JPH07505907A - オリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲート - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 オリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲート技術分野 本発明は、好ましくは遊離の３°ヒドロキシ部分を有する新規なオリゴヌクレオ チド−ポリアミドコンジュゲート（ここに、ポリアミドはそのカルボキシ末端を 介してオリゴヌクレオチドと結合している）に関する。

背景技術 ヌクレオチド配列の検出またはヌクレオチド配列のリポータ−基（リポータ−グ ループ）による標識には、多くの分子生物学的な方法が関与している。例えば、 広範に用いられているポリメラーゼ連鎖反応技術（ＰＣＲ）によって、極く僅か な標的分子から、１〜２時間の間に、生産が望まれるＤＮＡの多量のコピーを得 ることができ、結果として、以前には感度が低いために制限されていた核酸検出 法が適用できるようになった。増幅されたＰＣＲ産物の検出は多くの方法で行い 得る。非放射能的に、例えば、増幅されたヌクレオチド配列中のリポータ−基を 用いて、増幅産物を検出し得ることが最も望ましい。

同様に、二ンクトランスレーンヨンのような反応では、後のハイブリダイゼーシ ョン生成物の検出のために、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼによ って製造された反応生成物に標識したヌクレオチドを組込むことが望ましい。

発明の開示 本発明は、その１つの態様において、以下の式（１）で示されるヌクレオチドポ リアミドコンジュゲートを提供するものである：Ｎｕ−ＮＵＣ−Ｃ＝Ｃ−Ｘ’− ＮＨ−Ｘｌ−Ｘ’　（Ｉ）（式中、Ｘｌは非置換または置換Ｃ１〜Ｃ３゜アルキ レン基（１またはそれ以上の炭素が所望により−Ｎ１ｌ−１−０−１または−８ −で置換されていてもよい）であり：Ｘ２は結合、または非置換もしくは置換Ｃ ｌ−Ｃ２６アルキレン基（１またはそれ以上の炭素が所望により−ＮＨ−１−０ −５または−８−で置換されていてもよい〕であり： ＸｌまたはＸ２における所望による置換基は、オキソ、アミノ、チオキソ、ヒド ロキシル、メルカプト、カルボキシル、ハロゲン、低級アルキル、フェニル、ア ミノ−低級アルキル、エステル−低級アルキル、アミド−低級アルキル、エーテ ル−低級アルキルまたはチオエーテル−低級アルキル基、これら置換基の硫黄類 似体、または天然に存在するアミノ酸由来の側鎖置換基およびこれら側鎖の密接 に関連した類似体のうちの１またはそれ以上の基から選択され：Ｘ３はアミノ酸 またはカルホキ／末端で結合したポリアミドであり；ＮＵＣは、以下の式のいず れかで示されるヌクレオシド基であり：［式中、→は式（１）における−〇ミＣ −基への結合を示す］：そしてＸ４は以下の式で示される糖基であり・［式中、 ５°酸素はＮｕに結合し、そしてＸｌおよびＸ６は各々独立してＨまたはＯＲで ある（ＲはＨ，保護基または固相マトリックスである）］、そしてＮｕはオリゴ ヌクレオチドである１゜ ｘｌは非置換または置換ＣＩ−Ｃ，。アルキレン基（ここに、１またはそれ以上 の炭素が、−Ｎ　＋−（−１−〇−または−８−で置換されていてもよい）であ り、該Ｘｌが置換されている場合の置換基は、オキソ、アミノ、チオキソ、ヒド ロキシル、メルカプト、カルボキシル、ハロゲン、低級アルキル、フェニル、ア ミノ−低級アルキル、エステル−低級アルキル、アミド−低級アルキル、エーテ ル−低級アルキル、またはチオエーテル−低級アルキル基などの置換基、これら 化合物の硫黄類似体、および任意の他の官能基から選択される１またはそれ以上 の置換基である。その他の可能な置換基は、例えば、天然に存在するアミノ酸の 側鎖置換基、およびそれらの側鎖と密接に関連した類似体である。好ましくは、 Ｃｌ−０１゜アルキレンはＣ７〜Ｃ３アルキレンであり、それは所望により、ア ミド、ハロゲン、アリール、エステルなどの１またはそれ以上で置換されていて もよい。ＸＩの好ましい形はメチレンである。

Ｘ２は結合、または非置換基または置換Ｃ９〜Ｃ２゜アルキレン基（ここに、１ またはそれ以上の炭素が、−ＮＨ−１−〇−または−８−で置換されていてもよ い）であり、該Ｘ２が置換されている場合の置換基は、例えば、オキソ、アミノ 、チオキソ、ヒドロキシル、メルカプト、カルボキシル、ハロゲン、低級アルキ ル、フェニル、アミノ−低級アルキル、エステル−低級アルキル、アミド−低級 アルキル、エーテル−低級アルキル、またはチオエーテル−低級アルキル基など の置換基、これら置換基の硫黄類似体、または天然に存在するアミノ酸のα−炭 素に結合している側鎖置換基、およびそれらの類似体から選択される１またはそ れ以上の置換基である。Ｘ２は、好ましくは−ＣＯ（Ｃｌ−Ｃｏアルキレン）− ＮＨ−（ここに、アルキレンは、さらに、例えば天然に存在するアミノ酸に結合 している置換基等によって置換されていてもよい）の形を有する。Ｘ２の好まし い形は−ｃ。

（ＣＨｚ）ｓ　Ｎ　■１−などである。

ポリアミド（Ｘ’）は、好ましくは２またはそれ以上のアミノ酸を含むポリペプ チドである。該ポリペプチドは１またはそれ以上のリポータ−基をも有すること が好ましい。また、このポリペプチドは１個のアミノ酸からなっていてもよい。

ヌクレオノド基ＮＵＣの１つの好ましい形は、式。

［式中、Ｘ４は上記定義と同意義である］で示されるｍａを有する。糖残基Ｘ′ において、置換基Ｘ５およびＸ＠はそれぞれ独立して［ＩまたはＯＲ（ここに、 ＲはＨ１保護基または固相マトリックスである）であり、好ましくは、Ｘ３はＨ ｌそしてＸ６はＯＲ（ここに、ＲはトＩまたは支持マトリックスである）である 。

特に好ましい本発明の化合物は、式（ＩＩ）［式中、Ｘ２、Ｘｌ、Ｘ５、Ｘ６お よびＮｕは上記定義と同意義である］で示される化合物群からなる。

基Ｘ３は基Ｘ２に共有結合的に結合しているポリアミドを表す。このポリアミド は、アミド結合またはいわゆるペプチド結合によって結合した、リジン、バリン 、グリシジ、セリン、スレオニン、チロノン、メチオニン、プロリンなどの天然 に存在するアミノ酸で形成されていて良い（［ｌｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２ 版、＾１ｂｅｒｔ　Ｌ、　Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、　ｐｐ、７２−７７、１９７０ ）。あるいは、ポリアミドは合成アミノ酸、即ち、タンパク胃中に天然には存在 しない合成アミノ酸で形成されていても良く、あるいは該ポリアミドは天然アミ ノ酸と合成アミノ酸との組合せで形成されていてもよい。

好ましくは、該合成アミノ酸は、一般式：１Ｉ２ＮｃＨＲ’ｃＯＯ１ｌ　［式中 、Ｒ１は、直鎖または分枝鎖状の、飽和または不飽和の１またはそれ以上のオレ フィン性またはアセチレン性のＣ−Ｃ結合をｆｌするｃ１〜ｃ２゜アルキレンの 様な任意の有機部分であり、例えば、飽和または部分的に飽和であり、そして／ または、１またはそれ以上のへテロ原子あるいはそのようなヘヂロ原子を含有す る基（例、アミド基）が介在しており、モして／または、ハロゲン、ジアン、ア ミノまたは非置換または置換フェニルまたはベンジルで置換されていてもよく、 ンクロアルキルが例として挙げられる］で表されるα、ω−アミノーカルボン酸 を含んでいて良い。ポリアミドは、例えば１〜１００アミノ酸の、任意の数のア ミノ酸単位（残基）を含有していてよい。

ポリアミド（Ｘ３）は、天然に存在するかまたは天然に存在しないアミノ酸を含 むペプチドを形成していてよい。ペプチドの配列は、抗体との相互作用、酵素反 応など任意の所望の適用に適するように設計することができる。

ポリアミドはリジンのような誘導体化されたアミノ酸を介してポリアミド鎖に結 合した１またはそれ以上のリポータ−基を含有していても良い。リポータ−基は 蛍光部分、化学発光部分、常磁性部分など、ビオチンおよびフェリチンのような コロイド性化合物またはコロイド状銀もしくは金、および酵素類を含有していて も良い。リポータ−基はポリアミド内の共有結合的に結合した、特にリジンの遊 離アミノ基を介して結合した、１またはそれ以上のアミノ酸であってよい。

蛍光団リポータ−基は以下のものから選択される。フルオレセイン−５−イソチ オシアナート、ジアシル（イソブチリル、アセチルまたはピバロイルなど）フル オレセイン−５および／または６カルボン酸ペンタフルオロフエニルエステル、 ６−（ジアンルー５および／または６−カルボキンアミド−フルオレセイン）ア ミノ−ヘキサン酸ペンタフルオロフェニルエステル、テキサスレッド（Ｔｅｘａ ｓ　Ｒｅｄ。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、　Ｉｎｃ、の登録商１ｍ１）、テトラメチ ルローダミン−５（および６）イソチオシアナート、オエンンーイソチオンアナ ート、エリスロンンー５−イソチオンアナート、４−クロロ−７−二トロベンザ ー２−オキサ−１，３−ジアゾール、４−フルオロ−７−ニドロベンザー２−オ キサ−１，３−シアシン、３−（７−ニドロベンザー２−オキサ−１，３−ジア ゾール−４−イル）メチルアミノ−プロピオニトリル、６−（７−ニドロベンザ ー２−オキサ−１，３−ノアゾール−４−イル）アミノヘキサン酸、スクシンイ ミジルＬＳＩ’−（Ｎ−メチル−Ｎ−（７−ニドロベンザー２−オキサ−１，３ −ジアゾール−４−イル）アミノドデカナート、７−ンエヂルアミノー３−（４ °−イソチオノアナトフェニル）−４−メチルクマリン（ＣＰ）、７−ヒトロキ ノクマリンー４−酢酸、７−ジメチルアミノ−クマリンー４−酢酸、スクシンイ ミジル７−ジメチルアミノクマリン−４−アセテート、７−メドキンクマリンー ４−酢酸、４−アセトアミド−４′−イソチオンアナトスチルベン−２，２°− ジスルホン酸（Ｓ　ＩＴＳ）、９−クロロアクリジン、スクシンイミジル３−（ ９−カルバゾール）−プロピオネート、スクシンイミジル１−ピレンブチレート 、スクシンイミジル１−ビレンノナノエート、ｐ−ニトロフェニル−１−ピレン ブチレート、９−アントラセンプロピオン酸、スクシンイミジルアントラセン− ９−プロピオネート、２−アントラセンスルホニルクロリド、または特定の方法 で処理すると蛍光を発する蛍光団前駆体。

リポータ−基は、当該技術分野で自体既知の常法により、ポリアミドに結合され る。例えば、１級アミン基のようなポリアミド上の核性基は蛍光または酵素リポ ータ−基と反応して、それらとの間に共有結合を形成することができる。また、 当該技術分野で自体既知の２機能性のカップリング試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ 　Ｃｈｅｗｉｃａｌ　Ｃｏ叩ａｎｙカタログ、１９８７に記載の試薬）を用いて リポータ−基をポリアミドに結合させることができる。

ビオチンは、常法によってポリアミド内に導入することができる。例えば、ＢＯ Ｐカップリング法［Ｃａ５ｔｒｏ、　Ｂら、　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　（１９７６ ）　ｐｐ、　７５１−７５２１を用いて誘導体化されていないビオチンをポリア ミドに導入することができる。別法によれば、ビオチンをＮ−ヒドロキシスクシ ンイミノル活性エステルとして導入することができる。さらに、例えばビオチニ ル化アミノ酸誘導体を用いて導入することができる。ビオチンは、リポータ−基 に結合したアビジンを用いて検出することができる。例えば、ビオチンと結合さ せるのに、ストレプトアビノン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用い ることができる。アルカリホスファターゼは適当な基質と反応し、視覚的に観察 し得る不溶性の二沈殿（ｄｉｐｒｃｃｉｐｉｔａｔｃ）を生成する。

酵素リポータ−基はβ−ガラクトンダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウレ アーゼ、アルカリホスファターゼ、デヒドロゲナーゼ、ルノフエラーゼおよび炭 酸デヒドラターゼなどから選択される。一般に、酵素は１またはそれ以上の基質 と反応し、変色、発光（ルミネッセンス）、または沈殿形成などの検出可能なシ グナルを生成する。

ポリアミドに含有させ得るリポータ−基の数は、本発明にとって重要ではな（、 例えば、１〜２０個またはそれ以上のリポータ−基をポリアミドに導入すること ができる。ポリアミド内のリポータ−基の配置は本発明にとって重要ではない。

例えば、アルキンアミノ基と離れたポリアミドの末端に単一のリポータ−基が存 在していても良い。別法によれば、アルキンアミノ基の近くにリポータ−基が存 在していても良い。さらに、複数のリポータ−基がポリアミドに沿って分布して いても良い。

オリゴヌクレオチドＮｕは適当な任意のヌクレオチド配列であってよいが、好ま しい１つの形は、以下の一般式で示される・［式中、Ｂは独立して、アデニル、 グアニル、チミニルまたはシトンニルから選択され、ｎは１〜約４００、より好 ましくは２〜約２００である］。

式■およびＴＩの糖残基化合物の５°ヒドロキシル部分から延びるオリゴヌクレ オチド配列Ｎｕは、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的とノ＼イブリダイゼーンヨンさせ、 さらにＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼのためのプライマーとして作用し得る、 任意の所望の配列および組成であって良い。オリゴヌクレオチドはデオキシリボ ヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキソおよびリボヌクレオチドの組合 せからなっていてよい。オリゴヌクレオチドは１〜４００ヌクレオチドまたはそ れ以上、好ましくは２〜２００ヌクレオチドを含有することができる。オリゴヌ クレオチドを適切に修飾して、ハイブリダイゼーションに影響を与えることなく インビボの半減期を増大させることができる。例えば、Ａｒｇａｗａｌら［Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８５　（１９８８）　ｐｐ、７０７９−７０８３）］または５ ｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４８@（１ ９８８）　ｐｐ、２６５９−２６８８１の方法に従い、リン骨格」二の１または それ以上の非架橋酸素を硫黄またはアミンで置換することにより、オリゴヌクレ オチドを修飾することができる。その様な、修飾されたオリゴヌクレオチドもオ リゴヌクレオチドという語句の範囲に包含される。「オリゴヌクレオチド」とい う語句は、単一のヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはチオキシリポヌクレオ チド）、またはりボヌクレオチド、チオキンリボヌクレオチドまたはその混合物 からなるポリヌクレオチドをも包含し得る。

以下の式（１） ％式％（） ［式中、各置換基は上記定義と同意義である］で示されるヌクレオチドポリマー コンジュゲートの一般的な製造方法は、以下の工程を包含する。

（１）以下の式（ＩＩＩ） ［式中、ＮＵＣ’は以下の式で示されるいずれかの基でありＸＩ、ＸｌおよびＸ ６は上記定義と同意義であり、Ｐｒ’およびＰｒ”は同一または異なっていてよ い保護基である］ で示される化合物を得： （２）Ｐｒ”を除去するかまたは除去しない条件下で化合物（ＩＩＩ）中のＰｒ ’を除去することによりペンダントアミノ基を脱保護し、次いで脱保護された化 合物を式：　Ｐｒ’Ｘ”Ｒ’（Ｘ”は先に記載した通りであり、Ｐｒ３は保護基 であり、Ｒ’は脱離基である）で示される化合物と反応させてＸｚをペンダント アミノ基に共有結合させて、以下の式で示される化合物を得：モして５−ＯＨ基 が遊離基である場合には、この基を所望によりＰｒ”［除去可能な保護基であり 、工程（１）におけるＰｒ”と同一または異なる］で再保護するか、またはＸｚ が結合である場合には工程（２）を省略し。

