JPS58201754A - 合成ｓｔ毒素、その製造方法およびそのワクチン接種剤としての用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は合成によって得られる新規ペプチド、その製造
方法および大腸菌（Ｅ　ｚｃＡｇｒｉｃｈｉａ　ＣｏＬ
ｉ　）種によって生成される熱安定性の腸内毒素を中和
することのできる抗体製造用のそれらの用途及びそれら
の製造方法に関する、ものである。

大腸菌種の生成するペプチド腸内毒素によってヒトや動
物に下痢が発生することはよく知られた事実である。ペ
プチドとしての腸内毒素に２つの群があることが確認さ
れたが、そのうちの１群として低分子量で熱安定性の腸
内毒素（以下″″ＳＴ腸内毒素”または“天然ＳＴ腸内
毒素”と称する）がある。このＳＴ腸内毒素は分子の大
きさ、アミノ酸組成、原子配置、分子内結合等でそれぞ
れ異った多様性の分子形状をとることも知られている。

このように腸内毒素といってもそれが多種多様な形態を
示すこ止のために、その同定がむずかしく、また精製し
た腸内毒素を用いなければならないことからますますそ
の困難性が大きくなる。

これまでに知られた精製法によって豚から採った大腸菌
のＳＴ腸内毒素のアミノ酸配列が決定（ＳＯＭ、　オヨ
ヒＭ　（、’　　Ｃ１４ＲＴＩＩＹ　Ｂ、（１９８０年
）ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　１ｃａｄ、　Ｓｃｉ　、　
ＵＳ　Ａ　７７＋　４０　ｌｌ−４０１５）され、また
ヒトの大腸菌からのＳＴＴ内毒素の１１．本釣構造カ決
定（ＣＨ，４Ｎ　Ｓ、Ａ　オＪ：　ヒＧＩｉ４ＮＥＬＬ
、４Ｒ−４−（１９８１）、／、　　Ｂｉａｓ、　　Ｃ
ｈ信、　　２５６．　７７４４−７７４６　　）されて
いる。

その結果、次のことが確認された；すなわちヒトのｓＴ
Ｔ内毒素のペプチドＩ配列には１８ケのアミノ酸が含有
されていること、その生物活性と毒性はジスフィト結合
（二硫黄（Ｓ−５）結合）の存在することによって発現
すること、かつ豚の腸内毒素のペプチド配列はヒトの腸
内毒素のペプチド配列に比較し２つのアミノ酸で相違す
るだけであること（５ＩＰＬＥＳ　Ｓ、Ｊ、、ＡＳＨＥ
Ｒ５，Ｅ、　、およびＧＩＩＮＥＬＬｉｌ　Ｒ，ｉ４．
　（１９８０年）　、　ＴｈｇＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
ＢｉｏｌＯｇｉｃａＬ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＋　２５
５　＋　４１０　＋　４７１６−４７２１　；　ＣＨ，
４Ｎ　Ｓ、に、　：［［Ｇｌ、４ＮＥＬＬＩ　Ｒ，，４
，（１９８１年）。

ＴｈｄＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、　２５６　、　Ａ　Ｉ５　。

７７４４−７７４６　）である。

さらに次のこと屯確認された、ヒトと豚のＳＴＴ内毒素
のアミノ酸のうち最初の４ケのアミノ酸は生物活性に対
して必要ではないが、この配（１１） 列の最後の１４ケのアミノ酸は生物学的に活性で、毒性
の原因となること（ＣＨ，４７ｖＳ、に、およびＧＩＡ
ＮＥＩ、Ｌ、４　Ｒ，１，（１９８１年）　、　Ｔｈｅ
　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏ−１ｉｃａＬ　Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ　、　２５６　、Ａ　Ｉ５　、７７４
４−７７４６）である。

しかし、以上の精製法には時間がかかつて複雑であると
いう欠点があり、また精製腸内毒素の取得量が少ないと
いう難点があった。

このように、精製ＳＴＴ内毒素を得ることが困難なため
に、今日までＳＴＴ内毒素の抗原性の究明が不充分であ
ったことがよく判る。ＳＴＴ内毒素は免疫原性をもたな
いと長い間者えられ工いた。このような推測に反して、
最近の研究の結果によってジスルフィド橋の存在するＳ
ＴＴ内毒素はＳＴＴ内毒素を同定し、その生物活性を中
和する抗体を誘発し得ることが判った。

（ＰＲ腑Ｚ　Ｊ、Ｃ，およびＲＯＢＥＲＴＳＯＮ　Ｉ）
、Ｃ，（１９８１年）Ｉｎｆｅｃｔ、　ａｎｄｌｒｎｒ
ｒｕｂｎｉｔｙ　、　３３　＋　１９３−１９８　）　
＊　　’しかし、これと同じ抗体でも過＠酸による酸化
でジスルフィド橋の破かいされたＳＴＴ内毒素とは結合
鎖を作り得ないこと（ＧＩＡＮＮＥＬｔｉ４（１２） Ｒ，，４，、ＤＲＡＫＥ　Ｋ、Ｗ、およびＬＵＴＴＲＥ
Ｌ　Ｍ、　（１９８１年）。

Ｉｎｆｅｃｔ　ａｎｄ　Ｉｔｖｎｕｎｉｔｙ　３３　、
１８６〜１９２）が判った。

従って、分子内ジスルフィド橋は天然の毒素に認められ
る免疫原性を保持するために必要であるとみられる。

本件出願人は分子内ジスルフィド橋をもたないｌｌｆｒ
ｍな合成ペプチドについて、このものが著しく毒性が低
く、また該合成ペプチド配列のみでなく、まったく意外
かつ驚くべきことには豚やヒトの天然ＳＴＴ内毒素（豚
やヒトのＳＴＴ内毒素には分子内ジスルフィド橋がある
にもかかわらず）とも結合を生じ、その毒性を中和する
抗体を誘導することを見出した。

ここで分子内ジスルフィド橋とは同一のペプチド鎖に属
する２ケのシステイル残基の硫黄原子の間において作ら
れる結合（鎖）をいう。しかし、第１のペプチド類に属
するシステイル残基の硫黄原子と第２のペプチド鎖に属
する別のシスティ・ル残基の硫黄原子との間で生ずるジ
スルフィド橋が本発明でいうペプチド中に存在し得る可
能性を除外するものではない。

さて、本発明の目的は、生物学的条件下で安定性を示し
、毒性のある天然ＳＴＴ内毒素に対して極めて興味のあ
る性質を示す無毒性の合成ペプチドを提供することにあ
る。

本発明の目的は、１つにはその誘発原因となる該ペプチ
ド配列を認識し、さらにまたヒトまたは動物特に豚の天
然ＳＴ膓円内毒素Ｂａ１ｌする抗体番誘発する能力をも
った無毒性の合成ペプチドを提供することにある。

さらに本発明の目的は、各種の適当なキャリヤー（担体
）分子と一緒になってヒトや動物の腸内毒素（特に豚の
腸内毒素）の毒性を中和する抗体を誘発す名ことのでき
る無毒性合成ペプチドを提供することにある。

さらに本発明の目的は、安定な抗原（性）決定因子とし
て用いられる合成ペプチドを提供することにある。　　
　　　゛ さらに本発明の目的は、例えば赤面球または乳液につい
て放射１ＩＩ４疫テスト、免疫−酵素テスト、凝集テス
トによってヒトのまたは動物特に豚のＳＴ腸内毒素が存
在するか否かをチェックする際に用いられる無毒性合成
ペプチドを提供することにある。

さらに本発明の目的は、ヒトまたは動物特に豚のＳＴ腸
内毒素についてヒトまたは動物を免疫化する無毒性合成
ペプチドを提供することにある。

さらに本発明の目的は、無毒性ペプチドを直接に、すな
わち無毒性化工程や精製工程を行なわなくとも有用なぺ
１チドを得ることのできる製造方法を提供するものであ
る。

さらに本発明の目的は所定の構造をもった合成ペプチド
を大量に得ることのできる製造工程を提供するものであ
る。

本発明は、その好ましい態様の一つにおいて、多くとも
１８ケの、少なくとも４ケのアミノ酸（好ましくは左旋
性の）を含むペプチドＣＰ＞ｎ〔ここでルは１または２
で、ルが１のときはペプチドシーケンスＰは次めペプチ
ド鎖に含まれ（１５） る； （ここでＡは、４」ルをＴはＴｙｒを示すか、もしくは
ｌはＴｙｒをＴは、４翔を示す）、 また分子中に存在するシステイル残基のチオール基は生
物学的条件下で安定な基で保護されたものであるが、そ
のチオール基の最高１すは遊離のＳＲ基の形であっても
いいし、生物学的条件下で不安定な基で保護された形の
ものでもよい： さらに、ルが２のときは、ペプチドシーケンスＰ−Ｐは
、前記式（υのペプチド鎖に含まれそれぞれ少なくとも
４個のアミノ酸乃至せいぜい１８個のアミノ酸を含有す
る同−又は與なる二つのペプチドシーケンスＰから成り
、二つのベプチドシーケンベＰは、二つのシーケンスの
一方のシステイル残基のいずれかのイオウ原子と他のシ
ーケンスのシスティル残基のいずれかの（１６） イオウ原子との間に確立されたジスルフィド結合を通じ
て、または二つのペプチドシーケンスＰのカルボキシル
基と他のシーケンスのアミン基との間に確立された結合
を通じて、互いに連結されており、チオール基の多くて
も一つは、もしジスルフィド結合に接合されていないな
らば、遊離のＳＨ基の形態てあり得または生物学的条件
下で不安定な基により保護されることができ、また存在
し得るシステイル残基の他のチオール基は生物学的条件
下で安定な基で保護されていてもよい〕に関するもので
ある。

本発明の望ましい態様の１つはペプチドシーケンスが同
じ場合である。

また、本発明の望ましい態様の１つは、多くとも１８ケ
のアミノ酸、少なくとも４ケのアミノ酸を含有するペプ
チドＣＰ）ｎにこでペプチドシーケンスＰがいかなるシ
ステイル残基も含有しないときにはれは１であり、ペプ
チドシーケンスＰが少なくとも一つのシステイル残基を
含有するときルは１または２に等しく、ルが１のとき、
ペプチドシーケンスＰが以下のペプチド鎖に含まれ、 （ここで、ｌはＩｌｎを表わしまたＴはＴｙｒを表わす
か、またはｌはＴｙｒを表わしＴはＩＳｎを表わす。） 分子中に存在し得るシスティル残基のチオール基は生物
学的条件下で安定な基により保護されており、チオール
基の多くて本一つは遊離のＳＲ基の形態にあり示ちであ
るかまたは生物学的条件下で不安定な基により保護され
がちであり、ルが２のとき、ペプチドシーケンスＰ−Ｐ
は、前記式（１）のペプチド鎖に含まれそれぞれ少なく
とも４個のアミノ酸乃至せいぜい１８個のアミノ酸を含
有する二つのペプチドシーケンスＰから成り、二つのペ
プチドシーケンスＰは、二つのシーケンスの一方のシス
ティル残基のいずれかのイオウ原子と他のシーケンスの
システィル　　　。

