JP3443809B2 - 免疫学的に重要なエピトープに相当するペプチドの決定方法、及び免疫学的に重要なエピトープに相当するビオチニル化ペプチド又は抗体の決定のための方法におけるその利用、その調製方法及びそれを含む組成物 - Google Patents

免疫学的に重要なエピトープに相当するペプチドの決定方法、及び免疫学的に重要なエピトープに相当するビオチニル化ペプチド又は抗体の決定のための方法におけるその利用、その調製方法及びそれを含む組成物

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明の基礎にある技術的問題は、細菌及びウイルス
性タンパク質上の免疫学的に重要なエピトープに相当す
るペプチド、及び診断用又は免疫原性組成物における該
ペプチドの用途を提供することにある。
遺伝子工学ならびに固相ペプチド合成化学における最
近の発達により、生化学及び免疫学において合成ペプチ
ドが増々広く用いられるに至った。分子クローニング技
術の結果として利用可能になったタンパク質配列を、構
造、機能及び免疫学的研究のために化学的に大量に合成
することが可能である。ウイルス及び細菌のタンパク質
上に見られる免疫学的に重要なエピトープに相当するペ
プチドも同様に、抗体の検出及び感染の診断のために用
いることができる、きわめて特異的な試薬であることが
立証されてきた。
合成ペプチドが提供する数多くの利点にもかかわら
ず、その使用に関連した欠点も多く存在する。その比較
的短いサイズのため(一般に、長さがアミノ酸50個未
満)、その構造は、全長タンパク質に存在する分子内相
互作用の安定化の影響が無い状態で、数多くの異なるコ
ンホーメーションの間で変動しうる。その上、これらの
ペプチドの小さなサイズは、すなわち、その化学特性及
び可溶性が往々にしてその全長タンパク質のものとかな
り異なるものであり、ペプチドの全体的化学特性を決定
するに向けてのペプチド配列内の個々のアミノ酸の貢献
は、それに比例して大きくなるということを意味してい
る。
多くの免疫検定では、抗体検出のために用いられる抗
原を固体支持体上に固定化することを必要としている。
ほとんどの酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)は、固相
としてポリスチレンを使用している。多くのタンパク質
が固相に安定した形で吸着され得、抗体との次に続く相
互作用のためにアクセス可能である配列を呈する。その
サイズが小さいため、固相に対するペプチドの直接的吸
着は、往々にして数多くの理由のうちのいずれかのため
に不充分な結果を生み出す。
第1に、ペプチドは、それが固相に結合できるように
する適正な全体的電荷又はアミノ酸組成を有しない可能
性がある。第2に、固相への結合に必要とされるのと同
じアミノ酸残基が抗体認識のためにも必要とされる可能
性があり、従って抗体結合のためには利用できない。第
3に、ペプチドは、固相への結合時点で不利なコンホメ
ーションで固定された状態となり、かくして抗体分子に
とって認識不可能となる可能性がある。数多くの場合に
おいて、これらの可能性を区別することは可能でもない
し、また必要でもない。まず最初にペプチドを大きな担
体分子に結合させることにより、固相に対する結合を増
大させ、ぺプチドの特異的化学特性に対する感受性を低
くすることが可能である。標準的には、担体分子はタン
パク質である。
固相に結合するペプチドの量は、たとえ間接的にであ
れ、ある種のケースにおいてこの方法によって増大され
得るが、このアプローチは、ペプチドと担体分子の間の
リンケージには、往々にして抗体による認識にとってそ
の完全性が必要不可欠である内部三官能性アミノ酸の側
鎖が関与しているという事実に悩まされている。内部的
に修飾されたペプチドに対する抗血清の結合活性は、往
々にして非修飾ペプチド又は未変性タンパク質と比較し
てかなり減少している。
合成ペプチドに対する抗血清の生成にもまた、大部分
の場合において、ペプチドが担体にカップリングされる
ことが必要である。ここでも又、ペプチドの内部三官能
性アミノ酸と担体との間のカップリング反応は、ペプチ
ドの免疫原性を変える可能性がある。
カップリング反応を行なうには数多くの方法が存在
し、現在使用されている手順の大部分が、Van Regenmor
tel,M.H.V.Briand,J.P.,Muller,S.,及びPlaue,S.;生化
学及び分子生物学における実験室技術、第19巻、抗原と
しての合成ポリペプチド、Elsevier Press,Amsterdam,N
ew York,Oxford,1988年に詳述されている。これらの手
順に加えて、未保護ペプチドは、同様にN−ヒドロキシ
スクシンイミドビオチン又はカプロン酸ビオチンアミド
N−ヒドロキシスクシンイミドエステルのような市販の
試薬を用いてビオチニル化することができる。これらの
試薬の多くは、Billingsley,M.L.,Pennypacker,K.R.,Ho
over,C.G.及びKincaid,R.L.,Biotechniques(1987)5
(1):22−31に論述されている。ビオチニル化された
ペプチドは、ビオチンに対して並外れて高い親和性結合
を示す2つのタンパク質であるストレプトアビジン及び
アビジンによって結合される能力をもつ。
ある種の例においては、ビオチンを未保護のペプチド
に又は未保護のペプチドを担体に、選択的にカップリン
グすることが可能である。このことは、カップリング反
応に参加することのできる一方の端部に加えられた付加
的な三官能性アミノ酸を有するぺプチドを合成すること
によって達成できる。しかしながら、このアプローチ
は、このアミノ酸が問題の免疫原性配列内の重要な残基
でないかぎりにおいて、そして選択されたカップリング
剤が充分な選択性をもつかぎりにおいてのみ成功する。
そのアミノ酸組成の如何に関わらず、未保護の全てのペ
プチドに適用可能な単一の技術は存在しない。
非A非B型肝炎の原因である病因学的作用物質が同定
され、C型肝炎ウイルス(HCV)と名付けられた。特許
出願明細書EP−A−0 318 216は、このウイルスゲノ
ムの約80%に相当する配列を開示している。これらの配
列が利用可能になったことにより、残りのコーディング
配列、特にゲノムの5'末端に位置するものが迅速に解明
されるに至った(Okamoto;J.Exp.Med.60,167−177,199
0)。HCVゲノムは、約9,400ヌクレオチドの長さをもつ
線状プラス鎖RNA分子である。末端におけるやや短い非
翻訳領域を除いて、ゲノムは、約3,000アミノ酸のポリ
タンパク質をコードする、大きくしても中断されていな
い1つのオープンリーディングフレームで構成されてい
る。このポリタンパク質は、翻訳と同時に個々のウイル
ス構造領域及び非構造(NS)領域へと切断されることが
立証されている。この構造タンパク質領域は、さらにカ
プシド(コア)及びエンベロープ(E1及びE2)タンパク
質へと分割される。NS領域は、NS−1〜NS−5の領域に
分割される。
数多くの個別の特許出願明細書が、診断上重要なアミ
ノ酸配列の位置を決定するためにさまざまな戦略を利用
してきており、多くのこれらの研究により、HCVポリタ
ンパク質の類似の領域が同定されるに至った。
NS4領域は、主としてEP−A−0 318 216、EP−A
−0 442 394、US−5,106,726、EP−A−0 489 98
6、EP−A−0 484 787及びEP−A−0 445 801に
おいて検討されている。残念なことに、HCVに感染した
患者の70%だけがNS4に対する抗体を産生し、この領域
からの配列を含む合成又は組換え型のいずれのタンパク
質も全ての感染した血清試料を同定するには適していな
い。ヌクレオカプシド又はコア領域については、特許出
願明細書EP−A−0 442 394、US−5,106,726、EP−
A−0 489 986、EP−A−0 445 801、EP−A−0
451 891及びEP−A−0 479 376において検討され
ている。往々にして混合物として用いられるこれらのペ
プチドは、NS4から誘導されたペプチドに比べさらに頻
繁に、慢性的に感染した患者からの血清中の抗体によっ
て認識される(85〜90%)ということがわかった。NS5
領域については、特許出願明細書EP−A−0 489 986
及びEP−A−0 468 527において検討されている。使
用される血清パネルに応じて、60%を超えるNANB(非A
非B)肝炎がこれらのペプチドに対して向けられた抗体
を含むことを立証することができる。NS3領域も同様に
特許出願明細書EP−A−0 468 527において検討され
ている。全ての利用可能な証拠は、NS3の最も優勢なエ
ピトープは元来不連続的なものであり、合成ペプチドに
よって適切に表わすことができない、ということを示唆
している。ウイルス粒子の外表面(考えられる免疫原性
エピトープ)からの一領域として潜在的に興味深いE1領
域については、EP−A−0 468 527及びEP−A−0
507 615の両特許出願明細書中で検討されている。E1と
同じ理由で、E2/NS1領域が検討された。異なるHCV変異
体からのこの領域を比較することによって、このタンパ
ク質が、gp120エンベロープタンパク質のHIV V3ループ
領域を想起させるさまざまな領域を含んでいるというこ
とが解明された。EP−A−0 468 527では、比較的低
頻度で認識されるエピトープを含むことがわかっている
4つのペプチドが見い出された。最後に、HCVのNS2領域
は、EP−A−0 486 527において分析された。しかし
ながら、この領域の診断上の価値はまだ明確ではない。
抗体検出のための診断上有用な合成ペプチドに関するほ
ぼ全ての特許出願明細書が、ペプチドの好ましい組合せ
について記載している。これらの大部分は、HCVコアタ
ンパク質及びNS4からのペプチドを含んでいる。いくつ
かのケースでは、NS5からのペプチド(EP−A−0 489
968及びEP−A−0 468 527)、及びE1とE2/NS1が
含まれている(EP−A−0 507 615及びEP−A−0
468 527)。
さまざまな特許出願明細書が、ヒト免疫不全ウイルス
(HIV)の診断上有用なエピトープを発見するという問
題に取り組んでいる。環状HIV−1及びHIV−2ペプチド
を含む重要な免疫優性領域は、特許出願明細書EP−A−
0 326 490において見出された。EP−A−0 379 9
49では、この領域は、ビオチン分子がこれらの環状HIV
ペプチドにカップリングされた場合に、HIV特異抗体と
の反応性がさらに高いことが明らかにされた。SU−A−
161 22 64も同様に、HIV抗体の検出のため固相免疫検
定においてビオチニル化されたペプチドを使用すること
を記載している。
その他の出願は、gp120の超可変性V3ループ領域にお
ける有用なHIVエピトープを探し求めている(例えばEP
−A−0 448 095及びEP−A−0 438 332)。
米国特許第4,833,071号は、HTLV−I抗体の検出のた
めのペプチド組成物を提供している。
1つのエピトープが診断上有用であるか否かを決定す
ることは、必ずしも容易ではなく、ある程度は、それが
取り入られる試験の具体的な形態によって左右される。
それは、理想的には、高いパーセンテージの真性陽性血
清により認識される免疫優性エピトープであるべきであ
り、あるいは試験においてその他の抗原を補うことがで
き、検出率を増大させなくてはならない。頻繁に認識さ
れないエピトープは、真性陽性血清中の抗体の検出率を
増大させることに向けてそれらが果たす貢献度、及びそ
の他のさらに強いエピトープの希釈により試験の感度に
対してこれらのエピトープの取り入れが及ぼす不利な影
響の程度に応じて、診断上有用であることもできるし、
又役に立たない場合もある。
かくして、感染又は免疫の結果として産生された抗体
によって特異的に認識されるタンパク質の領域を同定す
るために、ペプチドを利用することが可能である。一般
に、従うことのできる戦略としては2つある。これらの
戦略のうちの1つは、Geysen,H.M.,meloen,R.H.及びBar
teling,S.J.;Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984),81:3998
−4002に記載されている。このアプローチは、問題のタ
ンパク質又はタンパク質フラグメントの全長が表わされ
るように、開裂不可能なリンカーで誘導されたポリエチ
レンロッド上に大きな一連の短い重複ペプチドを合成す
ることに係わっている。
ロッドを、抗血清と共にインキュベートし、抗体結合
を抗免疫グロブリン−酵素コンジュゲートを用いて検出
する。陽性反応が、タンパク質配列内に存在するエピト
ープの位置及び配列を直ちに同定する。この技術は、全
てのペプチドがそのカルボキシ末端を介して固体支持体
に均等に連結されるという利点をもつ。この方法は、線
状エピトープのきわめて精確なマッピングを可能にする
ものの、ロッド上に高い信頼性で合成できるペプチドの
長さは制限されている。このことは、エピトープの長さ
が合成されたペプチドの長さを上回る場合に、時として
問題をひき起す可能性がある。
エピトープマッピングに対する第2のアプローチに
は、一般に長さがアミノ酸15個〜30個である、分析すべ
きタンパク質の配列に沿ったより大きいペプチドの合成
が係わっている。連続するペプチドは隣接していてもよ
いが、好ましくは重複している。切断に続いて、個々の
ペプチドに対する抗体結合の評価を行ない、エピトープ
のおおよその位置を同定することができる。このアプロ
ーチの一例は、Neurath,A.R.,Strick,N.,及びLee,E.S.