（３）工程（２）の化合物中のＰｒ３（またはＸｌが結合であるときにはＰｒ’ ）を除去することによりペンダントアミノ基を脱保護し、それを活性化アミノ酸 またはポリアミドと反応させて、Ｘ３の全てまたは一部を導入し、Ｘ３の一部の みが導入されたときには、次いで順に１またはそれ以上の活性化アミノ酸または ポリアミドを１回またはそれ以上の回数で通常のペプチド合成条件のもとで付加 し、化合物にＸ３の残りを付加して、以下に示す化合物を得：（４）予め脱保護 されていないときには工程（３）の化合物の糖部分の５−ＯＨ基を脱保護し、そ して脱保護されたＯＨ基を活性化ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと反応 させて５°−３゛結合を形成させ、次いで順に１またはそれ以上の活性化ヌクレ オチドを付加してオリゴヌクレオチド鎖を形成させて、Ｎｕを化合物に付加し、 そして （５）所望によりあらゆる残存の保護基を除去し、そして所望によりＸＩまたは Ｘ６がＯＲであってＲが固相マトリックスである場合の固相マトリックスから該 化合物を切断して、化合物（１）を得る。

式１およびＩＩの化合物のアミノおよびヒドロキシル基は、Ｇｒｅｅｎ［Ｐｒｏ ｔｅｃｔｉｎｇ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、 　Ｊｏｈｏｎ　Ｖｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、、　１９８１］が記載し ■■ うな適当な保護基で保護され得る。例えば、ヒドロキシ保護基は置換または非置 換アルカノイル（例、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチ リル、バレリル、ブロモアセチル、ジクロロアセチル、トリフルオロアセチル） 、置換または非置換アロイル（例、ベンゾイル、トルオイル、キシロイル、ニト ロベンゾイル、ブロモベンゾイル、サリシロイル）、アリールアルキル（例、ベ ンジル）、メチル、メトキン、メチルチオメチル、２−メトキンエトキシメチル 、ビス（２−クロロエトキ／）メチル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチ オピラニル、４−メトキノテトラヒドロピラニル、４−メトキンテトラヒドロチ オピラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、１−エトキシ エチル、１−メチル−１−メトキノエチル、２−（フェニルセレニル）エチル、 ｔ−ブチル、アリル、ベンノル、０−ニトロベンジル、トリフェニルメチル、α −ナフチルジフェニルメチル、ｐ−メトキンフェニルジフェニルメチル、９−（ ９−フェニル−１０−オキソ）アンスリル（Ｔｒｉｔｙｌｏｎｅ）、ジメトキシ トリチルまたはピキシル、トリメチルシリル、イソプロピルジメチルシリル、ｔ −ブチルジメチルシリル、トリイソブロピルンリルなどのアシルから選択される 。アミノ保護基はアシル特に有機アシル、例えば置換または非置換脂肪族炭化水 素オキシカルボニル、例えばアルコキンカルボニル（例、メトキンカルボニル、 エトキシカルボニル、プロポキンカルボニル、ブトキシカルボニル、ｔ−ブトキ シカルボニル、５−ベントキンカルボニル）、ハロアルコキシカルボニル（例、 クロロメトキンカルボニル、トリブロモエトキノカルボニル、トリクロロエトキ ンカルボニル）：アルカンーまたはアレーン−スルホニルアルコキンカルボニル ［例、２−（メシル）エトキシカルボニル、２−（ｐ−トルエンスルホニル）エ トキノカルボニル］；アルキルチオーオラリルチオアルコキシカルボニル（ａｌ ｋｙｌｔｈｉｏ−ｏｒａｒｙｌ　ｔｈｉｏａｌｋｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）［例 、２−（エチルチオ）−エトキンカルボニル、２−（ｐ−トルイルチオ）−エト キシカルボニル］、置換または非置換アルカノイル、例えばハロ（低級）アルカ ノイル（例、ホルミル、トリフルオロアセチル）：単環または融合環式の脂環式 オキシカルボニル（例、クロロへキ／ルオキシカルボニル、アダマンチルオキシ カルボニル、イソボルニルオキシカルボニル）：置換または非置換アルケニルオ キシカルボニル（例、アロイルオキシカルボニル）：置換または非置換アルキニ ルオキメシルボニル（例、１．１−ジメチルプロパルギルオキメシルボニル）： 置換または非置換アリールオキシカルポニル（例、フェノキシカルボニル、ｐ− メチルフェノキシカルボニル）、置換または非置換アリールアルコキシカルボニ ル［例、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロペンジルオキシ力ルポニル、ｐ −フェニルアゾベンジルオキシカルボニル、ｐ−（＋）−メトキシフェニルアゾ ）−ベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブ ロモベンジルオキシカルボニル、α−ナフチルメトキンカルボニル、ｐ−ビフェ ニルイソブ口ボキ７カルボニル、フルオレニルメトキノカルボニル］：置換また は非置換アレーンスルホニル（例、ベンゼンスルホニル、Ｉ）−トルエンスルホ ニル）：置換または非置換シアルキリホスホリル（例、ジメチルホスホリル）： Ｗ１換または非置換ジアラルキルホスホリル（例、０，０゛−ンベンジルホスホ リル）、置換または非置換アリ−ルオキシアルカノイル［例、フェノキンアセチ ル、ｐ−クロロフェノキノアセチル、２−ニトロフェノキンアセチル、２−メチ ル−２−（２−ニトロフェノキ／）プロピオニル］；ｆｉＩ換または非置換アリ ール（例、フェニル、トリル）；または置換またはＪｌｒＩ！換アラルキル（例 、ベンジル、ジフェニルメチル、トリチルまたはニトロベンジル）から選択され る。

特に好ましい保護基は４，４゛−ジメトキノトリチル、Ｆｍｏｃ、ＢＯＣおよび Ｐｉｘｙｌである。

上記の保護基には、以下においてｐ　ｒ　＋およびＰｒ”（またはＰｒ３）と称 するものも包含される。上記の保護基は、Ｘ５またはＸＳの保護にも使用できる 。

式１およびＩＩの化合物は、フレノウフラグメントなどのＤＮＡポリメラーゼま たはＲＮΔポリメラーゼ（Ｓｒ１またはＴ７ボリメラーゼなど）を用いる、鋳型 ヌクレオチド配列のｆｌｌｌ長に用い得る。本発明を限定するものではないが、 特に、式１またはＩＩの化合物をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いること ができる（Ｎｕで示される基のヌクレオチド配列は標的配列の一部と相補的であ るように選択される）。選択したオリゴヌクレオチド「プライマー」を、低温で 標的ＤＮＡの反対鎖−Ｌの相補性配列とアニーリングさせた後、熱安定性のポリ メラーゼを用いて３゛方向に伸長させることによって、遺伝子が増幅される。増 幅産物は、ポリアミド残基中に含有されるリポータ−基を介して容易に検出され る。例えば、蛍光性リポータ−基は、増幅産物に蛍光団の励起周波数範囲内の光 線を照射することにより、検出される。ビオチン含有リポータ−基は、アビジン との反応によって検出することができる。

本発明の化合物は基、Ｘ３またはＸＳを介して、支持マトリックスに結合させる ことができる。支持マトリックスは、例えば、アミノプロピル制御多孔性ガラス （ＡＰ−ＣＰＧ）のような制御ｉｔ（コントロール）多孔性ガラス、またはポリ スチレン樹脂であって良い。

本発明の化合物は、本明細書に記載した保護基を用いて完全に保護され、支持マ トリックスに結合され得るが、保護された形または完全に脱保護された形で支持 マトリックスから脱離される。

式（ＩＩ）　： １式中、ｘ２、ｘ３、ｘ５、Ｘ＠およびＮｕは上記定義と同意義である］で示さ れる化合物は、一般に、以下の方法で調製される（１）以下の式（ＩＩＩａ）二 ［式中、Ｘ′およびＸＳは上記定義と同意義であり、そしてＰｒ’およびＰｒ” は同一または異なっていてよい保護基である〕で示される化合物を得； （２）Ｐｒ２を除去するかまたは除去しない条件下で化合物（ＩＩＩａ）中のＰ ｒ’を除去することによりペンダントアミノ基を脱保護し、次いで脱保護された 化合物を式：　Ｐｒ”Ｘ”Ｒ’（Ｘ’は先に記載した通りであり、Ｐｒ３は保護 基であり、Ｒｏは脱離基である）で示されるアミノ酸と反応させてＸ２をペンダ ントアミノ基に共有結合させ、そして５−ＯＨ基が遊離基である場合には、この 基を所望により除去可能な保護基［工程（１）における保１１［基Ｐｒ”と同一 または異なっていてよい］で再保護するか、またはＸ２が結合である場合には工 程（２）を省略し。

（３）工程（２）の化合物中のＰｒ３（または、Ｘ２が結合であるときにはＰｒ ’）を除去することによりペンダントアミノ基を脱保護し、それを活性化アミノ 酸またはポリアミドと反応させてＸＳの全てまたは一部を導入し、ＸＳの一部の みが導入されたときには、次いで順に１またはそれ以上の活性化アミノ酸または ポリアミドを、１回またはそれ以上の回数で通常のペプチド合成条件のもとで付 加して化合物にＸＳの残りを１−１加し く４）予め脱保護されていないときには工程（３）の化合物の糖部分の５°−Ｏ １］基を脱保護し、そして脱保護されたＯ１ｌ基を活性化ヌクレオチドまたはオ リゴヌクレオチドと反応させて５’−３’結合を形成させ、次いで順に１または それ以」二の活性化ヌクレオチドをイ］加してオリゴヌクレオチド鎖を形成させ て、Ｎｕを化合物に付加し７そして （５）所望によりあらゆる残存の保護基を除去し、そして所望によりＸ５または ＸＳがＯＲであってＲが固相マトリックスである場合の固相マトリックスから該 化合物を切断して、化合物（ＩＩ）を得る。

式Ｉおよび０の化合物の合成において、ｘ２が結合である場合、工程（２）は、 所望による５’ＯＩＩ基の脱保護と共に未処置アミノ基を脱保護し、上記のよう に、脱保護したアミノ基をＸ２、次いでＸＳと反応させる、ただし、その各々は 、例えば、式（Ｉｌｌ）の化合物の保護または脱保護した５°ＯＨ基に付加する ことなくペンダントアミノ基にアミノ酸を共有結合的に結合させ得る、活性化ア ミノ酸またはペプチドである。また、式（ＩＩＩ）の化合物の５°Ｏｔ（基が遊 離基である場合、該基を所望により除去可能な保護基で再保護する。

ｘ３のポリアミド類は、例えば、固相ＦＩｌｏＣ法［Ａｔｈｃｒｔｏｎ、　Ｒお よび５ｈｅｐｐａｒｄ、　Ｒ，Ｃ。

（＋９８５）　Ｊ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　Ｃｏａ＋ｌ１ｕｎ、　、　ｐｐ、 　１６５−１６６１または同相Ｂｏｃ法［Ｂａｒａｎｙ、　f、および菖 ｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｒ，Ｂ、（Ｈ１８０）　５ｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｆ’ｃ ｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔ奄р■刀h、Ｖ。

１．２．　Ｅ、Ｇｒｏｓｓ　＆　Ｊ、Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ　Ｅｄｓ、、＾ｃａｄ ｃｓｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ、　１|２８４］で合 成することができる。これらの方法では、反応性部分を保護するために、アミノ 酸を当分野で自体既知の標準的な保護基［例えば、Ｇｒｅｅｎ（１９８１）　Ｐ ｒｏｔｅｃｔｉｎｇ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉ ｓ、　Ｊｏｈｏｎ　１ｉｌｃｙ　＆　５ｏｎｓ、Ｉｎｃ、、１９８１　；　Ａｔ ｈｃｒｔｏ獅■謔■T ｈｅｐｐａｒｄ　（１９８５）　Ｊ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　Ｃｏｍｍｕｎ、 　、　ｐｐ、　１６５−１６６　；　ＢａｒａｎｙおよびＭ■窒窒奄■奄■撃п @（前 掲）］を用いて保護する。

オリゴヌクレオチドＮｕは、固相ホスホトリエステル法［５ｐｒｏａｔおよびＧ ａ１ｔ　（１９８４）　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ 、＾Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　ｐｐ、８３−１１６．　ＩqＬ 　Ｐｒｅｓ ｓ、　０ｘｆｏｒｄコ、固相１１−ホスホネート法［Ｆｒｏｅｈｌｅｒら（１９ ８６）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１４．　ｐｐ、５３ ９９−５４０７１または固相ホスホルアミダイト法［ＢｃａｕｃａｇｅおよびＣ ａｒｕｔｈｅｒｓ　（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、　２２ ．　ｐｐ、１８５９−１８６２３によって合成することができる。これらの方法 の各々において、ヒドロキシまたはアミノ基のような反応性の基は、既述［Ｇｒ ｃｅｎ　（１９８１）　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａ ｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｊｏｈ盾■ ｆｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、、　１９８１　；　Ｂｅａｕｃａｇｅ、 Ｓ、ＬおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ、１１．　（１９８１j　Ｔｅｔｒａ ｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　、　２２．　ｐｐ、　１８５９−１８６２　；　５ ｐｒｏａｔ、　Ｓ、およびＧａ１ｔ、ＭＪ、（１９８４）　nｌｉｇｏｎｕｃ ｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、＾ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ 、　ｐｐ、　８３−１１６．　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘ■盾窒р■ の標準的なヒドロキシおよびアミノ保護基で保護されていて良い。

式（１１１）の化合物のＸＳまたはＸ＠の１つの基が固相マトリックスに結合し ていることが好ましい。最も好ましくは、基Ｘ＠が固相マトリックスに結合して いる。

マトリックスは、上記のように適当な反応性基を含むように活性化することがで きる。様々な異なる段階で、ポリアミドに１またはそれ以上のリポータ−基を導 入することができる。リポータ−基はポリアミド合成前にアミノ酸中に存在して いるか（第３工程）、ポリアミド合成後（第４工程）；オリゴヌクレオチド合成 後（第５工程）；あるいは脱保護およびオリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジ ュゲートの精製後のいずれかに導入することができる。方法の選択は、選択され たリポータ−基および合成法に依存する。

リポータ−基がペプチドおよびオリゴヌクレオチドのいずれの合成条件下でも安 定である場合、それを、誘導体化アミノ酸として、ポリアミド合成の最初から導 入することができる。もしそれがＤＮＡ合成の条件下では安定であるが、ペプチ ド合成の条件下では安定でない場合、ポリアミド合成の後に、それを導入するこ とができる。もしリポータ−基がペプチドまたはオリゴヌクレオチド鎖の組立て のいずれにおいても安定でないが、脱保護法には安定である場合、それを完全に 保護されたポリアミド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチ ド鎖の組立ての後に導入することができる。もし標識が本発明化合物の合成に用 いたどの条件下でも安定でない場合、精製され完全に脱保護されたポリアミド− オリゴヌクレオチドコンツユゲートとの液相反応において導入することができる 。

蛍光団は工程（３）〜（６）の任意の段階でオリゴヌクレオチド−ポリアミドコ ンジュゲートに導入することができる。ビオチンの場合も同様である。

酵素、およびコロイド状金、コロイド状銀、フェリチンまたはビオチン等のコロ イド性化合物は工程（３）〜（６）で導入することができる。

オリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲートのポリアミド部分は、生成した 検出可能なシグナルを増大し、その結果、検出を容易にする複数のリポータ−基 を含有していても良い。

