JPH07505907A - オリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲート - Google Patents

オリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲート

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JPH07505907A JP50002993A JP50002993A JPH07505907A JP H07505907 A JPH07505907 A JP H07505907A JP 50002993 A JP50002993 A JP 50002993A JP 50002993 A JP50002993 A JP 50002993A JP H07505907 A JPH07505907 A JP H07505907A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 オリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲート技術分野 本発明は、好ましくは遊離の3°ヒドロキシ部分を有する新規なオリゴヌクレオ チド−ポリアミドコンジュゲート(ここに、ポリアミドはそのカルボキシ末端を 介してオリゴヌクレオチドと結合している)に関する。
背景技術 ヌクレオチド配列の検出またはヌクレオチド配列のリポータ−基(リポータ−グ ループ)による標識には、多くの分子生物学的な方法が関与している。例えば、 広範に用いられているポリメラーゼ連鎖反応技術(PCR)によって、極く僅か な標的分子から、1〜2時間の間に、生産が望まれるDNAの多量のコピーを得 ることができ、結果として、以前には感度が低いために制限されていた核酸検出 法が適用できるようになった。増幅されたPCR産物の検出は多くの方法で行い 得る。非放射能的に、例えば、増幅されたヌクレオチド配列中のリポータ−基を 用いて、増幅産物を検出し得ることが最も望ましい。
同様に、二ンクトランスレーンヨンのような反応では、後のハイブリダイゼーシ ョン生成物の検出のために、DNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼによ って製造された反応生成物に標識したヌクレオチドを組込むことが望ましい。
発明の開示 本発明は、その1つの態様において、以下の式(1)で示されるヌクレオチドポ リアミドコンジュゲートを提供するものである:Nu−NUC−C=C−X’− NH−Xl−X’ (I)(式中、Xlは非置換または置換C1〜C3゜アルキ レン基(1またはそれ以上の炭素が所望により−N1l−1−0−1または−8 −で置換されていてもよい)であり:X2は結合、または非置換もしくは置換C l−C26アルキレン基(1またはそれ以上の炭素が所望により−NH−1−0 −5または−8−で置換されていてもよい〕であり: XlまたはX2における所望による置換基は、オキソ、アミノ、チオキソ、ヒド ロキシル、メルカプト、カルボキシル、ハロゲン、低級アルキル、フェニル、ア ミノ−低級アルキル、エステル−低級アルキル、アミド−低級アルキル、エーテ ル−低級アルキルまたはチオエーテル−低級アルキル基、これら置換基の硫黄類 似体、または天然に存在するアミノ酸由来の側鎖置換基およびこれら側鎖の密接 に関連した類似体のうちの1またはそれ以上の基から選択され:X3はアミノ酸 またはカルホキ/末端で結合したポリアミドであり;NUCは、以下の式のいず れかで示されるヌクレオシド基であり:[式中、→は式(1)における−〇ミC −基への結合を示す]:そしてX4は以下の式で示される糖基であり・[式中、 5°酸素はNuに結合し、そしてXlおよびX6は各々独立してHまたはORで ある(RはH,保護基または固相マトリックスである)]、そしてNuはオリゴ ヌクレオチドである1゜ xlは非置換または置換CI−C,。アルキレン基(ここに、1またはそれ以上 の炭素が、−N +−(−1−〇−または−8−で置換されていてもよい)であ り、該Xlが置換されている場合の置換基は、オキソ、アミノ、チオキソ、ヒド ロキシル、メルカプト、カルボキシル、ハロゲン、低級アルキル、フェニル、ア ミノ−低級アルキル、エステル−低級アルキル、アミド−低級アルキル、エーテ ル−低級アルキル、またはチオエーテル−低級アルキル基などの置換基、これら 化合物の硫黄類似体、および任意の他の官能基から選択される1またはそれ以上 の置換基である。その他の可能な置換基は、例えば、天然に存在するアミノ酸の 側鎖置換基、およびそれらの側鎖と密接に関連した類似体である。好ましくは、 Cl−01゜アルキレンはC7〜C3アルキレンであり、それは所望により、ア ミド、ハロゲン、アリール、エステルなどの1またはそれ以上で置換されていて もよい。XIの好ましい形はメチレンである。
X2は結合、または非置換基または置換C9〜C2゜アルキレン基(ここに、1 またはそれ以上の炭素が、−NH−1−〇−または−8−で置換されていてもよ い)であり、該X2が置換されている場合の置換基は、例えば、オキソ、アミノ 、チオキソ、ヒドロキシル、メルカプト、カルボキシル、ハロゲン、低級アルキ ル、フェニル、アミノ−低級アルキル、エステル−低級アルキル、アミド−低級 アルキル、エーテル−低級アルキル、またはチオエーテル−低級アルキル基など の置換基、これら置換基の硫黄類似体、または天然に存在するアミノ酸のα−炭 素に結合している側鎖置換基、およびそれらの類似体から選択される1またはそ れ以上の置換基である。X2は、好ましくは−CO(Cl−Coアルキレン)− NH−(ここに、アルキレンは、さらに、例えば天然に存在するアミノ酸に結合 している置換基等によって置換されていてもよい)の形を有する。X2の好まし い形は−c。
(CHz)s N ■1−などである。
ポリアミド(X’)は、好ましくは2またはそれ以上のアミノ酸を含むポリペプ チドである。該ポリペプチドは1またはそれ以上のリポータ−基をも有すること が好ましい。また、このポリペプチドは1個のアミノ酸からなっていてもよい。
ヌクレオノド基NUCの1つの好ましい形は、式。
[式中、X4は上記定義と同意義である]で示されるmaを有する。糖残基X′ において、置換基X5およびX@はそれぞれ独立して[IまたはOR(ここに、 RはH1保護基または固相マトリックスである)であり、好ましくは、X3はH lそしてX6はOR(ここに、RはトIまたは支持マトリックスである)である 。
特に好ましい本発明の化合物は、式(II)[式中、X2、Xl、X5、X6お よびNuは上記定義と同意義である]で示される化合物群からなる。
基X3は基X2に共有結合的に結合しているポリアミドを表す。このポリアミド は、アミド結合またはいわゆるペプチド結合によって結合した、リジン、バリン 、グリシジ、セリン、スレオニン、チロノン、メチオニン、プロリンなどの天然 に存在するアミノ酸で形成されていて良い([liochemistry、第2 版、^1bert L、 Lehninger、 pp、72−77、1970 )。あるいは、ポリアミドは合成アミノ酸、即ち、タンパク胃中に天然には存在 しない合成アミノ酸で形成されていても良く、あるいは該ポリアミドは天然アミ ノ酸と合成アミノ酸との組合せで形成されていてもよい。
好ましくは、該合成アミノ酸は、一般式:1I2NcHR’cOO1l [式中 、R1は、直鎖または分枝鎖状の、飽和または不飽和の1またはそれ以上のオレ フィン性またはアセチレン性のC−C結合をflするc1〜c2゜アルキレンの 様な任意の有機部分であり、例えば、飽和または部分的に飽和であり、そして/ または、1またはそれ以上のへテロ原子あるいはそのようなヘヂロ原子を含有す る基(例、アミド基)が介在しており、モして/または、ハロゲン、ジアン、ア ミノまたは非置換または置換フェニルまたはベンジルで置換されていてもよく、 ンクロアルキルが例として挙げられる]で表されるα、ω−アミノーカルボン酸 を含んでいて良い。ポリアミドは、例えば1〜100アミノ酸の、任意の数のア ミノ酸単位(残基)を含有していてよい。
ポリアミド(X3)は、天然に存在するかまたは天然に存在しないアミノ酸を含 むペプチドを形成していてよい。ペプチドの配列は、抗体との相互作用、酵素反 応など任意の所望の適用に適するように設計することができる。
ポリアミドはリジンのような誘導体化されたアミノ酸を介してポリアミド鎖に結 合した1またはそれ以上のリポータ−基を含有していても良い。リポータ−基は 蛍光部分、化学発光部分、常磁性部分など、ビオチンおよびフェリチンのような コロイド性化合物またはコロイド状銀もしくは金、および酵素類を含有していて も良い。リポータ−基はポリアミド内の共有結合的に結合した、特にリジンの遊 離アミノ基を介して結合した、1またはそれ以上のアミノ酸であってよい。
蛍光団リポータ−基は以下のものから選択される。フルオレセイン−5−イソチ オシアナート、ジアシル(イソブチリル、アセチルまたはピバロイルなど)フル オレセイン−5および/または6カルボン酸ペンタフルオロフエニルエステル、 6−(ジアンルー5および/または6−カルボキンアミド−フルオレセイン)ア ミノ−ヘキサン酸ペンタフルオロフェニルエステル、テキサスレッド(Texa s Red。
Mo1ecular Probes、 Inc、の登録商1m1)、テトラメチ ルローダミン−5(および6)イソチオシアナート、オエンンーイソチオンアナ ート、エリスロンンー5−イソチオンアナート、4−クロロ−7−二トロベンザ ー2−オキサ−1,3−ジアゾール、4−フルオロ−7−ニドロベンザー2−オ キサ−1,3−シアシン、3−(7−ニドロベンザー2−オキサ−1,3−ジア ゾール−4−イル)メチルアミノ−プロピオニトリル、6−(7−ニドロベンザ ー2−オキサ−1,3−ノアゾール−4−イル)アミノヘキサン酸、スクシンイ ミジルLSI’−(N−メチル−N−(7−ニドロベンザー2−オキサ−1,3 −ジアゾール−4−イル)アミノドデカナート、7−ンエヂルアミノー3−(4 °−イソチオノアナトフェニル)−4−メチルクマリン(CP)、7−ヒトロキ ノクマリンー4−酢酸、7−ジメチルアミノ−クマリンー4−酢酸、スクシンイ ミジル7−ジメチルアミノクマリン−4−アセテート、7−メドキンクマリンー 4−酢酸、4−アセトアミド−4′−イソチオンアナトスチルベン−2,2°− ジスルホン酸(S ITS)、9−クロロアクリジン、スクシンイミジル3−( 9−カルバゾール)−プロピオネート、スクシンイミジル1−ピレンブチレート 、スクシンイミジル1−ビレンノナノエート、p−ニトロフェニル−1−ピレン ブチレート、9−アントラセンプロピオン酸、スクシンイミジルアントラセン− 9−プロピオネート、2−アントラセンスルホニルクロリド、または特定の方法 で処理すると蛍光を発する蛍光団前駆体。
リポータ−基は、当該技術分野で自体既知の常法により、ポリアミドに結合され る。例えば、1級アミン基のようなポリアミド上の核性基は蛍光または酵素リポ ータ−基と反応して、それらとの間に共有結合を形成することができる。また、 当該技術分野で自体既知の2機能性のカップリング試薬(例えば、Pierce  Chewical Co叩anyカタログ、1987に記載の試薬)を用いて リポータ−基をポリアミドに結合させることができる。
ビオチンは、常法によってポリアミド内に導入することができる。例えば、BO Pカップリング法[Ca5tro、 Bら、 5ynthesis (1976 ) pp、 751−7521を用いて誘導体化されていないビオチンをポリア ミドに導入することができる。別法によれば、ビオチンをN−ヒドロキシスクシ ンイミノル活性エステルとして導入することができる。さらに、例えばビオチニ ル化アミノ酸誘導体を用いて導入することができる。ビオチンは、リポータ−基 に結合したアビジンを用いて検出することができる。例えば、ビオチンと結合さ せるのに、ストレプトアビノン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用い ることができる。アルカリホスファターゼは適当な基質と反応し、視覚的に観察 し得る不溶性の二沈殿(diprccipitatc)を生成する。
酵素リポータ−基はβ−ガラクトンダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウレ アーゼ、アルカリホスファターゼ、デヒドロゲナーゼ、ルノフエラーゼおよび炭 酸デヒドラターゼなどから選択される。一般に、酵素は1またはそれ以上の基質 と反応し、変色、発光(ルミネッセンス)、または沈殿形成などの検出可能なシ グナルを生成する。