Y.;J.Gen.Virol.(1990)71:85−95に示されている。こ
のアプローチは、未変性タンパク質の相同な配列とおそ
らくより密接に類似し、抗体結合のためのより優れたタ
ーゲットを提供する、さらに長いペプチドを合成するこ
とが可能であるという利点を有している。このアプロー
チの欠点は、各々のペプチドが化学的に固有の(ユニー
クな)ものであり、免疫学的評価のため各ペプチドを固
相上に最適にコーティングできる条件が、pH、イオン強
度及び緩衝液組成といった要因について大幅に変動しう
るということにある。固相上に吸着できるペプチドの量
も、各ペプチドに固有で、制御されない要因である。
本発明の主要な目的は、その非修飾バージョンに比べ
て優れた免疫学的特性をもつ状態で、免疫学的に有用な
エピトープに相当する修飾されたペプチドを提供するこ
とにある。
本発明のもう1つの目的は、従来のエピトープマッピ
ング技術を用いて同定することのできなかった免疫学的
に有用なエピトープに相当する修飾されたペプチドを提
供することにある。
本発明のもう1つの目的は、実施しやすくかつ標準化
に導きうる、前記ペプチドを用いる抗体のインビトロ決
定のための方法を提供することにある。
本発明のもう1つの目的は、細菌及びウイルス性タン
パク質上の免疫学的に重要なエピトープに相当するペプ
チドを決定するための方法を提供することにある。
本発明のもう1つの目的は、前記方法のいずれかにお
いて用いられるタンパク質配列を調製する方法を提供す
ることにある。
本発明のもう1つの目的は、そのエピトープを決定す
るための方法又は抗体をインビトロで決定するための方
法において用いることのできるタンパク質配列を調製す
る方法を提供することにある。
本発明のもう1つの目的は、上述の方法において用い
られるペプチドの調製に有用な中間化合物を提供するこ
とにある。
本発明のもう1つの目的は同様に、診断用としてタン
パク質上の免疫学的に重要なエピトープに相当すると決
定されたペプチドを含む組成物を提供することにもあ
る。
本発明のもう1つの目的は、ワクチン用としてタンパ
ク質上の免疫学的に重要なエピトープに相当すると決定
されたペプチドを含む組成物を提供することにある。
本発明に従うと、ウイルスタンパク質の免疫学的に重
要な領域を表わすビオチニル化された一連のペプチドが
同定され、固相ペプチド合成によって調製される。これ
らのペプチドは、(i)HCV及び/又はHIV及び/又はHT
LV−IもしくはIIに対する抗体の検出にとって、きわめ
て有用であるものとして同定されている。いくつかの好
ましい態様においては、これらのペプチドは、BALB/Cマ
ウスなどの健康な動物におけるHCV及び/又はHIV及び/
又はHTLV−IもしくはIIに対する抗体の産生を刺激する
上で、ならびにHCV及び/又はHIV及び/又はHTLV−Iも
しくはIIの感染予防のためのワクチン組成物において、
有用であるということが発見されているか、或は少なく
とも予想されている。
本発明の実施例の節で実証されているように、ビオチ
ニル化ペプチドを用いることによって、予め決定された
タンパク質配列内の免疫学的に重要なエピトープの決定
が可能になる。固相に対し共有結合的にカップリングさ
れた非ビオチニル化ペプチドを用いる免疫学的に重要な
エピトープの決定は、往々にしてこれらのエピトープを
局在化できない。特に構造エピトープの局在化の場合、
ビオチニル化ペプチドの使用はかなり成功すると思われ
る。
(1)本発明に従うと、HCV及び/又はHIV及び/又はHT
LV−IもしくはIIに対する抗体の検出のために有用なペ
プチド組成物は、次のような構造をもつ免疫学的に重要
なエピトープに相当するペプチドを含んでいる: (A)−(B)−(X)−Y−[アミノ酸]−Y−(X)−Z 式中、 − [アミノ酸]は、nを約4〜約50、好ましくは約
35未満、さらに好ましくは約30未満、そして有利には約
4〜約25の整数である残基の数として、ペプチド鎖の長
さを示し; − Bは、ビオチンを表わし; − Xは、合成プロセス中に取り込まれるビオチニル化
された化合物を表わし; − Yは、ビオチニル部分B又はXからペプチド自体の
アミノ酸を分離するリンカーアームを単独で又は一緒に
なって形成し、しかもアビジン又はストレプトアビジン
に対するビオチニル部分B又はXの結合と干渉しうる立
体障害を最小限にするという機能をもつ単数又は複数の
化学的単位又は共有結合を表わし、Yが共有結合でない
場合、有利には少なくとも1つの化学的単位であり、30
個もの化学的単位から構成されていてよいが、最も頻繁
には1〜10個の同一の又は異なっていてもよい化学的単
位、より好ましくはグリシン残基、β−アラニン、4−
アミノブチル酸、5−アミノ吉草酸、6−アミノヘキサ
ン酸(カプロン酸)で構成されることになり; − B及びXは、カッコ内に囲まれていて、これはこれ
らの位置でのビオチン又はビオチニル化された化合物の
存在が任意のものであり、唯一の規定要件はB又はXが
示された位置のうち少なくとも1つにおいて存在してい
ることであることを表わしており; − Aは、カッコで表わされているように存在する場
合、アミノ酸(単数又は複数)、アミノ基又はペプチド
鎖のアミノ末端の化学的修飾を表わし; − Zは、単数又は複数のアミノ酸、1つのOH基、1つ
のNH2−基又はこれら2つの化学基のいずれかが関与す
るリンケージを表わし、ここで該アミノ酸は、大きな割
合の真性陽性血清によって認識されるか又は試験におい
てその他の抗原を補って検出率を増大させることのでき
る免疫優性エピトープとなるべく選択的に選ばれ、Bは
選択されたアミノ酸と相互作用して、より大きい診断上
の感度をもつ化合物を生成する。
このペプチド組成物は、少なくとも1つ、及び好まし
くは2つ、3つ、4つ又はそれ以上の、以下の配列から
選ばれたビオチニル化ペプチドの組合せを含んでいる: これらの上述のビオチニル化ペプチドは、合成され、
感染を受けたヒト又は霊長類からの抗血清によって特異
的に認識されることがわかっており、特に有利であると
考えられている。これらの上述のペプチドは全て新しい
ものである。
本発明の方法は、これらのHIVペプチドの抗原性を増
大させることを可能にし、これらのペプチドはたとえビ
オチニル化されていない場合でさえ支持体に結合するこ
とができる。
次に続くHCVペプチド配列は、感染を受けたヒト又は
霊長類からの抗血清により特異的に認識されることがわ
かっており、それらは特に有利であると考えられてい
る。非ビオチニル化アミノ酸配列は、従来の方法に従っ
て合成可能である。
問題のペプチドは、HCVによりコードされるタンパク
質又はそのドメインを、免疫学的に擬態するように意図
されている。HCVに関して配列可変性が観察されたた
め、異なる株のエピトープをより良く擬態するように単
数又は複数のアミノ酸を変えることが望ましい可能性も
ある。対象となる化合物がHCVの少なくとも1つの株と
の免疫学的競合を提供することができるかぎりにおい
て、記載したペプチドがいずれかの特定のHCV配列と同
一である必要はないということも理解すべきである。従
ってペプチドは、その使用においてある種の利点を提供
する可能性がある場合に、挿入、欠失、ならびに保存的
及び非保存的アミノ酸置換といった変更の対象となる可
能性がある。これらのペプチドは、好ましくは、より大
きな配列の感度を全て維持しながらも、可能なかぎり短
いものであろう。ある種のケースにおいては、2つ以上
のペプチドを単一の構造の形に合体させることが望まし
い可能性がある。このような複合物の形成には、共有結
合的又は非共有結合的リンケージが関与する可能性があ
る。
特に興味の対象となるのは、ペプチドの環化に使用す
ることのできるメルカプト基を提供する目的で、システ
イン、チオグリコール酸又はその他のチオール含有化合
物をペプチド鎖中に取り込んだHCVのビオチニル化され
たペプチドである。
HCVのコア領域からの以下のペプチドは、免疫学的に
重要なエピトープに相当するものとして決定された。
1.ペプチドI又はコアI〔アミノ酸(aa)1−20〕は以
下のアミノ酸配列を有する: 2.ペプチドII又はコア2(aa7−26)は次のアミノ酸配
列を有する: 特に興味深いのはオリゴペプチドII A(aa8−18)で
ある。
3.ペプチドIII又はコア3(aa13−32)は以下の配列を
有する: 4.ペプチドIV又はコア7(aa37−56)は以下の配列を有
する: 特に興味深いのはオリゴペプチドIV a又はコア6(aa
31−50)である。
5.ペプチドV又はコア9(aa49−68)は以下の配列を有
する: 特に興味深いのはオリゴペプチドV a(aa55−74)で
ある: 6.ペプチドVI又はコア11(aa61−80)は以下の配列を有
する: 7.ペプチドVII(aa73−92)又はコア13は次の配列を有
する: 8.ペプチドコア123(aa1−32): 9.ペプチドコア7910(aa37−80): HCVのNS4領域からの以下のペプチドは、免疫学的に重
要なエピトープに対応することがわかった。
ペプチドVIII又はNS4−1又はHCV1(aa1688−1707)
は次の配列を有する: ペプチドIX又はHCV2(aa1694−1713)は次の配列を有
する: ペプチドX又はHCV4(aa1706−1725)は次の配列を有
する: 11.ペプチドXI又はNS4−5又はHCV5(aa1712−1731)は
次の配列を有する: 12.ペプチドXII又はHCV6(aa1718−1737)は次の配列を
有する: 13.ペプチドXIII又はNS4−7又はHCV7(aa1724−1743)
は次の配列を有する: 14.ペプチドXIV又はHCV8(aa1730−1749)は次の配列を
有する: 15.ペプチドNS4−27又はHCV9(aa1712−1743): 16.ペプチドNS4e: HCVのNS5領域の以下のペプチドは、免疫学的に重要な
エピトープに対応することがわかった。
ペプチドXV又はNS5−25(aa2263−2282)は次の配列
を有する: ペプチドXVI又はNS5−27(aa2275−2294)は次の配列
を有する: ペプチドXVII又はNS5−29(aa2287−2306)は次の配
列を有する: ペプチドXVIIIはNS5−31(aa2299−2318)は次の配列
を有する: ペプチドXIX又はNS5−33(aa2311−2330)は次の配列
を有する: ペプチドNS5−2527(aa2263−2294): HCVのE2/NS1領域のN末端領域からの以下のペプチド
は、免疫学的に重要なエピトープに対応することがわか
った。
上述の配列は、HCV1型分離株HCV−1(Choo et al.,P
roc.Natl.Acad.Sci.88,2451−2455,1991)及びHC−J1
(Okamoto et al.,Jap.J.Exp.Med.60,167−177,1990)
配列上に局在化されたエピトープに対応する。しかしな
がら、上述の免疫学的に重要な領域に対応するその他の
1型HCV分離株配列からのペプチドも、同様に本発明に
従った組成物中に含まれうるということも理解しなくて
はならない。同様に本発明の範囲内に入る変異体HCV配
列の一例を、HCV−J分離株から誘導することができる
(Kato et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.87,9524−9528)。
以下のペプチドは、2型HCV配列からの上述のペプチ
ド領域と同じ領域に由来したものである。
上述の配列は、HCV2型分離株HC−J6配列上に局在化さ
れたエピトープに対応する(Okamoto et al.,J.Gen.Vir
ology 72,2697−2704,1991)。しかしながら、上述の免
疫学的に重要な領域に対応するその他の2型HCV分離株
配列からのペプチドも、同様に本発明に従った組成物中
に含まれうるということも理解されるべきである。本発
明の範囲内に入る変異株配列の例を、HCV分離株HC−J8
から誘導することが可能である(Okamoto et al.,Virol
ogy 188,331−341,1992)。
HCV3型のNS4領域からの以下のペプチドも、同様に本
発明に従った好ましいペプチドである: HCV1型及び2型について決定されたような免疫学的に
重要な領域に対応するHCV3型分離株配列に対応するその
他のペプチドも、同様に本発明に従った組成物中に含ま
れうるということも理解されるべきである。
本発明に従った組成物は同様に、Gly及び/又はSer残
基により分離されるHCVコア(表9)、HCV NS4(表1
0)又はHCV NS5(表11)領域のコアエピトープの組合
せから成るハイブリッドHCVペプチド配列、そして好ま
しくは以下のハイブリッドHCV配列をも含みうる: 本発明に従った組成物は、同様に、上述の免疫学的に
重要な領域のいずれかから誘導された状態にあって、し
かも天然の分離株に見られる全てのアミノ酸を各位置に
含んだペプチドから成るいわゆるビオチニル化されたミ
クソトープ(mixotope)配列をも含みうる(図14参
照)。
(2)C型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイスル1型及
びヒト免疫不全ウイルス2型を検出し、及び/又はこれ
に対して免役するためのビオチニル化ペプチドの好まし
い混合物は、以下のものから成る: A. II、III、IV a、V a、IX、XI、XIII、XV、XVI、XVI
II、1a.3、1a.4、1a.b、1b.1a、2b、2d、 B. II、III、IV a、V a、IX、IX−2、XI、XI−2、XI
II、XIII−2、XV、XV−2、XVI、XVI−2、XVIII、XVI
II−2、1a.3、1a.4、1a.b、1b.1a、2b、2d。
(3)ヒト免疫不全ウイルス1型及び2型、及びヒトリ
ンパ球栄養性ウイルスI型及びII型を検出し、及び/又
はこれに対して免疫するためのビオチニル化ペプチドの
好ましい混合物は、以下のものから成る: 1a.3、1a.4、1b.1、2b、2c、2d、I−gp46−3、I−gp
46−4、I−gp46−5、I−gp−46−6、II−gp52−
2、II−gp52−3、I−p21−2、I−p19、II−p19。
(4)C型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス1型及
び2型、及びヒトリンパ球栄養性ウイルスI型及びII型
を検出し、及び/又はこれに対して免疫するためのビオ
チニル化ペプチドのもう1つの好ましい混合物は、以下
のものから成る: 1a.3、1a.4、1a.6、1b.1a、2d、II、III、IV a、V a、I
X、XI、XIII、XV、XVI、XVIII、XX a−2、XX c−2、X
X g−2、XX h−2、I−gp46−3、I−gp46−4、I
−gp46−5、I−gp46−6、II−gp52−3、I−p21−
2、I−p19、II−p19。
(5)本発明は、同様に、C型肝炎ウイルスに対する診
断用ならびに免疫原としての目的のために特に有利であ
り、かつ次のような混合物を有利に含む、ビオチニル化
ペプチドの組成物にも関する: A. I、III、IV a、V a、 B. II、III、IV a、V a、 C. IX、XI、XIII、 D. XV、XVI、XVIII、XIX、 E. XX c−2、XX a−1、XX a−2、XX h−1、XX h−
2、XX g−2、XX/2−2、 F. IX−2、XI−2、XIII−2、 G. XV−2、XVI−2、XVIII−2、XIX−2、 H. IX、IX−2、XI、XI−2、XIII、XIII−2、 I. XV、XV−2、XVI、XVI−2、XVIII、XVIII−2、XI
X、XIX−2、 J. II、III、IV a、V a、IX、IX−2、XI、XI−2、XI
II、XIII−2、XV、XV−2、XVI、XVI−2、XVIII、XVI
II−2、 K. II、III、IV a、V a、IX、XI、XIII、XV、XVI、XVI
II、 L. II、III、IV、V、IX、XI、XIII、XV、XVI、XVII
I、 M. II、III、IV a、V a、IX、XI、XIII、XV、XVI、XVI
II、XX a−2、XX c−2、XX g−2、XX h−2。
(6)本発明は、同様に、ヒト免疫不全ウイルスに対す
る診断用ならびに免疫原としての目的のために特に有利
であると考えられ、しかも以下の混合物の中から有利に
選択されるビオチニル化ペプチドの組成物にも関する: 1型について: A. 1a.3、1a.4、1a.5、1a.b B. 1a.3、1a.4、1b.1、1b.3、1b.6、1b.10、 C. 1b.1、1b.2、1b.3、1b.4、1b.5、1b.6、1b.7、1b.