コンジュゲートのポリアミド部分はリポータ−基が結合するためのビヒクルとし て機能するのみならず、ポリアミドを特定の細胞型、細胞位置に指向させる（タ ーゲット）か、またはオリゴヌクレオチドの細胞膜通過を向上させるためのアド レスマーカーとして作用する。ペプチド配列のアドレスラベル活性は良く確立さ れている［Ｖｅｒｎｅｒおよび５ｃｈａｔｚ　（１９８８）　５ｃｉｅｎｃｅ　 ２４１．　ｐｐ、　１３０７−１３１３；　Ｇｏｌｄｆａｒｂ■ （１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　３２２．　ｐｐ、６４１−６４４１゜例えば、細 胞表面受容体によって認識されるペプチド配列を選択することにより、そのペプ チド配列と結合したオリゴヌクレオチドは特定の型の細胞内に輸送され、そこで 生物学的効果を発揮することができる（例えばそれらがアンチセンスオリゴヌク レオチドである場合、ウィルス性または細胞性ＲＮＡの転写を阻害する）。

本発明の特に好ましい方法では、式（ＩＩＩａ）［式中、Ｐｒ’、Ｐｒ”、Ｘｓ およびＸｓは上記定義と同意義である］で示される化合物は３′−ヒドロキシ基 を介して固相支持体に結合している（即ち、Ｘ６はＯＲであり、Ｒは固相マトリ ックスである）。式　Ｐｒ３ＨＮＸ２ＣＯＲ”で示されるスペーサーまたはアミ ノ酸を、上記のように、脱保護されたペンダントアミノ基に付加した後、ペプチ ド合成の常法に従い、１またはそれ以上のアミノ酸基を連続的に付加することに より、ポリアミド鎖を付加する。

次いで、オリゴヌクレオチド鎖を式ＩＶの化合物の脱保護した５゛−ヒドロキシ 基に付加する。種々の保護基Ｐｒ’、Ｐｒ２およびＰｒ”は同一または異なって いて良く、前記の通りである。

図面の簡単な説明 図１は５′末端を標識したオリゴヌクレオチドのＰＡＧＥを示す。レーンＡおよ びＣは通常のオリゴヌクレオチド、そしてレーンＢはＡｈｘ−Ｌｙｓ（ビオチン ）−Ａ１ａペプチドを含有する２３量体コンジュゲートを示す。

図２は本発明化合物の製造の概略（反応式■）を示す。

図３は図２の反応物質を製造するための詳細な説明（反応式ｉｆ）を示す。

図４は本発明の好ましい化合物を製造するための詳細な説明（反応式ＩＩＩ）の 最初の部分を示す。

図５は図４の続きであり、反応式ＩＩＩの後半のさらに詳細な説明を示す。

図６は本発明のペプチド合成に用いた標識化アミノ酸の製造のさらに詳しい説明 を示す。

発明を実施するための様式 本発明の具体的な態様を、以下の限定のためのものではない実施例により説明す る。製造された化合物は、しばしば、図面の図２〜６に記載された参照番号で表 される。

３−アミノプロピン、５−ヨード−２′−チオキシウリジン、ビオチン、および ３−アミノプロピルトリエトキシシランはＳ　ｉｇｍａから購入した。Ｎ−（フ ルオレン−９−イルメトキン−カルボニルオキシ）スクシンイミド、Ｎ“−Ｆｍ ｏｃ−Ｌ−シラン、ペンタフルオロフェノール、ＤＣＣ，およびＦｍｏｃ−Ａｌ ａ−ＯＰｆｐはＡｕｓｐｃｐ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）から入手した。３−ニトロ ピリジン−２−スルフェニルクロリドはＫｏｋｕｓａｎ（東京）から入手した。

９−クロロ−９−フェニルキサンチンおよびテトラキス（トリフェニルホスフィ ン）パラジウム（０）はＡｌｄｒｉｃｈより調達した。

Ｎ−ヒドロキシスフノンイミドはＰｉｅｒｃｅから入手した。トリエチルアミン （ｐｕｒｊＳＳ級）、管理された細孔グラス（２００〜４００メツンユ、細孔サ イズ５００人、カタログ番号２７７２０）およびジイソプロピルカルボジイミド （ＤｒＣ）はＦｌｕｋａから購入した。ニンヒドリン検定の試薬はＡｐｐｌｉｅ ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ訃より調達した。ＤＭＦは減圧下で蒸留し、１４日以内に 使用した。ピリジンは大気圧下にＣａＨ２を用いて蒸留し、５人モレキュラーノ ーブを入れて保荏した。全ての他の試薬はさらに精製することなく使用した。薄 層クロマトグラフィーはＭｅｒｃｋ　Ｓ　Ｇ　−６０被覆済プラスチツクプレー トで実施し、フラッシュクロマトグラフィーはＭｅｒｃｋンリカゲル（ＳＧ−（ ３０，２３０〜２４０メツシユ）で実施した。９５％エタノール７１％酢酸７４ ％Ｈ，Ｏを再結晶溶媒として代用したことを除いて既述型のように、ビオチン− Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを調製した。Ｎ−Ｆｍｏｃ−εＡｈｘ −ＯＰＩ’ｐ”およびＮ−ＢＯＣ−３−７アミノプロピン３は文献の方法に従っ て調製した。

融点は電熱装置で測定し、補正はしなかった。ＮＭＲスペクトルはＪＥＯＬＧＸ −４００分光計で記録し、’Ｈ（７）観測を３９９．９ＭＨｚで、目Ｃｃ７）［ Ｍヲ９９．９８ＭＨｚで操作した。ＤＥＰＴ実験は１３５”Ｉ−１選択パルスで 実施した。ＤＱＦ−ＣＯ３Ｙ実験は、１６トランジ工ント／増分および３５６ｘ ２にデータマトリックスのデータ累積の相感受性モードで行った。ＩＫｘｌＫ最 終データマトリックスへの０充填および両方向の指数荷量関数の適用後、スペク トルを得た。

ＨＭＢＣ実験は、１２８トランジ工ント／増分および１２８ｘ２に粗データマト リックスの絶対吸収モーｐで行った。ｔ５次元における４回の０充填および両方 向の正弦鐘状の荷量関数の適用後にスペクトルを得た。この実験は”Ｃ−１−１ 値を８ｌ−１ｚと仮定して行った。ヌクレオノド３および４に用いた番号付与系 は反応式１に示されており、一方、化合物２２および２３の番号付与系は反応式 Ｉｖに示す通りである。Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　１６００ンリーズＦＴＩＲ を用い、ＫＢｒディスクを用いて、ＴＲスペクトルを記録した。０，１回Ｍ　Ｅ ＤＴＡ溶液に溶解した試料を用い、Ｖａｒｉａｎ　Ｃａｒｙ　１分光光度計でＵ Ｖスペクトルを記録した。ＢｅｃｋＩＩａｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　６３００アミノ酸 分析器でアミノ酸分析を実施した。緩衝液Δ（０，１Ｍ酢酸トリエチルアンモニ ウム、ｐＨ７，０）および緩衝液Ｂ（０，１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、３ ０％ＣＨ３ＣＮ、ｐＨ７，０）を用い、Ｐ　ｈｅｎｏｍｅｎｅｘ逆相Ｃ１８カラ ム（５０ＤＳ３０．５μｍ、細孔サイズ６０人）を用いる島原ＬＣ４Ａ装置でＨ ＰＬｃ分析を実施した。

元素分析はＣＭ　Ａ　Ｓ　Ｐ　ｔｙ、Ｌ　ｔｄ、　（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）から 入手した。高および低分解能ＦＡＢ１１ｔｊｉスヘクｔ−ルハ、ＦＡＢ［を装着 したＪＥＯＬ　ＤＸ−３００およびＪＥＯＬ　ＡＸ−５０５Ｈ装着で各々記録し た。高分解能測定の試料はポリエチレングリコール（６００）／チオールグリセ ロール／グリセロール／ＤＭＳＯマトリックスに、低分解能試料はチオグリセロ ールマトリックスに墾濁した。この両方のイオン化気体はＸｅであった。

試薬の合成 実施例１（ａ）　３−（フルオレン−９−イル−メトキンカルボニル）−アミド プロピン（９） ３−アミノプロピン（３５９μｌ、５．２５ｗｍｏｌ）を、０℃でＴＩ（Ｆ（８ ｍｌ）中のＮ−（フルオレン−９−イルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイ ミド（Ｆ　ｗｏｅ　Ｎ　ＨＳＸ１．６９ｇ、５．００−■ｏｌ）の溶液に滴下し 、２時間撹拌した。この溶液を室温まで温め、溶媒を真空下で除去した。この粗 残渣を酢酸エチル（１００＠ｌ）に溶解し、溶液をＨ２０（３ｘ３０醜ｌ）で洗 浄し、次いで乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ＋）。酢酸エチルからの再結晶によって無 色の針状物として９を得た（１．１１ｇ、８０％、融点１２９〜１３０℃）。

’ＨＮＭＲ（ｄｓ　ＤＭＳＯ）：δ３．１３（ｔ、ＩＨ，Ｈｌ、Ｊ＝２．３Ｈｚ ）、３゜８０（ｄｄ、２１１．　Ｈ３，Ｊ＝５．９．　２．５ｌ−１ｚ）、４． ２３（ｔ、ｉｌｌ、Ｆｍｏｃ　ＣＨ。

Ｊ＝６．８夏（ｚ）、４．３３（ｄ、２Ｈ，Ｆ＋＋ｏｃＣＨｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ ）、７．３３（ｄｄｄ。

２Ｈ，Ｆｗｏｃ　Ｈ２およびＨ７，Ｊ＝７．６．７．５．　１．２Ｈｚ）、７． ４１　（ｄｄｄ、　２＋−Ｉ　Ｆｍｏｃ　Ｈ３およびＨ６，Ｊ＝７．６．　７． ５．０．９Ｈｚ）、７．７１（ｄ、　２Ｈ。

ＦｍｏｃＨ２およびＨ８，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、７．８Ｈｔ、ＩＨ，ＮＨ，Ｊ＝５ ．９Ｈｚ）、７．９０（ｄ、２Ｈ，Ｆｍｏｃ　Ｈ４およびＨ５、Ｊ＝７．６Ｈｚ ）。

”ＣＮＭＲ（ｄ、−ＤＭＳＯ）：６２９．８（Ｃ３）、４６．６（Ｆｍｏｃ　Ｃ Ｈ，６５゜７　（Ｆ　ｍｏｃ　Ｃ）（ｔ）、７３．０Ｃ１）、８１．４（Ｃ２） 、１２０．１（Ｆｍｏｃ　Ｃ３およびＣ６）、１２５．２（Ｆ■ｏｃＣ２および Ｃ７）、１２７．１（Ｆ象ｏｃｃ４およびＣ５）、１２７．６（Ｆｗｏｃ　Ｃ１ およびＣ８）、１４０．７（Ｃ４ａおよびＣ４ｂ）、１４３、８（Ｆｍｏｃ　Ｃ ８ａおよびＣ９ａ）、１５５．９（Ｆｍｏｃ　Ｃｏ）。

Ｆ　Ａ　ＢＭＳ　ｍＨｚ　：　３００（Ｍ＋Ｎａ）、２７８（Ｍ＋Ｉ（）。

元素分析（Ｃ＋ａｌＬｓＮＯｉとして）：ｔＨＥｌｌ：Ｃ，７８，０；Ｈ，５， ４５；Ｎ、５．０５；実測値：Ｃ，７８，１：１．１．５．４５：Ｎ、５．０１ ゜ＤＭＦ（２０■ｌ）中の３−アミノプロピン（８５５ｔｌｌ、　１２．５ｍｍ ｏｌ）の撹拌溶液に、３−ニトロピリジン−２−スルフェニルクロリド（０，９ ４ｇ、５．Ｑ＋ｅｍｏｌ）を２等分して０．５時間かけて加えた。１．５時間後 、この反応混合物を酢酸エチル（５００１１１）に注ぎ入れ、Ｈ，Ｏ（３ｘ　２ ００＋ａｌ）で洗浄し、乾燥させ（ＮａｚＳ　０４）、溶媒を真空下で除去した 。ＭｅＯＨ／ＨｚＯからの再結晶によって赤い結晶とじて１０を得た（０．６５ ３ｇ、６２％、融点１０７〜９℃）。

ＩＨＮＭＲ（δ６−ＤＭＳＯ）　：δ３．１８（ｔ、　ＩＨ，Ｈｌ、　Ｊ＝２． ６Ｈｚ）、３゜７７（ｄｄ、２Ｈ，Ｈ３，Ｊ＝４．４．２．６Ｈｚ）、５．３４ （ｔ、　ＬＨ，ＮＨ，Ｊ＝４゜４Ｈｚ）、７．４７（ｄｄ、　ＩＨ，ＮＰＹＳ　 Ｈ５，Ｊ＝８．３．４．６Ｈｚ）、８．６１（ｄｄ、　ＩＨ，ＮＰＹＳ　Ｈ６， Ｊ＝８．４．１．５Ｈｚ）、８．９０（ｄｄ、　ＩＨ，ＮＰＹＳ　Ｈ４，Ｊ＝４ ．４．　１．５Ｈ２）。

１３ＣＮＭＲ（ｄ、−ＤＭＳＯ）：δ３０．７（Ｃ３）、７４．８（Ｃ１）、８ １．７（Ｃ２）、１２０．４（ＮＰＹＳ　Ｃ５）、１３４．３（ＮＰＹＳ　Ｃ４ ）、１３９．８（ＮＰＹＳ　Ｃ３）、１５４．１（ＮＰＹＳ　Ｃ６）、１６３． １（ＮＰＹＳ　Ｃ２）。

ＦＡＢＭＳ　ｍＨｚ：　２１０（Ｍ＋Ｈ）。

元素分析（Ｃ，Ｈ，Ｎ３０．Ｓとして１計算値、Ｃ１４５，９；Ｈ，３，３７； Ｎ、２０．１　；’ＡＪＩＩ：Ｃ，４５，７；Ｈ，３，３３；Ｎ、２０．１゜実 施例１（ｃ）　３−（９−フェニルキサンチン−９−イル）アミノプロピン（１ ２）９−クロロ−９−フェニルキサンチン（１４，７ｇ、５０■ｍｏｌ）溶液を 、２等分して、０．５時間かｌｔテＤＭＦ（１００ｍ１）中の３−アミノプロピ ン（８，６ｍｌ、１２５關ｏ１）の撹拌溶液に加えた。３時間後、ＭｅＯＨ（２ ０ｍｌ）を加えて、反応混合物を１５分間撹拌した。次いでこの混合物をジエチ ルエーテル（５００＠ｌ）中に抽出し、Ｈ２０（３ｘ　３００ｉ＋１）で洗浄し て、乾燥させ（ＮａｌＳ　０４）、溶媒を真空下で除去した。得られた黄色のオ イルを高真空下で乾燥させ（４時間）、次いで熱いジエチルエーテル（７０■ｌ ）に再溶解させた。この溶液を−２０”Ｃで２４時間保持し、次いで濾過して、 固体を水冷ヘキサン（２ｘ　５０１１１）で洗浄し、次いで水冷ジエチルエーテ ル（２ｘ　５０ｍ１）で洗浄して、無色粉末として１２を得た（１２．７ｇ、８ ２％、融点１１６〜８℃）。

ＩＨＮＭＲ（ｄ、−ＤＭＳＯ）：δ２．８６（ｄｄ、２Ｉ■、　■Ｉ３．　Ｊ＝ ７．３．　４．４Ｈｚ）、２．９９（ｔ、　ＩＨ，ｔｌｌ、　Ｊ＝２．旧（ｚ） 、４．ＯＨｔ、ＬＨ，ＮＨ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、　［３，９８−７，５０（ｍ、 １３Ｈ，ＰＫ　ＣＩ）。

