DE69331266T2 - Oligonucleotid-polyamide konjugate - Google Patents
Oligonucleotid-polyamide konjugateInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft neue Oligonucleotid-Polyamid-Konjugate, vorzugsweise mit einer freien 3'-Hydroxyl-Gruppe, worin das Polyamid an das Oligonucleotid über seinen Carboxylterminus gebunden ist.
- Eine Reihe von molekularbiologischen Verfahren umfasst die Detektion von Oligonucleotidsequenzen mit Reportergruppen. Beispielsweise ermöglicht die weit verbreitete Polymerase-Kettenreaktion- (PCR-) Technologie die Herstellung zahlreicher Kopien einer gewünschten DNA aus nur wenigen Target-Molekülen innerhalb einer Zeitspanne von 1 bis 2 Stunden und hat folglich in Nucleinsäure-Nachweisverfahren Anwendung gefunden, die bis dahin durch die geringe Empfindlichkeit eingeschränkt waren. Die Detektion amplifizierter PCR-Produkte kann auf verschiedenste Weise erfolgen. Es wäre äußerst wünschenswert, Amplifikationsprodukte nichtradioaktiv, beispielsweise unter Verwendung einer Reportergruppe innerhalb der amplifizierten Nucleotidsequenzen detektieren zu können.
- Ebenso wäre es bei Reaktion wie etwa Nicktranslation wünschenswert, ein markiertes Nucleotid in die mittels DNA-Polymerase oder RNA-Polymerase erzeugten Reaktionsprodukte zur darauf folgenden Detektion von Hybridisierungsprodukten einzuführen.
- Die WO 89/03849 befasst sich mit Oligonucleotid-Polyamid-Konjugaten der Formel X- L-Y, worin X das Polyamid, Y das Oligonucleotid und L ein Linker ist, der eine kovalente Bindung zwischen dem Aminoterminus des Polyamids X und der 3'-Phosphatgruppe des Oligonucleotids Y bildet. Das Beispiel 9 darin offenbart eine Ausführungsform, bei der der Linker zwischen X und Y ähnlich jenem aus Fig. 5 der vorliegenden Beschreibung ist, spezifiziert jedoch keine der nachstehend beschriebenen Verbindungen der vorliegenden Erfindung, bei denen das Oligonucleotid mit dem Carboxylterminus des Polyamids verknüpft ist.
- Gemäß vorliegender Erfindung wird in einem Aspekt ein Nucleotid-Polyamid-Konjugat der Formel (I):
- Nu-NUC-C C-X¹-NH-X²-X³ (I)
- bereitgestellt, worin X¹ eine unsubstituierte oder substituierte C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkylengruppe ist, worin ein oder mehrere Kohlenstoffatome gegebenenfalls durch -NH-, -O- oder -S- ersetzt sind, X² eine Bindung oder eine unsubstituierte oder substituierte C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkylengruppe ist, worin ein oder mehrere Kohlenstoffatome gegebenenfalls durch -NH-, -O- oder -S- ersetzt sind, wobei die optionalen Substituenten in X¹ bzw. X² beispielsweise aus einem oder mehreren von Oxo-, Amino-, Thioxo-, Hydroxyl-, Mercapto-, Carboxyl-, Halogen-, Niederalkyl-, Phenyl-, Niederalkylamino-, Niederalkylester-, Niederalkylamido-, Niederalkylether- und Niederalkylthioether-Gruppen, Schwefelanalogen dieser Substituenten und Seitenketten-Substituenten natürlich vorkommender Aminosäuren sowie eng verwandten Analogen dieser Seitenketten ausgewählt sind. X³ ist ein(e) über ihren/seinen Caboxylterminus verknüpfte Aminosäure oder Polyamid; NUC ist ein Nucleosid entsprechend einer der folgenden Formeln:
- worin → die Bindung zur -C C- Gruppe in Formel (I) angibt und X&sup4; eine Zuckergruppe der Formel:
- ist, worin der 5'-Sauerstoff an Nu gebunden ist und X&sup5; und X&sup6; jeweils unabhängig voneinander H oder OR sind, worin R = H, eine Schutzgruppe oder eine Festphasen-Matrix ist. Nu ist ein Oligonucleotid.
- X¹ ist eine unsubstituierte oder substituierte C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkylengruppe, worin ein oder mehrere Kohlenstoffatome gegebenenfalls durch -NH-, -O- oder -S- ersetzt sind, wobei die optionalen Substituenten in X¹ aus einem oder mehreren von Oxo-, Amino-, Thioxo-, Hydroxyl-, Mercapto-, Carboxyl-, Halogen-, Niederalkyl-, Phenyl-, Niederalkylamino-, Niederalkylester-, Niederalkylamido-, Niederalkylether- und Niederalkylthioether-Gruppen und dergleichen, wie z. B. Schwefelanalogen dieser Verbindungen, sowie beliebigen anderen funktionellen Gruppen ausgewählt sind. Andere mögliche Substituenten sind beispielsweise die Seitenketten-Substituenten natürlich vorkommender Aminosäuren sowie eng verwandte Analoge davon. Vorzugsweise ist das C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkylen ein C&sub1;&submin;&sub3;- Alkylen und ist gegebenenfalls mit einem oder mehreren von Amid, Halogen, Aryl, Ester und dergleichen substituiert. Eine bevorzugte Form von X¹ ist Methylen.
- X² ist eine Bindung oder eine unsubstituierte oder substituierte C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkylengruppe, worin ein oder mehrere Kohlenstoffatome gegebenenfalls durch -NH-, -O- oder -S- ersetzt sind, wobei die optionalen Substituenten in X² beispielsweise aus einem oder mehreren von Oxo-, Amino-, Thioxo-, Hydroxyl-, Mercapto-, Carboxyl-, Halogen-, Niederalkyl-, Phenyl-, Niederalkylamino-, Niederalkylester-, Niederalkylamido-, Niederalkylether- und Niederalkylthioether-Gruppen, Schwefelanalogen dieser Substituenten und Seitenketten-Substituenten am α-Kohlenstoff natürlich vorkommender Aminosäuren sowie eng verwandten Analogen davon ausgewählt sind. X² liegt vorzugsweise in der Form -CO-(C&sub1;&submin;&sub9;-Alkylen)-NH- vor, worin das Alkylen weiter substituiert sein kann, z. B. mit Substituenten von natürlich vorkommenden Aminosäuren oder dergleichen. Eine bevorzugte Form von X² ist -CO-(CH&sub2;)&sub5;-NH- oder dergleichen.
- Das Polyamid (X³) ist vorzugsweise ein Polypeptid aus zwei oder mehr Aminosäuren. Vorzugsweise enthält das Polyamid auch eine oder mehrere Reportergruppen. Alternativ dazu kann das Polyamid nur eine einzige Aminosäure umfassen.
- Die Nucleosidgruppe NUC besitzt in einer bevorzugten Ausführungsform die folgende Struktur:
- worin X&sup4; wie zuvor beschrieben ist. In der Zuckergruppe X&sup4; sind die Substituenten X&sup5; und X&sup6; jeweils unabhängig voneinander H oder OR, worin R = H, eine Schutzgruppe oder eine Festphasen-Matrix ist; vorzugsweise sind R&sup5; = H und R&sup6; = OR, worin R = H oder eine Trägermatrix ist.
- Besonders bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfassen Verbindungen der Formel (II):
- worin X², X³, X&sup5;, X&sup6; und Nu wie zuvor beschrieben sind.
- Die Gruppe X³ stellt ein Polyamid dar, das kovalent mit der Gruppe X² verbunden ist. Das Polyamid kann aus natürlich vorkommenden Aminosäuren (Biochemistry, 2. Aufl., Albert L. Lehninger, S. 72-77 (1970)), wie z. B. Lysin, Valin, Glycin, Serin, Threonin, Tyrosin, Methionin, Prolin usw., über Amid- oder so genannte Peptidbindungen gebildet werden. Andererseits kann das Polyamid aus synthetischen Aminosäuren, wobei synthetische Aminosäuren jene Aminosäuren sind, die in der Natur nicht Proteinen vorkommen, oder auch aus einer Kombination aus natürlichen und synthetischen Aminosäuren bestehen. Vorzugsweise können die synthetischen Aminosäuren α,ω-Aminocarbonsäuren, dargestellt durch die allgemeine Formel H&sub2;NCHR¹COOH umfassen, worin R¹ eine beliebige organische Gruppe ist, wie z. B. ein C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkylen, das unverzweigt oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt mit einer oder mehreren olefinischen oder acetylenischen C-C-Bindungen sein kann, beispielsweise Cycloalkyl, das gesättigt oder teilweise gesättigt und/oder durch ein oder mehrere Heteroatome oder Gruppen, die derartige Heteroatome enthalten, wie z. B. Amidgruppen unterbrochen und/oder mit Halogen, Cyano, Amino oder unsubstituiertem oder substituiertem Phenyl oder Benzyl substituiert sein kann, um nur einige Beispiele zu nennen. Das Polyamid kann eine beliebige Anzahl an Aminosäure-Einheiten (-Resten) enthalten, beispielsweise 1 bis 100 Aminosäuren.
- Das Polyamid (X³) kann ein Peptid bilden, das natürlich vorkommende oder nicht in der Natur vorkommende Aminosäuren umfasst. Die Sequenz des Peptids kann so konstruiert werden, dass sie an beliebige gewünschte Anwendungen, wie z. B. der Wechselwirkung mit Antikörpern, Enzymreaktionen und dergleichen, angepasst ist.
- Das Polyamid kann eine oder mehrere, über eine derivatisierte Aminosäure, wie z. B. Lysin, an die Polyamidkette gebundene Reportergruppen enthalten. Reportergruppen können fluoreszierende Einheiten, chemolumineszierende Einheiten, paramagnetische Einheiten und dergleichen, Biotin und kolloidale Verbindungen, wie z. B. Ferritin oder kolloidales Silber oder Gold, sowie Enzyme sein. Reportergruppen können kovalent an eine oder mehrere Aminosäuren innerhalb des Polyamids, insbesondere über die freien Aminogruppen von Lysin, gebunden sein.
- Fluorophore Reportergruppen können aus folgenden ausgewählt werden: Fluorescein-5- isothiocyanat, Diacyl- (wie z. B. Isobutyryl-, Acetyl- oder Pivaloyl-) Fluorescein-5- und/ oder -6-carbonsäure-pentafluorphenylester, 6-(Diacyl-5- und/oder -6-carboxamidofluorescein)aminohexansäure-pentafluorphenylester, Texasrot (oder Texas Red, Handelsname von Molecular Probes, Inc.), Tetramethylrhodamin-5- (und -6-) isothiocyanat, Eosin-isothiocyanat, Erythrosin-5-isothiocyanat, 4-Chlor-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol, 4- Fluor-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazon, 3-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)methylaminopropionitril, 6-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)aminohexansäure, Succinimidyl-12-(Nmethyl-N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)aminododecanat, 7-Diethylamino-3-(4'-isothio-cyanatophenyl)-4-methylcumarin (CP), 7-Hydroxycumarin-4-essigsäure, 7-Methoxycumarin-4-essigsäure, 4-Acetamido-4'-isothiocyanatostilben-2,2'-disulfonsäure (SITS), 9- Chloracridin, Succinimidyl-3-(9-carbazol)-propionat, Succinimidyl-1-pyrenbutyrat, Succinimidyl-1-pyrennonanat, p-Nitrophenyl-1-pyrenbutyrat, 9-Anthracenpropionsäure, Succinimidylanthracen-9-propionat, 2-Anthracensulfonylchlorid; oder Fluorophor-Vorläufer, die nach geeigneter Behandlung fluoreszieren.
- Reportergruppen können gemäß herkömmlicher, allgemein bekannter Verfahren an die Polyamide gebunden werden. Beispielsweise können nukleophile Gruppen auf Polyamiden, wie z. B. primäre Aminogruppen, mit den fluoreszierenden oder enzymatischen Reportergruppen reagieren und eine Bindung dazwischen bilden. Andererseits können allgemein bekannte bifunktionelle Koppler (beispielsweise wie im Katalog der Pierce Chemical Company aus 1987 beschrieben) eingesetzt werden, um die Reportergruppen an die Polyamide zu binden.
- Biotin kann nach herkömmlichen Verfahren in das Polyamid eingebunden werden. Beispielsweise kann underivatisiertes Biotin unter Einsatz des BOP-Kopplungsverfahrens (B. Castro et al., Synthesis 1976, 751-752) in ein Polyamid eingebaut werden. Alternativ dazu kann Biotin als aktiver N-Hydroxysuccinimidyl-Ester eingeführt werden. Es kann beispielsweise auch unter Verwendung eines biotinylierten Aminosäure-Derivats eingebaut werden. Beispielsweise kann ein Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat zur Bindung an Biotin eingesetzt werden. Die alkalische Phosphatase kann mit einem geeigneten Substrat reagieren, um ein unlösliches Dipräzipitat zu bilden, das visuell nachweisbar ist.
- Enzymatische Reportergruppen können aus β-Galactosidase, Meerrettich-Peroxidase, Urease, alkalischer Phosphatase, Dhydrogenasen, Luciferase und Carboanhydrase ausgewählt werden. Im Allgemeinen reagieren Enzyme mit einem oder mehreren Substraten, um ein detektierbares Signal, wie z. B. eine Farbänderung, Lumineszenz oder Bildung eines Niederschlags, zu liefern.
- Die im Polyamid enthaltene Anzahl an Reportergruppen ist für die Erfindung nicht ausschlaggebend; beispielsweise können 1 bis 20 oder mehr Reportergruppen in das Polyamid eingebaut werden. Die Position der Reportergruppen innerhalb des Polyamids ist für die Erfindung nicht ausschlaggebend. Beispielsweise kann eine einzelne Reportergruppe am zur Alkin-Aminogruppe distalen terminalen Ende des Polyamids vorliegen. Alternativ dazu kann eine Reportergruppe proximal zur Alkin-Aminogruppe liegen. Als weiteres Beispiel können mehrere Reportergruppen über die Länge des Polyamids verteilt sein.
- Das Oligonucleotid Nu ist eine beliebige geeignete Nucleotidsequenz, in einer bevorzugten Ausführungsform entspricht sie jedoch der allgemeinen Formel:
- worin die Reste B unabhängig voneinander aus Adenyl, Guanyl, Thyminyl oder Cytosinyl ausgewählt sind und n = 1 bis etwa 400, noch bevorzugter 2 bis etwa 200, ist.