8、1b.9、1b.10 D. 1b.1、1b.2、1b.3、1b.4、1b.6、1b.10、 E. 1a.3、1a.4、1a.5、1a.b、1b.1a。
2型について: A.2b、2c、2d、2e。
1型及び2型について: A. 1a.3、1a.4、1b.1、2b、2c、2d、 B. 1a.3、1a.4、1b.1a、2b、2d。
(7)本発明は、同様に、ヒトTリンパ球栄養性ウイル
スに対する診断用ならびに免疫原としての目的のために
特に有利であると考えられ、しかも以下の混合物の中か
ら有利に選択されるビオチニル化ペプチドの組成物にも
関する: ヒトTリンパ球栄養性ウイルスI型について: ペプチドI−gp46−3、I−gp46−4、I−gp46−
5、I−gp46−6、I−p21−2、I−p19。
ヒトTリンパ球栄養性ウイルスII型について: ペプチドII−gp52−1、II−gp52−2、II−gp52−
3、I−gp46−4、II−p19、I−p21−2。
ヒトリンパ球栄養性ウイルスI型及びII型について: ペプチドI−gp46−3、I−gp46−4、I−gp46−
5、I−gp46−6、II−gp52−1、II−gp52−2、II−
gp52−3、I−p21−2、I−p19、II−p19。
ペプチドの合成は、溶液中又は固体支持体上で達成す
ることができる。合成プロトコールは、一般にt−ブチ
ルオキシカルボニル又は9−フルオレニルメトキシカル
ボニルで保護された活性化アミノ酸を利用する。合成を
行なうための手順、アミノ酸活性化技術、側鎖保護タイ
プ及び使用される開裂手順は、例えば、Stewart and Yo
ung,固相ペプチド合成、第2版、Pierce Chemical Comp
any,1984;及びAtherton and Sheppard,固相ペプチド合
成、IRL Press,1989の中に充分に記載されている。
(8)本発明は、同様に、上述のビオチニル化ペプチド
を用いる抗体のインビトロ決定のための方法において、
前記ビオチニル化されたペプチドが、好ましくはストレ
プトアビジン−ビオチニル化ペプチド複合体又はアビジ
ン−ビオチニル化ペプチド複合体の形態である方法にも
関する。
ストレプトアビジン−ビオチニル化ペプチド又はアビ
ジン−ビオチニル化ペプチド複合体において、ペプチド
は、N末端、C末端又は内部のいずれがビオチニル化さ
れていてもよい。
抗体の決定のためのこのアプローチは、ペプチドの長
さに関して制限されておらず、免疫学的評価のために固
相上に直接ペプチドをコーティングする場合の固有の問
題点が回避される。
本発明の方法においてビオチニル化ペプチドを使用す
ることによって、固体支持体に対するペプチドの固定
は、その必須のアミノ酸を抗体により自由に認識されう
る状態にするものとなる。
固体支持体にペプチドを固定するという表現は、ペプ
チドが固定化された状態となるような共有結合又は非共
有結合的相互作用を介しての支持体に対するペプチドの
付着を意味する。
固体支持体は、ニトロセルロース、ポリスチレン、ナ
イロン又はその他のいかなる天然もしくは合成ポリマー
であってもよい。
「その必須のアミノ酸が抗体により自由に認識されう
る状態にされる」という表現は、ペプチド自体のアミノ
酸側鎖が、いかなる形であれ化学的に修飾されておら
ず、又ペプチドと固相との間の相互作用にも関与しない
ということを意味する。
本発明におけるビオチニル化ペプチドの使用は、この
ビオチニル化ペプチドが、それに対する抗体の結合に適
しているものを少なくとも1つ含む広範囲のコンホーメ
ーションを自由にとることを可能にする。
本発明の方法で使用するのに、いかなるビオチニル化
ペプチドを選択することもできる。しかしながら、その
うちのいくつかは、ビオチニル化されず、ストレプトア
ビジン又はアビジン複合体に関与していなくても、固体
支持体上に固定され、このペプチド内のエピトープを特
異的に認識する抗体と反応することができる。この場
合、ビオチニル化ペプチドの使用は、ペプチドがビオチ
ニル化されてない場合に観察される抗原性との関係にお
いて、ペプチドの見かけ上の抗原性の増大という結果を
もたらす。「見かけ上の」という語は、観察された変化
の絶対的原因の如何に関わらず、類似の試験条件下で得
られる観察された変化を表わすためのものである。
「抗原性」というのは、抗体によって結合されるとい
うペプチドの特性のことを意味する。
「抗原性の増大」というのは、非ビオチニル化ペプチ
ドの希釈の少なくとも2倍の希釈に対し、陽性シグナル
が得られることを意味する。この陽性シグナルは、非ビ
オチニル化ペプチドについて得られるものと同じ絶対値
(大きさ)のものである。
換言すると、陽性シグナルの獲得は、非ビオチニル化
ペプチドの量と比べて少ない量のビオチニル化ペプチド
について得ることができる。
本発明は、同様に、以下の工程を含むタンパク質配列
内のエピトープの同定方法をも示している: − 分析すべきタンパク質又はポリペプチドのアミノ酸
配列の部分に対応するペプチドを調製する工程、なお、
このペプチドは隣接しているか又は好ましくは互いに重
複しており、重複の量は少なくともアミノ酸3個、好ま
しくは約6個〜12個であり、ペプチドの長さは少なくと
もアミノ酸約5個であって約50個未満、好ましくはアミ
ノ酸約40個未満、より好ましくは9個〜約30個であり、
このペプチドはビオチニル化されていることを特徴とす
る: − ビオチニル基とストレプトアビジン又はアビジンと
の間の相互作用を通して固相にペプチドを結合し、従来
の方法を用いて個々のペプチドに結合する抗体を測定す
る工程。
(9)本発明は、同様に、上述のようなペプチド組成物
を免疫検定手順において使用することによる、HIVに対
する抗体のインビトロ決定又はHIV感染の診断のための
方法において、使用されるビオチニル化ペプチドが、ス
トレプトアビジン−ビオチニル化ペプチド又はアビジン
−ビオチニル化ペプチドの複合体の形態である方法にも
関する。
(10)本発明は、同様に、上述のようなペプチド組成物
を免疫検定手順において使用することによる、HCVに対
する抗体のインビトロ決定又はHCV感染の診断のための
方法において、使用されるビオチニル化ペプチドが、ス
トレプトアビジン−ビオチニル化ペプチド又はアビジン
−ビオチニル化ペプチドの複合体の形態である方法にも
関する。
(11)本発明は、同様に、上述のようなペプチド組成物
を免疫検定手順において使用することによる、HTLV−I
又はIIに対する抗体のインビトロ決定又はHTLV−又はII
感染の診断のための方法において、使用されるビオチニ
ル化ペプチドが、ストレプトアビジン−ビオチニル化ペ
プチド又はアビジン−ビオチニル化ペプチドの複合体の
形態である方法にも関する。
抗体のインビトロ決定を行なうための好ましい方法
は、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)を用いるもので
ある。この検定法は、一般にポリスチレンマイクロタイ
タープレート又はビーズである固相を利用する。しかし
ながら、固相は、共有結合を介して化学的に又は受動吸
着によってタンパク質を結合することのできるあらゆる
材料であってよい。この点において、ナイロンベースの
膜も特に有利であるものとみなされる。固相は、ストレ
プトアビジン又はアビジンによりコーティングされ、適
当な時間の後、余分な未結合タンパク質は洗浄により除
去される。固相上の占有されていない結合部位があれ
ば、それはこのときウシ血清アルブミン又はカゼインと
いった無関連タンパク質でブロッキングされる。
ビオチニル化ペプチドの混合物又は選択物を含む溶液
を、その後ストレプトアビジン又はアビジンでコーティ
ングされた表面と接触させ、結合させる。未結合のペプ
チドは、洗浄によって除去する。代替的には、アビジン
又はストレプトアビジンのいずれかとビオチニル化ペプ
チドとに、複合体を形成させる。結果として得られた複
合体を、固相をコーティングするのに用いる。適当なイ
ンキュベーション時間の後、未結合の複合体を洗浄によ
って除去する。抗血清又はその他の体液の適当な希釈溶
液を、ペプチドが結合されている固相と接触させる。結
合反応を起こさせるのに必要な時間、インキュベーショ
ンを行なう。その後、固相を洗浄して未結合成分を除去
する。免疫複合体の検出は、供試血清の中に存在する抗
体に対して特異的に結合し、かつ、目で検出できるか又
は分光光度分析法で測定できる色原体との有色複合体を
形成することのできる生成物又は高度に着色された生成
物の形に、無色の又はほとんど無色の基質又は補基質を
変換することのできる酵素、好ましくは(ただしこれに
制限されるわけではない)西洋ワサビペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ又はβ−ガラクトシダーゼ
のいずれかとコンジュゲートされた異種抗体を用いるこ
とによって達成される。
しかしながら、当該技術分野において知られているそ
の他の検出システムも利用することができ、それには、
形成された生成物の量を電気化学的又はルミノメトリー
によって測定するシステムが含まれる。検出システム
は、放射能標識された抗体を利用してもよく、この場
合、免疫複合体の量は、シンチレーション計数又は計数
によって定量される。原理的には、試験がストレプトア
ビジン又はアビジンと上述のとおりに合成されたビオチ
ニル化ペプチドとの間の複合体を利用するかぎりにおい
て、抗体の検出のためのあらゆるタイプの免疫学的試験
を用いることができる。
同様に、溶液中のストレプトアビジン又はアビジン−
ビオチニル化ペプチド複合体を抗体結合に関して固相結
合抗体と競合させる競合検定、又は溶液中の遊離ペプチ
ドを、固相結合されたストレプトアビジン又はアビジン
−ビオチニル化ペプチド複合体と競合させる検定も含ま
れる。一例を挙げると、抗体及び抗原の検出及び定量の
ための数多くの免疫検定が詳細に論述されている(Tijs
sen,P.,酵素免疫検定の実践と理論、Elsevier Press,Am
sterdam,Oxford,New York,1985)。
免疫学的検定は、単一のビオチニル化ペプチドに制限
されうる。しかしながら、好ましくは、特異的抗体の存
在を測定すべき対象である感染因子から誘導された複数
のエピトープを含むビオチニル化ペプチドの混合物が使
用される。
抗体検出のインビトロ決定を行なうためのもう1つの
好ましい方法は、直線免疫検定法(LIA)である。
この抗体検出方法は、基本的に以下の工程から成る: − 試験すべき又は使用されるビオチニル化ペプチド−
ストレプトアビジン又はアビジン複合体の形態の抗原
を、試験すべき抗原を共有結合により又は非共有結合に
より結合することのできる膜上に平行線として適用す
る、 − 膜上の占有されていない結合部位を、カゼイン又は
ウシ血清アルブミンのような非関連タンパク質でブロッ
キングする、 − 抗原(ビオチニル化ペプチド)の線が適用されてい
る方向に対して垂直方向に、ストリップ状に膜を切断す
る、 − (検出すべき抗体を含む)血清又はその他の体液の
適当な希釈溶液を、抗原が結合されたストリップと接触
させ、結合反応が起こるのに充分な時間インキュベート
する、 − ストリップを洗浄することによって未結合成分を除
去する、 − 供試血清中の抗体と特異的に結合し、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼなどの酵素にコンジュゲートされた異種
抗体と共にストリップをインキュベートすることによっ
て、免疫複合体の検出を達成する、 − 結合を起こさせるのに充分な期間インキュベーショ
ンを行なう、 − 酵素の作用によって有色生成物に変換される必要な
基質又は補基質の添加により、結合したコンジュゲート
の存在を検出する、 − 反応を、視覚により検出するか、又はデンシトメト
リーにより定量する。
(12)実施例の節で実証されるように、本発明は、同様
に、HIV、及び/又はHCV、及び/又はHTLV−Iもしくは
II感染に対する免疫のための上述のとおりのペプチド組
成物の使用にも関する。
(13)本発明は、同様に、本発明で用いられるビオチニ
ル化ペプチドの調製方法において、N−α−Fmoc−X
(N−y−ビオチン)又はN−α−Fmoc−X(N−y−
ビオチン)誘導体の使用が関与し、ここでXは、 を表わし、nは、1以上10未満、好ましくは2〜6の間
であり、Cα原子に1つのアミノ基が付着している一
方、その他のアミノ基は側鎖中で最も遠くの炭素である
炭素Cyに付着しているか;又はアルコールROHを用いて
得られるそのエステル、より特定的にはペンタフルオロ
フェニルエステルであり; yは、ラジカル内でCOOH基を担持する炭素原子との関
係におけるyの位置を表わす 調製方法にも関する。
このビオチン誘導体は、中間生成物と呼ばれ、上述の
中間生成物は本発明の方法に従って決定された新しい化
合物である。
(14)本発明の化合物を調製するための有利な方法にお
いて、中間生成物は以下の式のうちの1つによって表わ
すことができる: N−α−Fmoc−(N−y−ビオチン)は、N−α−Fm
oc−リジン(ε−ビオチン)又はN−α−Fmoc−オルニ
チン(N−δ−ビオチン)である。
(15)N−末端ビオチニル化ペプチドは、以下の工程を
含む方法に従って調製することができる: − 適切に保護された連続したアミノ酸を樹脂に付加し
て、 Fmoc−AAn……AA1−樹脂 を得る工程; − 例えばピペリジンを用いて、NH2−末端を脱保護す
る工程; − 中間生成物: を、そのCOOHを通してNH2−末端に付加して、 を得る工程; − 得られた化合物のNH2−末端基を脱保護し、樹脂か
ら開裂させ、そのアミノ末端でビオチニル化された得ら
れたペプチドを抽出及び精製し、側鎖脱保護及びペプチ
ド開裂工程が同時又は別々に行なわれる可能性もある工
程;特に − 例えばピペリジンを用いて、中間基のNH2末端基を
脱保護する工程; − エタンジチオール、チオアニソール又はアニソール
のようなスカベンジャー(掃去剤)の存在下で、例えば
トリフルオロ酢酸などの酸を用いて樹脂から開裂させる
工程; − 酸及びスカベンジャーの大部分を除去するためにジ
エチルエーテルのような溶剤でペプチドを抽出する工
程; − HPLCなどを用いて精製して、 を得る工程。
ビオチンは、そうでなければ完全に保護されているペ
プチド鎖の自由アミノ末端に対して、同様に従来の活性
化手順を用いて便利にカップリングされ得る。ビオチン
は1つのカルボキシ基を有し、アミノ基を全く有さない
ことから、ビオチンは基本的に鎖ターミネーターとして
機能する。インシチュ(in situ)活性化のための好ま
しい活性化剤としては、ベンゾトリアゾール−1−イル
−オキシ−トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロ
ホスフェート(PyBOP)、O−ベンゾトリアゾール−1
−イル−N,N,N′,N′−テトラメチルウロニウムヘキサ
フルオロホスフェート(HBTU)及びO−(1H−ベンゾト
リアゾール−1−イル)−N,N,N′,N′−テトラメチル
ウロニウムテトラフルオロボレート(TBTU)が挙げられ
るが、これらに制限されない。これらの及び関連する化
合物を利用する活性化手順は、固相ペプチド合成の当業
者にとっては周知のことであり、ビオチンのカップリン
グは、標準的カップリングプロトコールからの大きな逸
脱をもたらすものではない。
予め活性化された形態のビオチンも、同様に使用可能
である。N−ヒドロキシスクシンイミドビオチン又はビ
オチンアミドカプロン酸N−ヒドロキシスクシンイミド
エステルのいずれでも便利に利用され、両方共市販され
ている。このカップリング方法は、Lobl,T.J.,Deibel,
M.R.,及びYem,A.W.,Anal.Biochem.(1988),170(2):
502−511により記載されている。N末端ビオチンの付加
の後、ペプチドをスカベンジャーの存在下で樹脂から開
裂させるが、スカベンジャーの選択は、ペプチドアミノ
酸組成及び使用される保護基の性質の通常の考慮事項に
よって左右される。
(16)本発明の方法に関与するカルボキシ末端ビオチニ
ル化ペプチドは、次の工程を含む方法に従って調製でき
る: − 樹脂に付着した開裂可能なリンカーに対してカルボ
キシ活性化形態の上述の中間生成物をカップリングし、
例えば以下の化合物: を得る工程; − 例えばピペリジンを用いて、中間化合物のαアミノ
基を脱保護して、 を得る工程; 上に、適切に保護された次に続くアミノ酸AA1…AAn
連続的に付加して、 を得る工程; − 例えばピペリジンを用いて、NH2−末端を脱保護す
る工程、 − 得られた化合物を脱保護し、樹脂から開裂させ、そ
のカルボキシ末端でビオチニル化された得られたペプチ
ドを抽出及び精製し、側鎖脱保護及びペプチド開裂工程
が同時又は別々に行なわれる可能性がある工程;そして
特に − 例えばピペリジンを用いて、NH2末端を脱保護する
工程; − エタンジチオール、チオアニソール又はアニソール
のようなスカベンジャーの存在下で、例えばトリフルオ
ロ酢酸を用いて樹脂から開裂させる工程; − 酸及びスカベンジャーの大部分を除去するためにジ
エチルエーテルのような溶剤でペプチドを抽出する工
程; − HPLCなどを用いて精製して、 を得る工程。
(17)内部的にビオチニル化されたペプチドは、以下の