残基のいずれかのイオウ原子との間に確立されたジスル
フィド（，５−，５）結合を通じて互いに連結されてお
り、また存在し得るシステイル残基のジスルフィド結合
に接合されていない他のチオール基は生物学的条件下で
安定な保護基によって保護されている）に関するもので
ある。

総合的にみれば、本発明は前記のベプチドシーケレスの
１ケまたは複数個を含み、ＳＴ腸内毒素に対しての抗体
を生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）で誘導することができ、
かつ互いに異ったシーケンスＰが架橋剤（そのＰシーケ
ンスを含有する抗原決定因子によってもたらされる免疫
原性に障害を及ぼさないものであるかぎりペプチドであ
ってもなくて本よい）によって互いに連結された状態の
ものであ□ればいかなるペプチドであってもよい。

一般的に、本発明は上述の条件に対応し、必要によって
適当な巨大分子誓持体に固定された祇ので、ＨＬ　１１
０１０において抗体（本発明の第１の対象との関連で規
定されたペプチドまたは天然（１９） のＳＴ腸内毒素に対して活性を示す）を生成することの
できるすべてのペプチドを対象とする。

ペプチド橋の例としてはＬ−リジンのオリゴマー（リジ
ン単位１０ケまで、好ましくは５ケ）や個々のペプチド
シーケンス、Ｐによって保有されたアミン官能基を結鎖
する基のアジピン醗誘導体が挙げられる。

通常これらの架橋基を構成するものとしては、アミンま
たはカルボキシル基のような官能基を含み、個々のＰシ
ーケンスに属するカルボキシル基やアミン官能基と反応
することのできる分子ならいずれでもよい。前記のＰシ
ーケンスに完全に遊離したＳＲ基があるとき、それと作
用するものも架橋基となり得る。　　　　　　　□以下
の説明において、ペプチドと称する場合、それはモノペ
プチドならびにジペプチドの両者を含むものとする。。

モノペプチドは外が１に相当する場合のペプチドであっ
て、そのペプチド鎖のアミノアシル残基は１　ヶまたは
複数個のペプチド結合によつ（２０） て１＋または複数個の隣位のアミノアシル基と結合して
いる。

ジペプチドはルが２に相当する場合であって、このペプ
チドは２ケの同一のペプチド鎖からなり、このペプチド
鎖の各アミノアシル基は２つの隣位のアミノアシル基と
ペプチド結合で結びつき、またこれら２ケのペプチド鎖
は一方の鎖のシステイル残基の硫黄原子と他方の鎖のシ
ステイル残基の硫黄原子との間に形成されるジスルフィ
ド結合によって互いに結合している。

生体（生物学的）条件下で不安定な基とはチオール基に
対して可逆的に定着する保護基であると定義できる。云
いかえると、これらの不安定な基がチオール基に定着し
つづけられるのは、その濃度が充分に高い場合だけであ
る。その濃度があまり高くない場合には、この不安定基
はチオール基から分離する。このように不安蝋基が分離
してしまう限界濃度は反応の種類、反応条件、保護され
るべきチオール基を含有する化合物によって変動する０
生体条件下で不安定な基を例示するならば、β−メルカ
プトエタノール、ジチオトレイトール、塩化水銀、ハラ
クロルマーキュロ−ベンゼン、４　、４’−ジチオ−ジ
ピリジンである。　　　・ 生体条件下で安定な基とは−たんチオール基に定着して
しまえば、そのペプチドが生体媒体と接触して代謝反応
その他の反応でペプチドの性質が変る場合でも定着の状
態を保持し得る保護基であると定義する。これらの保護
基はペプチドの毒性を生じさせる原因となる分子内ジス
ルフィド橋の形成を阻害する。

構成アミノ酸が左旋性であるペプチドが本発明では好ま
しいペプチドである。

本発明のペプチドのチオール官能基の保護基としては、
それが生体条件下で安定である限り、使用できる基であ
る。

チオール官能基を保護でき、また生体条件下で安定な保
護基の例としては、Ｒ，Ｇ、　ＨＩＳＫＥＹの論文１ペ
プチド合成におけるスルフヒドリル基保護’　（・ＴＡ
ｇ　Ｐｇｐｔｉｄｇｓ、　ｖｏｗ、　３　（１９８１年
））の１３７ページ〜１６４ページ；　　Ｇ、　Ｂ、４
ＲＡＮＹおよびＲ，Ｂ、　ＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤの論文
″″固相ペプチド合成”（Ｔｈｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　
、　ｖｏｌ、　３　（１９８１年））の２３３ページ〜
２４７ページに記載がある。

さらに、蛋白質チオール官能基の最終修飾のため生物化
学で用いられている基も保護基として使用できる。

一際的にみて、チオール官能基の保護基としては本発明
でペプチドを製造する際の合成条袢と調和し、特に、最
終の脱保護を含めた合成条件のもとて安定でなければな
らない。

チオール官能基の保護基の選定についてはいろいろの相
互依存パラメーターを考慮すべきである。すなわち酸や
アミン官能基を保護する基の種類は合成形式によって規
定されるし、一方保睦基の如何によって最終の脱保饅剤
が決まることになる。

チオール官能基の保護には次式で表わされる誘導基を使
用すると有利である； （２３） Ｅ−Ｃ−７ｖＨ−Ｒ １ この場合、保護されたチオール官能基は次の式によって
表現できる： ５−Ｃ−ＮＨＲ １１ 次の式で表わされる化合物から誘導される基もチオール
官能基の保護基として有利である：ＲＣＮＲＲ” １ （ここでＲ，Ｒ’およびＲ“は互いに独立してそれぞれ
水素原子、および炭素原子数が１〜４ケのアルキル基を
示す。）　゛ これらの化合物のうちでも次の式で表わ゛される化合物
が有利といえる： （ここでＲおよｒ）Ｒ′は水素原子、炭素原子数が１〜
４ケのアルキル基を示す。）　　　　　゛これら３種の
保護基によって保護されたチオ（２４） −ル官能基はそれぞれ次の通り表わされる（但し、Ｓは
保護されたシステイル基内に含まれるものとする）； 実際にはアセトアミドメチルまたはホルムアミドメチル
を使用するのが特に有利といえる。

この２つの保護基はチオール官能基の保護に結いて、生
体条件のもとに安□定であり、通爾用いられる最終脱保
護反応で屯脱保護されることがない。これらの保護基は
一つには合成ペプチドを製った支持体からその合成ペプ
チド番外離し、二つには合成過程で通常用いられる酸−
およびアミン官能基を保護していた保護基を除失する□
のに役立つ。

本発明における好ましいペプチドの群の１つはモノペプ
チドである（以下Ｇ１で表現する）。

これらのモノペプチドは最大１８ケのアミノ酸、最小で
４ケのアミノ酸を包含し、かつそのペプチド鎖は次に示
すペプチドシーケンスに含まれるという特徴をもってい
る： はＡはＴｙｒをＴはＡｚｎを示し；芥子内に存在するシ
ステイル残基のチオール基は生体条件下で安定な基によ
って保護されているが、これらチオール基のうち□の□
最大１ヶあチオール基は遊離ＳＨ基の形態もしくは生体
条件下で不安定な基によって保護された状態をとうても
よい）。

Ｇ１の□群のペプチドのうちで本発明にとって好ましい
モノペプチドは存在するシステイル残基のすべてのチオ
ール基が生体条件下で安定な基によって保護された形の
ものであり、以下この群のモノペプチドをＧｊＡで表現
する。

本発明における好ましいモノペプチドのもう１つの群は
、存在するシステイル残基のチオール基がただ１ケを除
いてすべて脱保護条件下で安定な基によって保護されて
いるモノペプチドである。以下このモノペプチド１ｋＧ
ＪＢとして表現する。

ＧＪＢに属するペプチドにおいては、生体条件下で安定
な基によって保護されていない１つのチオール基は遊離
のＳＨ基の状態（もしくは生体条件下で不安定な基によ
って保護された状態）にある。

保護基が脱保護条件下で不安定な場合には、その脱保護
工程で該保護基が除かれて、チオール基は再び遊離のＳ
＃ｆｉｔ７’ｔは複合ジスルフィドの状態となる。

ＳＨ基を保護し、脱保護工程で遊離する基の例としては
バラメトキシペ１ンジル基やＳ−ターシャリープチルス
ルフエニ省基が挙げられる。

以下に例示するペプチド鎖において、特にことわらない
かぎりそのシー省ンスの左側に位す（２７） る末端アミノ−アシルはＮ−末端アミノ−アシルであり
、シーケンス式の右側に位する末端アミノ−アシルはＣ
−末端アミノ−アシルとする。

例えばＡｚｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｇ−Ｔｙｒで表わされるペ
プチド鎖においてはＡｚｎがＮ−末端基で、ＴｙｒがＣ
−末端基である。

Ｇ　１　、　ＧＩＡおよびＧＩＢの群のうちで本発明の
ペプチドとして好ましいものは次のような配列をもった
ペプチドから構成されるものである；−Ａｚｎ−Ｔｈｒ
−ｐｈｇ　−Ｔｙｒ　−−Ａ、？ｎ−Ｔｈｒ−ｐｈｇ　
−Ｔｙｒ−Ｃｙｚ　−−Ｃｙｚ　−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐ
ｒｏ　−ＡＬａ−Ｃｙｚ　−−Ｃｙｚ−Ｃｙｚ−Ｔｙｒ
−Ｐｒｏ　−Ａｌａ−Ｃ３１，？　−−ＡＬａ−Ｔｈｒ
−ｐｈｇ−Ｔｙｒ−Ｃｙｚ−Ｃｙｓ−Ｇｔｗ−−Ａｓｎ
−Ｔｈｒ　−ｐｈ　ａ　−Ｔｙｒ−Ｃｙｚ−（’３１．
？　−Ｇｔｕ−Ｌａｗ−−Ｃｙ　ｓ−Ｃｙｚ−ＧＬｙ−
Ｌｇｕｌｃｙｓ−Ｃｙｚ　−Ａｓ　ｎ−Ｐｒｏ−Ａｔａ
−Ｃｙ、？　−ＡＬａ−ＧＬｙ−Ｃｙｚ− −Ｃｙ、、？−ＣＴ−ＧＬｙ−Ｌａ、ｕ−Ｃｙ　５−Ｃ
３１，？−Ｔｙｒ−Ｐｒ　ｏ−ＡＬａ−Ｃｙｚ−Ａｔａ
−ＧＡ／−Ｃｙｓ　− 以上によって規定されるペプチド群のうちで（２８） 本発明のペプチドとして好ましいサブ−クラスは次の式
で表現されるものである： ｒ Ａｚｎ−Ｔｈｒ−ｐｈｇ　−Ｔｙｒ−ＣｙｓＣｙｚ−Ｃ
ｙｓ−Ａｚｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＣｙｓＣｙｚ−（１，
’３／ＪＰ−Ｔｙｒ−Ｐｔ”ｏ　−Ａｔａ−ＣｙｚＡｚ
ｎ−Ｔｈｒ−ｐｈａ−Ｔｙｒ、−Ｃｙｚ−Ｃｙｚ−ＧＬ
ｕ　　１Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ｐｈｇ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ　−
Ｃｙｚ−ＧＬＬＬ−ＬａｗＣｙｚ−Ｃｙｚ−ＧＬｙ二Ｌ
ｔ’ｗ−Ｃｙｚ−Ｃｙｚ−Ａｚｎ−Ｐｒｏ−ＡＩ、ａ−
Ｃｙｓ−Ａｌａ−ＧＬｙ−Ｃｙｓ Ｃｙ　ｒ−Ｃｙ　ｚ−Ｇｌｙ、−Ｌｇｕ−Ｃｙ　ｓ　−
Ｃｙ　ｚ−Ｔｙｒ−ｐｒ　ｏ　−Ａ１．ａ−Ｃｙｚ　−
ＡＬａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｚ 次の３種のペプチド：は特に好ましいものである： Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｇ−Ｔｙｒ−Ｃｙｚ−Ｃｙｚ−Ｇ
ｌｙ−ＩＦ、ｇｕ−Ｃｙｚ−Ｃｙｓ−Ａｙｎ−Ｐｒｏ　
−ＡＬａ−Ｃｙｚ−Ａｌａ−ＧＬｙ−Ｃｙｒ−Ｔｙｒ　
　（１）Ａｚｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈａ−Ｔｙｒ−Ｃｙｚ−Ｃ
ｙｚ−ＧＬｙ−Ｌａｗ−Ｃｙｚ−Ｃｙｚ　−Ｔｙｒ−Ｐ
ｒｏ　−Ａｔａ−Ｃｙｚ−ＡＬａ７Ｇｔｙ−Ｃｙｚ−Ａ
ｚｎ　　（２）Ａｚｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈａ７Ｔｙｒ−Ｃｙ
ｚ−ＧＬｙ−１ｊＬｙ−ＧＬ”ｌ　　（３）本発明にお
ける吃り１つのペプチド群は前記の式においてルが２に
相当するものとして規定されたジペプチドである（以下
Ｇ２と表示する）。