- Die Oligonucleotidsequenz Nu, die von der 5'-Hydroxylgruppe der Zuckerreste in den Formeln I und II weg verläuft, kann eine beliebige gewünschte Nucleotidsequenz und Zusammensetzung darstellen, die Hybridisierung an ein DNA- oder RNA-Target ermöglicht und weiters in der Lage ist, als Primer für DNA- oder RNA-Polymerase zu fungieren. Das Oligonucleotid kann aus Desoxyribonucleotiden, Ribonucleotiden oder einer Kombination aus Desoxy- und Ribonucleotiden bestehen. Das Oligonucleotid kann 1 bis 400 Nucleotide oder mehr, vorzugsweise 2 bis 200 Nucleotide, umfassen. Die Oligonucleotide können in geeigneter Weise modifiziert werden, um die Halbwertszeit in vivo ohne Herbeiführung von Hybridisierung zu verlängern. Beispielsweise kann das Oligonucleotid durch Ersetzen 1 oder mehrerer der nicht-überbrückenden Sauerstoffe an der Phosphor-Hauptkette durch Schwefel oder Amine gemäß den Verfahren von Argawal et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7079-7083 (1988)) oder Stein und Cohen (Cancer Res. 48, 2659-2688 (1988)) modifiziert werden. Derartig modifizierte Oligonucleotide liegen im Bereich des Begriffs "Oligonucleotid". Der Ausdruck "Oligonucleotid" kann auch ein einzelnes Nucleotid (Ribo- oder Desoxyribonucleotid) oder ein Polynucleotid aus Ribonucleotiden, Desoxyribonucleotiden oder Gemischen davon umfassen.
- Das allgemeine Verfahren zur Herstellung eines Nucleotid-Polymer-Konjugats der Formel (I)
- Nu-NUC-C C-X¹-NH-X²-X³ (I)
- worin die Substituenten wie zuvor beschrieben sind, inkludiert ein Verfahren, das Folgendes umfasst:
- (1) Bereitstellung einer Verbindung der Formel (III):
- worin NUC' eine Gruppe gemäß einer der Formeln:
- ist, X¹, X&sup5; und X&sup6; wie zuvor beschrieben sind und Pr¹ und Pr² Schutzgruppen sind, die gleich oder voneinander verschieden sein können;
- (2) Abspaltung der Schutzgruppe von der frei hängenden Aminogruppe durch Entfernung von Pr¹ in Verbindung (III) unter Bedingungen, unter denen Pr² auch entfernt wird, und anschließende Umsetzung der ungeschützten Verbindung mit einer Verbindung der Formel Pr³X²Rx, worin X² wie zuvor beschrieben ist, Pr³ eine Schutzgruppe ist und Rx eine Abgangsgruppe ist, um X² mit der frei hängenden Aminogruppe kovalent zu verbinden, was
- ergibt; in Fällen, wo die 5'-OH-Gruppe frei ist, wird diese Gruppe gegebenenfalls mit Pr², einer entfernbaren Schutzgruppe, die dieselbe wie oder eine andere als Pr² in Stufe (1) sein kann, erneut geschützt; und wenn X² eine Bindung ist, wird Stufe (2) ausgelassen;
- (3) Abspaltung der Schutzgruppe von der frei hängenden Aminogruppe durch Entfernung von Pr³ (oder Pr¹, wenn X² eine Bindung ist und Stufe (2) ausgelassen wird) in der Verbindung aus Stute (2) und Umsetzung mit einer/einem aktivierten Aminosäure oder Polyamid, um X³ zur Gänze oder teilweise einzuführen; wenn nur ein Teil von X³ eingeführt wurde, werden eine oder mehrere aktivierte Aminosäuren oder Polyamide einmal oder mehrmals unter Standard-Peptidsynthese-Bedingungen nacheinander hinzugefügt, um den Rest von X³ an die Verbindung zu addieren, um
- zu bilden;
- (4) Abspaltung der Schutzgruppe von der Zuckereinheit der Verbindung aus Stufe (3), wenn diese nicht schon zuvor abgespalten wurde, und Umsetzung der ungeschützten OH-Gruppe mit einem aktivierten Nucleotid oder Oligonucleotid, um eine 5'-3'-Bindung herzustellen, und anschließendes Hinzufügen einer oder mehrerer aktivierter Nucleotide, um eine Oligonucleotid-Kette zu bilden, um der Verbindung Nu hinzuzufügen; und
- (5) gegebenenfalls die Entfernung jeglicher verbliebener Schutzgruppen und gegebenenfalls das Abspalten der Verbindung von einer Festphasen-Matrix, wenn X&sup5; oder X&sup6; OR ist und R eine Festphasen-Matrix ist, um Verbindung (I) zu erhalten.
- Amino- und Hydroxygruppen auf Verbindungen der Formeln I und II können mit geeigneten Schutzgruppen, z. B. wie von Green (Protecting Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Inc. (1981)) beschrieben, geschützt werden. Beispielsweise können Hydroxy-Schutzgruppen aus Acyl, wie z. B. substituiertem oder unsubstituiertem Alkanoyl (z. B. Formyl, Acetyl, Propionyl, Butyryl, Isobutyryl, Valeryl, Bromacetyl, Dichloracetyl, Trifluoracetyl), substituiertem oder unsubstituiertern Aroyl (z. B. Benzoyl, Toluoyl, Xyloyl, Nitrobenzoyl, Brombenzoyl, Salicyloyl), Arylalkyl (z. B. Benzyl), Methyl, Methoxy, Methylthiomethyl, 2-Methoxyethoxymethyl, Bis(2-chlorethoxy)methyl, Tetrahydropyranyl, Tetrahydrothiopyranyl, 4-Methoxytetrahydropyranyl, 4-Methoxytetrahydrothiopyranyl, Tetrahydrofuranyl, Tetrahydrothiofuranyl, 1-Ethoxyethyl, 1-Methyl-1-methoxyethyl- 2-(phenylselenyl)ethyl, t-Butyl, Allyl, Benzyl, o-Nitrobenzyl, Triphenylmethyl, α-Naphthyldiphenylmethyl, p-Methoxyphenyldiphenylmethyl, 9-(9-Phenyl-10-oxo)anthryl (Tritylon), Dimethoxytrityl oder Pixyl, Trimethylsilyl, Isopropyldimethylsilyl, t-Butyldimethylsilyl, Triisopropylsilyl, ausgewählt werden. Amino-Schutzgruppen können aus Acyl, insbesondere organischem Acyl, z. B. substituiertem oder unsubstituiertem aliphatischem Hydrocarbonoxycarbonyl, wie z. B. Alkoxycarbonyl (z. B. Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Propoxycarbonyl, Butoxycarbonyl, t-Butyloxycarbonyl, 5-Pentoxycarbonyl); Haloalkoxycarbonyl (z. B. Chlormethoxycarbonyl, Tribromethoxycarbonyl, Trichlorethoxycarbonyl); Alkan- oder Aren-sulfonylalkoxycarbonyl (z. B. 2-(Mesyl)ethoxycarbonyl, 2-(p-Toluolsulfonyl)ethoxycarbonyl); Alkylthio- oder Arylthioalkoxycarbonyl (z. B. 2-(Ethylthio)ethoxycarbonyl, 2-(p-Tolylthio)ethoxycarbonyl); substituiertem oder unsubstituiertem Alkanoyl, wie z. B. halogeniertem Niederalkanoyl (z. B. Formyl, Trifluoracetyl); Monozyklus- oder kondensiertem Zyklus-Alizyklus-oxycarbonyl (z. B. Cyclohexyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl); substituiertem oder unsubstituiertem Alkenyloxycarbonyl (z. B. Allyloxycarbonyl); substituiertem oder unsubstituiertem Alkinyloxycarbonyl (z. B. 1,1-Dimethylpropargyloxycarbonyl); substituiertem oder unsubstituiertem Aryloxycarbonyl (z. B. fhenoxycarbonyl, p-Methylphenoxycarbonyl); substituiertem oder unsubstituiertem Aralkoxycarbonyl (z. B. Benzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Phenylazobenzyloxycarbonyl, p-(p-Methoxyphenylazo)-benzyloxycarbonyl, p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, α- Naphthylmethoxycarbonyl, p-Biphenylisopropoxycarbonyl, Fluorenylmethoxycarbonyl); substituiertem oder unsubstituiertem Arensulfonyl (z. B. Benzolsulfonyl, p-Toluolsulfonyl); substituiertem oder unsubstituiertem Dialkylphosphoryl (z. B. Dimethylphosphoryl); substituiertem oder unsubstituiertem Diaralkylphosphoryl (z. B. O,O-Dibenzylphosphoryl); substituiertem oder unsubstituiertem Aryloxyalkanoyl (z. B. Phenoxyacetyl, p-Chlorphenoxyacetyl, 2-Nitrophenoxyacetyl, 2-Methyl-2-(2-nitrophenoxy)propionyl); substituiertem oder unsubstituiertem Aryl, wie z. B. Phenyl, Tolyl; oder substituiertem oder unsubstituiertem Aralkyl, wie z. B. Benzyl, Diphenylmethyl, Trityl oder Nitrobenzyl ausgewählt werden.
- Besonders bevorzugte Schutzgruppen sind 4,4'-Dimethoxytrityl, Fmoc, BOC und Pixyl.
- Die obigen Schutzgruppen können Pr¹ (oder Pr³) umfassen, worauf hierin später Bezug genommen wird. Die obigen Schutzgruppen können auch zum Schützen von X&sup5; oder X&sup6; eingesetzt werden.
- Verbindungen der Formeln I und II können zur Extension einer Templat-Nucleotidsequenz unter Verwendung von DNA-Polymerase wie etwa des Klenow-Fragments oder von RNA-Polymerase (wie z. B. SP6- oder T7-Polymerase) herangezogen werden. Insbesondere - ohne jedoch die vorliegende Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken - können die Verbindungen der Formeln I und II in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt werden, wobei die Nucleotidsequenz der Gruppe Nu so gewählt wird, dass sie zu einem Teil einer Target-Sequenz komplementär ist. Annelieren ausgewählter Oligonucleotid-"Primer" an komplementäre Sequenzen auf den gegenüberliegenden Strängen von Target-DNA bei niedrigen Temperaturen, gefolgt von Extension in 3'-Richtung mittels einer thermostabilen Polymerase führt zur Gen-Amplifikation. Die Amplifikationsprodukte sind aufgrund der im Polyamid-Rest enthaltenen Reportergruppen leicht zu detektieren. Beispielsweise können fluoreszierende Reportergruppen durch Bestrahlen der Amplifikationsprodukte mit einer Lichtquelle innerhalb der Anregungsfrequenz des Fluorophors detektiert werden. Biotin enthaltende Reportergruppen können durch Reaktion mit Avidin detektiert werden.
- Verbindungen der vorliegenden Erfindung können über die Gruppen X&sup5; oder X&sup6; an eine Trägermatrix gebunden werden. Die Trägermatrix kann beispielsweise aus Glas mit gesteuerter Porengröße, wie z. B. Aminopropyl-Glas mit gesteuerter Porengröße (AP-CPG), oder aus Polystyrolharzen ausgewählt werden.
- Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung der hierin beschriebenen Schutzgruppen vollkommen geschützt und an eine Trägermatrix gebunden, in geschützter Form, aber nicht an eine Trägermatrix gebunden, oder aber in vollkommen ungeschützter Form vorliegen.
- Verbindungen der Formel II:
- worin X², X³, X&sup5;, X&sup6; und Nu wie zuvor definiert sind, können allgemein folgendermaßen hergestellt werden:
- (1) Bereitstellung einer Verbindung der Formel (IIIa):
- worin X&sup5; und X&sup6; wie zuvor beschrieben sind und Pr¹ und Pr² Schutzgruppen sind, die gleich oder voneinander verschieden sein können;
- (2) Abspaltung der Schutzgruppe von δer frei hängenden Aminogruppe durch Entfernung von Pr¹ in Verbindung (IIIa) unter Bedingungen, unter denen Pr² auch entfernt wird, und anschließende Umsetzung der ungeschützten Verbindung mit einer Aminosäure der Formel Pr³X²Rx, worin X² wie zuvor beschrieben ist, Pr³ eine Schutzgruppe ist und Rx eine Abgangsgruppe ist, um X² mit der frei hängenden Aminogruppe kovalent zu verbinden; in Fällen, wo die 5'-OH-Gruppe frei ist, wird diese Gruppe gegebenenfalls mit einer entfernbaren Schutzgruppe, die dieselbe wie oder eine andere als Pr² in Stufe (1) sein kann, erneut geschützt; oder wenn X² eine Bindung ist, wird Stufe (2) ausgelassen;
- (3) Abspaltung der Schutzgruppe von der frei hängenden Aminogruppe durch Entfernung von Pr³ (oder Pr¹, wenn X² eine Bindung ist) in der Verbindung aus Stufe (2) und Umsetzung mit einer/einem aktivierten Aminosäure oder Polyamid, um X³ zur Gänze oder teilweise einzuführen; wenn nur ein Teil von X³ eingeführt wurde, werden eine oder mehrere aktivierte Aminosäuren oder Polyamide einmal oder mehrmals unter Standard-Peptidsynthese-Bedingungen nacheinander hinzugefügt, um den Rest von X³ an die Verbindung zu addieren;
- (4) Abspaltung der Schutzgruppe von der 5'-OH-Gruppe der Zuckereinheit der Verbindung aus Stufe (3), wenn diese nicht schon zuvor abgespalten wurde, und Umsetzung der ungeschützten OH-Gruppe mit einem aktivierten Nucleotid oder Oligonucleotid, um eine 5'-3'-Bindung herzustellen, und anschließendes Hinzufügen einer oder mehrerer aktivierter Nucleotide, um eine Oligonucleotid-Kette zu bilden, um der Verbindung Nu hinzuzufügen; und
- (5) gegebenenfalls die Entfernung jeglicher verbliebener Schutzgruppen und gegebenenfalls das Abspalten der Verbindung von einer Festphasen-Matrix, wenn X&sup5; oder X&sup6; OR ist und R eine Festphasen-Matrix ist, um Verbindung (II) zu erhalten.