工程を含む方法に従って調製することができる: − 適切に保護された連続したアミノ酸を樹脂に付加し
て、 Fmoc−AAn…AA1−樹脂 を得る工程、 − NH2−末端を脱保護する工程、 − 中間生成物: を、そのCOOHを通してNH2−末端に付加して、 を得る工程、 − 例えばピペリジンを用いて、中間化合物のαアミノ
基を脱保護して、 を得る工程、 − 適切に保護された次に続くアミノ酸を樹脂に付加し
て、 を得る工程、 − 得られた化合物のNH2末端基を脱保護し、樹脂から
開裂させ、そのアミノ末端でビオチニル化された得られ
たペプチドを抽出及び精製し、側鎖脱保護及びペプチド
開裂工程が同時又は別々に行なわれる可能性がある工
程;特に − 例えばピペリジンを用いて、NH2−末端を脱保護す
る工程; − エタンジチオール、チオアニソール又はアニソール
のようなスカベンジャーの存在下で、例えばトリフルオ
ロ酢酸などの酸を用いて樹脂から開裂させる工程; − 酸及びスカベンジャーの大部分を除去するためにジ
エチルエーテルのような溶剤でペプチドを抽出する工
程、 − HPLCなどを用いて精製して、 を得る工程。
ある種の状況の下では、内部的に又はそのカルボキシ
末端でペプチドをビオチニル化できることが特に有利で
あることがわかるかもしれない。このようなケースは、
例えばペプチドのアミノ酸配列がタンパク質のアミノ末
端配列に対応する場合に生じる。このようなペプチドの
アミノ末端に対するビオチンの付着は、結果として、未
変性タンパク質の中に見られるものとはかなり異なる構
造をもたらし、その結果として、ペプチドの生化学的特
性の結合特性に悪影響を及ぼしうる。内部タンパク質配
列に対応するペプチドについてさえ、結合タンパク質又
は免疫グロブリンによるそれらの認識は、ペプチドのど
の末端にどのような要領でそれが結合のために提示され
るかによって左右される可能性がある。ペプチド配向
(オリエンテーション)の重要性については、Dyrberg,
T.及びOldstone,M.B.A,J.Exp.Med.(1986)164:1344−1
349に記載されている。
ビオチニル部分を、位置及び配列に無関係な形でペプ
チド内に取り込ませることができるようにするために、
従来の手順を用いてカップリングできる好適な試薬を合
成するべく努力が払われた。C末端又は内部ビオチニル
化のための便利な1つの試薬は、N−ε−ビオチニル−
リジンである。この化合物のα−アミノ基が好適に保護
されていれば(Fmoc及びtBoc)、この試薬は、固相ペプ
チド合成において使用される標準的手順により、アミノ
酸末端を含むペプチド鎖内のどこにでもビオチンを導入
するのに用いることができる。t−Bocで保護された誘
導体の合成は、すでに記載されており〔Bodansky,M.及
びFagan,D.T.,J.Am.Chem.Soc.(1977)99:235−239〕、
ある種のトランスカルボキシラーゼの酵素活性を研究す
る上で使用するための短いペプチドを合成するのに用い
られた。
t−Boc誘導体とは異なり、N−α−Fmoc−Lys(N−
ε−ビオチン)の合成については記載されておらず、Fm
oc−ベースの合成戦略に対する関心が高まってきている
ことから、この化合物は特に有利なものとみなされてい
る。
Fmocで保護された望ましい化合物に到達するためにと
ることのできる可能なルートは数多く存在する。これら
を図1に示す。第1のアプローチにおいては、市販のN
−α−Fmoc−Lys(N−ε−tBoc)を出発材料として用
いることができる。N−ε−tBoc保護は、トリフルオロ
酢酸、及び水などのスカベンジャーを用いて除去され
る。わずかにモル過剰のこのようにして得られたN−α
−Fmoc−リジンを、次にカルボキシ活性化ビオチンと反
応させる。結果として得られた生成物は、選択的抽出及
び標準的クロマトグラフィ技術により、容易に精製する
ことができる。代替的な1つのアプローチにおいては、
フルオレニルメチルスクシンイミジルカーボネートとの
反応により、市販のN−ε−ビオチニルリジン(ビオシ
チン)からN−α−Fmoc−Lys(N−ε−ビオシチン)
を生成することができる。指針として用いることのでき
るこれらの反応の数多くの例が、Atherton及びSheppar
d、固相ペプチド合成、IRL Press、1988年に示されてい
る。
図1に示されている戦略(方法A)も同様に、市販の
N−α−Fmoc−オルニチン(N−δ−tBoc)からN−α
−Fmoc−オルニチン(N−δ−ビオチン)を合成するた
めに適用することができる。オルニチン誘導体は、オル
ニチン誘導体に関しては1つの炭素原子分だけ短い側鎖
の長さの点でのみ、リジン誘導体と異なっている。N−
α−Fmoc−Lysは、遊離ビオチンについて記載されてい
るインシチュ活性化用のものと同じ試薬を用いて、ペプ
チド鎖の中に便利に取り込ませうる。
代替的には、アミノ酸のO−ペンタフルオロフェニル
エステルの調製についてGreen,M.及びBerman,J.,Tetrah
edron Lett.(1990)31:5851−5852に記載されている塩
基触媒のエステル交換反応を用いて、N−α−Fmoc−Ly
s(N−ε−ビオチン)及びトリフルオロ酢酸ペンタフ
ルオロフェニルから、N−α−Fmoc−Lys(N−ε−ビ
オチン)−O−ペンタフルオロフェニルエステルを便利
に合成することができる。この活性エステルは、ペプチ
ド鎖中にN−α−Fmoc−Lys(N−ε−ビオチン)を取
り込ませるために直接使用できる。上述の中間生成物の
クラスは、以下の工程を含む方法に従って調製できる: − 前述のジアミノ−、モノカルボン酸を、入念に制御
されたpH条件下でフルオレニルメチルスクシンイミジル
カーボネート又はフルオレニルメチルクロロホルメート
と反応させて、単独で保護されたN−α−Fmoc誘導体を
得る工程、 − 又は代替的には、αアミノ基を保護するのに使用さ
れたFmoc基とは異なる保護基を側鎖アミノ基が有してい
る場合、市販のN−α−Fmocで保護されたジアミノ−モ
ノカルボン酸を使用する工程、なお、この側鎖アミノ基
保護は、N−α−Fmoc基を無傷の状態に残す条件下で選
択的に除去されやすい; − 選択的抽出及びクロマトグラフィによりモノ保護N
−α−Fmoc−ジアミノ−モノカルボン酸誘導体を精製す
る工程; − N−ヒドロキシスクシンイミドビオチンのようなビ
オチンのカルボキシ活性化誘導体と、得られた誘導体と
を反応させて、望ましい中間生成物である(N−α−Fm
oc)−(N−y−ビオチン)を得る工程; − 選択的抽出、沈殿又はクロマトグラフィにより中間
生成物を精製する工程。
本発明の方法において使用されるビオチニル化ペプチ
ドに、リンカーアームを備えつける場合、これらの化学
的単位は、これらの化合物のアミノ基に適切な一時的ア
ミノ基保護を有しているかぎりにおいて、標準的カップ
リングプロトコールを用いて固相合成の間にペプチド配
列のN末端又はC末端のいずれかに便利に付着されう
る。
これらの具体的なビオチニル化ペプチドは、全て新し
いものである。
図面の説明: 図及び表に記載の試料及び血清は全て、ウイルス性作
用物質による自然に生じる感染の結果として産生される
抗体を含む、無作為に選択された試料及び血清である。
図1は、N−α−Fmoc−リジン(N−ε−ビオチン)
の合成のための戦略を表わす。
より特定的には、方法Aは、N−ε−Fmoc−Lys(N
−ε−tBoc)からのN−α−Fmoc−Lys(N−ε−ビオ
チン)の合成に対応し、方法Bは、N−ε−ビオチニル
リジンからのN−α−Fmoc−Lys(N−ε−ビオチン)
の合成に対応する。
図2は、上述の中間生成物及び中間化合物の調製に関
与する前駆物質の逆相クロマトグラフィで得られたダイ
ヤグラムを表わす。
逆相クロマトグラフィは、以下の条件下で行なった。
− 勾配仕様: 緩衝液A:H2中、0.1%TFA 緩衝液B:アセトニトリル中、0.1%TFA カラム:C2/C18逆相(Pharmacia,Pep−S)、 検出波長:255ナノメートル; − 勾配: 0〜1分 0%B 1分〜60分 0%B〜100%B 60分〜70分 0%B 第1のダイヤグラムは、方法Aに対応し(図1参
照)、第2のダイヤグラムは方法Bに対応する(図1参
照)。
図3aは、(ELISAにおいて)HCVペプチドIIに結合する
抗体を表わす。
上部左側の曲線は、試料8320に対応する。
上部右側の曲線は、試料8242に対応する。
下部左側の曲線は、試料8243に対応する。
下部右側の曲線は、試料8318に対応する。
これらの試料の各々において、光学密度(450nmで
の)は、μg/m単位で表わしたコーティング濃度に対
してプロットされている。
十字記号を付した曲線は、非ビオチニル化HCVペプチ
ドIIに対応し、点を付した曲線はビオチニル化されたHC
VペプチドIIに対応する。
図3bは、(ELISAにおいて)HCVペプチドXIに結合する
抗体を表わす。
上部左側曲線は、試料8320に対応する。
上部右側曲線は、試料8326に対応する。
下部左側曲線は、試料8242に対応する。
下部右側曲線は、試料8243に対応する。
これらの試料の各々において、光学密度(450nmで
の)は、μg/m単位で表わしたコーティング濃度に対
してプロットされている。
十字記号を付した曲線は、非ビオチニル化HCVペプチ
ドXIに対応し、点を付した曲線はビオチニル化されたHC
VペプチドXIに対応する。
図3cは、(ELISAにおいて)HCVペプチドXVIに結合す
る抗体を表わす。
上部左側曲線は、試料8326に対応する。
上部右側曲線は、試料8242に対応する。
下部左側曲線は、試料8243に対応する。
下部右側曲線は、試料8318に対応する。
これらの試料の各々において、光学密度(450nmで
の)は、μg/m単位で表現されたコーティング濃度に
対してプロットされている。
十字記号を付した曲線は、非ビオチニル化HCVペプチ
ドXVIに対応し、点を付した曲線はビオチニル化されたH
CVペプチドXVIに対応する。
図4は、(ELISAにおいて)直接コーティングされた
ビオチニル化ペプチドの検出に対応する。
第1の曲線は、ビオチニル化されたHCVペプチドIIに
対応し、第2の曲線はビオチニル化されたHCVペプチドX
Iに対応し、第3の曲線はビオチニル化されたHVCペプチ
ドXVIに対応する。
これらの試料の各々において、光学密度(450nmで
の)は、μg/m単位で表われたコーティング濃度に対
してプロットされている。
図5は、HIV−Iの膜貫通(TM)タンパク質を起源と
するN末端及びC末端ビオチニル化HIV−1ペプチド
(前記1a.1と呼称されている)の構造を表わす。
図6aは、(ELISAにおいて)重複する9−mersを用い
たHCVのコア領域のコアエピトープの検出を表わす。
使用された血清は、各ダイヤグラムの上に表示されて
いる。
縦座標は、450nmでの光学密度に対応する。
横座標は、エピトープの場所を決定すべきタンパク質
の配列に対応する。グラフ表示する目的で、光学密度は
それぞれの9−mer配列における第1のアミノ酸に割り
当てられている。
図6bは、(ELISAにおいて)重複する9−mersを用い
たHCVのNS4領域のコアエピトープの検出を表わす。
使用された血清は、各ダイヤグラムの上に表示されて
いる。
縦座標は、450nmでの光学密度に対応する。
横座標は、エピトープの場所を決定すべきタンパク質
の配列に対応する。グラフ表示する目的で、光学密度は
それぞれの9−mer配列における第1のアミノ酸に割り
当てられている。
図6cは、(ELISAにおいて)重複する9−mersを用い
たHCVのNS5領域のコアエピトープの検出を表わす。
使用された血清は、各ダイヤグラムの上に表示されて
いる。
縦座標は、450nmでの光学密度に対応する。
横座標は、エピトープの場所を決定すべきタンパク質
の配列に対応する。グラフ表示する目的で、光学密度は
それぞれの9−mer配列における第1のアミノ酸に割り
当てられている。
図7aは、(ELISAにおける)重複する9−mersとの関
係におけるビオチニル化された20−mersの位置に対応す
る。
横座標は、エピトープを決定すべきタンパク質配列に
対応する。
図7bは、(ELISAにおける)重複する9−mersとの関
係におけるビオチニル化された20−mersの位置を対応す
る。
横座標は、エピトープを決定すべきタンパク質配列に
対応する。
図7cは、(ELISAにおける)重複する9−mersとの関
係におけるビオチニル化された20−mersの位置に対応す
る。
横座標は、エピトープを決定すべきタンパク質配列に
対応する。
図8は、直線免疫検定(LIA)によるビオチニル化及
び非ビオチニル化HCVペプチドの抗体認識の比較を表わ
す。
図9は、直線免疫検定(LIA)によるビオチニル化コ
アペプチドの抗体認識の比較を表わす。
短い方のペプチドと長い方のペプチドが比較されてい
る。
図10は、直線免疫検定(LIA)による型特異的HCV NS
4ペプチドの評価を表わす。
図11は、ペプチドNS4−a〜NS4−eのアミノ酸配列を
表わす。
図12は、ハイブリッドHCVペプチドの組成を表わす。
図13は、ハイブリッドHCVペプチドの抗体認識を表わ
す。
図14は、HCV1型のE2/NS1のN末端からのミクソトープ
ペプチドについての構築模式図を表わす。
図15は、ミクソトープ合成戦略を表わす。
図16は、多重抗原ペプチド(MAPs)の合成を表わす。
図17は、E2/NS1「b」ペプチドMAPsで免疫したウサギ
からの血清によるE2/NS1ペプチドの認識を表わす。
図18は、LIAストリップに取り込まれたある数のビオ
チニル化HTLV−I及びHTLV−IIペプチドでの市販の血清
パネルの認識を表わしている。
表1は、ELISAにおける非ビオチニル化HIV−1及びHI
V−2ペプチド(TM−HIV−1及びTM−HIV−2と呼称さ
れている)、ならびにビオチニル化HIV−1及びHIV−2
ペプチド(上記で1a.1及び2aと呼び、TM−HIV−1Bio及
びTM−HIV−2Bioとも呼称されている)の抗体認識を表
わす。
表2は、ELISAにおける分離株HIV−1mnのV3配列から
の非ビオチニル化及びビオチニル化ペプチド(1b.4とも
呼ぶ)の抗体認識の比較を表わす。
表3は、ELISAにおけるストレプトアビジン及びアビ
ジンに結合したビオチニル化V3−mnペプチド(1b.4と呼
ぶ)の抗体認識に比較を表わす。
表4は、ELISAにおけるビオチニル化及び非ビオチニ
ル化HCVペプチドの抗体認識の比較を表わす。
より特定的には、 表4Aは、HCVペプチドXIに対する抗体結合に対応す
る。
表4Bは、HCVペプチドXVIに対する抗体結合に対応す
る。
表4Cは、HCVペプチドIIに対する抗体結合に対応す
る。
表4Dは、HCVペプチドIIIに対する抗体結合に対応す
る。
表4Eは、HCVペプチドVに対する抗体結合に対応す
る。
表4Fは、HCVペプチドIXに対する抗体結合に対応す
る。
表4Gは、HCVペプチドXVIIIに対する抗体結合に対応す
る。
表5は、ELISAにおける異なるペプチドコーティング
濃度でのビオチニル化ペプチド及び非ビオチニル化ペプ
チドに対する抗体結合の比較を表わす。
表6は、ELISAにおけるN末端及びC末端ビオチニル
化TM−HIV−1ペプチド(1a.1と呼ぶ)の比較を表わ
す。
表7は、非ビオチニル化及びカルボキシビオチニル化
HCVペプチドIの抗体認識の比較を表わす。
表8は、ELISAにおける抗体検出のためのビオチニル
化HIVペプチド及びHCVペプチドの混合物の使用を表わ
す。
表9は、HCVコアタンパク質のコアエピトープの配列
を表わす。
表10は、HCV NS4タンパク質のコアエピトープの配列
を表わす。
表11は、HCV NS5タンパク質のコアエピトープの配列
を表わす。
表12は、10の供試血清によるさまざまなコア、NS4及
びNS5ビオチニル化20−mersの抗体結合を表わす。
表13は、個々のE2/NS1ペプチドの抗体認識(陽性反応
を与える全ての血清のパーセンテージ)を表わす。
表14は、HIV V3ループペプチドの全体的認識を表わ
す。
表15は、地理学的地域によるHIVペプチドの認識を表
わす。
表16は、HIV−I V3ループペプチドであるV3−con及
びV3−368に対するヨーロッパ産、アフリカ産及びブラ
ジル産HIV−1陽性血清の認識を表わす。
表17は、2つのHIV−2 V3ループペプチドに対するH
IV−2陽性血清の認識を表わす。
表18は、ハイブリッドペプチドの抗体認識を表わす。
表19は、混合HTLV−I及びIIペプチドの抗体認識を表
わす。
全てのアミノ酸配列は、世界的に受入れられた慣用的
な三文字コードで、又表示のある場合には一文字コード
で示されている。ペプチド配列は、慣用上アミノ末端か
らカルボキシ末端への方向である左から右に示されてい
る。
いくつかの非慣用的コードも、化学基又は修飾を表わ
すのに用いられ、以下のように定義づけられる: (基) (コード) Ac アセチル Bio D−ビオチニル Fmoc 9−フルオレニルメトキシカルボニル tBoc 第3ブチルオキシカルボニル 例1:ペプチド合成 記載される全てのペプチドは、開裂時点でペプチドカ
ルボキシ末端アミドを生成させるために、酸不安定性リ
ンカー、4−(α−Fmoc−アミノ−2′,4′−ジメトキ
シベンジル)フェノキシ酢酸〔Rink,Tetrahedron Lett.