ポリアミドに含有させ得るリポータ−基の数は、本発明にとって重要ではな(、 例えば、1〜20個またはそれ以上のリポータ−基をポリアミドに導入すること ができる。ポリアミド内のリポータ−基の配置は本発明にとって重要ではない。
例えば、アルキンアミノ基と離れたポリアミドの末端に単一のリポータ−基が存 在していても良い。別法によれば、アルキンアミノ基の近くにリポータ−基が存 在していても良い。さらに、複数のリポータ−基がポリアミドに沿って分布して いても良い。
オリゴヌクレオチドNuは適当な任意のヌクレオチド配列であってよいが、好ま しい1つの形は、以下の一般式で示される・[式中、Bは独立して、アデニル、 グアニル、チミニルまたはシトンニルから選択され、nは1〜約400、より好 ましくは2〜約200である]。
式■およびTIの糖残基化合物の5°ヒドロキシル部分から延びるオリゴヌクレ オチド配列Nuは、DNAまたはRNA標的とノ\イブリダイゼーンヨンさせ、 さらにDNAまたはRNAポリメラーゼのためのプライマーとして作用し得る、 任意の所望の配列および組成であって良い。オリゴヌクレオチドはデオキシリボ ヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキソおよびリボヌクレオチドの組合 せからなっていてよい。オリゴヌクレオチドは1〜400ヌクレオチドまたはそ れ以上、好ましくは2〜200ヌクレオチドを含有することができる。オリゴヌ クレオチドを適切に修飾して、ハイブリダイゼーションに影響を与えることなく インビボの半減期を増大させることができる。例えば、Argawalら[Pr oc、 Natl、^cad。
Sci、 US^85 (1988) pp、7079−7083)]または5 teinおよびCohen[Cancer Res、 48@(1 988) pp、2659−26881の方法に従い、リン骨格」二の1または それ以上の非架橋酸素を硫黄またはアミンで置換することにより、オリゴヌクレ オチドを修飾することができる。その様な、修飾されたオリゴヌクレオチドもオ リゴヌクレオチドという語句の範囲に包含される。「オリゴヌクレオチド」とい う語句は、単一のヌクレオチド(リボヌクレオチドまたはチオキシリポヌクレオ チド)、またはりボヌクレオチド、チオキンリボヌクレオチドまたはその混合物 からなるポリヌクレオチドをも包含し得る。
以下の式(1) %式%() [式中、各置換基は上記定義と同意義である]で示されるヌクレオチドポリマー コンジュゲートの一般的な製造方法は、以下の工程を包含する。
(1)以下の式(III) [式中、NUC’は以下の式で示されるいずれかの基でありXI、XlおよびX 6は上記定義と同意義であり、Pr’およびPr”は同一または異なっていてよ い保護基である] で示される化合物を得: (2)Pr”を除去するかまたは除去しない条件下で化合物(III)中のPr ’を除去することによりペンダントアミノ基を脱保護し、次いで脱保護された化 合物を式: Pr’X”R’(X”は先に記載した通りであり、Pr3は保護基 であり、R’は脱離基である)で示される化合物と反応させてXzをペンダント アミノ基に共有結合させて、以下の式で示される化合物を得:モして5−OH基 が遊離基である場合には、この基を所望によりPr”[除去可能な保護基であり 、工程(1)におけるPr”と同一または異なる]で再保護するか、またはXz が結合である場合には工程(2)を省略し。
(3)工程(2)の化合物中のPr3(またはXlが結合であるときにはPr’ )を除去することによりペンダントアミノ基を脱保護し、それを活性化アミノ酸 またはポリアミドと反応させて、X3の全てまたは一部を導入し、X3の一部の みが導入されたときには、次いで順に1またはそれ以上の活性化アミノ酸または ポリアミドを1回またはそれ以上の回数で通常のペプチド合成条件のもとで付加 し、化合物にX3の残りを付加して、以下に示す化合物を得:(4)予め脱保護 されていないときには工程(3)の化合物の糖部分の5−OH基を脱保護し、そ して脱保護されたOH基を活性化ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと反応 させて5°−3゛結合を形成させ、次いで順に1またはそれ以上の活性化ヌクレ オチドを付加してオリゴヌクレオチド鎖を形成させて、Nuを化合物に付加し、 そして (5)所望によりあらゆる残存の保護基を除去し、そして所望によりXIまたは X6がORであってRが固相マトリックスである場合の固相マトリックスから該 化合物を切断して、化合物(1)を得る。
式1およびIIの化合物のアミノおよびヒドロキシル基は、Green[Pro tecting Groups in Organic 5ynthesis、  Johon Viley & 5ons、 Inc、、 1981]が記載し ■■ うな適当な保護基で保護され得る。例えば、ヒドロキシ保護基は置換または非置 換アルカノイル(例、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチ リル、バレリル、ブロモアセチル、ジクロロアセチル、トリフルオロアセチル) 、置換または非置換アロイル(例、ベンゾイル、トルオイル、キシロイル、ニト ロベンゾイル、ブロモベンゾイル、サリシロイル)、アリールアルキル(例、ベ ンジル)、メチル、メトキン、メチルチオメチル、2−メトキンエトキシメチル 、ビス(2−クロロエトキ/)メチル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチ オピラニル、4−メトキノテトラヒドロピラニル、4−メトキンテトラヒドロチ オピラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、1−エトキシ エチル、1−メチル−1−メトキノエチル、2−(フェニルセレニル)エチル、 t−ブチル、アリル、ベンノル、0−ニトロベンジル、トリフェニルメチル、α −ナフチルジフェニルメチル、p−メトキンフェニルジフェニルメチル、9−( 9−フェニル−10−オキソ)アンスリル(Tritylone)、ジメトキシ トリチルまたはピキシル、トリメチルシリル、イソプロピルジメチルシリル、t −ブチルジメチルシリル、トリイソブロピルンリルなどのアシルから選択される 。アミノ保護基はアシル特に有機アシル、例えば置換または非置換脂肪族炭化水 素オキシカルボニル、例えばアルコキンカルボニル(例、メトキンカルボニル、 エトキシカルボニル、プロポキンカルボニル、ブトキシカルボニル、t−ブトキ シカルボニル、5−ベントキンカルボニル)、ハロアルコキシカルボニル(例、 クロロメトキンカルボニル、トリブロモエトキノカルボニル、トリクロロエトキ ンカルボニル):アルカンーまたはアレーン−スルホニルアルコキンカルボニル [例、2−(メシル)エトキシカルボニル、2−(p−トルエンスルホニル)エ トキノカルボニル];アルキルチオーオラリルチオアルコキシカルボニル(al kylthio−oraryl thioalkoxycarbonyl)[例 、2−(エチルチオ)−エトキンカルボニル、2−(p−トルイルチオ)−エト キシカルボニル]、置換または非置換アルカノイル、例えばハロ(低級)アルカ ノイル(例、ホルミル、トリフルオロアセチル):単環または融合環式の脂環式 オキシカルボニル(例、クロロへキ/ルオキシカルボニル、アダマンチルオキシ カルボニル、イソボルニルオキシカルボニル):置換または非置換アルケニルオ キシカルボニル(例、アロイルオキシカルボニル):置換または非置換アルキニ ルオキメシルボニル(例、1.1−ジメチルプロパルギルオキメシルボニル): 置換または非置換アリールオキシカルポニル(例、フェノキシカルボニル、p− メチルフェノキシカルボニル)、置換または非置換アリールアルコキシカルボニ ル[例、ベンジルオキシカルボニル、p−ニトロペンジルオキシ力ルポニル、p −フェニルアゾベンジルオキシカルボニル、p−(+)−メトキシフェニルアゾ )−ベンジルオキシカルボニル、p−クロロベンジルオキシカルボニル、p−ブ ロモベンジルオキシカルボニル、α−ナフチルメトキンカルボニル、p−ビフェ ニルイソブ口ボキ7カルボニル、フルオレニルメトキノカルボニル]:置換また は非置換アレーンスルホニル(例、ベンゼンスルホニル、I)−トルエンスルホ ニル):置換または非置換シアルキリホスホリル(例、ジメチルホスホリル): W1換または非置換ジアラルキルホスホリル(例、0,0゛−ンベンジルホスホ リル)、置換または非置換アリ−ルオキシアルカノイル[例、フェノキンアセチ ル、p−クロロフェノキノアセチル、2−ニトロフェノキンアセチル、2−メチ ル−2−(2−ニトロフェノキ/)プロピオニル];fiI換または非置換アリ ール(例、フェニル、トリル);または置換またはJlrI!換アラルキル(例 、ベンジル、ジフェニルメチル、トリチルまたはニトロベンジル)から選択され る。
特に好ましい保護基は4,4゛−ジメトキノトリチル、Fmoc、BOCおよび Pixylである。
上記の保護基には、以下においてp r +およびPr”(またはPr3)と称 するものも包含される。上記の保護基は、X5またはXSの保護にも使用できる 。
式1およびIIの化合物は、フレノウフラグメントなどのDNAポリメラーゼま たはRNΔポリメラーゼ(Sr1またはT7ボリメラーゼなど)を用いる、鋳型 ヌクレオチド配列のflll長に用い得る。本発明を限定するものではないが、 特に、式1またはIIの化合物をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に用いること ができる(Nuで示される基のヌクレオチド配列は標的配列の一部と相補的であ るように選択される)。選択したオリゴヌクレオチド「プライマー」を、低温で 標的DNAの反対鎖−Lの相補性配列とアニーリングさせた後、熱安定性のポリ メラーゼを用いて3゛方向に伸長させることによって、遺伝子が増幅される。増 幅産物は、ポリアミド残基中に含有されるリポータ−基を介して容易に検出され る。例えば、蛍光性リポータ−基は、増幅産物に蛍光団の励起周波数範囲内の光 線を照射することにより、検出される。ビオチン含有リポータ−基は、アビジン との反応によって検出することができる。
本発明の化合物は基、X3またはXSを介して、支持マトリックスに結合させる ことができる。支持マトリックスは、例えば、アミノプロピル制御多孔性ガラス (AP−CPG)のような制御it(コントロール)多孔性ガラス、またはポリ スチレン樹脂であって良い。
本発明の化合物は、本明細書に記載した保護基を用いて完全に保護され、支持マ トリックスに結合され得るが、保護された形または完全に脱保護された形で支持 マトリックスから脱離される。
式(II) : 1式中、x2、x3、x5、X@およびNuは上記定義と同意義である]で示さ れる化合物は、一般に、以下の方法で調製される(1)以下の式(IIIa)二 [式中、X′およびXSは上記定義と同意義であり、そしてPr’およびPr” は同一または異なっていてよい保護基である〕で示される化合物を得; (2)Pr2を除去するかまたは除去しない条件下で化合物(IIIa)中のP r’を除去することによりペンダントアミノ基を脱保護し、次いで脱保護された 化合物を式: Pr”X”R’(X’は先に記載した通りであり、Pr3は保護 基であり、Roは脱離基である)で示されるアミノ酸と反応させてX2をペンダ ントアミノ基に共有結合させ、そして5−OH基が遊離基である場合には、この 基を所望により除去可能な保護基[工程(1)における保11[基Pr”と同一 または異なっていてよい]で再保護するか、またはX2が結合である場合には工 程(2)を省略し。
(3)工程(2)の化合物中のPr3(または、X2が結合であるときにはPr ’)を除去することによりペンダントアミノ基を脱保護し、それを活性化アミノ 酸またはポリアミドと反応させてXSの全てまたは一部を導入し、XSの一部の みが導入されたときには、次いで順に1またはそれ以上の活性化アミノ酸または ポリアミドを、1回またはそれ以上の回数で通常のペプチド合成条件のもとで付 加して化合物にXSの残りを1−1加し く4)予め脱保護されていないときには工程(3)の化合物の糖部分の5°−O 1]基を脱保護し、そして脱保護されたO1l基を活性化ヌクレオチドまたはオ リゴヌクレオチドと反応させて5’−3’結合を形成させ、次いで順に1または それ以」二の活性化ヌクレオチドをイ]加してオリゴヌクレオチド鎖を形成させ て、Nuを化合物に付加し7そして (5)所望によりあらゆる残存の保護基を除去し、そして所望によりX5または XSがORであってRが固相マトリックスである場合の固相マトリックスから該 化合物を切断して、化合物(II)を得る。