- Bei der Synthese von Verbindungen der Formel I und II, worin X² eine Bindung ist, umfasst Stute (2) die Abspaltung der Schutzgruppe von der frei hängenden Aminogruppe (gegebenenfalls unter Abspaltung der Schutzgruppe von der 5'-OH-Gruppe) und die Umsetzung der ungeschützten Aminogruppe mit X² und anschließend mit X³ (wie zuvor beschrieben), die jeweils ein(e) aktivierte(s) Aminosäure oder Peptid sein können, um die Aminosäure mit der frei hängenden Aminogruppe zu verbinden - ohne Addition an die geschützte oder ungeschützte 5'-OH-Gruppe von Verbindungen der Formel (III); wenn dabei die 5'-OH-Gruppe von Verbindungen der Formel (III) frei ist, wird diese Gruppe gegebenenfalls mit einer entfernbaren Schutzgruppe erneut geschützt.
- Polyamide X³ können beispielsweise mittels Anwendung von Verfahren unter Einsatz von Festphasen-Fmoc (Atherton, R. und Sheppard, R. C. (1985) J. Chem. Soc. Commun., S. 165-166) oder Festphasen-Boc (G. Barany und R. B. Merrifield, "Solid-Phase Peptide Synthesis" in "The Peptides", Bd. 2, E. Gross & J. Meienhofer (Hrsg.), Academic Press, New York, S. 1-284 (1980)) synthetisiert werden. In diesen Verfahren werden die Aminosäuren mit allgemein bekannten Standard-Schutzgruppen (siehe z. B. Green, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, Inc. (1981); Atherton und Sheppard, J. Chem. Soc. Commun. 1985, 165-166; Barany und Merrifield, s.o.) geschützt, um reaktive Gruppen zu schützen.
- Oligonucleotide Nu können nach dem Phosphotriester-Festphasen-Verfahren (Sproat und Gait, "Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach", S. 83-116, IRL Press, Oxford (1984)), dem H-Phosphonat-Festphasen-Verfahren (Froehler et al., Nucleic Acids Research 14, 5399-5407 (1986)) oder dem Phosphoramidit-Festphasen-Verfahren (Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Lett. 22, 1859-1862 (1981)) synthetisiert werden. Bei allen diesen Verfahren können reaktive Gruppen, wie z. B. Hydroxy- oder Aminogruppen, mit Hydroxy- oder Amino-Standartschutzgruppen geschützt werden, wie z. B. von Green (Protecting Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Inc. (1981)); S. L. Beaucage und M. H. Caruthers (Tetrahedron Lett. 22, 1859-1862 (1981)); S. Sproat und M. J. Gait ("Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach", S. 83-116, IRL Press, Oxford (1984)) beschrieben.
- Vorzugsweise ist eine der Gruppen X&sup5; oder X&sup6; von Verbindungen der Formel III an eine Festphasen-Matrix gebunden. Noch bevorzugter ist die Gruppe X&sup6; an eine Festphasen- Matrix gebunden. Die Matrix kann aktiviert sein und geeignete reaktive Gruppen enthalten, wie zuvor beschrieben wurde.
- Eine oder mehrere Reportergruppen können in mehreren unterschiedlichen Stufen in das Polyamid eingeführt werden. Die Reportergruppe kann in den Aminosäuren vor der Polyamid-Synthese enthalten sein (Stufe 3); nach der Polyamid-Synthese eingeführt werden (Stufe 4); nach der Oligonucleotid-Synthese eingeführt werden (Stufe 5); oder nach der Abspaltung der Schutzgruppen und Reinigung des Oligonucleotid-Polyamid-Konjugats eingeführt werden. Das jeweils gewählte Verfahren hängt von der Wahl der Reportergruppen und dem Syntheseverfahren ab.
- Wenn die Reportergruppe sowohl unter den Bedingungen der Peptid-Synthese als auch unter jenen der Oligonucleotid-Synthese stabil ist, kann sie vom Beginn der Polyamid- Synthese an als derivatisierte Aminosäure enthalten sein. Wenn die unter den Bedingungen von DNA-Synthese, nicht aber unter jenen von Peptid-Synthese stabil ist, kann sie nach der Synthese des Polyamids eingebaut werden. Wenn die Reportergruppe weder während der Peptid- noch während der Oligonucleotid-Kettenassemblierung stabil ist, aber gegenüber Schutzgruppen-Entfernungsverfahren stabil ist, kann sie nach der Assemblierung der Oligonucleotid-Kette des vollkommen geschützten Polyamid-Oligonucleotid-Konjugats eingebaut werden. Wenn die Markierung unter keinerlei der zur Synthese der Verbindungen der vorliegenden Erfindung eingesetzten Bedingungen stabil ist, kann sie in einer Lösungsphasen-Reaktion mit dem vollkommen ungeschützten Polyamid-Oligonucleotid-Konjugat eingeführt werden.
- Fluorophore können in beliebigen der Stufen (3) bis (6) in das Polyamid-Oligonucleotid- Konjugat eingeführt werden. Dasselbe gilt auch für Biotin.
- Enzyme und kolloidale Verbindungen, wie z. B. kolloidales Gold, kolloidales Silber, Ferritin oder Biotin können in den Stufen (3) bis (6) eingeführt werden.
- Der Polyamid-Anteil des Polyamid-Oligonucleotid-Konjugats kann mehrere Reportergruppen enthalten, die das erzeugte detektierbare Signal verstärken und somit die Detektion erleichtern.
- Der Polyamid-Anteil des Konjugats fungiert nicht nur als Vehikel zur Anbindung einer Reportergruppe, sondern kann auch als Adressierungsmarker zum Abzielen eines Polyamids auf eine bestimmte Zelltype oder Zellposition dienen oder die Passage eines Oligonucleotids durch eine Zellmembran erleichtern. Die Adressierungsmarker-Aktivität von Peptidsequenzen ist gut erforscht (Verner und Schatz, Science 241, 1307-1313 (1988); Goldfarb et al., Nature 322, 641-644 (1986)). Durch die Wahl einer Peptidsequenz, die beispielsweise von einem Zelloberflächen-Rezeptor erkannt wird, können mit dieser Peptidsequenz konjugierte Oligonucleotide in bestimmte Zelltypen transportiert werden, wo sie eine biologische Wirkung zeigen können, wie z. B. im Fall von Antisense-Oligonucleotiden, die die Transkription viraler oder zellulärer RNA blockieren.
- In einem besonders bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung der Formel (IIIa):
- worin Pr¹, Pr², X&sup5; und X&sup6; wie zuvor beschrieben sind, über die Hydroxylgruppe an einen festen Träger gebunden (d. h. X&sup6; = OR, und R ist eine Festphasen-Matrix); eine Spacer der Formel Pr³HNX²CORx oder eine Aminosäure wird an die ungeschützte frei hängende Aminogruppe wie zuvor beschrieben gebunden, gefolgt von der Anbringung einer Polyamid-Kette durch aufeinander folgendes Hinzufügen einer oder mehrerer Aminosäuren gemäß herkömmlicher Peptidsynthese-Verfahren.
- Anschließend wird eine Oligonucleotid-Kette an die ungeschützte 5'-Hydroxygruppe der Verbindungen der Formel IV gebunden. Die jeweiligen Schutzgruppen Pr¹, Pr² und Pr³ können dieselben oder voneinander verschieden sein, wie zuvor bereits erwähnt.
- Fig. 1 zeigt dabei PAGE von am 5'-Ende markierten Oligonucleotiden. Die Spuren A und C zeigen normale Oligonucleotide und Spur B das 23-Mer-Konjugat, das ein Ahx- Lys(Biotin)-Ala-Peptid enthält.
- Fig. 2 zeigt eine Skizze (Schema I) der Herstellung von Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung.
- Fig. 3 zeigt eine detaillierte Anleitung (Schema II) zur Herstellung der Reaktanden in Fig. 2.
- Fig. 4 zeigt den ersten Teil einer detaillierten Anleitung (Schema III) zur Herstellung bevorzugter Verbindungen der vorliegenden Erfindung.
- Fig. 5 zeigt den zweiten Teil der detaillierteren Anleitung in Schema III als Fortsetzung von Fig. 4.
- Fig. 6 zeigt weitere Anleitungen zur Herstellung der zur Peptidsynthese verwendeten markierten Aminosäuren gemäß vorliegender Erfindung.
- In der Folge werden spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung anhand der folgenden nichteinschränkenden Beispiele beschrieben. Die hergestellten Verbindungen werden häufig mit den Bezugszahlen bezeichnet, die in den Fig. 2 bis 6 der Zeichnungen verwendet werden.
- Materialien: 3-Aminopropin, 5-Iod-2'-desoxyuridin, Biotin und 3-Aminopropyltriethoxysilan wuren von Sigma erstanden. N-(Fluoren-9-ylmethoxy-carbonyloxy)succinimid, Nα- Fmoc-L-Lysin, Pentafluorphenol, DCC und Fmoc-Ala-OPfp wurden von Auspep, Melbourne, Australien, erhalten. 3-Nitropyridin-2-sulfenylchlorid wurde von Kokusan, Tokyo, Japan, erhalten. 9-Chlor-9-phenylxanthen und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) wurden von Aldrich geliefert. N-Hydroxysuccinimid wurde von Pierce erhalten. Triethylamin (Reinheit: "puriss."), Controlled Pore Glass (200-400 Mesh, Porengröße: 500 Å, Kat.-Nr. 27720) und Diisopropylcarbodiimid (DIC) wurden von Fluka erstanden. Die Reagentien für den Ninhydrin-Test wurden von Applied Biosystems geliefert. DMF wurde unter reduziertem Druck destilliert und innerhalb von 14 Tagen verbraucht. Pyridin wurde über CaH&sub2; bei Atmosphärendruck destilliert und über 5 Å-Molekularsieben gelagert. Alle anderen Reagentien wurden ohne weitere Reinigung eingesetzt. Dünnschicht-Chromatographie erfolgte auf Kieselgel (Merck; SAMMELGEFÄSS-60, 230-240 Mesh). Biotin-N-hydroxysuccinimidylester wurde wie bereits früher beschrieben¹ hergestellt, außer dass 95% Ethanol/1% Essigsäure/4% H&sub2;O als Lösungsmittel zur Umkristallisation eingesetzt wurden. N-Fmoc-εAhx-OPfp² und N-Boc-3-aminopropin³ wurden nach literaturbekannten Verfahren hergestellt.
- Die Schmelzpunkte wurden auf einem Electrothermal-Gerät gemessen und sind unkorrigiert. NMR-Spektren wurden auf einem JEOL GX-400 Spetrometer, das mit 399,9 MHz für die ¹H-Spektren und für die ¹³C-Messungen mit 99,98 MHz betrieben wurde. DEPT- Experimente erfolgten mit einem ¹H-Selektionsimpuls in einem Winkel 135º. Das DQFCOSY-Experiment wurde im Phasenempfindlichkeits-Modus der Datenaufnahme mit einer 356 · 2K Datenmatrix und 16 Zwischenstufen pro Inkrement laufen gelassen. Das Spektrum wurde nach Nullanpassung an eine 1K · 1K Enddatenmatrix und Anwendung einer exponentiellen Gewichtungsfuktion in beiden Richtungen erhalten. Das HMBC- Experiment wurde im Absolutabsorptions-Modus mit einer 128 · 2K Rohdatenmatrix und 128 Zwischenstufen pro Inkrement laufen gelassen. Das Spektrum wurde nach viermaliger Nullanpassung in der t&sub1;-Dimension und Anwendung einer Sinus-Glocken-Kurven-Gewichtungsfunktion in beiden Richtungen erhalten. Das Experiment wurde unter Annahme eines ²¹C-H-Werts von 8 Hz laufen gelassen. Das für die Nucleoside 3 und 4 verwendete Nummerierungssystem ist in Schema I angeführt, während das für die Verbindungen 22 und 23 verwendete Nummerierungssystem wie in Schema IV angegeben ist. IR-Spektren wurden auf einem Perkin Elmer FT-IR der 1600 Serie unter Verwendung von KBr-Presslingen aufgenommen. UV-Spektren wurden mittels in 0,1 mM EDTA-Lösungen gelöster Proben auf einem Varian Cary 1-Spektralphotometer aufgenommen. Aminosäure-Analysen erfolgten auf einem Beckman System 6300-Aminosäure-Analyzer. HPLC-Analysen erfolgten auf einem Shimadzu LC4A-Gerät unter Verwendung einer Phenomex-RP-C&sub1;&sub8;-Säule (5 ODS 30,5 um, Porengröße: 60 Å), wobei Puffer A 0,1 M Triethylammoniumacetat (pH 7,0) und Puffer B 0,1 M Triethylammoniumacetat mit 30% CH&sub3;CN (pH 7,0) waren.
- Elementaranalysen wurden von CMAS Pty. Ltd., Melbourne, Australien, erhalten. Hoch- und niedrigauflösende FAB-Massenspektren wurden auf einem JEOL DX-300-Gerät bzw. einem JEOL AX-505H-Gerät mit FAB-Quellen aufgenommen. Die Proben für die hochauflösenden Messungen wurden in einer Polyethylenglykol (600)/Thioglycerin/Glycerin/ DMSO-Matrix suspendiert; die niedrigauflösenden Proben in einer Thioglycerin-Matrix. Das Ionisierungsgas war in beiden Fällen Xe.
- 3-Aminopropin (359 ul, 5,25 mMol) wurde zu einer Lösung von 3-(Fluoren-9-ylmethoxycarbonyloxy)succinimid (FmocNHS) (1,69 g, 5,00 mMol) in THF (8 ml) bei 0ºC zugetropft und 2 h lang gerührt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der rohe Rückstand wurde in Ethylacetat (100 ml) gelöst und die Lösung mit H&sub2;O (3 · 30 ml) gewaschen und anschließend getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;). Umkristallisation aus Ethylacetat ergab 9 als farblose Nadeln (1,11 g, 80%); Fp.: 129-130ºC.