(1987)28:3787〕で共重合体官能化されたポリスチレ
ン−ポリオキシエチレングラフトであるTenta Gel S−R
AM(Rapp Polymere,Tbingen,ドイツ)上で合成した。
t−ブチルベースの側鎖保護及びFmoc−α−アミノ保護
を用いた。アルギニンのグアニジン基は、2,2,5,7,8−
ペンタメチルクロマン−6−スルホニル部分で保護し
た。ヒスチジンのイミダゾール基は、t−Boc又はトリ
チルで保護し、システインのスルフヒドリル基は、トリ
チル基で保護した。1.5当量の塩基N−メチルモルフォ
リンの存在下で活性化剤としてTBTUを用いたアルギニン
の場合を除いて、予備形成されたO−ペンタフルオロフ
ェニルエステルを用いてカップリングを行なった。場合
によっては、グルタミン及びアスパラギンも、同様に、
TBTU活性化を用いてカップリングした。これらの場合に
は、これらのアミノ酸のトリチルで保護された誘導体を
利用した。TBTU又はHBTUのいずれかを用いて、ビオチン
をカップリングした。全ての合成は、連続フロー手順を
用いてMilligen 9050 PepSynthesizer(Novato、カリフ
ォルニア)上で行なった。スカベンジャーの存在下での
トリフルオロ酢酸での開裂及びジエチルエーテルでの抽
出の後、全てのペプチドを、C18−逆相クロマトグラフ
ィにより分析した。
例2:N−α−Fmoc−Lys(N−ε−ビオチン)の合成 A.方法A 市販のN−α−Fmoc−L−リジン(N−ε−tBoc)
(1.5g)を、20ミリリットルの95%トリフルオロ酢酸、
5%H2Oで、室温で2時間処理した。その後、大部分の
酸を窒素流の下で蒸発させた。10ミリリットルの水を添
加し、ジエチルエーテルで3回、溶液を抽出した。次
に、五酸化リン上、真空中で、乾燥に至るまで水相を蒸
発させた。結果として得られた粉末(N−α−Fmoc−L
−リジン)を逆相クロマトグラフィで分析し、これは予
想通り出発物質よりもさらに親水性の均質な生成物であ
ることがわかった。
8ミリリットルの0.1M硼酸塩緩衝液、pH8.7中に、N
−α−Fmoc−リジン(190mg、0.49mmo)を溶解した。
4ミリリットルのジメチルホルムアミド中に、N−ヒド
ロキシスクシンイミドビオチン(162mg、0.47mmo)を
溶解し、N−α−Fmoc−リジンの溶液に添加した。pHを
監視し、必要に応じてNaOHで滴定した。2時間後、溶液
をHClでpH2.0になるまで酸性化し、この時点で白色沈殿
物が得られた。
酢酸エチルでの抽出及び遠心分離の後、白色沈殿物は
H2O:酢酸エチルの界面に見出された。両方の相を除去
し、10mM HClで2回、酢酸エチルで1回、そしてその後
ジエチルエーテルで2回、沈殿物を抽出した。DMF中に
沈殿物を溶解し、ジエチルエーテルを添加することによ
って沈殿させた。その後、五酸化リン上、真空中で結晶
性粉末を乾燥した。結果として得られた生成物を逆相ク
ロマトグラフィで分析したところ、予想通りN−α−Fm
oc−Lysよりも遅く溶出される主要なピークが明らかに
なった。N−α−Fmoc−Lysの非常に小さいピークも同
様に観察された(図2a)。
B.方法B 市販のN−ε−ビオチニルリジン(ビオシチン、Sigm
a、249mg、0.67mmo)を、8ミリリットルの1M Na2CO3
中に溶解させ、氷上で冷却した。2ミリリットルのアセ
トン中にフルオレニルメチルスクシンイジミルカーボネ
ート(222mg、0.66mmo)を溶解し、激しく撹拌しなが
ら30分間にわたってビオチニルリジン溶液に添加した。
撹拌は室温で5時間続けた。pHは、必要に応じて1M Na2
CO3を添加することにより8〜9に維持した。その後、
真空中でアセトンを蒸発させ、溶液のpHが約2となるま
で1.0M HClを添加した。溶液の酸性化の時点で、白色沈
殿物が現われ、これを10mM HClで2回、酢酸エチルで2
回、ジエチルエーテルで2回洗浄した。沈殿物をDMF中
に溶解し、ジエチルエーテルを添加することによって沈
殿させた。次に、結晶性粉末を五酸化リン上、真空中で
充分に乾燥した。逆相クロマトグラフィによって、結果
として得られた生成物を分析し、方法1(図2b)を用い
て得られた生成物と同じ保持時間(30.5分)で溶出され
る主要なピークが明らかになった。
例3:特異的抗体を用いる酵素結合免疫吸着検定(ELIS
A)において免疫学的に重要なエピトープに相当するペ
プチドを決定する方法 ペプチドを直接コーティングする場合、ペプチドの原
液を炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6で希釈し、1ミリリ
ットル当り2〜5マイクログラムのペプチド濃度で、ポ
リスチレンマイクロタイタープレートを37℃で一時間コ
ーティングするのに使用した。
ビオチニル化されたペプチドを評価する場合には、プ
レートを、まず、炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6中、1
ミリリットル当り3マイクログラムの濃度のストレプト
アビジンを用いて、37℃で1時間コーティングした。そ
の後、プレートを洗浄して余分の未結合タンパク質を除
去した。次に、マイクロタイタープレートのウェルに、
炭酸ナトリウム緩衝液中、1ミリリットル当り1マイク
ログラムのビオチニル化ペプチドの作用溶液を添加し、
37℃で1時間インキュベートした。
プレートをひとたび抗原でコーティングし、プラスチ
ック上のあらゆる残りの占有されていない結合部位をカ
ゼインでブロッキングした。洗浄の後、適切な抗血清の
希釈液(通常1:100)をプレートのウェルに添加し、37
℃で1時間インキュベートした。
非結合物質を除去するため洗浄を行なった後、酵素西
洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされたヤギ
抗ヒト免疫グロブリン抗体と共にプレートをインキュベ
ートすることにより、特異的抗体結合を検出した。洗浄
による非結合コンジュゲートの除去の後、H2O2及び3,
3′,5,5′−テトラメチルベンジジンを含む溶液を添加
した。
好適な間隔をおいた後、硫酸の添加により反応を停止
させた。陽性反応は黄色を呈し、これを従来のマイクロ
タイタープレートリーダーを用いて定量した。450ナノ
メートルの波長で吸光度測定を行ない、全てのデータを
この波長での光学密度値として表わした。
例4:HIV特異的抗体の検出のためのビオチニル化されたH
IVペプチドの使用 HIV−2及びHIV−2の膜貫通タンパク質に含まれてい
るその他のものに相当する、10アミノ酸の長さの短いN
−アセチル化ペプチドの抗体認識を評価するために、実
験を行なった。マイクロタイタープレートのウェル中の
これらのペプチドの直接的コーティングは、ELISAにお
いて抗体結合を評価した場合、きわめて貧弱な結果を与
えた。ペプチドがポリスチレン固相に充分結合しなかっ
たことが疑われたため、リンカーアームとして役立つこ
とを役目とする3つのグリシン残基によりデカマーペプ
チド配列から分離した状態で、ペプチドのアミノ末端に
ビオチンを付着した点を除き、同じ要領でペプチドを再
合成した。比較のために使用したペプチドは、以下のと
おりであった。
ビオチニル化ペプチドを、ストレプトアビジンでコー
ティングしたマイクロタイタープレート上にロードし
た。これらのペプチドに対する抗体結合を、マイクロタ
イタプレート上に直接コーティングされた非ビオチニル
化ペプチドに対する抗体結合と比較した。結果を表1に
示す。ストレプトアビジンに結合したHIV−1又はHIV−
2膜貫通タンパク質からのビオチニル化ペプチドが、そ
れぞれHIV−1又はHIV−2に感染した人物からの抗血清
により非常に良く認識されるということは明らかであ
る。これは、ポリスチレンプレート上に直接コーティン
グされたこれらのペプチドの非ビオチニル化バージョン
とは対照的である。さらなる対照実験は、共にマイクロ
タイタープレート上に直接コーティングした場合には、
ビオチニル化ペプチド又は非ビオチニル化ペプチドの抗
体認識に全く差がなかったことから、抗体結合の増加が
ビオチニル化ペプチドとストレプトアビジンとの間の特
異的相互作用の結果であることを示した。
いくつかのペプチド、特に長さが15アミノ酸以上であ
るペプチドは、充分に固相に結合して、ペプチド配列内
に存在するエピトープを認識する特異的抗体の検出を可
能にする。
ビオチニル化がより長いペプチドの抗体認識をも改善
するか否かを確認するため、分離株HIV−1mnの部分的V3
ループ配列のビオチニル化及び非ビオチニル化の両バー
ジョンを合成した。両方のペプチドの配列及び合成方法
は、アミノ末端において以外、同一であった。非ビオチ
ニル化ペプチドは、単にアセチル化されただけである
が、一方ビオチニル化されたバージョンにおいては、ビ
オチニル部分からペプチドを分離するためのリンカーア
ームとして、2つのグリシン残基が付加された。
使用された2つのペプチドの配列は以下のとおりであ
る: 非ビオチニル化ペプチドは、ポリスチレンマイクロタ
イタープレートのウェル上に直接コーティングしたが、
一方、ビオチニル化ペプチドは、予めストレプトアビジ
ンでコーティングしたウェルに結合させた。表2に示す
結果は、ビオチニル化ペプチドに対する抗体結合が、プ
ラスチック上に直接コーティングされたペプチドに対す
る抗体結合よりも優れているということを実証してい
る。
例5:抗体検出のためのビオチニル化ペプチド−アビジン
複合体の使用 ペプチドをビオチニル化し、ストレプトアビジンに結
合させた場合、このペプチドの抗体認識が改善されるこ
とを実証した後、ストレプトアビジンをアビジンで置換
できるか否かを決定するためさらに実験を行なった。表
3に示す結果は、それが事実であり、アビジンに結合さ
れたビオチニル化ペプチドが特異的抗体によってきわめ
て効率良く認識されることを表わしている。
例6:HCV特異抗体の検出のためのビオチニル化HCVペプチ
ドの使用 ビオチニル化ペプチドの強化された抗体認識が一般的
な現象であるか否かを決定するために、C型肝炎ウイル
ス(HCV)ポリタンパク質から誘導された配列に相当す
る付加的な20アミノ酸の長さのペプチドを多数合成し
た。評価したアミノ酸配列は以下のとおりであった: 各々のケースにおいて、2つのバージョンのペプチド
を合成した。非ビオチニル化バージョンは、ペプチドを
アミノ末端でアセチル化した。ビオチニル化バージョン
は、全てN末端ビオチニル化した。2つのグリシン残基
から成るリンカーアームにより、ビオチニル部分を、HC
V配列を含むアミノ酸から離した。
非ビオチニル化ペプチドは、1ミリリットル当り3マ
イクログラムの濃度でポリスチレンマイクロタイターの
ウェル上に吸着させた。
ビオチニル化ペプチドは、1ミリリットル当り1マイ
クログラムの濃度で、ストレプトアビジンでコーティン
グされたマイクロタイタープレートに結合させた。これ
らのペプチドに対する抗体を含むことが知られている血
清を、評価のために使用し、20倍の希釈でテストした。
これらの比較の結果を、表4a〜gに示す。
これらの結果は、ストレプトアビジンに結合したビオ
チニル化ペプチドの抗体認識が、マイクロタイタープレ
ートのウェル上に直接コーティングされたペプチドのも
のに比べ、高められていることを明らかに示している。
例7:抗体検出に対するコーティング濃度の影響 プラスチック上の直接吸着に比べて高められたストレ
プトアビジン又はアビジンに結合したビオチニル化HCV
ペプチドの抗体認識について、さらに調べるため、ペプ
チドコーティング濃度の影響を調べた。マイクロタイタ
ープレートのウェル1つ当り200マイクロリットルの容
積で、1ミリリットルにつき10ナノグラム〜3マイクロ
グラムまでの濃度で、3つのペプチド(HCVペプチドI
I、XI及びXVI)をコーティングした。直接コーティング
のためには、これらのペプチドの非ビオチニル化バージ
ョンを用いた。予めストレプトアビジンを吸着させたウ
ェルをコーティングするために、これらのペプチドのビ
オチニル化バージョンを使用した。これらのペプチドに
対する抗体を含むことが知られている血清を、1〜100
の希釈で使用して、抗体結合の程度を評価した。
この実験の数値的結果は、表5に示され、図3、a〜
cではグラフに表わされている。
わずかな例外を除いて、テストされた最低の濃度(1
ミリリットル当り10ナノグラム、1ウェル当り2ナノグ
ラム)においてさえ、ビオチニル化ペプチドが非常に良
く認識されるということは明白である。数多くのケース
において、1ミリリットルにつきわずか30ナノグラムの
ペプチド濃度(1ウェル当り6ナノグラム)で、到達可
能な最大値に近い光学密度値が観察される。しかしなが
ら、それとは対照的に、プラスチック上に直接吸着され
た非ビオチニル化ペプチドは、全くないとまでは言わな
いもののわずかしか抗体によって結合されない。
例8:固相上でのペプチドのコーティング効率に対するペ
プチドのビオチニル化の影響 ペプチドを直接コーティングした場合のシグナルの欠
如が、ペプチド吸着の欠如によるものか否かを決定する
ため、さらに実験を行なった。この場合、ペプチドのビ
オチニル化バージョンは、非ビオチニル化バージョンに
ついての前の実験で用いられたものと同じ濃度でプラス
チック上に直接コーティングした。ビオチン標識された
ペプチドが結合したか否かを確かめるために、マイクロ
タイタープレートを、ストレプトアビジン:西洋ワサビ
ペルオキシダーゼのコンシュゲートと共にインキュベー
トした。各ペプチドは単一のビオチニル基を含んでいる
ことから、結果として得られる光学密度は、結合したペ
プチドの絶対量はわからないものの、結合したペプチド
の量の1つの尺度である。図4にグラフで表わされてい
る結果は、プラスチックに結合したペプチドを検出する
ことができることを立証している。予想通り、曲線は各
ペプチドについて異なっており、これはその化学的独自
性を反映するものである。ペプチドのうちの2つ、すな
わちHCVペプチドXIとXVIは、ポリスチレンマイクロタイ
タープレートのウェルに弱く結合するにすぎないように
思われ、この弱い結合は、ELISAにおいて得られた低い
光度密度値に反映されている。ストレプトアビジンでコ
ーティングされたウェルに対するビオチニル化ペプチド
の結合は、非常に優れた抗体認識という結果をもたらす
ことから、ビオチンとストレプトアビジンとの間の相互
作用を使用する場合には、固相に対するペプチドの貧弱
な結合が、制限条件とはならないことは明白である。
一方、ペプチドのうちの1つ、すなわちHCVペプチドI
Iは、特に高い方のコーティング濃度において、固相に
対して非常に有意な結合を示す。しかしながら、どんな
コーティング濃度においてであれ、ペプチドを直接コー
ティングした場合に得られるシグナルが、ビオチニル化
ペプチドをストレプトアビジンに結合させた場合に得ら
れるシグナルと等しくなることはなかった。試験した最
低濃度においてさえ、このペプチドのストレプトアビジ
ンと結合したビオチニル化バージョンは、試験した抗血
清で陽性シグナルを明らかに与えることから、結果は、
このペプチドの直接コーティングが異常に効率が悪い
か、又は固相に対するペプチドの単純な結合に加えてそ
の他の要因が重要であることのいずれかを表わしている
と思われる。
定量するのは難しいものの、これらの要因の1つは、
ペプチドが結合し、抗体結合に利用可能となる方法にほ
ぼ確実に関与している。固相上に直接コーティングされ
るペプチドの場合、いくらかの割合のペプチド分子が、
抗体認識にとっても必須のアミノ酸側鎖を通して固相と
相互作用するであろうということは、事実上避けられな
い。従って、これらのペプチド分子は抗体との結合反応
に参加することができないであろう。この問題は、ビオ
チンと、固相に結合したストレプトアビジンとの間の相
互作用を通して、全て固相に結合されているビオチニル
化ペプチドの場合には見られないものである。
例9:特異的抗体認識のためのC末端ビオチニル化HIVペ
プチドの使用 そのカルボキシ末端でビオチニル化されたペプチド
も、強化された抗体認識に使用できるか否かを決定する
ために、TM−HIV−1ペプチドのカルボキシ−ビオチニ
ル化バージョンを合成した。20%ピペリジンでリンカー
結合Fmoc基を除去した後、酸不安定性リンカー、4−
(α−Fmoc−アミノ−2′,4′−ジメトキシベンジル)
フェノキシ酢酸で官能化した樹脂に、上述のような方法
Aによって調製されたN−α−Fmoc−Lys(N−ε−ビ
オチン)を、直接カップリンングした。樹脂官能基と比