式Iおよび0の化合物の合成において、x2が結合である場合、工程(2)は、 所望による5’OII基の脱保護と共に未処置アミノ基を脱保護し、上記のよう に、脱保護したアミノ基をX2、次いでXSと反応させる、ただし、その各々は 、例えば、式(Ill)の化合物の保護または脱保護した5°OH基に付加する ことなくペンダントアミノ基にアミノ酸を共有結合的に結合させ得る、活性化ア ミノ酸またはペプチドである。また、式(III)の化合物の5°Ot(基が遊 離基である場合、該基を所望により除去可能な保護基で再保護する。
x3のポリアミド類は、例えば、固相FIloC法[Athcrton、 Rお よび5heppard、 R,C。
(+985) J、 Chew、 Soc、 Coa+l1un、 、 pp、  165−1661または同相Boc法[Barany、 f、および菖 errifield、R,B、(H180) 5olid−Phase F’c ptide 5ynthesis in The Pept奄р■刀h、V。
1.2. E、Gross & J、Meinhofer Eds、、^cad csic Press、 New York、 pp、 1|284]で合 成することができる。これらの方法では、反応性部分を保護するために、アミノ 酸を当分野で自体既知の標準的な保護基[例えば、Green(1981) P rotecting Groups in Organic 5ynthesi s、 Johon 1ilcy & 5ons、Inc、、1981 ; At hcrto獅■謔■T heppard (1985) J、 Chew、 Soc、 Commun、  、 pp、 165−166 ; BaranyおよびM■窒窒奄■奄■撃п @(前 掲)]を用いて保護する。
オリゴヌクレオチドNuは、固相ホスホトリエステル法[5proatおよびG a1t (1984) Oligonucleotide 5ynthesis 、^Practical Approach、 pp、83−116. IqL  Pres s、 0xfordコ、固相11−ホスホネート法[Froehlerら(19 86) Nucleic Ac1ds Re5earch 14. pp、53 99−54071または固相ホスホルアミダイト法[BcaucageおよびC aruthers (1981)Tetrahedron Lett、、 22 . pp、1859−18623によって合成することができる。これらの方法 の各々において、ヒドロキシまたはアミノ基のような反応性の基は、既述[Gr cen (1981) Protecting Groups in Orga nic 5ynthesis、 Joh盾■ filey & 5ons、 Inc、、 1981 ; Beaucage、 S、LおよびCaruthers、M、11. (1981j Tetra hedron Lett、 、 22. pp、 1859−1862 ; 5 proat、 S、およびGa1t、MJ、(1984) nligonuc leotide 5ynthesis、^PracticalApproach 、 pp、 83−116. IRL Press、 0x■盾窒р■ の標準的なヒドロキシおよびアミノ保護基で保護されていて良い。
式(111)の化合物のXSまたはX@の1つの基が固相マトリックスに結合し ていることが好ましい。最も好ましくは、基X@が固相マトリックスに結合して いる。
マトリックスは、上記のように適当な反応性基を含むように活性化することがで きる。様々な異なる段階で、ポリアミドに1またはそれ以上のリポータ−基を導 入することができる。リポータ−基はポリアミド合成前にアミノ酸中に存在して いるか(第3工程)、ポリアミド合成後(第4工程);オリゴヌクレオチド合成 後(第5工程);あるいは脱保護およびオリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジ ュゲートの精製後のいずれかに導入することができる。方法の選択は、選択され たリポータ−基および合成法に依存する。
リポータ−基がペプチドおよびオリゴヌクレオチドのいずれの合成条件下でも安 定である場合、それを、誘導体化アミノ酸として、ポリアミド合成の最初から導 入することができる。もしそれがDNA合成の条件下では安定であるが、ペプチ ド合成の条件下では安定でない場合、ポリアミド合成の後に、それを導入するこ とができる。もしリポータ−基がペプチドまたはオリゴヌクレオチド鎖の組立て のいずれにおいても安定でないが、脱保護法には安定である場合、それを完全に 保護されたポリアミド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチ ド鎖の組立ての後に導入することができる。もし標識が本発明化合物の合成に用 いたどの条件下でも安定でない場合、精製され完全に脱保護されたポリアミド− オリゴヌクレオチドコンツユゲートとの液相反応において導入することができる 。
蛍光団は工程(3)〜(6)の任意の段階でオリゴヌクレオチド−ポリアミドコ ンジュゲートに導入することができる。ビオチンの場合も同様である。
酵素、およびコロイド状金、コロイド状銀、フェリチンまたはビオチン等のコロ イド性化合物は工程(3)〜(6)で導入することができる。
オリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲートのポリアミド部分は、生成した 検出可能なシグナルを増大し、その結果、検出を容易にする複数のリポータ−基 を含有していても良い。
コンジュゲートのポリアミド部分はリポータ−基が結合するためのビヒクルとし て機能するのみならず、ポリアミドを特定の細胞型、細胞位置に指向させる(タ ーゲット)か、またはオリゴヌクレオチドの細胞膜通過を向上させるためのアド レスマーカーとして作用する。ペプチド配列のアドレスラベル活性は良く確立さ れている[Vernerおよび5chatz (1988) 5cience  241. pp、 1307−1313; Goldfarb■ (1986) Nature 322. pp、641−6441゜例えば、細 胞表面受容体によって認識されるペプチド配列を選択することにより、そのペプ チド配列と結合したオリゴヌクレオチドは特定の型の細胞内に輸送され、そこで 生物学的効果を発揮することができる(例えばそれらがアンチセンスオリゴヌク レオチドである場合、ウィルス性または細胞性RNAの転写を阻害する)。
本発明の特に好ましい方法では、式(IIIa)[式中、Pr’、Pr”、Xs およびXsは上記定義と同意義である]で示される化合物は3′−ヒドロキシ基 を介して固相支持体に結合している(即ち、X6はORであり、Rは固相マトリ ックスである)。式 Pr3HNX2COR”で示されるスペーサーまたはアミ ノ酸を、上記のように、脱保護されたペンダントアミノ基に付加した後、ペプチ ド合成の常法に従い、1またはそれ以上のアミノ酸基を連続的に付加することに より、ポリアミド鎖を付加する。
次いで、オリゴヌクレオチド鎖を式IVの化合物の脱保護した5゛−ヒドロキシ 基に付加する。種々の保護基Pr’、Pr2およびPr”は同一または異なって いて良く、前記の通りである。
図面の簡単な説明 図1は5′末端を標識したオリゴヌクレオチドのPAGEを示す。レーンAおよ びCは通常のオリゴヌクレオチド、そしてレーンBはAhx−Lys(ビオチン )−A1aペプチドを含有する23量体コンジュゲートを示す。
図2は本発明化合物の製造の概略(反応式■)を示す。
図3は図2の反応物質を製造するための詳細な説明(反応式if)を示す。
図4は本発明の好ましい化合物を製造するための詳細な説明(反応式III)の 最初の部分を示す。
図5は図4の続きであり、反応式IIIの後半のさらに詳細な説明を示す。
図6は本発明のペプチド合成に用いた標識化アミノ酸の製造のさらに詳しい説明 を示す。
発明を実施するための様式 本発明の具体的な態様を、以下の限定のためのものではない実施例により説明す る。製造された化合物は、しばしば、図面の図2〜6に記載された参照番号で表 される。
3−アミノプロピン、5−ヨード−2′−チオキシウリジン、ビオチン、および 3−アミノプロピルトリエトキシシランはS igmaから購入した。N−(フ ルオレン−9−イルメトキン−カルボニルオキシ)スクシンイミド、N“−Fm oc−L−シラン、ペンタフルオロフェノール、DCC,およびFmoc−Al a−OPfpはAuspcp(Melbourne)から入手した。3−ニトロ ピリジン−2−スルフェニルクロリドはKokusan(東京)から入手した。
9−クロロ−9−フェニルキサンチンおよびテトラキス(トリフェニルホスフィ ン)パラジウム(0)はAldrichより調達した。
N−ヒドロキシスフノンイミドはPierceから入手した。トリエチルアミン (purjSS級)、管理された細孔グラス(200〜400メツンユ、細孔サ イズ500人、カタログ番号27720)およびジイソプロピルカルボジイミド (DrC)はFlukaから購入した。ニンヒドリン検定の試薬はApplie d Biosyste訃より調達した。DMFは減圧下で蒸留し、14日以内に 使用した。ピリジンは大気圧下にCaH2を用いて蒸留し、5人モレキュラーノ ーブを入れて保荏した。全ての他の試薬はさらに精製することなく使用した。薄 層クロマトグラフィーはMerck S G −60被覆済プラスチツクプレー トで実施し、フラッシュクロマトグラフィーはMerckンリカゲル(SG−( 30,230〜240メツシユ)で実施した。95%エタノール71%酢酸74 %H,Oを再結晶溶媒として代用したことを除いて既述型のように、ビオチン− N−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを調製した。N−Fmoc−εAhx −OPI’p”およびN−BOC−3−7アミノプロピン3は文献の方法に従っ て調製した。
融点は電熱装置で測定し、補正はしなかった。NMRスペクトルはJEOLGX −400分光計で記録し、’H(7)観測を399.9MHzで、目Cc7)[ Mヲ99.98MHzで操作した。DEPT実験は135”I−1選択パルスで 実施した。DQF−CO3Y実験は、16トランジ工ント/増分および356x 2にデータマトリックスのデータ累積の相感受性モードで行った。IKxlK最 終データマトリックスへの0充填および両方向の指数荷量関数の適用後、スペク トルを得た。
HMBC実験は、128トランジ工ント/増分および128x2に粗データマト リックスの絶対吸収モーpで行った。t5次元における4回の0充填および両方 向の正弦鐘状の荷量関数の適用後にスペクトルを得た。この実験は”C−1−1 値を8l−1zと仮定して行った。ヌクレオノド3および4に用いた番号付与系 は反応式1に示されており、一方、化合物22および23の番号付与系は反応式 Ivに示す通りである。Perkin Elmer 1600ンリーズFTIR を用い、KBrディスクを用いて、TRスペクトルを記録した。0,1回M E DTA溶液に溶解した試料を用い、Varian Cary 1分光光度計でU Vスペクトルを記録した。BeckIIan System 6300アミノ酸 分析器でアミノ酸分析を実施した。緩衝液Δ(0,1M酢酸トリエチルアンモニ ウム、pH7,0)および緩衝液B(0,1M酢酸トリエチルアンモニウム、3 0%CH3CN、pH7,0)を用い、P henomenex逆相C18カラ ム(50DS30.5μm、細孔サイズ60人)を用いる島原LC4A装置でH PLc分析を実施した。
元素分析はCM A S P ty、L td、 (Melbourne)から 入手した。高および低分解能FAB11tjiスヘクt−ルハ、FAB[を装着 したJEOL DX−300およびJEOL AX−505H装着で各々記録し た。高分解能測定の試料はポリエチレングリコール(600)/チオールグリセ ロール/グリセロール/DMSOマトリックスに、低分解能試料はチオグリセロ ールマトリックスに墾濁した。この両方のイオン化気体はXeであった。
試薬の合成 実施例1(a) 3−(フルオレン−9−イル−メトキンカルボニル)−アミド プロピン(9) 3−アミノプロピン(359μl、5.25wmol)を、0℃でTI(F(8 ml)中のN−(フルオレン−9−イルメトキシカルボニルオキシ)スクシンイ ミド(F woe N HSX1.69g、5.00−■ol)の溶液に滴下し 、2時間撹拌した。この溶液を室温まで温め、溶媒を真空下で除去した。この粗 残渣を酢酸エチル(100@l)に溶解し、溶液をH20(3x30醜l)で洗 浄し、次いで乾燥させた(Na2SO+)。酢酸エチルからの再結晶によって無 色の針状物として9を得た(1.11g、80%、融点129〜130℃)。