このＰ−Ｐジペプチドは最大１８×２ヶのアミ酸、最小
でｊＸＺケのアミノ酸からなっているが、その特徴点は
前述の式（１）のペプチド鎖の内容をなすアきノ酸の最
大１８ケ、最小で４ケのアミノ酸をもった同一のペプチ
ドシーケンスＰの２ケから構成されており、これらの２
ケのペプチド、シーケンスはそのうちの１つのペプチド
シーケンス中の１つのシステイル残基の硫黄原子ともう
１方のペプチドシーケンス中のシステイル残基の硫黄原
子との間でジスルフィド結合をつくって結び合い、また
このジスルフィド結合に関与しないシステイル残基の他
のチオール基は生体条件下で安定な保護基によって保護
されている点である。

以上のジペプチドＧ２のうち本発明にとって好ましいサ
ブ−クラスのジペプチドはペプチドシーケンスＰの同じ
位ａｔ占める２ケのシステイル残基の間でジスルフィド
結合を形成した状態にある２ケのペプチド鎖から構成さ
れるジペプチドである。

本発明の０２群に属するジペプチドＰ−Ｐとして好まし
いのはそのペプチドシーケンスＰの中に次に示すペプチ
ド鎖を含む庵のから構成されるものであるニ ーＡｚｎ−Ｔｈｒ−ｐｈ　ｇ　−Ｔｙｒ−Ｃｙｚ　−−
Ｃｙｚ−Ｃｙｚ−Ａｚｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ　−
−Ｃｙｚ　−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−ｐｒｏ−ＡＬａ−Ｃｙｚ
　−−Ａｚｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈ　ａ　−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−
Ｃｙｚ　−Ｇｔｕ−−Ａｚｎ−７’ｈｒ　−Ｐｈ　ｇ　
−Ｔｙｒ−Ｃｙｚ−Ｃｙｓ−ＧＬｕ−Ｌａｗ−−Ｃｙｚ
−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｍ　ｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｚｎ
−Ｐｒｏ　−ＡＡａ−Ｃｙｓ　−々α−ＧＬｙ−Ｃｙｚ
　− −Ｃｙｚ　−Ｃｙｚ−Ｇｔｙ　−Ｌ　ａ　ｕ−Ｃｙｓ　
−Ｃｙ　ｚ　−Ｔｙｒ　−Ｐｒ　ｏ　−Ａｔａ−Ｃｙｓ
　−Ｍα−Ｇｔｙ−ＣｙＪＦ　− サブ−）ラスのジペプチドＰのうち本発明にとって好ま
しいのは次に示すペプチドシーケンスＰをもつものから
構成されるジペプチドである； （３１） Δ５ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈａ−Ｔｙｒ−ＣｙｔＡｚｎ−Ｔｈ
ｒ−ｐルー−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ　−Ｇｌ、ｙ−ＧＬｙ−Ｇ
Ｌｙ　　（３）Ｃｙｚ−Ｃｙｚ−Ａｚｎ−ｐｒｏ　−Ａ
Ｌａ−ＣｙｓＣｙｚ−Ｃｙｚ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ　−ＡＬ
ａ−ＣｙｚＡｓｎ−Ｔｈｒ＝Ｐｈｇ　−Ｔｙｒ−Ｃｙｇ
−Ｃｙｚ　−ＧＬｗＡｚｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｇ−Ｔｙｒ−
Ｃｙｓ−Ｃｙｚ−Ｇｔｕ−ＬａｗＣｙｚ−Ｃｙｚ−ＧＬ
ｙ−Ｌａｗ−Ｃｙｙ−Ｃｙｚ−Ａｚｎ−ｐｒｏ−Ａｔａ
−（１’３１．？　−，４１ａ、６ｔｙ−Ｃ’／’ Ｃｙｚ−Ｃｙｚ−ＧＬｙ−Ｌａｗ−Ｃｙｚ−Ｃｙｚ−Ｔ
ｙｒ−ｐｒｏ−μａ　−（？ｙ　ｚ　−Ｍα−ＧＬ　ｙ
−Ｃｙ　ｚ Ａｚｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｓ　−Ｔｙｒ−Ｃｙｚ−Ｃｙｓ　
−ＧＬｙ−Ｌａｗ−Ｃｙｓ−Ｃｙｚ　−Ａｚｎ−Ｐｒｏ
−ＡＬａ−Ｃｙｚ−ＡＬａ−ＧＬｙ−Ｃｙｚ−Ｔｙｒ　
　（Ｉ）Ａｚｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈａ　−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−
Ｃｙｚ＝ＧＬｙ−Ｌａｗ−Ｃｙｊ−Ｃｙｚ　−’ｒｙｒ
−ｐｒｏ　−Ａｔａ−Ｃｙｔ−ＡＬａ−ＧＬｙ−Ｃｙｚ
−Ａｚｎ　　（２）本発明にとって特に有利なのは、例
えば次のモデル式で表わされるジプペチドでめる：Ｃｙ
ｓ−Ｃｙｚ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａ１．ａ−ＣｙｚＣｙｙ
−Ｃｙｚ−Ａｚｎ−Ｐｒｏ−Ａ１．ａ−Ｃｙｚ（３２） Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈａ　−Ｔｙｒ−Ｃｙｚ−Ｃｙｚ−
Ｇ１．ｙ−Ｌａｕ−Ｃｙｔ−Ｃｙｓ−Ａｚｎ−Ｐｒｏ　
−Ａｔａ−Ｃｙｚ−ＡＬａ−ＧＬｙ−Ｃｙｚ−ＴｙｒＡ
ｔｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈａ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ　−Ｇ
Ｌｙ−Ｌａｔｈ　−Ｃｙ　ｔ　−Ｃｙ　ｚ　−ＡＩｒＬ
−Ｐｒ　ｏ　−ＡＬａ−Ｃｙ　ｚ　−ＡＬａ−ＧＬｙ−
Ｃｙ　ｚ−ＴｙｒＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈａ−Ｔｙｒ−Ｃ
ｙｚ−Ｃｙｚ−Ｇｔｙ−Ｌａｗ−Ｃｙｔ　−Ｃｙ　ｚ−
Ｔｙｒ−Ｐｒ　ｏ−ＡＬａ−Ｃｙ　、？−ＡＬａ−ＧＬ
ｙ−Ｃｙｚ　−Ａｓ　ｎ本発明は、本発明のペプチドの
１ケｔたは複数個と生理学的に許容で真青性のないキャ
リアー分子（担体）との共有結合体からなる接合体（Ｃ
ｏｎｊｕｇａｔｅ　）も対象としている。　　　□本発
明におけるこれらの複合体に包含させるキャリアー分子
としては腸レベルで作用部位をもつ生物分子のうちから
選定するのがよい。

天然の蛋白質としてテタナス（破傷風）トキシン、オパ
ルブミン、血清アルプンジなどが挙げられる。

合成の巨大分子支持体としてはポリリジンやポリ（Ｄ−
Ｌ−アラニン）−ポリ（Ｌ−リジン）が挙げられる。そ
の他、この目的に使用できる通常分子量が２００００以
上の巨体分子支持□体について文献にも記載がある。

免疫゛原性（ｉｒｒＬＷＬｔｂｎｏ１ｇｎｉｃ’）　ｆ
　４’つ蛋白質キャリアーもその免疫−性が総合的にみ
て相互“に障害を生じないかぎり極めて有利なキャリア
ー分好まし仏キャリアー蛋白質の例としてシゲラ細胞毒
素（’　ＳｈｉｇａＬＬａ　Ｃｙｔｏｔａｘｉｎ　）　
（Ｔｈｅ　ＴｏｕｒｎａＬｏｆ　Ｂｉｏｌｔｕｌｉｃａ
Ｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｗ、２５６　、１６１
６．’Ａリリーフ　２５．　１９８１年、ページ８７３
２〜８’１３Ｂ　）または赤痢の細胞毒の主要な抗原決
定因子（α、ｎｔｉｇｍｉｃｄａｔｇｒｍｉ３．Ｅｎｔ
ｓｐ　）　ｆ含んだシゲラ細胞毒素フラグメントも挙げ
られる。

特に適またキャリ手−蛋白質のもう１つの例はコレラゲ
ノイドまたはコレラ毒素の主要な抗原決定因子管含むコ
レラゲノイドフラグメントである。

コレラの毒素のＢサブユニットの無毒性集合体（αｇｌ
ｒｉａｔｇ　）であるコレラゲノイドは”　Ｉｎｆｅｃ
ｔｉｏｎ　ａｒＬｄ　ｌｍｍ１ｂｎｉｔｙ、　ｊｔｂｎ
ａ　ｌ　ｑ　７７年。

ページ７８９〜７９５”　に記載の方法によって精製す
ることができる。

コレラゲノイドはコレラ毒素の主要な抗原決定因子を含
んでおり適切な部位すなわち腸粘膜上に定着して効果的
な免疫性を有するので有利といえる。

従って本願におけるペプチドのいずれか１種とコレラゲ
ノイドとからなる分子接合体は、その各成分が同一部位
すなわち腸レベルで局所的な免疫原活性を発現すること
からみて極めて好ましいものと思われる。