- ¹H NMR (d&sub6;-DMSO): δ 3.13 (t, 1H, H1, J = 2.3 Hz), 3.80 (dd, 2H, H3, J = 5.9, 2.5 Hz), 4.23 (t, 1H, Fmoc CH, J = 6.8 Hz), 4.33 (d, 2H, Fmoc CH&sub2;, J = 7.1 Hz), 7.33 (ddd, 2H, Fmoc H2 und H7, J = 7.6, 7.5, 1.2 Hz), 7.41 (ddd, 2H, Fmoc H3 and H6, J = 7.6, 7.5, 0.9 Hz), 7.71 (d, 2H, Fmoc H2 und H8, J = 7.6 Hz), 7.81, (t, 1H, NH, J = 5.9 Hz), 7.90 (d, 2H, Fmoc H4 und H5, J = 7.6 Hz). ¹³C NMR (d&sub6;-DMSO): δ 29.8 (C3), 46.6 (Fmoc CH, 65.7 (Fmoc CH&sub2;), 73.1 (C1), 81.4 (C2), 120.1 (Fmoc C3 und C6), 125.2 (Fmoc C2 und C7), 127.1 (Fmoc C4 und C5), 127.6 (Fmoc C1 und C8), 140.7 (C4a und C4b), 143.8 (Fmoc C8a und C9a), 155.9 (Fmoc CO). FABMS m/z 300 (M + Na), 278 (M + H).
- Analyse für C&sub1;&sub8;H&sub1;&sub5;NO&sub2;
- Ber.: C 78,0; H 5,45; N 5,05.
- Gef.: C 78,1; H 5,45; N 5,01.
- Zu einer gerührten Lösung von 3-Aminopropin (855 ul, 12,5 mMol) in DMF (20 ml) wurde 3-Nitropyridin-2-sulfenylchlorid (0,94 g, 5,0 mMol) in zwei gleich großen Portionen innerhalb von 0,5 h zugesetzt. Nach 1,5 h wurde das Reaktionsgemisch in Ethylacetat (500 ml) gegossen und mit H&sub2;O (3 · 200 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Umkristallisation aus MeOH/H&sub2;O ergab 10 als rote Kristalle (0,653 g, 62%); Fp.: 107-9ºC.
- ¹H NMR (d&sub6;-DMSO): δ 3.18 (t, 1H, H1, J = 2.6 Hz), 3.77 (dd, 2H, H3, J = 4.4, 2.6 Hz), 5.34 (t, 1H, NH, J = 4.4 Hz), 7.47 (dd, 1H, NPYS H5, J = 8.3, 4.6 Hz), 8.61 (dd, 1H, NPYS H6, J = 8.4, 1.5 Hz), 8.90 (dd, 1H, NPYS H4, J = 4.4, 1.5 Hz). ¹³C NMR (d&sub6;-DMSO): δ 30.7 (C3), 74.8 (C1), 81.7 (C2), 120.4 (NPYS C5), 134.3 (NPYS C4), 139.8 (NPYS C3), 154.1 (NPYS C6), 163.1 (NPYS C2). FABMS m/z 210 (M + H).
- Analyse für C&sub8;H&sub7;N&sub3;O&sub2;S
- Ber.: C 45,9; H 3,37; N 20,1.
- Gef.: C 45,7; H 3,33; N 20,1.
- Zu einer gerührten Lösung von 3-Aminopropin (8,6 ml, 125 mMol) in DMF (100 ml) wurde 9-Chlor-9-phenylxanthen (14,7 g, 50 mMol) in zwei gleich großen Portionen innerhalb von 0,5 h zugesetzt. Nach 3 h wurde MeOH (20 ml) zugesetzt und das Reaktionsgemisch 15 min lang gerührt. Das Gemisch wurde anschließend in Diethylether (500 ml) extrahiert und mit H&sub2;O (3 · 300 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das resultierende gelbe Öl wurde im Hochvakuum getrocknet (4 h) und danach in heißem Diethylether (70 ml) erneut gelöst. Die Lösung wurde 24 h lang auf -20ºC gehalten, danach filtriert und der Feststoff mit eiskaltem Hexan (2 · 50 ml), gefolgt von eiskaltem Diethylether (2 · 50 ml) gewaschen, was 12 als farbloses Pulver ergab (12,7 g, 82%); Fp.: 116-8ºC.
- ¹H NMR (d&sub6;-DMSO): δ 2.86 (dd, 2H, 3H, J = 7.3, 4.4 Hz), 2.99 (t, 1H, H1, J = 2.4 Hz), 4.01 (t, 1H, NH, J = 7.2 Hz), 6.98-7.50 (m, 13H, Px CH). ¹³C NMR (d&sub6;-DMSO): δ 32.8 (C3), 59.7 (Px C9), 73.4 (C1), 82.7 (02), 1160.0 und 123.5 (Px CH), 125.0 (Px C8a und C9a), 126.3, 126.4, 128.0, 128.6, 128.7 (Px CH), 149.5 (Px Cl'), 150.7 (Px C4a und C10a). FABMS m/z 311 (M+).
- Analyse für C&sub2;&sub2;H&sub1;&sub7;NO
- Ber.: C 84,8; H 5,51; N 4,50.
- Gef.: C 84,4; H 5,73; N 4,30.
- 5-Iod-2'-desoxyuridin (IDU) (3,54 g, 10 mMol) wurde zusammen mit trockenem Pyridin (3 · 20 ml) coevaporiert. Das IDU wurde in trockenem Pyridin (15 ml) erneut gelöst, und 9-Phenyl-9-chlorxanthen (3,82 g, 13 mMol) wurde der gerührten Lösung in zwei gleich großen Portionen innerhalb von 0,5 h zugesetzt. Das Lösungsmittel wurde anschließend im Vakuum entfernt und der Rückstand aus einer Lösung von 1% Et&sub3;N in Ethylacetat umkristallisiert, was 7 als farblose Kristalle ergab (4,27 g, 70%); Fp.: 200- 2ºC.
- ¹H NMR (d&sub6;-DMSO): δ 2.20 (m, 2H, H2'), 2.99 (dd, 1H, H5', J = 10.5, 4.2 Hz), 3.10 (dd, 1H, H5", J = 10.5, 2.7 Hz), 3.85 (m, 1H, H4'), 4.15 (m, 1H, H3'), 5.29 (d, 1H, 3'OH, J = 4.2 Hz), 6.08 (t, 1H, H1', J = 7.0 Hz), 7.10-7.42 (m, 13H, Px CH), 8.08 (s, 1H, H6). ¹³C NMR (d&sub6;-DMSO): δ 40.4 (C2'), 63.8 (C5'), 69.9 (C5), 71.0 (C3'), 75.6 (Px C9), 85.2 (C1'), 85.9 (C4'), 116.3, 116.4 (Px CH), 122.3, 122.4 (Px C8a und C9a), 123.8, 124.0, 125.8, 126.8, 128.2, 129.3, 129.69, 129.7, 129.73 (Px CH), 143.9 (C6), 148.4 (Px C1'), 150.0 (C2), 150.51, 150.58 (Px C4a und C10a), 160.6 (C4). FABMS m/z 633 (M + Na&spplus;).
- Analyse für C&sub2;&sub8;H&sub2;&sub3;N&sub2;P&sub6;I
- Ber.: C 55,1; H 3,81; N 4,59.
- Gef.: C 55,0; H 3,81; N 4,54.
- Zu einer entgasten (Ar) Lösung von 11 (1,22 g, 2,00 mMol) in DMF (6 ml) wurden nacheinander Cul (0,076 g, 0,40 mMol), Et&sub3;N (558 ul, 4,00 mMol), 3-tert-Butyloxycarbonylamidopropin¹¹ (0,932 g, 6,00 mMol) und (Ph&sub3;P)&sub4;Pd&sup0; (0,232 g, 0,20 mMol) zugesetzt und die Lösung 5 h lang gerührt. AG1X8(HCO&sub3;&supmin;)-Ionenaustauschharz (6 Moläquiv.) wurde zusammen mit MeOH (10 ml) und CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) zugesetzt und das Gemisch 30 min lang gerührt. Das Harz wurde abfiltriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Der rohe Rückstand wurde in Ethylacetat (200 ml) gelöst, die Lösung wurde mit H&sub2;O (3 · 100 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und filtriert. Nach Entfernung des Lösungsmittels ergab Kieselgel-Flashchromatographie (70 g Kieselgel, 0-10% MeOH/CH&sub2;Cl&sub2;, gefolgt von Umkristallisation aus Chloroform/Diethylether 3 als farblose Kristalle (0,602 g, 47%); Fp.: 157-160ºC.
- ¹H NMR (d&sub6;DMSO): δ 1.35 (s, 9H, Boc CH&sub3;, 2.25 (m, 2H, H2'), 3.00 (dd, 1H, H5', J = 10.5, 4.4 Hz), 3.12 (dd, 1H, H5", J = 10.4, 2.6 Hz), 3.69 (m, 2H, H9), 3.91 (m, 1H, H4'), 4.15 (m, 1H, H3'), 5.30 (d, 1H, 3'OH, J = 4.2 Hz), 6.09 (5, 1H, H1', J = 6.7 Hz), 7.10-7.45 (m, 13H, Px CH), 7.96 (s, 1H, H6). ¹³C NMR (d6-DMSO): δ 28.2 (Boc CH&sub3;), 30.0 (C9), 40.3 (C2'), 63.8 (C5'), 70.8 (C3'), 73.8 (C8), 75.5 (Px C9), 78.2 (Boc C), 85.3 (C1'), 85.9 (C4'), 90.1 (C7, 98.4 (C5), 116.1, 116.3 (Px CH), 122.0 (Px C8a und C9a), 123.9, 124.0, 125.8, 126.7, 128.1, 129.0, 129.1, 129.7 (Px CH), 142.9 (C6), 148.3 (Px C2), 149.3 (C1'), 150.5, 150.7 (Px C4a und C10a), 155.1 (Boc CO), 161.6 (C4). FABMS m/z 660 (M + Na).
- Analyse für C&sub3;&sub6;H&sub3;&sub5;N&sub3;O
- Ber.: C 67,8; H 5,54; N 6,59.
- Gef.: C 67,7; H 5,68; N 6,54.
- Das Fmoc-Nucleosid 1 wurde auf analoge Weise hergestellt, es konnte jedoch aufgrund von anhaltenden Verunreinigungen mit Ausgangsnucleosid 7 nicht bis zu Analysenreinheit gereinigt werden.
- ¹³C NMR (CDCl&sub3;): δ 31.2 (C9), 41.8 (C2'), 46.9 (Fmoc C9), 60.3 (C5'), 63.4 (C8), 66.4 (Fmoc CH2), 72.4 (C3'), 74.3 (Px C9), 86.1 (C1'), 86.7 (C4'), 89.5 (C7), 99.4 (C5), 116.4 (Px CH), 119.8 (Fmoc C3 und C6), 122.1, 122.3 (Px C8a und C9a), 123.7, 123.8 (Px CH), 124.8 (Fmoc C2 und C7), 126.2 IPx CH), 126.85, 126.95 (Fmoc C4 und C5), 127.8 (Fmoc C1 und C8), 129.4, 129.6 (Px CH), 141.1 (Fmoc C4a und C4b), 143.2, 143.6 (Fmoc C8a und C9a), 143.7 (C6), 148.1 (C2), 149.4 (Px C1'), 151.06, 151.12 (Px C4a und C10a), 155.6 (Fmoc CO), 162.25 (C4).
- Das Verfahren war identisch mit jenem für 3, außer dass der rohe Rückstand erneut in CH&sub2;Cl&sub2; (200 ml) gelöst wurde. Die Lösung wurde mit 10% NaHCO&sub3; (2 · 100 ml) und H&sub2;O (1 · 100 ml) gewaschen. Nach dem Trocknen (Na&sub2;SO&sub4;) der Lösung, Filtrieren und Abdampfen des Lösungsmittels ergab Kieselgel-Flashchromatographie (0-5% MeOH/CH&sub2;Cl&sub2;, 1% Et&sub3;N) 4 als rehbraunen Feststoff (0,608 g, 76%). Diese Menge wurde aus MeOH bis zur Analysenreinheit umkristallisiert; Fp.: 156-8ºC (Zers.).
- ¹H NMR (d&sub6;-DMSO): δ 2.25 (m, 2H, H2'), 2.55 (dd, 1h, H9a, J = 16.3, 7.15 Hz), 2.66 (dd, 1H, H9b, J = 16.3, 7.14 Hz), 2.95 (dd, 1H, H5', J = 10.6, 3.67 Hz), 3.07 (dd, 1H, H5", J = 10.4, 2.38 Hz), 3.51 (t, 1H, N9H, J = 7.20 Hz), 3.9 (m, 1H, H4'), 4.21 (m, 1H, H3'), 5.31 (d, 1H, 3'OH, J = 4.03 Hz), 6.11 (t, 1H, H1', J = 6.78 Hz), 6.85-7.40 (m, 26H, NPx und OPx CH), 8.05 (s, 1H, H6), 11.6 (br s, 1H, H3). ¹³C NMR (d&sub6;-DMSO): δ 33.4 (C9), 40.8 (C2'), 59.6 (NPx C9), 63.6 (C5'), 70.9 (C3'), 74.6 (C8, 75.7 (OPX C9), 85.2 (C1'), 86.0 (C4'), 91.2 (C7), 115.86, 115.91, 116.21, 116.30 (NPx und OPx CH), 122.17 und 122.24 (OPx C8a und C9a), 123.50, 123.54, 123.92, 124.05 (NPx und OPx CH), 124.65, 124.68 (NPx C8a und C9a), 125.7, 126.3, 126.5, 127.8, 127.9, 128.46, 128.58, 128.68, 128.74, 128.98, 129.25, 129.64, 129.76 (NPx und OPx CH), 142.7 (C6), 148.1 (C2), 149.3 (NPx und OPx Cl'), 150.4, 150.61, 150.66, 150.75 (NPx und OPx C4a und C10a), 161.6 (C4). FABMS m/z 816 (M + Na), 794 (M + H).
- Genaue Masse mittels HR-FABMS: gef.: 794,2871; ber. für (C&sub5;&sub0;H&sub3;&sub9;N&sub3;O&sub7;) + H: 794,2868.