’HNMR(ds DMSO):δ3.13(t、IH,Hl、J=2.3Hz )、3゜80(dd、211. H3,J=5.9. 2.5l−1z)、4. 23(t、ill、Fmoc CH。
J=6.8夏(z)、4.33(d、2H,F++ocCHt、J=7.1Hz )、7.33(ddd。
2H,Fwoc H2およびH7,J=7.6.7.5. 1.2Hz)、7. 41 (ddd、 2+−I Fmoc H3およびH6,J=7.6. 7. 5.0.9Hz)、7.71(d、 2H。
FmocH2およびH8,J=7.6Hz)、7.8Ht、IH,NH,J=5 .9Hz)、7.90(d、2H,Fmoc H4およびH5、J=7.6Hz )。
”CNMR(d、−DMSO):629.8(C3)、46.6(Fmoc C H,65゜7 (F moc C)(t)、73.0C1)、81.4(C2) 、120.1(Fmoc C3およびC6)、125.2(F■ocC2および C7)、127.1(F象occ4およびC5)、127.6(Fwoc C1 およびC8)、140.7(C4aおよびC4b)、143、8(Fmoc C 8aおよびC9a)、155.9(Fmoc Co)。
F A BMS mHz : 300(M+Na)、278(M+I()。
元素分析(C+alLsNOiとして):tHEll:C,78,0;H,5, 45;N、5.05;実測値:C,78,1:1.1.5.45:N、5.01 ゜DMF(20■l)中の3−アミノプロピン(855tll、 12.5mm ol)の撹拌溶液に、3−ニトロピリジン−2−スルフェニルクロリド(0,9 4g、5.Q+emol)を2等分して0.5時間かけて加えた。1.5時間後 、この反応混合物を酢酸エチル(500111)に注ぎ入れ、H,O(3x 2 00+al)で洗浄し、乾燥させ(NazS 04)、溶媒を真空下で除去した 。MeOH/HzOからの再結晶によって赤い結晶とじて10を得た(0.65 3g、62%、融点107〜9℃)。
IHNMR(δ6−DMSO) :δ3.18(t、 IH,Hl、 J=2. 6Hz)、3゜77(dd、2H,H3,J=4.4.2.6Hz)、5.34 (t、 LH,NH,J=4゜4Hz)、7.47(dd、 IH,NPYS  H5,J=8.3.4.6Hz)、8.61(dd、 IH,NPYS H6, J=8.4.1.5Hz)、8.90(dd、 IH,NPYS H4,J=4 .4. 1.5H2)。
13CNMR(d、−DMSO):δ30.7(C3)、74.8(C1)、8 1.7(C2)、120.4(NPYS C5)、134.3(NPYS C4 )、139.8(NPYS C3)、154.1(NPYS C6)、163. 1(NPYS C2)。
FABMS mHz: 210(M+H)。
元素分析(C,H,N30.Sとして1計算値、C145,9;H,3,37; N、20.1 ;’AJII:C,45,7;H,3,33;N、20.1゜実 施例1(c) 3−(9−フェニルキサンチン−9−イル)アミノプロピン(1 2)9−クロロ−9−フェニルキサンチン(14,7g、50■mol)溶液を 、2等分して、0.5時間かltテDMF(100m1)中の3−アミノプロピ ン(8,6ml、125關o1)の撹拌溶液に加えた。3時間後、MeOH(2 0ml)を加えて、反応混合物を15分間撹拌した。次いでこの混合物をジエチ ルエーテル(500@l)中に抽出し、H20(3x 300i+1)で洗浄し て、乾燥させ(NalS 04)、溶媒を真空下で除去した。得られた黄色のオ イルを高真空下で乾燥させ(4時間)、次いで熱いジエチルエーテル(70■l )に再溶解させた。この溶液を−20”Cで24時間保持し、次いで濾過して、 固体を水冷ヘキサン(2x 50111)で洗浄し、次いで水冷ジエチルエーテ ル(2x 50m1)で洗浄して、無色粉末として12を得た(12.7g、8 2%、融点116〜8℃)。
IHNMR(d、−DMSO):δ2.86(dd、2I■、 ■I3. J= 7.3. 4.4Hz)、2.99(t、 IH,tll、 J=2.旧(z) 、4.OHt、LH,NH,J=7.2Hz)、 [3,98−7,50(m、 13H,PK CI)。
1”CNMR(ds−DMSO):δ32.8(C3)、59.7(Px C9 )、73.4(C1)、82.7(C2)、1160.0および123.5(P x CH)、125.0(Px C8aおよびC9a)、126.3.126. 4.1280.128.6.128.7(Px CH)、149.5(Px C 1’)、150.7(Px C4aおよびCl0a)。
FA13MS mHz : 311(M+)。
元素分析(C2d(+tNOとして) 計算値・C,84,8;)七 5.51;N、4.50:実測値:C,84,4 ;H,5,13:N、4.30゜実施例Hd)5−ヨード−5’−0−(9−フ ェニルキサンチン−9−イル)−2°−デオキシウリジン(7) 5−ヨード−2′−デオキシウリジン(I DtJX3.54g、10vmol )を乾燥ピリジン(3x 20m1)と共蒸発させた。このIDUを乾燥ピリジ ン(15■l)に再溶解し、9−フェニル−9−クロロキサンチン(3,82g 、13mmol)をこの撹拌溶液に2等分して0.5時間かけて加えた。1時間 後、MeOH(5ml)を加えて、溶液をさらに05時間撹拌した。次いで溶媒 を真空下で除去し、残渣を1%Et。
N/酢酸エチル溶液から再結晶させて無色結晶として7を得た(4.27g、7 0%、融点200〜2℃)。
ILI NMR(d、−DMSO):δ2.20(鋤、2H,I−+2°)、2 .99(dd、IH。
115′、J=10.5. 4.2+Iz)、3.10(dd、IH,H5”、 J=10.5. 2゜7)(z)、3.85(m、 IH,84°)、4.15 (s、 H(、H3’)、5.29(d、IH。
3°OH,J=4.2Hz)、6.08(t、 IH,l−11’、 J=7. 0Hz)、7.10−7.42(++、13H,PX CH)、 8.08(s 、IH,H6)。
”CNMR(d、−DMSO):δ40.4(C2’)、63.8(C5’)、 69.9(C5)、71.0(C3°)、75.6(Px C9)、85.2( C1’)、85.9(C4’)、1163.116.4(Px CH)、122 .3.122.4(PX C8aおよびC9a)、1238.1240.125 訳1268.128.2.1293.1.29.69.129.7.129.7 3(r’x CH)、143.9(C6)、1484(PxC1’)、150. 0(C2)、i50.51.150.58(Px C4aおよびCl0a)、1 60.6(C4)。
FABMS mHz: 633(M+Naつ。
元素分析(CzsHxsNxPslとして)計算値:C,55,1;H,3,8 1;N、4.59;実測値・C,55,0;H,3,81;N、 4.54゜実 施例He) 5−[3(−tert−プチルオキシカルポニルアミド)プロプ− 1−イン−1−イル月−5°−0−(9−フェニルキサンチン−9−イル)−2 ゛−デオキシウリジン(3) DMF(6ml)中のIHl、22g、2.00mm+ol)の脱ガス(Ar) 溶液に、Cu1(0,076g10.40+aII+ol)、Et、N(558 μl、4 、 OOmmol)、3−tert−ブチルオキシカルボニルアミド プロビン”(0,932g、 6.00mmol)および(PhsP)4Pd0 (0,232g、0.20mmol)を順次加え、この溶液を5時間撹拌した。
AGIX8(HCOs−)イオン交換樹脂(6M当量)をMeOH(10ml) およびCI−1。
C1,(10■l)と共に加え、この混合物を30分間撹拌した。この樹脂を濾 過して除き、溶媒を減圧下で除去した。この粗残渣を酢酸エチル(200ml) に溶解させ、溶液をHzO(3x 100111)で洗浄し、乾燥させ(Na2 SO+)、そして濾過した。
溶媒を除去した後、フラッシュンリ力ゲルクロマトグラフィ−(70gンリカ、 0〜10%MeOH/CI’(zc]2)にかけ、次いでクロロホルム/ジエチ ルエーテルからの再結晶により無色結晶として3を得た(0.602g、47% 、融点157〜160℃)。
’HNMR(do DMSO):δ1.35(s、9H,Boc CH,)、2 .25(m。
2H,H2’)、3.00(dd、ill H5’、J=10.5. 4.4H z)、3.12(dd、IH,H5”、J=10.4. 2.6Hz)、3.6 9(++、2H,H9)、3.91(−、IH,84°)、 4. 1 5(m 、IH,H3’)、 5.30(d、 IH,3°OH,J=4.2Hz)、6 .09(5,LH,H1’、J=6.7Hz)、7.10−7.45(L13H ,Px CH)、7.96(s、 IH,I−(6)。
”CNMR(ds DMSO):δ28.2(Bcx: CHz)、30.0( C9)、40゜3(C2’)、63.8(C5’)、70.8(C3’)、73 .8(C8)、75.5(Px C9)、78.2(Boc C)、85.3( C1’)、85.9(C4°)、90.1(C7)、98.4(C5)、116 1.1 ]、6.3(Px CH)、122.0(Px C8aおLびC9a) 、1239.124.0.125.8.126.7.1281.129.0゜1 29.1 、129.7(Px CH)、 142.9(C6)、 148.3 (Px C2)、 149.3(C1’)、1505.150.7(Px C4 aおよびCIQa)、155.1(BocCO)、161.6(C4)。
FABMS m/z: 660(M+Na)。
元素分析(Cs s l−1s s N s Osとして)訂*値: C,67 ,8:H,5,54;N、6.59 ;実測値:C,57,7;比 5.68; N、6.54゜実施例1(f) F *oc−ヌクレオ/ド1を類似の方法で!!#製したが、持続的に混入して いる出発ヌクレオシド7のために分析純度まで精製できなかった。
13CNMR(CDCl2): δ31.2(C9)、41.8(C2’)、4 6.9(FmocC9)、60.3(C5’)、63.4(C8)、66、4C FIooc CHI2)、72.4(C3′)、14.3(Px C9)、86 .0C1’)、86.7(C4’)、89.5(C7)、99.4(C5)、1 16.4(Px C1+)、119.8(FTIoc C3およびC6)、12 21.122.3(Px C8aおよびC9a)、■237.123.8(Px  CH)、124.8(FDIOCC2およびC7)、126.2(Px CH )、126.85.126.95(Fmoc C4およびC5)、127.8( Fmoc C1およびC8)、129゜4.129.6(Px CH)、141 .、1(Fmoc C4aおよびC4b)、1432.143、6(Fmoc  C8aおよびC9a)、143.7(C6)、148.1(C2)、149、4 (Px C1’)、151.06.151.12(Px C4aおよびC10a )、155、6(Fmoc CO)、162.25(C4)。
害mBR11(g) 5−[3−(フェニルキサンチン−9−イルアミノ)プロ プ−1−イン−1−イル]−5’−0−(9−フェニル−キサンチン−9−イル )−2°−チオキシウリジン(4) この方法は、粗残濱をC112c12(2’00m1)に再溶解したことを除い て3の方法と同一であった。コノ溶液を10 %NaHC03(2x 100I Il+)オ=にヒHzo(1x 100m1)で洗浄した。溶液を乾燥させた*  (N a ! S O4)、濾過し、溶媒を蒸発させて、フラノ/ニジリカゲ ルクロマトグラフィー(O〜5%MeOH/CHzC1g、1%Et3N)によ り淡黄褐色固体として4を得た(0.608g、76%)。その1部をMcOH から再結晶させて分析純度にした[融点156〜8℃(分解)]。
IHNMR(δ6−DMSO) :δ2.25(++、 2H,H2°入2.5 5(dd、 lh。
)(9a、J=16.3. 7.15Hz)、2.66(dd、IH,H9b、 J=16.3゜7、1.4 Hz)、2.95(dd、 IH,85°、 J= 10.6.3.67Hz)、3.07(dd、IH,115”、J=10.4.  2.38H2)、3.51(t、IH,N9H,J=7.20. fiz)、 3.9(m、 Hl、 H4’)、4.20m、 IH,H3’)、5.31( d。