１”ＣＮＭＲ（ｄｓ−ＤＭＳＯ）：δ３２．８（Ｃ３）、５９．７（Ｐｘ　Ｃ９ ）、７３．４（Ｃ１）、８２．７（Ｃ２）、１１６０．０および１２３．５（Ｐ ｘ　ＣＨ）、１２５．０（Ｐｘ　Ｃ８ａおよびＣ９ａ）、１２６．３．１２６． ４．１２８０．１２８．６．１２８．７（Ｐｘ　ＣＨ）、１４９．５（Ｐｘ　Ｃ １’）、１５０．７（Ｐｘ　Ｃ４ａおよびＣｌ０ａ）。

ＦＡ１３ＭＳ　ｍＨｚ　：　３１１（Ｍ＋）。

元素分析（Ｃ２ｄ（＋ｔＮＯとして） 計算値・Ｃ，８４，８；）七　５．５１；Ｎ、４．５０：実測値：Ｃ，８４，４ ；Ｈ，５，１３：Ｎ、４．３０゜実施例Ｈｄ）５−ヨード−５’−０−（９−フ ェニルキサンチン−９−イル）−２°−デオキシウリジン（７） ５−ヨード−２′−デオキシウリジン（Ｉ　ＤｔＪＸ３．５４ｇ、１０ｖｍｏｌ ）を乾燥ピリジン（３ｘ　２０ｍ１）と共蒸発させた。このＩＤＵを乾燥ピリジ ン（１５■ｌ）に再溶解し、９−フェニル−９−クロロキサンチン（３，８２ｇ 、１３ｍｍｏｌ）をこの撹拌溶液に２等分して０．５時間かけて加えた。１時間 後、ＭｅＯＨ（５ｍｌ）を加えて、溶液をさらに０５時間撹拌した。次いで溶媒 を真空下で除去し、残渣を１％Ｅｔ。

Ｎ／酢酸エチル溶液から再結晶させて無色結晶として７を得た（４．２７ｇ、７ ０％、融点２００〜２℃）。

ＩＬＩ　ＮＭＲ（ｄ、−ＤＭＳＯ）：δ２．２０（鋤、２Ｈ，Ｉ−＋２°）、２ ．９９（ｄｄ、ＩＨ。

１１５′、Ｊ＝１０．５．　４．２＋Ｉｚ）、３．１０（ｄｄ、ＩＨ，Ｈ５”、 Ｊ＝１０．５．　２゜７）（ｚ）、３．８５（ｍ、　ＩＨ，８４°）、４．１５ （ｓ、　Ｈ（、Ｈ３’）、５．２９（ｄ、ＩＨ。

３°ＯＨ，Ｊ＝４．２Ｈｚ）、６．０８（ｔ、　ＩＨ，ｌ−１１’、　Ｊ＝７． ０Ｈｚ）、７．１０−７．４２（＋＋、１３Ｈ，ＰＸ　ＣＨ）、　８．０８（ｓ 、ＩＨ，Ｈ６）。

”ＣＮＭＲ（ｄ、−ＤＭＳＯ）：δ４０．４（Ｃ２’）、６３．８（Ｃ５’）、 ６９．９（Ｃ５）、７１．０（Ｃ３°）、７５．６（Ｐｘ　Ｃ９）、８５．２（ Ｃ１’）、８５．９（Ｃ４’）、１１６３．１１６．４（Ｐｘ　ＣＨ）、１２２ ．３．１２２．４（ＰＸ　Ｃ８ａおよびＣ９ａ）、１２３８．１２４０．１２５ 訳１２６８．１２８．２．１２９３．１．２９．６９．１２９．７．１２９．７ ３（ｒ’ｘ　ＣＨ）、１４３．９（Ｃ６）、１４８４（ＰｘＣ１’）、１５０． ０（Ｃ２）、ｉ５０．５１．１５０．５８（Ｐｘ　Ｃ４ａおよびＣｌ０ａ）、１ ６０．６（Ｃ４）。

ＦＡＢＭＳ　ｍＨｚ：　６３３（Ｍ＋Ｎａつ。

元素分析（ＣｚｓＨｘｓＮｘＰｓｌとして）計算値：Ｃ，５５，１；Ｈ，３，８ １；Ｎ、４．５９；実測値・Ｃ，５５，０；Ｈ，３，８１；Ｎ、　４．５４゜実 施例Ｈｅ）　５−［３（−ｔｅｒｔ−プチルオキシカルポニルアミド）プロプ− １−イン−１−イル月−５°−０−（９−フェニルキサンチン−９−イル）−２ ゛−デオキシウリジン（３） ＤＭＦ（６ｍｌ）中のＩＨｌ、２２ｇ、２．００ｍｍ＋ｏｌ）の脱ガス（Ａｒ） 溶液に、Ｃｕ１（０，０７６ｇ１０．４０＋ａＩＩ＋ｏｌ）、Ｅｔ、Ｎ（５５８ μｌ、４　、　ＯＯｍｍｏｌ）、３−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミド プロビン”（０，９３２ｇ、　６．００ｍｍｏｌ）および（ＰｈｓＰ）４Ｐｄ０ （０，２３２ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を順次加え、この溶液を５時間撹拌した。

ＡＧＩＸ８（ＨＣＯｓ−）イオン交換樹脂（６Ｍ当量）をＭｅＯＨ（１０ｍｌ） およびＣＩ−１。

Ｃ１，（１０■ｌ）と共に加え、この混合物を３０分間撹拌した。この樹脂を濾 過して除き、溶媒を減圧下で除去した。この粗残渣を酢酸エチル（２００ｍｌ） に溶解させ、溶液をＨｚＯ（３ｘ　１００１１１）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ ＳＯ＋）、そして濾過した。

溶媒を除去した後、フラッシュンリ力ゲルクロマトグラフィ−（７０ｇンリカ、 ０〜１０％ＭｅＯＨ／ＣＩ’（ｚｃ］２）にかけ、次いでクロロホルム／ジエチ ルエーテルからの再結晶により無色結晶として３を得た（０．６０２ｇ、４７％ 、融点１５７〜１６０℃）。

’ＨＮＭＲ（ｄｏ　ＤＭＳＯ）：δ１．３５（ｓ、９Ｈ，Ｂｏｃ　ＣＨ，）、２ ．２５（ｍ。

２Ｈ，Ｈ２’）、３．００（ｄｄ、ｉｌｌ　Ｈ５’、Ｊ＝１０．５．　４．４Ｈ ｚ）、３．１２（ｄｄ、ＩＨ，Ｈ５”、Ｊ＝１０．４．　２．６Ｈｚ）、３．６ ９（＋＋、２Ｈ，Ｈ９）、３．９１（−、ＩＨ，８４°）、　４．　１　５（ｍ 、ＩＨ，Ｈ３’）、　５．３０（ｄ、　ＩＨ，３°ＯＨ，Ｊ＝４．２Ｈｚ）、６ ．０９（５，ＬＨ，Ｈ１’、Ｊ＝６．７Ｈｚ）、７．１０−７．４５（Ｌ１３Ｈ ，Ｐｘ　ＣＨ）、７．９６（ｓ、　ＩＨ，Ｉ−（６）。

”ＣＮＭＲ（ｄｓ　ＤＭＳＯ）：δ２８．２（Ｂｃｘ：　ＣＨｚ）、３０．０（ Ｃ９）、４０゜３（Ｃ２’）、６３．８（Ｃ５’）、７０．８（Ｃ３’）、７３ ．８（Ｃ８）、７５．５（Ｐｘ　Ｃ９）、７８．２（Ｂｏｃ　Ｃ）、８５．３（ Ｃ１’）、８５．９（Ｃ４°）、９０．１（Ｃ７）、９８．４（Ｃ５）、１１６ １．１　］、６．３（Ｐｘ　ＣＨ）、１２２．０（Ｐｘ　Ｃ８ａおＬびＣ９ａ） 、１２３９．１２４．０．１２５．８．１２６．７．１２８１．１２９．０゜１ ２９．１　、１２９．７（Ｐｘ　ＣＨ）、　１４２．９（Ｃ６）、　１４８．３ （Ｐｘ　Ｃ２）、　１４９．３（Ｃ１’）、１５０５．１５０．７（Ｐｘ　Ｃ４ ａおよびＣＩＱａ）、１５５．１（ＢｏｃＣＯ）、１６１．６（Ｃ４）。

ＦＡＢＭＳ　ｍ／ｚ：　６６０（Ｍ＋Ｎａ）。

元素分析（Ｃｓ　ｓ　ｌ−１ｓ　ｓ　Ｎ　ｓ　Ｏｓとして）訂＊値：　Ｃ，６７ ，８：Ｈ，５，５４；Ｎ、６．５９　；実測値：Ｃ，５７，７；比　５．６８； Ｎ、６．５４゜実施例１（ｆ） Ｆ　＊ｏｃ−ヌクレオ／ド１を類似の方法で！！＃製したが、持続的に混入して いる出発ヌクレオシド７のために分析純度まで精製できなかった。

１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ２）：　δ３１．２（Ｃ９）、４１．８（Ｃ２’）、４ ６．９（ＦｍｏｃＣ９）、６０．３（Ｃ５’）、６３．４（Ｃ８）、６６、４Ｃ ＦＩｏｏｃ　ＣＨＩ２）、７２．４（Ｃ３′）、１４．３（Ｐｘ　Ｃ９）、８６ ．０Ｃ１’）、８６．７（Ｃ４’）、８９．５（Ｃ７）、９９．４（Ｃ５）、１ １６．４（Ｐｘ　Ｃ１＋）、１１９．８（ＦＴＩｏｃ　Ｃ３およびＣ６）、１２ ２１．１２２．３（Ｐｘ　Ｃ８ａおよびＣ９ａ）、■２３７．１２３．８（Ｐｘ 　ＣＨ）、１２４．８（ＦＤＩＯＣＣ２およびＣ７）、１２６．２（Ｐｘ　ＣＨ ）、１２６．８５．１２６．９５（Ｆｍｏｃ　Ｃ４およびＣ５）、１２７．８（ Ｆｍｏｃ　Ｃ１およびＣ８）、１２９゜４．１２９．６（Ｐｘ　ＣＨ）、１４１ ．、１（Ｆｍｏｃ　Ｃ４ａおよびＣ４ｂ）、１４３２．１４３、６（Ｆｍｏｃ　 Ｃ８ａおよびＣ９ａ）、１４３．７（Ｃ６）、１４８．１（Ｃ２）、１４９、４ （Ｐｘ　Ｃ１’）、１５１．０６．１５１．１２（Ｐｘ　Ｃ４ａおよびＣ１０ａ ）、１５５、６（Ｆｍｏｃ　ＣＯ）、１６２．２５（Ｃ４）。

害ｍＢＲ１１（ｇ）　５−［３−（フェニルキサンチン−９−イルアミノ）プロ プ−１−イン−１−イル］−５’−０−（９−フェニル−キサンチン−９−イル ）−２°−チオキシウリジン（４） この方法は、粗残濱をＣ１１２ｃ１２（２’００ｍ１）に再溶解したことを除い て３の方法と同一であった。コノ溶液を１０　％ＮａＨＣ０３（２ｘ　１００Ｉ Ｉｌ＋）オ＝にヒＨｚｏ（１ｘ　１００ｍ１）で洗浄した。溶液を乾燥させた＊ 　（Ｎ　ａ　！　Ｓ　Ｏ４）、濾過し、溶媒を蒸発させて、フラノ／ニジリカゲ ルクロマトグラフィー（Ｏ〜５％ＭｅＯＨ／ＣＨｚＣ１ｇ、１％Ｅｔ３Ｎ）によ り淡黄褐色固体として４を得た（０．６０８ｇ、７６％）。その１部をＭｃＯＨ から再結晶させて分析純度にした［融点１５６〜８℃（分解）］。

ＩＨＮＭＲ（δ６−ＤＭＳＯ）　：δ２．２５（＋＋、　２Ｈ，Ｈ２°入２．５ ５（ｄｄ、　ｌｈ。

）（９ａ、Ｊ＝１６．３．　７．１５Ｈｚ）、２．６６（ｄｄ、ＩＨ，Ｈ９ｂ、 Ｊ＝１６．３゜７、１．４　Ｈｚ）、２．９５（ｄｄ、　ＩＨ，８５°、　Ｊ＝ １０．６．３．６７Ｈｚ）、３．０７（ｄｄ、ＩＨ，１１５”、Ｊ＝１０．４． 　２．３８Ｈ２）、３．５１（ｔ、ＩＨ，Ｎ９Ｈ，Ｊ＝７．２０．　ｆｉｚ）、 ３．９（ｍ、　Ｈｌ、　Ｈ４’）、４．２０ｍ、　ＩＨ，Ｈ３’）、５．３１（ ｄ。

ｌＨ，３°Ｏ１１，Ｊ＝４．０３１１ｚ）、６．１１（ｔ、　Ｉｌｌ、　Ｉｌｌ ’、　Ｊ＝６．７８Ｈｚ）、６．８５−７．４０（ｍ、２６Ｈ，ＮＰｘおよび０ ＰｘＣＨ）、８．０５（ｓ、　ｌＨ。

Ｈ６）、１１．６（ｂｒ　ｓ、　ｌｌ−１，１−１３）。

＋３ＣＮＭＲ（ｄｓ−ＤＭＳＯ）：　６ｉ３３．４（Ｃ９）、４０．８（Ｃ２° ）、５９．６（ＮＰｘＣ９）、６３．６（Ｃ５°）、７０．９（Ｃ３°）、７４ ．６（Ｃ８，７５，７（ＯＰＸＣ９）、８５．２（Ｃ１°）、８６．０（Ｃ４’ ）、９１．２（Ｃ７）、１１５．８６．１１５．９１．１１６．２１．１１６． ３０（ＮＰｘおよび０ＰｘＣＨ）、１．２２．１７および１．２２．２４、（Ｏ ＰＸ　Ｃ８ａおよびＣ９ａ）、１２３．５０．１２３．５４．１２３９２．１２ ４．０５（ＮＰｘおよび０Ｐｘ（ｊ−（）、１２４．６５．１２４．６８（ＮＰ ｘＣ１３ａおよびＣ９ａ）、１２５．７．１２６３．１２６．５．１２７．８． １２７．９．１２８．４６．１２８．５８．１２８．６８．１２８．７４．１２ ８．９８．１２９．２５．１２９．６４．１２９．７６（ＮＰｘおよびＯＰｘ　 ＣＨＩ）、１４２゜７（Ｃ６）、１４８．１（Ｃ２）、１４９．３（ＮＰｘおよ び０ＰｘＣ１’）、１５０．４．１５０．６１．１５０．６６．１５０．７５（ ＮＰＸおよびＯＰｘ　Ｃ４ａおよびＣｌ０ａ）、１６１．．６（Ｃ４）。

ＦＡＢＭＳ　ｍ／ｚ：　８１６（Ｍ＋Ｎａ）、７９４（Ｍ＋１．Ｉ）。

ＨＲ−ＦＡＢＭＳの正確な質量実測値７９４．２８７１、（Ｃｓ。Ｈｓ＋＋Ｎ５ Ｏｔ）＋［Ｉの計算値？９４．２８６８゜ ヂニルリ／ン、Ｆｍｏｃ　−Ｌｙｓ（ビオチン）−０１−１（２２）ＤＭＦ（７ ０ｍｌ）中のＥｔ３Ｎ（６９８７１１，５，００ｍｍｏｌ）の溶液を、ビオチン のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（３，４１ｇ、１０．　Ｏｍｍｏｌ ）とＮ’−Ｆｍｏｃ−リシン２Ｈ１，８４ｇ、５．００關ｏ１）の混合物に加え 、得られた混合物を６時間撹拌し、次いで濾過した。次に、冷ＨＣｌ水溶液（ｐ ｉ−１２，５００！１１）を加え、沈殿を濾過し、１ｉｃｋ水溶液（ｐｉ（２， ３ｘ　２００ｍ１）およびＨｔＯ（３ｘ　２００ｍ１）で洗浄した。この段階で 、残渣は大儀の水を含むことが分かり、従って凍結乾燥させて（４８時間）、綿 毛状の無色固体を得た［２．４１ｇ、　８１％、融点１８１〜２℃（分解）］。

