａ．４、１ｂ．１、２ｂ、２ｃ、２ｄ、
    Ｂ．１ａ．３、１ａ．４、１ｂ．１ａ、２ｂ、２ｄ
    から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドを含む組成物。
  10. ＨＴＬＶを検出するか又はＨＴＬＶに対して免疫するための請求の範囲第４項に記載のペプチド組成物であって、
    ヒトＴリンパ球栄養性ウイルスＩ型については：
    ペプチドＩ−ｇｐ４６−３、Ｉ−ｇｐ４６−４、Ｉ−ｇｐ４６−５、Ｉ−ｇｐ４６−６、Ｉ−ｐ２１−２、Ｉ−ｐ１９
    ヒトＴリンパ球栄養性ウイルスＩＩ型については：
    ペプチドＩＩ−ｇｐ５２−１、ＩＩ−ｇｐ５２−２、ＩＩ−ｇｐ５２−３、Ｉ−ｇｐ４６−４、ＩＩ−ｐ１９、Ｉ−ｐ２１−２、
    ヒトリンパ球栄養性ウイルスＩ型及びＩＩ型については：
    ペプチドＩ−ｇｐ４６−３、Ｉ−ｇｐ４６−４、Ｉ−ｇｐ４６−５、Ｉ−ｇｐ４６−６、ＩＩ−ｇｐ５２−１、ＩＩ−ｇｐ５２−２、ＩＩ−ｇｐ５２−３、Ｉ−ｐ２１−２、Ｉ−ｐ１９、ＩＩ−ｐ１９から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドを含む組成物。
  11. 免疫検定手順において請求の範囲第４項〜第１０項のいずれか１項に記載のペプチド組成物を用いることによって、ＨＣＶ、及び／又はＨＩＶ、及び／又はＨＴＬＶ−ＩもしくはＩＩに対する抗体をインビトロ決定するための方法であって、使用されるビオチニル化されたペプチドが、ストレプトアビジン−ビオチニル化ペプチド又はアビジン−ビオチニル化ペプチドの複合体の形態であることを特徴とする方法。
  12. 免疫検定手順において請求の範囲第４項、５項、６項、７項又は９項に記載のペプチド組成物を用いることによって、ＨＩＶに対する抗体のインビトロ決定又はＨＩＶ感染の診断を行なうための方法であって、使用されるビオチニル化されたペプチドが、ストレプトアビジン−ビオチニル化ペプチド又はアビジン−ビオチニル化ペプチドの複合体の形態であることを特徴とする方法。
  13. 免疫検定手順において請求の範囲第４項、５項、６項、７項又は８項に記載のペプチド組成物を用いることによって、ＨＣＶに対する抗体のインビトロ決定又はＨＣＶ感染の診断を行なうための方法であって、使用されるビオチニル化されたペプチドが、ストレプトアビジン−ビオチニル化ペプチド又はアビジン−ビオチニル化ペプチドの複合体の形態であることを特徴とする方法。
  14. 免疫検定手順において請求の範囲第４項、５項、６項、７項又は１０項に記載のペプチド組成物を用いることによって、ＨＴＬＶ−ＩもしくはＩＩに対する抗体のインビトロ決定又はＨＴＬＶ−ＩもしくはＩＩの感染の診断を行なうための方法であって、使用されるビオチニル化されたペプチドが、ストレプトアビシン−ビオチニル化ペプチド又はアビジン−ビオチニル化ペプチドの複合体の形態であることを特徴とする方法。
  15. ＨＩＶ、及び／又はＨＣＶ、及び／又はＨＴＬＶ−ＩもしくはＩＩによる感染に対して免疫するための、請求の範囲第４項〜第１０項のいずれか１項に記載のペプチド組成物の用途。
  16. 請求の範囲第４項〜第１０項のいずれか１項に記載のビオチニル化されたペプチドを得るための方法であって、中間生成物としてＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｘ（Ｎ−ｙ−ビオチン）又はＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｘ（Ｎ−ｙ−ビオチン）誘導体が使用され、ここでＸは、
    Figure 2004002379
    を表わし、ｎは、１以上１０未満、好ましくは３〜６の間であり、
    Ｃα原子に１つのアミノ基が付着している一方、その他のアミノ基は側鎖中で最も遠くの炭素である炭素Ｃｙに付着しているか；又はアルコールＲＯＨを用いて得られるそのエステル、より特定的にはペンタフルオロフェニルエステルであり；
    −　ｙは、ラジカル内でＣＯＯＨ基を担持する炭素原子との関係に　おけるｙの位置を表わす方法。
  17. Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｘ（Ｎ−ｙ−ビオチン）が、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−ビオチン）又はＮ−α−Ｆｍｏｃ−オルニチニル（Ｎ−ε−ビオチン）である、請求の範囲第６項に記載の方法。
  18. カルボキシ末端ビオチニル化ペプチドを調製するための方法において、以下の工程：
    −　樹脂に付着した開裂可能なリンカーに対してカルボキシ活性化形態の上述の中間生成物をカップリングし、例えば以下の化合物：
    Figure 2004002379
    を得る工程；
    −　例えばピペリジンを用いて、中間化合物のαアミノ基を脱保護して、
    Figure 2004002379
    を得る工程；
    Figure 2004002379
    上に適切に保護された次に続くアミノ酸ＡＡ１…ＡＡｎを連続的に付加して、
    Figure 2004002379
    を得る工程；
    −　例えばピペリジンを用いて、ＮＨ２　−末端を脱保護する工程；
    −　得られた化合物を脱保護し、樹脂から開裂させ、そのカルボキシ末端でビオチニル化された得られたペプチドを抽出及び精製し、側鎖脱保護及び開裂工程が同時又は別々に行なわれる可能性もあり、特に、例えばピペリジンを用いて、ＮＨ２　−末端を脱保護する工程；
    −　エタンジチオール、チオアニソール又はアニソールのようなスカベンジャーの存在下で、例えばトリフルオロ酢酸などを用いて樹脂から開裂させる工程；