lH,3°O11,J=4.0311z)、6.11(t、 Ill、 Ill ’、 J=6.78Hz)、6.85−7.40(m、26H,NPxおよび0 PxCH)、8.05(s、 lH。
H6)、11.6(br s、 ll−1,1−13)。
+3CNMR(ds−DMSO): 6i33.4(C9)、40.8(C2° )、59.6(NPxC9)、63.6(C5°)、70.9(C3°)、74 .6(C8,75,7(OPXC9)、85.2(C1°)、86.0(C4’ )、91.2(C7)、115.86.115.91.116.21.116. 30(NPxおよび0PxCH)、1.22.17および1.22.24、(O PX C8aおよびC9a)、123.50.123.54.12392.12 4.05(NPxおよび0Px(j−()、124.65.124.68(NP xC13aおよびC9a)、125.7.1263.126.5.127.8. 127.9.128.46.128.58.128.68.128.74.12 8.98.129.25.129.64.129.76(NPxおよびOPx  CHI)、142゜7(C6)、148.1(C2)、149.3(NPxおよ び0PxC1’)、150.4.150.61.150.66.150.75( NPXおよびOPx C4aおよびCl0a)、161..6(C4)。
FABMS m/z: 816(M+Na)、794(M+1.I)。
HR−FABMSの正確な質量実測値794.2871、(Cs。Hs++N5 Ot)+[Iの計算値?94.2868゜ ヂニルリ/ン、Fmoc −Lys(ビオチン)−01−1(22)DMF(7 0ml)中のEt3N(698711,5,00mmol)の溶液を、ビオチン のN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル(3,41g、10. Ommol )とN’−Fmoc−リシン2H1,84g、5.00關o1)の混合物に加え 、得られた混合物を6時間撹拌し、次いで濾過した。次に、冷HCl水溶液(p i−12,500!11)を加え、沈殿を濾過し、1ick水溶液(pi(2, 3x 200m1)およびHtO(3x 200m1)で洗浄した。この段階で 、残渣は大儀の水を含むことが分かり、従って凍結乾燥させて(48時間)、綿 毛状の無色固体を得た[2.41g、 81%、融点181〜2℃(分解)]。
’HNMR(ds−DMSO):δ1.20−1.40(m、 4H,Btn  H7およびLys )Iδ)、1.50 1.52(s、 611. BtnJ −1βおよびBin HLys Hδおよびlys+I7)、1.52−1.6 2(m、2H,Lys HR)、2.03(t、2H。
Btn tlα、J =7.3Hz)、2.56(d、LH,Btn 1(5b 、J=12.5)1z)、2.79(+:k1.]、)(、BtnJI5a、J =12.4.5.Hl2)、3.00(m、2H。
Lys l−(ε)、3.06(m、 1.11.8tn H2)、3.9(m 、 IH,Lys Hα)、4゜1(簡、IH,13tn H3)、4.18− 4.30(m、4H,Btn H4およびF woeCH、およびF moc  H9)、6.36(s、II(、Btn Hlo)、6.42(s、IH。
BtnH3’)、7.32(ddd、211 FTIoc )12およびH7, J=7.4.7.4゜1、IHz)、7.41(dd、2H,Fmoc H3お よびj−(6,J=7.2. 7.2Hz)、7.61(d、 1比Lys N ’l−L J = 8.1 Hz)、7.72(d、 2H,Fwoc Hlお よびl!8. J=7.4Hz)、7.76(t、IIl、 Lys N’比  J = 5.6 Hz)、7.88(d、2+1. Fmoc ++4およびH 5,J = 7. lI Hz)。
13CNMR(ds−DMSO): δ23.1(Lys C7)、25.3( Btn Cs)、28、0(Btn Cs)、28.2(Bin C7)、28 .8(Lys Cs)、30.5(LysCa)、 35.2(+3tn Cα )、 38.2(Lys Cε)、 39.9(Btn C5)、 467(F mocC9)、53.8(LysCa)、55.2(BtnC2)、59.2( BtnC4)、61.0(Bin C3)、65.6(FIOCC1+2)、1 20.1(Fmoc C3およびC6)、125.3(Fmoc C2およびC y)、127.1 (Fmoc C4およびC5)、1.27.7(FTIoc  C1およびC8)、1.40.7(Fmoc C4aおよびC4b)、143 .79.143.84(Fmoc C8aおよびC9a)、156.2(Fmo cCO)、162.7(Btn C2°)、17 ]、、 9(Btn C10 )、174゜(Lys CChtl)。
HR−FABMS+7)正flな質量実測値595.2566、(C84Hsa NnOsS)+H(7)計算1a595.2590゜I R: 1702c+e −’(Fmoc Coおよびリシン(ZCO)、1638cr’(アミドCo) 。
実施例1(D N’−(フルオレン−9−イルメトキシカルボニル)−N’−ビ オチニルリシンペンタフルオロ−フェニルエステル、Fmoc Lys(ビオチ ン)−0Pfp(23) DMF(5ml)中のペンタフルオロフェノール(1,75g、9.29mmo l)およびDCC(1,27,6,32+w+ol)の溶液をDMF(40ml )中の22(2,21g、 3゜72市o1)溶液に加え、混合物を16時間撹 拌した。この無色沈殿を濾過して除き、廃棄した。この濾液を保持し、溶媒を真 空下で除去した後、トリチュレートし、ジエチルエーテル(4x 1001Il )で無色固体を得た。この固体を酢酸エチル/エタノール/酢酸(80・19: 1)がら再結晶させて微細な無色結晶を得た[工、90g、67%、融点162 〜5℃(分解)]。
’HNMR(do DMSO) : 61.23 1.32(m、2H,Tbh  II 7)、1゜38−1.53(m、611. Btn HRおよびBtn HδおよびLys )lδ)、1l54−163(、2H,Lys HR)、2 .04(t、 2H,Btn Hα、 J=7.3Hz)、2.55(d、Il l Btn H5b、J=12.5Hz)、 2.79(dd、IH,Btn  H5a、J=12.5. 5.H(z)、2.98−3.04(m、2H,Ly s HR)、3.05−3. 1.0(m、 LH,Btn 112)、 4. 09(m、IH,Lys αH)、 4.20−4.30(m、2H,Btn  H3およびFmocH9)、4.32−4.42(++、3H。
BtnH4およびFDIOCCH2)、6.35(s、IH,旧n Hlo)、 6.42(s、IIt Btn I−(3’)、7.28−7.34(s、2+ 1. Fmoc H2および)−(7)、7.40(dd、2+1. Fmoc  113およびH6,J=7.5. 7.5Hz)、7.70(d、2H。
F moc l−(1およびH8,J=7.3Hz)、7.77(5,IH,L ys NεH,J=5.7Hz)、7.88(d、2H,Fmoc H4および H5,J =7.7Hz)、8,12(d、111. Lys N’T1. J =7.3Hz)。
”CNMR(do−DMSO):δ22.7(Lys Cy)、25.3(Bt nCβ)、28.1(Bin Ca)、28.3(Btn Cy)、28.7( Lys Ca)、29.9(LysCβ)、35.3(Btn Ca)、38. 1(Lys (、り、39.9(Btn C5)、46゜7(FmocC9)、 53.9(Lys C(Z)、55.5(Btn C2)、59.2(Btn  C4)、61.1(、Btn C3)、65.9(Fmoc CH2)、120 .2(FmocC3およびC6)、125.2(Fmoc C2およびC7)、 127.1(F+ooc C4およびC5)、127.7(Fmoc C1およ びC8)、136.5. 138.5. 139.0(2xm、C−CF)、1 40.8(Fmoc C4aおよびC4b)、142.0(II、C−CF)、 143.68.143. 71(Fmoc C8aおよびC9a)、1562( Fscx:Co)、1(32,7(BtnC2°)、169.2(LysCO) 、171.9(BtnClo)。
HR−FΔL3MSの正確な質量実測値761.2413、(C371−137 N 40 e 5Fs)+t17)tt’W111761.2432゜I R:  1787cm−’(エステルCo)、1702ca+−’(F+aoc Co )、1641c11(アミドCo)。
実施例1(32スクンニルーCPG樹脂(16)の調製エタノール(60ml) 中の3−アミノプロピルトリエ(・キシシラン(3g、135 ff1mo+  )溶液をCPG(200〜400メッシュ、細孔サイズ500人、カタログ番号 27720) l 3 (6g)に加え、混合物を6時間かけて一定の間隔で穏 やかに振盪した。この樹脂を重力濾過によって回収しくいかなる洗浄もしない) 、空気乾燥させ(24時間)、110℃で保持しく24時間)、アミノ化樹脂1 4を得た。このアミノ含有量をニンヒドリン検定によって129μmol/gと 決定した。DMF中のN−Fmoc−εAhx−OPfp(2,5M当量)およ びHOBT(2,5M当量)を焼結ガラスカラム中の14にカップリングさせた (二重ノノンブリング、各反応1.5時間)。2またはそれ以上のアミノヘキサ ン酸残渣を1.5時間の単独カンプリングを用いて結合させ、樹脂15を得た。
20%ピペリジン/DMFによる処理(5分)によってF moc基を開裂し、 樹脂をDMFで洗浄して、次いで最少量の乾燥ピリジン中の無水コハク酸(50 M当量)とDMP(10M当量)の溶液を加えた。この墾濁液を1時間振盪した 後、樹脂をピリジン、DMF、CHzClzですすぎ、真空下で乾燥させた。こ の反応をニンヒドリン検定によってモニターし、アミノ基の消失から算出したと きのカルボン酸基の含有量は46μmol/gであった。
実施例1(k)スクンニルーCPG樹脂16への修飾ヌクレオシド3および4の カップリング 樹脂16を、最少量の乾燥ピリジン中の3または4(5M当量)、ジイソプロピ ルカルボンイミド(5M当量)およびDMAP((1,5M当量)の溶液で2回 処理した。二重カップリングの間に洗浄を1回だけ行い、16時間ずつ独立して 2回カップリングを行った。2回目のカップリングの後、この樹脂をピリジンで すすぎ、ピキシル検定によって39μmol/Hのヌクレオノド含有量を得た。
Damha’の方法に従って、残存するカルボン酸およびアミノ基をピペリジン およびACzO/DMAPで覆い、樹脂18または19を得た。
実施例1(1) 20を得るための18および19の誘導体化18の場合、樹脂 を90%TFA/エタンジチオールで10分間処理し、CH。
C1,ですすぎ、次いで20%Et、N/CH2Cl2で中和した。次に、この 樹脂をCH2C12テt t f、乾燥サセ、そしてDMF中ノF+oc−εA hx−OPfp/HOBTの1=1混合物で処理した(2.5M当量、45分、 2回)。DMFですすいだ後、この樹脂を最少量の乾燥ピリジン中の4.4゛− ジメトキントリチルクロリド(各回につきに50M当量)と連続して2回、16 時間の反応に付し、樹脂2oを得た。トリチル検定によって30μmo1/gの ジメトキントリチル基の存在が示された。19を誘導体化して20を得る方法は 、3 !% D CA / Cl(x C12ヲ90 % TFA/エタンジチ オールの代わりに用いたことを除いて18のための方法と同一である。
実施例Hm) +射脂20上でのポリアミドおよびオリゴヌクレオチドの合成手 製のガラス焼結ペプチド合成セルにおいて、各々23およびN′−FIIoc− Ala−OPfpを用いるF moc固相ペプチド合成によって、ビオチニル化 り/ン残基およびアラニン残基を20に結合させた。1時間のカップリング時間 および脱保護剤として20%ピペリジン/DMFを用い、5倍過剰のアミノ酸ペ ンタフルオロフェニルエステルおよびHOB Tを使用した。アラニンのα−ア ミノ基を脱保護し、乾燥ピリジン中のAC20(25μm)およびDMA P( 0,050g)で覆った(5時間)。D M F、 Cl(x C1!ですすぎ 、真空下で乾燥させた後、ll2IIIolスケールで、標準β−ノジアエチル ー保護化ホスホルアミダイト(60秒のA C20/ D M AP覆い工程2 を伴う)を使用するApplied Biosystems 380ΔDNA合 成機3でのオリゴヌクレオチド合成において、樹脂の一部を用いた。合成された オリゴヌクレオチドの配列はGATGAGTTCGTGTCCGTACAACT *(T*は修飾ヌクレオノドリンカ−である)であった。得られたコンジュゲー トを、濃アンモニア処理(22℃、6時間)によって固体支持体から開裂した。