’ＨＮＭＲ（ｄｓ−ＤＭＳＯ）：δ１．２０−１．４０（ｍ、　４Ｈ，Ｂｔｎ　 Ｈ７およびＬｙｓ　）Ｉδ）、１．５０　１．５２（ｓ、　６１１．　ＢｔｎＪ −１βおよびＢｉｎ　ＨＬｙｓ　Ｈδおよびｌｙｓ＋Ｉ７）、１．５２−１．６ ２（ｍ、２Ｈ，Ｌｙｓ　ＨＲ）、２．０３（ｔ、２Ｈ。

Ｂｔｎ　ｔｌα、Ｊ　＝７．３Ｈｚ）、２．５６（ｄ、ＬＨ，Ｂｔｎ　１（５ｂ 、Ｊ＝１２．５）１ｚ）、２．７９（＋：ｋ１．］、）（、ＢｔｎＪＩ５ａ、Ｊ ＝１２．４．５．Ｈｌ２）、３．００（ｍ、２Ｈ。

Ｌｙｓ　ｌ−（ε）、３．０６（ｍ、　１．１１．８ｔｎ　Ｈ２）、３．９（ｍ 、　ＩＨ，Ｌｙｓ　Ｈα）、４゜１（簡、ＩＨ，１３ｔｎ　Ｈ３）、４．１８− ４．３０（ｍ、４Ｈ，Ｂｔｎ　Ｈ４およびＦ　ｗｏｅＣＨ、およびＦ　ｍｏｃ　 Ｈ９）、６．３６（ｓ、ＩＩ（、Ｂｔｎ　Ｈｌｏ）、６．４２（ｓ、ＩＨ。

ＢｔｎＨ３’）、７．３２（ｄｄｄ、２１１　ＦＴＩｏｃ　）１２およびＨ７， Ｊ＝７．４．７．４゜１、ＩＨｚ）、７．４１（ｄｄ、２Ｈ，Ｆｍｏｃ　Ｈ３お よびｊ−（６，Ｊ＝７．２．　７．２Ｈｚ）、７．６１（ｄ、　１比Ｌｙｓ　Ｎ ’ｌ−Ｌ　Ｊ　＝　８．１　Ｈｚ）、７．７２（ｄ、　２Ｈ，Ｆｗｏｃ　Ｈｌお よびｌ！８．　Ｊ＝７．４Ｈｚ）、７．７６（ｔ、ＩＩｌ、　Ｌｙｓ　Ｎ’比　 Ｊ　＝　５．６　Ｈｚ）、７．８８（ｄ、２＋１．　Ｆｍｏｃ　＋＋４およびＨ ５，Ｊ　＝　７．　ｌＩ　Ｈｚ）。

１３ＣＮＭＲ（ｄｓ−ＤＭＳＯ）：　δ２３．１（Ｌｙｓ　Ｃ７）、２５．３（ Ｂｔｎ　Ｃｓ）、２８、０（Ｂｔｎ　Ｃｓ）、２８．２（Ｂｉｎ　Ｃ７）、２８ ．８（Ｌｙｓ　Ｃｓ）、３０．５（ＬｙｓＣａ）、　３５．２（＋３ｔｎ　Ｃα ）、　３８．２（Ｌｙｓ　Ｃε）、　３９．９（Ｂｔｎ　Ｃ５）、　４６７（Ｆ ｍｏｃＣ９）、５３．８（ＬｙｓＣａ）、５５．２（ＢｔｎＣ２）、５９．２（ ＢｔｎＣ４）、６１．０（Ｂｉｎ　Ｃ３）、６５．６（ＦＩＯＣＣ１＋２）、１ ２０．１（Ｆｍｏｃ　Ｃ３およびＣ６）、１２５．３（Ｆｍｏｃ　Ｃ２およびＣ ｙ）、１２７．１　（Ｆｍｏｃ　Ｃ４およびＣ５）、１．２７．７（ＦＴＩｏｃ 　Ｃ１およびＣ８）、１．４０．７（Ｆｍｏｃ　Ｃ４ａおよびＣ４ｂ）、１４３ ．７９．１４３．８４（Ｆｍｏｃ　Ｃ８ａおよびＣ９ａ）、１５６．２（Ｆｍｏ ｃＣＯ）、１６２．７（Ｂｔｎ　Ｃ２°）、１７　］、、　９（Ｂｔｎ　Ｃ１０ ）、１７４゜（Ｌｙｓ　ＣＣｈｔｌ）。

ＨＲ−ＦＡＢＭＳ＋７）正ｆｌな質量実測値５９５．２５６６、（Ｃ８４Ｈｓａ ＮｎＯｓＳ）＋Ｈ（７）計算１ａ５９５．２５９０゜Ｉ　Ｒ：　１７０２ｃ＋ｅ −’（Ｆｍｏｃ　Ｃｏおよびリシン（ＺＣＯ）、１６３８ｃｒ’（アミドＣｏ） 。

実施例１（Ｄ　Ｎ’−（フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−Ｎ’−ビ オチニルリシンペンタフルオロ−フェニルエステル、Ｆｍｏｃ　Ｌｙｓ（ビオチ ン）−０Ｐｆｐ（２３） ＤＭＦ（５ｍｌ）中のペンタフルオロフェノール（１，７５ｇ、９．２９ｍｍｏ ｌ）およびＤＣＣ（１，２７，６，３２＋ｗ＋ｏｌ）の溶液をＤＭＦ（４０ｍｌ ）中の２２（２，２１ｇ、　３゜７２市ｏ１）溶液に加え、混合物を１６時間撹 拌した。この無色沈殿を濾過して除き、廃棄した。この濾液を保持し、溶媒を真 空下で除去した後、トリチュレートし、ジエチルエーテル（４ｘ　１００１Ｉｌ ）で無色固体を得た。この固体を酢酸エチル／エタノール／酢酸（８０・１９： １）がら再結晶させて微細な無色結晶を得た［工、９０ｇ、６７％、融点１６２ 〜５℃（分解）］。

’ＨＮＭＲ（ｄｏ　ＤＭＳＯ）　：　６１．２３　１．３２（ｍ、２Ｈ，Ｔｂｈ 　ＩＩ　７）、１゜３８−１．５３（ｍ、６１１．　Ｂｔｎ　ＨＲおよびＢｔｎ ＨδおよびＬｙｓ　）ｌδ）、１ｌ５４−１６３（、２Ｈ，Ｌｙｓ　ＨＲ）、２ ．０４（ｔ、　２Ｈ，Ｂｔｎ　Ｈα、　Ｊ＝７．３Ｈｚ）、２．５５（ｄ、Ｉｌ ｌ　Ｂｔｎ　Ｈ５ｂ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ）、　２．７９（ｄｄ、ＩＨ，Ｂｔｎ　 Ｈ５ａ、Ｊ＝１２．５．　５．Ｈ（ｚ）、２．９８−３．０４（ｍ、２Ｈ，Ｌｙ ｓ　ＨＲ）、３．０５−３．　１．０（ｍ、　ＬＨ，Ｂｔｎ　１１２）、　４． ０９（ｍ、ＩＨ，Ｌｙｓ　αＨ）、　４．２０−４．３０（ｍ、２Ｈ，Ｂｔｎ　 Ｈ３およびＦｍｏｃＨ９）、４．３２−４．４２（＋＋、３Ｈ。

ＢｔｎＨ４およびＦＤＩＯＣＣＨ２）、６．３５（ｓ、ＩＨ，旧ｎ　Ｈｌｏ）、 ６．４２（ｓ、ＩＩｔ　Ｂｔｎ　Ｉ−（３’）、７．２８−７．３４（ｓ、２＋ １．　Ｆｍｏｃ　Ｈ２および）−（７）、７．４０（ｄｄ、２＋１．　Ｆｍｏｃ 　１１３およびＨ６，Ｊ＝７．５．　７．５Ｈｚ）、７．７０（ｄ、２Ｈ。

Ｆ　ｍｏｃ　ｌ−（１およびＨ８，Ｊ＝７．３Ｈｚ）、７．７７（５，ＩＨ，Ｌ ｙｓ　ＮεＨ，Ｊ＝５．７Ｈｚ）、７．８８（ｄ、２Ｈ，Ｆｍｏｃ　Ｈ４および Ｈ５，Ｊ　＝７．７Ｈｚ）、８，１２（ｄ、１１１．　Ｌｙｓ　Ｎ’Ｔ１．　Ｊ ＝７．３Ｈｚ）。

”ＣＮＭＲ（ｄｏ−ＤＭＳＯ）：δ２２．７（Ｌｙｓ　Ｃｙ）、２５．３（Ｂｔ ｎＣβ）、２８．１（Ｂｉｎ　Ｃａ）、２８．３（Ｂｔｎ　Ｃｙ）、２８．７（ Ｌｙｓ　Ｃａ）、２９．９（ＬｙｓＣβ）、３５．３（Ｂｔｎ　Ｃａ）、３８． １（Ｌｙｓ　（、り、３９．９（Ｂｔｎ　Ｃ５）、４６゜７（ＦｍｏｃＣ９）、 ５３．９（Ｌｙｓ　Ｃ（Ｚ）、５５．５（Ｂｔｎ　Ｃ２）、５９．２（Ｂｔｎ　 Ｃ４）、６１．１（、Ｂｔｎ　Ｃ３）、６５．９（Ｆｍｏｃ　ＣＨ２）、１２０ ．２（ＦｍｏｃＣ３およびＣ６）、１２５．２（Ｆｍｏｃ　Ｃ２およびＣ７）、 １２７．１（Ｆ＋ｏｏｃ　Ｃ４およびＣ５）、１２７．７（Ｆｍｏｃ　Ｃ１およ びＣ８）、１３６．５．　１３８．５．　１３９．０（２ｘｍ、Ｃ−ＣＦ）、１ ４０．８（Ｆｍｏｃ　Ｃ４ａおよびＣ４ｂ）、１４２．０（ＩＩ、Ｃ−ＣＦ）、 １４３．６８．１４３．　７１（Ｆｍｏｃ　Ｃ８ａおよびＣ９ａ）、１５６２（ Ｆｓｃｘ：Ｃｏ）、１（３２，７（ＢｔｎＣ２°）、１６９．２（ＬｙｓＣＯ） 、１７１．９（ＢｔｎＣｌｏ）。

ＨＲ−ＦΔＬ３ＭＳの正確な質量実測値７６１．２４１３、（Ｃ３７１−１３７ Ｎ　４０　ｅ　５Ｆｓ）＋ｔ１７）ｔｔ’Ｗ１１１７６１．２４３２゜Ｉ　Ｒ： 　１７８７ｃｍ−’（エステルＣｏ）、１７０２ｃａ＋−’（Ｆ＋ａｏｃ　Ｃｏ ）、１６４１ｃ１１（アミドＣｏ）。

実施例１（３２スクンニルーＣＰＧ樹脂（１６）の調製エタノール（６０ｍｌ） 中の３−アミノプロピルトリエ（・キシシラン（３ｇ、１３５　ｆｆ１ｍｏ＋　 ）溶液をＣＰＧ（２００〜４００メッシュ、細孔サイズ５００人、カタログ番号 ２７７２０）　ｌ　３　（６ｇ）に加え、混合物を６時間かけて一定の間隔で穏 やかに振盪した。この樹脂を重力濾過によって回収しくいかなる洗浄もしない） 、空気乾燥させ（２４時間）、１１０℃で保持しく２４時間）、アミノ化樹脂１ ４を得た。このアミノ含有量をニンヒドリン検定によって１２９μｍｏｌ／ｇと 決定した。ＤＭＦ中のＮ−Ｆｍｏｃ−εＡｈｘ−ＯＰｆｐ（２，５Ｍ当量）およ びＨＯＢＴ（２，５Ｍ当量）を焼結ガラスカラム中の１４にカップリングさせた （二重ノノンブリング、各反応１．５時間）。２またはそれ以上のアミノヘキサ ン酸残渣を１．５時間の単独カンプリングを用いて結合させ、樹脂１５を得た。

２０％ピペリジン／ＤＭＦによる処理（５分）によってＦ　ｍｏｃ基を開裂し、 樹脂をＤＭＦで洗浄して、次いで最少量の乾燥ピリジン中の無水コハク酸（５０ Ｍ当量）とＤＭＰ（１０Ｍ当量）の溶液を加えた。この墾濁液を１時間振盪した 後、樹脂をピリジン、ＤＭＦ、ＣＨｚＣｌｚですすぎ、真空下で乾燥させた。こ の反応をニンヒドリン検定によってモニターし、アミノ基の消失から算出したと きのカルボン酸基の含有量は４６μｍｏｌ／ｇであった。

実施例１（ｋ）スクンニルーＣＰＧ樹脂１６への修飾ヌクレオシド３および４の カップリング 樹脂１６を、最少量の乾燥ピリジン中の３または４（５Ｍ当量）、ジイソプロピ ルカルボンイミド（５Ｍ当量）およびＤＭＡＰ（（１，５Ｍ当量）の溶液で２回 処理した。二重カップリングの間に洗浄を１回だけ行い、１６時間ずつ独立して ２回カップリングを行った。２回目のカップリングの後、この樹脂をピリジンで すすぎ、ピキシル検定によって３９μｍｏｌ／Ｈのヌクレオノド含有量を得た。

Ｄａｍｈａ’の方法に従って、残存するカルボン酸およびアミノ基をピペリジン およびＡＣｚＯ／ＤＭＡＰで覆い、樹脂１８または１９を得た。

実施例１（１）　２０を得るための１８および１９の誘導体化１８の場合、樹脂 を９０％ＴＦＡ／エタンジチオールで１０分間処理し、ＣＨ。

Ｃ１，ですすぎ、次いで２０％Ｅｔ、Ｎ／ＣＨ２Ｃｌ２で中和した。次に、この 樹脂をＣＨ２Ｃ１２テｔ　ｔ　ｆ、乾燥サセ、そしてＤＭＦ中ノＦ＋ｏｃ−εＡ ｈｘ−ＯＰｆｐ／ＨＯＢＴの１＝１混合物で処理した（２．５Ｍ当量、４５分、 ２回）。ＤＭＦですすいだ後、この樹脂を最少量の乾燥ピリジン中の４．４゛− ジメトキントリチルクロリド（各回につきに５０Ｍ当量）と連続して２回、１６ 時間の反応に付し、樹脂２ｏを得た。トリチル検定によって３０μｍｏ１／ｇの ジメトキントリチル基の存在が示された。１９を誘導体化して２０を得る方法は 、３　！％　Ｄ　ＣＡ　／　Ｃｌ（ｘ　Ｃ１２ヲ９０　％　ＴＦＡ／エタンジチ オールの代わりに用いたことを除いて１８のための方法と同一である。

実施例Ｈｍ）　＋射脂２０上でのポリアミドおよびオリゴヌクレオチドの合成手 製のガラス焼結ペプチド合成セルにおいて、各々２３およびＮ′−ＦＩＩｏｃ− Ａｌａ−ＯＰｆｐを用いるＦ　ｍｏｃ固相ペプチド合成によって、ビオチニル化 り／ン残基およびアラニン残基を２０に結合させた。１時間のカップリング時間 および脱保護剤として２０％ピペリジン／ＤＭＦを用い、５倍過剰のアミノ酸ペ ンタフルオロフェニルエステルおよびＨＯＢ　Ｔを使用した。アラニンのα−ア ミノ基を脱保護し、乾燥ピリジン中のＡＣ２０（２５μｍ）およびＤＭＡ　Ｐ（ ０，０５０ｇ）で覆った（５時間）。Ｄ　Ｍ　Ｆ、　Ｃｌ（ｘ　Ｃ１！ですすぎ 、真空下で乾燥させた後、ｌｌ２ＩＩＩｏｌスケールで、標準β−ノジアエチル ー保護化ホスホルアミダイト（６０秒のＡ　Ｃ２０／　Ｄ　Ｍ　ＡＰ覆い工程２ を伴う）を使用するＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０ΔＤＮＡ合 成機３でのオリゴヌクレオチド合成において、樹脂の一部を用いた。合成された オリゴヌクレオチドの配列はＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴ ＊（Ｔ＊は修飾ヌクレオノドリンカ−である）であった。得られたコンジュゲー トを、濃アンモニア処理（２２℃、６時間）によって固体支持体から開裂した。