本発明においてはコレラゲノイドまたはシゲラ細胞毒素
をキャリアー分子とし、かつ次のような配列を４つペプ
チドからなる接合体群が好ましい； −Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｇ−Ｔｙｒ− −Ａｚｎ−Ｔｈｒ−ＰＡｇ−Ｔｙｒ−Ｃｙｚ−−Ｃｙｚ
−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−ｐｒｏ−ＡＩ、ａ−Ｃｙｓ　−−Ｃ
ｙ、？−Ｃｙｚ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−（？ｙＪＰ
　−（３５） −Ａｚｎ−Ｔｈｒ−Ｐんａ　−Ｔｙｒ−ＣｙＪＩ−Ｃｙ
ｚ　−ＧＬｗ　−−Ａ、？ｎ−Ｔｈｒ　−Ｐｈ　ｇ　−
Ｔｙｒ−Ｃｙｚ−Ｃ’ｙｓ　−Ｇｌｗ−Ｌａｕ　−−Ｃ
ｙ　ｓ　−Ｃｙ　ｚ　−ＧＬｙ　−Ｌ　ｇ　ｕ−Ｃｙｚ
　−Ｃｙｓ　−Ａｓｎ　−Ｐｒ　ｏ　−ＡＬａ−Ｃｙｚ
　−４ａα−Ｇｌｙ−Ｃｙｚ− −Ｃｙｓ−Ｃｙｓ　−ＧＬｙ−Ｌｔｕ−Ｃｙｚ−Ｃｙｚ
−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ　−Ａｔａ−Ｃｙｚ　−Ｍα−ＧＬｙ
−Ｃｙｚ　− さらに本発明の好ましい接合体としては、キャリアー分
子がコレラゲノイドｔ＋はシゲラ細胞毒素で、ペプチド
が次のような式で表わされるものである場合が挙げられ
る： Ａｚｎ−Ｔｈｒ−ｐｈｇ−Ｔｙｒ Ａｚｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈａ　−Ｔｙｒ−ＣｙｚＡｓｎ−Ｔ
ｈｒ　−Ｐｈ　ａ−Ｔｙｒ−Ｃｙｚ−ＧＬｙ−ＧＬｙ−
ＧＬｙＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｚｎ−Ｐｒｏ　−ＡＬａ−Ｃ
ｙｓＣｙｓ−Ｃｙｚ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−ＡＬａ−Ｃｙｓ
Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｃｙｚ−Ｃｙｓ　−
ＧｌｗＡｚｒＬ−Ｔｈｒ−Ｐｈａ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｃ
ｙｓ−ＧＬｕ−ＬａｗＣｙｚ−Ｃｙｚ　−ＧＬｙ−Ｌａ
ｕ−Ｃｙｚ−Ｃｙｚ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｈａイｙ、ｔ
−ＡＬａ　−ＧＡｙ　−Ｃｙ　ｓ Ｃｙｔ−Ｃｙｚ−ＧＬｙ−Ｌａｗ−Ｃｙｚ−Ｃｙｓ　−
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−ＡＬａ−Ｃｙｓ　−（３６） 氾α−ＧＡｙ　−Ｃｙ　ｚ Ａｓｎ−Ｔｈｒ７Ｐｈｇ−Ｔｙｒ−Ｃｙｚ−Ｃｙｚ−Ｇ
Ｊｌｙ−Ｌｇｗ−Ｃｙｚ−Ｃｙｓ　−Ａｓｎ−Ｐｒ　ｏ
−ＡＬａ−Ｃｙｚ　−ＡＬａ−Ｃｙｓ−ＴｙｒＡｚｎ−
Ｔｈｒ−ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓイｙ、ｒ　−ＧＬｙ−
Ｌａｗ−Ｃｙｚ−Ｃｙｚ　−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
Ｃｙｚ−ＡＬａ　−Ｃ！ｚ−Ａｚｎペプチドの合成 本発明におけるモノペプチドは既知の方法で合成するこ
とができる。以下この方法について概説する。

ペプチドを均一溶液中および固相中で合成する方法は既
知である。

例えばハウペンウニイルの論文［−Ｍｇｔｈｏｄｇｍｄ
ａｒｏｒｇａｎｉｚｃｈａｎ　Ｃｈｔｍｉｅ　’　（Ｅ
　、ＦＰ’ｕ、ｎｌｃｈ編集）Ｖｏｗ、　　１５　１及
び画、　ＴＨＩＥｌｄＥ　　、　ＳｔｌＬｔｔｇａｒｔ
、　　１９７４年〕に記載された均質溶液中での合成方
法Ｉｔ利用できる。

この方法では所望の順序に並んだアミノアシルを１対ず
つ順次縮合するか、予め調製されていくつかのアミノア
シル残基金所望の順序に含有するフラグメントとアミノ
アシルを縮合するかおるいは同じく前もって調製したい
くつかのフラグメントな縮□合するかして合成していく
方法をとるが、いずれにしても（前もってカルボキシル
官能基を活性化する場合は特に）ペプチド結合の形成に
関与する一方のアミン官能基と他方のカルボキシル基；
またはその逆を除いてアミノアシルやフラグメントに含
まれる反応性官能基のすべてをペプチド合成でよく知ら
れた方法によって予め保護しておかなければならない。

変法として、通常のカルボジイミド型のカップリング剤
、例えば１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロ
ピル）−カルボジイミドを用いてカップリング反応を行
なうこともできる。

アミノアシル基にもう１つアミン官能基のある場合（例
えばリジン）や酸官能基のある場合（例えばグルタミン
酸）においては、それらを次の通り保晴しておく、例え
ばアξ・ン官能基についてはカルボベンゾキシまたはｔ
−プチロキジカルボニル基により、またカルボキシル官
能基についてはｔ−ブチルエステル基により保護する。

他の反応性官能基についても同様である。

例えばアミノアシル基の１つＫ　ＳＨ官能基が有るとき
（例えばシスティン）にはアセトアミドメチルかパラメ
トキシベンジル基を用いる。

アミノ酸を１ケずつ用いて順次合成し２てぃく場合はＣ
−末端アミノ酸とそれに目的配列で隣位すべきアミノア
シルに相蟲するアミノ酸とを順次縮合しＮ−末端アミノ
酸に至る方法をとる。

他の方法としてはＲｏＤｏＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤの報告
（＠５ｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ　’　（／、Ａｍ。

Ｃｈａｍ、　Ｓｏｃ、、　４５．２１４９〜２１５４）
）に記載の技術を用いてもよい。

このＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤ　の方法でペプチド鎖を合成
するには非常に多孔質のポリマー樹脂を用いこれにペプ
チド鎖の最初のＣ−末端アミノ酸を定着（固定）させる
。この樹゛脂へのアミノ酸の定着はカルボキシル基によ
って行われるので、アミン官能基の方は例えばｔ−ブチ
ルオキシカル（３９） ボニル基によって保護しておく。

最初のＣ−末端アミノ酸が樹脂に定着したならばアミン
官能基からその保護基を、樹脂管酸で洗うことにより除
去する。

アミン官能基の保護基がｔ−ブチルオキシカルボニル基
である場合はトリフロロ酢酸で樹脂を処理してそれを除
くことができる。

次いで目的の配列における第２番目のアミノアシルを供
給する第２のアミノ酸が、ペプチド鎖に定着した最初の
Ｃ−末端アミノ酸のＣ−末端アミノアシル残基から脱保
護アミン官能基の方向に付着していく。第２番目のアミ
ノ酸のカルボキシル官能基は例えばジサイクロへキシル
カルボジイミドで活性化し、アミン官能基は例Ｌｄｔ−
ブチルオキシカルボニルで保護しておくとよい。

このようにしてアミノアシルからなりその末端アミン官
能基が保護された形の所望のペプチド鎖の第１部分が得
られる。このアミン官能基は前述の通りに解保護され、
第２番目のＣ−末（４０） 端アミノ酸の付加のときと同様の条件下で第３のアミノ
アシル基の固定を行なう。

かくしてペプタイド鎖管構成するアミノ酸は、先に形成
され樹脂に付着したペプチド鎖の対応部分にある予め解
保護されたアミノ基に１つずつ順次定着していく。

目的〆するペプチド鎖の全体が形成され大なら、ペプチ
ド鎖を構成する各アミノ酸の保護基を除去し、次いで例
えば７ツ化水素酸で処理することにこのペプチドを樹脂
から分離する。

本発明のジペプチドは、チオール基が無保護のＳＨの状
態にあるシスティル残基なもったモノペプチドを用いて
合成されるが、それには本発明に係るモノペプチドを含
有する媒体中で例えば酸、素分子による酸化によって合
成する方法をどる。この媒体は例えばｐＨが約７の値の
水性溶液とする。

この酸化反応によって、チオール基な無保護Ｊの状態に
吃つシスティル残基の硫黄原子の間にジスルフィド結合
が形成される。

ＲｌＣ；、ＨＩＳＫＥＹの論文〔”ペプチド合成におけ
るスルフヒドリル基保ｉ１　’　Ｔｈｅ　Ｐｇｐｔｉｄ
ｍ　、Ｖｏｌ、３　。

（１９８１年）　１１５−１４９　ヘ−１）　〕ヤＧ、
ＢＡＲＡＮＹオよびＲ０Ｂ６ＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤの論
文〔慎固相ペプチド合成”、　Ｔｈｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ
、　Ｖａｌ、　３　（ｌ　９　ｇ　１年）。

２４０〜２４３　ページ〕にて提示された合成指針も本
発明に係るジペプチドの製造に用いられる。

本操作は次に述べる方法ま六はこれと均等の方法で行な
うことができる、すなわちペプチドを解保護し、このペ
プチド溶液中に空気を導入して遊離のチオール官能基を
消失させるという方法である。

本発明の接合体の合成には既知の工程を用いる、例えば
ＦＲＡＮＴＺおよびＲＯＢＥＲＴＳＯＮ　（Ｉｎｆａｔ
ｙｔ。

ａｎｄ　Ｉｍｔｙｕｂｎｉｔｙ　、　３３　、１９３−
１９８　（１９ｇ１年））やｐ、Ｅ、ＫＡＵＦ７”ＭＡ
Ｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ
ａｌＭｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ、　ｏｃｔｏｈｅ’ｒ
　ｌ　ｑ　ｇ　１年、　Ｖｏｌ、　４２　。

４４．６１１〜６１４）によって記載された方法でペプ
チドと適当なキャリアー分子とから合成する。

実際には次の化合物がカップリング剤として有利（しか
し、これらに限定されないが）であるニゲルタール　ア
ルデヒド、エチル　クロロホルメート、水溶性カルボジ
イミド（Ｎ−エチル−Ｎ′（３−ジメチルアミノ−プロ
ピル）カルボジイミド　Ｈｃｔ　）　、ジイソシアネー
ト、ビスニジアゾベンジン、ジーおよびトリクロロ−５
−トリアジン、シアノグンプロマイド、ベンザキノン、
さらに５ｃａｎｄＩｌ／＋ＩｒｎｍｕｎｏＬ、、　１９
７ｇ　＋ＶｏＬ０ｇ　、　７−２３　（、ｆＲＡＭＥＡ
Ｓ　、ＴＥＲＮＹＩＩＣＫ。