べて3倍モル過剰のN−α−Fmoc−Lys(N−ε−ビオ
チン)を用いることにより、カップリングを行なった。
カルボキシル基の活性化を、HBTU1当量、1−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール1当量及びN−メチルモルフォリ
ン1.5当量を用いて達成した。N−α−Fmoc−Lys(N−
ε−ビオチン)の完全な溶解を達成するために必要な40
パーセントのジメチルスルホキシドを含むジメチルホル
ムアミド中、0.6M溶液としてN−メチルモルフォリンを
施した。N−α−Fmoc−Lys(N−ε−ビオチン)のカ
ップリングに続いてFmoc脱保護ピークを検査すると、カ
ップリングがスムーズにかつ効率良く進んだことがわか
った。TM−HIV−1アミノ酸配列からビオチニルリジン
を分離させるため、2つのグリシン残基をカップリング
した。ペプチド合成に続いて、無水酢酸を用いてアミノ
末端をアセチル化した。結果として得られたカルボキシ
ビオチニル化ペプチドの構造は、アミノ末端でビオチニ
ル化されたペプチドとはかなり異なっている。これらの
構造の比較を図5に示す。
これら2つのペプチドの抗体認識を評価するため、ス
トレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイター
プレートにペプチドを個別に結合させ、HIV−1血清陽
性ドナーからの抗血清パネルを用いて試験した。この比
較の結果を表6に示す。明らかに、C末端でビオチニル
化されたペプチドの抗体認識は、N−末端でビオチニル
化されたペプチドの抗体認識と比べ、まさるとも劣らな
いものである。これれの結果は、同様に、カルボキシ末
端ビオチニル化についての試薬N−α−Fmoc−Lys(N
−ε−ビオチン)の有用性をも確認している。
例10:直接コーティングされた(非ビオチニル化)又は
ストレプトアビジンでコーティングしたプレートに結合
された(カルボキシ末端ビオチニル化)HCVペプチドI
の抗体認識の比較 カルボキシ−ビオチニル化形態のペプチドが、非ビオ
チニル化形態のペプチドに比べ、結果として優れた抗体
認識をもたらすか否かを決定するため、ポリスチレンEL
ISAプレートに比較的よく結合するペプチドを用いて、
類似の実験を行なった。選択されたペプチドはHCVペプ
チドIであり、これを以下のバージョンで合成した: Lys(N−ε−Bio)からペプチド自体のHCV部分を物
理的に分離するため、カルボキシ末端に2つのグリシン
残基から成るスペーサーを付加した。開裂時にカルボキ
シ末端アミドを生成させるため、4−(α−Fmoc−アミ
ノ−2′,4′−ジメトキシベンジル)フェノキシ酢酸リ
ンカーで官能化した樹脂上で合成を行なった。リンカー
に対するN−α−Fmoc−Lys(N−ε−ビオチン)のカ
ップリングは、リンカーと比べ3倍モル過剰の中間生成
物を用いて行なった。N−α−Fmoc−Lys(N−ε−ビ
オチン)の活性化は、TBTU1当量、1−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール1当量及びN−メチルモルフォリン1.5
当量を用いて達成した。その他の全てのアミノ酸のカッ
プリングは、従来のプロトコールに従って行なった。適
切なスカベンジャーの存在下、トリフルオロ酢酸中での
ペプチドの開裂に続いて、ペプチドを沈殿させ、ジエチ
ルエーテルで抽出した。
非ビオチニル化HCVペプチドIは、炭酸ナトリウム緩
衝液、pH9.6中、1ミリリットル当り3マイクログラム
の濃度で、ポリスチレンELISAプレートのウェル上に直
接コーティングした。ビオチニル化HCVペプチドIは、
1ミリリットルにつき1マイクログラムの濃度でペプチ
ドを含む原液を用いて、ストレプトアビジンでコーティ
ングしたウェルに結合させた。次に、結果として得られ
たプレートを、平行した、HCV−血清陽性ドナーからの
血清のパネルと共にインキュベートした。この比較の結
果を表7に示す。ビオチニル化されたペプチドは、明ら
かに、同じ配列の非ビオチニル化バージョンと比べて優
れた結果を与えている。2つの血清(8326及び8244)
は、非ビオチニル化バージョンに比べてはるかに良くこ
のペプチドのビオチニル化バージョンを認識している。
抗体反応の特異性は、同様に、非感染ドナーからの5つ
の血清試料(F88、F89、F76、F136及びF6)について得
られた低い光学密度によっても反映されている。
例11:ビオチニル化HIV及びHCVペプチドの混合物の使用 数多くのケースにおいて、望ましい結果を得るため
に、ペプチド混合物の使用が必要となる。ペプチド混合
物は、単一のウイルスの単数又は複数のタンパク質に対
して向けられた抗体を検出するため、又は単一の試験に
おいて複数のウイルスのタンパク質に対して向けられた
抗体を検出するために使用することができる。このよう
な試験は、輸血のため及び血液製剤の供給源として使用
する上での適性について献血をスクリーニングするため
に、特に有利であると考えられる。このような場合、好
適なペプチド混合物でコーティングされたELISAプレー
ト又はその他の固体支持体を用いて、その存在が試料を
使用に適さないものにしてしまう単数又は複数の感染性
因子に対する抗体の存在について、試料をスクリーニン
グすることができる。特定の感染性因子の診断には、精
確な決定を得るためにペプチドの適切な混合物が必要と
される。個々のペプチド又はペプチド混合物が、固相に
結合されており、しかし、個々の反応を観察及び評価で
きるように、例えば直線免疫検定の場合のように物理的
に分離されている試験システムを使用すれば、単数又は
複数の感染性因子から誘導された個々のウイルス性抗原
に対する抗体を、個々に検出し、同時に同定することが
可能である。このような試験は、望ましい結果を達成す
るためには、ペプチド混合物の適切な組合せの使用を必
要とする。
往々にして、進行中の又は過去の感染の診断のため
に、単一のペプチドではなくむしろ複数のペプチドの混
合物を使用することが好ましい。単一のエピトープに対
する個々の応答はかなり可変的でありうるので、抗体試
験においていくつかの免疫学的に重要なエピトープが存
在する場合に、より信頼性の高い結果が往々にして得ら
れる。しかしながら、各ペプチドは化学的に独特のもの
であるので、1つの試験の中に望ましいペプチドの全て
を取込むことは、特にペプチドを固相上に直接コーティ
ングしようとする場合に、往々にして困難である。全て
のペプチドが固相に結合できるわけではなく、混合物中
のペプチドは、pH、イオン強度及び緩衝液組成に関して
非常に異なる最適コーティング条件を示しうる。
ストレプトアビジン又はアビジンでコーティングした
プレートに結合させた場合に、混合物中でビオチニル化
ペプチドがいかにうまく機能するかを決定するため、HC
V−1ペプチドTM−HCV−1(前記では1a.1と呼んでい
る)及びV3−mn(前記では1b.4と呼んでいる)、HIV−
2ペプチドTM−HIV−2(前記では2aと呼んでいる)、
ならびにC型肝炎ウイルスペプチドII、IX及びXVIIIの
N末端ビオチニル化バージョンの2つの混合物を作っ
た。混合物Aは、1ミリリットル当り1マイクログラム
(合計で1ミリリットルにつきペプチド6マイクログラ
ム)の濃度で6つのビオチニル化ペプチドの各々を含ん
でおり、一方、混合物Bには、1ミリリットル当り0.1
マイクログラム(合計で1ミリリットル当りペプチド0.
6マイクログラム)の濃度で各ペプチドが存在してい
た。個々のペプチドを、1ミリリットルにつき1マイク
ログラムの濃度でコーティングした。比較のために、混
合物A及びBを、マイクロタイタープレートのウェル上
に直接コーティングもした。HIV−1、HIV−2及びHCV
−血清陽性ドナーからの試料を試験し、血清陰性血液ド
ナーからの血清と比較した。反応が陽性か陰性かを決定
するため、0.250をカットオフ吸光度値とした。0.250以
上の吸光度値を陽性とみなし、一方、この値より下の吸
光度値は陰性とみなした。この実験の結果を表8に示
す。
個々のペプチドに対する反応に基づくと、HCV血清試
料は全て、HIV−1又はHIV−2のいずれかに対する抗体
について陰性であった。1つのHIV−2試料(No.1400)
は、HCVペプチドXVIIIに対する抗体を有していた。試験
したHIV試料のうち、交叉反応性を示すものは全く存在
せず、個々のペプチドに基づくELISAは特異的である。
混合物A及びBは、両方共、アビジンでコーティング
したマイクロタイタープレートに結合させた場合、優れ
た結果を与えた。予想通り、これらの混合物は、HIV−
1、HIV−2及びHCV陽性の血清によっては認識された
が、血清陰性血液ドナーからの血液によっては認識され
なかった。これとは対照的に、これらの混合物をマイク
ロタイタープレート上に直接コーティングした場合、結
果はかなり満足度の低いものであり、数多くの試料が、
適用したカットオフ値よりも下に入る反応を与えた。こ
れらの結果は、直接固相上にコーティングされたペプチ
ドに比較して高められたアビジンに結合したビオチニル
化ペプチドの免疫学的認識、ならびに複数の抗体検出の
ためにペプチド混合物を用いることの利点を、かなり説
得力のある形で例示するのに役立つ。
例12:HCVの診断上有用な領域におけるエピトープのマッ
ピングのためのビオチニル化ペプチドの使用 例6において、コア、NS4及びNS5のようなHCVポリタ
ンパク質の診断上重要ないくつかの領域を、重複する20
−merのビオチニル化ペプチドを用いて同定できること
が立証された。さらに広範に血清学的試験を行なうこと
により、これらのビオチニル化ペプチドを利用した直線
免疫検定の開発を可能にした最も有用な20−merビオチ
ニル化ペプチドが同定された。しかしながら、これら20
アミノ酸の長さの配列中のどこにエピトープが位置して
いるかをより正確に知ることが望ましい。その理由の1
つは、より短い配列が同定できた場合、ペプチドが極端
に長くなることなく2つ又は3つのエピトープを含む合
成ペプチドを作ることが可能になるという点にある。
推定HCVタンパク質の1つの位置に存在するエピトー
プは、Geysen,H.M.,Meloen,R.H.及びBarteling,S.J.;Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81:3998−4002によって
初めて記載された方法を用いてマッピングされた。8ア
ミノ酸の重複を伴う9アミノ酸の長さの連続的なペプチ
ドを、開裂不可能なリンカーで誘導されたポリエチレン
ピン上で合成した。このペプチドの長さが選ばれたの
は、それが、一般に5〜7アミノ酸の長さである標準的
な線状エピトープのサイズよりも大きいためである。9
−mersを合成することにより、エピトープが見逃がされ
る確率は最小限におさえられることになる。
HCVポリタンパク質の走査された領域は、コア配列(a
a1〜80)、NS4(aa1688〜1755)、及びNS5(aa2191〜23
30)を含んでいる。これらの領域は、予め決定された20
−mers、すなわちペプチドI〜VII(コア1〜13)、ペ
プチドVIII〜XIV(NS4−1〜9)及びペプチドXV〜XIX
(NS5−13〜33)に相当する。
合成の後、アミノ末端の天然でない正の電荷を除去す
るため、側鎖脱保護に先立って、全てのペプチドをN−
アセチル化した。
その後、ペプチドを、HCV血液陽性ドナーからの血清
中に存在する抗体によって認識されるその能力について
検定した。これらの実験の結果を図6a〜6cに示す。図示
されている光学密度値は、重複した測定値の平均であ
り、9−mer配列の最初のアミノ酸に割り当てられてい
る。
10個の異なるHCV血清の抗体結合プロフィールを図6a
に示す。HCVのコアタンパク質が、合成ペプチドにより
容易に刺激される明確な線状エピトープを呈するという
ことは明らかである。少なくとも表面的には、ほとんど
の血清はきわめて類似したパターンを示すように見え
る。しかしながら、より密に検査すると、個別の相違が
あることが明らかになる。抗体により認識されたHCVコ
アタンパク質のさまざまな領域は、まちがいなく、各領
域がポリクローナル血清を用いて区別することが不可能
でなければ困難であるいくつかの重複するエピトープか
ら構成されているので、恐らくそのままのエピトープと
いうよりもむしろエピトープ性クラスターと呼ぶ方が適
切であると思われる。これらのエピトープ性クラスター
の各々におけるコアエピトープを同定するための試みを
行なった。この意味で、「コア」という語は、抗体によ
って認識可能な最小限のアミノ酸配列のことを言う。し
かしながら、コア配列に加えてアミノ酸が、特にポリク
ローナル血清の場合において反応性を改善しうるという
ことを強調しておくべきであろう。エピトープの分析を
表9に示す。さまざまな血清の反応を比較することによ
り、エピトープ性クラスターのサブドメインを同定する
ことができた。いくつかの血清は1つのサブドメインと
優先的に反応するが他のサブドメインとは反応せず、一
方、その他の血清は全てのサブドメインを認識するもの
の、各々がその特定のエピトープ性クラスターを構成す
る大きいピークにおいて肩部を形成することから、なお
もサブドメインの区別を許す。表9及び図7aは、20−me
rsの配列との関係におけるコアエピトープの場所を示し
ている。
20−merコアペプチドの各々に相当する一連の9−mer
sを、試験した抗血清の1つに関する抗体認識プロフィ
ールと関連させたこれらの配列を各々の位置づけと合わ
せて、図7aに示す。
10の血清を用いて得られたNS4に対する抗原プロフィ
ールを、図6bに示す。一般に、9−mersとこれらの血清
との反応は、コアタンパク質からのペプチドとの反応に
比べ、さほど強いものではなかった。それでもなお、ウ
イルス性NS4タンパク質のN末端配列内のエピトープ領
域を同定することは可能であった。これらのエピトープ
のコア配列は表10で分析されており、この領域において
診断上重要な20−merの合成ペプチドに対するその関係
を示している。異なる20−mersに対応する9−mersを、
抗原プロフィールの一例と関連させたその位置づけと合
わせて、図7bに示す。20−mersがこの領域内のエピトー
プにかなり良く対応していることがわかる。
走査されたNS5タンパク質の部分は、20−merペプチド
13〜33により網羅される領域に相当する。この領域で得
られた抗原プロフィールを図6cに示す。ここでも又、コ
アエピトープを定義づけする試みを行なった、これらを
表11に列挙する。この配列のアミノ末端部分には抗体結
合はほとんど見られなかった。図7cには、20−merペプ
チドNS5−21〜NS5−31に対応する9−mersが列挙され、
抗原プロフィールの1つと関連させたそれらの位置が示
されている。
特に、HCVペプチドXVI(NS5−27)によって表わされ
る配列の重要性は、重複する9−mersを用いて得られた
結果に基づくと著しく過小評価されたであろうというこ
とが明らかである。この配列の重要性は、同様に、マイ
クロタイタープレート上への直接コーティングに続くEL
ISAにおいて非ビオチニル化HCVペプチドXVI(NS5−27)
が評価された場合にも、過小評価されたであろう(表4B
参照)。しかしながら、このペプチドのビオチニル化バ
ージョンをストレプトアビジン又はアビジンでコーティ
ングされたプレートに結合させた場合、診断上価値のあ
る非常に重要なエピトープの存在が明らかになる。
9−mersの場合に見られる往々にして弱い結合とは対
照的に、20−mersでの結合は、往々にして非常に強い
(表12参照)。いくつかのケースでは、相違は劇的であ
る。例えば、血清8241はいずれの9−mersも認識しない
のに対し、ペプチドHCV2(ペプチドIX)及びHCV5(ペプ
チドXI)に対する結合は非常に強い。ペプチドHCV7(ペ
プチドXIII)に対する中程度の結合も観察された。この
ことは、20−mersには存在するが9−mersには存在しな
いこれらのエピトープに対する重要な構造的成分が存在
することを表わしていると思われる。
例13:HCV直線免疫検定のNS1領域のN末端におけるエピ
トープの同定のためのビオチニル化ペプチドの使用 エピトープは、直線免疫検定(LIA)を用いても同定
することができる。一般に、非ビオチニル化ペプチド
は、ポリスチレンELISAプレートに対してよりもナイロ
ン膜に対してより良く結合する。それでもなお、ストレ