- Eine Lösung von Et&sub3;N (698 ul, 5,00 mMol) in DMF (70 ml) wurde zu einem Gemisch aus dem N-Hydroxysuccinimidylester von Biotin (3,41 g, 10,0 mMol) und Nα-Fmoc-Lysin 21 (1,84 g, 5,00 mMol) zugesetzt, und das resultierende Gemisch wurde 6 h lang gerührt und anschließend filtriert. Danach wurde kalte, wässrige HCl (pH 2, 500 ml) zugesetzt, der Niederschlag abfiltriert und mit wässriger HCl (pH 2, 3 · 200 ml) und H&sub2;O (3 · 200 ml) gewaschen. Im Rückstand wurde in dieser Stufe eine große Menge an Wasser festgestellt, weswegen er gefriergetrocknet (48 h) wurde, um einen flockigen, farblosen Feststoff zu ergeben (2,41 g, 81%); Fp.: 181-2ºC (Zers.).
- ¹H NMR (d&sub6;-DMSO): δ 1.20-1.40 (m, 4H, Btn Hγ und Lys Hδ), 1.50-1.52 (m, 6H Btn Hβ und Btn Hδ und Lys Hγ), 1.52- 1.62 (m, 2H, Lys Hβ), 2.03 (t, 2H, Btn Hα, J = 7.3 Hz), 2.56 (d, 1H, Bm H5b, J = 12.5 Hz), 2.79 (dd, 1H, Btn H5a, J = 12.4, 5.1 Hz), 3.00 (m, 2H, Lys Hε), 3.06 (m, 1H, Btn H2), 3.9 (m, 1H, Lys Hα), 4.1 (m, 1H, Btn H3), 4.18-4.30 (m, 4H, Btn H4 und Fmoc CH&sub2; und Fmoc H9), 6.36 (s, 1H Btn H1'), 6.42 (s, 1H, Btn H3'), 7.32 (ddd, 2H, Fmoc H2 und H7, J = 7.4, 7.4, 1.1 Hz), 7.41 (dd, 2H, Fmoc H3 und H6, J = 7.2, 7.2 Hz), 7.61 (d, 1H, Lys NαH, J = 8.1 Hz), 7.72 (d, 2H, Fmoc H1 und H8, J = 7.4 Hz), 7.76 (t, 1H, Lys N H, J = 5.6 Hz), 7.88 (d, 2H, Fmoc H4 und H5, J = 7.4 Hz). ¹³C NMR (d6-DMSO): d 23.1 (Lys Cγ), 25.3 (Btn Cβ), 28.0 (Btn Cδ), 28.2 (Btn Cγ), 28.8 (Lys Cδ), 30.5 (Lys Cβ), 35.2 (Btn Cα), 38.2 (Lys Cε), 39.9 IBtn C5), 46.7 (Fmoc C9), 53.8 (Lys Cα), 55.2 (Btn C2), 59.2 (Btn C4), 61.0 (Btn C3), 65.6 (Fmoc CH&sub2;), 120.1 (Fmoc C3 und C6), 125.3 (Fmoc C2 und Cy), 127.1 (Fmoc C4 und C5), 127.7 (Fmoc C1 und C8), 140.7 (Fmoc C4a und C4b), 143.79, 143.84 (Fmoc C8a und C9a), 156.2 (Fmoc OC), 162.7 (Btn C2'), 171.9 (Btn C10), 174.0 (Lys CO&sub2;H).
- Exakte Masse mittels HR-FABMS: gef.: 595,2566; ber. für (C&sub3;&sub1;H&sub3;&sub8;N&sub4;O&sub6;S) + H: 595,2590. IR 1702 cm&supmin;¹ (Fmoc CO und Lysin α CO), 1638 cm&supmin;¹ (Amid CO).
- Eine Lösung von Pentafluorphenol (1,75 g, 9,29 mMol) und DCC (1,27 g, 6,32 mMol) in DMF (5 ml) wurde zu einer Lösung von 22 (2,21 g, 3,72 mMol) in DMF (40 ml) zugesetzt und das Gemisch 16 h lang gerührt. Der farblose Niederschlag wurde abfiltriert und verworfen. Das Filtrat wurde behalten und nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum, gefolgt von Zerstoßen des Rückstands und Zusatz von Diethylether (4 · 100 ml) wurde ein farbloser Feststoff erhalten, der aus Ethylacetat/Ethanol/Essigsäure (80 : 19 : 1) umkristallisiert wurde, um feine, farblose Kristalle zu ergeben (1,90 g, 67%); Fp.: 162-5ºC (Zers.).
- ¹H NMR (d&sub6;-DMSO): δ 1.23-1.32 (m, 2H, Tbh Hγ), 1.38-1.53 (m, 6H, Btn Hβ rmd Btn Hδ und Lys Hδ), 154-163 (m, 2H, Lys Hβ), 2.04 (t, 2H, Btn Hα, J = 7.3 Hz), 2.55 (d, 1H, Btn H5b, J = 12.5 Hz), 2.79 (dd, 1H, Btn H5a, J = 12.5, 5.1 Hz), 2.98-3.04 (m, 2H, Lys Hε), 3.05-3.10 (m, 1H, Btn H2), 4.09 (m 1H, Lys αH), 4.20-4.30 (m, 2H. Btn H3 und Fmoc H9), 4.32-4.42 (m, 3H, Btn H4 t4nd Fmoc CH&sub2;), 6.35 (s, 1H, Btn H1'), 6.42 (s, 1H, Btn H3') 7.28-7.34 (m, 2H, Fmoc H2 egLd H7, 7.40 (dd, 2H, Fmoc H3 cmd H6, J = 7.5, 7.5 Hz), 7.70 (d, 2H, Fmoc H1 und H8, J = 7.3 Hz), 7.77 (5, 1H, Lys NεH, J = 5.7 Hz), 7.88 (d, 2H, Fmoc H4 und H5, J = 7.7 Hz), 8.12 (d, 1H Lys NαH, J = 7.3 Hz). ¹³C NMR (d&sub6;-DMSO): δ 22.7 (Lys Cγ), 25.3 (Btn Cβ), 28.1 (Btn Cδ), 28.3 (Btn Cγ), 28.7 (Lys Cδ), 29.9 (Lys Cβ), 35.3 (Btn Cα), 38.1 (Lys Cε), 39.9 (Btn C5), 46.7 (Fmoc C9), 53.9 (Lys Cα), 55.5 (Btn C2), 59.2 (Btn C4), 61.1 (Btn C3), 65.9 (Fmoc CH&sub2;), 120.2 (Fmoc C3 Lind C6), 125.2 (Fmoc C2 ind C7), 127.1 (Fmoc C4 und C5), 127.7 (Fmoc C1 qnd C8), 136.5, 138.5, 139.0 (2 · m, C - CF), 140.8 (Fmoc C4a und C4b), 142.0 (m, C - CF), 143.68, 143.71 (Fmoc C8a und C9a), 156.2 (Fmoc CO), 162.7 (Btn C2'), 169.2 (Lys CO), 171.9 (Btn C10).
- Exakte Masse mittels HR-FABMS: gef.: 761,2413; ber. für (C&sub3;&sub7;H&sub3;&sub7;N&sub4;O&sub6;SF&sub5;) + H: 761,2432. IR 1787 cm&supmin;¹ (Ester CO), 1702 cm&supmin;¹ (Fmoc CO), 1641 cm&supmin;¹ (Amid CO).
- Eine Lösung von 3-Aminopropyltriethoxysilan (3 g, 13,6 mMol) in Ethanol (60 ml) wurde zu CPG (200-400 Mesh; Porengröße: 500 Å, Kat.-Nr. 27720) 13 (6 g) zugesetzt, und das Gemisch wurde in regelmäßigen Abständen über einen Zeitraum von 6 h vorsichtig geschüttelt. Das Harz wurde durch Schwerkraftfiltration (ohne jegliches Waschen) filtriert, luftgetrocknet (24 h) und bei 110ºC (24 h) gehalten, um das aminierte Harz 14 zu ergeben. Die Amino-Beladung wurde mittles Ninhydrin-Test mit 129 uMol/g bestimmt. N-Fmoc-εAhx-OPfp (2,5 Moläquiv.) und HOBT (2,5 Moläquiv.) in DMF wurden in einer Glassintersäule an 14 gebunden (Doppelkupplung, 1,5 h pro Reaktion). Unter Einsatz von je 1,5 h langen Einzelkupplungen wurden zwei oder mehr Aminohexansäure-Reste angekuppelt, was Harz 15 ergab. Die Fmoc-Gruppe wurde durch Behandlung mit 20% Piperidin/DMF (5 min) abgespalten, das Harz mit DMF gewaschen und anschließend eine Lösung von Bernsteinsäureanhydrid (50 Moläquiv.) und DMP (10 Moläquiv.) im minimalen Volumen an trockenem Pyridin zugesetzt. Nach einstündigem Schütteln der Suspension wurde das Harz mit Pyridn, DMF und CH&sub2;Cl&sub2; gespült und im Vakuum getrocknet. Die Reaktion wurde mittels Ninhydrin-Test verfolgt, und die Beladung mit Carbonsäuregruppen wurde aus dem Verschwinden von Aminogruppen berechnet; sie betrug 46 uMol/g.
- Harz 16 wurde zweimal mit einer Lösung von 3 und 4 (5 Moläquiv.), Diisopropylcarbodiimid (5 Moläquiv.) und DMAP (0,5 Moläquiv.) im minimalen Volumen an trockenem Pyridin in zwei getrennten 16 h-Kupplungsreaktionen mit nur einer dazwischen vorgesehenem Waschung (Doppelkupplung). Nach der zweiten Kupplung wurde das Harz mit Pyridin gespült, und ein Pixyl-Test ergab eine Nucleosid-Beladung von 39 uMol/g. Die verbliebenen Carbonsäure- und Aminogruppen wurden mit Piperidin und Ac&sub2;O/DMAP nach dem Verfahren von Damha&sup4; verkappt, vvas die Harze 18 und 19 ergab.
- Im Falle von 18 wurde das Harz mit 90% TFA/Ethandiol 10 min lang behandelt, mit CH&sub2;Cl&sub2; gespült und anschließend mit 20% Et&sub3;N/CH&sub2;Cl&sub2; neutralisiert. Das Harz wurde danach mit CH&sub2;Cl&sub2; gespült, getrocknet und mit einem 1 : 1-Gemisch aus Fmoc-εAhx- OPfp/HOBT in DMF (2,5 Moläquiv., 45 min. zweimal) behandelt. Nach Spülung mit DMF wurde das Harz zwei aufeinander folgenden 16 h-Reaktionen mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (jeweils 50 Moläquiv.) im minimalen Volumen an trockenem Pyridin unterzogen, um Harz 20 zu ergeben. Der Trityl-Test erfgab 30 uMol/g an vorhandenen Dimethoxytrityl-Gruppen. Das Verfahren zur Derivatisierung von 19 zu 20 ist mit dem Verfahren für 18 identisch, außer dass 3% DCA/CH&sub2;Cl&sub2; anstelle von 90% TFA/Ethandiol verwendet wurde.
- Ein biotinylierter Lysin-Rest und ein Alanin-Rest wurden mittels Fmoc-Festphasen-Peptidsynthese unter Verwendung von 23 bzw. Nα-Fmoc-Ala-OPfp in einer manuellen Glassinter-Peptidsynthesezelle an 20 gebunden. Dabei wurden ein fünffacher Überschuss an Aminosäurepentafluorphenylester und HOBT sowie eine Kupplungszeit von 1 h und 20% Piperidin/DMF als Mittel zum Abspalten der Schutzgruppen eingesetzt. Die α- Aminogruppe von Alanin wurde von der Schutzgruppe befreit und mit Ac&sub2;O (25 ul) und DMAP (0,050 g) in trockenem Pyridin (0,5 h) verkappt. Nach einer Spülung mit DMF, CH&sub2;Cl&sub2; und Trockung im Vakuum wurde ein Teil des Harzes zur Oligonucleotid-Synthese auf einem Applied Biosystems 380A DNA-Synthesizer³ unter Verwendung von β- Cyanoethyl-geschützten Standard-Phosphoramiditen (mit einem 60 s Ac&sub2;O/DMAP-Verkappungsschritt²) im 1 uMol-Maßstab eingesetzt. Die Sequenz des synthetisierten Oligonucleotids lautete GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT* (worin T* der modifizierte Nucleosid-Linker ist). Das resultierende Konjugat wurde vom festen Träger durch Behandlung mit konzentriertem Ammoniak (22ºC, 6 h) abgespalten. Die resultierende Lösung des Konjugats wurde 24 h lang auf 50ºC erhitzt, um die Befreiung der Basen von den Schutzgruppen durchzuführen. Das Ammoniak wurde unter reduziertem Druck entfernt und das Konjugat in 0,1 mM EDTA (2 ml) erneut gelöst. Auftrennung mittels präparativer PAGE (16% Polyacrylamid-Gel)&sup5; lieferte zwei Produkte, wovon jenes mit der niedrigsten elektrophoretischen Mobilität gereinigt wurde, was 5 in einer Gesamtausbeute von 2,1% ergab.
- Eine Probe des Konjugats 5 wurde mit γ-[³²P]-ATP und T&sub4;-Polynucleotid-Kinase am 5'- Ende markiert&sup5; und erwies sich bei PAGE (16% Polyacrylamid-Gel) als homogen. Das UV-Spektrum zeigte ein Absorptionsmaximum bei 260 nm. Eine 3,0 nMol-Aliquote des Konjugats (Menge aus der UV-Absorption bei 260 nm berechnet) wurde auf ihren Aminosäure-Gehalt analysiert und zeigte das erwartete Verhältnis von 1,01 Mol Ala zu 0,99 Mol Lys. Die Menge an in der Probe gefundenem Peptid betrug 2,55 nMol. Eine 1 ug- Aliquote von 5 (in 20 ul H&sub2;O) wurde mit P&sub1;-Nuclease (5 ug in 5 ul 0,05 M NaOAc, pH 6,0) und 0,5 M NaOAc (pH 6,0, 2 ul) bei 37ºC 30 min lang inkubiert. Der resultierende enzymatische Verdau wurde mittel RP-C&sub1;&sub8;-HPLC unter Einsatz eines linearen Gradienten von 0-100% B innerhalb von 60 min analysiert. Das HPLC-Profil wurde manuell integriert und ergab folgende Nucleotid-Anteile: pdA (4,67), pdG (5,21), pdC (4,80), pdT (6,05), dG (1,27). Erwartete Anteile: pdA (5,00), pdG (5,00), pdC (5,00), pdT (6,00), dG (1,00).