ＧＵＥＳＤＯ）Ｉ　）に記載のカップリング剤。

カップリング工程はいずれの場合も、一方はペプチドの
反応性官能基の１ケ１＋は複数個、他方は支持体分子の
反応性官能基の１ケｔｆｃは複数個を用いて行なう。そ
の場合、蛋白質の合成で用いられるカップリング剤、例
えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
−カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾー
ルの存在下でカップリング反応を生ずるカルボキシル−
およびアミン官能基を有することが有利である。それぞ
れペプチドと支持分子（４３） によって保持されたアミン基同志を結びつける場合はグ
ルタルアルデヒドが用いられる。

以下実施例によって本発明の好ましいペプチド合成法を
述べるが、これは発明をよシ明確にするためのものであ
り、決してそれを限定するためのものではない。

実施例１　　　・・ 本合成モノペプチドは豚のＳＴ腸内毒素と同じペプチド
配列をもつ。しかし天然の豚ＳＴ腸内毒素と異って本モ
ノペプチドではシステイル残基のすべてのチオール基が
アセトアミド−メチルで保護されており、分子内ジスル
フィド橋が存在しない。以下、このモノペプチドを１合
成による豚ＳＴ腸内、毒素”と呼ぶ。

式（１）のモノペプチドは既に述べたペプチド合成法に
よって製造されるが、その手順は次に示（４４） す通りまｆＣはその均等方法によって行われる。

本合成にお・いて使用する略語はそれぞれ下記の意味を
有する： ＢＯＣ：ｔ−ブチルカルボニルオキシ ＡＳＰ　：　アスパラギン酸 Ｔｈｒ　：　スレ、オニン ＧＬｕ　＋　　グルタミン酸 ｐｒｏ　：　　プロリン ＧＬｙ：　グリシン ＡＬａ　＋　アラニン Ａｓｎ：　アスパラギン Ｃｙｚ　：　　システィン Ｌｇμ＝　ロイシン Ｔｙｒ：　チロシン Ｐｈｇ　：　フェニルアラニン アミノ酸としてはｔ−ブチルオキシカルボニル基（ＥＯ
Ｃ）のみで保護されたＡ−α−アミノ酸だけを使用し喪
。

側鎖の官能基の保護は次のように行ったニー　チロシン
は２．６−ジクロロベンジル基で保護、 −システイルはアセトアミドメチル基で保護、 ’−グルタミン酸とスレオニンはベンジル基で保護、 ＣＨ，Ｃｔ、は使用前に無水へα、ＣＯｓを用いそ蒸溜
する。

樹脂支持体としてはスチレンとジビニルベンゼンとのク
ロルメチル化コポリマー（１憾）（ＢＩＯＲＡＤ　ＬＡ
ＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ　　）からなるものを使用するの
が有利である。

Ｎ−α−−−プチルオキシカルボニルー〇−２，６−ジ
クロロ−ベンジルチロシンはエステル化してセシウム塩
の形にするのがよい（ＧＩＳＩＮＢ、Ｆ、（１９７３年
）Ｈｇｔｖ、Ｃｈｉｎ、Δｃｔａ　５６　、１４７６　
）　。

合成はＩｈ　ｃｈｍａｎ社から９９０Ｂの名称で販売さ
れている自動合成器（ａｔｂｔｏｍａｔｉｔｙ　ｚｙｎ
ｔｈａｚｉｊｇｒ　）によって行なう。

モノペプチド（＋）を構成するアミノ酸は次の手順で前
もって製つ唇いたペプチド鎖に是着させる： α）樹脂を塩化メチレンに懸濁させるようにして約３分
間の間に３回洗滌する、 ｂ＞ＡＯ４トリフロロ酢酸にて約３分間洗滌し、それを
樹脂中に浸透させる、 Ｃ）形成されるペプチド鎖のＮ−末端基の脱保護を行な
うためにトリフロロ酢酸で約３分間洗滌する、 ｄ）次いで塩化メチレンで約３分かけて２回洗滌し、ト
リフロロ酢酸を除去する、 −）次いで、イソプロピルアルコールで約３分かけて２
回洗滌し７、塩化メチレンを除去する、 ｆ）さらに塩化メチレンで３分かけて４回洗滌し、再浸
透させる、 りジイソプロピルエチルアミンで約３分かけて３回洗滌
しアミン官能基を中和（トリフロロ酢酸との塩の形にな
る）し、 ｈ）塩化メチレンで約３分かけて４回洗滌して過剰のジ
インプロピルアミンを除く、（４７） Ｌ）予め形成されたペプチド鎖に定着させるべきアミノ
酸を添加する、 ノ）次いで塩化メチレンで約３分かけて３回洗滌する、 ｋ）イソプロピルアルコールで約３分かけて２回洗滌【
７塩化メチレンを抽出する、り最後に塩化メチレンで約
３分かけて３回洗滌し、反応媒体をそれによって置きか
える。

（４８） 形成されたペプチド鎖にそれぞれのアきノ酸を定着させ
るには、そのアミン官能基がｔ−ブチルオキシカルボニ
ル基で保饅され、その酸官能基がジサイクロへキシルカ
ルボジイミドで活性化されたアミノ酸（前もって形成さ
れたペプチド鎖に対して過剰量、すなわちペプチド鎖の
チャージ量の３倍量）を使用し、かつヒドロキシベンゾ
トリ了ゾールを加えて副反応ができるだけ生じないよう
にする（　Ａ、　ＡＲＥＮＤＴ、　　ｉ４．Ｍ。

ＫＯＬＯＤＺＩＥＪＺＫＹＫ　（１９７８年）、Ｔｅｔ
ｒａ−ｈａｄｒｏｎＬａｔｔ　４０．３ｆＧ６７；　Ｓ
、ＭＯＪＳＯＶ、Ａ−、ＲｏＭＩＴＣＨＥＬＬ（１９８
０年）　、　Ｊ、ｏｒｇ、　Ｃｈｇｍ、４５，５５５　
）。

それぞれのアミノ酸を添加するたびごとにペプチド鎖に
定着しなかった遊離アミノ酸〔しかしアスパラギン（ペ
プチド（１）の左から右に数えて１１番目の位置にある
）がプロリン（ペプチド（１）の左から右に数えて１２
番目の位置にるる）に定着する場合を除いて〕はニンヒ
ドリンテストで定着する（　ＫＡＩＳＥＲＥ、　、　Ｃ
０ＬＥＳＣＯＴＴＲ，Ｌ。

他（１９’１６年）　、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｅｈｇｍ、
　３４，５９５　）。

アスパラギンとプロリンの定着の場合はクロラニルテス
トを用いる（　ＣＭＲＩＳＴＥＮＳＥＮ　Ｔ、Ｃｌ９７
９年）　Ａｃａｔ、　５ｃａｎｄ’、、　８３３．７６
３）　ｏ合成が終ったら樹脂に裸持さ糺たペプチドに結
合している保護基（該試剤に対して安定なアセト了はト
メチル基を除いて）はすべて除去される（　ＶＥＲＢＥ
Ｒ他、（１９７２年）　、　Ｊ、　Ａｍ、Ｃｈｔｍ、　
Ｓｏｃ、　９４．５４５６）。

無水のフッ化水素酸（樹脂１ｆ当り無水Ｅ　Ｆ　＋。

−の割合）をアニソール（ｌｔｎｌ／ｆ）の存在下で作
用（０℃、約６０分間）させて樹脂のペプチドを分別す
る。

フッ化水素酸を蒸溜して１反応混合物をエーテルにて洗
滌し、５０％酢酸で抽出して樹脂からペプチドを分離さ
せる。抽出物は水で稀釈して凍結乾燥する〇 ここに得られる粗ペプチドは水にわずかに可溶である。

カラムクロマトグラフィー〔ＬＰ０１型、可動相として
ジメチルホルムアミ）’　−０，１Ｍ′酢酸（３：　Ｉ
）を使用〕で精製する。２５４μｍの吸収を測定。主要
なピークの各フラクションの均一性を調べてから合併す
る。

得られるａＪＩｌ！ペプチド（９７ｑ、総収率約１０％
）は次のようなアミノ酸組成を示す：実験値　　　　　
　　理論値 ＊ 、４．？Ｐ　　　　　　　　２．２２　　　　　　　　
　２Ｔｈｒ　　　　　　　Ｏ，ｇ５　　　　　　　　　
１Ｇｔｑ　　　　　　　　１．１３　　　　、　　　　
　　１ｐｒｏ　　　　　　　　ｌ。２１　　　　　　　
　１Ｇｔｙ　　　　　　　　１．２０　　　　　　　　
　１Ａｌａ　　　　　　　　２．０７　　　　　　　　
　２Ｃｙ　ｓ　　　　　　　　４．６８　　　　　　　
　　６Ｌｔｕ　　　　　　　　１．１３　　　　　　　
　　　ＩＴｙｒ　　　　　　　　２．２７　　　　　　
　　　２Ｐｈａ　　　　　　　　１．１２　　　　　　
　　　１オ　加水分解の段階でＡｚｎの第一アミド官能
基が切断しＡｓｐに変るためＡｚｎＯ値は、４ＪＰＦと
して表わした。

高圧液体クロマトグラフィー（μＢｏｎｄａｐａｃｋＣ
１８カラム、逆相、溶離液組成下記の通り）（５１） により、　　２１０　、２５４　、２７０μｍでチェッ
クして純度を測定する： ＣＨ，ＯＢ　　、　　　　　　　４２５ｍＨ，０５２５
ｍ 実施例２ 上記の配列をもちそのチオール基のすべてがアセドアば
トメチルで修飾されたモノペプチドを前述の方法によっ
て調製した。

このモノペプチドは然のヒトＳＴ腸内ｌ１ｇ素と同じア
ミノ酸配列をもっているので以下１ヒト・合成ＳＴ腸内
毒素・と呼ぶことにする。しかしこのペプチドはシスイ
ル残基のすべてのチオール基がアセトアミドメチルで保
論され１分子内ジスルフィド橋が存在しない点で天然の
ヒトＳＴ腸（５２） 内毒素とは異っている。

実施例３〜．６ 本実施例は本発明の４種の接合体の合成に関するが、こ
れらの接合体におけるペプチドは豚・合成ＳＴ腸内毒素
かヒト合成ＳＴ腸内毒素であり。

キャリアー分子はテタヌストキシンかオバルブずンであ
る。

以下の説明において、　５Ｔ−ＴＴはそのペプチドが合
成ＳＴ腸内毒素（豚、ヒト）であってそのキャリアー分
子がテタヌストキシンである接合体含水し、　５Ｔ−Ｏ
Ｖ、４　はそのペプチドが合成ＳＴ腸内毒素（豚、ヒト
）でろってキャリアー分子がオバヌン゛ミンである接合
体を示すものとする〇コｆｉ　ラ（ＤＪｉｌ’合（Ｈ：
ｔ　ＦＲＡＮＴＺ　オ！　ヒＲＯＢＥＲＴＳＯＮ（Ｉｎ
ｆｅｃｔ、　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、　３３．１９
３〜１９ｇ（１９８１年））によって記載された方法で
合成することができる。