得られたコンジュゲートの溶液を50℃で24時間加熱し、塩基の脱保護を行っ た。アンモニアを減圧下で除去し、コンジュゲートをQ、IRIM EDTA( 2耐)に溶解した。
調製用PAGE(16%ポリアクリルアミドゲル)5による分離によって2つの 産物が示され、最も低い電気泳動移動性をもつ産物を精製して総数率2.1%で 5コンジユゲート5の試料の5′末端をγ−[”P]−ATPおよびT4ポリヌ クレオチドキナーゼでラベルし、PAGE(16%ポリアクリルアミドゲル)に よって均質であることが示された。U■スペクトルは26On11で最大吸収を 示した。
3、0!mol(2G OnmのUV吸収から算出した量)のコンジュゲートを アミノ酸含量について分析し、予想どおりに比率101■olΔla : 0. 99mol Lysを示した。試料中に見い出されるペプチド量は2.55!m olでありだ。1agの5(水20μl中)をP17クレアーゼ(5ag、5μ lの0.05M Na0Ac中、pH6,0)および0.5M Na0Ac(p H6゜0.2μm)と37℃で30分間インキュベートした。得られた酵素分解 物を、60分間の0〜100%Bの直線勾配を用いる逆相C+5HPLCによっ て分析した。このHP L Cプロフィールを手作業で積分してヌクレオチド比 率を得た:pdA(4,67)、pdG(5,21)、pdC(4,80)、p dT(6,05)、dG(1,27)。予想比率・pdΔ(5,OO)、pdG (5,00)、−C(5,00)、pdT(6,00)、dG(1,00)。
実施例1(o)ニンヒドリン検定 これは、100℃で7分間のインキュベート時間を指定した元の検定6の改良法 である。正確に計量した樹脂を、110℃で10分間、76%(W/W)フェノ ール/エタノール(パスツールピペットから411ii)、0.0002M フ ァン化カリウム/ピリノン(8m)、および領28Mニンヒドリン/エタノール (4滴)で処理した。60%エタノール(3,8m1)で希釈した後、吸収を5 70!m(ε=1.5000M−’c++−りで測定した。
実施例1(p) ビキンルおよびトリチル検定正確に計量した樹脂を、室温で1 0分間、10%トルエンスルホン酸/アセトニトリル(3ml)で処理した。吸 収を、ビキノルについては445!m(ε=440QM”cr’)で、トリチル については507!m(ε−66500M−’crりで測定した。
実施例1 (q) F coc検定7 正確に計量した樹脂を、室温で30分間、ピペリジン(200μm)およびCH ICI2(200μm)で処理した。cH,ci□(3,6m1)で希釈した後 、吸収を301!m(ε=7800M−’all−’)で測定した。
(以下、余白) 実施例2 結果および議論 修飾ヌクレオシドの合成: オリゴヌクレオチドとポリアミドの間のリンカ−として働く修飾ヌクレオシド1 .3および4は、市販品から入手可能な5−ヨード−2゛−デオキシウリジン( IDU)6から出発する3工程で合成した(反応式II)。第一の工程は、3− アミノプロピンおよびN−(フルオレン−9−イルメトキシカルボニルオキシ) スクシンイミド、3−ニトロピリジン−2−スルフェニルクロリド(NPYSC I)、ジーt−プチルノカルボネートおよび9−クロロ−9−フェニルキサンチ ン各々の反応による4つの異なるN−保護されたプロパルギルアミン9〜12の 合成を含む。NPYS誘導体10の場合には、効率的な反応のために塩基の存在 が必要であった。トリエチルアミンはNPYSC+の核性置換を容易に行って第 四アンモニウム塩[(EtsN)S(C$113NOり]+01−を形成するこ とが見いだされ、ゆえに25モル過剰の3−アミノプロピンを用いて塩基として 同様に作用させた。4つ全ての保護されたプロパルギルアミンを高収率で合成し た。
所望のアルキニルヌクレオシドの合成は2つの経路:IDUのC5への保護され たプロパルギルアミンの結合、次いで5゛−ヒドロキシルの保護およびこの逆に より試みた。保護されていないヌクレオシドへの保護されたアミノアルキンのP d(0)−触媒化酸化的結合の結果、シリカゲルクロマトグラフィーにより分離 不可能な複合体混合物を生じた。9−クロロ−9−フェニルキサンチンを用いた DMP−触媒化アルキル化によるIDUの5°−ヒドロキシルの保護は5゛−保 護されたヌクレオノド7を高い収率および純度で与え、これを1lobbs@の 方法に従い保護されたプロパルギルアミン9〜12と結合させた。F moc− 保護されたプロパルギルアミン9を用いた、保護されたヌクレオシド7の反応は 、所望の生成物1を非常に低い収率(30%)で与えたが、これはおそらくトリ エチルアミンによる9の部分的脱保護によるものである。脱保護により生じる遊 離第一アミノ基は、パラジウム触媒とさらに配位結合し、結合反応を妨げるであ ろう8゜生成物1は、シリカゲルクロマトグラフィーにおいて広い範囲の溶離条 件下で出発物質と共溶離し、’Hおよび”CNMRスペクトルの両方はこれが7 の少量を含有することを示した。7とNPYS−保護されたプロパルギルアミン 10の間の結合反応は、複合体混合物を生じ、これはシリカゲルクロマトグラフ ィー、次いでC+s逆層HP LCによってのみ分離することができた。+ ) (および”CNMR分光学ならびにFABMSによるH P L C分画の分析 は、いずれも所望の生成物を含んでいないことを示した。対照的に、Bocとピ キンル(pixyl)−保護されたプロパルギルアミン11および12の結合は 簡単であった。Boc−保護されたヌクレオシド3も出発ヌクレオシド7と共溶 離するが、それにもかかわらず生成物3は、有意な汚染量の7の不在により高収 率で単離することができた。ジビンル化(dipicylated)ヌクレオシ ド4の製造は、TLC(5%MeOH/1%Et、N/CH,C1□)によりモ ニターすることができ、反応は5時間後に完了したと判断された。この反応も高 収率を有していた。
アルキニルヌクレオシド3および4は非常に複雑な構造を有していたが、1−次 元的’Hおよび13c NMR分光学により十分な特性化を行うことができ、こ れは前者の化合物における多重線が良く分離され、後者のほとんどの共鳴が本発 明者らが既に報告している3類似化合物の共鳴に非常に厳密に対応するからであ る。
これらアルキニルヌクレオシドの”CNMRスペクトルのかなり顕著な特徴は、 アルキニル第四炭素C8およびC7(番号付与系については反応式lを参照)各 々に対応するδ73,8〜746およびδ90.1〜91.2領域における2つ の共鳴である。IDUにお+Jるδ69.9からδ98.4〜98.7への05 の低磁場シフトは、ヨウ素原子に対する第四アルキニル炭素による置換と一致す る。他の全ての共鳴は提案されている3および4の構造と一致していた。
コンジュゲートの合成における次の段階は、ポリアミドおよびオリゴヌクレオチ ド合成のための固体支持体の誘導体化であった。制御化−多孔ガラス(CPG) 樹脂は、ポリアミドおよびオリゴヌクレオチドの両方が効率的に合成されるのを 可能にする。通常のペプチド合成樹脂、例えばPepsyn K’は、CPGよ り高い充填性を有するが、ボスポルアミダイト法による効率的なりNA合成は不 可能であり、ゆえにCPGが選択された固体支持体である。
DNA合成のためのCPG樹脂の誘導体化は、CPGのアミノ化、次いでヌクレ オノドスクンネート活性エステ71,10との結合または通常DCCI6.11 とのカルボッイミド結合により行われるのが普通である。Damhaら[Nuc leic Ac1ds Re5ear哄U嬰埠、移、 pp、3813−382 11は、1−(3°−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボンイミド( DEC)−介在縮合によるスクシニル化CPG樹脂へのヌクレオシドの結合のた めの方法を最近開示した。この方法は、ヌクレオノド誘導体の別の溶液用操作を 不必要にするから、さらに好都合である。DCCに比較したDECの有効性は、 その比較的小さな立体要求性に帰するものであったII。これを考慮して、本発 明者らはジイソプロピルカルボンイミド(D I C)もDCCより良いであろ うと予想した。ゆえに、通常のヌクレオシド、5゛−O−ジメトキシトリチル− N4−ベンゾイル−2゛−チオキシンチジン(ジメトキントリチル=ジ(p−メ トキシフェニル)フェニルメチル)を用いてDICとDCCおよびDECとの比 較を行った。スクンニル化−CPG樹脂をヌクオシド、DMAP(0,5モル当 量)および乾燥ピリジン中の適当な縮合剤で処理した。24時間後、ヌクオシド 結合の0麿をトリデル検定により評価した。ヌクオシド含有量は、DCC,DE CおよびDICの各々について22.18および30μモルフgであることが測 定され、これはDICが選択すべき縮合試薬であることを示した。
コンジュゲート合成のための固体支持体を、CPG樹脂13から出発する4工程 (反応式IH)で製造した。CPGを3−アミノプロピルトリエトキンシラン1 2でアミン化し、次いで通常のF vaoc固相ペプチド合成法9を用いて3つ の6−アミノヘキサン酸スペーサー残基を結合し、樹脂15を得た。3つのスペ ーサー単位の結合が、長鎖アルキルアミン(LCAA)CPG13と類似の方法 において、試薬に対する末端の用脂−結合性ヌクオツドの接近可能性の上昇より さらに効率的なオリゴヌクレオチド合成を可能にするであろうことが予想された 。アミン化崩脂15を無水コハク酸によるI)MAP−触媒化スクンニル化に供 して、樹脂16を得た。スフノニル樹脂16への適当なヌクオシドの結合を、D IC/DMΔP−介在縮合により行い、あらゆる遊離カルボン酸および残存する アミン基をDCC/4−二トロフェノール/ピペリジンおよび無水酢酸/DMA P処理の各々によりブロックした4゜ スクシニル樹脂16へのF moc−ヌクレオシド誘導体1の結合は問題を含ん でいた。DMAPの使用は約30μモル/gの十分なヌクレオシド含有量を達成 するために必要であるが、用いた濃度が24時間でF moc基の45%の切断 をもたらすことを本発明者らは見いだした■4゜FIlOC−ヌクレオシド1と スクシニル樹脂16の間の2回連続の24時間の結合反応の後に、Fmocおよ びビキシル検定の比較により、約半分のヌクレオシドがアミン脱保護を受け、ア ミド結合により樹脂におそらく結合されることを示唆した。この副産物は最終の 切断条件に安定であってゆえに固体支持体上に留まると予測されたので、該副産 物は所望のコンジュゲートの製造において干渉するとは予測されなかった。しか し、Fmoc−ヌクレオシド1で誘導体化された樹脂は一貫してコンジュゲート の非常に低い収率を与え、これについてはさらに検討を行なわなかった。
Bocおよびビキンルヌクレオシド3および4は、上記の条件下で固体支持体1 6に容易に結合し、ビキシル検定により評価したときに22μモル/gおよび4 0μモル/gの各々の含有量が得られた。Bocおよびピキンル誘導体3および 4の両方は、効率的なオリゴヌクレオチド合成のための十分なヌクレオシド含有 量を与えたが、その容易な調製および必要とされる比較的穏やかな脱保護条件の ために後者が好ましい。
実施例3 ビオチニル化リシンシントン(Synthon) 23の製造既に、 本発明者らはりシン残基のε−アミノ基の脱保護後のポリアミド部分の球状ビオ チニル化によりビオチン残基をフンシュゲートに導入した16゜このバッチ様式 でのアプローチは、ビオチンの配置の限られた制御を与え、そして10個までの りシン残基を含む比較的大きなポリアミドにおいては、ビオチニル化反応は完結 するまで進まず、ビオチンの一様でない分布が生じるであろう。シントン23( 反応式■v)は通常のFmocペプチド合成を用いて非常に制御された様式でビ オチンの導入を可能にする。これはビオチンのN−ヒドロキシスクシンイミジル エステルによるN’−Fmoc−L−Lys−OH21のビオチニル化、次いで ペンタフルオロフェノールを用いるDCC−介在縮合により2段階法において調 製される。