得られたコンジュゲートの溶液を５０℃で２４時間加熱し、塩基の脱保護を行っ た。アンモニアを減圧下で除去し、コンジュゲートをＱ、ＩＲＩＭ　ＥＤＴＡ（ ２耐）に溶解した。

調製用ＰＡＧＥ（１６％ポリアクリルアミドゲル）５による分離によって２つの 産物が示され、最も低い電気泳動移動性をもつ産物を精製して総数率２．１％で ５コンジユゲート５の試料の５′末端をγ−［”Ｐ］−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌ クレオチドキナーゼでラベルし、ＰＡＧＥ（１６％ポリアクリルアミドゲル）に よって均質であることが示された。Ｕ■スペクトルは２６Ｏｎ１１で最大吸収を 示した。

３、０！ｍｏｌ（２Ｇ　ＯｎｍのＵＶ吸収から算出した量）のコンジュゲートを アミノ酸含量について分析し、予想どおりに比率１０１■ｏｌΔｌａ　：　０． ９９ｍｏｌ　Ｌｙｓを示した。試料中に見い出されるペプチド量は２．５５！ｍ ｏｌでありだ。１ａｇの５（水２０μｌ中）をＰ１７クレアーゼ（５ａｇ、５μ ｌの０．０５Ｍ　Ｎａ０Ａｃ中、ｐＨ６，０）および０．５Ｍ　Ｎａ０Ａｃ（ｐ Ｈ６゜０．２μｍ）と３７℃で３０分間インキュベートした。得られた酵素分解 物を、６０分間の０〜１００％Ｂの直線勾配を用いる逆相Ｃ＋５ＨＰＬＣによっ て分析した。このＨＰ　Ｌ　Ｃプロフィールを手作業で積分してヌクレオチド比 率を得た：ｐｄＡ（４，６７）、ｐｄＧ（５，２１）、ｐｄＣ（４，８０）、ｐ ｄＴ（６，０５）、ｄＧ（１，２７）。予想比率・ｐｄΔ（５，ＯＯ）、ｐｄＧ （５，００）、−Ｃ（５，００）、ｐｄＴ（６，００）、ｄＧ（１，００）。

実施例１（ｏ）ニンヒドリン検定 これは、１００℃で７分間のインキュベート時間を指定した元の検定６の改良法 である。正確に計量した樹脂を、１１０℃で１０分間、７６％（Ｗ／Ｗ）フェノ ール／エタノール（パスツールピペットから４１１ｉｉ）、０．０００２Ｍ　フ ァン化カリウム／ピリノン（８ｍ）、および領２８Ｍニンヒドリン／エタノール （４滴）で処理した。６０％エタノール（３，８ｍ１）で希釈した後、吸収を５ ７０！ｍ（ε＝１．５０００Ｍ−’ｃ＋＋−りで測定した。

実施例１（ｐ）　ビキンルおよびトリチル検定正確に計量した樹脂を、室温で１ ０分間、１０％トルエンスルホン酸／アセトニトリル（３ｍｌ）で処理した。吸 収を、ビキノルについては４４５！ｍ（ε＝４４０ＱＭ”ｃｒ’）で、トリチル については５０７！ｍ（ε−６６５００Ｍ−’ｃｒりで測定した。

実施例１　（ｑ）　Ｆ　ｃｏｃ検定７ 正確に計量した樹脂を、室温で３０分間、ピペリジン（２００μｍ）およびＣＨ ＩＣＩ２（２００μｍ）で処理した。ｃＨ，ｃｉ□（３，６ｍ１）で希釈した後 、吸収を３０１！ｍ（ε＝７８００Ｍ−’ａｌｌ−’）で測定した。

（以下、余白） 実施例２　結果および議論 修飾ヌクレオシドの合成： オリゴヌクレオチドとポリアミドの間のリンカ−として働く修飾ヌクレオシド１ ．３および４は、市販品から入手可能な５−ヨード−２゛−デオキシウリジン（ ＩＤＵ）６から出発する３工程で合成した（反応式ＩＩ）。第一の工程は、３− アミノプロピンおよびＮ−（フルオレン−９−イルメトキシカルボニルオキシ） スクシンイミド、３−ニトロピリジン−２−スルフェニルクロリド（ＮＰＹＳＣ Ｉ）、ジーｔ−プチルノカルボネートおよび９−クロロ−９−フェニルキサンチ ン各々の反応による４つの異なるＮ−保護されたプロパルギルアミン９〜１２の 合成を含む。ＮＰＹＳ誘導体１０の場合には、効率的な反応のために塩基の存在 が必要であった。トリエチルアミンはＮＰＹＳＣ＋の核性置換を容易に行って第 四アンモニウム塩［（ＥｔｓＮ）Ｓ（Ｃ＄１１３ＮＯり］＋０１−を形成するこ とが見いだされ、ゆえに２５モル過剰の３−アミノプロピンを用いて塩基として 同様に作用させた。４つ全ての保護されたプロパルギルアミンを高収率で合成し た。

所望のアルキニルヌクレオシドの合成は２つの経路：ＩＤＵのＣ５への保護され たプロパルギルアミンの結合、次いで５゛−ヒドロキシルの保護およびこの逆に より試みた。保護されていないヌクレオシドへの保護されたアミノアルキンのＰ ｄ（０）−触媒化酸化的結合の結果、シリカゲルクロマトグラフィーにより分離 不可能な複合体混合物を生じた。９−クロロ−９−フェニルキサンチンを用いた ＤＭＰ−触媒化アルキル化によるＩＤＵの５°−ヒドロキシルの保護は５゛−保 護されたヌクレオノド７を高い収率および純度で与え、これを１ｌｏｂｂｓ＠の 方法に従い保護されたプロパルギルアミン９〜１２と結合させた。Ｆ　ｍｏｃ− 保護されたプロパルギルアミン９を用いた、保護されたヌクレオシド７の反応は 、所望の生成物１を非常に低い収率（３０％）で与えたが、これはおそらくトリ エチルアミンによる９の部分的脱保護によるものである。脱保護により生じる遊 離第一アミノ基は、パラジウム触媒とさらに配位結合し、結合反応を妨げるであ ろう８゜生成物１は、シリカゲルクロマトグラフィーにおいて広い範囲の溶離条 件下で出発物質と共溶離し、’Ｈおよび”ＣＮＭＲスペクトルの両方はこれが７ の少量を含有することを示した。７とＮＰＹＳ−保護されたプロパルギルアミン １０の間の結合反応は、複合体混合物を生じ、これはシリカゲルクロマトグラフ ィー、次いでＣ＋ｓ逆層ＨＰ　ＬＣによってのみ分離することができた。＋　） （および”ＣＮＭＲ分光学ならびにＦＡＢＭＳによるＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃ分画の分析 は、いずれも所望の生成物を含んでいないことを示した。対照的に、Ｂｏｃとピ キンル（ｐｉｘｙｌ）−保護されたプロパルギルアミン１１および１２の結合は 簡単であった。Ｂｏｃ−保護されたヌクレオシド３も出発ヌクレオシド７と共溶 離するが、それにもかかわらず生成物３は、有意な汚染量の７の不在により高収 率で単離することができた。ジビンル化（ｄｉｐｉｃｙｌａｔｅｄ）ヌクレオシ ド４の製造は、ＴＬＣ（５％ＭｅＯＨ／１％Ｅｔ、Ｎ／ＣＨ，Ｃ１□）によりモ ニターすることができ、反応は５時間後に完了したと判断された。この反応も高 収率を有していた。

アルキニルヌクレオシド３および４は非常に複雑な構造を有していたが、１−次 元的’Ｈおよび１３ｃ　ＮＭＲ分光学により十分な特性化を行うことができ、こ れは前者の化合物における多重線が良く分離され、後者のほとんどの共鳴が本発 明者らが既に報告している３類似化合物の共鳴に非常に厳密に対応するからであ る。

これらアルキニルヌクレオシドの”ＣＮＭＲスペクトルのかなり顕著な特徴は、 アルキニル第四炭素Ｃ８およびＣ７（番号付与系については反応式ｌを参照）各 々に対応するδ７３，８〜７４６およびδ９０．１〜９１．２領域における２つ の共鳴である。ＩＤＵにお＋Ｊるδ６９．９からδ９８．４〜９８．７への０５ の低磁場シフトは、ヨウ素原子に対する第四アルキニル炭素による置換と一致す る。他の全ての共鳴は提案されている３および４の構造と一致していた。

コンジュゲートの合成における次の段階は、ポリアミドおよびオリゴヌクレオチ ド合成のための固体支持体の誘導体化であった。制御化−多孔ガラス（ＣＰＧ） 樹脂は、ポリアミドおよびオリゴヌクレオチドの両方が効率的に合成されるのを 可能にする。通常のペプチド合成樹脂、例えばＰｅｐｓｙｎ　Ｋ’は、ＣＰＧよ り高い充填性を有するが、ボスポルアミダイト法による効率的なりＮＡ合成は不 可能であり、ゆえにＣＰＧが選択された固体支持体である。

ＤＮＡ合成のためのＣＰＧ樹脂の誘導体化は、ＣＰＧのアミノ化、次いでヌクレ オノドスクンネート活性エステ７１，１０との結合または通常ＤＣＣＩ６．１１ とのカルボッイミド結合により行われるのが普通である。Ｄａｍｈａら［Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒ哄Ｕ嬰埠、移、　ｐｐ、３８１３−３８２ １１は、１−（３°−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボンイミド（ ＤＥＣ）−介在縮合によるスクシニル化ＣＰＧ樹脂へのヌクレオシドの結合のた めの方法を最近開示した。この方法は、ヌクレオノド誘導体の別の溶液用操作を 不必要にするから、さらに好都合である。ＤＣＣに比較したＤＥＣの有効性は、 その比較的小さな立体要求性に帰するものであったＩＩ。これを考慮して、本発 明者らはジイソプロピルカルボンイミド（Ｄ　Ｉ　Ｃ）もＤＣＣより良いであろ うと予想した。ゆえに、通常のヌクレオシド、５゛−Ｏ−ジメトキシトリチル− Ｎ４−ベンゾイル−２゛−チオキシンチジン（ジメトキントリチル＝ジ（ｐ−メ トキシフェニル）フェニルメチル）を用いてＤＩＣとＤＣＣおよびＤＥＣとの比 較を行った。スクンニル化−ＣＰＧ樹脂をヌクオシド、ＤＭＡＰ（０，５モル当 量）および乾燥ピリジン中の適当な縮合剤で処理した。２４時間後、ヌクオシド 結合の０麿をトリデル検定により評価した。ヌクオシド含有量は、ＤＣＣ，ＤＥ ＣおよびＤＩＣの各々について２２．１８および３０μモルフｇであることが測 定され、これはＤＩＣが選択すべき縮合試薬であることを示した。

コンジュゲート合成のための固体支持体を、ＣＰＧ樹脂１３から出発する４工程 （反応式ＩＨ）で製造した。ＣＰＧを３−アミノプロピルトリエトキンシラン１ ２でアミン化し、次いで通常のＦ　ｖａｏｃ固相ペプチド合成法９を用いて３つ の６−アミノヘキサン酸スペーサー残基を結合し、樹脂１５を得た。３つのスペ ーサー単位の結合が、長鎖アルキルアミン（ＬＣＡＡ）ＣＰＧ１３と類似の方法 において、試薬に対する末端の用脂−結合性ヌクオツドの接近可能性の上昇より さらに効率的なオリゴヌクレオチド合成を可能にするであろうことが予想された 。アミン化崩脂１５を無水コハク酸によるＩ）ＭＡＰ−触媒化スクンニル化に供 して、樹脂１６を得た。スフノニル樹脂１６への適当なヌクオシドの結合を、Ｄ ＩＣ／ＤＭΔＰ−介在縮合により行い、あらゆる遊離カルボン酸および残存する アミン基をＤＣＣ／４−二トロフェノール／ピペリジンおよび無水酢酸／ＤＭＡ Ｐ処理の各々によりブロックした４゜ スクシニル樹脂１６へのＦ　ｍｏｃ−ヌクレオシド誘導体１の結合は問題を含ん でいた。ＤＭＡＰの使用は約３０μモル／ｇの十分なヌクレオシド含有量を達成 するために必要であるが、用いた濃度が２４時間でＦ　ｍｏｃ基の４５％の切断 をもたらすことを本発明者らは見いだした■４゜ＦＩｌＯＣ−ヌクレオシド１と スクシニル樹脂１６の間の２回連続の２４時間の結合反応の後に、Ｆｍｏｃおよ びビキシル検定の比較により、約半分のヌクレオシドがアミン脱保護を受け、ア ミド結合により樹脂におそらく結合されることを示唆した。この副産物は最終の 切断条件に安定であってゆえに固体支持体上に留まると予測されたので、該副産 物は所望のコンジュゲートの製造において干渉するとは予測されなかった。しか し、Ｆｍｏｃ−ヌクレオシド１で誘導体化された樹脂は一貫してコンジュゲート の非常に低い収率を与え、これについてはさらに検討を行なわなかった。

Ｂｏｃおよびビキンルヌクレオシド３および４は、上記の条件下で固体支持体１ ６に容易に結合し、ビキシル検定により評価したときに２２μモル／ｇおよび４ ０μモル／ｇの各々の含有量が得られた。Ｂｏｃおよびピキンル誘導体３および ４の両方は、効率的なオリゴヌクレオチド合成のための十分なヌクレオシド含有 量を与えたが、その容易な調製および必要とされる比較的穏やかな脱保護条件の ために後者が好ましい。

実施例３　ビオチニル化リシンシントン（Ｓｙｎｔｈｏｎ）　２３の製造既に、 本発明者らはりシン残基のε−アミノ基の脱保護後のポリアミド部分の球状ビオ チニル化によりビオチン残基をフンシュゲートに導入した１６゜このバッチ様式 でのアプローチは、ビオチンの配置の限られた制御を与え、そして１０個までの りシン残基を含む比較的大きなポリアミドにおいては、ビオチニル化反応は完結 するまで進まず、ビオチンの一様でない分布が生じるであろう。シントン２３（ 反応式■ｖ）は通常のＦｍｏｃペプチド合成を用いて非常に制御された様式でビ オチンの導入を可能にする。これはビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル エステルによるＮ’−Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ２１のビオチニル化、次いで ペンタフルオロフェノールを用いるＤＣＣ−介在縮合により２段階法において調 製される。

Ｎ’−Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（ビオチン）−ＯＨの合成は、Ｊａｃｏｂｓｏｎら Ｉにより報告されているが、この方法は大規模合成に対しては実際的でない。こ れは生成物が抽出工程のために用いられる溶媒中にわずかに可溶性であるにすぎ ず、活性エステル２３について本発明者らの全体収率が５４％であるのに比較し てＮ’−Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ−ＯＨから出発して４７％の収率を有するからで ある。さらに、元素分析（２，５当量の水および０５当量のＤＭＦを結晶化溶媒 として用いる）のみが特性化として与えられた嘗６゜ ペンタフルオロフェニルエステル２３は、その非常に複雑な’ＨＮＭＲスペクト ルおよび出発１ＩＩＩＩｌ酸２２に対するその”ＣＮＭＲスペクトルの類似性に より、特性化を行うのが困難であった。この活性エステルの”ＣＮＭＲスペクト ルにおける唯一の有意な差異は、リノンα−カルボニルの５　ｐｐｍの高磁場シ フトおよびペンタフルオロフェニル基による芳香族領域におけるある種の分離さ れない多重線の存在であった。遊離酸２２および活性エステル２３の両方の構造 に対してさらに決定的な証拠を提供するために、データ蓄積の相−感受性様式に おける二重量子フィルター化同核シフト相関実験（ＤＱＦＰｈ　Ｃ０３Ｙ）を２ ２について行い、異核多重結合結合性（ＨＭＢＣ）実験を２３について行った。