プトアビジン又はアビジンと複合体形成したビオチニル
化ペプチドは、直線免疫検定において、膜に直接結合さ
れたその非ビオチニル化対応物よりも優れた結果を与え
る。これを例示するため、HCVペプチドXX g−1及びXX
g−2の非ビオチニル化及びN末端ビオチニル化バージ
ョンを合成した。非ビオチニル化ペプチドは、1ミリリ
ットル当り100マイクログラムのペプチドを含む原液と
して膜に適用し、一方、ビオチニル化ペプチドは、スト
レプトアビジンに結合させ、1ミリリットル当り100マ
イクログラムの複合体の原液として適用した。従って、
原液中のビオチニル化ペプチドの量は、1ミリリットル
当り約100マイクログラムであった。反応の強度を評価
する上での助けとするため、3つのヒトIgG対照ライン
をもストリップに適用した。抗原ラインの適用の後、膜
上の余分な結合部位を、リン酸緩衝生理食塩水中のカゼ
インを用いてブロッキングした。その後、膜を、抗原ラ
インを適用した方向に対して垂直にストリップの形に裁
断し、結果として得られたストリップを、HCV血清陽性
ドナーからの血清パネルと共にインキュベートした。結
合した抗体を、酵素アルカリホスファターゼにコンジュ
ゲートされたヤギ抗ヒトIgG抗体を用いて、5−ブロモ
−4−クロロ−3−インドリルホスフェートとニトロブ
ルーテトラゾリウムを添加した後、視覚的に検出した。
結果を図8に示す。
反応の特異性は、HCV血清陰性ドナーから得た3つの
血清(33、34及び35)によりHCVペプチドのいずれかに
対する検出可能な抗体結合の欠如によって実証される。
非ビオチニル化HCVペプチドXX−1及びXX−2に対する
血清1〜32の反応は、一般に存在しないか又はきわめて
弱い。これとは対照的に、試験した血清の多くは、スト
レプトアビジンと複合体形成したこれらのペプチドのビ
オチニル化バージョンを認識した。ビオチニル化ペプチ
ドに対する抗体反応は、非ビオチニル化ペプチドの原液
中に存在する量に比較してこれらの原液中には約10分の
1の量のペプチドしか存在しなかったという事実にもか
かわらず、有為に強いものである。ビオチニル化ペプチ
ドを用いて得られた結果は、ペプチドの非ビオチニル化
バージョンを用いた場合には明らかでないこれらのペプ
チド配列中の診断上有用なエピトープの存在を実証して
いる。
さらなる評価のため、異なるHCV分離株のHCV E2−NS
1領域の超可変性N末端にまたがる合計8つの配列(HCV
ポリタンパク質のaa383〜416)を選択した。これらの整
列させた配列(一文字コード)は以下のとおりである: これらの配列は、以下のグループによって記載された
分離株から誘導されている: (1)Hijikata et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.1
75:220−228,1991。
(2)結果未公開。
(3)Hijikata et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.1
75:220−228,1991。
(4)Kato et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9524−
9528,1990。
(5)Takamizawa et al.,J.Virology 65:1105−1113,1
991。
(6)Weiner et al.,Virology 180:842−848,1991。
(7)Okamoto et al.,Japan.J.Exptl.Med.60:167−17
7,1990。
(8)Kremsdorfl et al.,Abstract V64,HCVに関する第
3回国際シンポジウム,Strasbourg,France,September,1
991。
配列がやや長く、合成中に二次構造に関連する問題点
が発生することが予想されたことから、配列を、重複す
る2つの部分(「a」=HCVポリタンパク質のアミノ酸3
83〜404、「b」=アミノ酸393〜416)に分割すること
が決定された。配列を細分割することによって、エピト
ープの位置がより正確に定義づけされ得ることにもな
る。
ペプチドは、全てN末端ビオチニル化し、ストレプト
アビジンと複合体形成させ、LIAストリップの調製に使
用した(データは示さず)。
LIA陽性試料のみを考慮した場合、E2/NS1ペプチドに
関する検出率は、およそ90パーセント台であることがわ
かった。E2/NS1ペプチドの認識とLIA反応性との間の相
関関係ならびに個々のペプチドに対するスコアを、表13
に示す。観察された反応から、この配列中の一次エピト
ープが超可変領域のカルボキシ末端に向かって位置して
いることも同様に明らかであった。ただし、これには例
外があった。各々の血清は、このエピトープがLIAにお
いて1本のラインとして含まれる場合、異なる配列の混
合物を用いることの重要性を過小評価する独自の認識パ
ターンをもつように思われた。同様に、タイプ1aとタイ
プ1bの配列の間にはかなりの程度の交叉反応性が存在す
るか、又は大部分の人々が二重感染しているかのいずれ
かであるとも思われた。1つの配列に結合する抗体を選
択的に除去し、その他の配列の抗体認識に対する効果が
いかなるものであるかを見ることによって、これら2つ
の可能性を区別することは単純なことである。多くの試
料が、1つ又はそれ以上のE2/NS1ペプチドに対してやや
弱い反応を与えたものの、LIA陰性であった。擬陽性反
応である確率が最も高いものの、これらの血清は、以前
に感染したものの感染を消滅させた人からのものである
可能性もある。
例14:LIAによる抗体の検出のための、HCVのコア領域か
らの組合されたHCVペプチドの使用 HCVのELISA又はLIAにおけるペプチドの総数を減少さ
せるため、その他の免疫学的に重要なペプチドにまたが
るビオチニル化ペプチドを合成することができる。HCV
のコアタンパク質NS3領域からのこのような「組合わさ
れた」HCVペプチドの例を、以下に示す: これらのペプチド全てには、アミノ末端に1つのビオ
チンとGly−Glyスペーサーが備えられていた。ペプチド
を、直線免疫検定実験(LIA)において評価し、より短
いコアペプチドと比較した。結果を図9に示す。より長
いコアは、より短いペプチドに比べて好ましく、一貫し
てより強い反応を示す。これは、(i)長い方のペプチ
ドが、以前は2つの別々のペプチド上に広がっていた2
つ以上のエピトープを取り込んでいる場合、及び/又は
(2)長い方のペプチドにおいてさらに卓越したもので
ありうる何らかのコンフォーメーション上の貢献が存在
する場合に、説明しうる。
例15:LIAによる抗体の検出のための、HCVのNS4及びNS5
領域からの組合されたHCVペプチドの使用 その他のペプチドにおいては、次のもののようなNS4
及びNS5内の配列が組合わされている: より長いペプチドを使用することの一般的利点は、EL
ISA又はLIAにおけるその使用が、免疫学的に重要なエピ
トープを担持するその他のペプチドを取り込むためのよ
り多くのスペースを残すという事実にある。
例16:LIAによる抗体の検出のための、型特異的HCV NS4
ペプチドの使用 NS4のエピトープを含むことがわかった1型ペプチド
に対応するHCV2型及び3型NS4配列を含む等価ペプチド
を合成した。比較のために、これらのペプチドの配列を
以下に示す: LIAストリップを、これらの9つのペプチドを用いて
調製し、それを、その後、異なる血清を用いてインキュ
ベートした。結果を図10に示す。1型のNS4ペプチドに
関して以前陰性であった血清のうちの2つが、3型及び
2型のペプチドに対して陽性の反応を示した。このこと
は、これらのペプチドを用いてNS4検出率を増大するこ
とが可能であることを表わしている。
例17:HIV抗体の検出のための直線免疫検定における、異
なるHIV−1分離株のgp120のV3ループ領域からのビオチ
ニル化ペプチドの使用 gp120のV3ループ領域の一般的な診断上の価値を決定
するために、9つの異なるHIV−1分離株のこの領域か
ら誘導された9つのペプチドを合成し、LIAに用いた。
9つのペプチドは全て、Gly−GlyスペーサーとN末端ビ
オチンを備えていた。整列させたペプチド(一文字アミ
ノ酸コード)配列は、以下のとおりである: ペプチドを、ビオチン結合部位に対しわずかにモル過
剰のストレプトアビジンと混合し、ペプチド:ストレプ
トアビジン複合体を、SephadexG−25上で未結合の物質
から分離した。ボイド容量中に溶出する材料を、LIAの
調製に使用した。
さまざまな地理的地域から得られた合計332の血清を
試験した。ヨーロッパ又は北米で単離されたウイルス株
が、アフリカの分離株と比べて低い株ごとの変動性を示
すことがわかっているため、V3−ループ配列認識におけ
る地理的な差は予想されるものであった。さまざまなラ
インの反応を、陽性(i)又は陰性(o)として評価し
た(データは示さず)。
血清の完全な評価を表14に示す。合計で、332のうち3
07の血清が、V3−ループLIAに関して少なくとも1つの
ペプチドに対する反応を示した。V3−ループLIAでいか
なるペプチドに対しても反応を示すことのなかった血清
は、ウェスタンブロット法で試験して、その血清が本当
に抗HIV−I抗体について陽性であったか否かを決定し
た。6つの血清が実際には陰性であることがわかった。
従って、試験した陽性血清の合計数は326であった。し
かしながら、V3−ループLIAのいずれとも反応しなかっ
たgp120に対する抗体を含む血清が19あり、陽性反応を
示す血清のパーセンテージは、包括的に言って94%であ
った。しかしながら、著しい地理的差異が存在してい
た。これらの差異を表15に示す。
少なくとも1つの陽性反応を示す異なる地理的地域か
らの血清の合計パーセンテージは、以下のように要約で
きる: ヨーロッパ 100% アフリカ 94% ブラジル 92% ヨーロッパの試料を用いてさらに評価すると、このパ
ーセンテージが実際には100%より幾分か低いものであ
るということがわかる(データは示さず)。LIAにおい
て反応を示さなかったアフリカの試料は、その他のHIV
抗体の存在を確認するべくウェスタンブロット法によっ
て試験されなかった。
ヨーロッパの血清が優れたスコアを示すことは、予想
されていた。アフリカの血清について得られたより低い
スコアも、アフリカにはより高いウイルスの不均一性が
存在することがわかっているため、全く予想外ではなか
った。HIVのアフリカ株のV3−ループ配列はヨーロッパ
や北米の株ほど広範に特徴づけされていなかったため、
我々が代表的配列をもっていないか、又はあまりにも配
列多様性が大すぎるので、コンセンサス配列に関してア
フリカ株を特徴づけしようとすることは不可能であるこ
とが明白である。ブラジルの血清を用いて得られた結果
は、ブラジルにおけるHIV変動性に関してこれまで何も
報告されていなかったことから、予想できないものであ
った。これらの結果から、ブラジルにおける状況は、ア
フリカの状況とより密接に似通っており、北米又はヨー
ロッパの状況とは似通っていないと思われる。
例18:ブラジル分離株から誘導されたV3配列を用いたブ
ラジルの血清中のHIV−1抗V3ドメイン抗体の改良型検
出 前述のLIAストリップ上に存在するどのHIV−1V3ルー
プ配列も認識しなかったが、ウェスタンブロット上のHI
V−1gp120タンパク質を認識する抗体については陽性で
あったブラジルの血清試料を、さらなる研究のために選
択した。これらの試料のうちの1つにおいて、血清試料
中に存在するウイルスのV3ループ配列を、超可変ドメイ
ンに隣接するより定常的な領域から誘導されたプライマ
ーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅すること
ができた。結果として得られたDNAフラグメントを、続
いてクローニングし、ヌクレオチド配列を決定した。こ
のフラグメントによりコードされる推定アミノ酸配列に
相当するペプチドを合成し、さまざまなHIV−1抗体陽
性血清によって認識されるその能力について試験した。
このペプチドの配列は、以下のとおりであった: 2つのグリシン残基から成るスペーサーを、アミノ末
端に付加した。その後、結果として得られたN末端グリ
シン残基をビオチニル化した。ヨーロッパ、アフリカ及
びブラジルのHIV−1抗体陽性血清がこのペプチドを認
識する能力を調べ、これら同じ血清のELISAにおけるコ
ンセンサス配列ペプチド認識能力と比較した。同様に、
2つのペプチドを1つの混合物として一緒に評価した。
これらの結果を表16に要約する。これらの結果は、ヨー
ロッパ又はアフリカ産の血清を用いる場合、V3−368ペ
プチドが、V3conペプチドで見られるものに比べて増大
した抗V3ループ抗体の検出という結果をもたらさないこ
とを立証している。それとは対照的に、V3−368ペプチ
ドの使用は、ブラジルの血清でのV3抗体検出において著
しい改善をもたらす。このペプチドはV3conペプチドに
比べて少ない頻度で認識されるが、2つのペプチドは互
いに相補って、検出率を、V3conペプチドを単独で用い
た場合の83.3パーセントから2つのペプチドを一緒に用
いた場合の97.2パーセントまで上昇させる。
例19:HIV−2V3ループ配列の抗体認識 HIV−2の外膜糖タンパク質(gp105)は、その編成に
関してHIV−1のそれと類似している。HIV−1のgp120
タンパク質と同様に、HIV−2のgp105のタンパク質は、
比較的保存されたアミノ酸配列のドメインと隣接する可
変的配列のドメインから成る。このウイルスによる感染
に応答して産生されたHIV−2のV3ドメインに対して特
異的な抗体を検出するため、HIV−2/SIV分離株GB12及び
分離株SIVmm239のV3配列に対応するビオチニル化ペプチ
ドを合成した(Boeri,E.,Giri,A.,Lillo,F.et al;J.Vir
ol.(1992)66(7):4546−4550)。合成されたペプチ
ドの配列は、以下のとおりである: スペーサーとして役立つよう各ペプチドのN末端に2
つのグリシン残基を付加し、結果として得られたN末端
グリシンのα−アミノ基にビオチンをカップリングし
た。ペプチドをストレプトアビジンに結合させ、マイク
ロウェルプレートのウェル内をコーティングした。ELIS
Aにおいてこれら2つのペプチドを評価するため、HIV−
2抗体陽性血清を使用した。これらの結果を表17に要約
する。これらの結果は、HIV−2感染の診断に対するこ
れら2つのペプチド配列の有効性を明らかに立証してい
る。
例20:ビオチニル化ペプチドを用いたC−100のカルボキ
シ末端におけるエピトープの局在化 C−100タンパク質のカルボキシ末端部分に向かって
位置するエピトープについては、さまざまな報告書が存
在してきた(EP−A−0 468 527、EP−A−0 484
787)。5−1−1フラグメント内に位置するエピト
ープに対してではなく、このエピトープに向かってのあ
る種の血清の反応性によって、これらの血清が、何故C
−100に関しては陽性反応を示すが上述の例に記されて
いる上述のペプチドに対しては示さないのかを説明する
ことができた。合成された5つの重複するビオチニル化
ペプチド、NS4−a、b、c、d及びeを図11に示す。
これらは、最後の3つのアミノ酸を除いてC−100のカ
ルボキシ末端を網羅している。これらのペプチドを用い
て調製したLIAストリップを、一連のHCV抗体(Ab)陽性
及び陰性血清を用いて試験した。この実験の結果(デー
タは示さず)を以下に要約する: ペプチド 反応性血清の数 パーセンテージ NS4−a 0 0% NS4−b 2 3% NS4−c 0 0% NS4−d 0 0% NS4−e 16 27% 例21:異なるHCVタンパク質からのエピトープを含むビオ
チニル化されたハイブリッドペプチドの使用 9−mersを用いたHCVポリタンパク質の免疫学的に最
も重要な領域におけるエピトープの詳細なマッピング
を、例12に示すとおりに行なった。この情報を用いて、
2アミノ酸の長さのスペーサーで分離されたHCV配列の
3つの9−merストレッチから成る3つのペプチド配列
が考案された。一般に、鎖の柔軟性を提供するため、Gl
y−Gly、Gly−Ser又はSer−Glyスペーサーが用いられ
た。合成された3つのハイブリッドペプチド内のエピト
ープの配置及びその配列を、図12に示す。LIAストリッ
プ上で3つのペプチドを評価した。第1の評価では、エ
ピトープの詳細マッピング実験で当初用いた血清がエピ