N’−Fmoc−D−Lys(ビオチン)−OHの合成は、Jacobsonら Iにより報告されているが、この方法は大規模合成に対しては実際的でない。こ れは生成物が抽出工程のために用いられる溶媒中にわずかに可溶性であるにすぎ ず、活性エステル23について本発明者らの全体収率が54%であるのに比較し てN’−Fmoc−D−Lys−OHから出発して47%の収率を有するからで ある。さらに、元素分析(2,5当量の水および05当量のDMFを結晶化溶媒 として用いる)のみが特性化として与えられた嘗6゜ ペンタフルオロフェニルエステル23は、その非常に複雑な’HNMRスペクト ルおよび出発1IIIIl酸22に対するその”CNMRスペクトルの類似性に より、特性化を行うのが困難であった。この活性エステルの”CNMRスペクト ルにおける唯一の有意な差異は、リノンα−カルボニルの5 ppmの高磁場シ フトおよびペンタフルオロフェニル基による芳香族領域におけるある種の分離さ れない多重線の存在であった。遊離酸22および活性エステル23の両方の構造 に対してさらに決定的な証拠を提供するために、データ蓄積の相−感受性様式に おける二重量子フィルター化同核シフト相関実験(DQFPh C03Y)を2 2について行い、異核多重結合結合性(HMBC)実験を23について行った。
ビオチニル化リシン22のC03Yスペクトルにおける交差ピークは十分良(分 離されて、1次元IHNMRスペクトルにおける全ての多重線の明白な帰属を、 込み合ったメチレン領域における共鳴についてでさえ提供した。活性エステル2 3のHM B Cスペクトルは、α−カルボニルであることが仮帰属された61 69.2の共鳴を除く全てのカルボニルとそれらの隣接プロトンの間の強い結合 性を示した。これは、あらゆるプロトンに対してこれら特定実験条件下でいかな る相関関係も有していなかった。しかし、カルボニル領域における4つの共鳴の うち3つについて明白な帰属を提供することにより、HMBC実験はδ1692 の共鳴かりシンα−カルボニルによるものであることを間接的に確認し、そして さらに基本的にN ’−F s。
c−L −L ys−Or+およびビオチン17のスペクトルの付加である残り の共鳴の帰属を確認した。さらに、23のIRスペクトルは、エステルカルボニ ルに対応する1 787c11−’のバンド、1702cr’での22のカルボ ン酸バンドからの有意なシフトを有する。
実施例4 オリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲートの合成初めにモデル 化合物5を合成して、PCRプライマーとしてのこれらの型のコンジュゲートの 効力を試験した。このコンジュゲートのポリアミド部分は、PCR増幅産物の検 出のためのε−ビオチニル化リシン残基中、スペーサーとして6−アミノヘキサ ン酸残基(図2中、反応式りを含み、さらに参考アミノ酸としてアラニン残基を 含む。オリゴヌクレオチド部分は231erであり、これはλファージのDNA の700塩基対領域を増幅する(この鋳型は制御反応のための通常のCetus  PCRキットにより提供される)。
本発明者らが既に開示しているコンジュゲートの合成と同様に2.+5、本発明 のコンジュゲートのポリアミド部分は最初に通常のFmoc法9により上記の誘 導体化固体支持体上で合成するが、これはペプチド合成条件がDNA合成条件よ りも苛酷であるからである。誘導体化固体支持体18および19のペンダント( ぶら下がり)アミノおよび5゛−ヒドロキシル基は、90%TFA/エタンジチ オールおよび3%D CA / CHz C1x各々による処理、次いで20% トリエチルアミン/CH,CI、での中性化により脱保護した。次いでこれらを N −F moc−5−アミノヘキサン酸ペンタフルオロフェニルエステル(F ■■−εAhz−OPfp)および1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOB T)(各々2.5モル当量)の1:1混合物を用いて二重の(各々45分間)結 合に供した。定性トリニトロベンゼンスルホン酸試験lは、最初の結合の終了点 でご(微量の遊離アミノ酸を示し゛、繰り返しの結合の後にいかなる遊離アミノ 基も示さなかった。5゛−ヒドロキシルの再保護は、ピリジン中の4,4°−ジ メトキシトリチルクロリドを用いた(Fmoc基の存在のために、触媒としてD MPを有さない)トリチル化により行い、樹脂20を得た。2回の連a24時間 処理の後に樹脂のトリチル充填は、アシル化反応前に測定したヌクレオシド充填 に匹敵し、これはペンダントアミンで高度な選択性を有するアシル化が起こった ことを確認した。あらゆる残存遊離カルボン酸およびアミノ基を既に開示したよ うにブロックした。
5倍過剰のアミノ酸活性エステルおよびHOBTを使用する通常のFmoc化学 により、ビオチニル化リシン・シントン23およびF moc−A 1a−OP  fpを固体支持体20に結合させた(反応式111)。23の結合効率は、通 常のアラニン誘導体のものと類似しており、反応は1時間で完了した。この段階 での固体支持体のアミノ酸分析は、リシンおよびアラニン各々について26およ び23μモル/gの含有量を有する、リノン対アラニンの予測された比を与えた 。アラニンのF moc基を20%ピペリジン/DMFで除去し、得られた遊離 アミノ基をAczO/DMAPを用いた処理によりアセチル化した。
ポリアミドの合成後に、3%D CA / CHz C12を用いた脱トリチル 化により樹脂結合性ヌクレアーゼの5゛−ヒドロキシルを脱保護し、通常のβ− ンアノエチルホスホルアミダイト化学2.1fi、l*を用いてオリゴヌクレオ チドを合成した。トリチル検定により評価したオリゴヌクレオチドの繰り返し結 合収率は、通常の固体支持体を用いたDNA合成の収率に匹敵していた。固体支 持体からの切断、アンモニア処理によるホスフェートおよび塩基脱係vi2.l fi、+2は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により2つの主生 成物からなることが示された物質を与えた。比較的高い電気泳動移動度を有する 生成物は、いかなるペプチド性物質も含有していなかったが、低い方の移動度を 有する生成物は所望の組成のアミノ酸を含有していた。調製用PAGEによる精 製の結果、所望のコンジュゲートの高い収率が得られた。
オリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲート5は、UV分光学、アミノ酸分 析、その構成しているヌクレオチドに対するヌクレアーゼ消化およびPAGEに より特性化した。そのUV吸光度によるオリゴヌクレオチド部分の定量およびア ミノ酸分析によるポリアミド部分の定量は、オリゴヌクレオチド対ポリアミドの 12・1の比を与えた。さらに、アミノ酸の反応は予測した通りであり、ポリア ミド部分は無傷でオリゴヌクレオチド合成条件に対して安定であることを示唆し た。フンシュゲートをさらに放射活性ホスフェートを用いてλ−[”PI−AT PおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼにより5°−末端ラベル化し、PAGE により分析し、得られたオートラジオダラム(図1)によりコンジュゲートの均 質性を確認した。このコンジュゲートをPCRプライマーとして用いる予備実験 は、予測された長さの生成物を与えた。次いでこの生成物中のビオチンラベルの 化学発光検出は、このコンジュゲートが予測されたようにPCR産物中にi入さ れたことを明白に示した(データは他で報告されるであろう)。ゆえに、これら の型のコンジュゲートは生きたPCRプライマーである。
実施例5 PCR分析 実施例4のコンジュゲートを、最終濃度が1100n/μLになるよう0.1曽 MEDTA溶液に溶解した。オリゴヌクレオチド配列はGATGAGTTCGT GTCCGTAC^^CT本(T本=ビオチニル化トリアミドを有する修飾デオ キシリジン)であり、オリゴヌクレオチドブライマーGGTTATCG^^^T CAGCCAC^GCGと結合させた場合に、これを用いてPerkin−El mer P CRテストキットと共に供給されるバクテリオファージλ由来のc 1857 DNAの500bp領域7131−7630を増幅した。さらに通常 のオリゴヌクレオチドブライマー(3°−ヌクレオチドがTである)を合成して 上記の方法で精製した。
各PCR反応混合物は以下のものを含有していた:Taqポリメラーゼ溶液(2 ゜5U、Taqポリメラーゼ緩衝液750%グリセロール中)(5μL)、各オ リゴヌクレオチドブライマー(100ngをオートクレーブ処理した蒸留水で5 0μLにして1滴のオートクレーブ処理した鉱油を加えた)(1μL)。全ての 反応は、Perkin Elmer Cetus DNA Thermal C ycler装置上で以下のサイクル:95℃(1分)、55℃(1分)、72℃ (1分)、30サイクル(完全な鎖伸長を確保するための72℃で10分間の段 階で終了する)を用いて行った。PCR反応混合物(5μL)のゲル電気泳動は 、アガロースゲル(1,5%アガロース、0.001%臭化エチジウム)上で1 xTBE緩衝液を用い、80Vで1時間行った。アガロースゲルをサザン法によ りナイロン膜上にプロットした。次いでこの膜をBRL Like Techn ologies Inc、から得たPH0TOGENEキツトを用いてビオチン の存在について調べた。この検出は以下の方法で行う。
膜をトリス−緩衝食塩水(TBS Tween 20)に浸し、次いで同じ緩衝 液中の3%ラウン清アルブミン中でブロックした後に、TBS Tween 2 0で1:1000に希釈したストレプトアビジン(streptavidin) −アルカリホスファターゼコンジュゲート溶液(3M NaC1,1mM Mg Cl4.0.1mM ZnC5,30mMトリエタノールアミン(pH7,6) 中1−g/s+1)と共に膜を10分間インキュベートした。膜をTBS Tv een 20を用いて15分間、’ Final 1asher Buffer ’ (蒸留水で1.10に希釈)を用いて室温で60分間洗浄した後に、膜をプ ロットして過剰な緩衝液を除去した。次いでこれを現像ホルダーに入れ、製造者 により供給されたアルカリホスファターゼに対する化学発光基質で処理した。膜 を3時間暗所に保管し、次いでX線フィルムを上においた。30秒の暴露の後に 強いシグナルが記録された。
臭化エチジウム−染色されたゲルのUV視覚化は、コンジュゲートをプライマー の1つとして用いるPCRが、通常のオリゴヌクレオチドブライマーのみを用い て行うPCRに匹敵する量の増幅DNAを与えることを非常に明白に示した。
両PCR産物は予測された長さを有していた。
増幅産物がビオチニル化コンジュゲートによるものであることを明白に証明する ために、アガロースゲル上の生成物を上記のようにナイロン膜中にプロットした 。この検出系は、化学発光を生じる脱リン酸化反応を順に触媒するストレプトア ビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートと固定化ビオチニル化DNAの 反応を含む。化学発光は、通常のX線フィルムへのプロットの暴露により検出さ れる。予測されたように、ビオチニル化コンジュゲートPCRプライマーから生 じるPCRffl物に対応するビオチンを含有する唯一のバンドが存在した。こ れは、ビオチニル化プライマーがR終増幅産物に効果的に導入されることを明白 に示す。 化学発光検出は、この場合において唯一のビオチンを有するものでさ え、非常に感度が高い。強いシグナルはほんの30秒の暴露時間後に生じ、5分 後にシグナル飽和が存在した。
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一 国際調査報告 !□−轡−N6 1’CT/入り9311つ力は Th1s Annex 1ists the knOwn ”A″public ation 1evel pabnt family me高b■窒刀@rel ating to山e、patentdocumentscited in t heabove−menuoncd +ruernaaonal 5earch  report、 TheAustr≠撃奄≠氏@Pate+uOffice+ s +n no way 1iablefor these putio出vs  wluch ar: merely given for山e purpos e of info窒高≠浮盾氏B FarmKゴnsknlcM−に謹1a+m11 紡閣xにju17 +992 1 ”P”