ビオチニル化リシン２２のＣ０３Ｙスペクトルにおける交差ピークは十分良（分 離されて、１次元ＩＨＮＭＲスペクトルにおける全ての多重線の明白な帰属を、 込み合ったメチレン領域における共鳴についてでさえ提供した。活性エステル２ ３のＨＭ　Ｂ　Ｃスペクトルは、α−カルボニルであることが仮帰属された６１ ６９．２の共鳴を除く全てのカルボニルとそれらの隣接プロトンの間の強い結合 性を示した。これは、あらゆるプロトンに対してこれら特定実験条件下でいかな る相関関係も有していなかった。しかし、カルボニル領域における４つの共鳴の うち３つについて明白な帰属を提供することにより、ＨＭＢＣ実験はδ１６９２ の共鳴かりシンα−カルボニルによるものであることを間接的に確認し、そして さらに基本的にＮ　’−Ｆ　ｓ。

ｃ−Ｌ　−Ｌ　ｙｓ−Ｏｒ＋およびビオチン１７のスペクトルの付加である残り の共鳴の帰属を確認した。さらに、２３のＩＲスペクトルは、エステルカルボニ ルに対応する１　７８７ｃ１１−’のバンド、１７０２ｃｒ’での２２のカルボ ン酸バンドからの有意なシフトを有する。

実施例４　オリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲートの合成初めにモデル 化合物５を合成して、ＰＣＲプライマーとしてのこれらの型のコンジュゲートの 効力を試験した。このコンジュゲートのポリアミド部分は、ＰＣＲ増幅産物の検 出のためのε−ビオチニル化リシン残基中、スペーサーとして６−アミノヘキサ ン酸残基（図２中、反応式りを含み、さらに参考アミノ酸としてアラニン残基を 含む。オリゴヌクレオチド部分は２３１ｅｒであり、これはλファージのＤＮＡ の７００塩基対領域を増幅する（この鋳型は制御反応のための通常のＣｅｔｕｓ 　ＰＣＲキットにより提供される）。

本発明者らが既に開示しているコンジュゲートの合成と同様に２．＋５、本発明 のコンジュゲートのポリアミド部分は最初に通常のＦｍｏｃ法９により上記の誘 導体化固体支持体上で合成するが、これはペプチド合成条件がＤＮＡ合成条件よ りも苛酷であるからである。誘導体化固体支持体１８および１９のペンダント（ ぶら下がり）アミノおよび５゛−ヒドロキシル基は、９０％ＴＦＡ／エタンジチ オールおよび３％Ｄ　ＣＡ　／　ＣＨｚ　Ｃ１ｘ各々による処理、次いで２０％ トリエチルアミン／ＣＨ，ＣＩ、での中性化により脱保護した。次いでこれらを Ｎ　−Ｆ　ｍｏｃ−５−アミノヘキサン酸ペンタフルオロフェニルエステル（Ｆ ■■−εＡｈｚ−ＯＰｆｐ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢ Ｔ）（各々２．５モル当量）の１：１混合物を用いて二重の（各々４５分間）結 合に供した。定性トリニトロベンゼンスルホン酸試験ｌは、最初の結合の終了点 でご（微量の遊離アミノ酸を示し゛、繰り返しの結合の後にいかなる遊離アミノ 基も示さなかった。５゛−ヒドロキシルの再保護は、ピリジン中の４，４°−ジ メトキシトリチルクロリドを用いた（Ｆｍｏｃ基の存在のために、触媒としてＤ ＭＰを有さない）トリチル化により行い、樹脂２０を得た。２回の連ａ２４時間 処理の後に樹脂のトリチル充填は、アシル化反応前に測定したヌクレオシド充填 に匹敵し、これはペンダントアミンで高度な選択性を有するアシル化が起こった ことを確認した。あらゆる残存遊離カルボン酸およびアミノ基を既に開示したよ うにブロックした。

５倍過剰のアミノ酸活性エステルおよびＨＯＢＴを使用する通常のＦｍｏｃ化学 により、ビオチニル化リシン・シントン２３およびＦ　ｍｏｃ−Ａ　１ａ−ＯＰ 　ｆｐを固体支持体２０に結合させた（反応式１１１）。２３の結合効率は、通 常のアラニン誘導体のものと類似しており、反応は１時間で完了した。この段階 での固体支持体のアミノ酸分析は、リシンおよびアラニン各々について２６およ び２３μモル／ｇの含有量を有する、リノン対アラニンの予測された比を与えた 。アラニンのＦ　ｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦで除去し、得られた遊離 アミノ基をＡｃｚＯ／ＤＭＡＰを用いた処理によりアセチル化した。

ポリアミドの合成後に、３％Ｄ　ＣＡ　／　ＣＨｚ　Ｃ１２を用いた脱トリチル 化により樹脂結合性ヌクレアーゼの５゛−ヒドロキシルを脱保護し、通常のβ− ンアノエチルホスホルアミダイト化学２．１ｆｉ、ｌ＊を用いてオリゴヌクレオ チドを合成した。トリチル検定により評価したオリゴヌクレオチドの繰り返し結 合収率は、通常の固体支持体を用いたＤＮＡ合成の収率に匹敵していた。固体支 持体からの切断、アンモニア処理によるホスフェートおよび塩基脱係ｖｉ２．ｌ ｆｉ、＋２は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により２つの主生 成物からなることが示された物質を与えた。比較的高い電気泳動移動度を有する 生成物は、いかなるペプチド性物質も含有していなかったが、低い方の移動度を 有する生成物は所望の組成のアミノ酸を含有していた。調製用ＰＡＧＥによる精 製の結果、所望のコンジュゲートの高い収率が得られた。

オリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲート５は、ＵＶ分光学、アミノ酸分 析、その構成しているヌクレオチドに対するヌクレアーゼ消化およびＰＡＧＥに より特性化した。そのＵＶ吸光度によるオリゴヌクレオチド部分の定量およびア ミノ酸分析によるポリアミド部分の定量は、オリゴヌクレオチド対ポリアミドの １２・１の比を与えた。さらに、アミノ酸の反応は予測した通りであり、ポリア ミド部分は無傷でオリゴヌクレオチド合成条件に対して安定であることを示唆し た。フンシュゲートをさらに放射活性ホスフェートを用いてλ−［”ＰＩ−ＡＴ ＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５°−末端ラベル化し、ＰＡＧＥ により分析し、得られたオートラジオダラム（図１）によりコンジュゲートの均 質性を確認した。このコンジュゲートをＰＣＲプライマーとして用いる予備実験 は、予測された長さの生成物を与えた。次いでこの生成物中のビオチンラベルの 化学発光検出は、このコンジュゲートが予測されたようにＰＣＲ産物中にｉ入さ れたことを明白に示した（データは他で報告されるであろう）。ゆえに、これら の型のコンジュゲートは生きたＰＣＲプライマーである。

実施例５　ＰＣＲ分析 実施例４のコンジュゲートを、最終濃度が１１００ｎ／μＬになるよう０．１曽 ＭＥＤＴＡ溶液に溶解した。オリゴヌクレオチド配列はＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴ ＧＴＣＣＧＴＡＣ＾＾ＣＴ本（Ｔ本＝ビオチニル化トリアミドを有する修飾デオ キシリジン）であり、オリゴヌクレオチドブライマーＧＧＴＴＡＴＣＧ＾＾＾Ｔ ＣＡＧＣＣＡＣ＾ＧＣＧと結合させた場合に、これを用いてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌ ｍｅｒ　Ｐ　ＣＲテストキットと共に供給されるバクテリオファージλ由来のｃ １８５７　ＤＮＡの５００ｂｐ領域７１３１−７６３０を増幅した。さらに通常 のオリゴヌクレオチドブライマー（３°−ヌクレオチドがＴである）を合成して 上記の方法で精製した。

各ＰＣＲ反応混合物は以下のものを含有していた：Ｔａｑポリメラーゼ溶液（２ ゜５Ｕ、Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液７５０％グリセロール中）（５μＬ）、各オ リゴヌクレオチドブライマー（１００ｎｇをオートクレーブ処理した蒸留水で５ ０μＬにして１滴のオートクレーブ処理した鉱油を加えた）（１μＬ）。全ての 反応は、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃ ｙｃｌｅｒ装置上で以下のサイクル：９５℃（１分）、５５℃（１分）、７２℃ （１分）、３０サイクル（完全な鎖伸長を確保するための７２℃で１０分間の段 階で終了する）を用いて行った。ＰＣＲ反応混合物（５μＬ）のゲル電気泳動は 、アガロースゲル（１，５％アガロース、０．００１％臭化エチジウム）上で１ ｘＴＢＥ緩衝液を用い、８０Ｖで１時間行った。アガロースゲルをサザン法によ りナイロン膜上にプロットした。次いでこの膜をＢＲＬ　Ｌｉｋｅ　Ｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ、から得たＰＨ０ＴＯＧＥＮＥキツトを用いてビオチン の存在について調べた。この検出は以下の方法で行う。

膜をトリス−緩衝食塩水（ＴＢＳ　Ｔｗｅｅｎ　２０）に浸し、次いで同じ緩衝 液中の３％ラウン清アルブミン中でブロックした後に、ＴＢＳ　Ｔｗｅｅｎ　２ ０で１：１０００に希釈したストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ） −アルカリホスファターゼコンジュゲート溶液（３Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭ　Ｍｇ Ｃｌ４．０．１ｍＭ　ＺｎＣ５，３０ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ７，６） 中１−ｇ／ｓ＋１）と共に膜を１０分間インキュベートした。膜をＴＢＳ　Ｔｖ ｅｅｎ　２０を用いて１５分間、’　Ｆｉｎａｌ　１ａｓｈｅｒ　Ｂｕｆｆｅｒ ’　（蒸留水で１．１０に希釈）を用いて室温で６０分間洗浄した後に、膜をプ ロットして過剰な緩衝液を除去した。次いでこれを現像ホルダーに入れ、製造者 により供給されたアルカリホスファターゼに対する化学発光基質で処理した。膜 を３時間暗所に保管し、次いでＸ線フィルムを上においた。３０秒の暴露の後に 強いシグナルが記録された。

臭化エチジウム−染色されたゲルのＵＶ視覚化は、コンジュゲートをプライマー の１つとして用いるＰＣＲが、通常のオリゴヌクレオチドブライマーのみを用い て行うＰＣＲに匹敵する量の増幅ＤＮＡを与えることを非常に明白に示した。

両ＰＣＲ産物は予測された長さを有していた。

増幅産物がビオチニル化コンジュゲートによるものであることを明白に証明する ために、アガロースゲル上の生成物を上記のようにナイロン膜中にプロットした 。この検出系は、化学発光を生じる脱リン酸化反応を順に触媒するストレプトア ビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートと固定化ビオチニル化ＤＮＡの 反応を含む。化学発光は、通常のＸ線フィルムへのプロットの暴露により検出さ れる。予測されたように、ビオチニル化コンジュゲートＰＣＲプライマーから生 じるＰＣＲｆｆｌ物に対応するビオチンを含有する唯一のバンドが存在した。こ れは、ビオチニル化プライマーがＲ終増幅産物に効果的に導入されることを明白 に示す。　化学発光検出は、この場合において唯一のビオチンを有するものでさ え、非常に感度が高い。強いシグナルはほんの３０秒の暴露時間後に生じ、５分 後にシグナル飽和が存在した。

参考文献 以下の参考文献はその全体が本明細書の一部を構成するものとする。

１、　Ｂｅｃｋｃｒ、Ｊ、Ｍ、　；　ｆｉｌｃｈｃｋ、Ｍ、、　Ｋａｔｃｈａｌ ｉｓｋｉ、Ｅ。、　Ｉ”ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃ堰@ＵＳ＾ １９７１、６８．２６０４−７゜ ２、　ｌｌａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ、　Ｊ、　：　Ｄｕｎｃａｎ、　Ｌ、　；＾ ｎｇｕｓ、に、　；　Ｔｒｃｇｅａｒ、Ｇ、　Ｗ、Ｎｕｃｌ■奄メ@Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ　＋９９０．１８．４９３−４９９゜３、　Ｈａｒａｌａｍｂ ｉｄｉｓ、Ｊ、　；　Ｃｈａｉ、Ｍ、　：　Ｔｒｅｇｅａｒ、Ｇ、、　Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒモ■@１９ｇ？。

１５、　４８５７−４８７６゜ ４　、　Ｄａ＊ｈａ０Ｍ、　Ｊ、　；　Ｇｉａｎｎａｒｉｓ、　Ｐ、＾、　；　 Ｚａｂａｒｙｌｏ、Ｓ、Ｖ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ刀@Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ １９９０、　１８．　３８１８−３８２１゜５　、　Ｐｅｎ５ｃｈｏｖ、　Ｊ、 　Ｐ、　；　Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ、　Ｊ、　；＾１ｄｒｅｄ、　Ｐ、　； 　Ｔｒｅｇｅａｒ、　ＧA　１．　： Ｃｏｇｈｌａｎ、Ｊ、Ｐ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 １９８６．　１２４．５３４−５４８゜６、　５ａｒｉｎ、Ｖ、に、；　Ｋｅｎ ｔ、Ｂ」、；　Ｔａｇ、Ｊ、Ｐ、；　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｒ，Ｂ、、＾ｎａ ｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅＩＩＩｉｓｔｒｙ、１９８１．　１１７．　１４７ −１５７；＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋ｓｓ　Ｉｎｃ、　Ｍｏｄｅｌ　 ４３０＾Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ　Ｕｓｅｒ’　５１１ａｎｕ ａ１．　Ｖｅｒｓｉｏｎ　］、３Ｂ、　ｐｐ、７−８５〜７−８６．　Ｊｕｌｙ 、１９８８゜７、Ｉｌｉｌｌｉｇｅｎ　９０５０１’ｅｐＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ｒ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｎｏｔｅ　３．１０．　ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐ ｏｒａｔｉｏｎ、１９８７゜ ８、　１ｌｏｂｂｓ　Ｊｒ、、Ｆ、ｆ、Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｃｍ、、１９８９．５ ４．３４２０−３４２２８９　＾ｔｈｅｒｔｏｎ、　Ｅ、　；　５ｈｅｐｐａｒ ｄ、　Ｒ，Ｃ，、ｒ固相ペプチド合成−実際のアプローチ」。

ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ：　０ｘｆｏｒｄ、１９８９゜１０、＾ｔｋｉｎｓｏｎ、Ｔ 、　；　Ｓｍ１ｔｈ、ｉｌ、　ｒオリゴヌクレオチド合成：実際（７）７ブロー チ」中。

Ｇａ１ｔ、Ｍ、Ｊ、１１；　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ：　０ｘｆｏｒｄ、　１９８４ ；　ｐｐ　３５−８１；＾ｄａｍｓ；Ｓ、Ｐ、　；　Ｋａｖｋａ、　Ｋ、Ｓ、　 ；　ｆｙｋｅｓ、　Ｅ、　Ｊ、　；　Ｉ（ｏｌｄｅｒ、ｓ、　Ｂ、　；　Ｇａ１ ｌｕ垂堰AＧ、　Ｒ，。

Ｊ、＾−、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、＋９８３．　１０５．　６６１−６６３゜１１、 　Ｐｏｎ、Ｒ，Ｔ、　；　Ｕｓｍａｎ、Ｎ、　；　０ｇ１ｌｖｉｅ、に、Ｘ、、 　Ｂｉｏ　ＴｅｃｈｎｉｑｕｅＳ　１９８８．６．７U８−７７５゜ ＋２．　Ｍａｔｔｅｕｃｃｊ、　Ｍ、　Ｄ、　；　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、 　Ｉｔ、　、　Ｊ、Ａ−、Ｃｈｃｍ、Ｓｏｃ、　１９８１．P０３．３１８５− ３１９１； １１ａｒａｌａ１ｍｉｄｉｓ、Ｊ、、　Ｉ’ｈＤ　Ｔｈｅｓｉｓ、　Ｕｎｉｖｅ ｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、　１９８４゜１３、　Ｇａｊｔ、Ｍ、 Ｊ、、　ｒオリゴヌクレオチド合成：実際のアプローチＪ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓ ｓ：０ｘｆｏｒｄ、　１９８４゜ １４、　Ｔａｇｇ、Ｇ、未公表結果。