- Dies ist eine modifizierte Version des ursprünglichen Tests&sup6;, für den eine Inkubationszeit von 7 min bei 100ºC angegeben wurden. Genau eingewogene Harz-Aliquoten wurden mit 76 Gew.-% Phenol/Ethanol (4 Tropfen aus einer Pasteur-Pipette), 0,0002 M Kaliumcyanid/Pyridin (8 Tropfen) und 0,28 M Ninhydrin/Ethanol (4 Tropfen) bei 1 10ºC 10 min lang behandelt. Nach Verdünnung mit 60% Ethanol (3,8 ml) wurde die Absorption bei 570 nm gemessen (ε = 15000 M&supmin;¹cm&supmin;¹).
- Genau eingewogene Harz-Allquoten wurden mit 10% Toluolsulfonsäure/Acetonitril (3 ml) bei Raumtemperatur 10 min lang behandelt. Die Absorption wurde bei 445 nm (ε = 4400 M&supmin;¹cm&supmin;¹) für Pixyl und bei 507 nm (ε = 66500 M&supmin;¹cm&supmin;¹) für Trityl gemessen.
- Genau eingewogene Harz-Allquoten wurden mit Piperidin (200 ul) und CH&sub2;Cl&sub2; (200 ul) bei Raumtemperatur 30 min lang behandelt. Nach Verdünnung mit CH&sub2;Cl&sub2; (3,6 ml) wurde die Absorption bei 301 nm (ε = 7800 M&supmin;¹cm&supmin;¹) gemessen.
- Die modifizierten Nucleoside 1, 3 und 4, die als Linker zwischen dem Oligonucleotid und dem Polyamid fungieren, wurden in drei Stufen, ausgehend von im Handel erhältlichem 5-Iod-2'-desoxyuridin (IDU) 6 (Schema II) synthetisiert. Die erste Stufe umfasste die Herstellung der vier verschiedenen N-geschützten Propargylamine 9 bis 12 durch Reaktion von 3-Aminopropin und N-(Fluoren-9-ylmethoxy-carbonyloxy)succinimid, 3-Nitropyridin-2-sulfenylchlorid (NPYSCI), Di-t-butyldicarbonat bzw. 9-Chlor-9-phenylxanthen. Im Falle des NPYS-Derivats 10 war für effiziente Reaktion die Gegenwart einer Base erforderlich. Es zeigte sich, dass Triethylamin eine rasche nukleophile Substitution des NPYSCI unter Bildung des quaternären Ammoniumsalzes [(Et&sub3;N)S(C&sub5;H&sub3;NO&sub2;)] + Cl&supmin; bewirkt, so dass ein 2,5facher molarer Überschuss an 3-Aminopropin eingesetzt wurde, um ebenfalls als Base zu fungieren. Alle vier geschützten Propargylamine wurden in hoher Ausbeute synthetisiert.
- Die Synthese der gewünschten Alkinylnucleoside wurde auf zwei Wegen versucht: Bindung eines geschützten Propargylamins an das C5 von IDU, gefolgt vom Schützen des 5'-Hydroxyls und umgekehrt. Die Pd(0)-katalysierte oxidative Kupplung eines geschützten Aminoalkins an das ungeschützte Nucleosid resultierte in komplexen Gemischen, die durch Kieselgelchromatographie nicht auftrennbar waren. Schützen der 5'-Hydroxyl- Gruppe von IDU über DMP-katalysierte Alkylierung mit 9-Chlor-9-phenylxanthen ergab das 5'-geschützte Nucleosid 7 in hoher Ausbeute und Reinheit, das mit den geschützten Propargylaminen 9 bis 12 nach dem Verfahren von Hobbs&sup8; verbunden wurden. Die Reaktion des geschützten Nucleosids 7 mit dem Fmoc-geschützten Propargylamin 9 lieferte das gewünschte Produkt 1 in eher niedrigen Ausbeuten (30%), wahrscheinlich aufgrund partieller Abspaltung der Schutzgruppe von 9 durch Triethylamin. Die bei der Abspaltung der Schutzgruppe gebildeten, freien primären Aminogruppen können auch mit dem Palladium-Katalysator koordinieren und die Kupplungsreaktion behindern&sup8;. Das Produkt 1 eluierte bei Kieselgelchromatographie in einem weiten Bereich von Elutionsbedingungen zusammen mit dem Ausgangsmaterialm und sowohl das ¹H- als auch das ¹³C-NMR-Spektrum zeigten, dass es eine geringe Menge an 7 enthielt. Die Kupplungsreaktion zwischen 7 und dem NPYS-geschützten Propargylamin 10 erzeugte ein komplexes Gemisch, das nur mittels Kieselgetchromatographie, gefolgt von C&sub1;&sub8;-RP-HPLC aufgelöst werden konnte. Analyse der HPLC-Fraktionen mittels ¹H- und ¹³C-NMR-Spektroskopie und FABMS zeigte, dass keine davon das gewünschte Produkt enthielt. Im Gegensatz dazu funktionierte die Kupplung der Boc- und Pixyl-geschützten Propargylamine 11 und 12 problemlos. Das Boc-geschützte Nucleosid 3 eluiert zwar auch zusammen mit dem Ausgangsnucleosid 7, das Produkt 3 konnte aber dennoch in hoher Ausbeute isoliert werden - aufgrund der Abwesenheit signifikanter Mengen an Verunreinigungen von 7. Die Herstellung des dipicylierten Nucleosids 4 konnte mittels DC verfolgt werden (5% MeOH/1% Et&sub3;N/CH&sub2;Cl&sub2;), und die Reaktion wurde nach 5 h als vollständig abgelaufen beurteilt. Auch diese Reaktion ergab hohe Ausbeuten.
- Obwohl die Alkinylnucleoside 3 und 4 ziemlich komplexe Strukturen aufweisen, konnte geeignete Charakterisierung mittel eindimensionaler ¹H- und ¹³C-Spektroskopie erfolgen, da die Multipletts bei der ersteren Verbindung gut getrennt sind und die meisten Resonanzen der letzteren ziemlich gut mit jenen von analogen Verbindungen übereinstimmen, über die bereits früher berichtet wurde³. Hervorstechende Eigenschaften des ¹³C-NMR-Spektrums dieser Alkinylnucleoside sind die beiden Resonanzen in den Bereichen von δ = 73,8-74,6 und δ = 90,1-91,2, die den quaternären Alkinyl-Kohlenstoffen C8 bzw. C7 entsprechen (Nummerierungssystem siehe Schema I). Die Niederfeld-Verschiebung von C5 von δ = 69,9 in IDU zu δ = 93,4-98,7 stimmt mit der Substitution eines quaternären Alkinyl-Kohlenstoffs mit einem Iodatom überein. Alle anderen Resonanzen entsprachen den angegebenen Strukturen von 3 und 4.
- Die nächste Stufe bei der Synthese des Konjugats war die Derivatisierung eines festen Trägers für die Polyamid- und Oligonucleotid-Synthese. CPG-Harz ("controlled pore glass") ermöglicht eine effiziente Synthese sowohl von Polyamid als auch von Oligonucleotid. Herkömmliche Peptidsyntheseharze, wie z. B. Pepsyn K&sup9;, besitzen eine höhere Beladung als CPG, es ist jedoch keine wirksame DNA-Synthese nach dem Phosphoramidit-Ansatz möglich, so dass CPG der feste Träger der Wahl ist.
- Derivatisierung des CPG-Harzes für die DNA-Synthese erfolgt herkömmlicherweise durch Aminierung des CPG, gefolgt von Kupplung mit einem aktiven Nucleosid-Succinatester¹&sup0; oder einer Carbodiimid-Kupplung, typischerweise mit DCC10,11. Damha et al. (Nucleic Acids Research 18, 3813-3821 (1990)) haben neulich ein Verfahren zur Bindung von Nucleosiden an succinyliertem CPG-Harz über eine 1-(3'-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid- (DEC-) vermittelte Kondensation beschrieben. Dieses Verfahren ist besser geeignet, da es zusätzliche Lösungsphasen-Manipulation der Nucleosid-Derivate vermeidet. Die Effizienz von DEC im Vergleich zu jener von DCC wird seinen niedrigeren sterischen Anforderungen zugeschrieben¹¹. Unter Berücksichtigung dessen wurde angenommen, dass Diisopropylcarbidiimid (DIC) ebenfalls besser als DCC sein könnte. Daher wurde eine Vergleich zwischen DIC und DCC sowie DEC unter Verwendung eines Standard-Nucleosids, 5'-O-Dimethoxytrityl-N&sup4;-benzoyl-2'-desoxycytidin (Dimethoxytrityl = Di(p-methoxyphenyl)phenylmethyl), angestellt. Succinyliertes CPG- Harz wurde mit dem Nucleosid, DMAP (0,5 Moläquiv.) und dem geeigneten Kondensationsmittel in trockenem Pyridin behandelt. Nach 24 h wurde der Grad der Nucleosid- Anbindung mittels Trityl-Test untersucht. Die Nucleosid-Beladungen wurden für DCC, DEC und DIC bestimmt und lagen bei 22, 18 bzw. 30 uMol/g, was zeigt, dass DIC das Kondensationsmittel der Wahl war.
- Der teste Träger für die Synthese des Konjugats wurde in vier Stufen, ausgehend vom CPG-Harz 13 hergestellt (Schema III). Das CPG wurde mit 3-Aminopropylethoxysilan¹² aminiert, und anschließend wurden drei 6-Aminohexansäure-Spacer-Reste unter Anwendung von Standard-Fmoc-Festphasen-Peptidsyntheseverfahren&sup9; angebunden, was Harz 15 ergab. Es wurde angenommen, dass der Einbau der drei Spacer-Einheiten aufgrund der besseren Zugänglichkeit des terminalen harzgebundenen Nucleosids für Reagentien - analog zu langkettigem Alkylamin (LCAA) CPG13 - eine wirksamere Oligonucleotid- Synthese ermöglicht. Das aminierte Harz 15 wurde DMAP-katalysierter Succinylierung mit Bernsteinsäureanhydrid unterzogen, was Harz 16 ergab. Die Anbindung des geeigneten Nucleosids an das Succinylharz 16 erfolgte mittels DIC/DMAP-vermittelter Kondensation, und jegliche verbliebene freie Carbonsäure- und Aminogruppen wurden mittels DCC/4-Nitrophenol/Piperidin- bzw. - Essigsäureanhydrid/DMAP-Behandlung blockiert&sup4;.
- Die Anbindung des Fmoc-Nucleosid-Derivats 1 an das Succinylharz 16 war problematisch. Der Einsatz von DMAP ist erforderlich, um geeignete Nucleosid-Beladungen von etwa 30 uMol/g zu erzielen; es wurde jedoch herausgefunden¹&sup4;, dass die eingesetzte Konzentration innerhalb von 24 h eine 45%ige Abspaltung der Fmoc-Gruppe bewirkt. Nach zwei weiteren 24 h-Kupplungsreaktionen zwischen dem Fmoc-Nucleosid 1 und dem Succinylharz 16 legte ein Vergleich zwischen dem Fmoc- und dem Pixyl-Test nahe, dass etwa die Hälfte des Nucleosids eine Abspaltung der Amino-Schutzgruppe erfahren hatte und wahrscheinlich über eine Amidbindung an das Harz gebunden war. Von diesem Nebenprodukt wurde nicht angenommen, dass es bei der Herstellung des gewünschten Konjugats stören würde, da erwartet wurde, dass es gegenüber den abschließenden Abspaltungsbedingungen stabil wäre und daher auf dem festen Träger verbleiben sollte. Mit dem Fmoc-Nucleosid 1 derivatisiertes Harz ergab jedoch konsistent niedrige Ausbeuten an Konjugat und wurde nicht weiter untersucht.
- Die Boc- und Pixyl-Nucleoside 3 und 4 ließen sich unter den obigen Bedingungen leicht an den festen Träger 16 binden, was laut Pixyl-Test Beladungen von 22 uMol/g bzw. 40 uMol/g ergab. Sowohl das Boc- als auch das Pixyl-Derivat 3 bzw. 4 ergaben ausreichende Nucleosid-Beladungen für effiziente Oligonucleotid-Synthese, letzteres wird jedoch aufgrund seiner einfachen Herstellung und den schonenderen, bei der Schutzgruppenentfernung erforderlichen Bedingungen bevorzugt.
- Bereits zuvor wurden Biotinreste über globale Biotinylierung des Polyamid-Anteils nach Schutzgruppenentfernung von der ε-Aminogruppe der Lysinreste in Konjugate eingebaut¹&sup5;. Dieser Batch-Ansatz ergab nur eine begrenzte Steuerung der Position der Biotine, und bei größeren Polyamiden, die bis zu 10 Lysinreste enthalten, wo die Biotinylierungsreaktion nicht vollständig abläuft, kann eine ungleichmäßige Verteilung der Biotine resultieren. Das Synthon 23 (Schema IV) ermöglicht den Einbau von Biotinen auf gut steuerbare Weise unter Anwendung herkömmlicher Fmoc-Peptidsynthese. Es wurde in einem zweistufigen Verfahren mittels Biotinylierung von Nα-Fmoc-L-Lys-OH 21 mit dem N-Hydroxysuccinimidylester von Biotin, gefolgt von DCC-vermittelter Kondensation mit Pentafluorphenol. Eine Synthese von Nα-Fmoc-D-Lys(Biotin)-OH wurde von Jacobson et al.¹&sup6; berichtet; dieses Verfahren ist jedoch für Synthesen in großem Maßstab nicht praktikabel, da das Produkt in den für den Extraktionsschritt verwendeten Lösungsmittels kaum löslich ist und - bezogen auf Nα-Fmoc-D-Lys-OH - in einer Ausbeute von 47% anfällt: im Vergleich zur vorliegenden Gesamtausbeute von 54% für den aktiven Ester 23. Außerdem wurde nur eine Elementaranalyse mit 2,5 Äquiv. H&sub2;O und 0,5 Äquiv. DMF als Kristallisationslösungsmittel zur Charakterisierung angegeben¹&sup6;.