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.以下の式(I)で示されるヌクレオチドポリマーコンジュゲート:Nu−N UC−C≡C−X1−NH−X2−X3(I)(式中、X1は非置換または置換 C1〜C10アルキレン基(1またはそれ以上の炭素が所望により−NH−、− O−、または−S−で置換されていてもよい)であり:X2は結合、または非置 換もしくは置換C∫〜C20アルキレン基(1またはそれ以上の炭素が所望によ り−NH−、−O−、または−S−で置換されていてもよい)であり: X1またはX2における所望による置換基は、オキソ、アミノ、チオキソ、ヒド ロキシル、メルカプト、カルボキシル、ハロゲン、低級アルキル、フェニル、ア ミノー低級アルキル、エステルー低級アルキル、アミドー低級アルキル、エーテ ルー低級アルキルまたはチオエーテルー低級アルキル基、これら置換基の硫黄類 似体、または天然に存在するアミノ酸由来の側鎖置換基およびこれら側鎖の密接 に関連した類似体のうちの1またはそれ以上の基から選択され;X3はアミノ酸 またはカルボキシ末端で結合したポリアミドであり;NUCは、以下の式のいず れかで示されるヌクレオシド基であり:▲数式、化学式、表などがあります▼ 〔式中、→は式(I)における−C≡C−基への結合を示す];そしてX4は以 下の式で示される糖基であり:▲数式、化学式、表などがあります▼ [式中、5′酸素はNuに結合し、そしてX5およびX6は各々独立してHまた はORである(RはH、保護基または固相マトリックスである)]:そしてNu はオリゴヌクレオチドであるI。 2.X1がC1〜C3アルキレンであり、X2が−CO−(C1〜C9アルキレ ン)−NH−であり、X3がカルボキシ末端により結合したペプチドであり、N UCが以下の式で示されるヌクレオシドであり: ▲数式、化学式、表などがあります▼ X4、X5およびX6は請求項1に記載した通りであり、そしてNuが以下の式 :▲数式、化学式、表などがあります▼ (式中、Bは独立してアデニル、グアニル、チミニルまたはシトシニルから選択 され、nは1〜約400である) で示される請求項1に記載のコンジュゲート。 3.X1がメチレンであり、X2が−CO−(CH2)5−NH−である請求項 2に記載のコンジュゲート。 4.以下の式で示される請求項1に記載のコンジユゲート:▲数式、化学式、表 などがあります▼ [式中、X2、X3、X5、X6およびNuは請求項1に記載した通りである] 。 5.X3が2〜100アミノ酸からなるペプチドである請求項1に記載のコンジ ユゲート。 6.X3が1またはそれ以上のリポーター基を含有するポリアミド鎖である請求 項1に記載のコンジュゲート。 7.リポーター基が、鎖に存在するリシン基上のε−アミノ基により該鎖に結合 している請求項6に記載のコンジュゲート。 8.Nuの定義においてnが2〜約200である請求項2に記載のコンジュゲー ト。 9.X5がHであり、そしてX6がOR(RはHまたは固相マトリックス)であ る請求項1に記載のコンジュゲート。 10.Rが制御された多孔ガラスまたはポリスチレン樹脂から選択される固相マ トリックスである請求項1に記載のコンジュゲート。 11.以下の式(I): Nu−NUC−C≡C−X1−NH−X2−X3(I)[式中、X1は非置換ま たは置換C1〜Cl0アルキレン基(1またはそれ以上の炭素が所望により−N H−、−O−、または−S−で置換されていてもよい)であり:X2は結合、ま たは非置換もしくは置換C1〜C20アルキレン基(1またはそれ以上の炭素が 所望により−NH−、−O−、または−S−で置換されていてもよい)であり: X1またはX2における所望による置換基は、オキソ、アミノ、チオキソ、ヒド ロキシル、メルカプト、カルボキシル、ハロゲン、低級アルキル、フェニル、ア ミノー低級アルキル、エステルー低級アルキル、アミドー低級アルキル、エーテ ルー低級アルキルまたはチオエーテルー低級アルキル基、これら置換基の硫黄類 似体、または天然に存在するアミノ酸由来の側鎖置換基およびこれら側鎖の密接 に関連した類似体のうちの1またはそれ以上の基から選択され;X3はアミノ酸 またはカルボキシ末端で結合したポリアミドであり:NUCは、以下の式のいず れかで示されるヌクレオシド基であり:▲数式、化学式、表などがあります▼ 〔式中、→は式(I)における−C≡C−基への結合を示す];そしてX4は以 下の式で示される糖基であり:▲数式、化学式、表などがあります▼ [式中、5′酸素はNuに結合し、そしてX5およびX6は各々独立してHまた はORである(RはH、保護基または固相マトリックスである)];そしてNu はオリゴヌクレオチドであるI で示されるヌクレォチドポリマーコンジュゲートを製造する方法であって、以下 の工程からなる方法: (I)以下の式(III): ▲数式、化学式、表などがあります▼ [式中、NUC′は以下の式で示されるいずれかの基であり:▲数式、化学式、 表などがあります▼(1)▲数式、化学式、表などがあります▼(1)▲数式、 化学式、表などがあります▼(出)▲数式、化学式、表などがあります▼(μ) X1、X5およびX6は上記定義と同意義であり、Pr1およびPr2は同−ま たは異なっていてよい保護基である] で示される化合物を得; (2)Pr2を除去するかまたは除去しない条件下で化合物(III)中のPr 1を除去することによりペンダントアミノ基を脱保護し、次いで脱保護された化 合物を式:Pr3X2R1(X2は上記定義と同意義であり、Pr3は保護基で あり、R1は脱離基である)で示される化合物と反応させてX2をペンダントア ミノ基に共有結合させて、以下の式で示される化合物を得▲数式、化学式、表な どがあります▼そして5′−OH基が遊離基である場合には、この基を所望によ りPr2[除去可能な保護基であり、工程(1)におけるPr2と同−または異 なる]で再保護するか、またはX2が結合である場合には工程(2)を省略し; (3)工程(2)の化合物中のPr3(またはX1が結合であるときにはPr1 )を除去することによりペンダントアミノ基を脱保護し、それを活性化アミノ酸 またはポリアミドと反応させて、X3の全てまたは一部を導入し、X3の一部の みが導入されたときには、次いで順に1またはそれ以上の活性化アミノ酸または ポリアミドを1回またはそれ以上の回数で通常のペプチド合成条件のもとで付加 し、化合物にX3の残りを付加して、以下に示す化合物を得:▲数式、化学式、 表などがあります▼(4)予め脱保護されていないときには工程(3)の化合物 の糖部分の5′−OH基を脱保護し、そして脱保護されたOH基を活性化ヌクレ オチドまたはオリゴヌクレオチドと反応させて5′−3′結合を形成させ、次い で順に1またはそれ以上の活性化ヌクレオチドを付加してオリゴヌクレオチド鎖 を形成させて、Nuを化合物に付加し:そして (5)所望によりあらゆる残存の保護基を除去し、そして所望によりX5または X6がORであってRが固相マトリックスである場合の固相マトリックスから該 化合物を切断して、化合物(I)を得る。 12.以下の式: ▲数式、化学式、表などがあります▼ [式中、X2、X3、X5、X6およびNuは請求項Iで定義した通りである] で示されるヌクレオチドポリマーコンジユゲートを製造する方法であって、以下 の工程からなる方法: (1)以下の式(IIIa): ▲数式、化学式、表などがあります▼ [式中、X5およびX6は上記定義と同意義であり、そしてPr1およびPr2 は同−または異なっていてよい保護基である]で示される化合物を得; (2)Pr2を除去するかまたは除去しない条件下で化合物(IIIa)中のP r1を除去することによりペンダントアミノ基を脱保護し、次いで脱保護された 化合物を式:Pr3×2R′(X2は上記定義と同意義であり、Pr3は保護基 であり、R1は脱離基である)で示されるアミノ酸と反応させてX2をペンダン トアミノ基に共有結合させ、そして5′−OH基が遊離基である場合には、この 基を所望により除去可能な保護基[工程(1)における保護基Pr2と同−また は異なっていてよい]で再保護するか、またはX2が結合である鳩合には工程( 2)を省略し:(3)工程(2)の化合物中のPr3(または、X2が結合であ るときにはPr1)を除去することによりペンダントアミノ基を脱保護し、それ を活性化アミノ酸またはポリアミドと反応させてX3の全てまたは一部を導入し 、X3の一部のみが導入されたときには、次いで順に1またはそれ以上の活性化 アミノ酸またはポリアミドを、1回またはそれ以上の回数で通常のペプチド合成 条件のもとで付加して化合物にX3の残りを付加し: (4)予め脱保護されていないときには工程(3)の化合物の糖部分の5′−O H基を脱保護し、そして脱保護されたOH基を活性化ヌクレオチドまたはオリゴ ヌクレオチドと反応させて5′−3′結合を形成させ、次いで順に1またはそれ 以上の活性化ヌクレオチドを付加してオリゴヌクレオチド鎖を形成させて、Nu を化合物に付加し:そして (5)所望によりあらゆる残存の保護基を除去し、そして所望によりX5または X6がORであってRが固相マトリックスである場合の固相マトリックスから該 化合物を切断して、化合物(II)を得る。 13.DNAまたはRNAポリメラーゼのための基質としての請求項1に記載の コンジュゲートの使用。 14.ラベル化ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマーとしての請求項1に 記載のコンジュゲートの使用。 15.ラベル化ハイブリダイゼーシヨンプローブとしての請求項1に記載のコン ジュゲートの使用。 16.病気の治療のための請求項1に記載のコンジュゲートの使用。 17.動物または植物組織における特定のポリヌクレオチド集団の存在および位 置を測定する方法であって、以下の工程からなる方法:(a)調べようとする組 織の切片を調製し;(b)組織切片を請求項1に記載のオリゴヌクレオチドポリ マーコンジュゲート(コンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は標的ポリヌク レオチドの一部に相補的である)とハイブリダイズさせ; (c)ハイブリダイズしていないプローブ物質を組織切片から除去し;そして( d)コンジュゲートのハイブリダイゼーシヨンによるラベル化が起こった組織切 片中の位置を検出または同定する。 18.支持マトリックスに固定化したかあるいは他の方法でそれに結合させたポ リヌクレオチドの検出方法であって、支持マトリックスを請求項1に記載のオリ ゴヌクレオチドポリマーコンジュゲート(コンジュゲートのオリゴヌクレオチド 部分は標的ポリヌクレオチドの一部に相補的である)と接触させ、次いで支持マ トリックスへのコンジュゲートのハイブリダイゼーションを検出することからな る方法。 19.生物学的試料中の特定のウイルス性、細菌性または他のポリヌクレオチド の存在または非存在を検出する方法であって、該試料の核酸を、標的ポリヌクレ オチドの一部に相補的な請求項1に記載のオリゴヌクレオチドポリマーコンジュ ゲートと接触させ、次いでコンジュゲートのハイブリダイゼーションが起こった か否かを検出することからなる方法。 20.ウイルス性、細菌性または他の疾病を治療する方法であって、このような 治療を必要とする患者に、請求項1に記載のオリゴヌクレオチドポリマーコンジ ュゲートの治療的有効量を投与することを特徴とし、さらに特定のポリヌクレオ チドの転写または翻訳がブロックされるようにコンジュゲートのオリゴヌクレオ チド部分が特定のウイルス性、細菌性または他のポリヌクレオチドに相補的なア ンチセンスオリゴヌクレオチドであることを特徴とする方法。 21.請求項1に記載のオリゴヌクレオチドポリマーコンジュゲート(コンジュ ゲートのオリゴヌクレオチド部分が所望のポリヌクレオチドの一部に相補的であ る)およびコンジュゲートのハイブリダイゼーシヨンを検出するための試薬を含 む、所望のポリヌクレオチドを検出するための診断キット。 22.動物または植物組織における特定のポリヌクレオチド集団の存在および位 置を測定する際に使用するための、組織切片調製用試薬をさらに含む請求項21 に記載の診断キット。
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BR9305435A (pt) * 1992-03-06 1994-12-27 Innogenetics Nv Processo para determinação de peptídeos correspondendo a epítopos imunologicamente importantes e seu uso em um processo para determinação de anticorpos ou peptídeos biotinilados correspondendo a epítopos imunologicamente importantes, processo para preparação dos mesmos e composições contendo os mesmos

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