この反応混合物中に含有される合成（豚、ヒト）ＳＴ腸
内毒素の量はキャリアー蛋白質の約２倍量以上の過剰と
する。合成ＳＴ腸内毒素と各種のキャリアー蛋白質との
カップリングは例えば１−エチル−３−（３−ジメチル
ーアはノグロビル）−カルボシイミドを用いて行なう。

反応混合物Ｆｉ室温下、暗所にて約１８時間インキュベ
ートする０ ｐｉｎａａ衝液（ＰＲ′１ＱＱ）で透析を行って遊離の
合成Ｓ′Ｉｗｋ内毒素と未反応のカップリング剤をとり
除（０ＰｉＮａ緩衝液はリン酸緩衝液でその組成（蒸溜
水１１に対して）は次の通りでめる１、：ＮａＣ１８ｆ ＮａＨＰＯ２・Ｉ　２Ｈ，０２，８？ ＫＨ，ＰＯ４０，２ｆ ＫＣｌ　　　　　　　　０．２　ｔ Ｓ’ｌ’−０ＶＡ接合体は動物の免疫テス）Ｋ直接使用
できる０ ５Ｔ−ＴＴ　接合体の場合はＢＬＡＳＳ　他（ＢｔＬｌ
ｌ。

ＳｏＣ，（、’ｈｉｍ、　ＩＱ、、　３０５７〜３９６
５　（１９６７年））の方法によりホルムアルデヒドを
用いて無毒化する必要がある。

５Ｔ−ＴＴ接合体は使用に先立ってマウスの筋内円注射
でその毒性をチェックする。

本発明のペプチドはヒトおよび動物の天然ＳＴ腸内毒素
に対して興味ある性質をもっている。

次に示すペプチドを使用し、本発明のペプチドに関する
性質を調べてみた； （１）豚の合成ＳＴ腸内毒素（その申得方法は前述の通
り）。

（１１）豚の合成ＳＴ腸内毒素とテタヌストキシンとか
らなる接合体（５Ｔｐ−ＴＴと表示する）。

（＊＋ｏ　　豚の合成ＳＴ腸内毒素とオパルブミンとか
らなる接合体（５Ｔｐ−ＯＶＡと表示する）。

この試験にはヒトの天然ＳＴ腸内毒素も使用したが、そ
れは次のよりにして精製した。

熱に安定な腸内毒素のみを生成するヒト大腸菌種（ＮＩ
Ｂ−ＵＳＡめＤｒ、ｌＦ’ａｌｔｅｒ　ＬＩＩＲＤから
提供された）からＳＴ腸内毒素をとり、これを精製した
。バクテリアの生育条件や腸内毒素の精製法は５ＴＡＰ
ＬＥＳ他（／、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈａｍ、　２５５゜４７
１６〜４７２１）の記載する方法に従った０（５５） Ｄｒ、　Ｒ，ＧＩＡＮＮＥＬＬＡ　　によって提供され
たＳＴ腸内毒素標品も研究に使用した。

本発明ペプチドの性質についての研究 １、　毒性 試験に用いられたペプチドは前記の同相法によって得ら
れるペプチドでそのシステイル残基のＳＴ基はアセトア
ミドメチル基で保護されたものである。

ペプチドの毒性はマウスを用い、　ｇｒ＊ｐｒ、Ｅｓ他
（７，ＢｉｏＬ、　Ｃｈｇｍ、　２５５　（１９８０年
）、４７１６〜４７２１　）によって記載された方法に
よって鯛べる。それはマウスに被検化合物を投与すると
き腸液の蓄積にどのような効果を及ぼすかによって判定
される。生後３または４８′目のマウスの胃の中に被検
化合物を注入し、温度３７℃のオーブン中に約１時間お
いてから麻酔し、その旗を摘゛出する。腸が膨張してい
るなら′、それは注入された化合物に上って腸液の蓄積
が起ったためでおり、この化合物は生物学的に活性で毒
性を有する。これを定量的にみると、腸の重さと（５６
） 体重との間の比が少くともｏ、ｏｇ　（水のみを注入し
たコントロールではその腸／体重量比は０．０５）なら
その被検化合物は生物学的に活性である。

添付の図における各点は３頭のマウスで得られた結果の
平均値を示している。

図Ｉは腸の合成ＳＴ腸内毒素の毒性試験で得られた結果
を示す。縦座標は編／体の重量比を表わし、その各コラ
ムは３つの実験値の平均を表わす。コラム４は９μｆず
つ投与されたヒトの天然ＳＴ腸内毒素について得られた
結果を示し、コラム５は腸内毒素を投与しないコントロ
ールで得られた結果を示す。白色のコラム１，２．３は
それぞれ５０μｆ（コラムｌ　）、　５００μｆ（コラ
ム２）、５０μｆ（コラム３）ずつ投与された合成ＳＴ
腸内毒素について得ら゛れた結果を示す。

このグラフから推測されることは豚の合成ＳＴ腸内毒素
は腸管液の蓄積を引きおこすことがなく、従って毒性を
有しないことでるる。

本発明のペプチドに毒性のないことはそのシステイル残
基のＳＲ基が生体媒体中で安定な保護基で保護されてお
り、そのため分子内ジスルフィド橋が存在しないことと
よく一致する。豚およびヒトの天然ＳＴヒトシンの生物
学的活性には分子内ジスルフィド橋の不可欠であること
が判った（　ＳＴ、４ＰＬＥＳ他、　／、　Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｕｍ、　２５５．４７１６〜４７２１　（１９８
０年））。

２　免疫原性 本発明に係るペプチドは毒性のないものであるが１次に
それを免疫学的見地から研究した。

本発明による接合体について試験した結果。

次のことが判った： （ｚ）　　この接合体は抗体を誘導する、（ｈ）　　こ
れらの抗体は本発明に係るペプチドと特異的に反応する
。

（Ｃ）　　これらの抗原は天然ＳＴ腸内毒素（豚または
ヒト）を認識する。　　′ （ｄ）　　これらの抗体は天然ＳＴ腸内毒素（豚または
ηト）を中和する。　　“ 次に、以下の接合体を用いて各種の試験を行った： その接合体とは； （１）　　合成豚ＳＴ腸内毒素とオパルブξンとからな
る接合体（５Ｔ−ＯＶＡ）： （２）合成豚ＳＴ腸内毒紫とテタヌストキシンとからな
る接合体（５Ｔｐ−ＴＴ）； であり、天然のトキシンをこれら２つの［１テ嶽きかえ
テＦＲＡＮＴＺ　オ、、ヨ（ｆ　ＲＯＢＥＲＴＳＯ（Ｉ
ｎｆ　ｇｅｔ　。

ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、　３３．１９３〜１９ｇ　
（Ｉ　９８１年））の方法でそれぞれウサギとマウスと
を免疫化させた。

本接合体試料は合成豚ＳＴ腸内毒素（１００μｔ／−）
ならびにそれと尋量の７０インド（ＦＲＥＩＩＮＤ）補
助薬から調製した＠ ウサギ（ＢＯＵＳＣｉ４Ｔ、　６ケ月）の背中の複数個
所に１−の５ＴＰ−ＯＶ、４を皮肉注射した。

不完全フロイント補助薬に懸濁させたワクチン（合成豚
ＳＴ＃Ｊ内毒素５０ｓｆ　）　’ｆｔ　４　ａｆｓ１隔
テ３（５９） 夕月間投与した。

最終の注射から３週目にウサギの血清をＷ、増し一２０
℃で保存し、これを用いてエリザ（Ｅｌｉｚα）法によ
る試験を行った。

次（Ｄ手順テＳＴＰ　−ＴＴ　接合体によるマウス（Ｂ
ａｌｌ／ｃ）Ｏ免疫を行ッｉｅ。１００　ｐｔｆ）　５
ＴＰ−ＴＴ　接合体（合成豚５ＴＨ５内毒素：０μｔを
含有）ならびにそれと等容量の完全７０インド補助薬と
を混合し、これを腹腔内注射したＯ ｌケ力ごと、２回の筋内円注射（接合体１００μｔと不
完全フロイント補助薬との混合物）でワクチン注入を行
った０最終の注射後４日目にマウスの血清を採嵌し、こ
れを−２０℃にて保存し、エリザ法による試験に供した
。

エリザ法は抗原−抗体反応で抗体を定量する不均一相に
ょる測定法（エンザイムーイムノソ（６０） ルペントアツセイ）でおる。

通常、過剰の抗原を被扱したプラスチック管を使用し、
これに抗体を含む血！を入れてインキュベートする。イ
ンキュベートによって抗体はそれぞれ対応する抗原と結
合する◇次いで。

＃素によってマークされた抗免疫（アンチイムノ）グロ
ブリンを用いて１２のインキュベーションを行なう◇ すなわち、この試験で味ＳＴＰ　−ＯＶＡとＳＴＰ　−
ＴＴ接合体によってそれぞれ免疫されたウサギとマウス
の血清に含まれる抗体をＶＯＬＬＥＲ他（Ｅｎｚｙｍｇ
ハｎｋａｄ　ｉｍｍｕｎｏｚｏｒｂａｎｔ　Ａｓ５ａｙ
、　ａ　ｇｕｉｄｇ　ｗｉｔｈａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏ
ｆ　ｍ１ｃｒｏｐｌａｔａｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｚ。

Ｄｙｎａｔｇｃｈ、　Ｅｕｒｏｐｅ、　Ｇｂａｒｎｓｍ
ｙ、　Ｐ、Ｉ（１９７９年））の記載した方法で定量す
る〇 合成豚ＳＴ腸内毒素または天然豚ＳＴ腸内毒素〔５０ｍ
μのカーボネート／ビカーボネート緩衝液、ｐＨｑ、。

（すなわち被覆緩衝液）中２０ａｆ／−の濃度の〕をエ
リザマイクロプレート（Ｎｕｎｃ　Ｉｎｔｅｒ−Ｍａｄ
Ｄｅｎｍａｒｋ　）のチューブ上に、３７℃、約２時間
かけて過剰に沈着（デポジット）させた。

沈着後、その管をα０５％のＴｗｅｇｎ　２０　（脂肪
酸エステルとソルビトールエチレンオキサイドを縮合し
、ソルビトールを非エステル化水解することによりポリ
オキシエチレン鎖を固定して得られる湿潤剤で、　Ｍａ
ｒｃｈ社によりＴｗｇｇｎ　２０として販売）を含むリ
ン酸ナトリウム緩衝液の生理食塩液（ｐＥ　７．４　）
　（ＰｉＮａ／Ｔｗａｇｎ　２０　）　ＶＣて洗滌した
。