- Die Charakterisierung des Pentafluorphenylesters 23 war aufgrund seines hochkomplexen ¹H-NMR-Spektrums und der Ähnlichkeit seines ¹³C-NMR-Spektrums zu jenem der freien Säure 22 als Ausgangsmaterial schwierig. Der einzige signifikante Unterschied im ¹³C-NMR-Spektrum des aktiven Esters war die Hochfeldverschiebung von 5 ppm des α- Carbonyls von Lysin und die Gegenwart einiger nichtaufgelöster Multipletts im aromatischen Bereich aufgrund der Pentafluorphenyl-Gruppe. Um schlüssigere Hinweise auf die Strukturen sowohl der freien Säure 22 als auch des aktiven Esters 23 zu erhalten, wurde ein Doppel-Quantenfilter-Homonuklearverschiebungs-Korrelationsexperiment im phasensensitiven Modus der Datenaufnahme (DQFPH COSY) an 22 durchgeführt, und ein Heteronuklear-Mehrfachbindungs-Konnektivitäts-Experiment (HMBC) wurde an 23 durchgeführt. Die Kreuz-Peaks im COSY-Spektrum von biotinyliertem Lysin 22 waren ausreichend gut aufgelöst, um eindeutige Zuordnungen aller Multipletts im eindimensionalen ¹H-NMR-Spektrum vornehmen zu können - selbst für Resonanzen im überfüllten Methylen-Bereich. Das HMBC-Spektrum des aktiven Esters 23 zeigte starke Konnektivitäten zwischen allen Carbonylen und ihren benachbarten Protonen, außer der Resonanz bei δ = 169,2, die daher provisorisch dem α-Carbonyl zugeordnet wurde. Dieses zeigte unter diesen speziellen Versuchsbedingungen keinerlei Korrelationen zu irgendwelchen Protonen. Durch Bereitstellung eindeutiger Zuordnungen für drei der vier Resonanzen im Carbonyl-Bereich bestätigte das HMBC-Experiment indirekt, dass die Resonanz bei δ = 169,2 vom Lysin-α-Carbonyl herrührt, und bestätigte auch die Zuordnung der übrigen Resonanzen, die im Grunde genommen die Addition der Spektren von Nα- Fmoc-L-Lys-OH und Biotin¹&sup7; darstellten. Außerdem zeigte das IR-Spektrum von 23 eine dem Ester-Carbonyl entprechende Bande bei 1787 cm&supmin;¹, die eine signifikante Verschiebung von der Carbonsäurebande von 22 bei 1702 cm&supmin;¹ darstellt.
- Anfänglich wurde die Modellverbindung 5 synthetisiert, um die Wirksamkeit dieser Art von Konjugaten als PCR-Primer zu untersuchen. Die Polyamid-Gruppe dieses Konjugats enthält einen 6-Aminohexansäure-Rest als Spacer (Schema I in Fig. 2), einen ε-biotinylierten Lysinrest zur Detektion der PCR-Amplifikationsprodukte und einen Alaninrest als Bezugsaminosäure. Die Oligonucleotid-Gruppe war ein 23-Mer, das eine 700 Basenpaar-Region der DNA von λ-Phagen amplifiziert; das Templat wird zusammen mit dem Standard-Cetus-PCR-Set für Vergleichsreaktionen bereitgestellt.
- Wie bei der Synthese von bereits zuvor beschriebenen Konjugaten2, ¹&sup5; wurde der Polyamid-Anteil des vorliegenden Konjugats zuerst auf dem oben beschriebenen, derivatisierten, festen Träger nach der herkömmlichen Fmoc-Vorgangsweise synthetisiert, da die Bedingungen der Peptidsynthese rauer als jene der DNA-Synthese sind. Die frei hängenden Amino- und 5'-Hydroxlygruppen der derivatisierten festen Träger 18 und 19 wurden durch Behandlung mit 90% TFA/Ethandiol bzw. 3% DCA/CH&sub2;Cl&sub2; von Schutzgruppenbefreit und anschließend mit 20% Triethylamin/CH&sub2;Cl&sub2; neutralisiert. Sie wurden Doppelkupplungsreaktionen (jeweils 45 min) mit einem 1 : 1-Gemisch aus N- Fmoc-6-aminohexansäurepentafluorphenylester (Fmoc-εAhz-Opfp) und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) (jeweils 2,5 Moläquiv.) unterzogen. Der qualitative Trinitrobenzolsulfonsäure-Test¹&sup8; zeigte nur Spurenmengen von freien Aminosäuren am Ende der ersten Kupplungsreaktion und keinerlei freie Aminosäuren nach der Wiederholung der Kupplungsreaktion. Erneutes Schützen der 5'-Hydroxylgruppe erfolgte durch Tritylierung mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid in Pyridin (ohne DMP als Katalysator aufgrund der Gegenwart der Fmoc-Gruppe), was Harz 20 ergab. Die Trityl-Beladung des Harzes nach zwei nachfolgenden 24 h-Behandlungen war mit der vor der Acylierungsreaktion festgestellten Nucleosid-Beladung vergleichbar, was bestätigte, dass die Acylierung mit hoher Selektivität am frei hängenden Amin erfolgt war. Alle übrigen freien Carbonsäure- und Aminogruppen wurden wie bereits beschrieben blockiert.
- Das biotinylierte Lysin-Synthon 23 und Fmoc-Ala-Opfp wurden unter Einsatz von Standardchemie mit einem fünffachen Überschuss an aktivem Aminosäureester und HOBT an den testen Träger 20 gebunden (Schema III). Die Effizienz der Kupplung an 23 war ähnlich jener des Standard-Aminderivats, wobei die Reaktion innerhalb 1 h abgeschlossen war. Aminosäure-Analyse des festen Trägers in diesem Stadium lieferte das erwartete Verhältnis zwischen Lysin und Alanin mit Beladungen von 26 bzw. 23 uMol/g für Lysin und Alanin. Die Fmoc-Gruppe von Alanin wurde mit 20% Piperidin/DMF entfernt, und die resultierenden freien Aminogruppen wurden durch Behandlung mit Ac&sub2;O/DMAP acetyliert.
- Gemäß der Synthese des Polyamids wurde das 5'-Hydroxyl des harzgebundenen Nucleosids durch Tritylierung mit 3% DCA/CH&sub2;Cl&sub2; von Schutzgruppen befreit, und unter Einsatz von Standard-β-Cyanoethylphosphoramidit-Chemie2,10,9 wurde ein Oligonucleotid synthetisiert. Die mittels Trityl-Tests bestimmten Ausbeuten der wiederholten Kupplungsreaktionen des Oligonucleotids waren mit jenen der DNA-Synthese unter Verwendung normaler fester Träger vergleichbar. Abspaltung vom festen Träger sowie Entfernung der Phosphat- und Basen-Schutzgruppen durch Ammoniak-Behandlung2,10,12 lieferte ein Material, das - wie durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gezeigt - aus zwei Hauptprodukten bestand. Das Produkt mit der höheren elektrophoretischen Mobilität enthielt kein Peptid-Material, während das langsamer migrierende die gewünschte Aminosäure-Zusammensetzung enthielt. Reinigung mittels präparativer PAGE führte zu hohen Ausbeuten des gewünschten Konjugats.
- Das Oligonucleotid-Polyamid-Konjugat 5 wurde mittels UV-Spektroskopie, Aminosäureanalyse, Nuclease-Verdau in seine einzelnen Nucleotide sowie PAGE charakterisiert. Quantifizierung der Oligonucleotid-Einheit anhand ihres UV-Absorptionsvermögens und Quantifizierung der Polyamid-Einheit mittels Aminosäureanalyse ergaben ein 1, 2 : 1 - Verhältnis zwischen Oligonucleotid und Polyamicl. Außerdem waren die Reaktionen der Aminosäuren wie erwartet, was nahe legt, dass die Polyamid-Einheit intakt und gegenüber den Bedingungen bei der Oligonucleotid-Synthese stabil war. Das Konjugat wurde auch am 5'-Ende mittels γ-[³²P]-ATP und T&sub4;-Polynucleotid-Kinase mit einem radioaktiven Phosphat markiert und mittels PAGE analysiert, wobei das resultierende Autoradiogramm (Fig. 1) die Homogenität des Konjugats bestätigte. Vorhergehende Experimente unter Verwendung dieses Konjugats als PCR-Primer lieferten ein Produkt mit der erwarteten Länge. Nachfolgende Chemolumineszenz-Detektion der Biotin- Markierung in diesem Vorgang zeigte eindeutig, dass das Konjugat wie erwartet in das PCR-Produkt inkorporiert war (die Daten werden an anderer Stelle beschrieben). Diese Arten von Konjugaten sind daher geeignete PCR-Primer.
- Das Konjugat aus Beispiel 4 wurde in 0,1 mM EDTA-Lösung in einer Endkonzentration von 100 ng/ul gelöst. Die Sequenz des Oligonucleotids lautete GATAGTCGTTCCTAC- ACT* (worin T* ein modifiziertes Desoxyuridin ist, das das biotinylierte Triamid trägt), die in bination mit dem Oligonucleotid-Primer GGTATCAAACAGCACGCG zur Amplifikation der 500 bp-Region 7131-7630 von c1857-DNA des Bakteriophagen λ eingesetzt wurde, die zusammen mit dem Perkin-Elmer PCR-Testset bereitgestellt wird. Der normale Oligonucleotid-Primer (bei dem das 3'-Nucleotid ein T ist) wurde auch auf die oben beschriebene Weise synthetisiert und gereinigt.
- Jedes PCR-Reaktionsgemisch enthielt Folgendes: 5 ul Taq-Polymerase-Lösung (2,5 U, in Taq-Polymerase-Puffer/50% Glycerin), 1 ul jedes Oligonucleotid-Primers (100 ng wurden mit autoklaviertem, destilliertem Wasser auf 50 ul eingestellt, und ein Tropfen autoklaviertes Mineralöl wurde zugesetzt. Alle Reaktionen erfolgten auf einem Perkin- Elmer Cetus-DNA-Thermal Cycler-Gerät gemäß folgendem Zyklus: 95ºC (1 min), 55ºC (1 min), 72ºC (1 min) für 30 Zyklen, die in einer 10-minütigen Stute bei 72ºC endeten, um vollständige Kettenverlängerung sicher zu stellen. Gelelektrophorese der PCR-Reaktionsgemische (5 ul) erfolgte auf einem Agarose-Gel (1,5% Agarose, 0,0001% Ethidiumbromid) mit 1 · TBE-Puffer bei 80 V innerhalb 1 h. Das Agarose-Gel wurde auf einer Nylonmembran nach dem Southern-Verfahren geblottet. Die Membran wurde anschließend unter Verwendung des PHOTOGENE-Sets von BRL Like Technologies Inc. auf Gegenwart von Biotin sondiert. Diese Bestimmung wird auf folgende Weise durchgeführt.
- Nach dem Einweichen der Membran in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS Tween 20) und anschließendes Blockieren in 3% Rinderserumalbumin in demselben Puffer wurde die Membran 10 min lang mit einer Lösung des Streptavidin-alkalische Phosphatase- Konjugats (1 mg/ml in 3 M NaCl, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;, 30 mM Triethanolamin (pH 7,6)), 1 : 1000 verdünnt mit TBS-Tween 20, inkubiert. Nach Waschen der Membran mit TBS-Tween 20 über 15 min und "Final Washer Buffer" (1 : 10 verdünnt mit destilliertem Wasser) über 60 min bei Raumtemperatur wurde die Membran geblottet, um überschüssigen Puffer zu entfernen. Sie wurde dann in einen Entwicklungs-Ordner gelegt und mit dem vom Hersteller bereitgestellten Chemolumineszenz-Substrat für alkalische Phosphatase behandelt. Die Membran wurde 3 h lang im Dunklen aufbewahrt, wonach ein Röntgenfilm daraufgelegt wurde. Nach 30 s Belichtungszeit wurde ein starkes Signal verzeichnet.
- Die UV-Visualisierung des Ethidiumbromid-gefärbten Gels zeigte deutlich, dass die PCR unter Verwendung des Konjugats als einer der Primer vergleichbare Mengen an amplifizierter DNA ergab wie jene, die bei alleiniger Verwendung des normalen Oligonucleotid-Primers erzielt wurden. Beide PCR-Produkte hatten die erwartete Länge.
- Um unwiderlegbar zu beweisen, dass die Amplifikationsprodukte von biotinylierten Konjugat herrühren, wurden die Produkte auf dem Agarose-Gel wie zuvor beschrieben auf Nylonmembran geblottet. Das Detektionssystem umfasst im Grunde die Reaktion von immobilisierter DNA mit einem Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat, was wiederum eine Dephosphorylierungsreaktion katalysiert, die Chemolumineszenz ergibt. Die Chemolumineszenz wird durch Belichtung von normalem Röntgenfilm mit dem Blot detektiert. Wie erwartet existierte nur eine Bande, die Biotin enthielt und den vom biotinylierten PCR-Primer-Konjugat herrührenden PCR-Produkten entsprach. Dies zeigt unwiderlegbar, dass der biotinylierte Primer wirksam in die fertigen Amplifikationsprodukte inkorporiert war.
- Chemolumineszenz-Detektion ist - selbst bei nur einem Biotin in diesem Fall - ist äußerst empfindlich. Ein starkes Signal wurde nach nur 30 s Belichtungszeit erhalten, und nach 5 min war Signalsättigung erreicht.
- Die folgenden Literaturverweise sind hierin zur Gänze aufgenommen:
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Claims (22)
1. Nukleotid-Polymer-Konjugat der Formel (I)
Nu-NUC-C C-X¹-NH-X²-X³ (I)
worin:
X¹ eine unsubstituierte oder substituierte C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkylengruppe ist, in der ein oder
mehrere Kohlenstoffatome gegebenenfalls durch -NH-, -O- oder -S- ersetzt sind,
X² eine Bindung oder eine unsubstituierte oder substituierte C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkylengruppe ist, in
der ein oder mehrere Kohlenstoffatome gegebenenfalls durch -NH-, -O- oder -S- ersetzt
sind,
die optionalen Substituenten in X¹ oder X² aus einer oder mehreren von Oxo-, Amino-
Thioxo-, Hydroxyl-, Mercapto-, Carboxyl-, Halogen-, Niederalkyl-, Phenyl-,
Amino-Niederalkyl-, Ester-Niederalkyl-, Amido-Niederalkyl-, Ether-Niederalkyl- oder
Thioether-Niederalkyl-Gruppen, Schwefel-Analogen dieser Substituenten oder
Seitenketten-Substituenten von natürlich vorkommenden Aminosäuren unci eng verwandten Analogen
dieser Seitenketten ausgewählt sind;
X³ eine Aminosäure oder ein über seine Carboxyl-Endgruppe gebundenes Polyamid ist,
NUC eine Nukleosidgruppe einer der Formeln:
ist, worin → die Bindung zur -C C-Gruppe in Formel (I) bezeichnet und X&sup4; eine
Zuckergruppe der Formel
ist, worin der 5'-Sauerstoff an Nu gebunden ist, und
X&sup5; und X&sup6; jeweils unabhängig voneinander H oder OR sind, worin R = H, eine
Schutzgruppe oder eine Festphasenmatrix ist, und
Nu ein Oligonukleotid ist.