１５、　Ｉｌａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ、　Ｊ、　；＾ｎｇｕｓ、　Ｋ、　；　ｌ ’ｏｖｎａｌ　１．　Ｓ、　；　Ｄｕｎｃａｎル、　；　Ｃ■≠堰A　Ｍ、　； Ｔｒｅｇｅａｒ、Ｇ、ｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　 １９９０．１８．５０１−５０５゜１６、　Ｊａｃｏｂｓｏｎ、に＾；　Ｕｋｅ ｎａ、Ｄ、　；　Ｐａｄｇｅｔｔ、ｆ、　：　Ｋｉｒｋ、に、Ｌ、　；　Ｄａｌ ｙ、Ｊ、Ｗ、。

Ｂｉｏｃｈｃｍｉｃａｌ　Ｉ”ｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　１９８７．３６．　１ ６９７−１７０７゜１７、Ｉｋｕｒａ、１１．：Ｋｕｎｉｏ、１１．、Ｏｒｇａ ｎｉｃＭａｇｎｃｔｉｃＲｃｓｏ口ａｎｃｃ１９８２．２０．２６［１−２７３ K １８、　Ｂｃｎｊａｍｉｎ、　Ｄ、　Ｍ、　；　１１ｃＣｏｒｍａｃｋ、　Ｊ、 　Ｊ、　；　Ｇｕｍｐ、　Ｄ、　１．　、＾ｎａｌｙｔｉｃ≠戟@Ｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ １９７３、　４５．　１５３１−１５３４゜１９、　Ｒｃａｕｃａｇｅ、Ｓ、Ｉ −、：　Ｃａｒｕｔｈｃｒｓ、１１．Ｉｌ、、　Ｔｃｔｒａｈｃｄｒｏｎ　Ｌｃ Ｌｊ、　１９８１．２２D１８５９−１８６２（１ ＢＣ レーンＡ：２４量体オリゴヌクレオチドレーンＢ：２３量体コンジュゲート レーンＣ：３０量体オリゴヌクレオチドＦ／（ｙ、　４ Ｆ／Ｃｙ、５ Ｆ／６．６ 国際調査報告　ｍ７ａＰＰ７Ｎ。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下の式（Ｉ）で示されるヌクレオチドポリマーコンジュゲート：Ｎｕ−Ｎ ＵＣ−Ｃ≡Ｃ−Ｘ１−ＮＨ−Ｘ２−Ｘ３（Ｉ）（式中、Ｘ１は非置換または置換 Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン基（１またはそれ以上の炭素が所望により−ＮＨ−、− Ｏ−、または−Ｓ−で置換されていてもよい）であり：Ｘ２は結合、または非置 換もしくは置換Ｃ∫〜Ｃ２０アルキレン基（１またはそれ以上の炭素が所望によ り−ＮＨ−、−Ｏ−、または−Ｓ−で置換されていてもよい）であり： Ｘ１またはＸ２における所望による置換基は、オキソ、アミノ、チオキソ、ヒド ロキシル、メルカプト、カルボキシル、ハロゲン、低級アルキル、フェニル、ア ミノー低級アルキル、エステルー低級アルキル、アミドー低級アルキル、エーテ ルー低級アルキルまたはチオエーテルー低級アルキル基、これら置換基の硫黄類 似体、または天然に存在するアミノ酸由来の側鎖置換基およびこれら側鎖の密接 に関連した類似体のうちの１またはそれ以上の基から選択され；Ｘ３はアミノ酸 またはカルボキシ末端で結合したポリアミドであり；ＮＵＣは、以下の式のいず れかで示されるヌクレオシド基であり：▲数式、化学式、表などがあります▼ 〔式中、→は式（Ｉ）における−Ｃ≡Ｃ−基への結合を示す］；そしてＸ４は以 下の式で示される糖基であり：▲数式、化学式、表などがあります▼ ［式中、５′酸素はＮｕに結合し、そしてＸ５およびＸ６は各々独立してＨまた はＯＲである（ＲはＨ、保護基または固相マトリックスである）］：そしてＮｕ はオリゴヌクレオチドであるＩ。 ２．Ｘ１がＣ１〜Ｃ３アルキレンであり、Ｘ２が−ＣＯ−（Ｃ１〜Ｃ９アルキレ ン）−ＮＨ−であり、Ｘ３がカルボキシ末端により結合したペプチドであり、Ｎ ＵＣが以下の式で示されるヌクレオシドであり： ▲数式、化学式、表などがあります▼ Ｘ４、Ｘ５およびＸ６は請求項１に記載した通りであり、そしてＮｕが以下の式 ：▲数式、化学式、表などがあります▼ （式中、Ｂは独立してアデニル、グアニル、チミニルまたはシトシニルから選択 され、ｎは１〜約４００である） で示される請求項１に記載のコンジュゲート。 ３．Ｘ１がメチレンであり、Ｘ２が−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−である請求項 ２に記載のコンジュゲート。 ４．以下の式で示される請求項１に記載のコンジユゲート：▲数式、化学式、表 などがあります▼ ［式中、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６およびＮｕは請求項１に記載した通りである］ 。 ５．Ｘ３が２〜１００アミノ酸からなるペプチドである請求項１に記載のコンジ ユゲート。 ６．Ｘ３が１またはそれ以上のリポーター基を含有するポリアミド鎖である請求 項１に記載のコンジュゲート。 ７．リポーター基が、鎖に存在するリシン基上のε−アミノ基により該鎖に結合 している請求項６に記載のコンジュゲート。 ８．Ｎｕの定義においてｎが２〜約２００である請求項２に記載のコンジュゲー ト。 ９．Ｘ５がＨであり、そしてＸ６がＯＲ（ＲはＨまたは固相マトリックス）であ る請求項１に記載のコンジュゲート。 １０．Ｒが制御された多孔ガラスまたはポリスチレン樹脂から選択される固相マ トリックスである請求項１に記載のコンジュゲート。 １１．以下の式（Ｉ）： Ｎｕ−ＮＵＣ−Ｃ≡Ｃ−Ｘ１−ＮＨ−Ｘ２−Ｘ３（Ｉ）［式中、Ｘ１は非置換ま たは置換Ｃ１〜Ｃｌ０アルキレン基（１またはそれ以上の炭素が所望により−Ｎ Ｈ−、−Ｏ−、または−Ｓ−で置換されていてもよい）であり：Ｘ２は結合、ま たは非置換もしくは置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキレン基（１またはそれ以上の炭素が 所望により−ＮＨ−、−Ｏ−、または−Ｓ−で置換されていてもよい）であり： Ｘ１またはＸ２における所望による置換基は、オキソ、アミノ、チオキソ、ヒド ロキシル、メルカプト、カルボキシル、ハロゲン、低級アルキル、フェニル、ア ミノー低級アルキル、エステルー低級アルキル、アミドー低級アルキル、エーテ ルー低級アルキルまたはチオエーテルー低級アルキル基、これら置換基の硫黄類 似体、または天然に存在するアミノ酸由来の側鎖置換基およびこれら側鎖の密接 に関連した類似体のうちの１またはそれ以上の基から選択され；Ｘ３はアミノ酸 またはカルボキシ末端で結合したポリアミドであり：ＮＵＣは、以下の式のいず れかで示されるヌクレオシド基であり：▲数式、化学式、表などがあります▼ 〔式中、→は式（Ｉ）における−Ｃ≡Ｃ−基への結合を示す］；そしてＸ４は以 下の式で示される糖基であり：▲数式、化学式、表などがあります▼ ［式中、５′酸素はＮｕに結合し、そしてＸ５およびＸ６は各々独立してＨまた はＯＲである（ＲはＨ、保護基または固相マトリックスである）］；そしてＮｕ はオリゴヌクレオチドであるＩ で示されるヌクレォチドポリマーコンジュゲートを製造する方法であって、以下 の工程からなる方法： （Ｉ）以下の式（ＩＩＩ）： ▲数式、化学式、表などがあります▼ ［式中、ＮＵＣ′は以下の式で示されるいずれかの基であり：▲数式、化学式、 表などがあります▼（１）▲数式、化学式、表などがあります▼（１）▲数式、 化学式、表などがあります▼（出）▲数式、化学式、表などがあります▼（μ） Ｘ１、Ｘ５およびＸ６は上記定義と同意義であり、Ｐｒ１およびＰｒ２は同−ま たは異なっていてよい保護基である］ で示される化合物を得； （２）Ｐｒ２を除去するかまたは除去しない条件下で化合物（ＩＩＩ）中のＰｒ １を除去することによりペンダントアミノ基を脱保護し、次いで脱保護された化 合物を式：Ｐｒ３Ｘ２Ｒ１（Ｘ２は上記定義と同意義であり、Ｐｒ３は保護基で あり、Ｒ１は脱離基である）で示される化合物と反応させてＸ２をペンダントア ミノ基に共有結合させて、以下の式で示される化合物を得▲数式、化学式、表な どがあります▼そして５′−ＯＨ基が遊離基である場合には、この基を所望によ りＰｒ２［除去可能な保護基であり、工程（１）におけるＰｒ２と同−または異 なる］で再保護するか、またはＸ２が結合である場合には工程（２）を省略し； （３）工程（２）の化合物中のＰｒ３（またはＸ１が結合であるときにはＰｒ１ ）を除去することによりペンダントアミノ基を脱保護し、それを活性化アミノ酸 またはポリアミドと反応させて、Ｘ３の全てまたは一部を導入し、Ｘ３の一部の みが導入されたときには、次いで順に１またはそれ以上の活性化アミノ酸または ポリアミドを１回またはそれ以上の回数で通常のペプチド合成条件のもとで付加 し、化合物にＸ３の残りを付加して、以下に示す化合物を得：▲数式、化学式、 表などがあります▼（４）予め脱保護されていないときには工程（３）の化合物 の糖部分の５′−ＯＨ基を脱保護し、そして脱保護されたＯＨ基を活性化ヌクレ オチドまたはオリゴヌクレオチドと反応させて５′−３′結合を形成させ、次い で順に１またはそれ以上の活性化ヌクレオチドを付加してオリゴヌクレオチド鎖 を形成させて、Ｎｕを化合物に付加し：そして （５）所望によりあらゆる残存の保護基を除去し、そして所望によりＸ５または Ｘ６がＯＲであってＲが固相マトリックスである場合の固相マトリックスから該 化合物を切断して、化合物（Ｉ）を得る。 １２．以下の式： ▲数式、化学式、表などがあります▼ ［式中、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６およびＮｕは請求項Ｉで定義した通りである］ で示されるヌクレオチドポリマーコンジユゲートを製造する方法であって、以下 の工程からなる方法： （１）以下の式（ＩＩＩａ）： ▲数式、化学式、表などがあります▼ ［式中、Ｘ５およびＸ６は上記定義と同意義であり、そしてＰｒ１およびＰｒ２ は同−または異なっていてよい保護基である］で示される化合物を得； （２）Ｐｒ２を除去するかまたは除去しない条件下で化合物（ＩＩＩａ）中のＰ ｒ１を除去することによりペンダントアミノ基を脱保護し、次いで脱保護された 化合物を式：Ｐｒ３×２Ｒ′（Ｘ２は上記定義と同意義であり、Ｐｒ３は保護基 であり、Ｒ１は脱離基である）で示されるアミノ酸と反応させてＸ２をペンダン トアミノ基に共有結合させ、そして５′−ＯＨ基が遊離基である場合には、この 基を所望により除去可能な保護基［工程（１）における保護基Ｐｒ２と同−また は異なっていてよい］で再保護するか、またはＸ２が結合である鳩合には工程（ ２）を省略し：（３）工程（２）の化合物中のＰｒ３（または、Ｘ２が結合であ るときにはＰｒ１）を除去することによりペンダントアミノ基を脱保護し、それ を活性化アミノ酸またはポリアミドと反応させてＸ３の全てまたは一部を導入し 、Ｘ３の一部のみが導入されたときには、次いで順に１またはそれ以上の活性化 アミノ酸またはポリアミドを、１回またはそれ以上の回数で通常のペプチド合成 条件のもとで付加して化合物にＸ３の残りを付加し： （４）予め脱保護されていないときには工程（３）の化合物の糖部分の５′−Ｏ Ｈ基を脱保護し、そして脱保護されたＯＨ基を活性化ヌクレオチドまたはオリゴ ヌクレオチドと反応させて５′−３′結合を形成させ、次いで順に１またはそれ 以上の活性化ヌクレオチドを付加してオリゴヌクレオチド鎖を形成させて、Ｎｕ を化合物に付加し：そして （５）所望によりあらゆる残存の保護基を除去し、そして所望によりＸ５または Ｘ６がＯＲであってＲが固相マトリックスである場合の固相マトリックスから該 化合物を切断して、化合物（ＩＩ）を得る。 １３．ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼのための基質としての請求項１に記載の コンジュゲートの使用。 １４．ラベル化ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとしての請求項１に 記載のコンジュゲートの使用。 １５．ラベル化ハイブリダイゼーシヨンプローブとしての請求項１に記載のコン ジュゲートの使用。 １６．病気の治療のための請求項１に記載のコンジュゲートの使用。 １７．動物または植物組織における特定のポリヌクレオチド集団の存在および位 置を測定する方法であって、以下の工程からなる方法：（ａ）調べようとする組 織の切片を調製し；（ｂ）組織切片を請求項１に記載のオリゴヌクレオチドポリ マーコンジュゲート（コンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は標的ポリヌク レオチドの一部に相補的である）とハイブリダイズさせ； （ｃ）ハイブリダイズしていないプローブ物質を組織切片から除去し；そして（ ｄ）コンジュゲートのハイブリダイゼーシヨンによるラベル化が起こった組織切 片中の位置を検出または同定する。 １８．支持マトリックスに固定化したかあるいは他の方法でそれに結合させたポ リヌクレオチドの検出方法であって、支持マトリックスを請求項１に記載のオリ ゴヌクレオチドポリマーコンジュゲート（コンジュゲートのオリゴヌクレオチド 部分は標的ポリヌクレオチドの一部に相補的である）と接触させ、次いで支持マ トリックスへのコンジュゲートのハイブリダイゼーションを検出することからな る方法。 １９．生物学的試料中の特定のウイルス性、細菌性または他のポリヌクレオチド の存在または非存在を検出する方法であって、該試料の核酸を、標的ポリヌクレ オチドの一部に相補的な請求項１に記載のオリゴヌクレオチドポリマーコンジュ ゲートと接触させ、次いでコンジュゲートのハイブリダイゼーションが起こった か否かを検出することからなる方法。 ２０．ウイルス性、細菌性または他の疾病を治療する方法であって、このような 治療を必要とする患者に、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドポリマーコンジ ュゲートの治療的有効量を投与することを特徴とし、さらに特定のポリヌクレオ チドの転写または翻訳がブロックされるようにコンジュゲートのオリゴヌクレオ チド部分が特定のウイルス性、細菌性または他のポリヌクレオチドに相補的なア ンチセンスオリゴヌクレオチドであることを特徴とする方法。 ２１．請求項１に記載のオリゴヌクレオチドポリマーコンジュゲート（コンジュ ゲートのオリゴヌクレオチド部分が所望のポリヌクレオチドの一部に相補的であ る）およびコンジュゲートのハイブリダイゼーシヨンを検出するための試薬を含 む、所望のポリヌクレオチドを検出するための診断キット。 ２２．動物または植物組織における特定のポリヌクレオチド集団の存在および位 置を測定する際に使用するための、組織切片調製用試薬をさらに含む請求項２１ に記載の診断キット。