この緩衝液（ＰｉＮａ／Ｔｗｇｇｎ　２０　）は被検兎
やマウスの血清の稀釈剤として、また酵素でマークされ
た抗免疫グロブリン抗体の稀釈剤としても使用する。

これらの抗免疫グロブリン抗体の１つは抗つ”ｊ　−’
ｉ’　−’ｒ　Ａ’　１１Ｇｚ（ＢＩＯＮＥＴＩＣ’ｙ
　ホ５　）　ＩＪ　−％ＵＳＡ。

製）であり、もう１つはヒツジ抗−マウスＩＩＧｓ（ｌ
Ｎ５ＴＩＴＵＴ　ＰＡＳ’ｌ”ＥＵＲ，ｙランス、１１
りで、これらはいずれも過酸化酵素（ベル　オキシダー
ゼ）に結合したものである〇 ウサギとマウスの血清は適尚に稀釈されて管に入れられ
、３７℃で１時間インキュベートされる。

ｐｉＮα／Ｔｗ＠ｇｎ　２０で洗滌してから上記の抗−
免疫グロブリン抗体を添加し、３７℃で１時間インキュ
ベートする。数回洗滌処理後、基質としてＯ−フェニレ
ン　ジチオン（５０■／１００＋ｄ）と４０μｌの過酸
化水素（５Ｑｍ＆　　クエン酸／リン酸・緩衝液、ＰＨ
１）を用いて、管に結合した酵素の１を定量する。

３０分後１２５チＨ１５０，５０μｔを加えて反応を停
止させ、すみやかに４９２μｍの吸光度を計る。

反応 ウサギの血清を対象として、合成豚ＳＴｗｉｊ内毒素を
結合できるか調べてみた。

図２は接合体５Ｔｐ−ＯＶ４によって誘導された抗体を
含有するウサギ血清の一投与カーブ（エリザ法）を示す
。

血清稀釈物の逆数の関数として変動する光学（６３） 密度を縦座標として示す。

ＳＴＰ　−ＯＶＡ接合体によって誘導された抗体を含有
する血清の投与量が黒点のカーブであり。

白い点のカーブはＳＴＰ　−ＯＶ４接合体によって誘導
された抗体を含みエリザ法による試験の前に室温下で過
剰量の合成豚５ｒＩｌｌ内毒素とインキュベートされた
血清についてのものでるる。

図から判る通り、管のプラスチック壁に結合した合成５
Ｔ９）内毒素に付加する前に合成豚ＳＴＭＪ内毒素の過
！ｌ１ｉｉｉとインキュベートした場合には反応が認め
られず、　ＳＴｐ　−ＯＶＡ接合体によって誘導された
抗体と合成豚ＳＴ腸内毒素との結合が特異熱であること
を示している。

接合体ＳＴＰ　−ＯＶＡによって誘導された抗体とヒト
合成ＳＴトキシ゛ンとの反応について調べたところそこ
にクロス反応を認めた０ 図３はＳＴＰ　−ＯＶ、４接合体によって誘導された（
６４） 抗体を含むウサギの血清の合成ヒトＳＴ腸内毒素による
投与カーブ（エリザ法）を示す。

光学密度の変動を縦座標に、血清稀釈物の逆数を横座標
に示す。

三角形のつくるカーブはＳＴＰ　−ＯＶＡ接合体によっ
て誘導された抗体を含む血清についての結果に対応する
。

白い点のカーブはＳＴＰ　−ＯＶＩ接合体によって誘導
された抗体を含み、エリザ法による試験の前に室温下で
過剰量の合成ヒトＳＴ腸内毒素とインキュベートされた
血清についての結果に対応する。

この図から判る通り、　ＳＴＰ　−ＯＶＡ接合体によっ
て誘導された抗体は管に固定された合成ヒトＳＴ膓内毒
素七反応する◎ すなわち、エリザ試験前に、被検血清とインキュベート
されたヒト合成ＳＴ腸内毒素（過剰量）はＳＴＰ　−Ｏ
ＶＡ接合体によって誘導された抗体の特異結合をブロッ
クすることが認められる０体による天然ヒトＳＴ腸内毒
素のｍｍ 合成豚ＳＴ＆内毒素に対して誘導された抗体が天然ヒト
ＳＴ腸内毒素と反応し得ることを調べる０ヒトＳＴ腸内
毒素とヒト合成ＳＴ腸内毒素をエリザ・ずクログレード
のカップに入れた。エリザ試験の結果、上記の抗体が天
然ヒトＳＴｗｋ内毒素と反応すると七を認□めた。

同様にして合叡豚５ＴＷｋ内毒素に対して誘導された抗
体が天然豚ＳＴ腸内毒素を認識することを認めた。

以上のことから１本発明に係るペプチドは次に示す腸内
毒素を認識する抗体を誘導するものでめるニ ー合成豚ｓｒ腸内毒素 一合成ヒトＳＴ＃内毒素 一天然豚５ＴＰＩｋ内毒素 一天然ヒトＳＴ腸内毒素０ ｓｒｐ　−ｏｒｉｓｐＨ）　ｓ’ｒｐ−ｒｒ接合体ｒｃ
ｘツーｃ免疫されたウサギおよびマウスの血清を用いて
テストし、天然ヒトＳＴ腸内毒素の生物活性を中和する
能力が有すか調べてみた０その試験方法はマウスを用い
た５ＴＡＰＬＥＳ他（／、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｇｍ。

２５５　（１９，８０年）、４７１６〜４７２１　）の
方法に従った。

試験にはそれぞれ、ｐｉＮａ緩衝液（ｐＥ　７．００　
）で次の６段階に稀釈した血清を使用した、−４＝１：
１／　　　　・　１／、１１ ５０　２、　２００　３．　４００ ４　：　　ｌ／　　　　、　　’／　　　　　、　　Ｉ
／８００５　、　１６００　６　、　３２００被検血清
は天然ヒト５ＴＰＪｈ内毒素と混和した０図４は、天然
ヒトｓｒ腸内毒素１２５μｔ〔ＳＴｐ内毒素１２５μｆ
は５マウス単位を示す；　ＧＩＡＮＮＥＬＬＡＲ，／４
．　（＋９’１６年）　（Ｉｎｆｅｃｔ、ａｎｄ　Ｉｍ
ｍｔｔｎｉｔｙ。

１４．９５〜９９）〕で引きおこされる腸液蓄積に対し
てＳＴＰ　−ＯＶＡによって誘導された抗体を含むウサ
ギ血清がどのような効果を及ばすか（６７） を示すものでるる。

縦座標に腸／体重比をプロットし、横座標に血清稀釈物
６段階をプロットしている。

いずれの血清稀釈物についても１２５μＶの天然ヒトＳ
Ｔ腸内毒素を２０μｌの血清と混合（全［１００μｌ）
し、小マウスを用いるテストの肋に１時間インキュベー
トした。

カーブの各点は各３ケのデーターの平均値である。

コラム１はコントロール）（対照区）であり。

天然ヒトＳＴ腸内毒素１２５μＶで得られた結果に対応
する。

コラム２もコントロールで、天然ヒトＳＴ腸内毒素１２
．５μｔに非免疫ウサギ血清（’１５ｏ　稀釈）２０μ
ｌを加えた場合の結果である。

コラム３もコントリールで、腸内毒素なしで得られた結
果でおる。

図５は、　　１２．５μｆの天然ヒトＳＴ＆に内毒素に
よう（６ｇ） て引きおこ濱れた腸液蓄積に対するＳＴＰ　−ＴＴ接合
体により誘導された抗体を含むマウス血清の影智を示す
。

図５は図４と同様にして作成畜れ、コラム１゜２−３は
図４で説明したものと同じ意味をもつ・。

本発明に係る接合体で誘導された抗体には特に天然ヒト
５ＴＰｊｋ内毒素の生物活性を中和するという％性がめ
る〇 本発明のペプ、チドは固相台盤によって製造することが
できるので大量製造が可能でかつ均一な形で得られる（
その結果、バクテリアを増殖させた後どうしても精製工
程を必要とする複雑な方法を避けることができる）とい
う利点をもっている。

本発明のペプチドは試験結果が示す通り、大雪に使用し
ても毒性がない。このことはシスチル残基のＳＥ基が生
文媒体中で安定な基によって保睦され、ジスルフィド橋
が存在しないという事実によって説明で、きる。

本発明のペプチドは、別のキャリアー蛋白質と結合した
とき、天然ＳＴ腸内毒素を認識し、この腸内毒素と結合
を生じ、その生物活性を中和させる抗体を誘導しうると
いう興味ある特性をもっている。

これらの結果は％ＳＴ＆内毒素の１８ケのアミノ酸から
なる配列のＮ−末端にある４ケのアはノ酸残基Ａｚｎ−
Ｔｈｒ−Ｐｈｇ−Ｔｙｒはジスルフィド橋によって誘導
さ、れる重積（ｆｏＬｄｇｄ　）配置の中に包含されな
いためでおるという推測によって説明ができるＯ ８Ｔ腸内毒素のこの部位は安定な抗原決定因子からなり
、重積天然ＳＴ腸内毒素におけるよりも免疫原性が低く
、シスチル残基のチオール基が還元された天然ＳＴ腸内
毒素の１部分を形成しているとき、または本発明のペプ
チド鎖特に合成ＳＴ腸内毒素のペプチド配列（そのシス
チル残基のチオール基が保設されている）中に存在する
ときには抗体を生ずる。

抗体がこの部分に向けられると、配置のいかにかかわら
ず天然ＳＴ腸内毒素と結合を生ずる。

次の実施例は培養系におけるＳＴトキシンを示すもので
ある。

培養系におけるＳＴトキシン（毒性）の検定試料から分
離したバクテリアを液体栄養培地、例えば酵母抽出物、
カゼイン氷解物（ＣＹＥと表示）を用いて１２時間培養
する。

培養後のバクテリアを遠心分離にかけ、上澄液を回収す
る。

通常の放射線−免疫手法によって上澄液に含まれる毒性
を測定する。本発明のペプチドで誘導された抗体によっ
てＳＴ毒性が決定される。パ本発明のペプチドはその自
体でまたはキャリ、。

アー分子と結合して中和抗体を合成することができるの
で、ワクチン剤として使用可能である。

本発明のペプチド（テタヌストキシンのようなキャリア
ー分子と結合して）は路次の割合で使用する： −マウｘ　（Ｂａ１ｈ／ｃマウス、約２０？）に対して
ｌＯμｆ。

−ウサギ（Ｂｏｕｚｃａｔ　）に対して５０μ２゜（７
１） 本発明はＳＴ腸内毒素を直接検定するための放射線−免
疫−ならびに免疫−酵累テストの実施（エリザ法）のた
めに、さらに医学、獣医学分野において天然ｓｒ＃Ｊ内
毒素に対する免疫目的に木兄、！に係るペプチドを使用
することも対象としＣＩ諭る。