2. Konjugat nach Anspruch 1, worin
X¹ = C&sub1;-C&sub3;-Alkylen ist,
X² = -CO-(C&sub1;-C&sub9;-Alkylen)-NH- ist,
X³ ein Peptid ist, das über seine Carboxy-Endgruppe gebunden ist,
NUC ein Nukleosid der Formel
ist, worin X&sup4;, X&sup5; und X&sup6; wie in Anspruch 1 definiert sind
und Nu die Formel
aufweist, worin B unabhängig aus Adenyl, Guanyl, Thyminvl oder Cytosinyl ausgewählt
ist und n = 1 bis etwa 400 ist.
3. Konjugat nach Anspruch 2, worin X¹ Methylen ist und X² = -CO-(CH&sub2;)&sub5;-NH- ist.
4. Konjugat nach Anspruch 1, das die Formel
aufweist, worin X², X³, X&sup5;, X&sup6; und Nu wie in Anspruch 1 definiert sind.
5. Konjugat nach Anspruch 1, worin X³ ein Peptid ist, das 2 bis 100 Aminosäuren
umfasst.
6. Konjugat nach Anspruch 1, worin X³ eine Polyamidkette ist, die eine oder
mehrere Reportergruppen enthält.
7. Konjugat nach Anspruch 6, worin die Reportergruppen über die ε-Aminogruppe
einer in der Kette vorhandenen Lysingruppe an die Kette gebunden sind.
8. Konjugat nach Anspruch 2, worin in der Definition von NU n = 2 bis etwa 200
ist.
9. Konjugat nach Anspruch 1, worin X&sup5; = H ist und X&sup6; = OR ist, worin R = H oder
eine Festphasenmatrix ist.
10. Konjugat nach Anspruch 1, worin R eine Festphasenmatrix ist, die aus einem
Glas mit gesteuerter Porengröße oder einem Polystyrolharz ausgewählt ist.
11. Verfahren zur Herstellung eines Nukleotid-Polymer-Konjugats der Formel (I):
Nu-NUC-C C-X¹-NH-X²-X³ (I)
worin:
X¹ eine unsubstituierte oder substituierte C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkvlengruppe ist, in der ein oder
mehrere Kohlenstoffatome gegebenenfalls durch -NH-, -O- oder -S- ersetzt sind,
X² eine Bindung oder eine unsubstituierte oder substituierte C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkylengruppe ist, in
der ein oder mehrere Kohlenstoffatome gegebenenfalls durch -NH-, -O- oder -S- ersetzt
sind,
die optionalen Substituenten in X¹ oder X² aus einer oder mehreren von Oxo-, Amino-
Thioxo-, Hydroxyl-, Mercapto-, Carboxyl-, Halogen-, Niederalkyl-, Phenyl-,
Amino-Niederalkyl-, Ester-Niederalkyl-, Amido-Niederalkyl-, Ether-Niederalkyl- oder
Thioether-Niederalkyl-Gruppen, Schwefel-Analogen dieser Substituenten oder
Seitenketten-Substituenten von natürlich vorkommenden Aminosäuren und eng verwandten Analogen
dieser Seitenketten ausgewählt sind;
X³ eine Aminosäure oder ein über seine Carboxyl-Endgruppe gebundenes Polyamid ist,
NUC ein Nukleosid einer der Formeln:
ist, worin → die Bindung zur -C C-Gruppe in Formel (I) bezeichnet und X# eine
Zuckergruppe der Formel
ist, worin der 5'-Sauerstoff an Nu gebunden ist, und X&sup5; und X&sup6; jeweils unabhängig
voneinander H oder OR sind, worin R = H, eine Schutzgruppe oder eine Festphasenmatrix
ist, und
Nu ein Oligonukleotid ist,
wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
(1) das Bereitstellen einer Verbindung der Formel (III):
in der NUC' eine Gruppe einer der folgenden Formeln:
ist,
und X#, X&sup5; und X&sup6; wie zuvor beschrieben sind, und Pr¹ und Pr² Schutzgruppen sind, die
gleich oder voneinander verschieden sein können;
(2) das Entfernen der Schutzgruppe von der angehängten Aminogruppe durch
Entfernen von Pr¹ in Verbindung (III) unter Bedingungen, unter denen auch Pr² entfernt
wird oder auch nicht, und das anschließende Umsetzen der von der Schutzgruppe
befreiten Verbindung mit einer Verbindung der Formel Pr³X²Rx, worin X² wie zuvor
beschrieben ist, Pr³ eine Schutzgruppe ist und Rx eine Abgangsgruppe ist, um X² kovalent
an die angehängte Aminogruppe zu binden, was:
ergibt, und für den Fall, dass die 5'-OH-Gruppe frei ist, diese Gruppe gegebenenfalls
erneut mit Pr² als entfernbarer Schutzgruppe geschützt wird, welche dieselbe oder eine
andere als Pr² in Schritt (1) sein kann, oder, wenn X² eine Bindung ist, das Auslassen
von Schritt (2);
(3) das Entfernen der Schutzgruppe von der angehängten Aminogruppe durch
Entfernen von Pr³ (oder Pr¹, wenn X¹ eine Bindung ist) in der Verbindung aus Schritt (2)
und Umsetzen derselben mit einer/einem aktivierten Aminosäure oder Polyamid, um
das gesamte oder einen Teil von X³ einzuführen, und, wenn nur ein Teil von X³
eingeführt worden ist, die anschließende aufeinanderfolgende Zugabe einer oder mehrerer
aktivierter Aminosäuren oder Polyamide einmal oder mehrmals unter
Standard-Peptidsynthese-Bedingungen, um den Rest von X³ zur Verbindung hinzuzufügen, um
zu bilden
(4) das Entfernen der Schutzgruppe von der 5'-OH-Gruppe der Zuckergruppe der
Verbindung aus Schritt (3), wenn die Schutzgruppe nicht zuvor entfernt worden ist, und das
Umsetzen der von der Schutzgruppe befreiten OH-Gruppe mit einem aktivierten
Nukleotid oder Oligonukleotid, um eine 5'-3'-Bindung zu bilden, und die anschließende
aufeinanderfolgende Zugabe eines oder mehrerer aktivierter Nukleotide, um eine
Oligonukleotidkette zu bilden, um Nu der Verbindung hinzuzufügen; und
(5) gegebenenfalls das Entfernen jeglicher verbleibender Schutzgruppen, und
gegebenenfalls das Abspalten der Verbindung von einer Festphasenmatrix, wenn X&sup5; oder
X&sup6; = OR ist und R eine Festphasenmatrix ist, was Verbindung (I) ergibt.
12. Verfahren zur Herstellung eines Nukleotid-Polymer-Konjugats der Formel:
worin X², X³, X&sup5;, X&sup6; und Nu wie in Anspruch 1 definiert sind, wobei das Verfahren
Folgendes umfasst:
(1) das Bereitstellen einer Verbindung der Formel (IIIa):
worin X&sup5; und X&sup6; wie zuvor beschrieben sind und Pr¹ und Pr³ Schutzgruppen sind, die
gleich oder voneinander verschieden sein können;
(2) das Entfernen der Schutzgruppe von der angehängten Aminogruppe durch
Entfernen von Pr¹ in Verbindung (IIIa) unter Bedingungen, unter denen auch Pr² entfernt
wird oder auch nicht, und das anschließende Umsetzen der von der Schutzgruppe
befreiten Verbindung mit einer Aminosäure der Formel Pr³X²Rx, VOrin X² wie zuvor
beschrieben ist, Pr³ eine Schutzgruppe ist und Rx eine Abgangsgruppe ist, um X² kovalent
an die angehängte Aminogruppe zu binden, und für den Fall, dass die 5'-OH-Gruppe
frei ist, diese Gruppe gegebenenfalls erneut mit einer entfernbaren Schutzgruppe
geschützt wird, welche dieselbe oder eine andere als Pr² in Schritt (1) sein kann, oder,
wenn X² eine Bindung ist, das Auslassen von Schritt (2);
(3) das Entfernen der Schutzgruppe von der angehängten Aminogruppe durch
Entfernen von Pr³ (oder Pr¹, wenn X² eine Bindung ist) in der Verbindung aus Schritt (2)
und Umsetzen derselben mit einer/einem aktivierten Aminosäure oder Polyamid, um
das gesamte oder einen Teil von X³ einzuführen, und, wenn nur ein Teil von X³
eingeführt worden ist, die anschließende aufeinanderfolgende Zugabe einer oder mehrerer
aktivierter Aminosäuren oder Polyamide einmal oder mehrmals unter
Standard-Peptidsynthese-Bedingungen, um den Rest von X³ zur Verbindung hinzuzufügen;
(4) das Entfernen der Schutzgruppe von der 5'-OH-Gruppe der Zuckergruppe der
Verbindung aus Schritt (3), wenn die Schutzgruppe nicht zuvor entfernt worden ist, und
das Umsetzen der von der Schutzgruppe befreiten OH-Gruppe mit einem aktivierten
Nukleotid oder Oligonukleotid, um eine 5'-3'-Bindung zu bilden, und die
anschließende aufeinanderfolgende Zugabe eines oder mehrerer aktivierter Nukleotide, um eine
Oligonukleotidkette zu bilden, um Nu der Verbindung hinzuzufügen; und
(5) gegebenenfalls das Entfernen jeglicher verbleibender Schutzgruppen, und
gegebenenfalls das Abspalten der Verbindung von einer Festphasenmatrix, wenn X&sup5; oder
X&sup6; = OR ist und R eine Festphasenmatrix ist, was Verbindung (II) ergibt.
13. Verwendung des Konjugats nach Anspruch 1 als Substrat für DNA- oder
RNA-Polymerase in vitro.
14. Verwendung des Konjugats nach Anspruch 1 als markierter
Polymerase-Kettenreaktions- (PCR-) Primer.
15. Verwendung des Konjugats nach Anspruch 1 als markierte Hybridisierungssonde
in vitro.
16. Verwendung des Konjugats nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments
zur Behandlung von Krankheiten.
17. Verfahren zum Bestimmen der Gegenwart und der Position einer spezifischen
Polynukleotidpopulation in einem Tier- oder Pflanzengewebe, welches Folgendes
umfasst:
(a) das Präparieren eines Schnitts des zu untersuchenden Gewebes;
(b) das Hybridisieren des Gewebeschnitts mit einem Oligonukleotid-Polymer-
Konjugat nach Anspruch 1, worin der Oligonukleotid-Abschnitt des Konjugats zu einem
Abschnitt eines Ziel-Polynukleotids komplementär ist;
(c) das Entfernen von unhybridisiertem Sondenmaterial vom Gewebeschnitt; und
(d) das Detektieren oder Identifizieren jener Positionen im Gewebeschnitt, wo
Markierung durch Hybridisieren des Konjugats erfolgt ist.
18. Verfahren zum Detektieren von an einer Trägermatrix immobilisiertem oder auf
andere Weise damit assoziiertem Polynukleotid, wobei das Verfahren das Kontaktieren
der Trägermatrix mit einem Oligonukleotid-Polymer-Konjugat nach Anspruch 1 umfasst,
worin der Oligonukleotid-Abschnitt des Konjugats zu einem Abschnitt des
Ziel-Polynukleotids komplementär ist, und das anschließende Detektieren von Hybridisierung des
Konjugats an die Trägermatrix umfasst.
19. Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit eines spezifischen
viralen, bakteriellen oder anderen Polynukleotids in einer biologischen Probe,
umfassend das Kontaktieren der Nukleinsäuren der Probe mit einem Oligonukleotid-Polymer-
Konjugat nach Anspruch 1, das zu einem Abschnitt eines Ziel-Polynukleotids
komplementär ist, und das anschließende Detektieren, ob Hybridisierung des Konjugats erfolgt
ist.
20. Verwendung eines Oligonukleotid-Polymer-Konjugats nach Anspruch 1, worin
der Oligonukleotid-Abschnitt des Konjugats ein Antisense-Oligonukletoid ist, das zu
einem spezifischen viralen, bakteriellen oder anderen Polynukleotid komplementär ist,
so dass Transkription oder Translation des spezifischen Polynukleotids blockiert wird,
zur Herstellung eines Medikaments zu Behandlung einer viralen, bakteriellen oder
anderen Erkrankung.
21. Diagnoseset zum Detektieren eines gewünschten Polynukleotids, welches ein
Oligonukleotid-Polymer-Konjugat nach Anspruch 1, worin der Oligonukleotid-Abschnitt
des Konjugats zu einem Abschnitt des gewünschten Polynukleotids komplementär ist;
sowie Reagenzien zum Detektieren von Hybridisierung des Konjugats umfasst.
22. Diagnoseset nach Anspruch 21 zur Verwendung zum Bestimmen der Gegenwart
und der Position einer spezifischen Polynukleotidpopulation in Tier- oder
Pflanzengewebe, das zusätzlich Reagenzien zur Gewebeschnittpräparation umfasst.
Applications Claiming Priority (2)
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---|---|---|---|
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PCT/AU1993/000252 WO1993024511A1 (en) | 1992-05-29 | 1993-05-28 | Oligonucleotide-polyamide conjugates |
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---|---|
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
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DE (1) | DE69331266T2 (de) |
Family Cites Families (1)
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---|---|---|---|---|
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1993
- 1993-05-28 JP JP6500029A patent/JP2723360B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-05-28 EP EP93909699A patent/EP0644890B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-05-28 DE DE69331266T patent/DE69331266T2/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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---|---|
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