    −　酸及びスカベンジャーの大部分を除去するためにジエチルエー　テルのような溶剤でペプチドを抽出する工程；
    −　ＨＰＬＣなどを用いて精製して、
    Figure 2004002379
    を得る工程、
    を含むことを特徴とする方法。
  19. Ｎ末端ビオチニル化ペプチドを調製するための方法におい
    て、以下の工程：
    −　適切に保護された連続したアミノ酸を樹脂に付加して、
    Ｆｍｏｃ−ＡＡ１……ＡＡｎ−樹脂
    を得る工程；
    −　例えばピペリジンを用いて、ＮＨ２　−末端を脱保護する工程；
    −　中間生成物：
    Figure 2004002379
    を、そのＣＯＯＨを通してＮＨ２　−末端に付加して、
    Figure 2004002379
    を得る工程；
    −　得られた化合物のＮＨ２　末端基を脱保護し、樹脂から開裂させ、そのアミノ末端でビオチニル化された得られたペプチドを抽出及び精製し、側鎖脱保護及びペプチド開裂工程が同時又は別々に行なわれる可能性もあり、特に、例えばピペリジンを用いて、
    中間基のＮＨ−末端基を脱保護する工程；
    −　エタンジオール、チオアニソール又はアニソールのようなスカベンジャーの存在下で、例えばトリフルオロ酢酸などの酸を用いて樹脂から開裂させる工程；−　酸及びスカベンジャーの大部分を除去するためにジエチルエー　テルのような溶剤でペプチドを抽出する工程；
    −　ＨＰＬＣなどを用いて精製して、
    Figure 2004002379
    を得る工程を含むことを特徴とする方法。
  20. 内部的にビオチニル化されたペプチドを調製するための方法において、以下の工程：
    −　適切に保護された連続したアミノ酸を樹脂に付加して、
    Ｆｍｏｃ−ＡＡｎ……ＡＡ１−樹脂
    を得る工程、
    −　ＮＨ２　−末端を脱保護する工程、
    −　中間生成物：
    Figure 2004002379
    を、そのＣＯＯＨを通してＮＨ２　−末端に付加して、
    Figure 2004002379
    を得る工程、
    −　例えばピペリジンを用いて、中間化合物のαアミノ基を脱保護して、
    Figure 2004002379
    を得る工程、
    −　適切に保護された次に続くアミノ酸を樹脂に付加して、
    Figure 2004002379
    を得る工程、
    −　得られた化合物のＮＨ２　末端基を脱保護し、樹脂から開裂させ、そのアミノ末端でビオチニル化された得られたペプチドを抽出及び精製し、側鎖脱保護及び開裂工程が同時又は別々に行なわれる可能性もあり、特に、例えばピペリジンを用いて、ペプチドのＮＨ２　末端基を脱保護する工程；
    −　エタンジチオール、チオアニソール又はアニソールのような
    スカベンジャーの存在下で、例えばトリフルオロ酢酸などを用いて樹脂から開裂させる工程；
    −　酸及びスカベンジャーの大部分を除去するためにジエチルエー　テルのような溶剤でペプチドを抽出する工程；
    −　ＨＰＬＣなどを用いて精製して、
    Figure 2004002379
    を得る工程を含むことを特徴とする方法。
  21. 式：
    Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｘ（Ｎ−ｙ−ビオチン）
    又はＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｘ（Ｎ−ｙ−ビオチン）
    で示される化合物であって、
    Ｘは、
    Figure 2004002379
    を表わし、ｎは、１以上１０未満、好ましくは３〜６の間であり、１つのアミノ基がＣα原子に付着している一方、その他のアミノ基は側鎖中で最も遠くの炭素である炭素Ｃｙに付着しているか；又は、アルコールＲＯＨを用いて得られるそのエステル、より特定的にはペンタフルオロフェニルエステルであり；
    −　ｙは、ラジカル内でＣＯＯＨ基を担持する炭素原子との関係に　おけるｙの位置を表す化合物、
  22. 請求の範囲第２１項に記載の化合物を調製するための方法において、以下の工程：
    −　前述のジアミノ−、モノカルボキシル酸を、入念に制御されたｐＨ条件下でフルオレニルメチルスクシンイミジルカーボネート又はフルオレニルメチルクロロホルメートと反応させて、単独で保護されたＮ−α−Ｆｍｏｃ誘導体を得る工程、
    −　又は代替的には、αアミノ基を保護するために使用されたＦｍｏｃ基とは異なる保護基を側鎖アミノ基が有している場合、側鎖アミノ基の保護はＮ−α−Ｆｍｏｃ基を無傷状態に残す条件下で選択的に除去されやすいことから、市販のＮ−α−Ｆｍｏｃで保護されたジアミノ−モノカルボキシル酸を使用する工程、
    −　選択的抽出及びクロマトグラフィにより、モノ保護Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−ジアミノ−モノカルボキシル酸誘導体を精製する工程；
    −　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンのようなビオチンのカルボキシ活性化誘導体と、得られた誘導体とを反応させ、望ましい中間生成物である（Ｎ−α−Ｆｍｏｃ）−（Ｎ−ｙ−ビオチン）誘導体を得る工程、
    −　選択的抽出、沈殿又はクロマトグラフィにより中間生成物を精　製する工程、
    を含むことを特徴とする方法。
    Figure 2004002379
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