トープとの精確な相互作用が知られていることから、こ
れらの血清を用いた。これらの結果を、図13に示し、表
16に要約する。エピトープがこれら3つのハイブリッド
ペプチドに取り込まれる順序は任意であった。しかしな
がら、個々の9−mersに基づく試験を開発しようとする
よりは、むしろエピトープを合わせて、限られた数のペ
プチド鎖にリンケージさせることが有利である。別々の
9−mersを使用すると、プレート上のストレプトアビジ
ン結合部位(1つの9−mers当り1つのビオチン結合部
位)は急速に飽和し、一方、これらの実験において行な
ったように限られた数のペプチド内に9−mersを取り込
ませれば、1つが3倍の結合を行なうことが可能になる
(3つの9−mersにつき1つのビオチン結合部位)。
例22:E2/NS1「b」配列ミクソトープペプチド 合成ペプチドを用いた結果(上記の例を参照)は、大
部分のHCV血清陽性の血清がE2/NS1の超可変N末端に向
けられた抗体を含んでいることを表わしていた。しかし
ながら、このタンパク質のこの領域の超可変性のため、
許容可能なほど高いパーセンテージの血清においてこれ
らの抗体を検出するには、かなり広範な配列スペクトル
を使用することが必要である。利用可能な配列の分析
は、観察されたアミノ酸置換が完全に無作為のものでな
く、配列内のある位置にはあるアミノ酸が好まれるとい
うことを明らかにした。超可変配列はかなり長いもので
あるため、生成物の質を改善し合成を単純化するため、
この配列を、重複する2つの部分(「a」及び「b」)
に分割した。この領域を細分割することにより、抗体に
より最も頻繁に認識されるE2/NS1タンパク質のこのN末
端セグメントの部分が、これらの配列の「b」バージョ
ンに包含される領域の中に位置するということも、決定
することができた。図14に示す配列情報に基づいて、検
査した天然の分離株に見られる全てのアミノ酸を各位置
に含む「ミクソトープ」を合成した。ミクソトープの合
成において用いた戦略を、図15に記す。ミクソトープを
設計するための戦略は、Gras−masse et al.,Peptide R
es.(1992)5:211−216において総説されている。樹脂
は、カップリングすべきアミノ酸の数に等しい数の部分
に分割した。カップリング反応は、さまざまなアミノ酸
の間でのカップリング動態の差により生じる問題を避け
るため、個別に行なった。カップリング反応の後、樹脂
部分をプールし、よく混合した。この23アミノ酸の長さ
の配列について得られた変異体の合計数は、+1.147×
1,010であった。カルボキシ末端又はアミノ末端から測
定した鎖の長さの関数としての増大する変異体数を、図
14に示す。ミクソトープアプローチの背後にある原理
は、エピトープが、抗体結合に対する貢献度が等しくな
いアミノ酸で構成されているということである。抗体
は、いくつかの位置において比較的多数の(一般に無作
為でない)置換があったとしても、1つのエピトープを
認識する可能性がある。この点に関して、ミクソトープ
の抗原的複雑性は、混合物を含む変異体の数よりも実質
的に小さいはずである。例示を目的として、平均的エピ
トープの長さが6アミノ酸であると仮定したならば、配
列内の連続した6つのアミノ酸という長さをもつセグメ
ントの各々について変異体数を計算することが可能であ
る。配列内の位置の一関数としての変異体数を、図14に
示す。機能的変異体配列の実際の数は、偶然1つのエピ
トープに相当する6アミノ酸の長さのあらゆる配列につ
いて示された数を、エピトープの各位置における許容さ
れる置換の数に等しい縮重係数で割り算した数に等しく
なるが、しかし特定の置換が許容される度合を反映する
べく修正された。残念なことに、エピトープの正確な位
置はわかっていない。これが無作為のペプチドライブラ
リーでないということは明白に述べておくべきである。
天然の分離株におけるアミノ酸変異の欠如によって明ら
かにされているように、合計配列中の置換を許容しない
主要な位置が保存される。この合成アプローチに関する
1つの欠点は、稀なアミノ酸置換が過度に代表され、よ
り一般的に遭遇するアミノ酸を減殺する傾向をもつとい
うことにある。一方、稀な置換の過度の代表が、より頻
繁に遭遇するアミノ酸を含むエピトープ配列で検出不可
能な抗体の検出を許す可能性がある。ミクソトープの合
成の完了後、免疫学的評価を容易にするため、全てのペ
プチド鎖に(Gly)スペーサー及びビオチンを備えさ
せた。ミクソトープの多重抗原ペプチド(MAP)も、平
行して合成することができる。
以前の研究の1つの結果は、HCV陽性血清の約90パー
セントが、調査された16の「a」及び「b」配列を伴う
N末端超可変領域に対して向けられた抗E2/NS1抗体を含
むことが立証できたということにあった。残りの10パー
セントのHCV抗体陽性血清におけるこれらの抗体の見か
け上の欠如は、1)患者がE2/NS1のこの部分に対する抗
体を産生しなかったか、又は2)これらの抗体を検出す
る正しい配列がまだ同定されていなかったという2つの
要因によるものであることが考えられた。HIV−1V3ルー
プでの実験に基づくと、この後者の可能性は全く非現実
ではないと思われる。ミクソトープに加えて以前に用い
た8つの「b」配列を含むLIAストリップを調製した。
8つの規定された配列のうち少なくとも1つについて以
前陽性とスコアされた血清ならびに陰性とスコアされた
血清を選択した。合計で60の血清を試験し、そのうち56
は以前に陽性反応を示したものであり、4つは以前に陰
性であることがわかったものであった。以前陽性とスコ
アされた56の血清のうち、21はストリップ上のペプチド
のうちわずか1つ又は2つと反応するか、又は非常に弱
い反応を示した(データは示さず)。ミクソトープは、
試験した全ての血清の約3分の1によって認識された。
いくつかの血清のミクソトープに対する反応は驚くほど
強かったが、ミクソトープの基礎となったE2/NS1配列の
収集物は真に代表的なものではなかった可能性がある。
ミクソトープMAPは、E2/NS1のアミノ末端に対して向け
られた特異性の広い抗血清の産生を惹起することが予想
される。
例23:抗体を産生させるための、分岐状HCV N末端E2/N
S1領域ペプチドの使用 E2/NS1のN末端からのいくつかの配列を、Tam(Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 85:5409−5413,1988)により記載さ
れた技術を用いて多重抗原ペプチド(MAP's)として合
成するために選択した。分岐状ペプチドを合成するのに
用いた戦略を、図16に概略的に示す。初回注射をウサギ
(各MAPにつき2匹)に施し、1回追加免疫(ブース
ト)してから、抗体産生の第1回目の評価のため採血し
た。合計16のE2ペプチド(8つの1型分離株から誘導さ
れた配列の、各々の「a」及び「b」バージョン)を含
むLIAストリップ上で抗血清を試験した。LIAストリップ
を検査したところ、ウサギの体内で産生させた抗体とス
トリップ上のさまざまなE2ペプチドとの間には著しい交
叉反応が存在することがわかる(図17)。異なる抗血清
によって認識される「a」及び「b」の両方のバージョ
ンが見い出されうるという事実は、これら2つのバージ
ョンが重複する領域内に少なくとも1つのエピトープが
位置しているということを表わしている。
例24:ビオチニル化合成ペプチドを用いたHTLV感染の診
断 HTLV−I及びIIは、抗原的に関連する、発ガン性レト
ロウイルスのファミリーのメンバーである。HTLV−I感
染は、2つの疾患症候群、すなわちHTLV−I関連骨髄症
/熱帯性痙性不全対麻痺(神経障害)及び成人T細胞白
血病(ATL)と関連していることが立証されている。こ
れとは対照的に、HTLV−IIは、既知のいかなる疾患症候
群とも決定的に結びつけられていない。このウイルス
は、元来ヘアリーセル白血病患者から分離されたもので
あるが、HTLV−II感染と該疾患状態との間にはいかなる
因果関係も確立されていない。HTLV−I感染が人間の病
気をひき起こす可能性をもつことが決定的に実証されて
きた一方で、HTLV−II感染については実証されていない
ことから、これら2つの感染性因子を区別できること
は、臨床学的に興味深い。これら2つのウイルスは、抗
原的に高度の関連性を有することから、抗体検出のため
にウイルス性又は組換え型抗原を用いる場合、HTLV−I
及びHTLV−IIを区別することは困難である。数多くのビ
オチニル化ペプチドを合成し、HTLV−I又はHTLV−IIに
よる感染に応答して産生された抗体を検出するその能力
について評価した。これらのペプチドのうちいくつか
は、それらがHTLV−IとHTLV−IIの間で高度に保存され
ているエピトープを含み、従ってウイルスタイプとは無
関係にHTLV感染を検出するための有効な試薬となるはず
であることを理由として、選択された。さらにその他の
ペプチドは、それらがHTLV−IとHTLV−IIの感染を区別
できるようにするはずのエピトープを含んでいることを
理由として選ばれた。合成したペプチドは以下のとおり
である。
多数のこれらのペプチドを用いて、HTLVに対する抗体
の検出のためのLIAストリップを調製した。これらのペ
プチドのいくつか、例えばそれぞれHTLV−I p19gagタ
ンパク質及びエンベロープ糖タンパク質の領域から誘導
されたI−p19及びI−gp46−4のようなペプチドが、
2つのウイルスにおいてこれらの配列がきわめて相同性
が高いことから、HTLV−I及びHTLV−IIの両方の感染の
結果として産生された抗体によって認識されると予想さ
れる。HTLV−IについてはI−gp46−3、I−gp46−
6、そしてHTLV−IIについてはII−gp52−1、II−gp52
−2及びII−gp52−3といったその他のペプチドは、抗
体の検出ならびに区別に有用でありうる。HTLV−IとHT
LV−IIの配列の間には幾分かの相同性があることから、
交叉反応が予想される。しかしながら、さまざまなペプ
チドに対する反応の強さは、抗体の産生された対象であ
るウイルスのアイデンティティを明らかにするはずであ
る。
多数のビオチニル化されたHTLV−I及びHTLV−IIペプ
チドを用いて調製したLIAストリップの例を、図×××
に示す。LIAストリップは、市販の血清パネル(Boston
Biomedica Inc.,混合タイターパネル、PRP203)を用い
て評価した。テスト結果は、販売業者が提供した分析と
完全に一致している。HTLV−Iに対してはわずか1つの
試料(nr.9)のみが陽性であった。試料nr.12は、ペプ
チドI−p19に対する陽性反応のために陽性として検出
されている。この試料は、これらのペプチドを用いて識
別することができず、又、血清パネルの販売業者により
用いられたその他のいかなる試験によっても識別できな
かった。試料nr.11は陰性であり、その他全ての試料はH
TLV−IIに対して陽性であることがわかった。付加的な
実験において、ビオチニル化されたHTLV−I及びHTLV−
IIペプチドを10個全て用いてELISAを行なった。ペプチ
ドをストレプトアビジンと個別に複合体形成させ、次に
コーティングに先立って混合した。LIAストリップを評
価するために用いたパネルからの試料のいくつかを用い
て、ELISAにおいてペプチドを評価した。これらの結果
を表に示す。この形態でのELISAは、HTLV−I及び−II
感染を区別するのに使用できないが、ウイルスタイプの
如何にかかわらずHTLV陽性試料全般を同定するはずであ
る。この結果は、さらに、HTLV感染の診断のためのこれ
らのペプチドの有用性を立証している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI G01N 33/576 G01N 33/576 Z (56)参考文献 特開 昭64−63382(JP,A) 特開 平2−233697(JP,A) 特開 平4−330098(JP,A) 特表 平7−501442(JP,A) 特表 昭60−500673(JP,A) 特表 平5−503722(JP,A) 国際公開93/10239(WO,A1) 欧州公開442394(EP,A1) Biological Chemis try Hoppe−Seyler, 372(3),p.163−172(1991) (54)【発明の名称】 免疫学的に重要なエピトープに相当するペプチドの決定方法、及び免疫学的に重要なエピトープ に相当するビオチニル化ペプチド又は抗体の決定のための方法におけるその利用、その調製方法 及びそれを含む組成物

Claims (17)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】C型肝炎ウィルス3型に特異的なアミノ酸
    配列からなるNS4領域由来のペプチドであって、以下の
    もの: (式中、Aは、それが存在する場合には、1個又は複数
    個のアミノ酸を表わし、Zは、それが存在する場合に
    は、1個又は複数個のアミノ酸を表わす。) からなる群から選択されるペプチド。
  2. 【請求項2】以下のもの: から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項1記載の
    ペプチド。
  3. 【請求項3】N末端又はC末端がビオチニル化されてい
    る、請求項1又は2記載のペプチド。
  4. 【請求項4】それ自体が固相にカップリングされていて
    もよいストレプトアビジン又はアビジンにカップリング
    されている請求項3に記載のペプチド。
  5. 【請求項5】ナイロン膜上に存在するストレプトアビジ
    ンにそのビオチン基を介してカップリングされている請
    求項3記載のペプチド。
  6. 【請求項6】共有結合性又は非共有結合性相互作用によ
    り固体支持体にアンカーリングされている請求項1〜3
    のいずれか1項記載のペプチド。
  7. 【請求項7】生物学的試料中に存在するHCVに対する抗
    体を検出する方法であって、 (i)HCVの存在に関して分析する生物学的試料を請求
    項1〜6のいずれか1項記載の1つ以上のペプチドと接
    触させる工程、 (ii)上記抗体と上記ペプチドとの間で形成される免疫
    複合体を検出する工程、 を含む方法。
  8. 【請求項8】該ペプチドが、さらに、以下のもの: (式中、A及びZは、請求項1に記載の定義を有す
    る。) から選択される少なくとも一つのHCV2型NS4ペプチドを
    含有する、請求項7記載の方法。
  9. 【請求項9】該ペプチドが、さらに、以下のもの: (式中、A及びZは、請求項1に記載の定義を有す
    る。) から選択される少なくとも一つのHCV1型NS4ペプチドを
    含有する、請求項7又は8記載の方法。
  10. 【請求項10】請求項1〜6のいずれか1項記載の1つ
    以上のペプチドを含有するHCV抗体検出用診断キット。
  11. 【請求項11】請求項1又は2記載のペプチドを含有す
    る、HCV抗体検出用診断キット。
  12. 【請求項12】平行線状形態で膜に付着しているペプチ
    ドを有する、請求項10又は11記載のHCV抗体検出用診断
    キット。
  13. 【請求項13】請求項1〜6のいずれか1項記載のHCV3
    型NS4ペプチドを含有し、さらに請求項8で定義されたH
    CV2型NS4ペプチド及び/又は請求項9で定義されたHCV1
    型NS4ペプチドを含有する、試料中の異なるHCV遺伝子型
    に対する抗体の存在又は非存在を同時に検出するための
    診断キット。
  14. 【請求項14】請求項1〜6のいずれか1項記載のHCV3
    型NS4ペプチド及び請求項8で定義されたHCV2型NS4ペプ
    チドを含有する、請求項13記載の診断キット。
  15. 【請求項15】請求項9で定義されたHCV1型NS4ペプチ
    ドをさらに含有する、請求項13又は14記載の診断キッ
    ト。
  16. 【請求項16】請求項1〜6のいずれか1項記載の1つ
    以上のペプチドを使用することを含むHCV株の型決定方
    法。
  17. 【請求項17】請求項1〜3のいずれか1項記載のペプ
    チドの調製方法であって、上記ペプチドの合成を溶液中
    又は固体支持体上で行う方法。
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