禾″発明はこれまで考察した特定のペプチドのみに唄定
されるものでないことは当然でめる。

当；−者にとって自明のことでめるが、Ｐ＠に□　含ま
ｉるアミ′ノーアシル残基の成るものを必要により他の
アミノ−了シル残基によって代える、こと声、もしそれ
によってペプチドの表面配置に実質的な変化が生ずるこ
となく、また修正されたペプチドによって誘導きれる抗
体の性質が修正前のペプチド、本発明においては天然Ｓ
Ｔ腸内毒素に対して変更を生じないかぎり、可能でおる
。その意味で１例えばアラニル基のグリシル基による置
きかえ、またはその逆、イソ−アスパラキン残基のアス
パラギン酸、グルタミンまたはイソグルタミン残基によ
る置きかえ、バ（７２） リン基のアラニン、ロイシン首たはグリシン基による甑
キかえ、リジン基のノルロイシン基またはアルギニンに
よる置きかえ等が可能でおるが、その場合も、修正され
たペプチドが前述のペプチドや天然毒素を中和し得る抗
体を誘導する能力についてその都度確認すべきである。

このような均等物も本発明の特許請求の範囲に規定され
るペプチドに当然包含される−のでおる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、各種腸内毒素投与により、体重ＣＢＦ）に対
する腸の重さくＧＦ）の比率に及ぼす影！＃を示すグラ
フであり、第２図は合成豚ＳＴｈ内毒素でのＳＴＰ　−
ＯＶＡ接合体に、より誘発さ−れた抗体を含有する兎血
清のエリザ法による薬用量曲線を、血清稀釈の逆数に対
する光学密度・の変化として示すグラフでロク、第３図
は合成ヒトＳＴ腸内毒素での第２図と同様の変化を示す
　□グラフでるり、第４図はＳＴＰ　−ＯＶＡ接合体に
より誘発された抗体を含有する兎血清の稀釈に対する腸
の１さ／体重の比率の変化を示すグラフであり、第５図
は５ＴＰ−ＴＴ接合体により誘発された抗体を含有する
マウス血清の稀釈に対する腸の重さ／体重の比率の変化
を示すグラフである。 出願人　　アンスティテユ、パスツール代理人　弁理士
　米　原　正　章 弁　理　士　　松　　本　　　　　昂 ６　　５　　４　　３　　２　　　　　１　　　　　　
　　　　３２１血清の稀釈 ５０３− 血清の稀釈 ＦＩＧ、５゜ 第１頁の続き ０発　明　者　ニブイス・デュフロ フランス国９４２３０カチャン・リ ュ・パスカル１８番 ０発　明　者　パトリス・ボクエット フランス国９４０００クレテル・リ ュ・デュ・プアット・ゲオルゲ ット１番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）少なくとも４ｎ乃至せいぜい１８ルのアミノ゛−
   を含有し、好ましくＩｊ左旋性のペプチド（Ｐ）ｒＬに
   して、ルが１または２に等しく、ルが１のとき、ペプチ
   ドシーケンスＰが以下ｄペプチド鎖に含まれ、　　　　
   　　　　　　　　“１ｙｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈａ−Ｔ５ｉｒ
   −Ｃｙｓｐ−Ｃ’７ｚ−Ｇｌｕ−Ｌｎｂ−Ｃｙｚ−（Ｎ
   −末端） （ここで、Ａは１ｚｒＬを表わしまたＴはＴｙｒを゛表
   わすか、またはｌはＴｙｒを表わしＴはＡｘｎを表わす
   。） 分子中に４在し得るシスティル残基の卆オール基は生物
   学的条件下で安定な基により保護されており、チオール
   基の多くても−っは遊離のＳＨ基の形態にありがちであ
   るか、または１物学的条件下で不安定な基により保護さ
   れがちであり、ルが２のとき、ペプチドシーケンスｐ−
   ｐは、前記式（１）のペプチド鎖に含まれそれぞれ少な
   くとも４個のアミノ酸乃至せいぜい１８個のアミノ酸を
   含有する同−又は異なる二つのペプチドシーケンスＰか
   ら成り、二つのペプチドシーケンスＰは、二つのシーケ
   ンスの一方のシステイル残基のいずれかのイオウ原子と
   他のシーケン□。 スのシステイル残基のいずれかのイオウ原子との間に確
   立されたジスルフィド結合を通じて、または二つのペプ
   チドシーケンスＰのカルボキシル基と他のシーケンスの
   アミ７基との間に確立された結合を通じて、互いに連結
   されており、チオール基の多くても一つは、もしジスル
   フィド結合に接合されていないならば、遊離のＳＥ基の
   形態であ□り得または生物学的条件下で不安定な基によ
   り・保護されることができ、また存在し得るシステイル
   残基の他のチオール基は生物学的条件下で安定な保護基
   によ”り保護されている”ことを特゛徴とする少なくと
   も４ｎ乃至せいぜいＩ８ルのアミノ酸を含有するペプチ
   ド（Ｐ）ｎ　。 （２）　　少なくとも４ｎ乃至せいぜい１８ルのアミノ
   酸を倉有し、好ましくは左旋性のペプチド（Ｐ）ｎ−ケ
   ンスＰがいがなるシス テイル残基も含有しれ）ときにはルは１であり、□ペプ
   チドシーケンスＰが少なくとも一つのシステイル残基を
   含有するときルは１または２に等しく、ルが１のとき、
   ペプチドシーケンスＰが以下のペプチド鎖に含まれ、 （ここで、ΔはＡｚｎを表わしまたＴはＴｙｒを表わす
   か、またはｌはＴｙｒを表わ□しＴは／４５ルを表わす
   。） 分子中に存在し得るシスティル残基のチオール基は化物
   学的条件下で安定な基により保護されており、チオール
   基の多くても−っは遊離のＳＲ基の形態にありがちであ
   る一ｔＩ−または生物学的条件下で不、安定な基により
   保護されがちであり、ルが２のとき、ペプチドシーケン
   スＰ−Ｐは、前記式（１）のペプチド鎖に含まれそれぞ
   れ少なくとも４個のアミノ酸乃至せいぜい１８個のアミ
   ノ酸を含有スる二つのペプチドシーケンスＰから成り、
   二つのペプチドシーケンスＰは、二つのシーケンスの一
   方のシステイル残基のいずれかのイオウ原子と他のシー
   ケンスのシステイル残基のいずれかのイオウ原子゛との
   間に確立されたジスルフィド結合を通じて互いに連結声
   れており、また存在、し得るシステイル残基のジスルフ
   ィド結合に接合されていない他のチオール基は生物学的
   条件下で安定な保護基により保護されていることを特徴
   とする特許〃求の［頭語１項に記載の少なくとも４ｎ乃
   至騒いぜい１８ｎのアミノ酸を含有するペプチド（Ｐ）
   ｒＬｏ（３）　　システイル残基のチオール官能基の生
   物学的条件下で安゛定な保護基が下記式 ％式％ （ここで、Ｒ、Ｒ’およびＲ“は、互いに独立に水素原
   子、炭素原子１〜４のアルキル基を表わす。） 好ましくは （ここで、ＲおよびＲ′は水素原子、炭素原子１〜４を
   有するアルキル基を表わす。）を有するものであること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の
   ペプチド。 （４）　　チオール官能基を保護する基がアセトアミド
   メチルまたはホルムアミドメチルであることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の
   ペプチド。 （５）　　それらのペプチド鎖が下記ペプチドシーケン
   スに含まり、 （ここで１、ｌはＡｚｎを表□わしまたＴはＴｙｒを表
   わすか、またはｌはＴｙｒを表わしＴは／ｉ５３を表わ
   す。′） 分子中に存在し得るシステイル残基のチオール基は生物
   学的条件下で安定な基により保護されており、チオール
   基の多くても一つは遊離のＳＲ基の形態にあるか、また
   は生物学−条件下で不安定な基により保護されうろこと
   を特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第４項のし、１
   ずれかに記載のモノペプチド。 （６）存在し得るシステイル残基の全てのチオール基が
   生物学的条件下モ安定な基により保護されていることを
   特徴とする特許請求の範囲第５項に記載のモノペプチド
   。 （７）　　存在し得るシステイル残基の全てのチオール
   基がその７つを除いて生物学的条件下で安定な基により
   保護されていることを特徴とする特許請求の範囲第５項
   に記載のモノペプチド。 （＆）　　１項記式（１，？のペプチド鎖に含まれそれ
   ぞれ少なくとも４個のアミノ酸乃至せいぜい１８個のア
   ミノ酸を含有する同一の二つのペプチドシーケンスＰか
   ら成り、二つのペプチドシーケンス、Ｐは、二つのシー
   、テンスの一方のシステイル残基の一つのイオウ原子と
   他のシーケンスのシフテイル残基の一つのイオウ原子と
   の間に確立されたジスルフィド結合を通じて互いに連結
   されており、ｔｆｃ存在し得るシフステイルＰａ　基ｆ
   ）　ジスルフィド結合に接合されていない他のチオール
   基は生物学的条件下で安定な保護基により保護されてい
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第４項の
   いずれかに記載のジペプチド。 （９）　　以下のシーケンス 一４ｚｎ−Ｔｈｒ−ｐｈａ−Ｔｙｒ− −Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ｐｈｇ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ　−−Ｃｙ
   ｓ−Ｃｙｔ−４，？ｎ−Ｐｒｏ−４ｔａ−Ｃｙｐ　−−
   Ｃｙｚ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−ｐｒｏ−４１ａ−Ｃｙｓ−−
   Δｚｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈａ−Ｔｙｒ＝Ｃｙｚ＝Ｃｙｓ−Ｇ
   Ｌｕ　−−Ｉｚｎ−Ｔｈｒ−ｐｈａ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−
   Ｃｙｐ−ＧＬｕ−Ｌｅｕ　−−Ｃｙｓ−Ｃｙｚ−Ｇｌｙ
   −Ｌａｗ−Ｃｙｚ−Ｃｙｚ−４，？ｎ−Ｐｒｏ−１１ａ
   −Ｃｙｓ−ｒ４ｔα−ＧＬｙ−Ｃｙｓ　− −Ｃｙｚ　−Ｃ’ｙｓ　−ＧＬｙ　−Ｌａ　ｕ−Ｃｙｓ
   　−Ｃｙｚ　−Ｔｒ　ｙ　−ｐｒ　ｏ−４ｔａ−（、’
   ｙｓ　−４ｔα−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ の一つを有することを特徴とする特許請求の範匪第１項
   乃至第８項のいずれかに記載のペプチド。 （１０）以下の式 ％式％ （１） （２） （３） に相当するものであることを特徴とする特許請求の範囲
   第５項乃至第７項のいずれかに記載のモノペプチド。 （１１）生理学的に受容可能な無毒性担体分子、好まし
   くはオバルブミン、破傷風毒素、コレラゲノイドおよび
   シゲラ　チトトキシンから選択されたタンパク質と共同
   して、特許請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれかに
   記載のペプチドから構成されてなることを特徴とする接
   合体。 （１２）ヒトおよび動物の、特に豚のＳＴ毒素を証明し
   得る抗体の製造用の特許請求の範囲第１項乃至第１１項
   のいずれかに記載のペプチドの用途０ （Ｉ３）ヒトおよび動物の、特に豚のＳＴ腸内毒素に関
   しヒトおよび動物を種痘し得る抗体製造用の特許請求の
   範囲第１項乃至第１１項のいずれかに記載のペプチドの
   用途。